EP2507358A2 - Hybrids obtained by the fusion of saccharomyces cerevisiae and torulaspora. delbrueckii, their use to conduct red and white wine fermentations and/or to restart stuck or sluggish fermentations, and process of obtaining such hybrids - Google Patents

Hybrids obtained by the fusion of saccharomyces cerevisiae and torulaspora. delbrueckii, their use to conduct red and white wine fermentations and/or to restart stuck or sluggish fermentations, and process of obtaining such hybrids

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EP2507358A2
EP2507358A2 EP09706403A EP09706403A EP2507358A2 EP 2507358 A2 EP2507358 A2 EP 2507358A2 EP 09706403 A EP09706403 A EP 09706403A EP 09706403 A EP09706403 A EP 09706403A EP 2507358 A2 EP2507358 A2 EP 2507358A2
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EP
European Patent Office
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fermentations
hybrids
strains
delbrueckii
consortium
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Júlia Margarida RAPOSO MONTEIRO DOS SANTOS
Maria João MARQUES FERREIRA DE SOUSA MOREIRA
Maria Cecília DE LEMOS PINTO ESTRELA LEÃO
Maria de Fátima TEIXEIRA CARDOSO DA SILVA
Sofia Beatriz Teixeira Da Silva
Filipe Miguel Monteiro Centeno Da Costa
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Proenol Industria Biotecnologica Lda
Universidade do Minho
Original Assignee
Proenol Industria Biotecnologica Lda
Universidade do Minho
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    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Definitions

  • the present invention relates to the obtaining and use of hybrids from the fusion of protoplasts between Saccharomyces cerevisiae and Torulaspora delbrueckii strains, either for the whole conduction of alcoholic fermentations in white and red wines, or for the resolution of peanuts. and fermentation stops.
  • These new strains combine the sugar consumption capacity of 5. cerevisiae with ethanol resistance intermediate to that of the parent strains, and also have characteristic aromas of the parental strain T. delbrueckii.
  • the invention also relates to three strains thus obtained, as well as to a consortium thereof.
  • the main objective of the invention is to provide a yeast capable of combining the desirable organoleptic characteristics of said non-Saccharomyces yeasts with the ability to conduct a wine fermentation to its end, as is characteristic of Saccharomyces species.
  • yeast be capable of conducting both complete fermentations of wines, namely white and red wines, from the outset, as well as causing the re-starting of pouting or standing fermentations.
  • three new strains (hereinafter referred to as Fl-IC, F1-2C and F1-4C) were obtained using protoplast fusion between strains of 5. cerevisiae PYCC 5792 and T. delbrueckii Bio-J32, with unique characteristics, capable of solving the aforementioned problems.
  • the new strains have a higher growth rate than the parental strain T. delbrueckii, while retaining their organoleptic characteristics, while preserving most of the yeast genome traditionally used in wine fermentations: 5. cerevisiae.
  • the strains constructed have, in terms of sugar consumption equivalent to that found for parental strain 5.
  • Resistance to ethanol is equivalent to the T. delbrueckii Bio-J32 parental strain in the case of the Fl-IC strain and the F-ST1 consortium, and the resistance of strains F1-2C and F1-4C is similar to that of the parental strain 5.
  • cerevisiea. PYCC 5792 The organoleptic characteristics of the parental strain T. delbrueckii are present in all three strains and in the consortium.
  • the strains have the advantage of ensuring sugar consumption within the same time frame as parental strain 5.
  • the consortium presents a fermentation kinetics quite similar to a 5.
  • cerevisiae starter culture widely used in wineries Figure 1
  • the use according to the invention proves to be extremely attractive on the one hand, in the total conduction of alcoholic fermentations, with the combination of organoleptic traits and the high sugar consumption capacity and, on the other hand, in the rearrangement of pouting and fermentation. stops, making it possible, through the action of their yeasts, to consume total sugars and contribute to the aromatic profile of the wine.
  • Figure 1 illustrates the fermentation kinetics of a 5. cerevisiae starter culture and of the F-STl consortium, in vintage must from 2006. In the abscissas "d” represents days and the ordinates "D” represents the density.
  • Figure 2 illustrates the pulsed field electrophoresis chromosomal profiles of the following strains: F1-IC (lanes 1 and 2); F1-2C (lanes 3 and 4); F1-4C (lanes 5 and 6); F-STl (lane 7).
  • Parental strain 5 cerevisiae PYCC 5792 was selected because it is an oenological strain widely used in fermentation rearranges.
  • Parental strain T. delbrueckii Bio-J32 was selected for its high ethanol resistance and potential organoleptic characteristics.
