EP2668164A1 - Nouveaux derives d'azacoumarines presentant une activite inhibitrice des pompes mdr - Google Patents

Nouveaux derives d'azacoumarines presentant une activite inhibitrice des pompes mdr

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Publication number
EP2668164A1
EP2668164A1 EP12706636.3A EP12706636A EP2668164A1 EP 2668164 A1 EP2668164 A1 EP 2668164A1 EP 12706636 A EP12706636 A EP 12706636A EP 2668164 A1 EP2668164 A1 EP 2668164A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
compound
methyl
dimethoxy
substituted
phenylquinolin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP12706636.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Anne DOLEANS-JORDHEIM
Jean FRENEY
Charles Dumontet
Ahcène BOUMENDJEL
Jean-Baptiste VERON
Yung-Sing Wong
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Hospices Civils de Lyon HCL
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Hospices Civils de Lyon HCL
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL, Universite Joseph Fourier Grenoble 1, Hospices Civils de Lyon HCL filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP2668164A1 publication Critical patent/EP2668164A1/fr
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    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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Definitions

  • the subject of the present invention is new azacoumarin derivatives having an inhibitory activity of bacterial efflux pumps (IPE activity), in particular of the NorA pump, responsible for antibiotic resistance of MDR ("Multidrug Resistance”) type, as well as such compounds for their use to enhance the effect of an antimicrobial agent or for their use as an antimicrobial agent.
  • IPE activity bacterial efflux pumps
  • NorA pump responsible for antibiotic resistance of MDR ("Multidrug Resistance") type
  • antibiotic efflux systems Some of these resistances, identified in several Gram-positive and Gram-negative bacteria, especially those implicated in so-called nosocomial infections (acquired at the hospital), are linked to antibiotic efflux systems. These efflux results in decreased intracellular concentrations of antimicrobial agents and thus their effectiveness (Efflux-mediated resistance to fluoroquinolones in gram-positive bacteria and mycobacteria: Keith Poole, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2000, 44 (10), 2595- 2599).
  • the antibiotics concerned by this type of resistance belong, for example, to the classes of fluoroquinolones, tetracyclines or macrolides. It should be noted that this type of resistance is also evident with regard to certain antiparasitic and anti-tumor agents.
  • Bacterial efflux pumps are active transmembrane protein transporters functioning by the energy generated by the electrochemical gradient of the cytoplasmic membrane Microbiologicai Reviews, 1996, 575-608) or by the hydrolysis of ⁇ .
  • the function of these systems is identical despite their structural diversity and their energy source: they oppose the intracellular accumulation of their substrates such as heavy metals, bile salts, and in this case, antibiotics.
  • these systems have a negative impact on antibiotic therapy because they can (i) partially reduce the activity of the antibiotic, (ii) potentiate the effect of other pre-existing resistance mechanisms (enzymatic inactivation of the antibiotic or modification of its target, alteration of bacterial membrane permeability ...) / (iii) promote the emergence of bacteria resistant to conventional antibiotics as a result of genetic mutations (eg fluoroquinolone gyrases), (iv) in general, facilitate adaptation and persistence of bacteria in vivo.
  • inhibitors of bacterial efflux pumps is one of the possible solutions to fight against the bacterial resistance related to the efflux of antibiotics ⁇ Journal of Medicinal Chemistry 2001, 44 (2), 261-268, Antimicrobial agents and Chemotherapy 2001, 45 (1), 105-16, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1999, 43, 2404-2408 and Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2003, 47 (2), 719-726)).
  • the microorganisms concerned by these inhibitors are antibiotic-resistant bacteria via an efflux mechanism, in particular staphylococci such as Staphylococcus aureus, streptococci such as Streptococcus pneumoniae, enterococci such as Enterococcus faecalis or E faecium, or other bacterial species including Bacillus subtil / s, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, etc.
  • Various pumps can be targeted, including the NorA pump, responsible for the expulsion of hydrophilic fluoroquinolones (norfloxacin and or ciprofloxacin).
  • inhibitors of efflux pumps and in particular the NorA pump could thus occupy an important therapeutic place by being used in particular in combination with different antimicrobial agents such as antibiotics or antiseptics. These inhibitors could give a boost of activity to antibiotics that have become ineffective on multi-resistant bacteria by increasing their intracellular concentration. They could also secure the use of certain other antibiotics by significantly reducing the emergence of resistance, including the appearance of mutations in their targets. It should be noted that competitive-type inhibitors should be active on a large number of microorganism species, given the relative specificity of the pumps for the substrate and the homologies between the different carriers.
  • the inventors have identified new inhibitors of efflux pumps, in particular the NorA pump.
  • the inventors have demonstrated that these compounds, of azacoumarin type structure were able to restore the activity of a class of usual antibiotics of the family of fluoroquinolones vis-à-vis resistant bacterial strains.
  • These inhibitors used in particular pharmaceutical compositions, improve the action of an antibiotic whose effectiveness has been reduced, due to its expulsion by NorA pump.
  • These inhibitors can also be used in diagnostic tests for the identification of strains expressing the resistance phenotype.
  • the minimum inhibitory concentrations (MIC) of the antibiotic used in the treatment could be determined in the presence or absence of one of these inhibitors.
  • the results obtained should provide information on the existence and nature of a resistance mechanism to be considered in treatment.
  • R 1 and R 2 which may be identical or different, each independently represent a hydrogen atom or an unsubstituted or substituted (C 1 -C 12) alkyl group,
  • R 3 represents a hydrogen atom or an unsubstituted or substituted (C 1 -C 6) alkyl group, or an unsubstituted or substituted benzyl group,
  • R4 represents a (Ci-Ci 2) unsubstituted or substituted alkyl, aryl or heteroaryl, said aryl and heteroaryl groups may be unsubstituted or substituted
  • R5 is (Ci -C 2) unsubstituted or substituted alkyl
  • R 4 and R 5 are linked by a saturated hydrocarbon chain with 3 or 4 carbon atoms
  • the compounds of formula (I) according to the invention have one or more or all of the following characteristics:
  • R 3 represents a hydrogen atom, or a methyl or benzyl group
  • R 1 and R 2 which are identical or different, each independently represent a hydrogen atom or a methyl group
  • R 5 represents a methyl group
  • R 4 represents a benzyl, phenyl, naphthyl, thiophenyl and indolyl group, said groups possibly being unsubstituted or substituted by one or more substituents chosen from chlorine, bromine, iodine and fluorine atoms, (C 1 -C 6 ) alkyl and (Ci-C 6) alkoxy.
  • the compounds of formula (I) according to the invention have one or more or all of the following characteristics:
  • R3 represents a hydrogen atom
  • R 4 represents an unsubstituted phenyl group, an unsubstituted heteroaryl (and especially thiophenyl or indolyl) group or a phenyl group carrying one, two, three or four substituents chosen from chlorine, bromine, iodine and fluorine atoms, the groups (Ci-C 6) alkyl and (Ci-C6) alkoxy, the substituents chlorine or methoxy being preferred,
  • R 5 represents a methyl group
  • Ri represents a hydrogen atom
  • R 2 represents a (C 1 -C 6) alkyl group, and in particular methyl.
  • the compounds of formula (I) according to the invention have one or more or all of the following characteristics:
  • R3 represents a group of hydrogen, or a (C1-C6) alkyl group and in particular methyl
  • R4 represents an aryl, aryl (C1-C6) alkyl group, and in particular benzyl, or a heteroaryl group
  • R 5 represents a (C 1 -C 6 ) alkyl group, and especially methyl
  • Ri represents a methyl group
  • R 2 represents a (CI-C O) alkyl, and especially methyl.
  • the subject of the present invention is also compounds 1.1 to 1.16 as such, as well as the compounds as such of formula (Ip):
  • R 1 and R 2 which are identical or different, each independently represent a hydrogen atom or an unsubstituted or substituted (C 1 -C 2 ) alkyl group,
  • R 3 represents a hydrogen atom or an unsubstituted or substituted (Ci-C 6 ) alkyl group, or an unsubstituted or substituted benzyl group,
  • R 5 represents an unsubstituted or substituted C1-C11 alkyl group, optionally in hydrated form or in the form of a salt acceptable for administration to animals or plants.
  • the compounds of formula (Ip) according to the invention have one or more or all of the following characteristics:
  • R5 represents a methyl group
  • R3 represents a hydrogen atom or a methyl or benzyl group
  • R 1 and R 2 which are identical or different, each independently represent a hydrogen atom, or a methyl group.
  • alkyl is meant, when not more precise, a saturated hydrocarbon radical, linear or branched.
  • group (C 1 -C 6 ) alkyl is meant an alkyl group which has from 1 to 6 carbon atoms.
  • alkyl group mention may be made of methyl, ethyl and n-methyl groups.
  • aryl group is meant a mono-, bi- or polycyclic carbocycle, preferably comprising from 6 to 12 carbon atoms, comprising at least one aromatic group, for example a phenyl, cinnamyl or naphthyl group. Phenyl is the most preferred aryl group.
  • heteroaryl group is meant a mono-, bi- or polycyclic carbocycle, preferably containing from 6 to 12 carbon atoms, and comprising at least one heteroatom and aromatic group.
  • a heteroaryl group mention may be made of thiophenyl, indolyl, pyridyl, benzopheranyl and benzothiophenyl groups.
  • substituted group such a mono or poly-substituted group, by two or more identical or different substituents chosen from: a fluorine, chlorine, bromine or iodine atom, a hydroxy group, (Ci-Cl 2 ) alkyl, (C 1 -C 2 ) acenyl, (C 1 -C 2 ) alkoxy, (C 5 -C 12 ) cycloalkyl, benzyloxy, aryl, sulfhydryl, carboxy, or an amino group -NRaR b with Ra and R b same or different which represent , each independently of one another, a hydrogen atom or a (C 1 -C 2 ) alkyl group or else R a and R b are linked together to form, together with the nitrogen atom to which they are bonded piperidine, pyrrolidine, piperazine, N- (C 1 -C 2 ) alkylpiperazine or morpholine.
  • Benzyl is
  • alkenyl is an alkyl group as defined above comprising a double bond.
  • Vinyl, allyl, isopropenyl, 1-, 2- or 3-butenyl, pentenyl, hexenyl are examples of such alkenyl groups.
  • alkoxy refers to an O-alkyl group.
  • cycloalkyl denotes a cycloalkyl group comprising from 3 to 10 carbon atoms, for example cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, bridged cycloalkyl groups such as adamantyl, bicyclo [3.2.1] optanyl groups.
  • heterocycloalkyl means a cycloalkyl such as defined above, comprising one or more heteroatoms selected from nitrogen, oxygen and sulfur.
  • Sulfhydryl is -SH and carboxyl -COOH.
  • treatment means any prophylactic or suppressive therapeutic measure of a disease or disorder leading to a desirable clinical effect or any beneficial effect, including in particular the suppression or decrease of one or more symptoms, regression, slowing or cessation of the progression of the disorder associated with it.
  • terapéuticaally effective amount is meant any amount of a composition that improves one or more of the characteristic parameters of the condition being treated.
  • potentiator of the effect of an antimicrobial agent is meant that the antimicrobial effect of an antimicrobial agent is increased, when the latter is used in combination with the potentiating agent, namely a compound of formula (I ) Yes P). This increase can in particular be highlighted on one of the tests presented in the examples below.
  • the antimicrobial effect then observed is increased by at least a factor of 4 relative to the reference activity obtained with the tested antimicrobial agent in the absence of a potentiating agent, namely the compound of formula (I ) or (Ip), which means that the minimum inhibitory concentration of the antimicrobial agent then obtained is at least divided by 4 relative to that required in the absence of potentiating agent.
  • antibiotic agent in particular substances capable of inhibiting the growth of microorganisms, or even of killing them.
  • antibiotics having bacteriostatic activity (substance inhibiting bacterial growth) and bactericidal (substance killing bacteria). More particularly, the IPE activity of the molecules favors the class of fluoroquinolones including ciprofloxacin.
  • the compounds used in the context of the invention are prepared according to conventional techniques.
  • the compounds of formula (I) can be obtained according to SCHEME 1 below, wherein R 3 , and R 5 are as defined above for (I), R ' 1 and R' 2 respectively represent R 1 and R 2 as defined above for (I) or a precursor group thereof, X represents a halogen atom and in particular chlorine and R 'represents an alkyl group and especially an ethyl group.
  • the compound of formula (II) can, for its part, be obtained from the compound of formula (III) commercial or obtained by simple chemical syntheses, either by action of an acid chloride R4-CH2-C (0 ) -Cl, in the presence of triethylamine, or by the action of an acid R4-CH2-C (O) -OH, in the presence of triethylamine and an acid such as bis (2-oxo-3-oxazolidinyl) acid; ) phosphonic acid (BOP-CI).
  • the compounds of formula ( ⁇ ) thus prepared can correspond to a compound of formula (I), if the groups R'i and R'2 are respectively Ri and R2. It is also possible to obtain the desired group Ri or 2 from a precursor group R'i or R'2 after one or more transformations.
  • the molecules of formula (I) are therefore of simple chemical access, and can be obtained at a low cost of preparation.
  • the salts of the compounds according to the invention are prepared according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the salts of the compounds of formula (I) and (Ip) according to the present invention include those with inorganic or organic acids or bases which allow a suitable separation or crystallisation of the compounds of formula (I) or (Ip), as well as as pharmaceutically acceptable salts.
  • Suitable acids are: oxalic acid or an optically active acid, for example tartaric acid, dibenzoyltartaric acid, mandelic acid or camphorsulfonic acid, and those which form physiologically acceptable salts, such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, hydrogen sulfate, dihydrogenphosphate, maleate, fumarate, 2-naphthalenesulfonate, paratoluenesulfonate, mesylate, besylate, isotionate.
