EP2553512A2 - Mikroskop und verfahren zur erfassung von probenlicht - Google Patents

Mikroskop und verfahren zur erfassung von probenlicht

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EP2553512A2
EP2553512A2 EP11709019A EP11709019A EP2553512A2 EP 2553512 A2 EP2553512 A2 EP 2553512A2 EP 11709019 A EP11709019 A EP 11709019A EP 11709019 A EP11709019 A EP 11709019A EP 2553512 A2 EP2553512 A2 EP 2553512A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
phase
modulated
modulation
detection
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP11709019A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Kalkbrenner
Ralf Wolleschensky
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Carl Zeiss Microscopy GmbH
Original Assignee
Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss Microscopy GmbH filed Critical Carl Zeiss Microscopy GmbH
Publication of EP2553512A2 publication Critical patent/EP2553512A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
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    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0056—Optical details of the image generation based on optical coherence, e.g. phase-contrast arrangements, interference arrangements
    • G—PHYSICS
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    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
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    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
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    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • G—PHYSICS
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    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B26/00—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements
    • G02B26/06—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements for controlling the phase of light

Definitions

  • the invention relates to microscopy for optical examination, in particular in strongly scattering media with limited penetration depth, in particular biological samples.
  • Gated Intensifier Camera e.g. tautec pico star: http://www.tautec.com/4709/4736.html
  • Pulsed lasers are used for multiphoton excitation.
  • the lasers used are very expensive.
  • phase modulation With FMM, half the excitation laser beam is phase modulated (in diameter). When focussed by a microscope objective, this half-sided phase modulation leads to an intensity modulation in the focal volume. This intensity modulation can be detected after the confocal pinhole, for example by lock-in detection.
  • the advantage of the method is that only the ballistic, so unscattered, photons contribute to this modulation signal; For example, multiply scattered photons in strongly scattering media lose the fixed phase relationship. Accordingly, the scattered photons do not contribute to the lock-in demodulated signal, thereby becoming the Background by scattered light (both in excitation and in detection) greatly reduced and the penetration depth of a laser confocal microscope thereby increased.
  • the laser beam is directed to a split mirror, one half of which is moved over a piezo element relative to the other half.
  • the beam is passed halfway through a glass disk located on a galvanometer scanner. By rotating this disk, the phase of one beam half is modulated relative to the other.
  • the object of the invention is to avoid the disadvantages of the prior art.
  • EOM Electro-Qptic Modulator
  • EOMs are used for particularly fast, nonmechanical phase modulation of at least one part, preferably half of the excitation beam.
  • a portion of the excitation beam may pass over the EOM or the EOM may be modulated only partially in a portion in which the excitation beam passes.
  • Electro-optical modulators use the Pockels effect in a birefringent crystal, in which the polarization or phase of the laser light is changed by applying a voltage. This can be done very quickly, depending on the type and size of the crystal (up to a few 10 MHz).
  • Figure 1 shows the phase modulation of a part, in particular half
  • Fig. 1 a) -c) is in a plan view of the plane of the EOM hatched with the
  • the EOM is based on [1, 2] in the illumination beam path, advantageously in a widened (collimated) beam section.
  • the beam cross section can be adapted to the crystal size.
  • the crystal has electrodes on its sides for its high-frequency activation.
  • the modulation space is defined via the electrodes of the EOM, in that only half of the EOM, which lies above the lower half of the beam, is driven via the electrodes is, that is, the crystal is indeed fully illuminated, but only half is modulated (by the position of the electrodes).
  • Fig. 1 c two upper and lower beam halves are differently modulated with electrodes polarized in the upper and in the lower part in antiphase.
  • the modulated sections may or may not be superimposed on the laser beam.
  • FIG. 1c a side view (in the direction of the arrow in the left-hand part) is shown schematically in which the controlled sections are advantageously offset in relation to one another.
  • an antiphase poled version for example, if the crystal is not to be modified, but crosstalk effects from one side to the other should be avoided. Due to the anti-phase control, the stroke distance (distance of the opposite amplitudes) is also advantageously doubled in comparison to the single-phase triggering; in the case of a desired phase difference (stroke), the crystal could advantageously also be shortened (shortened run length). Due to the staggered arrangement of the controlled areas of the EOM, an overlap of the two beam areas is also possible (more than half).
  • acousto-optic modulators are used in order to modulate the excitation beam in conjunction with a division into a plurality of partial beam paths and optical elements for the partial phase modulation of the excitation beam and advantageous control elements for setting the phase difference.
  • Acousto-optical modulators use the diffraction of the laser beam on a stationary one Sound wave in a crystal for fast deflection or switching of a laser. This effect can also be used for the fast phase modulation of half the laser beam as follows, if the deflection of the beam is used accordingly:
  • AOM switches quickly between partial beam paths, each with half, fixed phase shift (for example through half the glass plate), cf. Fig. 2a.
  • AOM switches quickly between partial beam paths, which are combined again via a special beam combiner, in which a semicircle is designed as a mirror and the complementary semicircle as an aperture (see Fig. 2b).
  • the phase shift can be changed by opt. Path length finely adjusted by means of a piezoelectric actuator element on one of the deflecting mirrors and so for example adapted to different wavelengths.
  • AOMs do not switch as fast as EOMs (due to the acoustic propagation speed in the crystal) but are more cost effective.
  • Figure 2 shows the fast phase modulation of half the laser beam L by means of AOM (A).
  • Fig. 2a by switching between two beam paths, the upper half is passed through a glass plate.
  • the beam paths are at the Strahlverenberg (BC) again
  • Fig. 2 is in each case a laser beam in the field of illumination of the microscope
  • an acousto-optical element A such as an AOM and
  • A is an acousto-optic deflector and switches a beam with a frequency ⁇ back and forth between two angular directions in which a continuous beam Sd and a deflected beam Sa extend, in Sa via mirrors m1, m2, m3 as the beam detour.
  • Plate P in Fig. 2a is a glass plate as a semicircle, so that the full beam Sa of the bypass is phase-modulated in half and the transmitted beam does not Phase-modulated, at the beam combiner BC, the two beams are superimposed again and receive in BC a half-side modulated beam Sm.