  • Protoplast Production Cells from both parental strains were harvested by centrifugation, washed twice with cold deionized water and resuspended to a final concentration of 10 8 cel / ml in a solution containing 0.1 M Tris / HCl, 0.01 M EDTA, 1 M KCl, 0.1 M ⁇ -mercaptoethanol, pH 7. the suspension was incubated at 30 0 C for 30 minutes with slow agitation (70 rpm) and was again centrifuged, followed by washing with IM KCl .
  • the cells were subsequently resuspended in solution P (Buffer K phosphate, pH 7.5 0.05 M; 1 M KCl; Lyticase 200 U / ml) and incubated at 30 0 C for 120 minutes with slow agitation
  • P Buffer K phosphate, pH 7.5 0.05 M; 1 M KCl; Lyticase 200 U / ml
  • hybrid protoplasts 1 ml of each prepared 5. cerevisiae PYCC 5792 and T. delbrueckii Bio-J32 protoplast suspensions was added and centrifuged again at 2500 rpm for 10 minutes. The supernatant was discarded and the pellet resuspended in the residual volume of about 0.2 ml. 2 ml 35% PEG containing 15% DMSO was added and incubated at 30 ° C for 30 minutes with slow shaking. 200 ⁇ l of the protoplast suspension was removed and added to 8 ml of 1.5% solution; Agar, 1 M KCl at 45 ° C, and immediately distributed to ethanol (18%, v / v) YPD medium plates to form a thin surface layer. The plates were incubated at 30 0 C for 4 to 5 days, until obtaining of col ⁇ nias.
  • fructose consumption capacity of the hybrids was compared with the fermentative capacity displayed by the parental strains. Fermentations were carried out in 250 ml Erlenmeyer flasks containing 150 ml SF medium, capped with rubber stoppers, at 20 ° C and 120 rpm. In these tests an inoculum (4x10 6 cells / ml) of stationary phase culture cells
  • SF medium with a pH adjusted to 3.7 has the following composition: fructose (2.5% w / v), yeast extract (1% w / v), peptone (2% w / v) , ethanol (12%, v / v) and acetylic acid
  • Table 2 shows fructose consumption in SF medium ((2.5%, w / v) fructose) after 3, 6, 7 and 10 days by strains 5.
  • Exponential phase culture cells (OD 640 nm of approximately 0.4) were harvested by centrifugation and transferred to YPD medium containing ethanol (18%, v / v) and acetylic acid (0.06%, v / v) , incubated at 20 ° C and 140 rpm. Samples were taken periodically within two hours and plated, in duplicate, on YPDA plates of the following composition: yeast extract (0.5%, w / v), peptone (1.0%, w / v), glucose (2.0% w / v) and agar

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Description

DESCRI QAO
"HIBRIDOS DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE E TORULASPORA DELBRUECKII, SUA UTILIZAQAO NA CONDUQAO DE FERMENTAQOES DE VINHOS TINTOS E BRANCOS E/OU NO REARRANQUE DE FERMENTAQOES AMUADAS E PARADAS E PROCESSO DE OBTENQAO DE TAIS HIBRIDOS"
Dominio da invengao
A presente invenςao refere-se a obtencao e utilizacao de hibridos provenientes da fusao de protoplastos entre estirpes de Saccharomyces cerevisiae e Torulaspora delbrueckii, quer para a conducao, na totalidade, de fermentagδes alcoόlicas em vinhos brancos e vinhos tintos, quer para a resolugao de amuos e paragens de fermentacao. Estas novas estirpes combinam a capacidade de consumo de acύcar de 5. cerevisiae com resistencias ao etanol intermedias a das estirpes parentais, apresentando ainda aromas caracteristicos da estirpe parental T. delbrueckii . A invenςao refere-se tambem a tres estirpes assim obtidas, assim como a urn consόrcio das mesmas.
Antecedentes da invengao
As fermentacόes vinicas incompletas, designadas por fermentacόes amuadas e paradas, sao de ocorrencia frequente na indύstria vinica pelo que tern urn importante impacto econόmico nesta indύstria. Varios factores, incluindo a limitacao de nutrientes, temperatura e pH extremos, praticas enolόgicas, presenςa de microrganismos responsaveis pela deterioracao e compostos tόxicos, tais como fungicidas e etanol, sao potenciais causas de fermentacόes incompletas (Alexandre & Charpentier, 1998; Bisson, 1999; Bisson & Butzke, 2000; Varela et al 2004) . Um processo fermentativo controlado ajuda a prevenir a ocorrencia deste problema. Contudo, uma segunda inoculacao e por vezes necessaria para atingir o esgotamento total de acύcares no mosto. Neste cenario, a sensibilidade da estirpe ao etanol, geralmente presente em elevadas concentragδes em mostos amuados e parados, e apontada como urn dos maiores obstaculos ao sucesso do rearranque de fermentacόes (Cavazza et al . , 2004).