  • physiologically acceptable salts such as sodium, potassium and calcium salts.
  • compound in hydrated form there may be mentioned, for example, the semihydrates, monohydrates and polyhydrates.
  • the compounds of formula (I) and (Ip) above also include those in which one or more hydrogen, carbon or halogen atoms, in particular chlorine or fluorine atoms, have been replaced by their radioactive isotope, for example the tritium or carbon-14.
  • radioactive isotope for example the tritium or carbon-14.
  • the functional groups optionally present in the molecule of the compounds of formula (I) or (Ip) and in the reaction intermediates can be protected, either in permanent form or in temporary form, by protecting groups which ensure a unambiguous synthesis of the expected compounds.
  • the protection and deprotection reactions are carried out according to techniques well known to those skilled in the art.
  • temporary protective group of amines, alcohols or carboxylic acids is meant protective groups such as those described in Protective Groups in Organic Synthesis, Greene T.W. and Wuts P.G., ed. John Wiley and Sons, 2006 and in Protecting Groups, Kocienski P.J., 1994, Georg Thieme Verlag.
  • the inventors have demonstrated the potentiating effect of the compounds according to the invention by fluoroquinolones, and in particular hydrophilic fluoroquinolones such as norfloxacin or ciprofioxacin, on gram-positive bacteria belonging to the staphylococcus or enterococcus genera. These effects include resistant strains, such as methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains (MRSA) or glycopeptides (GISA for Glycopeptides Intermediate S. aureus).
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains
  • GISA glycopeptides
  • the compounds according to the invention have an activity improving by a factor 2 to 128 the activity of the conventional antibiotic.
  • the mechanism of action of this potentiating effect goes through an inhibitory activity of bacterial efflux pumps and, in particular, of NorA.
  • the compounds according to the invention can therefore be used to potentiate the effect, that is to say increase the effect, of antimicrobial agents and in particular antibiotics become inactive on resistant strains via an efflux mechanism.
  • potentiation it is meant that by combining a compound of formula (I) or (Ip) with an antimicrobial agent, an antimicrobial effect superior to that obtained with one or other of the compounds and even synergistic, is obtained. ie greater than the sum of the effects obtained separately.
  • the compounds of formula (I) or (Ip) can thus be used to restore the action of traditional antibiotics, in cases where efflux pumps are responsible for significant resistance to these antibiotics.
  • antibiotic resistance include resistance to quinolones of Staphylococcus aureus and Streptococcus pneumoniae, as well as various resistance of Pseudomonas aeruginosa (ASMNews, (1997), 63, 605-610).
  • ASMNews (1997), 63, 605-610).
  • the compounds of formula (I) or (Ip) can be used in pharmaceutical or phytosanitary compositions intended to restore the efficacy of antibiotic agents which have been affected by a NorA expulsion mechanism.
  • These compositions may contain, in addition to the inhibitor, an antibiotic, in particular of the family of fluoroquinolones, and a usual excipient allowing ingestion and transport of the active principles.
  • the compounds according to the invention may be used for the preparation of a medicament with antimicrobial activity or, preferably, for the preparation of a medicinal product intended to improve the action of antimicrobial agents of which efficiency is affected by efflux pump mechanisms, in particular NorA.
  • the administration of a compound of formula (I) or (Ip) is therefore accompanied by the administration of the antimicrobial agent whose activity is to be improved.
  • the compound of formula (I) or (Ip) may be formulated in combination with said antimicrobial agent or formulated separately. It can also be used for performing diagnostic tests such as an antibiogram to highlight, for the strain concerned, an efflux resistance mechanism.
  • the subject of the present invention is therefore also the compounds of formula (Ip), as well as compounds 1.1 to 1.16, their pharmaceutically compatible salts, or optionally solvents or hydrates, as medicaments.
  • compositions administrable to plants and animals contain an effective dose of a compound according to the invention or an acceptable salt, solvate or hydrate thereof, and suitable excipients.
  • Said excipients are chosen according to the form and the desired mode of administration.
  • the active ingredients of formula (I) or (Ip) above, or their salts, solvates and hydrates may be administered in unit dosage forms, in admixture with conventional pharmaceutical carriers, to animals and humans for the prophylaxis or treatment of infectious diseases related to resistant bacteria. or not.
  • Suitable unit dosage forms include oral forms such as tablets, capsules, powders, granules and oral solutions or suspensions, sublingual, buccal, intratracheal, intranasal, dosage forms.
  • the compounds according to the invention can be used in creams, ointments, lotions or eye drops.
  • the dose of active ingredient preferably varies between 1 and 100 mg per kg of body weight per day.
  • the compound (I) or (Ip) and the antimicrobial agent whose effect is to be potentiated are advantageously administered in a ratio of 4 to 1.
  • the main active ingredient is mixed with a pharmaceutical carrier, such as gelatin, starch, lactose, magnesium stearate, talc, gum arabic or the like.
  • a pharmaceutical carrier such as gelatin, starch, lactose, magnesium stearate, talc, gum arabic or the like.
  • the tablets can be coated with sucrose, a cellulose derivative, or other suitable materials or they can be treated in such a way that they have prolonged or delayed activity and continuously release a quantity predetermined active ingredient.
  • a preparation in capsules is obtained by mixing the active ingredient with a diluent and pouring the resulting mixture into soft or hard gelatin capsules.
  • compositions containing a compound of the invention may also be in liquid form, for example, solutions, emulsions, suspensions or syrups.
  • suitable liquid carriers may be water, organic solvents such as glycerol or glycols, as well as their mixtures, in varying proportions, in water.
  • a preparation in the form of syrup, elixir or dropwise administration may contain the active ingredient together with a preferred calorie-free sweetener, methylparaben and propylparaben as an antiseptic as well as a flavoring agent and a flavoring agent. appropriate dye.
  • the water-dispersible powders or granules may contain the active ingredient in admixture with dispersing agents, or wetting agents, or suspending agents, such as polyvinylpyrrolidone, as well as with sweeteners or preservatives. taste correctors.
  • compositions containing a number of active ingredients in combination, one of which is a compound (I) or (Ip) and the other an antimicrobial agent as previously defined.
  • the subject of the present invention is also the use of the inhibitors as defined above in diagnostic methods and in particular their use for demonstrating in vitro the presence in a biological sample of antibiotic-resistant bacteria and their degree. of resistance.
  • Derivative 2 (1.52 g, 4.39 mmol) is dissolved in f-BuOH (5 mL / mmol).
  • f-BuOK (5 eq.) is added and the solution is stirred at room temperature for 12 hours.
  • the f-BuOH is then evaporated under vacuum and a saturated solution of NH4Cl is added.
  • the solution is extracted with ethyl acetate (AcOEt), washed with water, then with saturated NaCl solution and finally dried over MgSO-.
  • the organic phase is concentrated and the product is crystallized in MeOH and the crystals are washed with CH 2 Cl 2 to provide the pure product 3.
  • 3-Amino-5-methoxyphenol 7 (prepared according to Chakraborti, AK, Sharma, L, Nayak, MK 3. Org Chem 2002, 67, 6406-6414.) Is placed in a flask, with the derivative of ethyl acetoacetate 8 (2 to 1.1 equiv) dissolved in chlorobenzene. The reaction mixture is placed in a microwave reactor. The reaction proceeds at 160 ° C and 130 W for a time of between 5 and 30 min.
  • the same reaction can be performed by thermal heating.
  • the reaction medium is placed directly at 165 ° C. in a graphite bath.
  • the reaction mixture is refluxed under argon between 2 and 72 hours.
  • the product of the reaction precipitates in chlorobenzene at room temperature, it is filtered and then washed with dichloromethane.
  • All the compounds according to the invention are solubilized in dimethylsulfoxide (DMSO).
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the highest concentration that can be used during the experiments is determined taking into account the toxicity of the solvent (final concentration of DMSO in contact with the bacteria of less than 3%) as well as the capacity of the compound to solubilize in medium.
  • Mueller Hinton II (MH II) Indeed, certain compounds precipitate dilutions of DMSO-based solutions in MH II medium.
  • the antibiotic used is a fluoroquinolone: ciprofloxacin. Its solubilization is carried out in sterile osmosis water or MH II acidified with a solution of HCl. Twenty ⁇ l of 12 N HCl (or 5 ⁇ l of 35% HCl) are required to solubilize 10 mg of ciprofloxacin in 1 ml of sterile osmosis H 2 0. -Bacterial strains
  • the strain allowing the screening of the compounds is a strain of Staphylococcus aureus derived from the "American Type Culture Collection" or ATCC called S. aureus ATCC 29213.
  • This potentiating effect is evaluated by comparing the MIC of ciprofloxacin alone with that of ciprofloxacin associated with a compound according to the invention according to the MIC method. This was performed according to the protocol described by the Antibiogram Committee of the French Society of Microbiology (CASFM) and the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). The determination of the MICs is carried out in round-bottomed 96-well micro-plate in MH II liquid medium. A dilution range of ciprofloxacin is carried out in MH II medium.
  • each well of a first column are mixed 100 ⁇ l of a bacterial suspension at 10 6 CFU / ml, 50 ⁇ l of a dilution range of ciprofloxacin and 50 ⁇ l of MH II.
  • each well of a second column are mixed 100 ⁇ l of a bacterial suspension at 10 6 CFU (Colony Forming Unit) / ml, 50 ⁇ l a concentration range of ciprofloxacin and 50 ⁇ l of a solution of a compound according to the invention at the highest possible concentration.
  • the lowest antibiotic concentration for which no bacterial growth is observed is recorded in the 2 columns with and without synthetic molecule.
  • a compound according to the invention has a potentiating effect on the activity of ciprofloxacin compared to the effect of ciprofloxacin only if the MIC of it is lowered by a dilution factor> 4 in the presence of this compound. Evaluation of the antibiotic activity of the compounds according to the invention alone
  • the antibiotic activity of a molecule is evaluated by the MIC technique.
  • the determination of the MIC of a molecule is carried out in a 96-well microplate, in a MH II liquid medium according to the CASFM and CLSI protocol.
  • a dilution range of the molecule is carried out beforehand in MH II medium.
  • 100 ⁇ l of a bacterial suspension of S. aureus ATCC 29213 (10 6 CFU / ml) 50 ⁇ l of the dilution range of the test compound and 50 ⁇ l of MH II.
  • After 18-24 h of incubation at 37 ° C, the molecules having shown inhibition of bacterial development are listed as having antibiotic activity.
  • the lowest concentration of compound for which no bacterial growth is observed is the MIC (lowest concentration inhibiting growth of bacteria).
  • the 16 compounds according to the invention tested potentiate the activity of ciprofloxacin (to different degrees).
  • the antibiotic used is ciprofloxacin with the same dilution as in paragraph B1.
  • Compound 1.12 is also used under the same conditions as in paragraph B1. - Bacterial strains
  • ATCC strains Nine of these strains are ATCC strains and 47 are of clinical origin and come from the East Bron Biology Center. Eighteen staphylococcal strains are tested: 1 strain of S. epidermidis, 2 strains of 5. aureus, 10 MRSA (S. Meticillin-resistant Aureus) and VISA (S. aureus of intermediate susceptibility to Vancomycin). Sixteen strains of enterococci are also tested, ie 9 faecium and 7 faecafis. These last 2 species include 2 vancomycin-sensitive strains (1 per species), and 14 resistant strains (VRE, respectively 8 £ faecium and 6 £ faecalis). The other genres are listed in TABLE 6 above.
  • the antibiotic activity of compound 1.12 is evaluated by the technique of (MIC) according to the protocol described above, taking into account the blood requirements of certain strains.
  • strains tested 28 were found to be more sensitive to ciprofloxacin when compound 1.12 was associated with it. These strains are Gram-positive bacteria of the Staphylococcus and Enterococcus type, including resistant (or even multiresistant) strains:
  • SASM S. aureus sensitive to meticillin
  • SASM S. aureus sensitive to meticillin
  • VISA S. aureus of intermediate sensitivity to vancomycin
  • VSE Vancomycin-sensitive Enterococci
  • ERV Vancomycin-Resistant Enterococcus
  • the C Is of ciprofloxacin are divided by a factor> 16 in the presence of the compound 1.12 except for a strain whose activity is> 4.
  • Two strains of E faecium ERV not listed in the 28 previously mentioned are weakly sensitive to the action of the combination of compound 1.12 with ciprofloxacin (factor> 2).
  • strains sensitive to the action of compound 1.12 alone are the same strains (clean antibiotic effect of compound 1.12).
  • the antibiotics used are erythromycin, ciprofloaxacin, vancomycin, tetracycline and oxacillin.
  • Ciprofloxacin is prepared as previously described.
  • Vancomycin is taken up at a concentration of 10 mg / mL of sterile reverse osmosis water. The solution is then diluted 10-fold and then 15.6-fold in MHII broth to obtain a stock solution of 64 ⁇ g / mL (16 ⁇ g / mL in well).
  • the tetracycline is taken up in sterile osmosis water at a concentration of 10 mg / tetracycline.
  • the solution is then diluted 10-fold and then 31.3-fold in MHII broth to obtain a stock solution of 32 ⁇ g / mL (8 ⁇ g / mL in well).
  • the oxacillin is taken up in sterile osmosis water at a concentration of 10 mg / ml
  • the solution is then diluted 10-fold and then 62.5-fold in MH II broth to obtain a stock solution of 16 mg / ml. (4 mg / mL in cup).
