EP3047015A1 - Utilisation de lactobacillus sakei pour la biopréservation des produits de la mer - Google Patents

Utilisation de lactobacillus sakei pour la biopréservation des produits de la mer

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Publication number
EP3047015A1
EP3047015A1 EP14722297.0A EP14722297A EP3047015A1 EP 3047015 A1 EP3047015 A1 EP 3047015A1 EP 14722297 A EP14722297 A EP 14722297A EP 3047015 A1 EP3047015 A1 EP 3047015A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
strain
sakei
products
lhis2885
food
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP14722297.0A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Gaëtan PODEUR
Françoise LEROI
Marie-France PILET
Hervé PREVOST
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Francais de Recherche pour lExploitation de la Mer (IFREMER)
Oniris SA
Original Assignee
Institut Francais de Recherche pour lExploitation de la Mer (IFREMER)
Oniris SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Francais de Recherche pour lExploitation de la Mer (IFREMER), Oniris SA filed Critical Institut Francais de Recherche pour lExploitation de la Mer (IFREMER)
Publication of EP3047015A1 publication Critical patent/EP3047015A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
    • A23B4/00—General methods for preserving meat, sausages, fish or fish products
    • A23B4/14—Preserving with chemicals not covered by groups A23B4/02 or A23B4/12
    • A23B4/18—Preserving with chemicals not covered by groups A23B4/02 or A23B4/12 in the form of liquids or solids
    • A23B4/20—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23B4/22—Microorganisms; Enzymes; Antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L17/00—Food-from-the-sea products; Fish products; Fish meal; Fish-egg substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L17/65—Addition of, or treatment with, microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/179—Sakei
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention relates to the biopreservation of food products, preferably seafood. More specifically, the present invention relates to the bacterial strain Lactobacillus sakei LHIS2885 and its use for limiting histamine formation in food products. , preferably seafood.
  • Seafood is responsible for 10 to 20% of human food poisoning. Of these, histamine is the leading cause of fish-related toxi-infections. Thus, 30 to 40% of the epidemics related to fish consumption are due to histamine. This toxi-infection results in cutaneous (redness, urticaria), neurological (headache), gastrointestinal (diarrhea, vomiting), palpitations and edema symptoms that can sometimes lead to hospitalization and death of weakened patients.
  • Histamine poisoning is related to the consumption of fish rich in histidine (such as, for example, tuna, mackerel, sardines or anchovies) and contaminated with histamine concentrations greater than 500 mg / kg.
  • histidine such as, for example, tuna, mackerel, sardines or anchovies
  • Histamine is formed in fish rich in histidine by a bacterial enzyme, histidine decarboxylase. Since histamine is resistant to cooking, canning, smoking and freezing, the fight against the histamine-induced infections involves the inhibition of the production of this biogenic amine, for example via the inhibition of the development of histamine producing bacteria on the products, or via the inhibition of histidine decarboxylase. Histamine can be formed by mesophilic bacterial species at temperatures above 7-10 ° C. The latter, however, are unable to form histamine at temperatures between 0-5 ° C, that is to say the temperature required for the conservation of seafood according to US or European standards.
  • histamine in the event of a cold chain break, and even at the recommended temperatures for the storage of seafood is therefore a major problem for the fishing industry.
  • Biopreservation is the addition to the product of microorganisms selected for their ability to inhibit the growth of undesirable microorganisms that are responsible for the alteration of the product or pathogenicity inducers.
  • the addition of these microorganisms can thus increase the shelf life of the product, and preserve its organoleptic properties.
  • US Pat. No. 5,576,035 describes the use of bacteria for the preservation of food products, in particular meat.
  • the European patent EP 1 456 350 describes the use of a strain of lactic acid bacterium, Lactococcus lactis, for the preservation of seafood products.
  • the Applicant has identified and isolated the bacterium Lactobacillus sakei LHIS2885.
  • a food product preferably a seafood, such as, for example, cooked fish.
  • this effect is observed not only at the usual preservation temperature, that is to say 4 ° C, but also at a temperature of 15 ° C, which allows the product to be protected from also in the event of a break in the cold chain.
  • the present invention therefore relates to the use of a strain of Lactobacillus sakei, one of its fragments or a composition comprising it for the preservation of food products, preferably seafood.
  • the production of histamine in said food products is inhibited.
  • the growth of histaminogenic bacteria in said food products is inhibited.
  • the food products are products of the sea, preferably fish, more preferably tuna, mackerel, sardine or herring.
  • said food products are cooked products, fresh products, frozen products, vacuum packaged products, products packaged in a modified atmosphere, smoked products, products packaged in a can and / or marinated products.
  • a quantity of bacteria ranging from about 10 2 to about 10 12 cfu of L. sakei I g of food product is applied to the food product.
  • the present invention furthermore relates to a strain of Lactobacillus sakei called strain Lactobacillus sakei LHIS2885 and deposited at the CNCM under the number CNCM I-4704.
  • the present invention also relates to a strain derived from Lactobacillus sakei obtained by mutation, variation or recombination of the strain. as described above.
  • said derived strain may comprise a genome having greater than 70% identity with the genome of the strain Lactobacillus sakei LHIS2885.
  • the present invention also relates to a composition comprising the bacterial strain or the derived strain as described above or a fragment thereof.
  • the present invention therefore also relates to the use of strain LHIS2885, a strain derived from LHIS2885, or a composition comprising them for the preservation of food products, preferably seafood products.
  • the production of histamine in said food products is inhibited, preferably the growth of histaminogenic bacteria in said food products is inhibited.
  • the food products are products of the sea, preferably fish, more preferably tuna, mackerel, sardine or herring.
  • said food products are cooked products, fresh products, frozen products, vacuum packed products, modified atmosphere packaged products, smoked products, canned goods, and / or or marinated products.
  • a quantity of bacteria ranging from about 10 2 to about 101 1 2 ufc of L. sakei LHIS2885 or from a derived strain / g of food product is applied to the food product.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of food products, preferably seafood products, comprising a step of applying to said products a L. sakei strain or one of its fragments, such that, for example, L. sakei strain LHIS2885, a strain derived from L. sakei LHIS2885 or one of their fragments.
  • the invention also relates to a food product, preferably seafood, comprising a strain of L. sakei, such as, for example, the strain of L. sakei LHIS2885, a strain derived from L. sakei LHIS2885 or one of their fragments.
  • a food product preferably seafood
  • a strain of L. sakei such as, for example, the strain of L. sakei LHIS2885, a strain derived from L. sakei LHIS2885 or one of their fragments.
  • the present invention relates to a new strain of lactic bacteria, namely the bacterial strain Lactobacillus sakei LHIS2885.
  • the strain Lactobacillus sakei LHIS2885 is isolated.
  • This bacterial strain belongs to the genus Lactobacillus and the sakei species. It is a Gram bacillus + catalase-oxidase-, homo heterofermentaire optional. If the taxonomy were to be modified, those skilled in the art could adapt the taxonomy modifications to deduce the bacterium usable in the present invention.
  • L. sakei strain LHIS2885 was isolated from fresh sardine meat packaged under modified atmosphere (50% N 2 + 50% C0 2 ).
  • strain Lactobacillus sakei LHIS2885 was deposited on December 12, 2012 under the Treaty of Budapest in the national collection of French microorganism culture (CNCM), Institut Pasteur, 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15. The sample received the number N ° CNCM 1-4704.
  • the strain Lactobacillus sakei LHIS2885 was able to inhibit the growth of histaminogenic bacteria, and to inhibit the production of histamine on food products contaminated with histaminogenic bacteria.
  • histaminogenic bacteria include, but are not limited to, Morganella psychrotolerans, Morganella morganii, Photobacterium phosphoreum, Photobacterium damselae and Hafiiia alvei.
  • the capacity for inhibiting the growth of histaminogenic bacteria is evaluated by a petri dish inhibition test, by measuring the halos of inhibition.
  • Bacterial growth inhibition tests on a petri dish are well known to those skilled in the art. An example of a bacterial growth inhibition test on a petri dish is described below.
  • this test can be performed by the double layer method.
  • the L. sakei strain LHIS2885 is cultured in broth, preferably in MRS broth (from Man, Rogosa and Sharpe), preferably for 24 to 48 hours, then spots of the bacterial suspension are deposited on an agar medium preferably agar medium based on tuna juice comprising 1.5% agar.
  • the volume of the bacterial suspension spots varies from 1 to 50 ⁇ l, preferably from 5 to 20 ⁇ l, more preferably is approximately 10 ⁇ l.
  • the petri dishes are incubated under anaerobic conditions, preferably at a temperature of varying from about 10 to 20 ° C, more preferably at a temperature of about 15 ° C, for a period of about 5 to 20 days, preferably about 10 days.
  • the agar plates are then incubated, preferably aerobically, at a temperature ranging from about 10 to 20 ° C., preferably at a temperature of about 15 ° C., for a period of 24 to 192 hours, preferably from 36 to 192 hours. 144 hours, even more preferably about 96 hours. At the end of the incubation period, the inhibition halos are measured.
  • the strain LHIS2885 of the invention has a halo of inhibition of the histaminogenic strain tested.
  • the capacity for inhibiting the growth of histaminogenic bacteria is evaluated by an inhibition test on a food sample, for example cooked tuna.
  • An example of an inhibition test on a food sample is shown below.
  • bacterial suspensions are prepared.
  • the histaminogenic strain is cultured in broth, preferably salted BHI (Brain Heart Infusion) broth (2% NaCl), preferably at a temperature of approximately 15 to 25 ° C., more preferably at a temperature of approximately 20 ° C.
  • the L. sakei strain LHIS2885 is cultivated, preferably in broth, more preferably in MRS broth, preferably at a temperature ranging from 10 to 37 ° C., preferably from 20 to 30 ° C., more preferably from 20 to 30 ° C. at about 26 ° C, until a concentration of from about 10 8 to about 10 10 CFU / ml is reached, preferably about 2.10 9 CFU / ml.
  • the histaminogenic strain, as well as the strain LHIS2885 are preferably diluted in sterile water, and then seeded on the food product.
  • the amount of inoculated histaminogenic bacteria ranges from about 1 to 100 CFU / g, preferably from about 5 to about 50 CFU / g, more preferably about 10 CFU / g of food product.
  • the amount of bacteria L. sakei LHIS2885 inoculated from 10 3 J to 108 ° CFU / g, more preferably from about 10 to about 10 7 CFU / g, even more preferably is about 10 5 to 10 6 CFU / g of food product.
  • the seeded food products are then incubated, preferably at a temperature ranging from about 10 to 20 ° C., more preferably about 15 ° C., for a period ranging from 24 to 120 hours, preferably from 48 to 96 hours, more preferably for 72 hours.
  • the inoculated food products are incubated under vacuum.
  • the amount of histaminogenic bacteria in the product is measured, for example by the method of enumeration on agar medium, such as, for example, on VRBG medium (Violet Red Bile Glucose) incubated at approximately 20 ° C for 48 hours.
  • the LHIS2885 strain of the invention makes it possible to reduce the growth of the histaminogenic bacterium in the food product relative to a control, said control having been inoculated only with the histaminogenic bacterium.
  • Another subject of the invention is a bacterial strain obtained by mutation, variation or recombination of the L. sakei strain LHIS2885 as described above. According to the invention, such a strain is called "strain derived from LHIS2885". According to one embodiment of the invention, these strains derived from L. sakei LHIS2885 have a capacity for inhibiting the growth of histaminogenic bacteria and / or an ability to inhibit the production of histamine equivalent, or at least equal to that of L. sakei strain LHIS2885.
  • the capacity for inhibiting the growth of histaminogenic bacteria is evaluated by a petri dish inhibition test, as described above.
  • the strain derived from LHIS2885 of the invention has an inhibition halo of the histaminogenic strain tested.
  • the strain derived from LHIS2885 has an inhibition halo equal to or greater than that measured for the L. sakei strain LHIS2885 of the invention.
  • the ability to inhibit the growth of histaminogenic bacteria is evaluated by an inhibition test on a food sample as described above.
  • the strain derived from LHIS2885 of the invention makes it possible to reduce the growth of the histaminogenic bacterium in the food product with respect to a control, said control having been seeded only with the histaminogenic bacterium.
  • this growth inhibition is approximately equal to or greater than that measured for L. sakei strain LHIS2885.
  • strains derived from L. sakei LHIS2885 include, but are not limited to, random mutagenesis or site-directed mutagenesis.
  • the strains derived from L. sakei LHIS2885 according to the invention comprise a genome having more than 70% identity with the genome of L. sakei LHIS2885, preferably more than 80%, 90 %, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity.
  • identity corresponds to a percentage of identity between two or more sequences. This percentage is defined as the number of positions for which the bases are identical when the sequences are optimally aligned, divided by the total number of bases of the smaller of the two sequences. The differences between the sequences can be divided randomly and over all their lengths.
  • Two sequences are said to be optimally aligned when the percentage of identity is maximum. Moreover, as will become clear to those skilled in the art, it may be necessary to use additions of gaps (gaps) so as to obtain an optimal alignment between the two sequences.
  • the percentage identity between two nucleic acid sequences can therefore be determined by comparing these two optimally aligned sequences in which the nucleic acid sequence to be compared can comprise additions or deletions with respect to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences. The percentage of identity is then calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions in the comparison window and multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage identity between these two sequences.
