EP2912190A1 - Methode zur spezifischen isolation von nukleinsäuren - Google Patents

Methode zur spezifischen isolation von nukleinsäuren

Info

Publication number
EP2912190A1
EP2912190A1 EP13780364.9A EP13780364A EP2912190A1 EP 2912190 A1 EP2912190 A1 EP 2912190A1 EP 13780364 A EP13780364 A EP 13780364A EP 2912190 A1 EP2912190 A1 EP 2912190A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
dna
prokaryotic
binding
affinity material
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP13780364.9A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Dirk Kuhlmeier
Natalia SANDETSKAYA
Andreas Naumann
Katharina HENNIG
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV filed Critical Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Publication of EP2912190A1 publication Critical patent/EP2912190A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/533—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving isomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/24—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a MBP (maltose binding protein)-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y599/00—Other isomerases (5.99)
    • C12Y599/01—Other isomerases (5.99.1)
    • C12Y599/01003—DNA topoisomerase (ATP-hydrolysing) (5.99.1.3)

Definitions

  • the present invention relates to an affinity material for separating and / or enriching prokaryotic DNA comprising a carrier and a protein bound thereto.
  • the present invention further relates to a kit for the enrichment and / or separation of prokaryotic DNA comprising such an affinity material, a method for separating and / or enriching prokaryotic DNA and the use of the affinity material, the kit and / or the method in the field of molecular diagnostics and environmental and food analysis.
  • the isolation of prokaryotic DNA is of great importance in many areas of analysis and diagnostics. So z. B. the isolation of pathogenic DNA to detect a u. U. life-threatening infection a major challenge in molecular diagnostics. Pathogenic bacteria can develop undesirable effects even at low concentrations, but they often have to be elaborately cultured and subsequently characterized for reliable detection. In the process, valuable time is lost for the affected patient in which effective therapy can not begin.
  • the invention aims at a method for the effective purification of bacterial nucleic acids from liquid sample media such. As blood, sputum or aqueous solutions, which is not only aimed at medical applications. In the field of food analysis, too, methods are required that enable as sensitive a detection of a bacterial contamination as possible. Here again, time-consuming intermediate steps for cultivating the bacteria are often necessary for reliable detection, which leads to a long period of the analysis process and to high costs.
  • a particularly sensitive detection of bacteria is achieved by amplifying bacterial DNA by means of the polymerase chain reaction. It should be noted, however, that the sensitivity and safety of the detection strongly depends on the ratio of the bacterial target nucleic acid to the background DNA.
  • FIG. 1 shows the detection of bacterial DNA in the presence (1) and in the absence (2) of background human nucleic acid.
  • the latter total DNA was spiked from 1 mL whole blood spiked with 10 6 cells E. coli, while (2) was generated in each case only from an aqueous E. coli solution with 10 6 cells.
  • Fig. 1 A shows an analysis and detection by means of the agarose gel electrophoresis
  • Fig. 1B is a real-time PCR the LightCycler ® System (Roche) shows. In both cases, the presence of the human nucleic acid generated a marked disruption of the amplification reaction.
  • a high concentration of z. B. human DNA (“background DNA”) leads to a significantly negative impact on the sensitivity It is therefore necessary to isolate the bacterial DNA as completely as possible before performing the polymerase chain reaction to separate off interfering contaminants or background DNA.
  • the silica matrix can be applied to particles (eg magnetic) or as column material. Isolation procedures usually proceed according to the following scheme: a) cell lysis in the presence of chaotropic salts and proteinase (degradation of protein) and subsequent centrifugation to separate the cell residues b) application to a column containing silica material which interacts with the nucleic acid.
  • the DNA adsorbs to the surface while other cell components are removed.
  • the elution of the nucleic acid takes place after one or more washing steps by adding water or low-salt buffer.
  • This method of isolating nucleic acids from samples by binding the DNA to silica materials is shown schematically in FIG.
  • FIG. 3 shows schematically the procedure of such a method for the isolation of DNA by silica materials in a mini column.
  • this method of isolating nucleic acids from samples by affinity of DNA to silica materials has numerous disadvantages.
  • the column materials used are usually associated with high costs.
  • these methods require many manual steps that bind personnel and time consuming.
  • these methods result in the purification of total DNA, which may contain an excess of non-relevant DNA.
  • the isolated bacterial DNA will usually be heavily contaminated with human DNA. The sensitivity of the detection of the bacterial DNA by a subsequent polymerase chain reaction can thereby be significantly reduced.
  • An example of a method of reducing non-bacterial DNA involves the selective lysis of human cells with subsequent targeted degradation of the human DNA. Such a method is shown schematically in FIG.
  • FIG. 4 schematically shows the procedure of a method for isolating bacterial nucleic acids from blood samples by targeted reduction of the human DNA.
  • the providers distribute application kits for the targeted depletion of human nucleic acid by lysis of the leukocytes.
  • the released DNA is selectively degraded, leaving the bacterial cells intact. This is followed by sedimentation of the bacteria with subsequent lysis of the bacterial cells to isolate the bacterial DNA.
  • a disadvantage of this method is the complexity of the process, which makes the process time-consuming and labor-intensive. In addition, these methods are also associated with high costs.
  • WO 2005/085440 A1 describes a process for the separation of prokaryotic DNA by means of a protein which binds non-methylated CpG motifs containing DNA-specific.
  • the property of prokaryotic DNA is exploited by occurrence of non-methylated CpG motifs (cytidine-phosphate-guanosine dinucleotides) (Hartmann G et al., 2001, Manuals ⁇ videblatt, vol. 98 / 15: A981-A985 (2001) to distinguish from eukaryotic DNA.
  • these motifs are unmethylated, whereas in eukaryotic cells they are mostly methylated.
  • a protein is used in this method which specifically binds unmethylated CpG motifs to a DNA.
  • the protein hCpGBP human CpG binding protein
  • the protein hCpGBP is immobilized on Sepharose or similar matrices and incubated with the lysate of blood and potential pathogens.
  • this method is associated with numerous disadvantages.
  • this method shows only a weak accumulation of bacterial DNA, since with the protein hCpGBP Although more bacterial DNA is bound, but it also comes to a significant binding of more methylated human DNA.
  • the specificity of the separation process is quite weak, which negatively affects the safety and sensitivity of subsequent detection of the bacterial DNA.
  • the method described in WO 2005/085440 Al is quite expensive.
  • the present invention was based on the object to provide a material and a method which allows the separation and / or accumulation of prokaryotic DNA from a sample. Compared to the previously known materials and methods, a high degree of enrichment should be achieved with as few work steps and the lowest possible cost.
  • an affinity material comprising a carrier and a protein bound thereto, wherein the protein comprises the DNA-binding subunit of a bacterial topoisomerase.
  • the protein comprises the subunit A of the topoisomerase II.
  • the invention takes advantage of the properties of the protein topoisomerase II (gyrase), which occurs only in prokaryotes.
  • the DNA-binding domain of gyrase A is used to selectively isolate bacterial nucleic acid from a mixture of highly complex DNA.
  • gyrase A protein topoisomerase II
  • Topoisomerases have a significant influence on the structure of the macromolecule DNA.
  • Topoisomerase II is an enzyme in the group of topoisomerases, which is ubiquitous and can loosen and loosen helix turns of double-stranded DNA strands (Source: Wikipedia).
  • Bacterial gyrase is the only enzyme that can induce negative supercoiling of a (circular) DNA molecule by consuming ATP.
  • the protein consists of two subunits A and B, which have different functionalities: GyrA has an active DNA binding site, while GyrB catalyzes the actual reaction of strand breakage and targeted rejoining under ATP consumption.
  • the subunit gyrase A which can specifically bind to various bacterial sequences.
  • the use of this protein allows, after cell lysis and release of the total DNA, a selective binding of the bacterial DNA, which can thus be concentrated.
  • human DNA which is naturally present in many body samples, is only bound to a very limited extent.
  • the carrier used in the context of the present invention is not subject to any restriction. However, particularly good results are achieved when the carrier is formed as magnetic particles, dextran, crosslinked polymers such as agarose and / or membrane. In the context of the present invention, the carrier is particularly preferably magnetic particles.
  • the protein can be bound to the carrier both by covalent binding and / or by non-covalent interaction, in particular in the form of protein-protein interactions and / or protein-polysaccharide interactions. It is particularly advantageous if the protein used according to the invention contains, in addition to the DNA-binding domain of a bacterial topoisomerase, another protein constituent which, for example, facilitates purification and / or improves the solubility of the protein.
  • the protein used according to the invention is a fusion protein which comprises the DNA-binding subunit of a bacterial topoisomerase and an affinity tag.
  • the protein comprises a bacterial topoisomerase II subunit A fusion protein and a maltose binding protein.
  • Fig. 5 shows a schematic representation of the immobilization strategy.
  • Protein A covalently binds to the magnetic particles by forming a peptide bond (MagPrep P-25 carboxy, Merck, Darmstadt). This protein fixes highly anti-MBP antibody via the Fv fragment of the antigen binding site
  • Fab region specifically immobilizes the fusion protein from GyrA and MBP.
  • the GyrA is thus freely presented on the surface of the magnetic particle to specifically capture bacterial nucleic acid.
  • the direct binding of the fusion protein to the surface of the magnetic particle is also possible in principle in order to minimize the effort of the immobilization strategy.