  • the S. aureus strains used are:
  • the sensitivity of S. aureus ATCC 29213 to the combination of ciprofloxacin antibiotic molecules and compound 1.12 and the effect of each of the two molecules on the activity of the other are determined by the chessboard method. This method is carried out in 96-well plate with round bottom (12 columns by 8 lines). Different concentrations of ciprofloxacin and compound 1.12 are obtained by diluting their stock solutions in MH II broth. Fifty microliters of the dilution range of compound 1.12 are deposited in each well of columns 1 to 10, each line corresponding to a dilution of this compound. Fifty microliters of the dilution range of ciprofloxacin are deposited in the wells of columns 2 to 10, each column corresponding to a dilution.
  • the reading of the plate is done visually.
  • the 200 ⁇ of reagents introduced into each well are either turbid (bacterial growth) or translucent (lack of bacterial growth).
  • the fractional inhibitory concentration (FIC) was calculated by summing the FIC FIC compound 1.12 and ciprofloxacin (FIC C i pr o) according to the following formulas (FIC1 February 1st.):
  • FIC1.12 MIC of compound 1.12 in combination with ciprofloxacin / MIC of compound 1.12 alone
  • -FICcipro MIC of compound 1.12 in combination with ciprofloxacin / MIC of ciprofloxacin alone
  • a FIC ⁇ 0.5 corresponds to a synergy between the two molecules
  • a FIC> 4 corresponds to an antagonism of the two molecules
  • a FIC between 0.5 and 4 corresponds to an absence of interaction between the two molecules.
  • a synergistic or antagonistic effect of the two molecules is defined by a decrease> 2 log 10 CFU / ml and an increase> 2 log 10 CFU / ml between the wells containing the combination of the two molecules and those containing the most active molecules.
  • the chessboard method highlights:
  • FIG. ⁇ 0.5 A synergistic combination (FIC ⁇ 0.5) antibacterial of 1.12 and ciprofloxacin sur5. aureus ATCC 29213 or resistant strains of the type SARM (strain ST07 1012) and VISA (strain V4). Lack of interaction (FIC> 0.5 but ⁇ 4) between 1.12 and oxacillin, erythromycin, tetracycline, vancomycin on the same bacterial strain.
  • Some of these compounds also possess significant antibiotic activity. In combination with ciprofloxacin, their action becomes synergistic with that of the antibiotic (and not simply additive). This synergy makes it possible to reduce the antibiotic concentrations used in vitro to destroy the bacteria and presumably those used in vivo (reduction of the toxic effects attributed to the anti-infectious molecules). This activity is found even on strains SARM and VISA. The presence of a synergistic effect is probably related to the inhibitory activity of the efflux pumps of the compounds according to the invention.
  • the molecules whose IPE effect has been evaluated are: 1.1 (24 ⁇ / L), 1.6 (16 ⁇ / L) and 1.14 (31 pmol / L).
  • the antibiotics with which these molecules have been associated are: ciprofloxacin and norfloxacin; tetracycline; oxacillin; erythromycin and vancomycin.
  • Bacterial Strains The bacterial strains tested are S. aureus ATCC 29213; S. aureus 1199b overexpressing NorA as well as S. aureus 1199 the strain from which it is derived; S. aureus K1712 not expressing NorA as well as S. aureus 8325.4 (the strain from which it is derived).
  • Compound 1.6 allows an improvement in MICs of factors 4, 8 or even 16 when in the presence of norfloxacin and ciprofloxacin. This activity is particularly notable when the compound associated with one of the two fluoroquinolones is evaluated with the strain 1199b overexpressing NorA. This activity is however zero when the associations are evaluated on the strain K1712. Finally, this activity is not very effective when the molecule is coupled to non-fluoroquinolone antibiotics.

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Description

NOUVEAUX DERIVES D'AZA COUMARINES PRESENTANT UNE
ACTIVITE INHIBTTRIΠDES POMPES MDR
La présente invention a pour objet de nouveaux dérivés d'azacoumarines présentant une activité inhibitrice des pompes à efflux bactériennes (activité IPE), en particulier de la pompe NorA, responsables d'une résistance aux antibiotiques de type MDR (« Multidrug Résistance »), ainsi que de tels composés pour leur utilisation pour augmenter l'effet d'un agent antimicrobien ou pour leur utilisation an tant qu'agent antimicrobien.
Ces dernières années, de nouvelles souches bactériennes présentant des phénotypes variés de résistance à différents agents antibiotiques se sont développées. En raison de l'émergence de ces résistances, un grand nombre de ces molécules anti-infectieuses se trouvent à présent inefficaces.
Ces phénomènes de résistance peuvent affecter tous les antibiotiques (quelque soit leur classe et leur structure chimique), ainsi que l'ensemble de leur champ d'application, posant, de ce fait, de graves problèmes de santé publique. Les conséquences de ces résistances sont en effet majeures, que ce soit d'un point de vue médical, social ou économique (impasses thérapeutiques, augmentation de la morbidité et de la mortalité, durées d'hospitalisation plus longues, utilisation de molécules onéreuses et/ou aux effets indésirables néfastes...)
Certaines de ces résistances, identifiées chez plusieurs bactéries à Gram positif et à Gram négatif notamment celles impliquées dans des infections dites nosocomiales (acquises à l'hôpital), sont liées à des systèmes d'efflux des antibiotiques. Ces efflux ont pour conséquence la diminution des concentrations intracellulaires des agents antimicrobiens et donc de leur efficacité (Efflux-mediated résistance to fluoroquinolones in gram-positive bacteria and the mycobacteria: Keith Poole; Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2000, 44(10), 2595-2599). Les antibiotiques concernés par ce type de résistance appartiennent, par exemple, aux classes des fluoroquinolones, des tétracyclines ou des macrolides. Il convient de noter que ce type de résistance se manifeste aussi vis-à-vis de certains agents antiparasitaires et anti-tumoraux. Les pompes à efflux bactériennes sont des transporteurs protéiques transmembranaires actifs fonctionnant grâce à l'énergie générée par le gradient électrochimique de la membrane cytoplasmique Microbiologicai Reviews, 1996, 575-608) ou par l'hydrolyse de ΓΑΤΡ. Pour plus de détails, on pourra se référer à : Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2003, 51, 9- 11, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2000, 44(9), 2233-2241, Molecular Microbiology 2000, 36(3), 772-773 et Current opinion in drug discovery & development 2001, 4(2), 237-45. La fonction de ces systèmes est identique malgré leur diversité structurale et leur source d'énergie : ils s'opposent à l'accumulation intracellulaire de leurs substrats tels que les métaux lourds, les sels biliaires, et dans le cas présent, les antibiotiques. Comme évoqués précédemment, ces systèmes ont un impact négatif en antibiothérapie car ils peuvent (i) diminuer partiellement l'activité propre de l'antibiotique, (ii) potentialiser l'effet d'autres mécanismes de résistance préexistants (inactivation enzymatique de l'antibiotique ou modification de sa cible, altération de la perméabilité membranaire bactérienne...)/ (iii) favoriser l'émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques classiques à la suite de mutations génétiques (par exemple les gyrases des fluoroquinolones), (iv) d'une manière générale, faciliter l'adaptation et la persistance des bactéries in vivo.
L'utilisation d'inhibiteurs des pompes à efflux bactériennes constitue l'une des solutions envisageables pour lutter contre les résistances bactériennes liées à l'efflux des antibiotiques {Journal of Médicinal Chemistry 2001, 44(2), 261-268, Antimicrobial agents and chemotherapy 2001, 45(1), 105-16, Antimicrobial agents and chemotherapy 1999, 43, 2404- 2408 et Antimicrobial agents and chemotherapy 2003, 47 (2), 719-726)). Les micro-organismes concernés par ces inhibiteurs sont les bactéries résistantes aux antibiotiques via un mécanisme d'efflux, en particulier les staphylocoques tels que Staphylococcus aureus, les streptocoques tels que Streptococcus pneumoniae, les entérocoques tels qu'Enterococcus faecalis ou E faecium, ou d'autres espèces bactériennes dont Bacilius subtil/s, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, etc.. Diverses pompes peuvent être ciblées, dont la pompe NorA, responsable de l'expulsion des fluoroquinolones hydrophiles (norfloxacine et ou ciprofloxacine).
Les inhibiteurs des pompes à efflux et en particulier de la pompe NorA, pourraient ainsi occuper en thérapeutique une place importante en étant utilisés notamment en association avec différents agents antimicrobiens comme des antibiotiques ou des antiseptiques. Ces inhibiteurs pourraient donner un regain d'activité à des antibiotiques devenus inefficaces sur les bactéries multi-résistantes en augmentant leur concentration intracellulaire. Ils pourraient également sécuriser l'utilisation de certains autres antibiotiques en réduisant considérablement l'émergence de résistances, notamment par l'apparition de mutations dans leurs cibles. Il convient de noter que les inhibiteurs de type compétitif devraient être actifs sur un grand nombre d'espèces de micro-organismes, étant donné la spécificité relative des pompes pour le substrat et les homologies entre les différents transporteurs.
Certains inhibiteurs de pompe à efflux sont décrits dans la littérature. On peut citer par exemple les dérivés de quinolones décrits dans les documents US 6346391, US 6271416, US 2007/078176 et US 2003/149074, ou encore les dérivés comportant un groupe thiophène ou benzothiophène tels que décrits dans la demande WO 2006018544.
Dans ce contexte, les inventeurs ont identifiés de nouveaux inhibiteurs de pompes à efflux, en particulier de la pompe NorA. Les inventeurs ont démontré que ces composés, de structure de type azacoumarine étaient capables de restaurer l'activité d'une classe d'antibiotiques usuels de la famille des fluoroquinolones vis-à-vis de souches bactériennes résistantes. Ces inhibiteurs, utilisés dans des compositions notamment pharmaceutiques, amélioreraient l'action d'un antibiotique dont l'efficacité a été diminuée, en raison de son expulsion par la pompe NorA. Ces inhibiteurs peuvent également être utilisés dans des tests diagnostiques destinés à l'identification de souches exprimant le phénotype de résistance. A partir d'un échantillon biologique prélevé sur un patient infecté, les concentrations minimales inhibitrices (CMI) de l'antibiotique utilisé dans le traitement (de préférence une fluoroquinolone dont la ciprofloxacine) pourraient être déterminées en présence ou non de l'un de ces inhibiteurs. Les résultats obtenus devraient fournir des renseignements sur l'existence et la nature d'un mécanisme de résistance à prendre en compte dans le traitement.
Plus précisément, la présente invention a pour objet des composés de formule (I) :
dans laquelle :
- Ri et R2, identiques ou différents représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène ou un groupe (Ci-Ci2)alkyle non substitué ou substitué,
- R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe (Ci-Cejalkyle non substitué ou substitué, ou un groupe benzyle non substitué ou substitué,
- R4 représente un groupe (Ci-Ci2)alkyle non substitué ou substitué, aryle ou hétéroaryle, lesdits groupes aryle et hétéroaryle pouvant être non substitués ou substitués, et R5 représente un groupe (Ci- Ci2)alkyle non substitué ou substitué,
- Ou bien R4 et R5 sont liés entre eux par une chaîne hydrocarbonée saturée à 3 ou 4 atomes de carbone,
éventuellement sous forme hydratée ou sous la forme d'un sel acceptable pour une administration aux animaux ou végétaux,
pour leur utilisation en tant que potentialisateur de l'effet d'un agent antimicrobien ou pour leur utilisation an tant qu'agent antimicrobien. Selon des modes de réalisation particuliers, les composés de formule (I) selon l'invention présentent, une ou plusieurs, voire toutes les caractéristiques ci-dessous :
- R3 représente un atome d'hydrogène, ou un groupe méthyle ou benzyle,
- Ri et R2, identiques ou différents représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle,
- R5 représente un groupe méthyle,
- R4 représente un groupe benzyle, phényle, naphtyle, thiophényle et indolyle, lesdits groupes, pouvant être non substitués ou substitués par un ou plusieurs substituants choisis parmi les atomes de chlore, brome, iode et fluor, les groupes (CrC6)alkyle et (Ci-C6)alcoxy.
Selon des modes de réalisation préférés conduisant à des composés présentant un effet antibiotique propre, les composés de formule (I) selon l'invention présentent, une ou plusieurs, voire toutes les caractéristiques ci- dessous :
- R3 représente un atome d'hydrogène,
- R4 représente un groupe phényle non substitué, un groupe hétéroaryle (et notamment thiophényle ou indolyle) non substitué ou un groupe phényle porteur de un, deux, trois ou quatre substituants choisis parmi les atomes de chlore, brome, iode et fluor, les groupes (Ci-C6)alkyle et (Ci-C6)alcoxy, les substituants chlore ou méthoxy étant préférés,
- R5 représente un groupe méthyle,
- Ri représente un atome d'hydrogène,
- R2 représente un groupe (Ci-Ce) alkyle, et notamment méthyle.
Selon d'autres modes de réalisation préférés, conduisant à des composés présentant une activité inhibitrice de pompe efflux NorA particulièrement importante, les composés de formule (I) selon l'invention présentent, une ou plusieurs, voire toutes les caractéristiques ci-dessous :
- R3 représente un groupe d'hydrogène, ou un groupe (Ci-Ce) alkyle et notamment méthyle, - R4 représente un groupe aryle, aryl(Ci-C6)alkyle, et notamment benzyle, ou un groupe hétéroaryle,
- R5 représente un groupe (Ci-C6) alkyle, et notamment méthyle,
- Ri représente un groupe méthyle,
- R2 représente un groupe (CI-CÔ) alkyle, et notamment méthyle.