  • the methods of determining the identity are designed to give the greatest possible concordance between the compared sequences.
  • the percentage of identity can be determined by a particular mathematical model or by a computer program (generally referred to as an "algorithm").
  • Methods for calculating identity between nucleotide sequences are well known to those skilled in the art. Non-limiting examples of such methods include those described in the following documents: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., Ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.
  • Methods of determining identity have been described in publicly available computer programs.
  • Preferred examples of methods using computer programs include, but are not limited to, the GCG software package, including GAP (Devereux et al., Nucl. Acid Res., 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul et al., J. Mol Biol 215, 403-410 (1990)).
  • the BLASTX program is available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and other sources (BLAST Manual, Altschul et al NCB / NLM / NIH Bethesda, Md 20894, Altschul et al., Supra).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the Smith-Waterman algorithm which is well known to those skilled in the art, can also be used to determine the percent identity between two sequences.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising a strain of L. sakei, preferably L. sakei LHIS2885 bacterium, a strain derived therefrom or a fragment thereof.
  • fragment is intended to mean cellular components, metabolites, secreted molecules, compounds resulting from the metabolism of L. sakei, preferably L. sakei LHIS2885 or a derived strain, L. sakei enzymes, preferably L. sakei LHIS2885 or a derived strain, etc.
  • the fragments of L. sakei, preferably L. sakei LHIS2885 or a derived strain can be obtained by recovering the culture supernatant of L. sakei, preferably L.
  • a fragment may also designate a degradation product of L. sakei, preferably L. sakei LHIS2885 or a derived strain.
  • the term fragment may designate a compound in an isolated form, or a mixture of several compounds derived from L. sakei, preferably L. sakei LHIS2885 or a derived strain.
  • the composition comprises living cells of L. sakei, preferably L. sakei LHIS2885, or a strain derived from LHIS2885, preferably cells in the growth phase, more preferably in stationary phase or exponential phase of growth, and even more preferably in the exponential phase of growth.
  • the composition comprises viable L. sakei cells, preferably L. sakei LHIS2885, or a strain derived from LHIS2885.
  • the composition comprises non-viable L. sakei cells, preferably L. sakei LHIS2885, or a strain derived from LHIS2885.
  • the composition is in liquid form.
  • liquid vehicles which may be used in the composition of the invention include, but are not limited to, water, phosphate buffer, or any liquid medium suitable for culturing L. sakei bacterial strain, preferably adapted to the cultivation of L. sakei LHIS2885 or a strain derived from LHIS2885, such as for example, MRS medium (from Man, Rogosa and Sharpe) or BHI medium containing 2% NaCl (brain heart infusion).
  • the composition is in the form of a frozen liquid.
  • this liquid comprises from 1 to 20% of glycerol approximately, preferably from 5 to approximately 15%, even more preferentially about 10% volume / volume. glycerol.
  • the composition is in solid form.
  • solid forms suitable for conditioning the composition according to the invention include, but are not limited to, a powder, such as, for example, a powder comprising L. sakei cells, preferably L. sakei LHIS2885, or a strain derived from LHIS2885 thereof lyophilized; a paste; one tablet; a solid formulation to be extemporaneously dissolved in a liquid vehicle, for example water; a fragment of solid culture medium inoculated with the L. sakei strain, preferably with L. sakei LHIS2885, or a strain derived from LHIS2885, such as, for example, MRS medium.
  • the composition comprising a strain of L. sakei, preferably the L. sakei strain LHIS2885, or a strain derived from LHIS2885 is packaged in the form of a unit dosage.
  • unit dosages include, but are not limited to, a bacterial culture tube, a powder sachet comprising L. sakei cells, preferably L. sakei LHIS2885, or a lyophilized strain of LHIS2885 ...
  • the concentration of a bacterial composition is expressed in cfu per unit volume or mass.
  • ufc is well known to those skilled in the art and refers to a number of "colony forming units", i.e., a number of living cells, capable of forming a colony on a solid culture medium.
  • the composition comprises a concentration of cells of a strain of L. sakei, preferably L. sakei strain LHIS2885, or a strain derived from LHIS2885 varying from about 10 to about 10 12 cfu / ml, preferably about 10 5 to about 10 cfu / ml, more preferably from about 10 to about 10 9 cfu / ml, and still more preferably
  • the composition comprises a concentration of cells of a strain of L. sakei, preferably L. sakei strain LHIS2885, or a strain derived from LHIS2885 varying from about 10 to about 10 12 cfu / g, preferably about 10 5 to about 10 10 cfu / g, more preferably from about 10 to about 10 9 cFU / g, and even more preferably the concentration is
  • the inventors have surprisingly demonstrated that the application of the strain Lactobacillus sakei LHIS2885 to food products, such as, for example, seafood products, makes it possible to control the production of histamine in these products, thus making it possible to prevent any toxi-infection.
  • the subject of the present invention is therefore also the use of a L. sakei bacterial strain, preferably of the L. sakei bacterial strain LHIS2885, or of a strain derived from L. sakei LHIS2885, from one of their fragments. or a composition comprising them, for the preservation, preferably biopreservation of food products, preferably seafood. More specifically, the present invention relates to the use of L. sakei, preferably L. sakei LHIS2885 , or a strain derived from L. sakei LHIS2885, a fragment thereof or a composition comprising them for controlling the production of histamine in a food product, preferably a product of the sea.
  • preservation is a process for treating a food product whose purpose is to preserve its organoleptic characteristics, its taste and nutritional properties, its texture and color characteristics, and to avoid possible food poisoning.
  • the preservation comprises the prevention or the inhibition of the development of microorganisms, in particular undesirable microorganisms, responsible for the deterioration of the product or inducing pathogenicity, such as bacteria or fungi.
  • the conservation includes preventing or inhibiting the production of molecules responsible for the alteration of said product or inducing pathogenicity.
  • the preservation of a food product within the meaning of the present invention does not correspond to the fermentation of the food product.
  • the application of a L. sakei bacterial strain, preferably L. sakei bacterial strain LHIS2885, or a strain derived from L. sakei LHIS2885, a fragment thereof or a composition comprising them on the food product does not modify the organoleptic properties of said food product.
  • the biopreservation of a product corresponds to the addition to said product of one or more microorganisms in order to preserve said product.
  • undesirable microorganisms include, but are not limited to, histaminogenic bacteria such as, for example, Morganella psychrotolerans, Hafnia alvei, Photobacterium phosphoreum, Photobacterium damselae and Morganella morganii.
  • histaminogenic bacteria such as, for example, Morganella psychrotolerans, Hafnia alvei, Photobacterium phosphoreum, Photobacterium damselae and Morganella morganii.
  • molecules responsible for the alteration of said product or inducing pathogenicity include, but are not limited to, histamine.
  • the present invention therefore also relates to a method for preserving, preferably biopreserving, a food product, preferably a product of the sea, comprising adding to said product a strain of L. sakei, preferably of the L. sakei bacterial strain LHIS2885, or a derivative of L. sakei LHIS2885, a fragment thereof or a composition comprising them. More specifically, the method comprises controlling the production of histamine in said product.
  • the application of a strain of L. sakei preferably L. sakei strain LHIS2885, a strain derived from LHIS2885, a fragment thereof or a composition comprising them inhibits the growth and development of bacterial strains producing histamine.
  • histamine-producing bacterial strains that can be inhibited include, without to be limited, Morganella psychrotolerans, Hafiiia alvei, Photobacterium phosphoreum, Photobacterium damselae and Morganella morganii.
  • the present invention therefore relates to a method for preserving, preferably biopreserving, a food product, preferably a product of the sea, comprising adding to said product a strain of L. sakei, preferably bacterial strain L. sakei LHIS2885, or a derivative of L. sakei LHIS2885, a fragment thereof or a composition comprising them, wherein the L. sakei strain, preferably the L. sakei bacterial strain. LHIS2885, or the derivative of L.
  • sakei LHIS2885 or one of their fragments inhibits the growth and development of histamine-producing bacterial strains, preferably selected from Morganella psychrotolerans, Hafiiia alvei, Photobacterium phosphoreum, Photobacterium damselae and / or Morganella morganii, thereby controlling the production of histamine in said product.
  • histamine-producing bacterial strains preferably selected from Morganella psychrotolerans, Hafiiia alvei, Photobacterium phosphoreum, Photobacterium damselae and / or Morganella morganii, thereby controlling the production of histamine in said product.
  • the method of preserving a food product does not include, or does not consist in, the fermentation of the food product.
  • the method of preserving a food product does not modify the organoleptic properties of said food product.
  • the application of a strain of L. sakei, preferably L. sakei strain LHIS2885, a strain derived from LHIS2885, a fragment thereof or a composition comprising them makes it possible to maintain the concentration of histamine-producing bacteria in the food product, preferably the product of the sea at a level of less than about 10 5 cfu / g of food product, preferably less than about 10 4 cfu / g, more preferably less than about 10 cfu / g.
  • these levels of inhibition are observed after incubation of the food product up to 4 days at about 15 ° C., preferably for at least 5, 6, 7 or 8 days of incubation at about 15 ° C. .
  • the application of a strain of L. sakei, preferably L. sakei strain LHIS2885, a strain derived from LHIS2885, one of of their fragments or a composition comprising them inhibits the production of histamine and / or allows the elimination of the histamine produced in the food product, preferably in the product of the sea.
  • the application of a strain of L. sakei, preferably L. sakei strain LHIS2885, a strain derived from LHIS2885, a fragment thereof or a composition comprising them makes it possible to maintain the concentration of histamine in the food product at a level of less than 100 mg / kg, preferably less than 75 mg / kg, more preferably less than 50 mg / kg.
  • these histamine levels are measured after incubation of the food product up to 4 days at 15 ° C, preferably for at least 5, 6, 7 or 8 days of incubation at about 15 ° C.
  • the L. sakei strain preferably L. sakei strain LHIS2885, a strain derived from LHIS2885 or one of their fragments inhibits the development of histamine-producing strains, and / or or inhibits the production of histamine and / or allows the removal of histamine produced in a food product at a temperature ranging from about 0 ° C to about 37 ° C, preferably from about 4 ° C to about 30 ° C. ° C, more preferably from about 4 ° C to about 15 ° C.
  • the biopreservation effect of L preferably from about 4 ° C to about 37 ° C, preferably from about 4 ° C to about 30 ° C. ° C, more preferably from about 4 ° C to about 15 ° C.
  • the L. sakei strain preferably the L. sakei strain LHIS2885, a strain derived from LHIS2885, one of their fragments or a composition comprising them is applied in an effective amount to the food product.
  • the term "effective amount" refers to the amount of the L. sakei strain, preferably L.
  • the effective amount varies from about 10 to about 10 12 cfu of the L. sakei strain, preferably L. sakei strain LHIS2885, a strain derived from LHIS2885 / g of food product.
  • the term "food product” denotes a product intended for human or animal consumption (for example for the feeding of pet animals (cat, dog, horse, hamster, guinea pig, ferret , etc.), farm animals (cattle, goats, sheep, pigs, equines, camelids, etc.) or zoo animals).
  • the term "food product” refers to a product intended for human consumption.
  • the food product is a product of the sea, preferably a fish, more preferably a fish rich in histidine.
  • histidine-rich products include, but are not limited to, tuna and other tunas (such as, for example, skipjack, marlin and swordfish), mackerel, sardines and anchovies.
  • the food product is a fresh product, a cooked product, a frozen product, a vacuum packaged product, a modified atmosphere packaged product (such as, for example, an atmosphere comprising 50% of N 2 and 50% of C0 2 ), a smoked product, a product packaged in a can, a marinated product or a fermented product ...
  • a modified atmosphere packaged product such as, for example, an atmosphere comprising 50% of N 2 and 50% of C0 2
  • a smoked product a product packaged in a can, a marinated product or a fermented product ...
  • the food product is not a fermented product.
  • the food product is cooked tuna under vacuum.
  • the subject of the present invention is also a process for the preparation of a food product, preferably a product of the sea for consumption, preferably for human consumption, the said preparation method comprising a step of application to the food product.
  • a strain of L. sakei preferably L. sakei strain LHIS2885, a strain derived from LHIS2885, a fragment thereof or a composition comprising them.
  • the L. sakei strain preferably the L. sakei LHIS2885 strain, the strain derived from LHIS2885, one of their fragments or a composition comprising them is applied to the food product before packaging, preferably just before packing.
  • the L. sakei strain preferably L. sakei strain LHIS2885, the strain derived from LHIS2885, one of their fragments or a composition comprising them is added to the fresh food product, with or without packaging.
  • the L. sakei strain preferably L. sakei strain LHIS2885, a strain derived from LHIS2885, one of their fragments or a composition comprising them is applied to the food product. after cooking said product.
  • the method of the invention comprises the following steps:
  • the L. sakei strain preferably L. sakei strain LHIS2885, a strain derived from LHIS2885, one of their fragments or a composition comprising them is applied to the food product before salting and / or smoking said product.
  • the method of the invention comprises the following steps:
  • L. sakei strain preferably L. sakei strain LHIS2885, a strain derived from LHIS2885, a fragment thereof or a composition comprising them;
  • the L. sakei strain preferably L. sakei strain LHIS2885, a strain derived from LHIS2885, one of their fragments or a composition comprising them is applied to the food product. after salting and / or smoking said product.