  • the absolute phase of the upper, redirected beam can be adjusted via a mirror on a piezo-actuator (PZT) (slow, DC).
  • PZT piezo-actuator
  • the fast modulation takes place by switching between the beam paths through the AOM.
  • the piezo element PCT in b) can also be a mirror with a mechanical adjusting element as indicated in a) by the Pofeil in order to adjust the path difference can.
  • the AOM switches with ⁇ between the two beams and thereby turns on the half-beam phase modulation on and off, which then leads in focus to the
  • intensity modulation according to the invention.
  • This intensity modulation is periodically increasing and decreasing but not necessarily a pure sine function; Rectangular, in demodulation that should be considered (higher harmonic
  • Fig. 2b no phase plate is provided in Sa, but in BC a semicircular reflective part and a semicircle open (half pinhole), i. the reflecting part is influenced out of phase via the path length difference of the beam paths (adjustable by the adjusting element PCT) and after BC the beam Sm has two phase-shifted halves which are superimposed in the focus.
  • modulation methods described here can be used directly for the FMM microscopy as described in [1] and [2] together with a fast lock-in amplifier.
  • the methods can also be used for multi-spot scanning microscopes when placing the modulator in the pupil or a conjugate plane.
  • optical modulators are used for demodulation in the detection or the operation of the detectors used for demodulation.
  • FIG. 3 shows a microscope setup for increasing the penetration depth / scattered-light suppression, wherein a dichroic splitter mirror D for separating the illumination and detection beam path is provided in a schematic beam path from a laser L in the direction of a sample P.
  • the detection is split by a beam splitter BS into two partial beam paths in which detectors d1, d2 are located:
  • the laser L for fluorescence excitation is modulated by a focus modulator (FM) as described for example with reference to FIGS. 1 and 2 with the frequency ⁇ .
  • FM focus modulator
  • Modulated fluorescence radiation of the sample (P) is detected phase sensitive by two detectors d1 and d2 via a 50/50 beam splitter (BS).
  • BS beam splitter
  • one modulator m is used in each case before d1 and d2 (m1, m2 in FIG. 3a) or the detector gain of d1 and d2 is modulated (3b).
  • filter F e.g., integrator
  • the modulators M1, m2 may advantageously be optical modulators such as EOM
  • m1 is directly modulated and m2 undergoes a phase shift over Ph, thereby two partial signals are detected which have a phase difference to each other (delta Phi) and mixed and filtered with low pass filter, so there is advantageously an optical demodulation with adjusted relative phase, ideally of 90 degrees between the two detection components to be able to subtract from each other the states with intact focus and the shifted states in which the focus is disturbed by the destructive interference (- operator).
  • Fig. 3b not the optical signal is modulated but the "gain" of the detectors (eg acceleration voltage of a PMT), respectively controlled via FM and again via Ph the phase adjusted, the signals filtered with F and subtracted with O-.
  • the detectors d1, d2 are switched on and off, for example, with frequency ⁇ (and set phase shift).
  • a) is an assumed signal of a classical confocal microscope in a strongly scattering medium over 3 pixels. The signal from focus is barely above the background produced by the path of the excitation beam through the sample.
  • b) is the corresponding signal using a phase modulator such. in Fig. 2. It is quickly switched between the states 1) and 2) shown above. However, since the excitation beam is phase-modulated and this modulation first changes into focus in an intensity modulation, the strong background contribution through the beam path through the sample is substantially the same for both states 1) and 2).
  • a beam switchover is used for demodulation by means of AOM.
  • Figure 5 shows a beam path similar to that shown in Fig. 3.
  • Ph can be used to set the phase difference.
  • an intensity modulation according to the FMM procedure is the Einzelfoki imprinted, either together by arranging a Half-space mask according to the FMM method, in particular we described above, in a pupil plane of the objective or by individually influencing each partial beam according to the FMM method or by jointly influencing a beam and subsequent division as described in DE 199 04 592 C2, US6219179.
  • modulation and demodulation methods described above which are carried out for a point-scanning system, can advantageously also be extended, for example, to a wide-field fluorescence imaging, as explained below.
  • a microscope assembly can be used as sketched in Fig. 5.
  • Figure 6 a shows a wide-field FMM microscope with rotating microlens disc (SML) in the intermediate image, a focus modulator (FM) in the pupil of the microscope objective O, and camera (K) with triggerable image intensifier.
  • SML rotating microlens disc
  • FM focus modulator
  • K camera
  • Fig. 6 b shows an example of discrete demodulation with 4 partial images (from [4]).
  • Fig.6c serves as an example to illustrate the modulation and pixel frequencies.
  • a spinning microlens disc e.g. in a Yokogawa wide field scanning module [3] is brought in the vicinity of an intermediate image plane so that the foci of the microlenses are imaged through the lens into the sample.
  • Each of these foci must now be modulated in intensity as described above or in [1] and [2].
  • a modulator can be brought into a pupil of the illumination beam path as already described above. Due to the phase modulation taking place there, all foci experience a corresponding intensity modulation in the sample.
  • the position of FM in the pupil means that all partial rays are present at different angles in the pupil depending on the position on the sample, in the pupil each point fills the pupil and half of the pupil is modulated by FM, each spot is half phase modulated and superimposed in the sample,
  • FM can be an EOM, but also an element as in the prior art
  • the scanning scheme of a Spinning Microlens Disc is shown reduced in Fig. 5c): all pixels 1 are exposed at the same time, then all pixels 2 etc. One complete cycle of the disc is exposed. So that the entire image can be demodulated in-phase, the rotation of the disc must be phase-locked, so that all pixels 1, 2,3,4 ... have the same phase position.
  • the modulation ⁇ must therefore also be an integer multiple of the rotational frequency and pixel frequency of the disc.
  • the frequency at which the intensifier is triggered must again be a multiple of the modulation frequency.
  • a typical spinning disc [3] can be operated at 125 U / sec or more, the ratio (total number of microlenses / number of simultaneously illuminated lenses) being 12, for example, so that 12 images are rastered per revolution, ie a frame rate of 1500 Hz.
  • the ratio (total number of microlenses / number of simultaneously illuminated lenses) being 12, for example, so that 12 images are rastered per revolution, ie a frame rate of 1500 Hz.