  • the protein comprises a fusion protein from subunit A of the bacterial topoisomerase II and a maltose-binding protein which has the amino acid sequence according to SEQ ID NO. 1 has:
  • the protein is designed as a fusion protein having an amino acid sequence homology of> 60%, particularly preferably> 80%, in particular> 90% with the amino acid sequence according to SEQ ID NO. 1 has.
  • sequence homology is to be understood as meaning in particular the percentage of the identity of the amino acid sequences when comparing two sequences.
  • the protein is therefore designed as a fusion protein having a sequence identity of> 60%, particularly preferably> 80%, in particular> 90% with the amino acid sequence according to SEQ ID NO. 1 has.
  • the genetic information of the bacterial GyrA DNA binding subunit was cloned in and the protein expressed in £ .co //.
  • the N-terminal fused maltose binding protein (MBP) was used to effectively purify the fusion protein.
  • EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assays
  • the DNA of both organisms could be specifically purified, even in the presence of human nucleic acid and then amplified. It has been shown that the expression of the protein used according to the invention as fusion protein with the maltose binding protein improves the solubility of the expressed protein and therefore facilitates the purification of the expressed protein.
  • the invention also relates to a kit comprising the affinity material according to the invention.
  • the kit comprises means for amplifying the enriched / separated prokaryotic DNA, in particular in the form of primers for carrying out a polymerase chain reaction.
  • kits according to the invention may also comprise further constituents, such as, for example, means for lysing the cells and for releasing the total DNA.
  • the present invention also relates to a method of separating and / or enriching prokaryotic DNA comprising the steps of: a) contacting at least one prokaryotic DNA in solution with a binding agent comprising the DNA-binding domain of a bacterial topoisomerase, b) separating the bound to the binding agent prokaryotic DNA.
  • the separation and / or enrichment of prokaryotic DNA succeeds in high selectivity, even in the presence of high amounts of foreign DNA in the sample.
  • the method of the invention is such that the binding agent is in the form of an affinity material comprising a carrier material and a protein bound thereto comprising the DNA-binding subunit of a bacterial topoisomerase.
  • the method according to the invention is designed such that the protein comprises the subunit A of the bacterial topoisomerase II.
  • the method according to the invention is preferably designed so that the protein is bound to the carrier by covalent bonding and / or by noncovalent interaction, in particular in the form of protein-protein interactions and / or protein-polysaccharide interactions.
  • the method of the invention is such that the protein is a fusion protein comprising a DNA-binding subunit of a bacterial topoisomerase and an affinity tag.
  • the protein comprises a bacterial topoisomerase II subunit A fusion protein and a maltose binding protein.
  • the protein comprises a fusion protein from the subunit A of the bacterial topoisomerase II and a maltose-binding protein which has the amino acid sequence according to SEQ ID NO. 1 has:
  • the protein is designed as a fusion protein having an amino acid sequence homology of> 60%, particularly preferably> 80%, in particular> 90% with the amino acid sequence according to SEQ ID NO. 1 has.
  • sequence homology is to be understood as meaning in particular the percentage of the identity of the amino acid sequences when comparing two sequences.
  • the protein is therefore designed as a fusion protein having a sequence identity of> 60%, particularly preferably> 80%, in particular> 90% with the amino acid sequence according to SEQ ID NO. 1 has.
  • the method according to the invention is suitable for analyzing a large number of samples which are to be examined for the presence of bacteria.
  • a body fluid is used as the sample fluid, in particular in the form of blood, serum, plasma, cell preparations of blood and / or sputum.
  • the inventive method is by no means limited to all applications of medical diagnostics.
  • the method is used such that a liquid is used as the sample liquid, which represents an environmental or food sample and / or one from a sample derived therefrom.
  • the inventive method is particularly suitable for the purification of bacterial DNA from a sample that is heavily contaminated with foreign DNA of genomic origin.
  • the prokaration bound to the binding material takes place.
  • ryotic DNA a step c, in which the prokaryotic DNA is subjected to an amplification, in particular by polymerase chain reaction. This sequence of steps allows extremely sensitive and safe detection even of small amounts of bacterial DNA in a sample.
  • the present invention also relates to the use of the affinity material or kit or method according to the invention for the detection of pathogenic bacteria for diagnostic purposes.
  • the present invention relates to the use of an affinity material or kit or method according to the invention for detecting a bacterial contamination in a foodstuff.
  • the material and method according to the invention has numerous surprising advantages over the prior art.
  • the affinity material according to the invention has an extremely high specificity for bacterial DNA in the presence of foreign DNA.
  • the binding of contaminating human DNA to the affinity material according to the invention is very low, so that an extremely high enrichment of the bacterial DNA is possible in a simple manner.
  • the high specificity extends both to the bacterial DNA of gram negative and gram positive bacteria.
  • a further advantage is that there is a high degree of flexibility with respect to the carrier material, as a result of which the material and method according to the invention can be used in a versatile and flexible manner.
  • the affinity material of the present invention is easy and inexpensive to produce, and enables a process for separating and / or accumulating prokaryotic DNA, which can be carried out quickly and in a few steps.
  • Example 1 The invention described is explained in more detail below with reference to examples: Example 1:
  • the C - terminal domain of the gyrase A subunit of E. coli (gyrA - CTD) was PCR amplified with the primer pair gyrA BamWIfw / gyrA Stop HindIII rev.
  • the template used for the PCR was the vector pMK90, which encodes the complete gyrase A subunit [Mizuuchi et al., 1984].
  • the amplicon was cloned into the pGEM-T vector for capture and excised for recloning with BamW I and Hind III.
  • the target vector pMAL-C2x was likewise linearized with the abovementioned restriction enzymes and subsequently dephosphorylated.
  • the gyrA CTD fragment was finally ligated into the reading frame of the malE gene. The correct cloning was checked by sequencing.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside solution induced.
  • the culture was cooled to 4 ° C and centrifuged down in the 50 ml reaction tube (20 min, 4600 rpm, 4 ° C). The pellet was then resuspended in 20 ml Column Buffer A (100 mM HEPES (pH 7.5), 90 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 1 mM TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine), 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride)) while constantly chilling on ice.
  • the digestion was carried out with short ultrasound pulses (10 s) for 6 min.
  • the cell residues were separated by centrifugation (30 min, 4600 rpm, 4 ° C.) and the supernatant was transferred to a 50 ml reaction vessel.
  • the target protein was finally eluted from the matrix with 2 x 2 ml of column buffer A + 10 mM maltose.
  • the elution fractions were dialyzed against 4 mM HEPES (pH 7.5) for 72 h before further use at 4 ° C. Storage took place at 4 ° C. Control of purification steps and purity was checked by SDS - PAGE.
  • Figure 6 shows a DNA-protein interaction analysis using an EMSA (5% polyacrylamide gel stained with ethidium bromide).
  • the proteins GyrA-MBP and MBP were investigated with specific oligonucleotides (56 bp, 0.25 pmol). The quantities of each protein used are indicated: A - 2.5 pmol, B-10 pmol, C-25 pmol.
  • the protein sequence of the construct is as follows:
  • 650 ⁇ g of protein A magnetic particles (eg MyOne, 1.05pm, Invitrogen) were magnetically separated and the buffer supernatant discarded.
  • the particles were coated with an anti-MBP monoclonal antibody (e.g., New England Biolabs) by resuspending in 200 ⁇ l solution ((1:46) in PBS / Tween 20) and incubating for 10 minutes at room temperature. The particles were then washed once each with PBS / Tween 20 and gyrA binding buffer (10 mM HEPES (pH 7.5);
  • Example 3 Isolation of S. aureus and E. coli DNA from buffer samples with the GyrA-MBP functionalized magnetic particles
  • GBBT buffer (10mM HEPES, 50mM KCl, 4mM MgCl 2, 1mM DTT, 0.05% Tween 20, pH 7.5) became bacterial at different concentrations (0.00005ng to 0.5ng) Spiked genomic DNA.
  • 20 pg of human DNA was added to simulate DNA samples extracted from infected biological material.
  • 200 ⁇ g of GyrA-coated beads were added to the sample and incubated for 30 min at 37 ° C with continuous shaking. The beads were washed three times with 10 mM Tris-HCl pH 8.5 and resuspended in 9 ⁇ l of water. For DNA isolation, the beads were heated to 95 ° C for 10 min.
  • Fig. 7 shows agarose gel electrophoresis (1.5% gel stained with ethidium bromide) of the PCR product after carrying out the binding assay without (control) and with pro- (E. coli; S. aureus) and eukaryotic (human), genomic DNA (gDNA).
  • M Marker (GeneRuler Low Range DNA Ladder, Fermentase); A: performed binding assay with the respective gDNA; R: reference, PCR of the respective gDNA as positive control; +: added components; -: component not included;
  • the DNA fragments were amplified using the respective primers of the gDNA to be detected: E. coli 16S rRNA (353 bp, Gram neg primer (E. coli), DG74), S. aureus 16S rRNA (215 bp, 16S_Stau_95-110_F, 16S_Stau_284 -300_R), hGAPDH (240 bp; hGAPDH_neu_fw, hGAPDH_neu_rev).
  • E. coli 16S rRNA (353 bp, Gram neg primer (E. coli), DG74
  • S. aureus 16S rRNA (215 bp, 16S_Stau_95-110_F, 16S_Stau_284 -300_R
  • hGAPDH 240 bp; hGAPDH_neu_fw, hGAPDH_neu_rev).
  • Figure 8 shows a plot of the efficiency of isolation of DNA from Staphylococcus aureus from spiked buffer solutions using GyrA beads (Magnetic Particles: MagPrep®-P25 carboxy, 025 nm, Merck, Darmstadt).
  • Figure 9 shows isolation and detection of increasing levels of DNA from Staphylococcus aureus.
  • Test solutions 1 to 3 each contained 20 pg of human DNA and were spiked with: (1) 0.5 ng, (2) 0.05 ng and (3) 0.005 ng of S.aureus DNA.
  • M DNA length marker
  • K + positive PCR control (0.005 ng S. aureus DNA).
  • Literature