  • the method of the invention comprises the following steps:
  • the method of the invention comprises the following steps:
  • LHIS2885 one of their fragments or a composition comprising them;
  • said food product is tuna, and the modified atmosphere comprises 30 to 70% CO 2 , preferably 40 to 60% CO 2 ; from 10 to 70% of O 2 , preferably from 15 to 60% of O 2 and from 0 to 30% of N 2 , preferably from 0 to 25% of N 2 .
  • said food product is tuna, and the modified atmosphere comprises about 40% of CO 2 and about 60% of O 2 .
  • said food product is tuna, and the modified atmosphere comprises about 60% of CO 2 , about 15% of O 2 and about 25% of N 2 .
  • said food product is herring or sardine, and the modified atmosphere comprises 30 to 70% CO 2 , preferably about 60% CO 2 ; and 30 to 70% N 2 , preferably about 40% N 2 .
  • the present invention also relates to a food product, preferably a product of the sea, comprising a strain of L. sakei, preferably the L. sakei strain LHIS2885 of the invention, a strain derived from LHIS2885, or one of their fragments.
  • the L. sakei strain LHIS2885 according to the invention has the following advantages:
  • the L. sakei strain LHIS2885 develops in food products, such as, for example, seafood, in particular cooked, smoked or conditioned under controlled atmosphere or under vacuum, at a temperature ranging from about 0 to about 37 ° C;
  • L. sakei strain LHIS2885 to a food product, such as, for example, a product of the sea, contaminated with a histaminogenic bacterium, inhibits the development of said histaminogenic strain;
  • L. sakei strain LHIS2885 to a food product, such as, for example, a product of the sea, contaminated with a histaminogenic bacterium, inhibits the production of histamine;
  • Figure 1 is a histogram showing the growth of M. pyschrotolerans alone (MP) or co-cultured with Lactococcus piscium EU2258 (MP + EU2258) or Lactobacillus sakei LHIS2885 (MP + LHIS2885) (MP) on cooked tuna loins kept at 15 ° C under vacuum.
  • Figure 2 is a histogram showing histamine production by Morganella psychrotolerans alone (MP) or in coculture with Lactococcus piscium EU2258 (MP + EU2258) or Lactobacillus sakei LHIS2885 (MP + LHIS2885) in cooked tuna stored at 15 ° C under -empty.
  • Figure 3 is a combination of two graphs showing (A) the effect of the strain LHIS2885 of the invention on the growth of M. morganii (Mm) on cooked tuna stored at 15 ° C under vacuum, and (B) the effect of the strain LHIS2885 of the invention on the production of histamine.
  • Figure 4 is a histogram showing growth of Morganella psychrotolerans in absence (Mp control) or presence (Mp test) of Lactobacillus sakei LHIS2885 at 4 ° C for 18 days.
  • Figure 5 is a histogram showing the growth of Lactobacillus sakei in the absence (control LHIS2885) or presence (test LHIS2885) of Morganella psychrotolerans at 4 ° C for 18 days.
  • Figure 6 is a histogram showing the production of histamine in tuna cooked at 4 ° C by M. psychrotolerans in absence (control - Mp) or presence of L. sakei (Test - Mp / LHIS2885).
  • Figure 7 is a combination of two graphs showing the effect of the strain LHIS2885 (Ls) of the invention on the bacterium Photobacterium phosphoreum (Pp) on cooked tuna stored at 15 ° C under vacuum.
  • Ls strain LHIS2885
  • Pp Photobacterium phosphoreum
  • A Effect of the strain LHIS2885 of the invention on the growth of Photobacterium phosphoreum.
  • B Effect of the strain LHIS2885 of the invention on the production of histamine.
  • Figure 8 is a graph showing the effect of the strain LHIS2885 of the invention on the growth of the bacterium Photobacterium damselae on cooked tuna stored at 15 ° C under vacuum.
  • This example describes the protocol that allowed the isolation and identification of L. sakei LHIS2885 bacteria as being useful for the biopreservation of food products such as, for example, seafood, and more particularly for preventing or controlling histamine production in these products.
  • the inhibition test is carried out according to the method of Matamores et al. (2009).
  • the lactic acid bacteria are cultured in broth in BHI medium (2% NaCl) at 20 ° C. for 24 hours or 48 hours. After this pre-culture time, spots of 10 ⁇ l of bacterial suspension are deposited on the medium Tuna Juice (JT) (1.5% Agar). After inoculation, the Petri dishes are incubated at 15 ° C. under anaerobic conditions for 10 days. At the end of the incubation time of the lactic acid bacteria, the bacterial mats are poured on the spots. The proper dilution of the bacterial mat is l / 100 th for the strain psychrotacirante Mr. psychrotolerans. The bacterial mats are made in the medium JT. The dishes are aerobically placed for 96 hours at 15 ° C. They are observed at 36, 72 and 96h and the halos of inhibitions are measured.
  • M. psychrotolerans comes from the Institut Pasteur collection, its accession number is CIP109403. It is cultured in salted BHI broth (2% NaCl) at 20 ° C for 24 h for the experiments (approximately 2.10 9 CFU / ml). The twelve strains of lactic acid bacteria are grown on MRS or Elliker medium at
  • M. psychrotolerans - lactic bacteria mixtures 10 ml of the preculture of M. psychrotolerans are mixed with 10 ml of the preculture of lactic acid bacterium. Each lactic acid bacterium is tested separately so that 12 different mixtures are prepared.
  • Seeding on tuna The previously prepared tuna is kneaded in the 200 g bag manually to make a homogeneous paste. With the help of a sterile spoon, the flesh is divided into bags of 40 g of tuna. The starting inoculum is fixed at 5% by volume relative to the total mass of tuna meat (v / m).
  • the M. psychrotolerans - lactic bacteria mixture is prepared extemporaneously and vortexed for 15 seconds at maximum speed. 2 ml of the mixture are added to 40 g of tuna using a sterile 2ml pipette.
  • the positive control is inoculated only with M. psychrotolerans, the 10 ml of lactic bacteria having been replaced by 10 ml of sterile physiological saline.
  • the sterility control consists of uninoculated tuna.
  • the Bacterial concentrations on the matrix are approximately 50 CFU / g of M. psychrotolerans and at least 10 6 CFU / g of lactic acid bacteria.
  • Incubation The inoculated products are evacuated and frozen at -20 ° C. for 48 hours. They are then thawed and stored at 15 ° C for 8 days. Analysis: The products are analyzed on the same day (D0) then at 24 (D1), 48 (D2) hours, 4 days (D4) and 8 days (D8). M. psychrotolerans is specifically counted on the VRBG medium at 20 ° C. (48 h of incubation). Lactic bacteria are enumerated either on MRS or Elliker anaerobically at 20 ° C for 48 h. Histamine production is analyzed after box counting using the Veratox kit, according to the manufacturer's instructions or by HPLC. The primary dilution of the count (1/5) is used to perform this test, a volume of 30 ml is collected on each sample and frozen at -20 ° C.
  • EU2258 does not seem to have any effect statistically significant on the growth of M. psychrotolerans from 4 days ( Figure 1).
  • the products before freezing, the products all contain less than 50 mg / kg of histamine.
  • the histamine level remains constant after thawing, and at 24h and 48h where it is always less than 50 mg / kg.
  • the amount of histamine increases to 3600 mg / kg of histamine in the control.
  • Lactobacillus sakei LHIS2885 reduces histamine production to 38 mg / kg (statistically significant difference).
  • the lactic acid bacterium EU2258 also reduces histamine production but more slowly with 1279 mg / kg (statistically significant difference).
  • the L. sakei lactic acid bacterium LHIS2885 is therefore able to inhibit the growth of M. psychrotolerans and the production of histamine by the latter, up to 8 days after thawing the product at 15 ° C.
  • Bacteria - culture and isolation media The pre-cultures of the histaminogenic bacterium Morganella psychrotolerans CIP 109403 were carried out in a 2% Brain Heart Broth medium (2% salted BHI) at 20 ° C for 24 hours ( concentration of 2.10 9 CFU / ml). Pre-cultures of L. sakei bacteria LHIS2885 were made in Man, Rogosa and Sharpe broth (MRS) at 26 ° C for 24 hours (concentration of 1.29.10 9 CFU / ml).
  • the tuna bags are sown at 5% (v / m), or 1.25 ml in 25g of tuna.
  • the bags are then mixed by hand to homogenize the distribution in the flesh (final concentration in the flesh 3.25 ⁇ 10 6 CFU / ml).
  • a solution with 10 3 CFU / ml of CIP109403 T and 6.5.10 'CFU / ml of LHIS2885 is prepared.
  • the bags of tuna are then seeded at 5% (v / m).
  • Samples of the mother solution obtained are then taken: 15 ml of ground tuna solution deposited in an empty Falcon tube for analyzes of biogenic amines by the HPLC method and 10 ml for the microbiological counts. From the 10 ml of ground tuna solution, cascade dilutions are carried out according to the assumed concentrations of bacteria.
  • M. psychrotolerans CIP109403 is enumerated in depth on VRBG medium while L. sakei LHIS2885 is counted on MRS medium on the surface. The media were then incubated for 48 h at 20 ° C for VRBG medium and 20 ° C in anaerobic jar for MRS medium.
  • Biogenic Amines HPLC
  • pH was measured from the Stomacher bag of ground tuna solution.
  • a pre-assay with the Neogen Veratox kit was carried out on 3 samples to verify the histamine concentration in the products on day 4 , 7 , Jn.
  • the samples on day 7 , day 14 and day 14 were analyzed by HPLC by dylylation. biogenic amines.
  • M. psychrotolerans and L. sakei are observable in Figures 4 and 5.
  • the initial concentration of M. psychrotolerans is less than 1 log CFU / g ( Figure 4), after 11 days of incubation, it approaches 7 log CFU / g to reach 18 days at a concentration of 8.3 log CFU / g.
  • the growth of M. psychrotolerans is weakly inhibited, the initial concentration is less than 1 log CFU / g, and growth follows that of the control with a maximum inhibition of 0.5 log CFU. / g to J 7 , J n , Ji 4 .
  • L. sakei develops well in tuna at 4 ° C ( Figure 5), the starting concentration is 6.5 log CFU / g and increases to 9 log CFU / g after 11 days of incubation. At 14 and 18 days a decrease in concentration is observed at 8.6 and 7.5 log CFU / g respectively. There is no significant difference in the initial rate and growth of L. sakei between the control and the test.
  • the evolution of the histamine concentration in the products is described in Figure 6.
  • the production of histamine in the presence of M. psychrotolerans is initiated from 7 days with concentrations lower than 50 mg / kg.
  • Albacore tuna loins come from the company Cobreco in Douarnenez. They were recovered from the plant's cutting line after their thawing / trimming process on frozen whole tuna. This raw material has been prepared for testing according to the following steps:
  • Sample preparation 10 batches of samples were prepared to test the sensory changes made to the product by pure strains and cocktail strains.
  • the sachets were inoculated and then stored according to the protocol described above, under the following conditions:
  • the tests were carried out by the internal sensory analysis panel of Ifremer de France. This panel has a long experience of seafood; he is asked once or twice a week to test products or for training sessions. A group of 9 people well trained on the odors of altered seafood participated in this study.
  • a computer system allows the automatic acquisition of data (Fizz software, Biosystems, Dijon) and their statistical processing.
  • the contents of the 2 bags of each sample are divided into 5 polystyrene odorless jars with a lid, ie about 15 g of crumbs per jar half of each sachet.
  • the pots are stored in an oven at 18 ° C during the course of the session.
  • Each of the 5 sets of 10 samples is felt by 2 different judges.
  • the reference control, thawed on the morning of the test, is proposed at the same time.
  • the samples are presented to the judges according to a balanced plan to avoid a bias due to the effect of the 1st tested product.
  • the session consists of 2 events:
  • a list of 22 scents is offered to judges who must select at least one smell: sardine, mackerel, tuna, pâté, oily fish, marine / iodine, milky, potato, vegetable, mop, brine, fruity, metallic, butter / caramel, pyrrolidine / sperm, rancid / linseed oil, amine / urine, acid / pungent, sour / fermented, foot / cheese, cabbage / gas, H 2 S / egg.
  • the control changes little between D4 and D8. Indeed, the product having been cooked and frozen, it is very little contaminated when the storage starts at 15 ° C.
  • the product inoculated with the strain M. psychrotolerans (Mp) is strongly altered on day 4 and does not evolve thereafter; the odor is of the sulfur type (mixture of dimethylsulfide and H 2 S).
  • Mp M. psychrotolerans
  • the "tuna" odor persists but the "pyrrolidine” grade was clearly detected on D4; a little less J8 because probably masked by other odors more present.
  • the product inoculated with the M. psychrotolerans (MP) and EU2258 strains has a sulfur content; it can come from M. psychrotolerans or from EU2258. Tuna is heavily altered on D8. On the other hand, the tuna inoculated with M. psychrotolerans and LHIS2885 shows no alteration over time.
  • the strain Lactobacillus sakei LHIS2885 inhibits the growth of the histaminogenic bacteria M. psychrotolerans and M. morganii, from 4 to 5 log CFU / g. The most important inhibition is observed after 4 days of incubation of cooked tuna under vacuum at 15 ° C. The production of histamine is less than 50 ppm (the threshold retained by the European legislation is 100 ppm, that retained by the American legislation is 50 ppm) whereas in products which could be naturally contaminated the quantity of histamine would be 4000 ppm.