  • 250 pixel exposures per microlens and image and at 10 MHz half-beam modulator modulation frequency will result in 10 MHz / (1500 Hz * 250) -26 modulation periods per pixel that can be sampled and integrated , for example, to obtain a measuring point for determining the phase position.
  • For 4 phase points (as in Fig. 5 b)) would result in a favorable overall frame rate of 375 Hz.
  • CMOS / CCD camera with integrated lock-in pixels can also be used, such as e.g. [4] & [5]. These cameras are typically used for time-of-flight based distance measurement in conjunction with modulated illumination, but can also be used in an array such as Fig. 5 for demodulation.

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Abstract

Mikroskop und Verfahren zur Erfassung von Probenlicht, mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl, der entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und einem Mikroskopobjektiv zur intensitätsmodulierten Fokussierung des Beleuchtungsstrahls in eine Probe sowie einem Detektionsstrahlengang mit mindestens einem Demodulator wobei vorteilhaft mindestens ein elektrooptischer Modulator (EOM) zur Phasenmodulation mindestens eines Teils, vorzugsweise der Hälfte des Beleuchtungsstrahls eingesetzt wird oder unterschiedliche Strahlabschnitte - oder hälften des Beleuchtungsstrahls durch gegenphasige Ansteuerung von Piezoelementen unterschiedlich, vorzugsweise gegenphasig, moduliert werden oder akustooptische Modulatoren zur Aufteilung in mehrere Teilstrahlengänge sowie optischen Elemente zur teilweisen Phasenmodulation des Anregungsstrahls vorgesehen sind sowie vorteilhaft Stellelemente zur Einstellung des Phasenunterschieds vorgesehen sind oder mindestens ein optischer Modulator, vorzugsweise ein akustooptischer Modulator (AOM), zur Demodulation in der Detektion eingesetzt wird oder eine Änderung der Betriebsweise der Detektoren zur Demodulation erfolgt oder bei einer Fokiverteilung, beispielsweise erzeugt durch eine rotierende Mikrolinsenscheibe oder einer Multispoterzeugung wird den Einzelfoki eine Intentsitätsmodulation aufgeprägt, entweder durch Anordnung einer Halbraumphasenmaske in einer Pupillenebene des Objektives oder durch Einzelbeeinflussung jedes Teilstrahles indem er entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird oder Beeinflussung eines Strahls indem er entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und seiner nachfolgender Aufteilung.

Description

Mikroskop und Verfahren zur Erfassung von Probenlicht
Die Erfindung betrifft die Mikroskopie zur optischen Untersuchung insbesondere in stark streuenden Medien mit begrenzter Eindringtiefe, insbesondere biologische Proben.
Herangezogene Literatur:
[1] Chen et al., Opt. Express 16, 18764 (2008)
[2] Wong et al., Appl. Opt. 48, 3237 (2009)
[3] http://www.yokogawa.com/scanner/products/csuX1 e_1.htm
[4] Dissertation R. Lange, Universität Siegen (2000)
[5] TOF Kamera mit Lock-In pixeln: http://www.mesa-imaging.ch/
[6] Gated-Intensifier-Kamera: z.B. tautec pico star: http://www.tautec.com/4709/4736.html
Herangezogene Patente sind im nachfolgenden Text aufgeführt.
Um die Nachteile der Beeinflussung der Probenstreuung auf das Detektionssignal zu begrenzen, sind unterschiedliche Verfahren bereits bekannt:
Die Multiphotonen-Mikroskopie (EP500717 B2) :
Es werden gepulste Laser zur Mehrphotonenanregung verwendet. Die verwendeten Laser sind sehr teuer.
Es gibt applikative Einschränkungen, beispielsweise in der in Wahl der Farbstoffe und durch die hohe Probenbelastung.
Die Fokal Modulation Microscopy (FMM) wie beispielsweise in [1 ,2] publiziert:
Bei FMM wird der halbe Anregungslaserstrahl (im Durchmesser) phasenmoduliert. Bei Fokussierung durch ein Mikroskopobjektiv führt diese halbseitige Phasenmodulation zu einer Intensitätsmodulation im Fokalvolumen. Diese Intensitätsmodulation kann nach dem konfokalen Pinhole beispielsweise durch Lock-In-Detektion erfasst werden. Der Vorteil des Verfahrens besteht darin, dass nur die ballistischen, also ungestreuten, Photonen zu diesem Modulationssignal beitragen; die z.B. in stark streuenden Medien mehrfach gestreuten Photonen verlieren die feste Phasenbeziehung. Dementsprechend tragen die gestreuten Photonen nicht zum Lock-ln-demodulierten Signal bei, dadurch wird der Hintergrund durch gestreutes Licht (sowohl in Anregung als auch in Detektion) stark reduziert und die Eindringtiefe eines Laser-Konfokalmikroskops dadurch erhöht.
Bislang werden zur Phasenmodulation des halben Laserstrahls mechanische Ansätze verwendet. In [1] wird der Laserstrahl auf einen geteilten Spiegel gelenkt, dessen eine Hälfte über ein Piezoelement relativ zur anderen Hälfte bewegt wird.
In [2] wird der Strahl zur Hälfte durch eine Glasscheibe geleitet, die sich auf einem Galvanometer-Scanner befindet. Durch Rotation dieser Scheibe wird die Phase der einen Strahlhälfte relativ zur anderen moduliert.
Das Grundproblem aller mechanischen Ansätze (abgesehen von Justage etc.) ist die niedrige Modulationsrate, die durch die mechanische Resonanzfrequenz der eingesetzten Stellelemente beschränkt wird (5-20 kHz für [1] und [2]). Da für das Lock-In- Detektionsverfahren eine Mindestanzahl von Modulationsperioden pro Pixelverweilzeit erforderlich ist (Minimum 5-10), wird damit die Bildaufnahmerate stark eingeschränkt.
Aufgabe der Erfindung ist es die Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden.
Diese Aufgabe wird durch Verfahren und Mikroskope gemäß den unabhängigen Patentansprüchen gelöst.
Bevorzugte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Patentansprüche.
Nachstehend werden besonders vorteilhafte Aspekte der Erfindung anhand von schematischen Darstellungen erläutert.