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Affinitätsmaterial, umfassend einen Träger und ein daran gebundenes Affinitätsprotein sowie einen Kit, der ein solches Affinitätsmaterial umfasst. Beschrieben wird ferner ein Verfahren zum Abtrennen und/oder Anreichern von prokaryotischer DNA sowie die Verwendung des Affinitätsmaterials zum Nachweis pathogener Bakterien oder zum Nachweis einer bakteriellen Kontamination.

Description

Methode zur spezifischen Isolation von Nukleinsäuren
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Affinitätsmaterial zum Abtrennen und/oder Anreichern prokaryotischer DNA, das einen Träger und ein daran gebundenes Protein umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Kit zur Anreicherung und/oder Trennung prokaryotischer DNA, der ein solches Affinitätsmaterial umfasst, ein Verfahren zum Abtrennen und/oder Anreichern von prokaryotischer DNA sowie die Verwendung des Affinitätsmaterials, des Kits und/oder des Verfahrens auf dem Gebiet der molekularen Diagnostik und der Umwelt- und Lebensmittelanalyse.
Die Isolierung von prokaryotischer DNA ist in vielen Bereichen der Analyse und Diagnostik von großer Bedeutung. So ist z. B. die Isolation pathogener DNA zum Nachweis einer u. U. lebensbedrohlichen Infektion eine wesentliche Herausforderung in der molekularen Diagnostik. Pathogene Bakterien können bereits in niedrigen Konzentrationen unerwünschte Wirkung entfalten, müssen jedoch zum sicheren Nachweis häufig aufwändig kultiviert und anschließend charakterisiert werden. Dabei verstreicht für den betroffenen Patienten wertvolle Zeit, in der keine effektive Therapie ansetzen kann. Die Erfindung zielt auf ein Verfahren zur effektiven Aufreinigung bakterieller Nukleinsäuren aus flüssigen Probenmedien wie z. B. Blut, Sputum oder wässrigen Lösungen, das nicht nur auf medizinische Applikationen zielt. Auch im Bereich der Lebensmittelanalytik sind Verfahren gefragt, die einen möglichst empfindlichen Nachweis einer bakteriellen Kontamination ermöglichen. Auch hier sind zu einem sicheren Nachweis häufig aufwändige Zwischenschritte zur Kultivierung der Bakterien notwendig, was zu einer langen Zeitdauer des Analyseverfahrens und zu hohen Kosten führt.
Ein besonders empfindlicher Nachweis von Bakterien gelingt durch Amplifizierung bakterieller DNA mittels der Polymerase-Kettenreaktion. Hierbei ist jedoch zu beachten, dass die Empfindlichkeit und Sicherheit des Nachweises stark vom Verhältnis der bakteriellen Zielnukleinsäure zu der Hintergrund-DNA abhängt.
Dies wird durch die Fig. 1 verdeutlicht. Fig. 1 zeigt den Nachweis bakterieller DNA in Gegenwart (1) und in Abwesenheit (2) humaner Hintergrund-Nukleinsäure. Letztere Gesamt- DNA wurde aus 1 mL Vollblut gespikt mit 106 Zellen E.coli isoliert, während (2) jeweils nur aus einer wässrigen E.coli-Lösung mit 106 Zellen generiert wurde. Fig. 1 A zeigt eine Analyse und Detektion mittels der Agaraose-Gelelektrophorese, während Fig. 1 B eine Realtime-PCR des Lightcyclers®-Systems (Roche) zeigt. In beiden Fällen generierte die Anwesenheit der humanen Nukleinsäure eine deutliche Störung der Amplifikationsreaktion. Während im Gelbild zumindest eine undeutliche, spezifische Produktbande für die Bakterien-DNA sichtbar war, gelang über das fluoreszenz-optische Verfahren der Realtime-PCR keine klare Analyse: Das Signal der Kurve 1 in Fig. 1 B basierte auf einer unspezifischen Produktbildung, die keinen Rückschluß auf die baktrielle DNA zuließ.
Eine hohe Konzentration an z. B. humaner DNA („Hintergrund-DNA") führt zu einer deutlich negativen Beeinflussung der Sensitivität. Es ist daher notwendig, die bakterielle DNA vor Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion möglichst vollständig zu isolieren, um störende Kontaminationen oder Hintergrund-DNA abzutrennen.
Zur Isolierung von bakterieller DNA aus einer Probe stehen im Stand der Technik verschiedene Verfahren zur Verfügung :
Zur Isolation von Nukleinsäuren aus Proben wird die Affinität von DNA zu Silica- Materialien ausgenutzt. Die Silica-Matrix kann dabei an Partikel (z. B. magnetische) oder als Säulenmaterial appliziert werden. Die Verfahren zur Isolation laufen üblicherweise nach dem folgenden Schema ab: a) Zelllyse in Gegenwart chaotroper Salze und Proteinase (Abbau von Protein) und nachfolgender Zentrifugation zum Abtrennen der Zellreste b) Aufbringen auf eine Säule, die Silica-Material enthält, das mit der Nukleinsäure wechselwirkt. Die DNA adsorbiert an der Oberfläche, während andere Zellbestandteile entfernt werden. Die Elution der Nukleinsäure erfolgt nach einem oder mehreren Waschschritten durch Zugabe von Wasser oder Niedrigsalz-Puffer.
Dieses Verfahren zur Isolation von Nukleinsäuren aus Proben durch Bindung der DNA an Silica-Materialien wird in Fig. 2 schematisch gezeigt.
In der Praxis erfordern diese Verfahren recht viele manuelle Handlungsschritte. Um den Verfahrensablauf zu erleichtern werden für diese Verfahren oftmals so genannte Minisäulen eingesetzt. Fig. 3 zeigt schematisch den Ablauf eines solchen Verfahrens zur Isolierung von DNA durch Silica-Materialien in einer Minisäule.
Nach Aufreinigung der Gesamt-Nukleinsäure durch diese Silica-Materialien erfolgt typischerweise ein Amplifikationsschritt, mit dessen Hilfe geringe Konzentrationen an bakterieller DNA, wie z. B. bei der Detektion von bakteriellen Kontaminanten im humanen Blut, nachgewiesen werden können. Es hat sich jedoch gezeigt, dass das Vorliegen zahlreicher Kontaminationen insbesondere in Form von Fremd-DNA die Nachweisgrenze bei diesem Verfahren deutlich beeinflusst (Handschur M, Kar- lic H, Hertel C, Pfeilstöcker M, Haslberger AG. Preanalytic removal of human DNA eliminates false Signals in general 16S rDNA PCR monitoring of bacterial patho- gens in blood. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2009 May; 32 (3) : 207-19. Epub 2008 Feb 7; Peters RP, van Agtmael MA, DNAer SA, Savelkoul PH, Vanden- broucke-Grauls CM. New developments in the diagnosis of bloodstream infections. Lancet Infect Dis. 2004 Dec; 4 (12) : 751-60).