E hoje reconhecido que os sabores e aromas dos vinhos sao fruto da uva em si, mas sao tambem fortemente influenciados pelas leveduras presentes durante a sua producao (Borneman et al . , 2007). Assim, assiste-se, cada vez mais, a uma diversificacao das estirpes de Saccharomyces utilizadas na fermentacao dos mostos com vista a diferenciacao dos vinhos, existindo uma forte tendencia para uma maior utilizacao de estirpes indigenas (Pretorious, 2000). Por outro lado, tern aumentando igualmente o interesse na exploracao de outras especies de leveduras tambem presentes no mosto em fermentacao (particularmente nas fases iniciais) mas que tradicionalmente nao sao responsaveis pelo processo fermentativo. Na realidade, estas especies parecem estar menos bem adaptadas as condicόes do mosto em fermentacao e desaparecem apόs o arranque da fermentacao (Xufre et al . , 2006) . Os aspectos que estao na base desta desvantagem competitiva relativamente a 5. cerevisiae, tern sido alvo de varios estudos, nao se encontrando no entanto ainda completamente esclarecidos (Mendoza et al . , 2007; Nissen e Arneborg, 2003; Nissen et al . , 2004).
A tecnica da fusao de protoplastos e conhecida desde pelo menos a decada de 80 do seculo passado. A metodologia da fusao de protoplastos permite a troca de material genetico entre celulas cujo cruzamento entre si nao e viavel espontaneamente . 0 interesse nesta tecnica ressurgiu nos ύltimos anos (Coloretti et al . , 2006; Giudici et al.,
2005; Nakazawa e Iwano, 2004) dado que nao sao conhecidos impedimentos legais e nao parece haver impedimentos sociais a utilizacao de estirpes obtidas por este metodo e que o mesmo oferece a vantagem de combinar genomas inteiros.
Objectivos da invengao
O principal objectivo da invengao e a disponibilizacao de uma levedura capaz de conjugar as caracteristicas organolepticas desejaveis das ditas leveduras nao-Saccharomyces com a capacidade de conduzir uma fermentacao vinaria ate o seu termo, como e caracteristico de especies de Saccharomyces .
Adicionalmente pretende-se que tal levedura seja apta tanto a conduςao de fermentacόes completas de vinhos, nomeadamente brancos e tintos, desde o inicio, como a provocar o rearranque de fermentacόes amuadas ou paradas .
Descrigao da invengao
Segundo a invengao, foram obtidas tres novas estirpes (doravante denominadas Fl-IC, F1-2C e F1-4C) , recorrendo a fusao de protoplastos entre estirpes de 5. cerevisiae PYCC 5792 e T. delbrueckii Bio-J32, com caracteristicas ύnicas, capazes de solucionar os problemas acima mencionados. As novas estirpes apresentam uma taxa de crescimento superior a da estirpe parental T. delbrueckii, mantendo contudo as suas caracteristicas organolepticas, para alem de preservarem a maioria do genoma da levedura tradicionalmente utilizada em fermentacόes vinicas: 5. cerevisiae.
Foi feito urn depόsito destas estirpes, de acordo com o Tratado de Budapeste, em 13 de Marco de 2009, junto do Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Uppsalalaan 8, NL-3584 CT Utrecht, Holanda/ P.O. Box 85167, NL-3508 AD Utrecht, Holanda.