1. Elektro-Qptischer Modulator (EOM):
Erfindungsgemäß werden EOM zur besonders schnellen, nichtmechanischen Phasenmodulation mindestens eines Teils, vorzugsweise der Hälfte des Anregungsstrahls eingesetzt.
Vorteilhaft kann ein Teil des Anregungsstrahls über den EOM verlaufen oder der EOM nur teilweise in einem Teil in dem der Anregungsstrahl verläuft moduliert werden.
Besonders vorteilhaft werden unterschiedliche Strahlabschnitte - oder hälften durch gegenpolige Ansteuerung von Teilen eines EOM oder durch mehrerer EOM unterschiedlich (gegenphasig) moduliert. Elektro-Optische Modulatoren nutzen den Pockels-Effekt in einem doppelbrechenden Kristall aus, bei dem durch Anlegen einer Spannung die Polarisation oder Phase des Laserlichts verändert wird. Dies kann, abhängig von Art und Größe des Kristalls sehr schnell erfolgen (bis zu einige 10 MHz).
Im Folgenden werden Ausführungen beschrieben, wie sich dies vorteilhaft für die FMM Mikroskopie ausnutzen lässt:
EOM-Kristall mit entsprechender Strahlaufweitung und kollimiertem Laserstrahl halb beleuchtet (Abb. 1 a))
EOM-Kristall, bei dem das elektrische Wechselfeld durch die Elektroden nur über den halben Strahl definiert wird (Abb. 1 b))
EOM mit gegenläufigen Feldern (ggf. sequentiell angeordnet, um Streufelder zu minimieren) (Abb. 1 c))
Klassischer EOM in Verbindung mit Polarisator vor und nach dem Strahl, wobei die Polarisatoren nur vom halben Strahl durchlaufen wird; so wird direkt die Intensität des halben Strahls moduliert, was ebenfalls zu einer Intensitätsmodulation im Fokus führt.
Ein grundsätzlicher wichtiger Vorteil aller EOM-basierten Lösungen ist die größtmögliche Modulationsrate von einigen 10 MHz.
Abbildung 1 zeigt die Phasenmodulation eines Teils, insbesondere des halben
Laserstrahls mit einem Elektrooptischem Modulator (EOM).
In der Abb. 1 a)-c) ist in einer Draufsicht die Ebene des EOM mit dem schraffiert
dargestellten, Laserstrahl L zu sehen.
Der EOM befindet sich in Anlehnung an [1 ,2] im Beleuchtungsstrahlengang, vorteilhaft in einem aufgeweiteten (kollimierten) Strahlabschnitt.
Durch die Größe der Strahlaufweitung kann eine Anpassung des Strahlquerschnitts an die Kristallgröße erfolgen.
In Abb. 1 a) wird der Modulationsraum durch den EOM über eine Beleuchtung des
Kristalls mit der Hälfte des Laserstrahls L definiert.
Der Kristall weist an den Seiten Elektroden zu seiner hochfrequenten Ansteuerung auf.
In Abb.1 b wird der Modulationsraums über die Elektroden des EOM definiert indem nur die Hälfte des EOM, die über der unteren Strahlhälfte liegt, über die Elektroden angesteuert wird, d.h. der Kristall wird zwar ganz beleuchtet, aber nur die Hälfte wird moduliert (durch die Lage der Elektroden).
In Abb. 1 c werden zwei obere und untere Strahlhälften mit im oberen und im unteren Teil gegenphasig gepolten Elektroden unterschiedlich moduliert.
Die modulierten Abschnitte können, müssen aber am Laserstrahl nicht übereinander sitzen.
Im rechten Teil in 1c ist eine Seitenansicht (in Pfeilrichtung im linken Teil) schematisch dargestellt bei der die angesteuerten Abschnitte vorteilhaft gegeneinander seitenversetzt sind.
Das kann zur Vermeidung von Streufeldern (bei EOM sind hohe Spannungen erforderlich)vorteilhaft sein.
Es kann eine gegenphasig gepolte Ausführung vorteilhaft sein beispielsweise wenn der Kristall nicht modifiziert werden soll, aber Übersprecheffekte von einer Seite auf die andere vermieden werden sollen. Durch die gegenphasige Ansteuerung wird außerdem vorteilhaft der Hubabstand (Abstand der gegenläufigen Amplituden) verdoppelt im Vergleich zur einphasigen Ansteuerung, bei einem gewünschten Phasenunterschied (Hub) könnte dadurch vorteilhaft auch der Kristall verkürzt werden (verkürzte Lauflänge). Durch die versetzte Anordnung der angesteuerten Gebiete des EOM ist außerdem eine Überlappung der beiden Strahlgebiete möglich (über die Hälfte hinaus).
Interessant ist dass sich die gegenphasige Ansteuerung auch eine vorteilhafte Weiterentwicklung von Chen [1] darstellt - hier könnte ein zweiter Piezoantrieb für die zweite Strahlhälfte installiert werden wobei beide Piezoantriebe gegenphasig betrieben werden.
Auch eine entlang des Strahls versetzte Beeinflussung wie in Fig. 1c dargestellt ist in Chen [1] vorteilhaft möglich.
2. Vorteilhafter Einsatz Akusto-Optischer Modulatoren (AOM) bei FMM:
Erfindungsgemäß werden akusooptische Modulatoren verwendet um im Zusammenwirken mit einer Aufteilung in mehrere Teilstrahlengänge und optischen Elementen zur teilweisen Phasenmodulation des Anregungsstrahls sowie vorteilhaft Stellelementen zur Einstellung des Phasenunterschieds den Anregungsstrahl zu modulieren.
Akusto-Optische Modulatoren nutzen die Beugung des Laserstrahls an einer stehenden Schallwelle in einem Kristall zum schnellen Ablenken bzw. Schalten eines Lasers. Auch dieser Effekt lässt sich wie folgt zur schnellen Phasenmodulation des halben Laserstrahls verwenden, wenn man die Ablenkung des Strahls entsprechend ausnutzt:
AOM schaltet schnell zwischen Teilstrahlengängen mit jeweils halber, fester Phasenschiebung (z.B. durch halbe Glasplatte), vgl. Abb. 2a.