Somit ist dieses Verfahren zur Isolation von Nukleinsäuren aus Proben durch Affinität der DNA zu Silica-Materialien mit zahlreichen Nachteilen verbunden. So sind die eingesetzten Säulenmaterialien in der Regel mit hohen Kosten verbunden. Außerdem erfordern diese Verfahren viele manuelle Schritte, die Personal binden und zeitintensiv sind. Darüber hinaus führen diese Verfahren zur Aufreinigung von Gesamt-DNA, die einen Überschuss an nichtrelevanter DNA enthalten kann. So wird beispielsweise bei Gewinnung der Probe aus einer Körperflüssigkeit die isolierte bakterielle DNA in der Regel sehr stark mit humaner DNA kontaminiert sein. Die Sensitivität des Nachweises der bakteriellen DNA durch eine anschließende Polymerase-Kettenreaktion kann dadurch deutlich verringert werden.
Um das Problem der störenden Fremd-DNA zu lösen, werden im Stand der Technik einige Verfahren vorgeschlagen. Dabei werden einerseits Verfahren beschrieben, bei denen eine Reduktion der Fremd-DNA erfolgen soll und andererseits Verfahren, bei denen eine Anreicherung der bakteriellen DNA erfolgen soll.
Ein Beispiel eines Verfahrens zur Reduktion der nichtbakteriellen DNA beinhaltet die selektive Lyse humaner Zellen mit anschließendem gezieltem Abbau der humanen DNA. Ein solches Verfahren ist schematisch in Fig. 4 gezeigt.
Fig. 4 zeigt schematisch den Arbeitsablauf eines Verfahrens zur Isolation bakterieller Nukleinsäuren aus Blutproben durch gezielte Reduktion der humanen DNA. Die Anbieter vertreiben Applikationskits zur gezielten Abreicherung humaner Nukleinsäure durch Lyse der Leukozyten. Die freigesetzte DNA wird gezielt degradiert, wobei die bakteriellen Zellen intakt bleiben. Anschließend erfolgt eine Se- dimentierung der Bakterien mit anschließender Lyse der bakteriellen Zellen zur Isolierung der bakteriellen DNA.
Nachteilig an diesem Verfahren ist die Komplexität des Ablaufs, was das Verfahren zeit- und arbeitsaufwändig macht. Darüber hinaus sind diese Verfahren auch mit hohen Kosten verbunden.
In der WO 2005/085440 AI wird ein Verfahren zur Abtrennung von prokaryoti- scher DNA mittels eines Proteins beschrieben, das nicht-methylierte CpG-Motive enthaltende DNA-spezifisch bindet. In dem in der WO 2005/085440 AI beschriebenen Verfahren wird die Eigenschaft prokaryotischer DNA genutzt, sich durch Vorkommen nicht-methylierter CpG-Motive (Cytidin-Phosphat-Guanosin- Dinukleotide) (Hartmann G et al., 2001, Deutsches Ärzteblatt Jg. 98/15: A981- A985 (2001) von eukaryotischer DNA zu unterscheiden. In prokaryotischer DNA sind diese Motive nicht-methyliert, wohingegen sie in eu- karyotischen Zellen zum größten Teil methyliert sind. Zur Anreicherung von bakterieller DNA wird bei diesem Verfahren ein Protein eingesetzt, das nicht- methylierte CpG-Motive einer DNA spezifisch bindet. Das Protein hCpGBP (humanes CpG-bindendes Protein) wird dazu an Sepharose oder ähnlichen Matrices immobilisiert und mit dem Lysat aus Blut und potentiellen Pathogenen inkubiert.
Auch dieses Verfahren ist jedoch mit zahlreichen Nachteilen verbunden. So zeigt dieses Verfahren lediglich eine schwache Anreicherung der bakteriellen DNA, da mit dem Protein hCpGBP zwar vermehrt bakterielle DNA gebunden wird, es jedoch auch noch zu einer signifikanten Bindung der stärker methylierten humanen DNA kommt. Somit ist die Spezifität des Trennungsverfahrens recht schwach, was sich negativ auf die Sicherheit und Empfindlichkeit eines anschließenden Nachweises der bakteriellen DNA auswirkt. Darüber hinaus ist das in der WO 2005/085440 AI beschriebene Verfahren recht kostenintensiv.
Vor dem Hintergrund dieses Standes der Technik lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zu Grunde, ein Material und ein Verfahren bereitzustellen, das die Abtrennung und/oder Anreicherung prokaryotischer DNA aus einer Probe erlaubt. Gegenüber den bisher bekannten Materialien und Verfahren soll dabei ein hoher Anreicherungsgrad mit möglichst wenigen Arbeitsschritten und möglichst geringen Kosten erreicht werden.
Die erwähnte Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Affinitätsmaterial, umfassend einen Träger und ein daran gebundenes Protein, wobei das Protein die DNA-bindende Untereinheit einer bakteriellen Topoisomerase umfasst.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass ein solches Affinitätsmaterial eine außerordentlich spezifische Abtrennung von bakterieller DNA in einer Probe insbesondere auch bei Vorliegen großer Mengen von Fremd-DNA ermöglicht.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Protein die Untereinheit A der Topoisomerase II.
Die Erfindung macht sich die Eigenschaften des Proteins Topoisomerase II (Gyra- se) zu Nutze, das lediglich in Prokaryoten vorkommt. Die DNA-bindende Domäne der Gyrase A wird verwendet, um gezielt bakterielle Nukleinsäure aus einem Gemisch hochkomplexer DNA zu isolieren. Damit kann ein generelles Prinzip etabliert werden, um ein breites Spektrum verschiedener DNA reversibel zu binden und für weitere Prozesse/Analysen zur Verfügung zu stellen.
Topoisomerasen haben einen wesentlichen Einfluss auf die Struktur des Makromoleküls DNA. Die Topoisomerase II ist ein Enzym aus der Gruppe der Topoisomerasen, das ubiquitär vorkommt und Helix-Windungen von doppelsträngigen DNA-Strängen auflockern und lösen kann (Quelle: Wikipedia). Die bakterielle Gyrase ist das einzige Enzym, das unter Verbrauch von ATP auch negatives Super- coiling eines (ringförmigen) DNA-Moleküls induzieren kann. Das Protein besteht aus zwei Untereinheiten A und B, die verschiedene Funktionalitäten haben : GyrA besitzt eine aktive DNA-Bindungsstelle, während GyrB die eigentliche Reaktion des Strangbruchs und der gezielten Wiederverknüpfung unter ATP-Verbrauch katalysiert.
Besonders bevorzugt wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Untereinheit Gyrase A eingesetzt, die gezielt an verschiedene bakterielle Sequenzen binden kann. Der Einsatz dieses Proteins ermöglicht nach Zelllyse und Freisetzung der Gesamt-DNA eine selektive Bindung der bakteriellen DNA, die somit aufkonzentriert werden kann. Dadurch wird insbesondere humane DNA, die naturgemäß in vielen Körperproben vorliegt, nur in sehr geringem Umfang gebunden.
Grundsätzlich unterliegt der im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzte Träger keiner Beschränkung. Besonders gute Ergebnisse werden jedoch erzielt, wenn der Träger als magnetische Partikel, Dextran, quervernetzte Polymere wie Agarose und/oder Membran ausgebildet ist. Besonders bevorzugt handelt es sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung bei dem Träger um magnetische Partikel.