A titre d'exemples de composés selon l'invention, on peut citer :
-3-(3-chlorophényl)-5,7-diméthoxy-4-méthylquinolin-2(lH)-one, composé 1.1,
- 5,7-diméthoxy-3-(4-méthoxyphényl)-4-méthylquinolin-2(lH)-one, composé 1.2,
- 5,7-diméthoxy-4-méthyl-3-(l-méthyl-lH-indol-3-yl)quinolin-2(lH)-one, composé 1.3,
- 5,7-diméthoxy-4-méthyl-3-(thiophén-2-yl)quinolin-2(lH)-one, composé 1.4,
- 5,7-diméthoxy-4-méthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.5,
- 3-(lH-indol-3-yl)-5,7-diméthoxy-4-méthylquinolin-2(lH)-one, composé 1.6, - 5-hydroxy-7-méthoxy-4-méthyl-3-(thiophén-2-yl)quinolin-2(lH)-one, composé 1.7,
- 5-hydroxy-7-méthoxy-l,4-diméthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.8,
- 5-hydroxy-7-méthoxy-4-méthyl-3-(naphthalen-2-yl)quinolin- 2(lH)-one, composé 1.9,
- 5,7-diméthoxy-l,4-diméthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.10,
- 7-hydroxy-5-méthoxy-4-méthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.11,
- 5-hydroxy-7-méthoxy-4-méthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.12,
- 5,7-dihydroxy-4-méthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.13,
- 3-benzyl-5-hydroxy-7-méthoxy-4-méthylquinolin-2(lH)-one, composé 1.14,
- 2 , 3 -d i hyd ro-9- hydroxy- 7- méthoxy- 1 H -cyclopenta [c]
quinolin-4(5H)-one, composé 1.15,
- l-benzyl-5,7-dimethoxy-4-methyl-3-phenylquinolin-2(lH)-one, composé 1.16.
La présente invention a également pour objet les composés 1.1 à 1.16 en tant que tels, ainsi que les composés en tant que tels de formule (Ip) :
dans laquelle :
- Ri et R2/ identiques ou différents représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène ou un groupe (Ci-Ci2)alkyle non substitué ou substitué,
- R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe (Ci-C6)alkyle non substitué ou substitué, ou un groupe benzyle non substitué ou substitué,
- R5 représente un groupe (Ci-Cnjalkyle non substitué ou substitué, éventuellement sous forme hydratée ou sous la forme d'un sel acceptable pour une administration aux animaux ou végétaux.
Selon des modes de réalisation particuliers, les composés de formule (Ip) selon l'invention présentent, une ou plusieurs, voire toutes les caractéristiques ci-dessous :
- R5 représente un groupe méthyle,
- R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle ou benzyle,
- Ri et R2, identiques ou différents représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène, ou un groupe méthyle.
Parmi ces composés de formule (Ip), ceux dans lesquels R5 = Me, Ri=H et R2=Me sont particulièrement préférés.
La description ci-après permet de mieux comprendre l'invention. En préliminaire, un certain nombre de définitions est rappelé.
Par alkyle, on entend, lorsqu'il n'est pas donné plus de précision, un radical hydrocarboné saturé, linéaire ou ramifié. Par groupe (Ci-C6)alkyle, on entend un groupe alkyle qui comporte de 1 à 6 atomes de carbone. A titre d'exemples de groupe alkyle, on pourra citer les groupes méthyle, éthyle, n- propyle, isopropyle, n-butyle, isobutyle, sec-butyle, t-butyle, n-pentyle, n- hexyle.
Par groupe aryle, on entend un carbocycle mono-, bi- ou polycyclique, comportant de préférence de 6 à 12 atomes de carbone, comprenant au moins un groupe aromatique, par exemple, un groupe phényle, cinnamyle ou naphtyle. Le phényle est le groupe aryle particulièrement préféré.
Par groupe hétéroaryle, on entend un carbocycle mono-, bi- ou polycyclique, comportant de préférence de 6 à 12 atomes de carbone, et comprenant au moins un hétéroatome et groupe aromatique. A titre d'exemple de groupe hétéroaryle, on peut citer les groupes thiophényle, indolyle, pyridyle, benzophéranyle, benzothiophenyle.
Par groupe substitué, on entend un tel groupe mono ou poly-substitué, par deux ou plus de substituants identiques ou différents choisis parmi : un atome de fluor, chlore, brome ou iode, un groupe hydroxy, (Ci-Ci2)alkyle, (Ci-Ci2)acényle, (Ci-Ci2)alcoxy, (C5-Ci2)cycloalkyle, benzyloxy, aryle, sulfhydryle, carboxy, ou un groupe aminé -NRaRb avec Ra et Rb identiques ou différents qui représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupe (Ci-Ci2)alkyle ou bien Ra et Rb sont liés entre eux pour former, avec l'atome d'azote auquel ils sont liés, une pipéridine, une pyrrolidine, une pipérazine, une /V-(Ci-Ci2)alkylpipérazine ou une morpholine. Le groupe benzyle est un exemple de groupe alkyle substitué.
Le terme alcényle correspond à un groupe alkyle tel que ci-dessus défini comprenant une double liaison. Les groupes vinyle, allyle, isopropényle, l-,2- ou 3-butényle, pentényle, hexényle sont des exemples de tels groupes alcényles.
Le terme alcoxy désigne un groupe O-alkyle.
Le terme cycloalkyle, désigne un groupe cycloalkyle comprenant de 3 à 10 atomes de carbone, par exemple cyclopropyle, cyclobutyle, cyclopentyle, cyclohexyle, des groupes cycloalkyle pontés tels que les groupes adamantyle, bicyclo[3.2.1]optanyle. Le terme hétérocycloalkyle désigne un cycloalkyle tel que ci-dessus défini, comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, sélectionnés parmi les atomes d'azote, oxygène et soufre.
Sulfhydryle désigne -SH et carboxyle -COOH.
Le terme « traitement » désigne toute mesure thérapeutique prophylactique ou suppressive d'une maladie ou désordre conduisant à un effet clinique souhaitable ou à tout effet bénéfique, incluant notamment la suppression ou la diminution de un ou plusieurs symptômes, la régression, le ralentissement ou la cessation de la progression du désordre qui y est associé.
Par « quantité thérapeutiquement efficace », on désigne toute quantité d'une composition qui améliore un ou plusieurs des paramètres caractéristiques de l'affection traitée.
Par « potentialisateur de l'effet d'un agent antimicrobien », on entend que l'effet antimicrobien d'un agent antimicrobien est augmenté, lorsque ce dernier est utilisé en combinaison avec l'agent potentialisateur, à savoir un composé de formule (I) ou (Ip). Cette augmentation peut notamment être mise en évidence sur l'un des tests présentés dans les exemples ci-après. En particulier, l'effet antimicrobien alors observé est augmenté d'au moins un facteur 4 par rapport à l'activité de référence obtenue avec l'agent antimicrobien testé en l'absence d'agent potentialisateur, à savoir le composé de formule (I) ou (Ip), ce qui signifie que la concentration minimale inhibitrice de l'agent antimicrobien alors obtenue est au moins divisée par 4 par rapport à celle nécessaire en l'absence d'agent potentialisateur.
Par « agent antimicrobien », on entend notamment des substances capables d'inhiber la croissance de micro-organismes, voire de les tuer. Dans le cadre de l'invention sont ciblés les antibiotiques ayant une activité bactériostatique (substance inhibant la croissance bactérienne) et bactéricide (substance tuant les bactéries). Plus particulièrement, l'activité IPE des molécules favorise la classe des fluoroquinolones dont la ciprofloxacine.
Les composés utilisés dans le cadre de l'invention sont préparés selon des techniques classiques. Par exemple, les composés de formule (I) peuvent être obtenus selon le SCHEMA 1 ci-dessous, dans lequel R3, et R5 sont tels que définis précédemment pour (I), R'i et R'2 représentent respectivement Ri et R2 tels que définis précédemment pour (I) ou un groupe précurseur de ces derniers, X représente un atome d'halogène et notamment de chlore et R' représente un groupe alkyle et notamment un groupe éthyle.
Les composés de formule (Γ) dans lesquels R3=H peuvent notamment être obtenus à partir d'un composé de formule (II), sous l'action d'un mélange tBuOK/tBuOH. Le composé de formule (II) peut, quant à lui, être obtenu à partir du composé de formule (III) commercial ou obtenu selon des synthèses chimiques simples, soit par action d'un chlorure d'acide R4-CH2- C(0)-Cl, en présence de triéthylamine, soit par action d'un acide R4-CH2- C(0)-OH, en présence de triéthylamine et d'un acide tel que l'acide bis(2- oxo-3-oxazolidinyl)phosphonique (BOP-CI). Alternativement, lorsque R'i=H, les composés de formule (10 dans lesquels R3=H peuvent être préparés à partir des phénols (IV), par couplage avec un composé (V) à chaud dans un solvant tel que le chlorobenzène.
Ensuite, les composés de formule (Ι') dans lesquels R3 est différent de H peuvent être préparés à partir du composé de formule ( ) correspondant dans lequel R3=H, par alkylation de la fonction aminé par action d'un halogénure, et notamment un chlorure d'alkyle X-R3, en présence d'un hydrure tel que NaH dans le DM F.
Les composés de formule (Γ) ainsi préparés peuvent correspondre à un composé de formule (I), si les groupes R'i et R'2 sont respectivement Ri et R2. Il est également possible d'obtenir le groupe Ri ou 2 souhaité, à partir d'un groupe précurseur R'i ou R'2 après une ou plusieurs transformations. Par exemple, un groupe Ri=H pourra être obtenu par réduction d'un groupe Ri=Me, par action de BBr3 dans le dichlorométhane.
Les molécules de formule (I) sont donc d'accès chimique simple, et peuvent être obtenues à un faible coût de préparation.
Les sels des composés selon l'invention sont préparés selon des techniques bien connues de l'Homme de l'art. Les sels des composés de formule (I) et (Ip) selon la présente invention comprennent ceux avec des acides ou des bases, minéraux ou organiques qui permettent une séparation ou une cristallisation convenable des composés de formule (I) ou (Ip), ainsi que des sels pharmaceutiquement acceptables. En tant qu'acide approprié, on peut citer : l'acide oxalique ou un acide optiquement actif, par exemple un acide tartrique, un acide dibenzoyltartrique, un acide mandélique ou un acide camphosulfonique, et ceux qui forment des sels physiologiquement acceptables, tels que le chlorhydrate, le bromhydrate, le sulfate, l'hydrogénosulfate, le dihydrogénophosphate, le maléate, le fumarate, le 2- naphtalènesulfonate, le paratoluènesulfonate, le mésylate, le bésylate, l'isotionate. En tant que base appropriée, on peut citer : la lysine, l'arginine, la méglumine, la bénéthamine, la benzathine et celles qui forment des sels physiologiquement acceptables, tels que des sels de sodium, de potassium, de calcium. Comme composé sous forme hydratée, on peut citer, à titre d'exemple, les semihydrates, monohydrates et polyhydrates.
Les composés de formule (I) et (Ip) ci-dessus comprennent également ceux dans lesquels un ou plusieurs atomes d'hydrogène, de carbone ou d'halogène, notamment de chlore ou de fluor ont été remplacés par leur isotope radioactif par exemple le tritium ou le carbone-14. De tels composés marqués sont utiles dans des travaux de recherche, de métabolisme ou de pharmacocinétique, dans des essais biochimiques.
Les groupes fonctionnels éventuellement présents dans la molécule des composés de formule (I) ou (Ip) et dans les intermédiaires réactionnels peuvent être protégés, soit sous forme permanente soit sous forme temporaire, par des groupes protecteurs qui assurent une synthèse univoque des composés attendus. Les réactions de protection et déprotection sont effectuées selon des techniques bien connues de l'Homme de l'art. Par groupe protecteur temporaire des aminés, alcools ou des acides carboxyliques on entend les groupes protecteurs tels que ceux décrits dans Protective Groups in Organic Synthesis, Greene T.W. et Wuts P.G. ., ed John Wiley et Sons, 2006 et dans Protecting Groups, Kocienski P.J., 1994, Georg Thieme Verlag.
Les inventeurs ont démontré l'effet potentialisateur des composés selon l'invention par des fluoroquinolones, et en particulier des fluoroquinolones hydrophiles telles que la norfloxacine ou la ciprofioxacine, sur des bactéries à Gram positif appartenant aux genres staphylocoque ou entérocoque. Ces effets portent notamment des souches résistantes, telles que des souches de Staphylococcus aureus résistantes à la méticilline (SARM) ou aux glycopeptides (GISA pour Glycopeptides Intermediate S. aureus). En général, les composés selon l'invention présentent une activité améliorant d'un facteur 2 à 128 l'activité de l'antibiotique classique. Le mécanisme d'action de cet effet potentialisateur passe par une activité inhibitrice des pompes à efflux bactériennes et, en particulier, de NorA.
Les composés selon l'invention peuvent donc être utilisés pour potentialiser l'effet, c'est-à-dire augmenter l'effet, d'agents antimicrobiens et en particulier d'antibiotiques devenus inactifs sur des souches résistantes via un mécanisme d'efflux. Par potentialisation, on entend qu'en associant un composé de formule (I) ou (Ip) et un agent antimicrobien, on obtient un effet antimicrobien supérieur à celui obtenu avec l'un ou l'autre des composés et même synergique, c'est à dire supérieur à la somme des effets obtenus séparément.
Les composés de formule (I) ou (Ip) peuvent ainsi être utilisés pour restaurer l'action d'antibiotiques traditionnels, dans les cas où les pompes à efflux sont responsables d'une résistance significative à ces antibiotiques. Comme exemple de résistance aux antibiotiques, on peut citer la résistance aux quinolones de Staphylococcus aureus et de Streptococcus pneumoniae, ainsi que les diverses résistances de Pseudomonas aeruginosa (ASMNews, (1997), 63, 605-610). On peut également se référer au Merck Index, llth Ed., Budavari éd., 1989, Merck & Co., Inc., Rahway, N. J., pp. THER-9 à THER-11 et THER-13, qui décrit un certain nombre d'agents antibiotiques dont l'effet pourrait être potenttalisé grâce aux composés de formule (I) ou (Ip).