AOM schaltet schnell zwischen Teilstrahlengängen, die über einen speziellen Strahlvereiniger wieder kombiniert werden, bei dem ein Halbkreis als Spiegel und der komplementäre Halbkreis als Apertur ausgeführt wird (vgl. Abb. 2b).
Die Phasenverschiebung kann über Veränderung der opt. Weglänge mittels eines Piezostellelements an einem der Umlenkspiegel fein eingestellt und so beispielsweise an unterschiedliche Wellenlängen angepasst werden.
AOMs schalten nicht so schnell wie EOMs (aufgrund der akustischen Ausbreitungsgeschwindigkeit im Kristall), sind aber kostengünstiger.
Die möglichen Schaltraten sind mit 1 -10 MHz aber immer noch deutlich höher als alle mechanisch oder elektromechanisch erreichbaren Elementen.
Abbildung 2 zeigt die schnelle Phasenmodulation des halben Laserstrahls L mittels AOM (A).
In Abb. 2a durch Schalten zwischen zwei Strahlwegen, wobei der obere halb durch eine Glasplatte geführt wird. Die Strahlwege werden am Strahlvereiniger (BC) wieder
kombiniert.
In Abb. 2 b) teilweise wie in 2a), aber mit einer halben verspiegelten Lochmaske als Strahlvereiniger (weiss=verspiegelt, schwarz=Öffnung).
In Abb. 2 ist jeweils ein Laserstrahl im Bereich der Beleuchtung des Mikroskops
dargestellt, ein akustooptisches Element A wie beispielsweise ein AOM und
Umlenkspiegel m1 , m2, m3, Strahlvereiniger BC und ein Piezosteller PZT sowie eine halbkreisförmige Glasplatte P.
A ist akustooptischer Deflektor und schaltet einen Strahl mit einer Frequenz ω zwischen zwei Winkelrichtungen hin und her, in denen ein durchgehender Strahl Sd und ein abgelenkter Strahl Sa verlaufen, in Sa über Spiegel m1 , m2, m3 als Strahlumweg.
Platte P in 2a) ist eine Glasplatte als Halbkreis, damit wird der volle Strahl Sa der Umleitung auf der Hälfte phasenmoduliert und der durchgehende Strahl wird nicht phasenmoduliert, am Strahlvereiniger BC werden die beiden Strahlen wieder überlagert und erhalten in BC einen halbseitig modulierten Strahl Sm.
Die absolute Phase des oberen, umgeleiteten Strahls kann über einen Spiegel auf einem Piezostellelement (PZT) eingestellt werden (langsam, DC). Die schnelle Modulation erfolgt durch Schalten zwischen den Strahlengängen durch den AOM.
Das Piezoelement PCT in b) kann auch ein Spiegel mit einem mechanischen Stellelement sein wie in a) durch den Pofeil angedeutet, um den Gangunterschied einstellen zu können. Der AOM schaltet mit ω zwischen den beiden Strahlen um und schaltet dadurch die halbstrahlige Phasenmodulation an und aus, das führt dann im Fokus zu der
erfindungsgemäßen Intensitätsmodulation. Diese Intensitätsmodulation ist periodisch an- und absteigend aber nicht zwingend eine reine Sinusfunktion, sie könnte z.B. rechteckig verlaufen, bei der Demodulation wäre das zu berücksichtigen (höhere harmonische
Anteile). Bei einer durch den AOM angenäherten Sinusfunktion würde der Ablenkwinkel zwischen durchgehendem und umgeleiteten Strahl durch den AOM auf M1 leicht variiert werden.
In 2b) ist keine Phasenplatte in Sa vorgesehen, sondern in BC ein halbkreisförmiger reflektierender Teil und einen Halbkreis offen (halbe Lochblende), d.h. der reflektierende Teil wird über den Weglängenunterschied der Strahlengänge (durch das Stellelement PCT einstellbar) phasenverschoben beeinflusst und nach BC hat der Strahl Sm zwei phasenverschobenen Hälften die sich im Fokus überlagern.
Die hier beschriebenen Modulationsverfahren können direkt für die wie in [1] und [2] ausgeführte FMM-Mikroskopie zusammen mit einem schnellen Lock-In-Verstärker eingesetzt werden.
Sie eignen sich aber auch für Detektionsverfahren wie im Folgenden anhand Fig.3 beschrieben, die den Einsatz eines teuren Lock-In Verstärkers umgehen.
Die Verfahren können bei Platzierung des Modulators in der Pupille oder einer konjugierten Ebene auch für Multi-Spot Rastermikroskope eingesetzt werden.
3. Vorteilhafte Ausführungen in der Detektion einer FMM Anordnung.
Erfindungsgemäß werden optische Modulatoren zur Demodulation in der Detektion eingesetzt oder die Betriebsweise der Detektoren zur Demodulation genutzt.
Abbildung 3 zeigt einen Mikroskopaufbau zur Erhöhung der Eindringtiefe/Streulichtunterdrückung wobei in einem schematischen Strahlengang von einem Laser L in Richtung einer Probe P ein dichroitischer Teilerspiegel D zur Trennung von Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang vorgesehen.
Die Detektion wird über einen Strahlteiler BS in zwei Teilstrahlengänge aufgespalten, in denen sich Detektoren d1 , d2 befinden:
Weiterhin dargestellt sind optische Modulatoren m1 , m2, ein Element Ph zur Phaseneinstellung, ein Filter F, ein Fokus- Modulator FM sowie ein Subtraktionsoperator O-.
Der Laser L zur Fluoreszenzanregung wird mit einem Fokus-Modulator (FM) wie beispielsweise anhand Fig. 1 und 2 beschrieben mit der Frequenz ω moduliert.
Die über den Dichroiten (D) reflektierte, nun ebenfalls mit ω. modulierte Fluoreszenz- Strahlung der Probe (P) wird über einen 50/50 Strahlteiler (BS) von zwei Detektoren d1 und d2 phasensensitiv detektiert. Dazu wird beispielsweise vor d1 und d2 jeweils noch ein Modulator m eingesetzt (m1 , m2 in 3a) oder der Detektor-gain von d1 und d2 wird moduliert (3b).
Die geglätteten Signale (Filter F, z.B. Integrator) werden dann voneinander subtrahiert (Operator O-).