Es sind zahlreiche Möglichkeiten bekannt, Proteine an Trägermaterialien zu binden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann das Protein sowohl durch kova- lente Bindung und/oder durch nichtkovalente Wechselwirkung, insbesondere in Form von Protein-Protein-Wechselwirkungen und/oder Protein-Polysaccharid- Wechselwirkungen, an den Träger gebunden sein. Besonders vorteilhaft ist es, wenn das erfindungsgemäß eingesetzte Protein neben der DNA-bindenden Domäne einer bakteriellen Topoisomerase noch einen weiteren Proteinbestandteil enthält, der beispielsweise die Aufreinigung erleichtern und/oder die Löslichkeit des Proteins verbessern kann.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäß eingesetzte Protein daher ein Fusions-Protein, das die DNA-bindende Untereinheit einer bakteriellen Topoisomerase und ein Affinitäts-Tag umfasst.
Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn das Protein ein Fusions-Protein aus der Untereinheit A der bakteriellen Topoisomerase II und ein Maltosebindendes Protein umfasst.
Fig. 5 zeigt eine prinzipielle Darstellung der Immobilisierungsstrategie. Protein A bindet kovalent über Ausbildung einer Peptidbindung an den Magnetpartikel (MagPrep P-25 carboxy, Merck, Darmstadt). Dieses Protein fixiert hochaffin einen anti-MBP-Antikörper, der über das Fv-Fragment der Antigenbindungsstelle
(Fab-Region) spezifisch das Fusionsprotein aus GyrA und MBP immobilisiert. Die GyrA wird damit frei auf der Oberfläche des Magnetpartikels präsentiert, um gezielt bakterielle Nukleinsäure zu fangen. Die direkte Bindung des Fusionsproteins an die Oberfläche des Magnetpartikels ist ebenso prinzipiell möglich, um den Aufwand der Immobilisierungsstrategie zu minimieren.
Es hat sich gezeigt, dass besonders gute Ergebniss erzielt werden, wenn das Protein ein Fusions-Protein aus der Untereinheit A der bakteriellen Topoisomerase II und ein Maltose-bindendes Protein umfasst, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aufweist:
10 20 30 40 50 60
MKIEEGKLVI WINGDKGYNG LAEVGKKFEK DTGIKVTVEH PDKLEEKFPQ VAATGDGPDI
70 80 90 100 110 120
IFWAHDRFGG YAQSGLLAEI TPDKAFQDKL YPFTWDAVRY NGKLIAYPIA VEALSLIYNK
130 140 150 160 170 180
DLLPNPPKTW EEIPALDKEL KAKGKSALMF NLQEPYFTWP LIAADGGYAF KYENGKYDIK
190 200 210 220 230 240
DVGVDNAGAK AGLTFLVDLI KNKHMNADTD YS IAEAAFNK GETAMTINGP WAWSNIDTSK
250 260 270 280 290 300
VNYGVTVLPT FKGQPSKPFV GVLSAGINAA SPNKELAKEF LENYLLTDEG LEAVNKDKPL
310 320 330 340 350 360
GAVALKSYEE ELAKDPRIAA TMENAQKGEI MPNIPQMSAF WYAVRTAVIN AASGRQTVDE
370 380 390 400 410 420
ALKDAQTNSS SNNNNNNNNN NLGRIKEEDF IDRLLVANTH DHILCFSSRG RVYSMKVYQL 430 440 450 460 470 480
PEATRGARGR PIVNLLPLEQ DERITAILPV TEFEEGVKVF MATANGTVKK TVLTEFNRLR
490 500 510 520 530 540
TAGKVAIKLV DGDELIGVDL TSGEDEVMLF SAEGKVVRFK ESSVRAMGCN TTGVRGIRLG
550 560 570 580 590 600
EGDKVVSLIV PRGDGAILTA TQNGYGKRTA VAEYPTKSRA TKGVISIKVT ERNGLVVGAV
610 620 630 640 650 660
QVDDCDQIMM ITDAGTLVRT RVSEISIVGR NTQGVILIRT AEDENWGLQ RVAEPVDEED
670 680
LDTIDGSAAE GDDEIAPEVD VDDEPEEE*
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Affinitätsmaterials ist das Protein als Fusions-Protein ausgestaltet, das eine Aminosäuresequenzhomologie von > 60 %, besonders bevorzugt > 80 %, insbesondere > 90 % mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aufweist.
Unter Sequenzhomologie soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere der prozentuale Anteil der Identität der Aminosäuresequenzen bei Vergleich von zwei Sequenzen verstanden werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Affinitätsmaterials ist das Protein daher als Fusions-Protein ausgestaltet, das eine Sequenzidentität von > 60%, besonders bevorzugt > 80 %, insbesondere > 90 % mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aufweist.
Um das erfindungsgemäße Affinitätsmaterial herzustellen, wurde die genetische Information der bakteriellen GyrA DNA-bindenden Untereinheit in kloniert und das Protein in £.co// exprimiert. Das N-terminal fusionierte Maltose-bindende Protein (MBP) wurde zur effektiven Aufreinigung des Fusionproteins benutzt. In modifizierten Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) konnte die prinzipielle Bindung von DNA an das produzierte GyrA-MBP-Konstrukt nachgewiesen werden.
Zum Nachweis der spezifischen Bindung von £.co// (gram negativ) sowie Staphy- lococcus aureus (gram positiv) Nukleinsäure an das MBP-GyrA-Fusionsprotein wurden magnetische Partikel mit dem Fängerprotein funktionalisiert und mit DNA inkubiert.
Die DNA beider Organismen konnte gezielt, selbst in Gegenwart humaner Nukleinsäure aufgereinigt und anschließend amplifiziert werden. Es hat sich gezeigt, dass die Expression des erfindungsgemäß eingesetzten Proteins als Fusionsprotein mit dem maltosebindenden Protein die Löslichkeit des ex- primierten Proteins verbessert und daher die Aufreinigung des exprimierten Proteins erleichtert.
Die Erfindung betrifft auch einen Kit, der das erfindungsgemäße Affinitätsmaterial umfasst.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst der Kit Mittel zur Amplifizierung der angereicherten/abgetrennten prokaryotischen DNA, insbesondere in Form von Primern zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion.
Darüber hinaus kann ein erfindungsgemäßer Kit auch weitere Bestandteile, wie beispielsweise Mittel zur Lyse der Zellen und zur Freisetzung der Gesamt-DNA umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Abtrennen und/oder Anreichern von prokaryotischer DNA, umfassend die Schritte: a) In-Kontakt-Bringen mindestens einer in Lösung befindlichen prokaryotischen DNA mit einem Bindungsmittel, das die DNA-bindende Domäne einer bakteriellen Topoisomerase umfasst, b) Separieren der an das Bindungsmittel gebundenen prokaryotischen DNA.
Durch ein solches Verfahren gelingt das Abtrennen und/oder Anreichern von pro- karyoter DNA in hoher Selektivität, auch bei Vorliegen hoher Mengen von Fremd- DNA in der Probe.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren so ausgebildet, dass das Bindungsmittel in Form eines Affinitätsmaterials vorliegt, umfassend ein Trägermaterial und ein daran gebundenes Protein, das die DNA- bindende Untereinheit einer bakteriellen Topoisomerase umfasst. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren so ausgebildet, dass das Protein die Untereinheit A der bakteriellen Topoiso- merase II umfasst.
Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn das erfindungsgemäße Verfahren so ausgebildet ist, dass als Träger magnetische Partikel, Sepharose und/oder Dextran eingesetzt werden. Es hat sich gezeigt, dass besonders gute Ergebnisse erzielt werden, wenn als Träger magnetische Partikel eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise so ausgebildet, dass das Protein durch kovalente Bindung und/oder durch nichtkovalente Wechselwirkung, insbesondere in Form von Protein-Protein-Wechselwirkungen und/oder Protein- Polysaccharid-Wechselwirkungen an den Träger gebunden ist.
Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Verfahren so ausgebildet, dass das Protein ein Fusions-Protein ist, das eine DNA-bindende Untereinheit einer bakteriellen Topoisomerase und ein Affinitäts-Tag umfasst.
Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn das Protein ein Fusions-Protein aus der Untereinheit A der bakteriellen Topoisomerase II und ein Maltosebindendes Protein umfasst.
Es hat sich gezeigt, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders gute Ergebniss erzielt werden, wenn das Protein ein Fusions-Protein aus der Untereinheit A der bakteriellen Topoisomerase II und ein Maltose-bindendes Protein umfasst, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aufweist:
10 20 30 40 50 60
MKIEEGKLVI WINGDKGYNG LAEVGKKFEK DTGIKVTVEH PDKLEEKFPQ VAATGDGPDI
70 80 90 100 110 120
IFWAHDRFGG YAQSGLLAEI TPDKAFQDKL YPFTWDAVRY NGKLIAYPIA VEALSLIYNK
130 140 150 160 170 180
DLLPNPPKTW EEIPALDKEL KAKGKSALMF NLQEPYFTWP LIAADGGYAF KYENGKYDIK
190 200 210 220 230 240
DVGVDNAGAK AGLTFLVDLI KNKHMNADTD YS IAEAAFNK GETAMTINGP WAWSNIDTSK
250 260 270 280 290 300
VNYGVTVLPT FKGQPSKPFV GVLSAGINAA SPNKELAKEF LENYLLTDEG LEAVNKDKPL
310 320 330 340 350 360
GAVALKSYEE ELAKDPRIAA TMENAQKGEI MPNIPQMSAF WYAVRTAVIN AASGRQTVDE
370 380 390 400 410 420
ALKDAQTNSS SNNNNNNNNN NLGRIKEEDF IDRLLVANTH DHILCFSSRG RVYSMKVYQL
430 440 450 460 470 480
PEATRGARGR PIVNLLPLEQ DERITAILPV TEFEEGVKVF MATANGTVKK TVLTEFNRLR 490 500 510 520 530 540
TAGKVAIKLV DGDELIGVDL TSGEDEVMLF SAEGKVVRFK ESSVRAMGCN TTGVRGIRLG
550 560 570 580 590 600
EGDKVVSLIV PRGDGAILTA TQNGYGKRTA VAEYPTKSRA TKGVISIKVT ERNGLVVGAV
610 620 630 640 650 660
QVDDCDQIMM ITDAGTLVRT RVSEISIVGR NTQGVILIRT AEDENWGLQ RVAEPVDEED
670 680
LDTIDGSAAE GDDEIAPEVD VDDEPEEE*
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Protein als Fusions-Protein ausgestaltet, das eine Aminosäuresequenzhomologie von > 60 %, besonders bevorzugt > 80 %, insbesondere > 90 % mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aufweist.
Unter Sequenzhomologie soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere der prozentuale Anteil der Identität der Aminosäuresequenzen bei Vergleich von zwei Sequenzen verstanden werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Protein daher als Fusions- Protein ausgestaltet, das eine Sequenzidentität von > 60%, besonders bevorzugt > 80 %, insbesondere > 90 % mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aufweist.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Analyse einer großen Vielzahl von Proben, die auf das Vorliegen von Bakterien untersucht werden sollen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird als Probenflüssigkeit eine Körperflüssigkeit eingesetzt wird, insbesondere in Form von Blut, Serum, Plasma, Zellpräparationen aus Blut und/oder Sputum.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist aber keineswegs auf alle Anwendungen der medizinischen Diagnostik beschränkt. In einer alternativen Ausführungsform wird das Verfahren so eingesetzt, dass als Probenflüssigkeit eine Flüssigkeit eingesetzt wird, die eine Umwelt- oder Lebensmittelprobe darstellt und/oder eine aus einer daraus abgeleiteten Probe.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Aufreinigung bakterieller DNA aus einer Probe, die stark mit Fremd-DNA genomischen Ursprungs kontaminiert ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt dann nach dem Schritt der Separation der an das Bindungsmaterial gebundenen proka- ryotischen DNA ein Schritt c, bei dem die prokaryotische DNA eine Amplifizierung, insbesondere durch Polymerase-Kettenreaktion, unterworfen wird. Diese Abfolge von Verfahrensschritten ermöglicht einen außerordentlich empfindlichen und sicheren Nachweis auch geringer Mengen von bakterieller DNA in einer Probe.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Affinitätsmaterials bzw. Kits bzw. Verfahrens zum Nachweis pathogener Bakterien zu diagnostischen Zwecken.
In einer alternativen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Affinitätsmaterials bzw. Kits bzw. Verfahrens zum Nachweis einer bakteriellen Kontamination in einem Lebensmittel.
Das erfindungsgemäße Material und Verfahren weist gegenüber dem Stand der Technik zahlreiche überraschende Vorteile auf.
Insbesondere hat sich gezeigt, dass das erfindungsgemäße Affinitätsmaterial eine außerordentlich hohe Spezifität für bakterielle DNA bei Vorliegen von Fremd-DNA aufweist. Insbesondere ist die Bindung von kontaminierender humaner DNA an das erfindungsgemäße Affinitätsmaterial sehr gering, so dass in einfacher Weise eine außerordentlich hohe Anreicherung der bakteriellen DNA möglich ist. Die hohe Spezifität erstreckt sich dabei sowohl auf die bakterielle DNA von gram negativen als auch von gram positiven Bakterien. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass eine hohe Flexibilität in Bezug auf das Trägermaterial besteht, wodurch das erfindungsgemäße Material und Verfahren vielseitig und flexibel anwendbar wird. Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Affinitätsmaterial leicht und kostengünstig zu produzieren und ermöglicht ein Verfahren zur Abtrennung und/oder Anreicherung prokaryotischer DNA, das schnell und in wenigen Schritten durchführbar ist.
Die beschriebene Erfindung wird im Folgenden anhand von Beispielen noch näher erläutert: Beispiel 1:
Expression und Aufreinigung des Fusions-Proteins GyrA-MBP Expression des Fusions-proteins GyrA-MBP
Die C - terminale Domäne der Gyrase A - Untereinheit von E. co// (gyrA - CTD) wurde mit dem Primerpaar gyrA BamW I fw/ gyrA Stop Hind ill rev mittels PCR amplifiziert. Als Matrize für die PCR diente der Vektor pMK90, welcher die komplette Gyrase A - Untereinheit kodiert [Mizuuchi et al., 1984]. Das Amplikon wurde zur Sicherung in den pGEM - T - Vektor kloniert und zur Umklonierung mit BamW I und Hind lll herausgeschnitten. Der Zielvektor pMAL - C2x wurde ebenfalls mit den genannten Restriktionsenzymen linearisiert und anschließend dephosphoryliert. Das gyrA - CTD - Fragment wurde zum Abschluss in den Leserahmen des malE - Gens ligiert. Die korrekte Klonierung wurde durch Sequenzierung überprüft.