Au vu de ces résultats, les composés de formule (I) ou (Ip) peuvent être utilisés dans des compositions pharmaceutiques ou phytosanitaires, destinées à restaurer l'efficacité d'agents antibiotiques ayant été affectée par un mécanisme d'expulsion par NorA. Ces compositions peuvent contenir, en plus de l'inhibiteur, un antibiotique, notamment, de la famille des fluoroquinolones, et un excipient usuel permettant l'ingestion et le transport des principes actifs.
De plus, aucun signe de toxicité cellulaire n'a été observé avec les composés selon l'invention aux doses pharmacologiquement actives. Leur toxicité est donc compatible avec leur utilisation comme médicaments.
D'une façon générale, les composés selon l'invention pourront être utilisés pour la préparation d'un médicament à activité anti-microbienne ou, de préférence, pour la préparation d'un médicament destiné à améliorer l'action d'agents antimicrobiens dont l'efficacité est affectée par des mécanismes de pompes à efflux, en particulier NorA. Dans ce dernier cas, l'administration d'un composé de formule (I) ou (Ip) s'accompagne donc de l'administration de l'agent antimicrobien dont on souhaite améliorer l'activité. Le composé de formule (I) ou (Ip) peut être formulé en association avec ledit agent antimicrobien ou faire l'objet d'une formulation séparée. Il pourra également être utilisé pour la réalisation de tests diagnostiques comme un antibiogramme permettant de mettre en évidence, pour la souche concernée, un mécanisme de résistance par efflux.
La présente invention a donc également pour objet les composés de formule (Ip), ainsi que les composés 1.1 à 1.16, leurs sels pharmaceutiquement compatibles, ou éventuellement solvants ou hydrates, en tant que médicaments.
Les compositions administrables aux plantes et aux animaux (y compris l'humain) contiennent une dose efficace d'un composé selon l'invention ou d'un sel, d'un solvat ou d'un hydrate acceptable de celui-ci, et des excipients convenables.
Lesdits excipients sont choisis selon la forme et le mode d'administration souhaité. Dans les compositions pharmaceutiques de la présente invention pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intra-veineuse, topique, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale ou intraoculaire, les principes actifs de formule (I) ou (Ip) ci-dessus, ou leurs sels, solvats et hydrates éventuels, peuvent être administrés sous formes unitaires d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques, aux animaux et aux humains pour la prophylaxie ou le traitement de maladies infectieuses liées à des bactéries résistantes ou non. Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intranasale, les formes d'administration sous-cutanées, intramusculaires ou intraveineuses et les formes d'administration rectales. Pour l'application topique, on peut utiliser les composés selon l'invention dans des crèmes, pommades, lotions ou collyres. Afin d'obtenir l'effet, la dose de principe actif varie, de préférence, entre 1 et 100 mg par kg de poids du corps et par jour. Le composé (I) ou (Ip) et l'agent antimicrobien dont l'effet est à potentialiser sont avantageusement administrés dans un rapport de 4 à 1.
Lorsqu'on prépare une composition solide sous forme de comprimés, on mélange l'ingrédient actif principal avec un véhicule pharmaceutique, tel que la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique ou analogues. On peut enrober les comprimés de saccharose, d'un dérivé cellulosique, ou d'autres matières appropriées ou encore on peut les traiter de telle sorte qu'ils aient une activité prolongée ou retardée et qu'ils libèrent d'une façon continue une quantité prédéterminée de principe actif.
On obtient une préparation en gélules en mélangeant l'ingrédient actif avec un diluant et en versant le mélange obtenu dans des gélules molles ou dures.
Les compositions pharmaceutiques contenant un composé de l'invention peuvent aussi se présenter sous forme liquide, par exemple, des solutions, des émulsions, des suspensions ou des sirops. Les supports liquides appropriés peuvent être l'eau, les solvants organiques tels que le glycérol ou les glycols, de même que leurs mélanges, dans des proportions variées, dans l'eau.
Une préparation sous forme de sirop, d'élixir ou pour l'administration sous forme de gouttes peut contenir l'ingrédient actif conjointement avec un édulcorant acalorique de préférence, du méthylparaben et du propylparaben comme antiseptique ainsi qu'un agent donnant du goût et un colorant approprié. Les poudres ou les granules dispersibles dans l'eau peuvent contenir l'ingrédient actif en mélange avec des agents de dispersion, ou des agents mouillants, ou des agents de mise en suspension, comme la polyvinylpyrrolidone, de même qu'avec des édulcorants ou des correcteurs de goût.
La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques contenant plusieurs principes actifs en association dont l'un est un composé (I) ou (Ip) et l'autre un agent anti-microbien tel que précédemment défini.
Par ailleurs, d'une façon générale, les mêmes préférences que celles indiquées précédemment pour les composés et compositions sont applicables mutatis mutandis aux médicaments et utilisations mettant en œuvre ces composés.
La présente invention a également pour objet l'utilisation des inhibiteurs tels que définis ci-dessus dans des méthodes de diagnostics et notamment leur utilisation pour mettre en évidence in vitro, la présence dans un échantillon biologique de bactéries résistantes à un antibiotique ainsi que leur degré de résistance. Les synthèses et descriptions des tests biologiques ci-après, en référence aux figures annexées, illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
A. EXEMPLES
Les composés suivants présentés dans le TABLEAU 1 ont été synthétisés.
TABLEAU 1
1.15 H 2,3-dihydro-9-hydroxy-7-méthoxy- lH-cyclopenta[cj
quinolin-4(5H)-one
1.16 l-benzyl-5,7-dimethoxy-4-methyl- 3-phenylquinolin-2(lH)-one
Méthode A
Les composés listés dans le TABLEAU 2 suivant ont été synthétisés selon la méthode A.
TABLEAU 2
Composé Ar = 4
1.1
1.2 →G^oMe 1.3
Me
1.4
1.5
1.6
H
Méthode B
Les composés listés dans le TABLEAU 3 suivant ont été préparés selon la méthode B.
TABLEAU 3
Les composés listés dans le TABLEAU 4 suivant ont été préparés selon la méthode C.
TABLEAU 4
Les composés listés dans le TABLEAU 5 suivant ont été préparés selon la méthode D.
TABLEAU 5
Méthode A
Première étape :
Voie A : Le dérivé d'aniline 1 (commercial ou préparé selon Feka et al. Heterocycles, 2002, 57, 123-128) est dissout dans le tétrahydrofurane (5 mL/mmol) a 0°C et sous argon. La triéthylamine (1,2 éq) est ajoutée suivie par l'addition en goutte à goutte du chlorure d'arylacétique (1,2 éq.) en solution dans le tétrahydrofurane (9 mL/mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant 15 h à température ambiante puis hydrolysé par l'ajout d'H20. La solution est extraite avec l'acétate d'éthyle et la phase organique est lavée successivement avec une solution de NaHCC (5% dans l'eau) et une solution saturée de IMaCI. La phase organique est séchée sur MgSÛ4 puis concentrée. Une purification sur colonne de gel de silice éluée par CH2CI2/MeOH (99,5:0,5 ; v:v) conduit au produit pur 2.
Voie B: Le dérivé d'aniline 2 est dissout dans le DMF (8 mL/mmol) sous une atmosphère d'argon puis traité successivement par de la Et3N (2 éq..), du BOP-CI (2.éq) et de l'acide 2-arylacétique (2 éq.). La réaction est agitée à température ambiante pendant 48H puis arrêtée par l'ajout de NaHC03 (5% dans H20). Le DMF est évaporé sous vide et le résidu est extrait par l'acétate d'éthyle, lavé avec une solution saturée de NaCI, puis séché sur MgSÛ4 puis concentré. Une purification sur colonne de gel de silice éluée par CH2CI2 conduit au produit attendu 2.
Deuxième étape :
Le dérivé 2 (1,52 g, 4.39 mmol) est dissout dans le f-BuOH (5 mL/mmol). f-BuOK (5 éq.) est ajouté et la solution est agitée à température ambiante pendant 12 heures. Le f-BuOH est ensuite évaporée sous vide et une solution saturée de NH4CI est ajoutée. La solution est extraite par l'acétate d'éthyle (AcOEt), lavée à l'eau, puis par une solution saturée de NaCI et enfin séchée sur MgSO->. La phase organique est concentrée et le produit est cristallisé dans le MeOH puis les cristaux sont lavés par CH2CI2 pour fournir le produit pur 3.
Méthode B
A une solution du dérivé 3 dans le THF (8 mL/mmol) et sous atmosphère d'argon est ajouté le IMaH (4 éq.) et la solution est agitée à température ambiante pendant 30 min. L'iodure de méthyle (1,5 éq) est ajouté en goutte à goutte et la solution est laissée sous agitation pendant 24 h. La réaction est arrêtée par l'ajout d'H20 puis extraite par l'acétate d'éthyle. La Phase organique est séchée sur MgS04 puis évaporée. Une purification par chromatographie sur gel de silice éluée par CH2CI2 fournit le produit attendu 4.
Méthode C
Une solution du dérivée 4 dans le CH2CI2 (20 mL/mmol) est traitée par du BBr3 (1 éq.) à 0 °C sous une atmosphère d'argon. Après 30 min. d'agitation à 0°C, de l'eau est ajoutée et la solution est filtrée pour fournir un précipité marron. Le produit solide est lavé par le CH2CI2. Une purification sur gel de silice en éluée par le CH2CI2 fournit le composé attendu 5. Méthode D
Le 3-amino-5-méthoxy-phénol 7 (préparé selon Chakraborti, A. K.; Sharma, L; Nayak, M. K. 3. Org. Chem. 2002, 67, 6406-6414.) est placé dans un ballon, avec le dérivé d'acétoacétate d'éthyle 8 (2 à 1,1 équiv) mis en solution dans du chlorobenzène. Le mélange reactionnel est placé dans un réacteur micro-ondes. La réaction se déroule à 160 °C et 130 W pendant un temps compris entre 5 et 30 min.
Remarque : La même réaction peut s'effectuer par chauffage thermique. Le milieu réactionnel est placé directement à 165 °C dans un bain graphite. Le mélange réactionnel est laissé à reflux sous argon entre 2 et 72 h. Le produit de la réaction précipite dans le chlorobenzène à température ambiante, il est filtré puis lavé avec du dichlorométhane. Caractéristiques physicochimiques des composés synthétisés selon les méthodes A, B, C et D
3-(3-Chlorophényl)-5,7-diméthoxy-4-méthylquinolin-2(lH)-one, composé 1.1
Rendement = 95%.
RMN H (DMSO; 400 MHz) 011.63 (s, 1H, NH); 7.36 (m, 2H, Ph-CI); 7.20 (s, 1H, Ph-CI); 7.10 (m, 1H, Ph-Cl); 6.44 (s, 1H, H6 or H8); 6.31 (s, 1H, H6 or H8); 3.79 (s, 3H, OCH3); 3,77 (s, 3H, OCH3); 2.29 (s, 3H, CH3).
RMN 13C (DMSO; 100 MHz) δ : 161.87; 161.24; 160.11; 145.46; 141.83; 139.90; 133.13; 130.95; 130.36; 130.00; 128.25; 127.44; 105.55; 94.48; 91.51; 56.49; 55.91; 22.09.
MS (ESI+) m/z [M+H]+ 330, [M+Na]+ 352. 5,7-Diméthoxy-3-(4-méthoxyphényl)-4-méthylquinolin-2(lH)-one/ composé 1.2
Rendement = 80%.
RMN ^ (CDCI3; 400 MHz) Ô 12.12 (s, IH, NH); 7.24 (d, 2H, J = 8.8 Hz, Ph- OCH3) ; 6.95 (d, 2H, J = 8.8 Hz, Ph-OCH3); 6.37 (d, IH, J - 2.4 Hz, H6 or H8) ; 6.21 (d, IH, J = 2.4 Hz, H6 or H8); 3.85 (s, 3H, OCH3); 3.83 (s, 3H, OCH3); 3.78 (s, 3H, OCH3); 2.46 (s, 3H, CH3).
RMN 13C (CDCI3; 100 MHz) ô 163.48 (Cq); 161.43 (Cq); 159.62 (Cq); 158.65 (Cq); 146.86 (Cq); 140.90 (Cq); 131.88 (Ph-OMe C2' and C6'); 129.15 (Cq); 128.56 (Cq); 113.53 (Ph-OMe C3' and C5'); 106.83 (Cq); 94.66 (C8); 91.04 (C6); 55.51 (OMe); 55.46 (OMe); 55.30 (OMe); 21.88 (Me).
MS (ESI+) m/z [M+H]+ 326, [M+Na]+ 348.
5,7-diméthoxy-4-méthyl-3-(l-méthyl-lH-indol-3-yl)quinolin- 2(lH)-one, composé 1.3
Rendement = 99%.
RMN XH (DMSO; 400 MHz) δ 11.51 (s, IH, NH); 7.42 (m, IH, indol); 7.28 (s, IH, indol); 7.12 (m, 2H, indol); 6.97 (m, IH, indol); 6.45 (s, IH, H8); 6.31 (s, IH, H6); 3.80 (m, 6H, 2 OCH3 or OCH3 and CH3-indol) ; 3,77 (s, 3H, OCH3 or CH3-indol); 2.37 (s, 3H, CH3).
RMN 13C (DMSO; 100 MHz) δ 161.33; 160.76; 159.13; 144.77; 140.80; 136.17; 130.43; 127.67; 121.94; 120.75; 119.54; 118.84; 109.71; 108.82; 105.44; 93.63; 90.80; 55.79; 55.24; 32.44; 22.04.