Die Modulatoren M1 , m2 können vorteilhaft optische Modulatoren wie EOM sein
m1 wird direkt moduliert und m2 erfährt eine Phasenverschiebung über Ph, dadurch werden zwei Teilsignale detektiert die zueinander eine Phasendifferenz aufweisen (Delta Phi) und gemischt und mit Tiefpassfilter gefiltert, es erfolgt also vorteilhaft eine optische Demodulation mit eingestellter Relativphase, im Idealfall von 90 Grad zwischen den beiden Detektionskomponenten, um die Zustände mit intaktem Fokus und die verschobenen Zustände in denen der Fokus durch die destruktive Interferenz gestört ist.voneinander subtrahieren zu können (- Operator).
So wird auf jedem Pixel vom Signal aus dem Fokus der außerfokale Hintergrund (Streulicht) abgezogen.
In Fig. 3b wird nicht das optische Signal moduliert sondern der„gain" der Detektoren (z.B. Beschleunigungsspannung eines PMT), jeweils über FM angesteuert und wieder über Ph die Phase eingestellt, die Signale mit F gefiltert und mit O- subtrahiert. Die Detektoren d1 , d2 werden beispielsweise mit Frequenz ω (und eingestellter Phasenverschiebung) ein- und ausgeschaltet.
Abbildung 4:
Dient der Veranschaulichung der Signaldetektion.
Oben ist zunächst die Fluoreszenzanregung im Fokusbereich mit den Strahlhälften in Phase (1 ) und 180° phasenverschoben (aus Gong et al., Optics Letters 34, 3508 (2009)) dargestellt.
Unten werden die Signale veranschaulicht
a) ist ein angenommenes Signal eines klassischen Konfokalmikroskops in einem stark streuenden Medium über 3 Pixel. Das Signal aus dem Fokus liegt kaum über dem Hintergrund, der durch den Weg des Anregungsstrahls durch die Probe erzeugt wird.
b) ist das entsprechende Signal unter Verwendung eines Phasenmodulators wie z.B. in Abb. 2. Es wird schnell zwischen den oben gezeigten Zuständen 1 ) und 2) hin- und hergeschaltet. Da der Anregungsstrahl aber phasenmoduliert ist und sich diese Modulation erst im Fokus in eine Intensitätsmodulation umwandelt, ist der starke Hintergrundbeitrag durch den Strahlweg durch die Probe für beide Zustände 1 ) und 2) im Wesentlichen gleich.
Durch phasen richtige elektronische Subtraktion dieser beiden Signale gemäß Abb. 3 kann also der gesamte Hintergrundbeitrag eliminiert werden, es bleibt das in c) gezeigte Nutzsignal.
4. Optische Modulation im Detektionsstrahlenganq:
Erfindungsgemäß wird mittels AOM eine Strahlumschaltung zur Demodulation genutzt. Abbildung 5 zeigt einen Strahlengang ähnlich wie in Fig. 3 dargestellt.
Hier wird zwischen jedoch zwischen den Detektoren d1 und d2 mit der Frequenz ω umgeschaltet, vorteilhaft mittels eines AOD (A), ähnlich wie in Fig.2 dargestellt, jedoch hier in der Detektion.
Wiederum und wie schon dargestellt und erläutert erfolgt eine Subtraktion der in-Fokus und ausser-Fokus Signale und Tiefpass-Filtern.
Dadurch dass kein Strahlteiler verwendet wird geht nicht jeweils die Hälfte der Signalintensität verloren.
Über Ph kann der Phasenunterschied eingestellt werden. 5. Weitfeldmikroskop mit Hinterqrundunterdrückunq
Erfindungsgemäß und überraschend wird einer Fokiverteilung, beispielsweise erzeugt durch eine rotierende Mikrolinsenscheibe oder einer Multispoterzeugung wie in US 6.028.306 beschrieben die zum Bestandteil der Offenbarung der vorliegenden Anmeldung gemacht wird, eine Intensitätsmodulation nach dem FMM verfahren wird den Einzelfoki aufgeprägt, entweder gemeinsam durch Anordnung einer Halbraummaske nach dem FMM Verfahren, insbesondere wir oben beschrieben, in einer Pupillenebene des Objektives oder durch Einzelbeeinflussung jedes Teilstrahles nach dem FMM Verfahren oder durch gemeinsame Beeinflussung eines Strahls und nachfolgender Aufteilung wie in DE 199 04 592 C2, US6219179 beschrieben.
Die oben dargestellten für ein punktscannendes System ausgeführten Modulations- und Demodulationsverfahren lassen sich wie im Folgenden ausgeführt vorteilhaft beispielsweise auch auf eine Weitfeld-Fluoreszenzabbildung ausdehnen.
Dazu kann ein Mikroskopaufbau wie in Abb. 5 skizziert verwendet werden.
Abbildung 6 a zeigt ein Weitfeld-FMM Mikroskop mit rotierender Mikrolinsen-Scheibe (SML) im Zwischenbild, einem Fokusmodulator (FM) in der Pupille des Mikroskopobjektives O, und Kamera (K) mit triggerbarem Bildverstärker.
Abb. 6 b) zeigt ein Beispiel zur diskreten Demodulation mit 4 Teilbildern (aus [4]).
Abb.6c dient beispielhaft zur Veranschaulichung der Modulations- und Pixelfrequenzen. Eine Spinning-Microlens-Disc wie z.B. in einem Yokogawa-Weitfeld Scanmodul [3] wird so in die Nähe einer Zwischenbildebene gebracht, dass die Foki der Mikrolinsen durch das Objektiv in die Probe abgebildet werden. Jeder dieser Foki muss nun wie oben oder in [1] und [2] beschrieben in seiner Intensität moduliert werden. Um dies zu erreichen, kann ein Modulator wie in oben schon beschrieben in eine Pupille des Beleuchtungsstrahlengangs gebracht werden. Durch die dort erfolgende Phasenmodulation erfahren alle Foki eine entsprechende Intensitätsmodulation in der Probe.