A correspondencia entre os nύmeros de depόsito atribuidos e as supracitadas tres estirpes dos hibridos e dada na tabela seguinte (1) :
Tabela 1
Segundo a presente invencao pode proceder-se a utilizacao directa das novas estirpes (Fl-IC, F1-2C e Fl-
4C) e/ou de urn consόrcio das mesmas, denominado F-STl, na conducao de fermentacόes alcoόlicas em vinhos tintos e vinhos brancos, bem como em cenarios de paragens e amuos de fermentacao. As estirpes construidas apresentam, em termos de capacidade de consumo de acύcares, uma capacidade equivalente a verificada para a estirpe parental 5. cerevisiae PYCC 5792, a excepcao de Fl-IC. A resistencia ao etanol e equiparada a estirpe parental T. delbrueckii Bio- J32, no caso da estirpe Fl-IC e do consόrcio F-STl, sendo a resistencia das estirpes F1-2C e F1-4C semelhante a da estirpe parental 5. cerevisiea PYCC 5792. As caracteristicas organolepticas da estirpe parental T. delbrueckii estao presentes nas tres estirpes e no consόrcio. As estirpes apresentam a vantagem de assegurar o consumo de acύcares dentro do mesmo intervalo de tempo que a estirpe parental 5. cerevisiae PYCC 5792 e a de possuir as mesmas caracteristicas organolepticas exibidas pela estirpe parental T. delbrueckii Bio-J32. Quando testado a escala de adega, na conducao total de fermentacόes, o consόrcio apresenta uma cinetica de fermentacao bastante semelhante a uma cultura starter de 5. cerevisiae largamente utilizada em adegas (Figura 1), sendo capaz de finalizar a fermentacao no mesmo intervalo de tempo da cultura starter. De facto, a utilizacao segundo a invencao revela-se extremamente atractiva por um lado, na conducao total de fermentacόes alcoόlicas, com a conjugacao dos tracos organoleoticos e da alta capacidade de consumo de acύcares e, por outro lado, no rearranque de fermentacόes amuadas e paradas, possibilitando, por accao das respectivas leveduras, o consumo total de acύcares e a contribuicao para o perfil aromatico do vinho.
Breve descrigao dos desenhos
A figura 1 ilustra a cinetica de fermentacao de uma cultura starter de 5. cerevisiae e do consόrcio F-STl, em mosto de vindima do ano 2006. Nas abcissas "d" representa dias e nas ordenadas "D" representa a densidade.
A figura 2 ilustra os perfis cromossόmicos obtidos por electroforese em campo pulsado das seguintes estirpes: Fl-IC (faixas 1 e 2); F1-2C (faixas 3 e 4); F1-4C (faixas 5 e 6) ; F-STl (faixa 7) .
Descrigao pormenorizada de urn modo preferencial de concretizagao
A presente invencao e respectivas metodologias sao seguidamente descritas com base num modo preferencial de concretizagao :
1. Seleccao das estirpes parentais.
A estirpe parental 5. cerevisiae PYCC 5792 foi seleccionada por ser uma estirpe enolόgica amplamente utilizada em rearranques de fermentacao. A estirpe parental T. delbrueckii Bio-J32 foi seleccionada pela sua elevada resistencia ao etanol e potenciais caracteristicas organolepticas .
2. Producao de protoplastos As celulas de ambas as estirpes parentais foram recolhidas por centrifugacao, lavadas duas vezes com agua desionizada fria e ressuspendidas a uma concentracao final 108 cel/ml numa solucao contendo 0,1 M Tris/HCl, 0,01 M EDTA, 1 M KCl, 0,1 M β-Mercaptoetanol, pH 7. Esta suspensao foi incubada a 300C, durante 30 minutos, com agitacao lenta (70 rpm) e foi novamente centrifugada, seguindo-se uma lavagem com KCl IM. As celulas foram posteriormente ressuspendidas na solucao P (Tampao K fosfato, pH 7,5 0,05 M; KCl 1 M; Liticase 200 U/ml) e incubadas a 300C, durante 120 minutos, com agitacao lenta
(70 rpm) . A formacao de protoplastos foi acompanhada por observacao no microscόpio de contraste de fase. Seguidamente centrifugou-se a suspensao a 6000 g durante 10 minutos e lavou-se 3 vezes com KCl 1 M. Ressuspenderam-se os protoplastos em CaCl 0,4 M a uma concentracao final de
5xlO7 eel/ml.
3. Fusao de Protoplastos
Para obtencao de protoplastos hibridos, juntou-se 1 ml de cada uma das suspensδes de protoplastos de 5. cerevisiae PYCC 5792 e T. delbrueckii Bio-J32 preparadas e centrifugou-se novamente a 2500 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi eliminado e ressuspendeu-se o sedimento no volume residual de cerca de 0,2 ml. Adicionaram-se 2 ml de PEG 35%, contendo 15% de DMSO, e incubou-se a 30°C durante 30 minutos, com agitacao lenta. Retiraram-se 200 μl da suspensao de protoplastos os quais foram adicionados a 8 ml de solucao 1,5%; Agar, 1 M KCl a 45°C, e imediatamente distribuido em placas de meio YPD com etanol (18%, v/v) , de modo a formar uma fina camada superficial. As placas foram incubadas a 300C, durante 4 a 5 dias, ate obtencao de colόnias .