MS (ESI+) m/z [M+H]+ 349, [M+Na]+ 371.
5,7-diméthoxy-4-méthyl-3-(thiophen-2-yl)quinolin-2(lH)-onef composé 1.4
Rendement = 63%.
RMN *H (CDCI3; 400 MHz) δ 12.57 (s, IH, NH); 7.42 (m, IH, thiophène); 7.11 (m, IH, thiophène); 7.02 (m, IH, thiophène); 6.48 (s, IH, H8); 6.23 (s, IH, H6); 3.84 (s, 6H, 2 OCH3); 2.62 (s, 3H, CH3). RMN 13C (CDC ; 100 MHz) δ 163.18; 162.14; 159.81; 149.78; 141.17; 137.36; 128.95; 126.51; 126.35; 121.52; 104.10; 95.13; 91.27; 55.68 (2C); 22.42.
MS (ESI+) m/z [M+H]+ 302
5,7-diméthoxy-4-méthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.5
Rendement = 98 %.
RMN XH (DMSO; 400 MHz) S 7.37-7.29 (m, 2H, Ph); 7.29-7.26 (m, IH, Ph); 7.14-7.12 (m, 2H, Ph); 6.44 (s, IH, H8); 6.30 (s, IH, H6); 3.78 (s, 3H, OCH3); 3.76 (s, 3H, OCH3); 2.28 (s, 3H, CH3).
RMN 13C (DMSO; 100 MHz) δ 161.64; 161.51; 160.01; 144.87; 141.71; 137.69; 131.14; 129.71; 128.46; 127.37; 105.65; 94.37; 91.46; 56.44; 55.87; 22.08.
MS (ESI+) m/z [M+H]+ 296, [M+Na]+ 318.
3-(lH-indol-3-yl)-5,7-diméthoxy-4-méthylquinolin-2(lH)-onef composé 1.6
Rendement - 45%.
RMN IH (DMSO; 400 MHz) δ 11.52 (s, IH, NH); 11.19 (s, IH, NH); 7.41 (m, IH, indol); 7.30 (s, IH, indol); 7.14 (m, IH, indol); 7.08 (m, IH, indol); 6.97 (m, IH, indol); 6.49 (s, IH, H8); 6.34 (s, IH, H6); 3.84 (s, 3H, OCH3); 3,81 (s, 3H, OCH3); 2.41 (s, 3H, CH3).
MS (ESI+) m/z [M+H]+ 335, [M+Na]+ 357.
5-Hydroxy-7-méthoxy-4-méthyl-3-(thiophen-2-yl)quinolin-2(lH)- one, composé 1.7
Rendement = 72 %.
RMN *H (DMSO; 400 MHz) δ 11.54 (s, IH, NH); 10.37 (s, IH, OH); 7.58 (m, IH, thiophène); 7.08 (m, IH, thiophène); 6.96 (m, IH, thiophène); 6.34 (d, IH, 3 = 2.4 Hz, H6 or H8); 6.22 (d, IH, 3 = 2.4 Hz, H6 or H8); 3.74 (s, 3H, OCH3); 2.49 (s, 3H, CH3). RMN 13C (DMSO; 100 MHz) δ : 161.39; 160.90; 158.14; 147.84; 141.37; 137.39; 128.79; 126.72; 126.55; 120.92; 104.74; 96.74; 90.20; 55.29; 48.79; 21.90.
MS (ESI+) m/z [M+H]+ 288, [M+Na]+ 310
5-hydroxy-7-méthoxy-l,4-diméthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.8
Rendement = 40 %.
RMN lH (DMSO; 400 MHz) δ 7.39-7.37 (m, 2H, Ph); 7.31 (m, IH, Ph); 7.15 (m, 2H, Ph); 6.43 (s, IH, H8 or H6); 6.35 (s, IH, H6 or H8); 3.83 (s, 3H, OCH3); 3.56 (s, 3H, CH3); 2.34 (s, 3H, CH3).
MS (ESI+) m/z [M+H]+ 296, [M+Na]+ 318.
5-hydroxy-7-méthoxy-4-méthyl-3-(naphthalen-2-yl)quinolin- 2(lH)-one, composé 1.9
Rendement = 61 %.
RMN 1H (DMSO; 400 MHz) δ 7.92 (m, 3H, biphényl); 7.72 (s, IH, biphényl); 7.52 (m, 2H, biphényl); 7.32 (m, IH, biphényl) 6.37 (d, IH, J = 2.8 Hz, H8); 6.24 (d, IH, J = 2.8 Hz, H6); 3.75 (s, 3H, OCH3); 2.40 (s, 3H, CH3).
MS (ESI+) m/z [M+H]+ 332, [M+Na]+ 354.
5,7-Diméthox7-l,4-diméthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.10
Rendement = 57%
RMN 1H (DMSO; 400 MHz) δ C7.41-7.37 (m, 2H) ; 7.33-7.31 (m, IH) ; 7.15 (m, 2H); 6.56 (d, J = 2 Hz, IH, H8); 6.48 (d, 7 = 2H, IH, H6); 3.91 (s, 3H, OCH3); 3.85 (s, OCH3); 3.34 (s, 3H, NCH3), 2.29 (s, 3H, C-CH3).
RMN 13C (DMSO; 100 MHz) δ : 161.3; 160.42; 159.86; 142.92; 141.89; 137.84; 130.41 (2C); 128.38; 127.93 (2C); 126.78; 105.64; 93.75; 91.50; 55.96; 55.51; 30.34; 21.79.
MS (ESI+) m/z [M+H]+ 310, [M+Na]+ 332; [M+Na]+; [2M+Na]+ 641. 7-Hydroxy-5-méthoxy-4-méthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.11
Rendement = 4 %.
RMN *H (DMSO; 400 MHz) δ 7.40-7.36 (m, 2H, Ph); 7.31 (m, IH, Ph); 7.15 (m, 2H, Ph); 6.35 (s, IH, H8); 6.20 (s, IH, H6); 3.79 (s, 3H, OCH3); 2.30 (s, 3H, CH3).
RMN 13C (DMSO; 100 MHz) δ : 161.00; 159.52; 144.35; 141.15; 137.27; 130.59; 128.18; 127.81; 126.64; 104.04; 94.41; 93.15; 55.59; 21.45.
MS (ESI+) m/z [M+H]+ 282.
5-Hydroxy-7-méthoxy-4-méthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one/ composé X.12
Rendement = 89 %.
RMN lH (DMSO; 400 MHz) δ 7.39-7.37 (m, 2H, Ph); 7.30 (m, IH, Ph); 7.16 (m, 2H, Ph); 6.34 (s, IH, H8); 6.22 (s, IH, H6); 3.74 (s, 3H, OCH3); 2.36 (S, 3H, CH3).
RMN 13C (DMSO; 100 MHz) δ : 161.03; 160.71; 157.82; 144.83; 141.26; 137.15; 130.57; 128.26; 127.81; 126.66; 104.39; 96.33; 90.00; 55.00; 21.22.
MS (ESI+) m/z [M+H]+ 282.
5,7-Dihydroxy-4-méthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.13
Rendement = 86 %.
RMN *H (DMSO; 400 MHz): 5 11,34 (s, IH, NH); 10.05 (s, IH, OH); 9.82 (s, IH, OH); 7.38-7.30 (m, 3H, Ph); 7.15 (m, 2H, Ph); 7.15 (m, 2H, Ph); 6.20 (s, IH, H8); 6.12 (s, IH, H6); 3.34 (s, 3H, OCH3); 2.33 (s, 3H, CH3).
MS (ESI+) m/z [M+H]+ 268, [M+Na]+ 290. 3-Benzyl-5-hydroxy-7-méthoxy-4-méthylquinolin-2(lH)-one, composé 1.14
Rendement - 88% (cristaux blancs).
P.F. > 278°C, décomposition.
Rf = 0,29 (DCM/MeOH 97:3).
RMN *H (400 MHz, DMSO-£¾): 52,53 (s, 3H, Me) ; 3,72 (s, 3H, OMe) ; 3,96 (s, 2H, 2χΗ1') ; 6,2 (d, J = 2,45 Hz, IH, H6) ; 6,34 (d, J = 2,45 Hz, IH, H8) ; 7,12-7,23 (m, 5H, Ph) ; 10,23 (s, IH, OH) ; 11,45 (s, IH, NH).
RMN 13C (100 MHz, DMSO-ûfe): δ 19,5 (CMe) ; 31,1 (Cl') ; 55,0 (COMe) ; 90,0 (C6) ; 96,4 (C8) ; 104,5 (C4a) ; 125,3 (C3) ; 125,5 (C5 ; 127,9 (C4',C6') ; 128,2 (C3', C7') 140,7 (C2 ; 140, 8 (C8a) ; 145,3 (C4) ; 157,4 (C5) ; 161,3 (C7) ; 161,9 (C2).
Masse (ESI+): m/z (%) 296 [M+H]+ (100), 318 [M+Na]+ (50), 613 [2xM+Na]+ (30).
2,3-Dihydro-9-hydroxy-7-méthoxy-lH-cyclopenta[c]quinolin- 4(5H)-one, composé 1.15
Rendement = 74% (poudre marron).
P.F. 189-190°C
Rf = 0,2 (DCM/MeOH 97:3).
RMN XH (400 MHz, DMSO-ûfe): δ 1,96 (q, 3 = 7,6 Hz, 2H, 2xH2') ; 2,6 (t, J = 7,6 Hz, 2H, 2xH1 ; 3,27 (t, J = 7,6 Hz, 2H, 2xH3') ; 3,71 (s, 3H, OMe) ; 6,16 (d, J = 2,3 Hz, IH, H6) ; 6,33 (d, J = 2,3 Hz, IH, H8) ; 10,13 (s, IH, OH) ; 11,27 (s, IH, NH).
RMN 13C (100 MHz, DMSO-£¾): 522,6 (C2') ; 29,1 (Cl1) ; 35,7 (C3') ; 55,0 (COMe) ; 89,9 (C6) ; 95,6 (C8) ; 103,2 (C4a) ; 128,0 (C3) ; 142,0 (C8a) ; 150,6 (C4) ; 156,1 (C5) ; 160,6 (C7) ; 160,7 (C2).
Masse (ESI+): m/z (%) 232 [M+H]+ (100), 254 [M+Na]+ (50), 485 [2xM+Na]+ (60). l-Benzyl-5,7-dimethoxy-4-methyl-3-phenylquinolin-2(lH)-one, composé 1.16
Rendement = 67%
RMN ^ (400 MHz, DMSO-û ): δ 7.45- 7.20 (m, 10H) ; 6.61 (d, J = 2 Hz, 1H, H8); 6.50 (d, J = 2H, 1H, H6); 4.32 (s, 2H); 3.89 (s, 3H, OCH3); 3.82 (s, OCH3); 2.31 (s, 3H, C-CH3).
Masse (ESI+) m/z [M+H]+ 385
B. TESTS BIOLOGIQUES
B.I Evaluation de l'effet « potentialisateur » de l'association des composés selon l'invention sur l'activité de la ciprofloxacine et de leur activité antibiotique propre - Composés
Tous les composés selon l'invention sont solubilisés dans du Diméthylsufoxyde (DMSO). Pour chaque composé, la plus forte concentration utilisable au cours des expérimentations est déterminée en tenant compte de la toxicité du solvant (concentration finale en DMSO au contact des bactéries inférieure à 3 %) ainsi que de la capacité du composé à se solubiliser dans du milieu Mueller Hinton II (MH II). En effet, certains composés précipitent lors des dilutions des solutions à base de DMSO dans du milieu MH II.
- Antibiotique
L'antibiotique utilisé est une fluoroquinolone : la ciprofloxacine. Sa solubilisation est effectuée dans de l'eau osmosée stérile ou du MH II acidifié avec une solution d'HCI. Vingt μΙ_ de HCI 12 N (ou 5 pL de HCI 35 %) sont nécessaires pour solubiliser 10 mg de ciprofloxacine dans 1 ml_ de H20 osmosée stérile. -Souches bactériennes
La souche permettant le criblage des composés est une souche de Staphyiococcus aureus issue de « l'American Type Culture Collection » ou ATCC appelée S. aureus ATCC 29213.
Evaluation de l'effet potentialisateur de l'association de chaque composé selon l'invention sur l'activité de la ciprofloxacine
Cet effet potentialisateur est évalué en comparant la CMI de la ciprofloxacine seule à celle de la ciprofloxacine associée à un composé selon l'invention selon la méthode des CMI. Celle-ci a été réalisée selon le protocole décrit par le Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CASFM) et par le Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). La détermination des CMI est réalisée en micro plaque 96 puits à fonds ronds, en milieu liquide MH II. Une gamme de dilution de ciprofloxacine est réalisée dans du milieu MH II. Dans chaque puits d'une première colonne, sont mélangés 100 pL d'une suspension bactérienne à 106 CFU/mL, 50 pL d'une gamme de dilution de ciprofloxacine et 50 pL de MH II. Dans chaque puits d'une deuxième colonne, sont mélangés 100 pL d'une suspension bactérienne à 106 UFC (Unité Formant Colonie)/mL, 50 pL cTune gamme de concentration de ciprofloxacine et 50 pL d'une solution d'un composé selon l'invention à la concentration la plus élevée possible. Après 18-24 h d'incubation à 37°C, la plus petite concentration en antibiotique pour laquelle aucun développement bactérien n'est observé (CMI) est relevée dans les 2 colonnes avec et sans molécule de synthèse. Un composé selon l'invention présente un effet potentialisateur sur l'activité de la ciprofloxacine par rapport à l'effet de la ciprofloxacine seule si la CMI de celle-ci est abaissée d'un facteur de dilution > 4 en présence de ce composé. Evaluation de l'activité antibiotique des composés selon l'invention seuls
L'activité antibiotique d'une molécule est évaluée par la technique des CMI. La détermination de la CMI d'une molécule est réalisée en micro plaque 96 puits, en milieu liquide MH II selon le protocole du CASFM et du CLSI. Une gamme de dilution de la molécule est réalisée au préalable dans du milieu MH II. Dans chaque puits sont mélangés 100 μί d'une suspension bactérienne de S. aureus ATCC 29213 (106 UFC/mL), 50 μί de la gamme de dilution du composé testé et 50 [il de MH II. Après 18-24 h d'incubation à 37°C, les molécules ayant montré une inhibition du développement bactérien sont répertoriées comme ayant une activité antibiotique. La plus petite concentration en composé pour laquelle aucun développement bactérien n'est observé représente la CMI (concentration la plus faible inhibant la croissance des bactéries).