Um die vorteilhafte Streulichtunterdrückung der Methode auszunutzen, muss nun auch phasenrichtig im Weitfeld detektiert werden. Dies kann über eine Kamera mit triggerbarem Bildverstärker (z.B. [6]) erfolgen: letzterer kann sehr schnell geschaltet werden und fungiert als schnelles„Gate", das während der vergleichsweise langen Aufnahmezeit der konventionellen CCD oder CMOS Kamera dahinter moduliert wird. Bei entsprechender Synchronisation von Modulator FM, Bildverstärker und rotierender Mikrolinsenscheibe SML können beispielsweise zwei Bilder sequentiell aufgenommen werden, wobei das erste mit„intakten" Foki (beide Anregungsstrahlenhälften in Phase, Abbildung 4) und das zweite mit„zerstörten" Foki (beide Anregungsstrahlenhälften gegenphasig, Abbildung 4). Wenn mehr als diese zwei beispielhaften„Stützstellen" der Modulationsperiode abgetastet werden, kann so die Phasenlage auch im Weitfeld rekonstruiert werden, beispielsweise aus 3 oder 4 Kamerabildern pro Periode. Die Mittelung über mehrere Perioden kann die Signalqualität weiter verbessern.
Die Lage von FM in der Pupille bedeutet dass alle Teilstrahlen je nach Lage auf der Probe unter unterschiedlichem Winkel in der Pupille vorliegen, in der Pupille füllt jeder Punkt die Pupille aus und dadurch dass die halbe Pupille durch FM moduliert wird wird jeder Spot zur Hälfte phasenmoduliert und in der Probe überlagert,
FM kann ein EOM sein, jedoch auch ein Element wie im Stand der Technik unter
[1.2].
In Abb. 5c) reduziert dargestellt ist das Scanschema einer Spinning Microlens Disc: alle Pixel 1 werden gleichzeitig belichtet, dann alle Pixel 2 etc. Bei einem Umlauf der Scheibe wird ein komplettes Bild belichtet. Damit das gesamte Bild phasenrichtig demoduliert werden kann, muss die Rotation der Scheibe phasengekoppelt erfolgen, so dass alle Pixel 1 ,2,3,4... die gleiche Phasenlage haben. Die Modulation ω muss also auch ein ganzzahliges Vielfaches der Rotationsfrequenz und Pixelfrequenz der Scheibe sein. Die Frequenz, mit der der Intensifier getriggert wird, muss wiederum ein Vielfaches der Modulationsfrequenz sein.
Konkretes Beispiel:
Eine typische Spinning Disc [3] kann mit 125 U/sec oder mehr betrieben werden, wobei das Verhältnis (Gesamtzahl Mikrolinsen/Zahl simultan beleuchteter Linsen) z.B. 12 beträgt, so dass pro Umdrehung 12 Bilder gerastert werden, also eine Bildrate von 1500 Hz. Bei beispielsweise 1000 simultan gerasterten Linsen und 500 x 500 Kamerapixeln ergeben sich 250 Pixelbelichtungen pro Mikrolinse und Bild und damit bei 10 MHz Modulationsfrequenz des Halbstrahl-Modulators 10 MHz/(1500 Hz *250) -26 Modulationsperioden pro Pixel, die abgetastet und aufintegriert werden können, um z.B. einen Messpunkt zur Ermittelung der Phasenlage zu erhalten. Für 4 Phasenpunkte (wie in Abb. 5 b)) würde sich dann eine vorteilhafte Gesamt-Bildrate von 375 Hz ergeben.
Alternativ zu der Image-Intensifier Kamera kann auch eine CMOS/CCD Kamera mit integrierten Lock-In-Pixeln verwendet werden, wie z.B. [4] & [5]. Diese Kameras werden normalerweise für Time-of-flight-basierte Entfernungsmessung in Verbindung mit einer modulierten Beleuchtung eingesetzt, können aber auch in einer Anordnung wie in Abb. 5 zur Demodulation eingesetzt werden.

Claims

Patentansprüche
1.
Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl, der entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und einem Mikroskopobjektiv zur intensitätsmodulierten Fokussierung des Beleuchtungsstrahls in eine Probe sowie einem Detektionsstrahlengang mit mindestens einem Demodulator wobei mindestens ein elektrooptischer Modulator (EOM) zur Phasenmodulation mindestens eines Teils, vorzugsweise der Hälfte des Beleuchtungsstrahls eingesetzt wird.
2.
Mikroskop nach Anspruch 1 ,
wobei ein Teil des Beleuchtungssstrahls über den EOM verläuft oder der EOM sich nur teilweise im Beleuchtungsstrahl befindet.
3.
Mikroskop nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei unterschiedliche Strahlabschnitte - oder hälften des Beleuchtungsstrahls durch gegenpolige Ansteuerung von Teilen eines EOM oder mehrerer EOM unterschiedlich, vorzugsweise gegenphasig, moduliert werden.
4.
Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl, der entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und einem Mikroskopobjektiv zur intensitätsmodulierten Fokussierung des Beleuchtungsstrahls in eine Probe sowie einem Detektionsstrahlengang mit mindestens einem Demodulator wobei unterschiedliche Strahlabschnitte - oder hälften des Beleuchtungsstrahls durch gegenphasige Ansteuerung von Piezoelementen unterschiedlich, vorzugsweise gegenphasig, moduliert werden.
5.
Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl, der entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und einem Mikroskopobjektiv zur intensitätsmodulierten Fokussierung des Beleuchtungsstrahls in eine Probe sowie einem Detektionsstrahlengang mit mindestens einem Demodulator, insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei akustooptische Modulatoren zur Aufteilung in mehrere Teilstrahlengänge sowie optische Elemente zur teilweisen Phasenmodulation des Anregungsstrahls vorgesehen sind sowie vorteilhaft Stellelemente zur Einstellung des Phasenunterschieds vorgesehen sind.
6.
Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl, der entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und einem Mikroskopobjektiv zur intensitätsmodulierten Fokussierung des Beleuchtungsstrahls in eine Probe sowie einem Detektionsstrahlengang mit mindestens einem Demodulator insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei mindestens ein optischer Modulator, vorzugsweise ein akustooptischer Modulator (AOM), zur Demodulation in der Detektion eingesetzt wird.
7.
Mikroskop nach Anspruch 6, wobei
mittels mindestens eines akustooptischen Modulators (AOM) eine Strahlumschaltung zur Demodulation erfolgt.