  • the strain Lactobacillus sakei LHIS2885 is not altered by itself. The strain can even reduce the alteration of the product at 4 and 8 days of incubation.
  • the strain Lactobacillus sakei LHIS2885 thus provides interesting elements to have a better control of the production of histamine in tuna and to limit the weathering of the product.

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Abstract

La présente invention concerne une souche de Lactobacillus sakei appelée souche Lactobacillus sakei LHIS2885, ainsi qu'une souche dérivée de L. sakei LHIS2885. La présente invention concerne également l'utilisation d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche LHIS2885 ou d'une souche dérivée de LHIS2885 pour la conservation de produits alimentaires, de préférence de produits de la mer.

Description

UTILISATION DE LACTOBACILLUS SAKEI POUR LA BIOPRÉSERVATION
DES PRODUITS DE LA MER
DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne la biopréservation des produits alimentaires, de préférence des produits de la mer. Plus spécifiquement, la présente invention concerne la souche bactérienne Lactobacillus sakei LHIS2885 et son utilisation pour limiter la formation d'histamine dans les produits alimentaires, de préférence les produits de la mer.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE
Les produits de la mer sont responsables de 10 à 20% des intoxications alimentaires humaines. Parmi celles-ci, l'histamine est la première cause de toxi-infections liées à la consommation de poisson. Ainsi, 30 à 40% des épidémies liées à la consommation de poisson sont dues à l'histamine. Cette toxi-infection se traduit par des symptômes cutanés (rougeurs, urticaires), neurologiques (maux de tête), gastro-intestinaux (diarrhées, vomissements), palpitations et œdèmes pouvant parfois conduire à l'hospitalisation et au décès de patients fragilisés.
Les intoxications histaminiques sont liées à la consommation de poissons riches en histidine (tels que, par exemple, le thon, le maquereau, la sardine ou l'anchois) et contaminés par des concentrations en histamine supérieures à 500 mg/kg.
L'histamine est formée dans des poissons riches en histidine par une enzyme bactérienne, l'histidine décarboxylase. L'histamine étant résistante à la cuisson, à l'appertisation, au fumage et à la congélation, la lutte contre les toxi-infections causées par l'histamine implique l'inhibition de la production de cette aminé biogène, par exemple via l'inhibition du développement de bactéries productrices d'histamine sur les produits, ou via l'inhibition de l'histidine décarboxylase. L'histamine peut être formée par des espèces bactériennes mésophiles, à des températures supérieures à 7-10°C. Ces dernières sont cependant incapables de former de l'histamine à des températures comprises entre 0-5°C, c'est-à-dire la température requise pour la conservation des produits de la mer selon les normes américaines ou européennes. Cependant, des études récentes ont démontré l'existence de bactéries psychrotolérantes fortement productrices d'histamine entre 0 et 5°C (Emborg et al., 2005; Kanki et al., 2004). Des exemples de ces bactéries sont Morganella morganii et Morganella psychrotolerans qui a été récemment isolée par l'équipe de Paw Dalgaard (Emborg et al., 2006), ainsi que les bactéries Photobacterium phosphoreum et Photobacterium damselae.
La formation d'histamine en cas de rupture de chaîne du froid, et même à des températures recommandées pour le stockage des produits de la mer représente donc un problème majeur pour les industriels de la pêche.
L'une des stratégies de lutte contre la contamination des produits alimentaires concerne la biopréservation. La biopréservation correspond à l'ajout au produit de microorganismes sélectionnés pour leur capacité à inhiber la croissance de microorganismes indésirables, responsables de l'altération du produit ou inducteurs de pathogénicité. L'ajout de ces microorganismes peut ainsi permettre d'augmenter la durée de conservation du produit, et de préserver ses propriétés organoleptiques. Ainsi, par exemple, le brevet américain US 5,576,035 décrit l'utilisation de bactéries pour la préservation de produits alimentaires, notamment de la viande. D'autre part, le brevet européen EP 1 456 350 décrit l'utilisation d'une souche de bactérie lactique, Lactococcus lactis, pour la conservation des produits de la mer.
Cependant, à la connaissance de la Demanderesse, aucun procédé de biopréservation n'a été décrit à ce jour, permettant de prévenir ou de maîtriser la production d'histamine dans les produits de la mer.
Lors de ses recherches d'un ferment pouvant être utilisé dans un tel procédé de biopréservation, la Demanderesse a identifié et isolé la bactérie Lactobacillus sakei LHIS2885. L'addition de cette bactérie sur un produit alimentaire, de préférence un produit de la mer, tel que, par exemple, un poisson cuit, permet, de façon surprenante, de réduire la production d'histamine dans celui-ci. De plus, cet effet est observé non seulement à la température de préservation habituelle, c'est-à-dire 4°C, mais également à une température de 15°C, ce qui permet de protéger le produit d'une contamination à l'histamine également en cas de rupture de la chaîne du froid.
RÉSUMÉ
La présente invention concerne donc l'utilisation d'une souche de Lactobacillus sakei, de l'un de ses fragments ou d'une composition la comprenant pour la conservation de produits alimentaires, de préférence de produits de la mer. Selon un mode de réalisation de l'invention, la production d'histamine dans lesdits produits alimentaires est inhibée. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la croissance de bactéries histaminogènes dans lesdits produits alimentaires est inhibée.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les produits alimentaires sont des produits de la mer, de préférence des poissons, plus préférentiellement du thon, du maquereau, de la sardine ou du hareng. Selon un mode de réalisation de l'invention, lesdits produits alimentaires sont des produits cuits, des produits frais, des produits congelés, des produits emballés sous vide, des produits conditionnés sous atmosphère modifiée, des produits fumés, des produits conditionnés en boîte de conserve, et/ou des produits marinés.
Selon un mode de réalisation de l'invention, on applique sur le produit alimentaire une quantité de bactéries variant d'environ 10 2 à environ 1012 ufc de L. sakei I g de produit alimentaire.
La présente invention concerne en outre une souche de Lactobacillus sakei appelée souche Lactobacillus sakei LHIS2885 et déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I- 4704. La présente invention concerne également une souche dérivée de Lactobacillus sakei obtenue par mutation, variation ou recombinaison de la souche telle que décrite ci- dessus. Par exemple, ladite souche dérivée peut comprendre un génome présentant plus de 70% d'identité avec le génome de la souche Lactobacillus sakei LHIS2885. La présente invention concerne également une composition comprenant la souche bactérienne ou la souche dérivée telles que décrites ci-dessus ou l'un de leurs fragments.
La présente invention concerne donc également l'utilisation de la souche LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, ou d'une composition les comprenant pour la conservation de produits alimentaires, de préférence de produits de la mer.
Selon un mode de réalisation, la production d'histamine dans lesdits produits alimentaires est inhibée, de préférence la croissance de bactéries histaminogènes dans lesdits produits alimentaires est inhibée.
Selon un mode de réalisation, les produits alimentaires sont des produits de la mer, de préférence des poissons, plus préférentiellement du thon, du maquereau, de la sardine ou du hareng.
Selon un autre mode de réalisation, lesdits produits alimentaires sont des produits cuits, des produits frais, des produits congelés, des produits emballés sous vide, des produits conditionnés sous atmosphère modifiée, des produits fumés, des produits conditionnés en boîte de conserve, et/ou des produits marinés.
Selon un mode de réalisation, on applique sur le produit alimentaire une quantité de bactéries variant d'environ 10 2 à environ 10112" ufc de L. sakei LHIS2885 ou d'une souche dérivée / g de produit alimentaire.
La présente invention concerne également un procédé de préparation de produits alimentaires, de préférence de produits de la mer, comprenant une étape d'application sur lesdits produits d'une souche de L. sakei ou de l'un de ses fragments, telle que, par exemple, la souche de L. sakei LHIS2885, une souche dérivée de L. sakei LHIS2885 ou de l'un de leurs fragments.
L'invention a également pour objet un produit alimentaire, de préférence produit de la mer, comprenant une souche de L. sakei, telle que, par exemple, la souche de L. sakei LHIS2885, une souche dérivée de L. sakei LHIS2885 ou de l'un de leurs fragments. DÉFINITIONS
Dans la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante :
- " Environ " placé devant un nombre, signifie plus ou moins 10% de la valeur nominale de ce nombre.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE
La présente invention concerne une nouvelle souche de bactérie lactique, à savoir la souche bactérienne Lactobacillus sakei LHIS2885. Selon un mode de réalisation de l'invention, la souche Lactobacillus sakei LHIS2885 est isolée. Cette souche bactérienne appartient au genre Lactobacillus et à l'espèce sakei. Il s'agit d'un bacille Gram+ catalase- oxydase-, homo hétérofermentaire facultatif. Si la taxonomie devait être modifiée, l'homme du métier pourrait adapter les modifications de taxonomie pour en déduire la bactérie utilisable dans la présente invention.
La souche L. sakei LHIS2885 a été isolée de la chair de sardine fraîche conditionnée sous atmosphère modifiée (50% N2 + 50% C02).
Un échantillon de la culture du microorganisme conforme à la présente invention, appelée souche Lactobacillus sakei LHIS2885 a été déposé le 12 décembre 2012 sous le Traité de Budapest dans la collection nationale de culture de microorganismes française (CNCM), Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15. L'échantillon a reçu le numéro N° CNCM 1-4704.
Les inventeurs ont démontré que la souche Lactobacillus sakei LHIS2885 était capable d'inhiber la croissance de bactéries histaminogènes, et d'inhiber la production d'histamine sur des produits alimentaires contaminés par des bactéries histaminogènes. Des exemples de bactéries histaminogènes incluent, sans y être limités, Morganella psychrotolerans, Morganella morganii, Photobacterium phosphoreum, Photobacterium damselae et Hafiiia alvei. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la capacité d'inhibition de la croissance des bactéries histaminogènes est évaluée par un test d'inhibition sur boîte de pétri, via la mesure de halos d'inhibition.
Les tests d'inhibition de la croissance bactérienne sur boîte de pétri sont bien connus de l'homme du métier. Un exemple de test d'inhibition de la croissance bactérienne sur boîte de pétri est décrit ci-dessous.
Selon un mode de réalisation, ce test peut être réalisé par la méthode de la double couche. Avantageusement, la souche L. sakei LHIS2885 est mise en culture en bouillon, de préférence en bouillon MRS (de Man, Rogosa et Sharpe), de préférence pendant 24 à 48 heures, puis des spots de la suspension bactérienne sont déposés sur un milieu gélosé, de préférence un milieu gélosé à base de jus de thon comprenant 1.5% d'agar.
Avantageusement, le volume des spots de suspension bactériennes varie de 1 à 50 μί, de préférence de 5 à 20 μί, plus préférentiellement est d'environ 10 μL· Après ensemencement, les boîtes de pétri sont incubées en anaérobiose, de préférence à une température variant de 10 à 20°C environ, plus préférentiellement à une température d'environ 15°C, pendant une période de 5 à 20 jours environ, de préférence d'environ 10 jours.
Au terme de la période d'incubation, des tapis de bactéries histaminogènes sont coulés sur les spots. L'homme du métier sait comment évaluer la dilution adéquate des souches histaminogènes pour obtenir un tapis bactérien homogène sur les boîtes.
Les boîtes gélosées sont ensuite incubées, de préférence en aérobiose, à une température variant de 10 à 20°C environ, de préférence à une température d'environ 15°C, pendant une période de 24 à 192 heures, de préférence de 36 à 144 heures, encore plus préférentiellement d'environ 96 heures. A l'issue de la période d'incubation, les halos d'inhibition sont mesurés.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la souche LHIS2885 de l'invention présente un halo d'inhibition de la souche histaminogène testée. Selon un second mode de réalisation de l'invention, la capacité d'inhibition de la croissance des bactéries histaminogènes est évaluée par un test d'inhibition sur un échantillon alimentaire, par exemple du thon cuit. Un exemple de test d'inhibition sur un échantillon alimentaire est présenté ci-dessous. Dans une première étape, des suspensions bactériennes sont préparées. Avantageusement, la souche histaminogène est cultivée en bouillon, de préférence en bouillon BHI (Brain Heart Infusion) salé (2% NaCl), de préférence à une température de 15 à 25°C environ, plus préférentiellement à une température d'environ 20°C, jusqu'à atteindre une concentration variant d'environ 1.10 8 à environ 1.1010 UFC/ml, de préférence d'environ 2.109 UFC/ml. En parallèle, la souche L. sakei LHIS2885 est cultivée, de préférence en bouillon, plus préférentiellement en bouillon MRS, de préférence à une température variant de 10 à 37°C environ, de préférence de 20 à 30°C environ, plus préférentiellement d'environ 26°C, jusqu'à atteindre une concentration variant d'environ 1.10 8 à environ 1.1010 UFC/ml, de préférence d'environ 2.109 UFC/ml.
Dans une seconde étape, la souche histaminogène, ainsi que la souche LHIS2885 sont de préférence diluées dans de l'eau stérile, puis ensemencées sur le produit alimentaire. Avantageusement, la quantité de bactéries histaminogènes inoculées varie de 1 à 100 UFC/g environ, de préférence d'environ 5 à environ 50 UFC/g, plus préférentiellement est d'environ 10 UFC/g de produit alimentaire. De préférence, la quantité de bactéries L. sakei LHIS2885 inoculées varie de 10 3J à 108° UFC/g environ, plus préférentiellement d'environ 10 à environ 107 UFC/g, encore plus préférentiellement est d'environ 105-106 UFC/g de produit alimentaire.