- Résultats
Les 16 composés selon l'invention testés potentia lisent l'activité de la ciprofloxacine (à des degrés différents).
Parmi les 16 composés, 4 composés (les composés 1.11, 1.12, 1.13 et
1.7) présentent également une activité antibiotique seule. Les composés 1.12, 1.13 et 1.7 montrent une activité antibiotique pour des concentrations respectivement de 62,5-125 μΜ, 155 μΜ et 62,5-125 μΜ. Le composé 1.11 n'est pas présent en quantité suffisante pour continuer les analyses.
B.II Description du spectre d'activité du composé 1.12
- Antibiotique et composé I.Î2
L'antibiotique utilisé est la ciprofloxacine avec la même dilution qu'au paragraphe B.l. Le composé 1.12 est également utilisé dans les mêmes conditions que dans le paragraphe B.l. - Souches bactériennes
Cinquante-six souches appartenant à 19 genres ont été utilisées (TABLEAU 6).
TABLEAU 6
Résistances Souches
- ATCC 29 213
- ATCC 25 923
SARM ST07 1012
SARM HT06 0164
SARM HT02 0634
SARM HT03 0336
SARM HT04 0473
SARM HT05 0109 aureus SARM ST07 1170
Staphylococcus SARM HT03 0870
SARM HT02 0290
SARM HT06 0163
VISA VI
VISA V3
VISA V4
VISA V5
VISA V7
ATCC 14 990 epidermidis - {CIP 81551)
VRE VanA 1
VRE VanA 2
VRE VanA 3
Enterococcus faecium
VRE VanB 4
VRE VanB 5
VRE VanB 6 Résistances Souches
- B509081205
VRE VanA 8196211
VRE VanB 8445271
- ATCC 29212
VRE VanA 7
VRE VanA 8
faecalis VRE VanA 9
VRE VanB 10
VRE VanB 11
VRE VanB 12
ATCC 49619 pneumoniae - (CIP 104485) agalactiae (Strepto
Streptococcus - (10.03.08)
B)
pyogenes (Strepto 8370
-
(15.01.09)
Listeria monocytogenes - 4243118 cereus - 17.1240
Bacillus
subtilis - ATCC 6683
Corynebacterium amycolatum - 103452T
Acinetobacter baumannii - Souche 1 aeruginosa - 15 442
Pseudomonas
fluorescens - 0025577401
Burkholderia cepacia - 734
Stenotrophomonas maltophilia - ATCC 17666
Escherichia coli - ATCC 25922 enterobacteriaceae pneumoniae - 26.2362
Klebsiella
oxytoca - ATCC 700324 Résistances Souches
Salmonella enterica - H H 0436412
Citrobacter freundii - 26.7009
aerogenes - -
Enterobacter
sakazakii - ATCC 51329
40437322
Serratia marscecens - (14.01.09)
Proteus mirabilis - 26.5354
Yersinia enterocolitica - 08484255
Neuf de ces souches sont des souches ATCC et 47 sont d'origines cliniques et proviennent du Centre de Biologie Est de Bron. Dix-huit souches de staphylocoque sont testées : 1 souche de S. epidermidis, 2 souches de 5. aureus, 10 SARM {S. Aureus Résistants à la Méticiline) et 5 VISA (S. Aureus de sensibilité intermédiaire à la Vancomycine). Seize souches d'entérocoques sont également testées soit 9 £ faecium et 7 E faecafis. Ces 2 dernières espèces regroupent 2 souches sensibles à la vancomycine (1 par espèce), et 14 souches résistantes (VRE, respectivement 8 £ faecium et 6 £ faecalis). Les autres genres sont répertoriés dans le TABLEAU 6 ci-dessus.
- Evaluation de l'effet potentialisateur de l'association du composé 1.12 sur l'activité de la ciprofloxacine
Cet effet potentialisateur est évalué comme précédemment. Cependant, la croissance en milieu liquide de certains micro-organismes (Streptococcus pneumoniae, S. agalactiae, S. pyogenes, Corynebacterium amycolatum et Listeria monocytogenes) nécessite du sang de cheval défibriné lysé dans 50 % d'eau osmosée stérile par une succession de 7 congélations (- 20°C) / décongélations (température ambiante). Le sang à 50 % est ensuite centrifugé à température ambiante à 12000 rpm pendant 20 min. Le surnageant est introduit dans du MH II stérile sans additif à hauteur de 5 % en volume. -Evaluation de l'activité antibiotique du composé 1.12
L'activité antibiotique du composé 1.12 est évaluée par la technique des (CMI) selon le protocole décrit précédemment, en tenant compte des exigences en sang de certaines souches.
- Résultats
Parmi les 56 souches bactériennes testées, 28 se sont révélées plus sensibles à la ciprofloxacine lorsque le composé 1.12 lui est associé. Ces souches sont des bactéries à Gram positif de type Staphylocoque et Entérocoque y compris des souches résistantes (voire multirésistantes) :
-2/2 S. aureus sensibles aux antibiotiques classiques, 10/10 S. aureus résistants à la méthicilline (SARM) et 5/5 S. aureus de sensibilité diminuée à la vancomycine (VISA) ;
-1/1 S. epidermidis.
-5/7 £. faecalis (4 sont des VRE c'est-à-dire des souches résistantes à la vancomycine) et 5/9 E faecium (les 5 étant des VRE) Le TABLEAU 7 présente la répartition des souches de staphylocoques et d'entérocoques sensibles à l'association de la ciprofloxacine et du composé 1.12
TABLEAU 7
Staphylococcus Enterococcus
epidermidis
aureus (n=17) faecalis (n=7) faecium (n=9)
(n l)
Souche
résistances 5ASM SARM VISA VSE VRE VSE VRE sensible
Nombre de
souches 2 10 5 1 1 6 1 8 testées
Nombre de
souches 2 10 5 1 1 4 0 5 sensibles
100
pourcentage 100% 100% 100% 100% 67 % 0 62,5%
% SASM : S. aureus sensible à la méticilline, SASM ; S. aureus sensible à la méticilline ; VISA : S. aureus de sensibilité intermédiaire à la vancomycine ; VSE : entérocoque sensible à la vancomycine, VRE : entérocoque résistant à la vancomycine
Pour chaque souche, les C Is de la ciprofloxacine sont divisées par un facteur > 16 en présence du composé 1.12 à l'exception d'une souche dont l'activité est > 4. Deux souches d'E faecium VRE non répertoriées dans les 28 précédemment citées sont faiblement sensibles à l'action de l'association du composé 1.12 à la ciprofloxacine (facteur > 2).
Les souches sensibles à l'action du composé 1.12 seul sont les mêmes souches (effet antibiotique propre du composé 1.12).
B-III- Recherche du mode d'action du composé 1.12
- Antibiotiques
Les antibiotiques utilisés sont l'érythromycine, la ciprofloaxacine, la vancomycine la tétracycline et l'oxacilline.
La ciprofloxacine est préparée comme décrit précédemment.
L'érythromycine conservation à 4°C) est reprise dans de l'éthano! à 96
%à une concentration de 10 mg /mL. La solution est ensuite diluée 10 fois puis 31,3 fois dans du bouillon MHII afin d'obtenir une solution mère de 32 pg/mL (8 pg/mL en cupule).
La vancomycine est reprise à une concentration de 10 mg /mL d'eau osmosée stérile. La solution est ensuite diluée 10 fois puis 15,6 fois dans du bouillon MHII afin d'obtenir une solution mère de 64 pg/mL (16 pg/mL en cupule).
La tétracycline est reprise dans de l'eau osmosée stérile à une concentration de 10 mg/ de tétracycline. La solution est ensuite diluée 10 fois puis 31,3 fois dans du bouillon MHII afin d'obtenir une solution mère de 32 pg/mL (8 pg/mL en cupule). L'oxacilline est reprise dans de l"eau osmosée stérile à la concentration de 10 mg/mL. La solution est ensuite diluée 10 fois puis 62,5 fois dans du bouillon M H II de manière à obtenir une solution mère de 16 Mg/mL (4 Mg/mL en cupule).
- Souches bactériennes
Les souches de S. aureus utilisées sont :
- la souche de référence ATCC 29213 ;
- deux souches ST07 1012 et V4 identifiées comme respectivement résistantes à la méticiline (SARM) et à la vancomycine
(VISA) ;
- des souches modifiées génétiquement et les souches dont elles sont dérivées : S. aureus 1199b (surexprimant la pompe à efflux NorA) et sa souche « mère » 1199 ; S. aureus K 1712 (ne présentant aucune pompe à efflux NorA au niveau de sa membrane bactérienne) et sa souche « mère » 8325-4.
- Evaluation de l'activité antibactérienne de l'association du composé 1.12 à différents antibiotiques sur la souche S. aureus ATCC 29213 (méthode des échiquiers)
La sensibilité de S. aureus ATCC 29213 à l'association des molécules antibiotiques ciprofloxacine et au composé 1.12 et l'effet de chacune des deux molécules sur l'activité de l'autre sont déterminées par la méthode de l'échiquier. Cette méthode est réalisée en plaque 96 puits à fond ronds (12 colonnes par 8 lignes). Différentes concentrations de ciprofloxacine et de composé 1.12 sont obtenues par dilution de leurs solutions mères dans du bouillon MH II. Cinquante microlitres de la gamme de dilution du composé 1.12 sont déposés dans chaque puits des colonnes 1 à 10, chaque ligne correspondant à une dilution de ce composé. Cinquante microlitres de la gamme de dilution de la ciprofloxacine sont déposés dans les puits de colonnes 2 à 10, chaque colonne correspondant à une dilution. Cette même gamme de dilution de la ciprofloxacine est également réalisée dans la colonne 11. Cinquante microlitres de bouillon MH II sont déposés dans les puits des colonnes 1 et 11. Enfin, 100 μί de suspension bactérienne à 106 UFC (Unité Formant Colonie) /mL sont introduits dans chaque puits des colonnes 1 à 10 (concentration finale en bactéries : 5.10s UFC/mL).
La lecture de la plaque est faite visuellement. Les 200 μί de réactifs introduits dans chaque puits sont soit troubles (croissance bactérienne) soit translucides (absence de croissance bactérienne). La concentration inhibitrice fractionnelle (FIC) est calculée en additionnant la FIC du composé 1.12 (FIC1.12) et la FIC de la ciprofloxacine (FICCipro) selon les formules suivantes :
-FIC1.12 = CMI du composé 1.12 en association avec la ciprofloxacine/CMI du composé 1.12 seul
-FICcipro = CMI du composé 1.12 en association avec la ciprofloxacine/CMI de la ciprofloxacine seule
-FIC = FId.12 + FICcipro
L'interprétation des résultats est la suivante : une FIC < 0,5 correspond à une synergie entre les deux molécules, une FIC >4 correspond à un antagonisme des deux molécules et une FIC comprise entre 0,5 et 4 correspond à une absence d'interaction entre les deux molécules.
- Evaluation de l'activité antibactérienne de l'association 1.12 / ciprofloxacine sur la souche S. aureus ATCC 29213
(méthode des cinétiques de croissance ou « time kill curve »)
Les cinétiques de croissance sont réalisées en plaques 6 puits. Chaque puits contient 5 mL de bouillon MH II ensemencé avec des bactéries en phase exponentielle de croissance (concentrations finales à 106UFC/mL). Les différentes conditions de croissances bactériennes testées sont :
- Puits 1 : 0,5 mg/ml de ciprofloxacine + 31 μΜ de 1.12.
- Puits 2 : 0,125 mg/ml de ciprofloxacine + 31 μΜ de 1.12.
- Puits 3 : 0,5 mg/ml de ciprofloxacine.
- Puits 4 : 0,125 mg/ml de ciprofloxacine.
- Puits 5 : 31 μΜ de 1.12. - Puits 6 : Aucune molécule.
Les cultures sont incubées à 37°C sous agitation 400 rpm. Des prélèvements sont effectués, chaque heure les 6 premières heures, et à 22 heures. Les bactéries vivantes sont dénombrées par culture sur boite après dilutions des cultures. Un effet synergique ou antagoniste des deux molécules est définis par une diminution > 2 logio UFC/ml et une augmentation > 2 logio UFC/ml entre les puits contenant l'association des deux molécules et ceux contenant la plus active des molécules.
- Résultats
- Evaluation de l'activité antibactérienne de l'association du composé 1.12 à différents antibiotiques sur la souche S. aureus ATCC 29213 (méthode des échiquiers)
La méthode des échiquiers met en évidence :
- Une association synergique (FIC < 0,5) antibactérienne d'1.12 et de la ciprofloxacine sur5. aureus ATCC 29213 ou des souches résistantes de type SARM (souche ST07 1012) et VISA (souche V4). Une absence d'interaction (FIC > 0,5 mais <4) entre 1.12 et l'oxacilline, l'érythromycine, la tétracycline, la vancomycine sur la même souche bactérienne.