8.
Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl, der entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und einem Mikroskopobjektiv zur intensitätsmodulierten Fokussierung des Beleuchtungsstrahls in eine Probe sowie einem Detektionsstrahlengang mit mindestens einem Demodulator insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei eine Änderung der Betriebsweise der Detektoren zur Demodulation erfolgt.
9.
Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl, der entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und einem Mikroskopobjektiv zur intensitätsmodulierten Fokussierung des Beleuchtungsstrahls in eine Probe sowie einem Detektionsstrahlengang mit mindestens einem Demodulator insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei bei einer Fokiverteilung, beispielsweise erzeugt durch eine rotierende Mikrolinsenscheibe oder einer Multispoterzeugung wird den Einzelfoki eine Intentsitätsmodulation nach dem aufgeprägt, entweder durch Anordnung einer Halbraumphasenmaske in einer Pupillenebene des Objektives oder durch Einzelbeeinflussung von aufgespaltenen oder separaten Teilstrahlen indem sie entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert werden oder Beeinflussung eines Strahls indem er entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und seiner nachfolgender Aufteilung in Teilstrahlen.
10.
Verfahren zur mikroskopischen Erfassung von Licht einer Probe, die mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl über ein Mikroskopobjektiv zur Fokussierung beleuchtet wird, der in seinem Querschnitt teilweise phasenmoduliert ist, wobei in einem Detektionsstrahlengang eine Demodulation erfolgt, wobei vorzugsweise die Phasenmodulierung der Beleuchtung in der Probe in eine Intensitätsmodulation umgewandelt wird die in der Detektion demoduliert wird
wobei mindestens ein elektrooptischer Modulator (EOM) zur Phasenmodulation mindestens eines Teils, vorzugsweise der Hälfte des Beleuchtungsstrahls eingesetzt wird.
11.
Verfahren nach Anspruch 10,
wobei ein Teil des Beleuchtungssstrahls über den EOM verläuft oder der EOM sich nur teilweise im Beleuchtungsstrahl befindet.
12.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 1 1 ,
wobei unterschiedliche Strahlabschnitte - oder hälften des Beleuchtungsstrahls durch gegenpolige Ansteuerung von Teilen eines EOM oder mehrerer EOM unterschiedlich, vorzugsweise gegenphasig, moduliert werden.
13.
Verfahren zur mikroskopischen Erfassung von Licht einer Probe, die mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl über ein Mikroskopobjektiv zur Fokussierung beleuchtet wird, der in seinem Querschnitt teilweise phasenmoduliert ist, wobei in einem Detektionsstrahlengang eine Demodulation erfolgt, wobei vorzugsweise die Phasenmodulierung der Beleuchtung in der Probe in eine Intensitätsmodulation umgewandelt wird die in der Detektion demoduliert wird,
wobei unterschiedliche Strahlabschnitte - oder hälften des Beleuchtungsstrahls durch gegenpolige Ansteuerung von Piezoelementen unterschiedlich, vorzugsweise gegenphasig, moduliert werden.
14.
Verfahren zur mikroskopischen Erfassung von Licht einer Probe, die mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl über ein Mikroskopobjektiv zur Fokussierung beleuchtet wird, der in seinem Querschnitt teilweise phasenmoduliert ist, wobei in einem Detektionsstrahlengang eine Demodulation erfolgt, wobei vorzugsweise die Phasenmodulierung der Beleuchtung in der Probe in eine Intensitätsmodulation umgewandelt wird die in der Detektion demoduliert wird
insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei mindestens ein akustooptischer Modulator eine Aufteilung in mehrere Teilstrahlengänge vornimmt sowie optischen Elemente zur teilweisen Phasenmodulation des Anregungsstrahls vorgesehen sind sowie vorteilhaft Stellelemente eine Einstellung des Phasenunterschieds durchführen.
15.
Verfahren zur mikroskopischen Erfassung von Licht einer Probe, die mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl über ein Mikroskopobjektiv zur Fokussierung beleuchtet wird, der in seinem Querschnitt teilweise phasenmoduliert ist, wobei in einem Detektionsstrahlengang eine Demodulation erfolgt, wobei vorzugsweise die Phasenmodulierung der Beleuchtung in der Probe in eine Intensitätsmodulation umgewandelt wird die in der Detektion demoduliert wird, insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei mindestens ein optischer Modulator, vorzugsweise ein akustooptischer Modulator (AOM), zur Demodulation in der Detektion eingesetzt wird.
16.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei
mittels des AOM eine Strahlumschaltung zur Demodulation erfolgt. Verfahren zur mikroskopischen Erfassung von Licht einer Probe, die mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl über ein Mikroskopobjektiv zur Fokussierung beleuchtet wird, der in seinem Querschnitt teilweise phasenmoduliert ist, wobei in einem Detektionsstrahlengang eine Demodulation erfolgt, wobei vorzugsweise die Phasenmodulierung der Beleuchtung in der Probe in eine Intensitätsmodulation umgewandelt wird die in der Detektion demoduliert wird, insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei eine Änderung der Betriebsweise der Detektoren zur Demodulation erfolgt. 18.
Verfahren zur mikroskopischen Erfassung von Licht einer Probe, die mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl über ein Mikroskopobjektiv zur Fokussierung beleuchtet wird, der in seinem Querschnitt teilweise phasenmoduliert ist, wobei in einem Detektionsstrahlengang eine Demodulation erfolgt, wobei vorzugsweise die Phasenmodulierung der Beleuchtung in der Probe in eine Intensitätsmodulation umgewandelt wird die in der Detektion demoduliert wird, insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei
bei einer Fokiverteilung, beispielsweise erzeugt durch eine rotierende Mikrolinsenscheibe oder eine Multispoterzeugung den Einzelfoki eine Intentsitätsmodulation aufgeprägt wird entweder durch Anordnung einer Halbraumphasenmaske in einer Pupillenebene des Objektives oder durch Einzelbeeinflussung von aufgespaltenen oder separaten Teilstrahlen indem sie entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird oder durch Beeinflussung eines Strahls indem er entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und seiner nachfolgender Aufteilung.
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