Selon un mode de réalisation, les produits alimentaires ensemencés sont ensuite incubés, de préférence à une température variant de 10 à 20°C environ, plus préférentiellement d'environ 15°C, pendant une période variant de 24 à 120 heures, de préférence de 48 à 96 heures, plus préférentiellement pendant 72 heures. Avantageusement, les produits alimentaires ensemencés sont incubés sous-vide. A l'issue de la période d'incubation, la quantité de bactéries histaminogènes dans le produit est mesurée, par exemple par la méthode de dénombrement sur milieu gélosé, tel que, par exemple sur milieu VRBG (Violet Red Bile Glucose) incubé à environ 20°C pendant 48 heures. Selon un mode de réalisation de l'invention, la souche de LHIS2885 de l'invention permet de réduire la croissance de la bactérie histaminogène dans le produit alimentaire par rapport à un témoin, ledit témoin ayant été ensemencé uniquement avec la bactérie histaminogène.
Un autre objet de l'invention est une souche bactérienne obtenue par mutation, variation ou recombinaison de la souche L. sakei LHIS2885 telle que décrite ci-dessus. Selon l'invention, une telle souche est appelée « souche dérivée de LHIS2885 ». Selon un mode de réalisation de l'invention, ces souches dérivées de L. sakei LHIS2885 présentent une capacité d'inhibition de la croissance des bactéries histaminogènes et/ou une capacité d'inhibition de la production d'histamine équivalente, ou au moins égale à celle de la souche L. sakei LHIS2885.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la capacité d'inhibition de la croissance des bactéries histaminogènes est évaluée par un test d'inhibition sur boîte de pétri, comme décrit ci-dessus. Avantageusement, la souche dérivée de LHIS2885 de l'invention présente un halo d'inhibition de la souche histaminogène testée. Selon un mode de réalisation de l'invention, la souche dérivée de LHIS2885 présente un halo d'inhibition égal ou supérieur à celui mesuré pour la souche L. sakei LHIS2885 de l'invention.
Selon un second mode de réalisation de l'invention, la capacité d'inhibition de la croissance des bactéries histaminogènes est évaluée par un test d'inhibition sur un échantillon alimentaire tel que décrit ci-dessus.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la souche dérivée de LHIS2885 de l'invention permet de réduire la croissance de la bactérie histaminogène dans le produit alimentaire par rapport à un témoin, ledit témoin ayant été ensemencé uniquement avec la bactérie histaminogène. De préférence, cette inhibition de croissance est environ égale ou supérieure à celle mesurée pour la souche L. sakei LHIS2885.
Des exemples de méthodes d'obtention de souches dérivées de L. sakei LHIS2885 incluent, sans y être limitées, la mutagenèse aléatoire ou la mutagenèse dirigée. Selon un mode de réalisation de l'invention, les souches dérivées de L. sakei LHIS2885 selon l'invention comprennent un génome présentant plus de 70% d'identité avec le génome de L. sakei LHIS2885, de préférence plus de 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% d'identité.
Au sens de la présente invention, le terme «identité», lorsqu'il est utilisé dans une relation entre les séquences de deux ou plusieurs séquences nucléotidiques, se réfère au degré de parenté entre ces séquences nucléotidiques, tel que déterminé par le nombre de correspondances entre les chaînes de deux bases ou plus.
Selon l'invention, « identité » correspond à un pourcentage d'identité entre deux séquences ou plus. Ce pourcentage est défini comme le nombre de positions pour lesquelles les bases sont identiques lorsque les séquences sont alignées de manière optimale, divisé par le nombre total de bases de la plus petite des 2 séquences. Les différences entre les séquences peuvent être réparties au hasard et sur toutes leurs longueurs.
Deux séquences sont dites alignées de manière optimale lorsque le pourcentage d'identité est maximal. Par ailleurs, comme cela apparaîtra de manière claire à l'homme du métier, il peut être nécessaire de faire appel à des ajouts de positions lacunaires (des « gaps ») de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences. Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques peut donc être déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale dans laquelle la séquence d'acides nucléiques à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est alors calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Préférentiellement, les méthodes de détermination de l'identité sont conçues pour donner la plus grande concordance possible entre les séquences comparées. Le pourcentage d'identité peut être déterminé par un modèle mathématique particulier ou par un programme d'ordinateur (généralement désigné par le terme d' « algorithme »). Des méthodes de calcul de l'identité entre des séquences nucléotidiques sont bien connues de l'homme du métier. Des exemples non limitatifs de telles méthodes incluent celles décrites dans les documents suivants : Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., éd., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Génome Projects, Smith, D. W., éd., Académie Press, New York, 1993; Computer Analysis of Séquence Data Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G, eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Séquence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G, Académie Press, 1987; Séquence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; et Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48, 1073 (1988).
Des méthodes de détermination de l'identité ont été décrites dans des programmes d'ordinateurs accessibles au public. Des exemples préférés de méthodes utilisant des programmes d'ordinateurs incluent, sans y être limités, le progiciel GCG, incluant GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. \2, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, et FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). Le programme BLASTX est disponible auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI) et d'autres sources (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra). L'algorithme de Smith-Waterman, qui est bien connu de l'homme du métier, peut également être utilisé pour déterminer le pourcentage d'identité entre deux séquences.
La présente invention concerne une composition comprenant une souche de L. sakei, de préférence la bactérie L. sakei LHIS2885, une souche dérivée de celle-ci ou l'un de leurs fragments. Par « fragment », on entend, au sens de la présente invention, des composants cellulaires, des métabolites, des molécules sécrétées, des composés résultant du métabolisme de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885 ou d'une souche dérivée, des enzymes de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885 ou d'une souche dérivée, etc .. Selon un mode de réalisation de l'invention, les fragments de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885 ou d'une souche dérivée peuvent être obtenus par récupération du surnageant de culture de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885 ou d'une souche dérivée, ou par extraction d'une culture de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885 ou d'une souche dérivée de composants ou de fractions cellulaires, de métabolites ou de composés sécrétés. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, un fragment peut également désigner un produit de dégradation de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885 ou d'une souche dérivée. Selon un mode de réalisation, le terme fragment peut désigner un composé sous une forme isolée, ou un mélange de plusieurs composés dérivés de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885 ou d'une souche dérivée.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la composition comprend des cellules vivantes de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885, ou d'une souche dérivée de LHIS2885, de préférence des cellules en phase de croissance, plus préférentiellement en phase stationnaire ou en phase exponentielle de croissance, et encore plus préférentiellement en phase exponentielle de croissance.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la composition comprend des cellules viables de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885, ou d'une souche dérivée de LHIS2885. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la composition comprend des cellules non-viables de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885, ou d'une souche dérivée de LHIS2885.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la composition est sous forme liquide. Des exemples de véhicules liquides utilisables dans la composition de l'invention incluent, sans y être limités, de l'eau, du tampon phosphate, ou tout milieu liquide adapté à la culture de la souche bactérienne L. sakei, de préférence adapté à la culture de L. sakei LHIS2885 ou d'une souche dérivée de LHIS2885, tels que, par exemple, le milieu MRS (de Man, Rogosa et Sharpe) ou le milieu BHI à 2% de NaCl (Infusion cervelle cœur). Selon un mode de réalisation de l'invention, la composition est sous la forme d'un liquide congelé. De préférence, lorsque la composition de l'invention est sous la forme d'un liquide congelé, ce liquide comprend de 1 à 20% de glycérol environ, de préférence de 5 à 15% environ, encore plus préférentiellement environ 10% volume/volume de glycérol.
Selon un second mode de réalisation de l'invention, la composition est sous forme solide. Des exemples de forme solides adaptées au conditionnement de la composition selon l'invention incluent, sans y être limités, une poudre, telle que, par exemple, une poudre comprenant des cellules de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885, ou d'une souche dérivée de LHIS2885 de celle-ci lyophilisées ; une pâte ; un comprimé ; une formulation solide devant être extemporanément dissoute dans un véhicule liquide, par exemple de l'eau ; un fragment de milieu de culture solide ensemencé par la souche L. sakei, de préférence par L. sakei LHIS2885, ou une souche dérivée de LHIS2885, tel que, par exemple, du milieu MRS.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la composition comprenant une souche de L. sakei, de préférence la souche L. sakei LHIS2885, ou une souche dérivée de LHIS2885 est conditionnée sous la forme d'un dosage unitaire. Des exemples de dosages unitaires incluent, sans y être limités, un tube de culture bactérienne, un sachet de poudre comprenant des cellules de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885, ou une souche dérivée de LHIS2885 lyophilisées...
Habituellement, la concentration d'une composition bactérienne s'exprime en ufc par unité de volume ou de masse. Le terme ufc est bien connu de l'homme du métier et désigne un nombre d' « unités formant colonie », i.e. un nombre de cellules vivantes, pouvant former une colonie sur un milieu de culture solide.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la composition comprend une concentration de cellules d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, ou d'une souche dérivée de LHIS2885 variant d'environ 10 à environ 1012 ufc/ml, de préférence d'environ 105 à environ 1010 ufc/ml, plus préférentiellement d'environ 10 à environ 109 ufc/ml, et encore plus préférentiellement la concentration g
est d'environ 10 ufc/ml.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la composition comprend une concentration de cellules d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, ou d'une souche dérivée de LHIS2885 variant d'environ 10 à environ 1012 ufc/g, de préférence d'environ 105 à environ 1010 ufc/g, plus préférentiellement d'environ 10 à environ 109 ufc/g, et encore plus préférentiellement la concentration est
g
d'environ 10 ufc/g.
Les inventeurs ont démontré, de façon surprenante, que l'application de la souche Lactobacillus sakei LHIS2885 sur des produits alimentaires, tels que, par exemple, des produits de la mer permet de maîtriser la production d'histamine dans ces produits, permettant ainsi de prévenir toute toxi-infection.
La présente invention a donc également pour objet l'utilisation d'une souche bactérienne L. sakei, de préférence de la souche bactérienne L. sakei LHIS2885, ou d'une souche dérivée de L. sakei LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant, pour la conservation, de préférence la biopréservation de produits alimentaires, de préférence de produits de la mer. Plus précisément, la présente invention concerne l'utilisation de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885, ou d'une souche dérivée de L. sakei LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant pour maîtriser la production d'histamine dans un produit alimentaire, de préférence un produit de la mer.
Au sens de la présente invention, la conservation correspond à un procédé de traitement d'un produit alimentaire ayant pour but de préserver ses caractéristiques organoleptiques, ses propriétés gustatives et nutritives, ses caractéristiques de texture et de couleur, et d'éviter d'éventuelles intoxications alimentaires. Selon un mode de réalisation de l'invention, la conservation comprend la prévention ou l'inhibition du développement de microorganismes, en particulier de microorganismes indésirables, responsables de l'altération du produit ou inducteurs de pathogénicité, tels que des bactéries ou des champignons. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la conservation comprend la prévention ou l'inhibition de la production de molécules responsables de l'altération dudit produit ou inductrices de pathogénicité.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la conservation d'un produit alimentaire au sens de la présente invention ne correspond pas à la fermentation du produit alimentaire. De préférence, l'application d'une souche bactérienne L. sakei, de préférence de la souche bactérienne L. sakei LHIS2885, ou d'une souche dérivée de L. sakei LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant sur le produit alimentaire, ne modifie pas les propriétés organoleptiques dudit produit alimentaire.
Au sens de la présente invention, la biopréservation d'un produit correspond à l'ajout audit produit d'un ou plusieurs microorganismes afin de conserver ledit produit.
Des exemples de microorganismes indésirables incluent, sans y être limités, les bactéries histaminogènes telles que, par exemple, Morganella psychrotolerans, Hafnia alvei, Photobacterium phosphoreum, Photobacterium damselae et Morganella morganii. Des exemples de molécules responsables de l'altération dudit produit ou inductrices de pathogénicité incluent, sans y être limités, l'histamine.
La présente invention concerne donc également un procédé de conservation, de préférence de biopréservation d'un produit alimentaire, de préférence d'un produit de la mer, comprenant l'ajout au dit produit d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche bactérienne L. sakei LHIS2885, ou d'un dérivé de L. sakei LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant. Plus précisément, le procédé comprend la maîtrise de la production d'histamine au sein dudit produit.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'application d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant inhibe la croissance et le développement de souches bactériennes productrices d'histamine. Des exemples de souches bactériennes productrices d'histamine pouvant être inhibées incluent, sans y être limités, Morganella psychrotolerans, Hafiiia alvei, Photobacterium phosphoreum, Photobacterium damselae et Morganella morganii.
La présente invention concerne donc un procédé de conservation, de préférence de biopréservation d'un produit alimentaire, de préférence d'un produit de la mer, comprenant l'ajout au dit produit d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche bactérienne L. sakei LHIS2885, ou d'un dérivé de L. sakei LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant, dans lequel la souche de L. sakei, de préférence la souche bactérienne L. sakei LHIS2885, ou le dérivé de L. sakei LHIS2885, ou l'un de leurs fragments inhibe la croissance et le développement de souches bactériennes productrices d'histamine, de préférence choisies parmi Morganella psychrotolerans, Hafiiia alvei, Photobacterium phosphoreum, Photobacterium damselae et/ou Morganella morganii, permettant ainsi la maîtrise de la production d'histamine au sein dudit produit.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de conservation d'un produit alimentaire ne comprend pas, ou ne consiste pas en la fermentation du produit alimentaire.