- Une absence d'interaction pour chaque ATB avec la souche K 1712 (souche sans la pompe NorA) et une association hautement synergique avec la souche 1199B (souche surexprimant NorA)
-Evaluation de l'activité antibactérienne de l'association 1.12 / ciprofloxacine sur la souche S. aureus ATCC 29213 (méthode des cinétiques de croissance ou « time kili curve »)
Les résultats sont une moyenne de deux expérimentations. Un effet synergique est observé avec l'association ciprofloxacine (0,5 mg/ml et 0,125 mg/ml)/ 1.12 (31μΜ) (réduction > 2 logio) comme le montre la Figure unique qui présente l'évaluation de l'activité a nti bactérien ne de l'association 1.12 / ciprofloxacine par la méthode des cinétiques de croissance. En conclusion, les composés selon l'invention, en association avec la ciprofloxacine, favorisent nettement l'activité de cet antibiotique sur des bactéries à Gram positif des genres staphylocoque et entérocoque, notamment des souches résistantes (SARM, VISA, VRE), fléaux des hôpitaux.
Certains de ces composés possèdent, également, une activité antibiotique notable. En association avec la ciprofloxacine, leur action devient synergique avec celle de l'antibiotique (et non simplement additive). Cette synergie permet de diminuer les concentrations en antibiotique utilisées in vitro pour détruire les bactéries et vraisemblablement celles utilisées in vivo (diminution des effets toxiques imputés aux molécules anti-infectieuses). Cette activité est retrouvée y compris sur des souches SARM et VISA. La présence d'un effet synergique est probablement liée à l'activité inhibitrice des pompes efflux des composés selon l'invention.
Cet effet synergique n'est présent que pour des antibiotiques de type fluoroquinolone, en particulier des fluoroquinolones hydrophiles telles que la nofloxacine, la ciprofloxacine, etc.. Cette activité est excellente pour la souche 1199B (surexprimant IMorA), mais est pratiquement nulle pour la souche K 1712 (dépourvue de pompe NorA). Ceci oriente vers une action inhibitrice des pompes à efflux bactériennes, notamment de NorA.
B-IV. Tests complémentaires démontrant l'activité inhibitrice des composés selon l'invention vis-à-vis de NorA
Composés
Les molécules dont l'effet IPE a été évalué sont : 1.1 (24 μηηοΙ/L), 1.6 (16 μηηοΙ/L) et 1.14 (31 pmol/L).
Antibiotiques
Les antibiotiques avec lesquels ces molécules ont été associées sont: la ciprofloxacine et la norfloxacine; la tétracycline ; l'oxacilline; l'érythromycine et la vancomycine. Souches bactériennes Les souches bactériennes testées sont S. aureus ATCC 29213 ; S. aureus 1199b surexprimant NorA ainsi que S. aureus 1199 la souche dont elle est dérivée ; S. aureus K1712 n'exprimant pas NorA ainsi que S. aureus 8325.4 (la souche dont elle est dérivée).
Evaluation de l'effet potentialisateur de l'association de chaque composé selon l'invention ci-dessus sur l'activité de la ciproHoxacine
La méthodologie utilisée repose sur la technique des CMI décrite précédemment. Seules les associations de molécules dont les activités
Vérifient la Condition « CMI antibiotique / CMI antibiotique+composé selon l'invention≥ » ont été retenues comme mettant en évidence une activité inhibitrice de la pompe à efflux NorA.
Les résultats ont été les suivants :
- Le composé 1.6 permet une amélioration des CMI de facteurs 4, 8 voire 16 lorsqu'il est en présence de la norfloxacine et de la ciprofloxacine. Cette activité est particulièrement notable lorsque le composé associé à l'une des deux fluoroquinolones est évaluée avec la souche 1199b surexprimant NorA. Cette activité est cependant nulle lorsque les associations sont évaluées sur la souche K1712. Enfin, cette activité est peu efficace quand la molécule est couplée aux antibiotiques non fluoroquinolones.
- Les résultats sont identiques pour le composé 1.14. Une faible activité qui n'existe pas pour le composé 1.6 est cependant relevée sur la souche 1199b lorsque la molécule IPE est en présence de la tétracycline et de l'érythromycine.
- Des effets du composé I.l semblent exister mais de façon mineure. Ces composés selon l'invention montrent préférentiellement une activité en association avec les fluoroquinolones. De plus, parmi toutes les souches, S. aureus 1199b est la souche la plus sensible à l'activité de l'association, contrairement à la souche Kl 712 pour laquelle l'association n'a pas favorisé l'activité de l'antibiotique classique.
L'ensemble de ces résultats est en faveur d'une activité potentialisatrice de 1.6 et 1.14 lorsque ces composés sont en association avec des fluoroquinolones, molécules relarguées hors de la bactérie par NorA. De plus, la souche surexprimant NorA (1199b) est très sensible à cette association alors que celle ne l'exprimant plus (K1712) est au contraire très peu sensible. La cible des composés selon l'invention apparaît bien être NorA.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Composés de formule (I) :
dans laquelle :
- Ri et R2, identiques ou différents représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène ou un groupe (Ci-Ci2)alkyle non substitué ou substitué,
- R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe (Ci-Côjalkyle non substitué ou substitué, ou un groupe benzyie non substitué ou substitué,
- R4 représente un groupe (Ci-Ci2)alkyle non substitué ou substitué, aryle ou hétéroaryle, lesdits groupes aryle et hétéroaryle pouvant être non substitués ou substitués, et R5 représente un groupe (d- Ci2)alkyle non substitué ou substitué,
- Ou bien R4 et R5 sont liés entre eux par une chaîne hydrocarbonée saturée à 3 ou 4 atomes de carbone,
éventuellement sous forme hydratée ou sous la forme d'un sel acceptable pour une administration aux animaux ou végétaux,
pour leur utilisation en tant que potentialisateur de l'effet d'un agent antimicrobien ou pour leur utilisation an tant qu'agent antimicrobien.
2 - Composés selon la revendication 1 caractérisés en ce que 3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle ou benzyie.
3 - Composés selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que Ri et R2, identiques ou différents représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène, ou un groupe méthyle.
4 - Composés selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que R5 représente un groupe méthyle. 5 - Composés selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que R4 représente un groupe benzyle, phényle, naphtyle, thiophényle et indolyle, lesdits groupes, pouvant être non substitués ou substitués par un ou plusieurs substituants choisis parmi les atomes de chlore, brome, iode et fluor, les groupes (d-Ceialkyle et (Ci-C6)alcoxy.
6 - Composés selon l'une des revendications précédentes choisis parmi : -3-(3-chlorophényl)-5,7-diméthoxy-4-méthylquinolin-2( lH)-one, composé 1.1,
- 5,7-diméthoxy-3-(4-méthoxyphényl)-4-méthylquinolin-2(lH)-one, composé 1.2,
- 5,7-diméthoxy-4-méthyl-3-(l-méthyl-lH-indol-3-yl)quinolin-2(lH)-one, composé 1.3,
- 5,7-diméthoxy-4-méthyl-3-(thiophén-2-yl)quinolin-2(lH)-one, composé 1.4,
- 5,7-diméthoxy-4-méthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.5,
- 3-(lH-indol-3-yl)-5,7-diméthoxy-4-méthylquinolin-2(lH)-one, composé 1.6, - 5-hydroxy-7-méthoxy-4-méthyl-3-(thiophén-2-yl)quinolin-2(lH)-one, composé 1.7,
- 5-hydroxy-7-méthoxy-l,4-diméthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.8,
- 5-hydroxy-7-méthoxy-4-méthyl-3-(naphthalen-2-yl)quinolin- 2(lH)-one, composé 1.9,
- 5,7-diméthoxy-l,4-diméthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.10,
- 7-hydroxy-5-méthoxy-4-méthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.11,
- 5-hydroxy-7-méthoxy-4-méthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.12,
- 5,7-dihydroxy-4-méthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.13,
- 3-benzyl-5-hydroxy-7-méthoxy-4-méthylquinolin-2(lH)-one, composé 1.14,
- 2,3-dihydro-9-hydroxy-7-méthoxy-lH-cyclopenta[c]
quinolin-4(5H)-one, composé 1.15,
- l-Benzyl-5,7-dimethoxy-4-methyl-3-phenylquinolin-2(lH)-one, composé 1.16,
éventuellement sous forme hydratée ou sous la forme d'un sel acceptable pour une administration aux animaux ou végétaux. 7 - Composés selon l'une des revendications 1 à 6 pour leur utilisation en tant que potentialisateur de l'effet d'un agent antimicrobien tel qu'un antibiotique ou un antiseptique, auquel des bactéries sont résistantes par expulsion par pompe efflux, et en particulier pompe NorA.
8 - Composés selon la revendication 7 caractérisés en ce que les bactéries sont des bactéries de type cocci à Gram positif avantageusement choisies parmi : Enterococcus tels que Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium ; Staphylococcus tels que Staphy/ococcus aureus et Staphylococcus epidermis.
9 - Composés selon l'une des revendications 7 ou 8 pour leur utilisation pour potentialiser l'effet d'un agent antimicrobien qui est un antibiotique.
10 - Composés selon la revendication 9 caractérisés en ce que l'agent antibiotique est choisi parmi : les tétracyclines, les macrolides, les ansamycines, les β-lactames et, de préférence, les fluoroquinolones choisies parmi l'enofloxacine, l'ofloxacine, la lévofloxacine, la moxifloxacine et, préférentiellement, la ciprofloxacine et la norfloxacine.
11 - Composés choisis parmi :
-3-(3-chlorophényl)-5,7-diméthoxy-4-méthylquinolin-2(lH)-one, composé 1.1, - 5,7-diméthoxy-3-(4-méthoxyphényl)-4-méthylquinolin-2(lH)-one, composé 1.2,
5,7-diméthoxy-4-méthyl-3-(l-méthyl-lH-indol-3-yl)quinolin-2(lH)-one, composé 1.3,
- 5,7-diméthoxy-4-méthyl-3-(thiophén-2-yl)quinolin-2(lH)-one, composé 1.4, - 5,7-diméthoxy-4-méthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.5,
- 3-(lH-indol-3-yl)-5,7-diméthoxy-4-méthylquinolin-2(lH)-one, composé 1.6,
5-hydroxy-7-méthoxy-4-méthyl-3-(thiophén-2-yl)quinolin-2(lH)-one, composé 1.7,
- 5-hydroxy-7-méthoxy-l,4-diméthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.8,
5-hydroxy-7-méthoxy-4-méthyl-3-(naphthalen-2-yl)quinolin-2(lH)-one, composé 1.9, - 5 -diméthoxy-l,4-diméthy[-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.10,
- 7-hydroxy-5-méthoxy-4-méthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.11,
- 5-hydroxy-7-méthoxy-4-méthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.12,
- 5,7-dihydroxy-4-méthyl-3-phénylquinolin-2(lH)-one, composé 1.13,
- 3-benzyl-5-hydroxy-7-méthoxy-4-méthylquinolin-2(lH)-one/ composé 1.14, 2/3-dihydro-9-hydroxy-7-méthoxy-lH-cyclopenta[c]quinolin-4(5H)-one, composé 1.15,
- l-Benzyl-5,7-dimethoxy-4-methyl-3-phenylquinolin-2(lH)-one, composé 1.16,
éventuellement sous forme hydratée ou sous la forme d'un sel acceptable pour une administration aux animaux ou végétaux.
12 - Composés de formule (Ip) :
dans laquelle :
- Ri et R2, identiques ou différents représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène ou un groupe (CrCi2)alkyle non substitué ou substitué,
- R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe (Ci-Ce)alkyle non substitué ou substitué, ou un groupe benzyle non substitué ou substitué, - Rs représente un groupe (d-Ci2)alkyle non substitué ou substitué, éventuellement sous forme hydratée ou sous la forme d'un sel acceptable pour une administration aux animaux ou végétaux.
13 - Composés selon la revendication 12 caractérisés en ce que R5 représente un groupe méthyle.
14 - Composés selon la revendication 12 ou 13 caractérisés en ce que R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle ou benzyle. 15 - Composés selon l'une des revendications 12 à 14 caractérisés en ce que i et R2, identiques ou différents représentent, chacun indépendamment, un atome d'hydrogène, ou un groupe méthyle.
16 - Composés selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisés en ce que R5 = Me, Ri = H et R2 = Me.
17 - Composés selon l'une des revendications 11 à 16, pour leur utilisation en tant que médicaments.
18 - Compositions pharmaceutiques contenant un composé selon l'une des revendications 1 à 10, pour son utilisation en tant que potentialisateur de l'effet d'un agent antimicrobien, ou un composé selon l'une des revendications 11 à 17, en association avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptables caractérisées en ce qu'elle contient, en outre, un agent antimicrobien dont l'effet est à potentialiser par le composé selon l'une des revendications 1 à 17.
19 - Compositions pharmaceutiques contenant un composé selon l'une des revendications 11 à 17, en association avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptables.
20 - Utilisation d'un composé de formule (I) dans laquelle i à R5 sont tels que définis à l'une des revendications 1 à 6 ou d'un composé selon l'une des revendication 11 à 16, pour mettre en évidence, in vitro, la présence de bactéries résistantes à un antibiotique donné dans un échantillon biologique.
21 - Utilisation d'un composé de formule (1) dans laquelle Ri à R5 sont tels que définis à l'une des revendications 1 à 6 ou d'un composé selon la revendication 11 à 16, pour mettre en évidence, in vitro, le degré de résistance à un antibiotique de bactéries présentes dans un échantillon biologique.
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