Aufreinigung des Fusions-proteins GyrA-MBP
Initial wurden 400 ml LB/ Amp/ Glucose (0,2 %) - Medium mit 5 ml einer Starterkultur des Transformanten angeimpft. Diese Kultur wurde bis zur OD60o = 0,6 im Erlenmeyerkolben im Schüttelinkubator angezogen (37 °C; 240 U/ min). Die Proteinexpression wurde dann durch Zugabe von 450 μΙ einer 100 mM
IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) - Lösung induziert. Vier Stunden post Induktion wurde die Kultur auf 4 °C herabgekühlt und im 50 ml - Reaktionsgefäß herab zentrifugiert (20 min; 4600 U/ min; 4 °C). Das Pellet wurde nun in 20 ml Säulenpuffer A (100 mM HEPES (pH 7,5); 90 mM KCl; 1 mM MgCI2, 1 mM TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin), 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid)) resuspendiert und dabei ständig auf Eis gekühlt. Der Aufschluss wurde mit kurzen Ultraschallimpulsen (10 s) für 6 min durchgeführt. Die Zellreste wurden durch Zent- rifugation (30 min; 4600 U/ min; 4°C) abgetrennt und der Überstand in ein 50 ml - Reaktionsgefäß überführt.
In Vorbereitung zur Aufreinigung wurde 1 ml Amylosematrix auf eine Chromatographiesäule geladen und mit 16 ml Säulenpuffer A equilibriert. Der Überstand wurde anschließend auf die Säule gegeben und mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/ min per Gravitation über Amylosematrix geleitet. Im Anschluss wurde die Säule mit Säulenpuffer A + 0,2 M NaCI (4 x 3 ml) gewaschen.
Das Zielprotein wurde zum Abschluss mit 2 x 2 ml Säulenpuffer A+ 10 mM Maltose von der Matrix eluiert. Die Elutionsfraktionen wurden vor der weiteren Verwendung gegen 10 mM HEPES (pH 7,5) für 72 h bei 4°C dialysiert. Die Lagerung erfolgte bei 4°C. Die Kontrolle der Aufreinigungsschritte und Reinheit wurde mittels SDS - PAGE überprüft.
Fig. 6 zeigt eine DNA-Protein-Interaktions-Analyse unter Durchführung eines EMSA (5 %iges Polyacrylamidgel, angefärbt mit Ethidiumbromid). Untersucht wurden die Proteine GyrA-MBP und MBP mit spezifischen Oligonukleotiden (56 bp, 0,25 pmol). Angegeben sind die Stoffmengen des jeweils eingesetzten Proteins: A - 2,5 pmol, B-10 pmol, C-25 pmol.
Wie der Fig. 6 klar zu entnehmen ist, kommt es zu einer starken Bindung des Fusionsproteins GyrA-MBP an die eingesetzten spezifischen Oligonukleotide.
Die Proteinsequenz des Konstrukts ist wie folgt:
MBP - gyrA (688 AS; Mw =75,15 kDa); theoretischer pl 4,87)
10 20 30 40 50 60
MKIEEGKLVI WINGDKGYNG LAEVGKKFEK DTGIKVTVEH PDKLEEKFPQ VAATGDGPDI
70 80 90 100 110 120
IFWAHDRFGG YAQSGLLAEI TPDKAFQDKL YPFTWDAVRY NGKLIAYPIA VEALSLIYNK
130 140 150 160 170 180
DLLPNPPKTW EEIPALDKEL KAKGKSALMF NLQEPYFTWP LIAADGGYAF KYENGKYDIK
190 200 210 220 230 240
DVGVDNAGAK AGLTFLVDLI KNKHMNADTD YS IAEAAFNK GETAMTINGP WAWSNIDTSK
250 260 270 280 290 300
VNYGVTVLPT FKGQPSKPFV GVLSAGINAA SPNKELAKEF LENYLLTDEG LEAVNKDKPL
310 320 330 340 350 360
GAVALKSYEE ELAKDPRIAA TMENAQKGEI MPNIPQMSAF WYAVRTAVIN AASGRQTVDE
370 380 390 400 410 420
ALKDAQTNSS SNNNNNNNNN NLGRIKEEDF IDRLLVANTH DHILCFSSRG RVYSMKVYQL
430 440 450 460 470 480
PEATRGARGR PIVNLLPLEQ DERITAILPV TEFEEGVKVF MATANGTVKK TVLTEFNRLR
490 500 510 520 530 540
TAGKVAIKLV DGDELIGVDL TSGEDEVMLF SAEGKVVRFK ESSVRAMGCN TTGVRGIRLG
550 560 570 580 590 600
EGDKVVSLIV PRGDGAILTA TQNGYGKRTA VAEYPTKSRA TKGVISIKVT ERNGLVVGAV
610 620 630 640 650 660
QVDDCDQIMM ITDAGTLVRT RVSEISIVGR NTQGVILIRT AEDENWGLQ RVAEPVDEED
670 680
LDTIDGSAAE GDDEIAPEVD VDDEPEEE* Beispiel 2: Herstellung von GyrA-MBP funktionalisierten magnetischen Partikeln
650 Mg Protein A - Magnetpartikel (z. B. MyOne , 1.05pm, Invitrogen) wurden magnetisch separiert und der Pufferüberstand verworfen. Die Partikel wurden mit einem monoklonalen anti-MBP-Antikörper (z. B. New England Biolabs) beschichtet, indem sie in 200 μΙ Lösung ( (1 :46) in PBS/ Tween 20) resuspendiert und für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Im Anschluss wurden die Partikel je einmal mit PBS/ Tween 20 und gyrA - Bindepuffer (10 mM HEPES (pH 7,5);
50 mM KCl, 4 mM MgCI2; 1 mM DTT) gewaschen und nach Abschluss in 40 μΙ gyrA - Bindepuffer resuspendiert.
Zum prinzipiellen Aufbau des Konstruktes wird nochmals auf die Fig. 5 verwiesen.
Beispiel 3: Isolierung von S. Aureus und E. coli DNA aus Pufferproben mit den mit GyrA-MBP funktionalisierten magnetischen Partikeln
200 μΙ GBBT-Puffer (10 mM HEPES, 50 mM KCl, 4 mM MgCI2, 1 mM DTT, 0,05% Tween 20, pH 7,5) wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen (0,00005 ng bis 0,5 ng) bakterieller genomischer DNA gespikt. Modellhaft wurden 20 pg humane DNA zugesetzt, um DNA-Proben zu simulieren, die aus infiziertem biologischem Material extrahiert wurden. 200 pg GyrA-beschichtete Beads wurden zu der Probe gegeben und für 30 min bei 37 ° C unter ständigem Schütteln inkubiert. Die Beads wurden drei Mal mit 10 mM Tris-HCI pH 8,5 gewaschen und in 9 pl Wasser resuspendiert. Zur DNA-Isolation wurden die Beads für 10min auf 95°C erhitzt.
Fig. 7 zeigt eine Agarosegelelektrophorese (1,5 %iges Gel, angefärbt mit Ethidiumbromid) des PCR-Produkts nach Durchführung des Bindeassays ohne (Kontrolle) und mit pro- (E. coli; S.aureus) und eukaryotischer (Human), genomischer DNA (gDNA).
M: Marker (GeneRuler Low Range DNA Ladder, Fermentas); A: Durchgeführtes Bindeas- say mit der jeweiligen gDNA; R: Referenz, PCR der jeweiligen gDNA als Positivkontrolle; + : zugegebene Komponenten; -: Komponente nicht enthalten;
Amplifiziert wurden die DNA-Fragmente unter Nutzung der jeweiligen Primer der nachzuweisenden gDNA: E. coli 16S rRNA (353 bp; Gram neg Primer(E. coli), DG74), S. aureus 16S rRNA (215 bp; 16S_Stau_95-110_F, 16S_Stau_284-300_R), hGAPDH ( 240 bp; hGAPDH_neu_fw, hGAPDH_neu_rev).
Fig. 8 zeigt eine graphische Auftragung der Effizienz der Isolation von DNA aus Staphylococcus aureus aus gespikten Pufferlösungen mit Hilfe von GyrA-Beads (Magnetische Partikel : MagPrep®-P25 carboxy, 025 nm, Merck, Darmstadt).
Fig. 9 zeigt Isolation und Nachweis steigender Konzentrationen an DNA aus Staphylococcus aureus. Die Testlösungen 1 bis 3 enthielten jeweils 20 pg humaner DNA und waren gespikt mit: (1) 0,5 ng, (2) 0,05 ng und (3) 0,005 ng S.aureus DNA. (M): DNA-Längenmarker; K+ : positive PCR Kontrolle (0,005 ng S.aureus DNA). Literatur:
Mizuuchi, K., Mizuuchi, M., O'Dea, M. H. und Geliert, M. (1984). Cloning and sim- plified purification of Escherichia coli DNA gyrase A and B proteins. J. B o/. Chem. 259 (14) : 9199 - 201.