De préférence, le procédé de conservation d'un produit alimentaire ne modifie pas les propriétés organoleptiques dudit produit alimentaire.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'application d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant permet de maintenir la concentration de bactéries productrices d'histamine dans le produit alimentaire, de préférence le produit de la mer à un niveau inférieur à environ 105 ufc/g de produit alimentaire, de préférence inférieur à environ 104 ufc/g, plus préférentiellement inférieur à environ 10 ufc/g. Selon un mode de réalisation, ces niveaux d'inhibition sont observés après incubation du produit alimentaire jusqu'à 4 jours à environ 15°C, de préférence pendant au moins 5, 6, 7 ou 8 jours d'incubation à 15°C environ.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'application d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant inhibe la production d'histamine et/ou permet l'élimination de l'histamine produite dans le produit alimentaire, de préférence dans le produit de la mer.
La présence d'histamine dans les poissons riches en histidine est réglementée en Europe (Règlement CE n° 1441/2007, 2007) avec une limite à 100 mg/kg.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'application d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant permet de maintenir la concentration d'histamine dans le produit alimentaire à un niveau inférieur à 100 mg/kg, de préférence inférieur à 75 mg/kg, plus préférentiellement inférieur à 50 mg/kg. Selon un mode de réalisation, ces niveaux d'histamine sont mesurés après incubation du produit alimentaire jusqu'à 4 jours à 15°C, de préférence pendant au moins 5, 6, 7 ou 8 jours d'incubation à 15°C environ.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la souche de L. sakei, de préférence la souche L. sakei LHIS2885, une souche dérivée de LHIS2885 ou l'un de leurs fragments inhibe le développement de souches productrices d'histamine, et/ou inhibe la production d'histamine et/ou permet l'élimination de l'histamine produite dans un produit alimentaire à une température variant d'environ 0°C à environ 37°C, de préférence d'environ 4°C à environ 30°C, plus préférentiellement d'environ 4°C à environ 15°C. Selon un mode de réalisation, l'effet de biopréservation de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition selon l'invention sont observés à 15°C pendant au moins 1 jour, de préférence au moins 2 jours, plus préférentiellement pendant au moins 4 jours, et encore plus préférentiellement pendant au moins 5, 6, 7 ou 8 jours. Selon un mode de réalisation de l'invention, la souche de L. sakei, de préférence la souche L. sakei LHIS2885, une souche dérivée de LHIS2885, l'un de leurs fragments ou une composition les comprenant est appliquée en une quantité efficace sur le produit alimentaire. Au sens de la présente invention, le terme « quantité efficace » désigne la quantité de la souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant à appliquer sur le produit pour observer l'effet souhaité d'inhibition des souches productrices d'histamine et/ou l'inhibition de la production d'histamine et/ou l'élimination de l'histamine déjà formée. Selon un mode de réalisation de l'invention, la quantité efficace varie d'environ 10 à environ 10 12 ufc de la souche de L. sakei, de préférence la souche L. sakei LHIS2885, une souche dérivée de LHIS2885 / g de produit alimentaire, de préférence d'environ 104 à environ 109 ufc/g, plus préférentiellement d'environ 10 à environ 107 ufc/g et encore plus préférentiellement d'environ 10 à environ 5.106 ufc/g. Au sens de la présente invention, le terme « produit alimentaire » désigne un produit destiné à l'alimentation humaine ou animale (par exemple à l'alimentation des animaux de compagnie (chat, chien, cheval, hamster, cochon d'inde, furet, etc .), des animaux d'élevage (bovins, caprins, ovins, porcins, équidés, camélidés, etc ..) ou des animaux de zoo). De préférence, le terme « produit alimentaire » désigne un produit destiné à 1 ' alimentation humaine .
Selon un mode de réalisation de l'invention, le produit alimentaire est un produit de la mer, de préférence un poisson, plus préférentiellement un poisson riche en histidine. Des exemples de produits riches en histidine incluent, sans y être limités, le thon et autres thonidés (tels que, par exemple, les bonites, les marlins et les espadons), le maquereau, la sardine et l'anchois.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le produit alimentaire est un produit frais, un produit cuit, un produit congelé, un produit emballé sous vide, un produit conditionné sous atmosphère modifiée (telle que, par exemple, une atmosphère comprenant 50% de N2 et 50% de C02), un produit fumé, un produit conditionné en boîte de conserve, un produit mariné ou un produit fermenté...
Selon un mode de réalisation, le produit alimentaire n'est pas un produit fermenté.
Selon un mode de réalisation, le produit alimentaire est du thon cuit conditionné sous- vide. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un produit alimentaire, de préférence d'un produit de la mer pour la consommation, de préférence la consommation humaine, ledit procédé de préparation comprenant une étape d'application sur le produit alimentaire d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant.
Selon un mode de réalisation, la souche de L. sakei, de préférence la souche L. sakei LHIS2885, la souche dérivée de LHIS2885, l'un de leurs fragments ou une composition les comprenant est appliquée sur le produit alimentaire avant emballage, de préférence juste avant l'emballage.
Selon un mode de réalisation, la souche de L. sakei, de préférence la souche L. sakei LHIS2885, la souche dérivée de LHIS2885, l'un de leurs fragments ou une composition les comprenant est ajoutée sur le produit alimentaire frais, avec ou sans emballage.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la souche de L. sakei, de préférence la souche L. sakei LHIS2885, une souche dérivée de LHIS2885, l'un de leurs fragments ou une composition les comprenant est appliquée sur le produit alimentaire après la cuisson dudit produit.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de l'invention comprend les étapes suivantes :
(a) cuisson du produit alimentaire ;
(b) application sur ledit produit alimentaire cuit d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant ; et
(c) emballage dudit produit alimentaire.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la souche de L. sakei, de préférence la souche L. sakei LHIS2885, une souche dérivée de LHIS2885, l'un de leurs fragments ou une composition les comprenant est appliquée sur le produit alimentaire avant le salage et/ou le fumage dudit produit.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de l'invention comprend les étapes suivantes :
(a) application sur le produit alimentaire d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant ;
(b) salage et/ou fumage dudit produit alimentaire ; et
(c) emballage dudit produit alimentaire. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la souche de L. sakei, de préférence la souche L. sakei LHIS2885, une souche dérivée de LHIS2885, l'un de leurs fragments ou une composition les comprenant est appliquée sur le produit alimentaire après le salage et/ou le fumage dudit produit.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de l'invention comprend les étapes suivantes :
(a) salage et/ou fumage du produit alimentaire ;
(b) application sur ledit produit alimentaire salé ou fumé d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant ; et
(c) emballage dudit produit alimentaire.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de l'invention comprend les étapes suivantes :
(a) application sur ledit produit alimentaire salé ou fumé d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de
LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant ;
(b) mise sous atmosphère protectrice dudit produit alimentaire ; et (c) emballage hermétique dudit produit alimentaire, de préférence par operculation.
Dans un mode de réalisation, ledit produit alimentaire est du thon, et l'atmosphère modifiée comprend de 30 à 70% de C02, de préférence de 40 à 60% de C02 ; de 10 à 70% d'02, de préférence de 15 à 60% d'02 et de 0 à 30% de N2, de préférence de 0 à 25% de N2. Selon un premier mode de réalisation, ledit produit alimentaire est du thon, et l'atmosphère modifiée comprend environ 40% de C02 et environ 60% d'02. Selon un second mode de réalisation, ledit produit alimentaire est du thon, et l'atmosphère modifiée comprend environ 60% de C02, environ 15% d'02 et environ 25% de N2. Dans un mode de réalisation, ledit produit alimentaire est du hareng ou de la sardine, et l'atmosphère modifiée comprend de 30 à 70% de C02, de préférence environ 60% de C02 ; et de 30 à 70% de N2, de préférence environ 40% de N2.
La présente invention concerne également un produit alimentaire, de préférence un produit de la mer, comprenant une souche de L. sakei, de préférence la souche L. sakei LHIS2885 de l'invention, une souche dérivée de LHIS2885, ou l'un de leurs fragments.
La souche L. sakei LHIS2885 selon l'invention présente les avantages suivants :
- la souche L. sakei LHIS2885 se développe dans les produits alimentaires, tels que, par exemple, les produits de la mer, notamment cuits, fumés ou conditionnés sous atmosphère contrôlée ou sous-vide, à une température variant d'environ 0 à environ 37 °C ;
- l'application de la souche L. sakei LHIS2885 sur un produit alimentaire, tel que, par exemple, un produit de la mer, contaminé par une bactérie histaminogène inhibe le développement de ladite souche histaminogène ;
- l'application de la souche L. sakei LHIS2885 sur un produit alimentaire, tel que, par exemple, un produit de la mer, contaminé par une bactérie histaminogène inhibe la production d'histamine ;
- l'application de la souche L. sakei LHIS2885 sur un produit alimentaire, tel que, par exemple, un produit de la mer, ne modifie pas de façon majeure les propriétés organoleptiques de ce produit. BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 est un histogramme montrant la croissance de M. pyschrotolerans seule (MP) ou en coculture avec Lactococcus piscium EU2258 (MP + EU2258) ou Lactobacillus sakei LHIS2885 (MP+LHIS2885) (MP) sur des longes de thon cuites conservées à 15°C sous-vide.
La Figure 2 est un histogramme montrant la production d'histamine par Morganella psychrotolerans seule (MP) ou en coculture avec Lactococcus piscium EU2258 (MP + EU2258) ou Lactobacillus sakei LHIS2885 (MP+LHIS2885) dans du thon cuit conservé à 15°C sous-vide. La Figure 3 est une combinaison de deux graphiques montrant (A) l'effet de la souche LHIS2885 de l'invention sur la croissance de M. morganii (Mm) sur du thon cuit conservé à 15°C sous vide, et (B) l'effet de la souche LHIS2885 de l'invention sur la production d'histamine.
La Figure 4 est un histogramme montrant la croissance de Morganella psychrotolerans en absence (Témoin Mp) ou présence (Essai Mp) de Lactobacillus sakei LHIS2885 à 4°C pendant 18 jours.
La Figure 5 est un histogramme montrant la croissance de Lactobacillus sakei en absence (témoin LHIS2885) ou présence (essai LHIS2885) de Morganella psychrotolerans à 4°C pendant 18 jours. La Figure 6 est un histogramme montrant la production d'histamine dans le thon cuit à 4°C par M. psychrotolerans en absence (témoin - Mp) ou présence de L. sakei (Essai - Mp/LHIS2885).
La Figure 7 est une combinaison de deux graphiques montrant l'effet de la souche LHIS2885 (Ls) de l'invention sur la bactérie Photobacterium phosphoreum (Pp) sur du thon cuit conservé à 15°C sous vide. (A) Effet de la souche LHIS2885 de l'invention sur la croissance de Photobacterium phosphoreum. (B) Effet de la souche LHIS2885 de l'invention sur la production d'histamine. La Figure 8 est un graphique montrant l'effet de la souche LHIS2885 de l'invention sur la croissance de la bactérie Photobacterium damselae sur du thon cuit conservé à 15°C sous vide.
EXEMPLES
La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants qui illustrent non-limitativement l'invention.
Cet exemple décrit le protocole ayant permis l'isolement et l'identification de la bactérie L. sakei LHIS2885 comme pouvant être utile pour la biopréservation des produits alimentaires tels que, par exemple, des produits de la mer, et plus particulièrement pour prévenir ou maîtriser la production d'histamine dans ces produits.
Isolement de bactéries lactiques sur des poissons riches en histidine Matériels et méthodes
Dans un premier temps, l'isolement de bactéries lactiques issues de chair de poissons riches en histidine a été réalisé. Des produits de la mer frais ou fumés (thon fumé, longe de thon frais, filet de sardine, filet de maquereau, maquereau entier ou hareng fumé) ont été conditionnés, puis incubés à 8°C pendant une (produits frais) ou deux (produits fumés) semaines, puis les bactéries lactiques ont été isolées de ces produits incubés.
Résultats
132 souches de bactéries Gram+ ont été isolées. Test d'inhibition sur boîtes de pétri
La capacité des 132 souches identifiées à inhiber in vitro la souche histaminogène Morganella psychrotolerans a ensuite été testée sur boîte de Pétri par la méthode de la double couche. Matériels et Méthodes
Le test d'inhibition est réalisé selon la méthode de Matamores et al. (2009). Les 132 bactéries lactiques sont mises en culture en bouillon dans du milieu BHI (2% NaCl) à 20°C pendant 24h ou 48h. Après ce temps de pré-culture, des spots de 10 μΐ de suspension bactérienne sont déposés sur le milieu Jus de thon (JT) (1,5% d'Agar). Après ensemencement, les boites de Pétri sont incubées à 15°C en anaérobiose pendant 10 jours. Au terme du temps d'incubation des bactéries lactiques, les tapis bactériens sont coulés sur les spots. La dilution adéquate pour le tapis bactérien est de l/100eme pour la souche psychrotolérante M. psychrotolerans. Les tapis bactériens sont réalisés dans le milieu JT. Les boites sont placées en aérobiose pendant 96 heures à 15°C. Elles sont observées à 36, 72 et 96h et les halos d'inhibitions sont mesurés.
Résultats
Sur les 132 souches bactériennes testées, 39 ont présenté une inhibition de la souche psychrotolérante M. psychrotolerans. Inhibition des bactéries histaminogènes Morganella psychrotolerans, Morganella morganii, Photobacterium phosphoreum et Photobacterium damselae par la bactérie LHIS2885 sur du thon cuit conservé sous-vide à 15°C
Six souches identifiées lors du test d'inhibition sur boîte de pétri, ainsi que six autres souches préalablement isolées de produits de la mer, ont ensuite été testées pour leur capacité à inhiber la bactérie M. psychrotolerans sur des longes de thon cuit.
Matériels et Méthodes
Bactéries : La souche de M. psychrotolerans provient de la collection de l'Institut Pasteur, son n° d'accession est CIP109403 . Elle est cultivée en bouillon BHI salé (2% NaCl) à 20°C pendant 24 h pour les expérimentations (environ 2.109 UFC/ml). Les douze souches de bactéries lactiques sont cultivées sur milieu MRS ou Elliker à
g
26°C pendant 24 h pour les expérimentations (concentration finale variant de 2.10 à 6.109 UFC/ml selon les souches).
Matrice alimentaire : Des longes de thon frais conditionnées sous-vide congelées ont été décongelées une nuit à 4°C dans une étuve. Les longes sont découpées en cubes de 2 cm3 et réparties dans un plateau préalablement nettoyé à l'alcool. Les cubes sont déposés dans des sacs à hauteur de 200 g puis scellés et conditionnés sous-vide. Le thon est cuit pendant 5 min dans de l'eau bouillante. La température à cœur finale du produit est de 81,2°C. Les cubes de thon sont refroidis dans une cellule de refroidissement rapide. Les produits sont conservés à 4°C s'ils sont utilisés le lendemain ou à -20°C si leur utilisation est reportée.
Méthode : a) Préparation de M. psychrotolerans : La préculture de M. psychrotolerans est diluée 6 fois successivement au l/10eme. La concentration obtenue est de 2.103 UFC/ml. b) Préparation des bactéries lactiques : Les précultures des bactéries lactiques sont
g
diluées (ou non) jusqu'à obtenir une concentration finale de 2.10 UFC/ml. c) Préparation des mélanges M. psychrotolerans - bactérie lactique : 10 ml de la préculture de M. psychrotolerans sont mélangés avec 10 ml de la préculture de bactérie lactique. Chaque bactérie lactique est testée séparément ce qui fait que 12 mélanges différents sont préparés. d) Ensemencement sur le thon : Le thon préalablement préparé est malaxé dans le sac de 200 g manuellement afin d'en faire une pâte homogène. A l'aide d'une cuillère stérile, la chair est répartie en sachets de 40 g de thon. L'inoculum de départ est fixé à 5% en volume par rapport à la masse totale de chair de thon (v/m). Le mélange M. psychrotolerans - bactérie lactique est préparé extemporanément et vortexé pendant 15 sec à vitesse maximale. 2 ml du mélange sont ajoutés à 40 g de thon à l'aide d'une pipette stérile de 2ml. Le témoin positif est ensemencé uniquement avec M. psychrotolerans, les 10 ml de bactérie lactique ayant été remplacés par 10 ml d'eau physiologique stérile. Le témoin de stérilité est constitué de thon non inoculé. Les concentrations bactériennes sur la matrice sont d'environ 50 UFC/g de M. psychrotolerans et au minimum 106 UFC/g de bactéries lactiques. e) Incubation : Les produits ensemencés sont mis sous vide puis congelés à -20°C pendant 48 h. Ils sont ensuite décongelés et conservés à 15°C pendant 8 jours. Analyse : Les produits sont analysés le jour-même (J0) puis à 24 (Jl), 48 (J2) heures, 4 jours (J4) et 8 jours (J8). M. psychrotolerans est spécifiquement dénombré sur le milieu VRBG à 20°C (48 h d'incubation). Les bactéries lactiques sont dénombrées soit sur MRS ou Elliker en anaérobiose à 20°C pendant 48 h. La production d'histamine est analysée après le dénombrement sur boites grâce au kit Veratox, selon les instructions du fabricant ou par HPLC. La dilution primaire du dénombrement (1/5) est utilisée pour effectuer ce test, un volume de 30 ml sont récupérés sur chaque échantillon et congelé à -20°C.
Toutes les expérimentations sont faites en duplicat. Résultats Deux souches de bactéries lactiques ont présenté des inhibitions de la production d'histamine ou de la croissance de M. psychrotolerans : EU2258 (Lactococcus piscium, préalablement isolée de grenadier sous atmosphère modifiée) et LHIS2885 (Lactobacillus sakei, isolée lors de cette étude d'échantillons de sardine).
Ces deux souches se développent efficacement sur le thon cuit, pour atteindre environ 9 log UFC/g en 8 jours.
A 24 h et 48 h de culture, une inhibition statistiquement significative d'environ 1 à 2 log UFC/g de M. psychrotolerans est visible pour les deux cocktails bactérie lactique / M. psychrotolerans. Par contre, à 4 jours d'incubation à 15°C, la bactérie Lactobacillus sakei LHIS2885 limite la croissance de M. psychrotolerans à 3 log UFC/g alors que le témoin se situe à 8 log UFC/g (différence statistiquement significative). A 8 jours d'incubation à 15°C, la bactérie Lactobacillus sakei LHIS2885 limite la croissance de M. psychrotolerans à 6 log UFC/g alors que le témoin se situe à 9 log UFC/g (différence statistiquement significative). La bactérie EU2258 ne semble pas avoir d'effet statistiquement significatif sur la croissance de M. psychrotolerans à partir de 4 jours (Figure 1).
L'effet des bactéries lactiques sur la production d' histamine a ensuite été mesuré avant décongélation, le jour de la décongélation (J0), puis 1, 2, 4 et 8 jours après décongélation (Jl, J2, J4 et J8, respectivement). Les résultats sont exprimés en mg/kg d'histamine et sont présentés sur la Figure 2.
Comme le montre la Figure 2, avant congélation, les produits contiennent tous moins de 50 mg/kg d'histamine. Le taux d'histamine reste constant après décongélation, et à 24h et 48h où il est toujours inférieur à 50 mg/kg. A 4 jours d'incubation, la quantité d'histamine augmente jusqu'à 3600 mg/kg d'histamine dans le témoin. Lactobacillus sakei LHIS2885 réduit la production d'histamine à 38 mg/kg (différence statistiquement significative). La bactérie lactique EU2258 réduit aussi la production d'histamine mais plus faiblement avec 1279 mg/kg (différence statistiquement significative).
A 8 jours d'incubation, cette inhibition de la production est encore bien marquée pour L. sakei LHIS2885 avec une quantité d'histamine de 245 mg/kg alors que le témoin est arrivé à une concentration de 8900 mg/kg (différence statistiquement significative). Pour la souche EU2258, la quantité d' aminé biogène est équivalente au témoin et se situe à 7425 mg/kg.
La bactérie lactique L. sakei LHIS2885 est donc capable d'inhiber la croissance de M. psychrotolerans et la production d'histamine par cette dernière, et ce jusqu'à 8 jours après décongélation du produit à 15°C.
Dans un second temps, le même type d'expérience a été réalisé avec la souche histaminogène M. morganii pour vérifier l'efficacité de la souche bio-protectrice Lactobacillus sakei, LHIS2885. Les résultats présentés Figure 3 montrent les effets de la souche LHIS2885 sur la croissance de M. morganii sur des échantillons de thon cuit (Figure 3A), ainsi que la production d'histamine dans ces mêmes échantillons (Figure 3B). Comme le montre la Figure 3, la souche LHIS2885 de l'invention permet également l'inhibition statistiquement significative de la croissance de M. morganii sur du thon cuit, ainsi que l'inhibition statistiquement significative de la production d'histamine des échantillons de thon cuit contaminés par la bactérie histaminogène M. morganii. Ces expériences ont ensuite été réalisées avec les souches histaminogènes Photobacterium phosphoreum et Photobacterium damselae. Les résultats présentés sur les Figures 7 et 8 montrent que la souche LHIS2885 inhibe la croissance de Photobacterium phosphoreum et Photobacterium damselae (respectivement) sur des échantillons de thon cuit. De plus, comme le montre la Figure 7, la souche LHIS2885 de l'invention permet également l'inhibition de la production d'histamine des échantillons de thon cuit contaminés par la bactérie histaminogène Photobacterium phosphoreum.
Inhibition de la bactérie histaminogène Morsanella psychrotolerans par la bactérie LHIS2885 sur du thon cuit en conserve conservé à 4°C
Matériel & méthodes Bactéries - millieux de culture et d'isolement : Les pré-cultures de la bactérie histaminogène Morganella psychrotolerans CIP 109403 ont été effectuées en milieu Brain Heart Broth salé à 2% (BHI salé 2%) à 20°C pendant 24h (concentration de 2.109 CFU/ml). Les pré-cultures de la bactérie L. sakei LHIS2885 ont été effectuées en bouillon Man, Rogosa and Sharpe (MRS) à 26°C pendant 24h (concentration de 1,29.109 CFU/ml).
Matrice alimentaire : Pour effectuer ces expérimentations, de la chair de thon albacore cuit en conserve a été choisie pour vérifier les capacités bioprotectrices de L. sakei LHIS2885 contre M. psychrotolerans CIP109403 . 25g de thon sont utilisés pour préparer chaque point d'analyse. 6 temps d'analyses et 3 lots de thon ont été analysés:
· Lot T : Témoin positif (thon ensemencé avec M. psychrotolerans CIP 109403 T ),
• Lot L : Témoin lactique (thon ensemencé avec LHIS2588),
• Lot E : Essai (LHIS2885 + CIP109403T). Les expérimentations ont été réalisées en triplicat. Méthode : a) Préparation des sachets : Les conserves de thon ont été ouvertes sous hotte à flux laminaire et le thon a été déposé dans un bac stérilisé à l'alcool puis mélangé. Le thon a ensuite été réparti en sachets de 25g, avec une spatule stérilisée à l'alcool. Ces sachets de thon ont ensuite été ensemencés et conservés sous vide. b) Préparation du témoin M. psychrotolerans pure : La préculture de M. psychrotolerans CIP109403 est diluée dans une solution de tryptone-sel à 0.85% pour obtenir une solution à 10 UFC/ml. Les sachets de thon sont ensuite ensemencés à 5% (v/m), soit 1,25 ml dans 25g de thon. Les sachets sont ensuite malaxés à la main pour homogénéiser la répartition dans la chair (concentration finale dans la chair 48 UFC/g). c) Préparation du lot Lactique (LHIS2885) et Essai (Mp+LHIS2885) : La préculture de L. sakei LHIS2885 est diluée dans une solution de tryptone-sel (TS) à 0.85% pour préparer l'ensemencement de la chair de thon. Pour le lot Lactique, une solution de L. sakei est préparée à 6,5.10 UFC/ml. Les sachets de thon sont ensemencés à 5% (v/m), soit 1,25 ml dans 25g de thon. Les sachets sont ensuite malaxés à la main pour homogénéiser la répartition dans la chair (concentration finale dans la chair 3,25.106 UFC/ml). Pour le lot Essai, une solution avec 103 UFC/ml de CIP109403T et 6,5.10' UFC/ml de LHIS2885 est préparée. Les sachets de thon sont ensuite ensemencés à 5% (v/m). Ils sont malaxés à la main pour homogénéiser la répartition dans la chair et obtenir une concentration finale de bactérie de 3,25.106UFC/g (LHIS2885) et 48 UFC/g (CIP109403T). d) Conditionnement et incubation des sachets : Une fois ensemencés, les sachets sont conditionnés sous vide. Ils sont mis au congélateur à -20°C pendant 48h (sauf les sachets à analyser avant congélation). Après ce laps de temps, les échantillons sont décongelés à 4°C et incubés à 4°C pendant 18 jours. e) Analyses Microbiologiques : Des prélèvements sont effectués à J0 après décongélation, à J4, J7, Jn et J14 et ½. A chaque temps d'analyse, 3 sachets de chaque lot ont été analysés. 20g de thon ont été prélevés stérilement et sont ensuite dilués au l/5e par ajout de 80 ml de milieu TS. Le contenu du sac est broyé au Stomacher à vitesse normale pendant 120 secondes.
Des prélèvements de la solution mère obtenue sont ensuite effectués : 15 ml de solution de thon broyé déposés dans un tube Falcon vide pour les analyses d' aminés biogènes par la méthode HPLC et 10 ml pour les dénombrements microbiologiques. A partir des 10ml de solution de thon broyé, des dilutions en cascade sont effectuées selon les concentrations supposées de bactéries. M. psychrotolerans CIP109403 est dénombré en profondeur sur milieu VRBG tandis que L. sakei LHIS2885 est dénombré sur milieu MRS en surface. Les milieux ont ensuite été incubés pendant 48h à 20°C pour le milieu VRBG et à 20°C en jarre anaérobiose pour le milieu MRS.