Claims

Patentansprüche
1. Affinitätsmaterial, umfassend einen Träger und ein daran gebundenes Protein,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et, dass
das Protein die DNA-bindende Domäne einer prokaryotischen
Topoisomerase umfasst.
2. Affinitätsmaterial gemäß Anspruch 1,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et, dass
das Protein die Untereinheit A der prokaryotischen Topoisomerase II umfasst.
3. Affinitätsmaterial gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 oder 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et, dass
der Träger in Form von magnetischen Partikeln, Membranen, Sepharose und/oder Dextran ausgebildet ist.
4. Affinitätsmaterial gemäß mindestens einem der vorhergehenden
Ansprüche,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et, dass
das Protein durch kovalente Bindung und/oder durch nichtkovalente Wechselwirkung, insbesondere in Form von Protein-Protein- Wechselwirkungen und/oder Protein-Polysaccharid-Wechselwirkungen, an den Träger gebunden ist.
5. Affinitätsmaterial gemäß mindestens einem der vorhergehenden
Ansprüche,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et, dass
das Protein ein Fusions-Protein ist, das die DNA-bindende Domäne einer prokaryotischen Topoisomerase und ein Affinitäts-Tag umfasst.
6. Affinitätsmaterial gemäß mindestens einem der vorhergehenden
Ansprüche,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et, dass das Protein ein Fusions-Protein aus der Untereinheit A der prokaryotischen Topoisomerase II und ein Maltose-bindendes Protein umfasst.
7. Affinitätsmaterial gemäß mindestens einem der vorhergehenden
Ansprüche,
d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et, dass
das Protein eine Sequenzhomologie von > 60 %, insbesondere > 80 %, insbesondere > 90 % mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aufweist, besonders bevorzugt, dass das Protein die Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aufweist.
8. Kit zur Anreicherung und/oder Trennung prokaryotischer DNA, umfassend ein Affinitätsmaterial gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-7.
9. Kit gemäß Anspruch 8,
d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et, dass
der Kit Mittel zur Amplifizierung der angereicherten/getrennten
prokaryotischen DNA, insbesondere in Form von Primern zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion, umfasst.
10. Verfahren zum Abtrennen und/oder Anreichern von prokaryotischer DNA, umfassend die Schritte: a) In-Kontakt-Bringen mindestens einer in Lösung befindlichen
prokaryotischen DNA mit einem Bindungsmittel, das die DNA-bindende Untereinheit einer prokaryotischen Topoisomerase umfasst, b) Separieren der an das Bindungsmittel gebundenen prokaryotischen DNA.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10,
d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et, dass
das Bindungsmittel in Form eines Affinitätsmaterials vorliegt, umfassend einen Träger und ein daran gebundenes Protein, das die DNA-bindende Untereinheit einer prokaryotischen Topoisomerase umfasst.
12. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 und 11,
d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et, dass
das Protein die Untereinheit A der prokaryotischen Topoisomerase II umfasst.
13. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 10-12,
d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et, dass
als Träger magnetische Partikel, Membranen, Sepharose und/oder Dextran eingesetzt werden.
14. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 10-13,
d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et, dass
das Protein durch kovalente Bindung und/oder durch nichtkovalente Wechselwirkung, insbesondere in Form von Protein-Protein- Wechselwirkungen und/oder Protein-Polysaccharid-Wechselwirkungen an den Träger gebunden ist.
15. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 10-14,
d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et, dass
das Protein ein Fusions-Protein ist, das eine DNA-bindende Untereinheit einer prokaryotischen Topoisomerase und ein Affinitäts-Tag umfasst.
16. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 10-15,
d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et, dass
das Protein ein Fusions-Protein aus der Untereinheit A der prokaryotischen Topoisomerase II und einem Maltose-bindenden Protein umfasst.
17. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 10-16,
d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et, dass
als Probenflüssigkeit eine Körperflüssigkeit und/oder eine von einer Körperflüssigkeit abgeleitete Flüssigkeit eingesetzt wird, insbesondere in Form von Blut, Serum, Plasma, Zellpräparationen aus Blut und/oder Sputum.
18. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 10-16,
d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et, dass als Probenflüssigkeit eine Flüssigkeit eingesetzt wird, die eine
Lebensmittel- oder Umweltprobe darstellt und/oder eine daraus abgeleitete Probe.
19. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 10-18,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et, dass
nach dem Schritt der Separation der an das Bindungsmaterial gebundenen prokaryotischen DNA ein Schritt c erfolgt, bei dem die prokaryotische DNA eine Amplifizierung, insbesondere durch Polymerase-Kettenreaktion, unterworfen wird.
20. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-19,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et, dass
das Protein eine Sequenzhomologie von > 60 %, insbesondere > 80 %, insbesondere > 90 % mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aufweist, besonders bevorzugt, dass das Protein die Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aufweist.
21. Verwendung eines Affinitätsmaterials gemäß mindestens einem der
Ansprüche 1-6 und/oder eines Kits gemäß mindestens einem der
Ansprüche 9-10 und/oder eines Verfahrens gemäß mindestens einem der Ansprüche 11-20 zum Nachweis pathogener Bakterien zu diagnostischen Zwecken.
22. Verwendung eines Affinitätsmaterials gemäß mindestens einem der
Ansprüche 1-6 und/oder eines Kits gemäß mindestens einem der
Ansprüche 9-10 und/oder eines Verfahrens gemäß mindestens einem der Ansprüche 11-20 zum Nachweis einer bakteriellen Kontamination in einem Lebensmittel.
EP13780364.9A 2012-10-25 2013-10-24 Methode zur spezifischen isolation von nukleinsäuren Withdrawn EP2912190A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102012021146.5A DE102012021146A1 (de) 2012-10-25 2012-10-25 Methode zur spezifischen Isolation von Nukleinsäuren
PCT/EP2013/072331 WO2014064223A1 (de) 2012-10-25 2013-10-24 Methode zur spezifischen isolation von nukleinsäuren

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2912190A1 true EP2912190A1 (de) 2015-09-02

Family

ID=49484284

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP13780364.9A Withdrawn EP2912190A1 (de) 2012-10-25 2013-10-24 Methode zur spezifischen isolation von nukleinsäuren

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20160010144A1 (de)
EP (1) EP2912190A1 (de)
DE (1) DE102012021146A1 (de)
WO (1) WO2014064223A1 (de)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3959312A1 (de) * 2019-04-26 2022-03-02 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Isolierte nukleinsäurebindungsdomänen

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4978608A (en) * 1987-09-04 1990-12-18 Molecular Devices Corporation DNA detection system
US8481262B2 (en) 2004-03-05 2013-07-09 Sirs-Lab Gmbh Method for enriching and/or separating prokaryotic DNA using a protein that specifically bonds to unmethylated DNA containing CpG-motifs

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
None *
See also references of WO2014064223A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014064223A1 (de) 2014-05-01
DE102012021146A1 (de) 2014-05-15
US20160010144A1 (en) 2016-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69802191T2 (de) Festphase nukleinsäure-isolierung
DE60210621T2 (de) Universelle methode und zusammensetzung zur schnellen lysierung von zellen zur freisetzung von nukleinsäuren und ihre detektion
EP2655616A1 (de) Extraktion von nukleinsäuren
Jahan et al. Genomic DNA extraction methods: a comparative case study with gram–negative organisms
Lopes et al. Development of a magnetic separation method to capture sepsis associated bacteria in blood
US20110275090A1 (en) Use of achromopeptidase for lysis at room temperature
Durnez et al. A comparison of DNA extraction procedures for the detection of Mycobacterium ulcerans, the causative agent of Buruli ulcer, in clinical and environmental specimens
AU2016263700B2 (en) Staphylococcus lyase and use thereof
EP1723233B1 (de) Verfahren zur anreicherung und/oder abtrennung von prokaryotischer dna mittels eines proteins, das nicht-methylierte cpg-motive enthaltende dna spezifisch bindet
EP1400589B1 (de) Verfahren zum Nachweis prokaryontischer DNA
DE69711073T2 (de) Verfahren zur erkennung von lebenden mikrobiologischen verunreinigungen in einer lebensmittelprobe
WO2014064223A1 (de) Methode zur spezifischen isolation von nukleinsäuren
US20090186346A1 (en) Method for Detecting the Presence or Absence of a Target Cell in a Sample
WO2001068900A2 (de) Verfahren zum spezifischen nachweis von mikroorganismen durch polymerase-kettenreaktion
DE69731388T2 (de) Nukleinsäure-fragmente, die spezifische für die mitglieder des m. tuberculosis komplexes sind, deren anwendung zur detektion und differentiale diagnose der mitglieder des m. tuberculosis komplexes
Wang et al. Daptomycin-modified magnetic beads integrated with lysostaphin for selective analysis of Staphylococcus
Kapustin et al. High-throughput method of one-step DNA isolation for PCR diagnostics of Mycobacterium tuberculosis
Hasche et al. Immobilisation of a repressor protein for binding of plasmid DNA
Albermani et al. Screening of Production Pyocin S5 Isolate from Multidrug Resistant Pseudomonas aeruginosa
Herfehdoost et al. Rapid detection of Vibrio Cholerae by polymerase chain reaction based on nanotechnology method
WO2002024904A2 (de) Verfahren zur herstellung von ribonukleinsäure (rns)
DE102010014840B4 (de) DNase-beschichtete magnetische Partikel
DE102004010928A1 (de) Protein zur Bindung prokaryonter DNA sowie Verfahren zur Trennung und Anreicherung prokaryonter DNA
EP2619320B1 (de) Reagenz zum aufschluss von zellmaterial mit vollständig integriertem internem standard
WO2006133758A2 (de) Vorrichtung zur anreicherung/abtrennung von nicht-methylierte cpg-motive enthaltender dna

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20150512

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: BA ME

RIN1 Information on inventor provided before grant (corrected)

Inventor name: HENNIG, KATHARINA

Inventor name: SANDETSKAYA, NATALIA

Inventor name: NAUMANN, ANDREAS

Inventor name: KUHLMEIER, DIRK

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
17Q First examination report despatched

Effective date: 20161115

RIC1 Information provided on ipc code assigned before grant

Ipc: C12Q 1/68 20060101AFI20170629BHEP

Ipc: C12N 9/90 20060101ALI20170629BHEP

Ipc: C12N 15/10 20060101ALI20170629BHEP

Ipc: C12Q 1/533 20060101ALI20170629BHEP

GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

INTG Intention to grant announced

Effective date: 20170927

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20180208