Aminés biogènes (HPLC) et pH : Le pH a été mesuré à partir du sac Stomacher de solution de thon broyé. Un pré-dosage avec le kit Neogen Veratox a été effectué sur 3 échantillons pour vérifier la concentration en histamine dans les produits à J4, J7, Jn - Les échantillons à J7, Jn et J14 ont été analysés par HPLC par dansylation des aminés biogènes.
Résultats
Les croissances de M. psychrotolerans et de L. sakei sont observables sur les Figures 4 et 5. La concentration initiale de M. psychrotolerans est inférieure à 1 log UFC/g (Figure 4), après 11 jours d'incubation, elle approche de 7 log UFC/g pour arriver à 18 jours à une concentration de 8,3 log UFC/g. En présence de L. sakei (Figure 4), la croissance de M. psychrotolerans est faiblement inhibée, la concentration initiale est inférieure à 1 log UFC/g, puis la croissance suit celle du témoin avec une inhibition maximale de 0,5 log UFC/g à J7, Jn , Ji4.
L. sakei se développe correctement dans le thon à 4°C (Figure 5), la concentration de départ est de 6,5 log UFC/g et augmente jusqu'à 9 log UFC/g après 11 jours d'incubation. A 14 et 18 jours on observe une baisse de sa concentration à 8.6 et 7,5 log UFC/g respectivement. Il n'y a pas de différence significative du taux initial et de la croissance de L. sakei entre le témoin et l'essai. L'évolution de la concentration en histamine dans les produits est décrite sur la Figure 6. La production d'histamine en présence de M. psychrotolerans s'initie à partir de 7 jours avec des concentrations inférieures à 50 mg/kg. Après 11 jours d'incubation la moyenne entre 3 échantillons indépendants est de 93 mg/kg, et après 18 jours la concentration est au-delà du seuil réglementaire et atteint une moyenne de 582 mg/kg. En présence de L. sakei, cette production d'histamine est limitée après 7 jours d'incubation (6 mg/kg de différence par rapport au témoin). Après 11 et 14 jours d'incubation, la concentration moyenne en histamine est de 23 et 249 mg/kg respectivement soit 75% et 57 % d'inhibition par rapport au témoin. La bactérie L. sakei permet de rester à un taux d'histamine inférieur à la norme américaine et européenne après 11 jours d'incubation et limite la production en très forte concentration à 14 jours.
Ces résultats démontrent que L. sakei LHIS2885 présente des capacités bio-protectrices intéressantes à 4°C, avec une réduction de la production d'histamine de 75% et 57 % après 11 et 14 jours d'incubation respectivement. Analyse sensorielle de thon cuit sous-vide en présence de M. psychrotolerans et de Lactobacillus sakei LHIS2885 conservé à 15°C
Nous avons ensuite analysé l'impact de l'ensemencement d'un produit de la mer par la bactérie L. sakei LHIS2885 sur les qualités sensorielles dudit produit.
Matériels et Méthodes Matière première : Les longes de thon Albacore proviennent de l'entreprise Cobreco à Douarnenez. Elles ont été récupérées sur la chaîne de découpe de l'usine après leur processus de décongélation/parage sur du thon entier congelé. Cette matière première a été préparée pour les tests selon les étapes ci-dessous :
- Décongélation du thon 1 nuit à 4°C,
- Découpe du thon et répartition en sachets de 200g,
- Conditionnement sous vide des sachets,
- Cuisson des sachets (70°C à cœur pendant 5 minutes) dans l'eau, - Refroidissement des sachets et entreposage à 4°C.
Préparation des échantillons : 10 lots d'échantillons ont été préparés afin de tester les modifications sensorielles apportées au produit par les souches pures et par les souches en cocktail.
- Lot 1 : Témoin (thon cuit)
- Lot 2 : Témoin + Morganella psychrotolerans (Mp)
- Lot 3 : Témoin + Lactococcus piscium : Lp (EU2258)
- Lot 4 : Témoin + Lactobacillus sakei : Ls (LHIS2885)
- Lot 5 : Essai Mp + Lp (EU2258)
- Lot 6 : Essai Mp + Ls (LHIS2885)
Les sachets ont été inoculés puis stockés selon le protocole décrit précédemment, dans les conditions suivantes :
- Pesée des sachets de 40g de thon cuit + ensemencement des sachets,
- Conditionnement sous vide des sachets,
- Congélation des sachets à -20°C pendant 48h,
- Décongélation des sachets à 8°C (sauf 4 sachets de Témoin dont 2 seront décongelés à J4 et 2 autres à J8, pour servir de référence au cours des tests sensoriels),
- Incubation des sachets à 15°C. Protocole d'analyse : Les produits sont analysés après 4 jours et 8 jours d'incubation. A chaque point, 2 sachets de chaque échantillon sont prélevés pour les tests sensoriels.
Les tests ont été réalisés par le jury interne d'analyse sensorielle de l'Ifremer de Nantes. Ce panel a une longue expérience des produits de la mer; il est sollicité une à deux fois par semaine pour tester des produits ou pour des séances d'entraînement. Un groupe de 9 personnes bien entraînées sur les odeurs d'altération des produits de la mer a participé à cette étude. Les séances d'évaluation sensorielle se déroulent dans une pièce climatisée, composée de 10 cabines individuelles de dégustation, éclairées par une lumière blanche standard (T = 6500°K) répondant aux spécifications de la norme AFNOR V-09-105 concernant les recommandations relatives à l'implantation des locaux destinés à l'analyse sensorielle. Un système informatique permet l'acquisition automatique des données (logiciel Fizz, Biosystèmes, Dijon) et leur traitement statistique.
Le contenu des 2 sachets de chaque échantillon est réparti dans 5 pots inodores en polystyrène munis d'un couvercle, soit environ 15 g de miettes par pot provenant pour moitié de chaque sachet. Les pots sont entreposés dans une étuve à 18°C pendant le déroulement de la séance. Chacune des 5 séries de 10 échantillons est sentie par 2 juges différents. Le témoin de référence, décongelé le matin du test, est proposé en même temps. Les échantillons sont présentés aux juges selon un plan équilibré pour éviter un biais dû à l'effet du 1er produit testé.
La séance se compose de 2 épreuves :
- un test de notation du niveau d'altération de l'odeur sur une échelle non structurée de 0 à 10. Il est précisé au panel qu'une note voisine de 6 est représentative d'une altération relativement forte. Cette valeur a été déterminée lors de précédents essais,
- un test de caractérisation par attributs. Une liste de 22 odeurs est proposée aux juges qui doivent sélectionner au moins une odeur : sardine, maquereau, thon, pâté, poisson gras, marine/iodée, laiteuse, pomme de terre, végétale, serpillière, saumure, fruitée, métallique, beurre/caramel, pyrrolidine/sperme, rance/huile de lin, aminée/urine, acide/piquante, aigre/fermentée, pied/fromage, chou/gaz, H2S/œuf. Résultats
Pour le test de caractérisation par attribut, le critère « aminée/urine » a été supprimé car très rarement cité. Des regroupements de fréquences de citation ont été effectués pour les 5 premiers descripteurs (poisson gras/thon), pour rance et végétal, pour aigre/fermenté et pied/fromage (aigre/fromage) et pour chou/gaz et H2S (soufrée). Les juges ayant cité de 1 à 5 descripteurs d'odeur par produit, le nombre de citations n'est pas toujours le même pour chaque échantillon. Aussi, la fréquence de citation, pour un produit et un critère d'odeur donné, a été calculée en prenant en compte le nombre de citations total pour le produit.
Les notes obtenues par les produits non ensemencés (témoin) ou les produits ensemencés par les souches pures sont présentées dans le Tableau 1 ci-dessous :
Tableau 1
Comme démontré dans le Tableau 1, le témoin évolue peu entre J4 et J8. En effet, le produit ayant été cuit et congelé, il est très peu contaminé quand débute l'entreposage à 15°C. Le produit ensemencé avec la souche M. psychrotolerans (Mp) est fortement altéré à J4 et n'évolue plus par la suite ; l'odeur est de type soufré (mélange de Diméthylsulfure et d'H2S). Dans le thon ensemencé par la souche EU2258 seule, l'odeur « thon » persiste mais la note « pyrrolidine » a été clairement détectée à J4 ; un peu moins à J8 car probablement masquée par les autres odeurs plus présentes. La pyrrolidine est une aminé cyclique dont l'odeur à l'état pur ressemble à celle de l'ammoniac, diluée elle évoque plutôt l'odeur du sperme ou de l'eau de javel. Enfin, le thon ensemencé par la souche LHIS2885 seule ne présente pas d'altération au cours du temps. Les notes obtenues par les produits ensemencés avec la souche M. psychrotolerans en mélange avec une bactérie lactique (EU2258 ou LHIS2885) sont présentées dans le Tableau 2 ci-dessous :
Tableau 2
Comme montré dans le Tableau 2, le produit ensemencé par les souches M. psychrotolerans (MP) et EU2258 présente une note soufrée; elle peut provenir de M. psychrotolerans ou de EU2258. Le thon est fortement altéré à J8. Par contre, le thon ensemencé avec M. psychrotolerans et LHIS2885 ne présente pas d'altération au cours du temps.
Ces résultats montrent que la souche Lactobacillus sakei LHIS2885 inhibe la croissance des bactéries histaminogène M. psychrotolerans et M. morganii, de 4 à 5 log UFC/g. L'inhibition la plus importante est observée après 4 jours d'incubation de thon cuit conditionné sous-vide à 15°C. La production d'histamine est inférieure à 50 ppm (le seuil retenu par la législation Européenne est de 100 ppm, celui retenu par la législation américaine est de 50 ppm) alors que dans des produits qui pourraient être naturellement contaminés la quantité d'histamine serait de 4000 ppm. Au niveau sensoriel, la souche Lactobacillus sakei LHIS2885 n'est pas altérante par elle même. La souche permet même de réduire l'altération du produit à 4 et 8 jours d'incubation. La souche Lactobacillus sakei LHIS2885 apporte donc des éléments intéressants pour avoir une meilleure maîtrise de la production d'histamine dans le thon et pour limiter l'altération du produit dans le temps.

Claims

REVENDICATIONS
1. Souche de Lactobacillus sakei appelée souche Lactobacillus sakei LHIS2885 et déposée à la CNCM sous le numéro CNCM 1-4704.
2. Souche dérivée de Lactobacillus sakei comprenant un génome présentant plus de 70% d'identité avec le génome de la souche selon la revendication 1.
3. Composition comprenant la souche bactérienne selon la revendication 1 ou 2 ou l'un de ses fragments.
4. Utilisation d'une souche selon la revendication 1 ou 2, ou d'une composition selon la revendication 3, pour la conservation de produits alimentaires, de préférence de produits de la mer.
5. Utilisation selon la revendication 4, dans laquelle la production d'histamine dans lesdits produits alimentaires est inhibée, de préférence dans laquelle la croissance de bactéries histaminogènes dans lesdits produits alimentaires est inhibée.
6. Utilisation selon la revendication 4 ou la revendication 5, dans laquelle les produits alimentaires sont des produits de la mer, de préférence des poissons, plus préférentiellement du thon, du maquereau, de la sardine ou du hareng.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, dans laquelle lesdits produits alimentaires sont des produits cuits, des produits frais, des produits congelés, des produits emballés sous vide, des produits conditionnés sous atmosphère modifiée, des produits fumés, des produits conditionnés en boîte de conserve, et/ou des produits marinés.
8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, dans laquelle on applique sur le produit alimentaire une quantité de bactéries variant d'environ 10 a environ 10 112" ufc de L. sakei LHIS2885 ou d'une souche dérivée / g de produit alimentaire.
9. Utilisation d'une souche de Lactobacillus sakei, de l'un de ses fragments ou d'une composition la comprenant pour la conservation de produits alimentaires non fermentés, de préférence de produits de la mer.
10. Utilisation selon la revendication 9, dans laquelle la production d'histamine dans lesdits produits alimentaires est inhibée, de préférence dans laquelle la croissance de bactéries histaminogènes dans lesdits produits alimentaires est inhibée.
11. Utilisation selon la revendication 9 ou la revendication 10, dans laquelle les produits alimentaires sont des produits de la mer, de préférence des poissons, plus préférentiellement du thon, du maquereau, de la sardine ou du hareng.
12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, dans laquelle lesdits produits alimentaires sont des produits cuits, des produits frais, des produits congelés, des produits emballés sous vide, des produits conditionnés sous atmosphère modifiée, des produits fumés, des produits conditionnés en boîte de conserve, et/ou des produits marinés.
13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, dans laquelle on applique sur le produit alimentaire une quantité de bactéries variant d'environ 10 à environ 10 12 ufc de L. sakei I g de produit alimentaire.
14. Procédé de préparation de produits alimentaires, de préférence de produits de la mer, comprenant une étape d'application sur lesdits produits d'une souche de L. sakei ou de l'un de ses fragments, telle que, par exemple, une souche de
L. sakei LHIS2885 selon la revendication 1, une souche dérivée de L. sakei LHIS2885 selon la revendication 2 ou l'un de leurs fragments.
15. Produit alimentaire, de préférence produit de la mer, comprenant une souche de L. sakei ou l'un de ses fragments, telle que, par exemple, une souche de L. sakei LHIS2885 selon la revendication 1, une souche dérivée de L. sakei LHIS2885 selon la revendication 2 ou l'un de leurs fragments.
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