4. Avaliacao dos hibridos seleecionados guanto a capacidade de consumo de fructose
A avaliacao da capacidade de consumo de fructose dos hibridos foi comparada com a capacidade fermentativa exibida pelas estirpes parentais. As fermentacόes foram relalizadas em balδes Erlenmeyer de 250 ml contendo 150 ml de meio SF, tapados com rolhas de borracha, a 20 °C e 120 rpm. Nestes ensaios utilizou-se urn inόculo (4xlO6 celulas/ml) de celulas de cultura em fase estacionaria
(D.0.640 nm de aproximadamente 4), crescidas em meio YPD. 0 meio SF, com urn pH ajustado para 3,7 apresenta a seguinte composicao: frutose (2,5%, p/v) , extracto de levedura (1%, p/v), peptona (2%, p/v), etanol (12%, v/v) e acido acetico
(0,06%, v/v). Foram retiradas amostras ao longo do tempo, centrifugadas a velocidade de 16000 g durante 5 minutos, congelando-se em seguida o sobrenadante a -20°C. 0 doseamento de acύcares foi realizado pelo metodo do DNS. Este metodo foi descrito por Sumner (1944) .
A tabela 2 apresenta o consumo de frutose no meio SF ((2,5%, p/v) de frutose) ao fim de 3, 6, 7 e 10 dias pelas estirpes 5. cerevisiae PYCC 5792, Fl-IC, F1-2C e pelo consόrcio F-STl.
Tabela 2
Consumo (g/L) 3 6 7 10 Estirpes dias dias dias dias
S. cerevisiae PYCC 5792 11,08 23,34 5. cerevisiae PYCC 5792
(eel. Imobilizadas) 22,11 23,76
F-STl 11,01 23,82
F-STl (eel. Imobilizadas) 18,45 24,00
Fl-IC 3,47 9,94
F1-2C 6,97 24,27 5. Avaliacao dos hibridos seleccionados guanto a resistencia ao etanol
Foram recolhidas, por centrifugacao, celulas de cultura em fase exponencial (D.O.640 nm de aproximadamente 0,4) e transferidas para meio YPD contendo etanol (18%, v/v) e acido acetico (0,06%, v/v) , incubado a 20° C e 140 rpm. Foram retiradas amostras periodicamente num intervalo de duas horas e plaqueadas, em duplicado, em placas de YPDA com a seguinte composicao: extracto de levedura (0,5%, p/v) , peptona (1,0%, p/v) , glucose (2,0%, p/v) e agar
(2,0%, p/v) . As placas foram incubadas a 30°C durante 48 horas ou ate as colόnias estarem suficientemente crescidas.
6. Analise dos perfis cromossόmicos dos hibridos seleccionados
Para a extraccao e preparacao do DNA, foi usado o metodo de Schwartz e Cantor (1984), com algumas modificacόes . As celulas foram recolhidas, lavadas duas vezes com EDTA (50 mM, pH 8) e ressupendidas a uma concentracao de aproximadamente 109 eel/ml. A esta suspensao foi adicionado Zymoliase (3 mg/ml) , seguida de agarose de baixo ponto de fusao (2%, p/v) e rapidamente se verteu a suspensao para moldes adequados ate solidificar. Os blocos em forma de disco foram em seguida imersos numa solucao de EDTA (0.45M, pH 8) e β-mercaptoetanol (7.5%), e incubados durante a noite a 37°C. Depois de lavados tres vezes com tampao TE (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA pH 8) os discos foram submersos numa solucao de digestao com a seguinte composicao: proteinase K (1 mg/ml), EDTA (0.5 M), Tris (10 mM, pH 8) e sarcosil(l% p/v), e incubados durante 24 horas a 500C. Seguiram-se tres novas lavagens com EDTA (50 mM, pH 8) e os discos foram carregados num gel de agarose (1%, p/v) . A electroforese foi efectuada a 12°C, em tampao TBE (Bio-Rad) , e com pulsos que variaram dos 900s aos 60s, com a duracao total de 55 horas .

Claims

REIVINDICAςόES
1. Processo de obtencao de leveduras com propriedades organolepticas e resistencia ao etanol melhoradas caracterizado pela geracao conjunta de urn consόrcio de tres hibridos distintos de Saccharomyces cerevisiae e Torulaspora delbrueckii , por fusao de protoplastos .
2. Processo segundo a reivindicacao anterior, caracterizado pelo isolamento de cada urn dos tres hibridos constitutivos do consόrcio a partir deste.
3. Leveduras obtidas segundo o processo da reivindicacao 1 caracterizadas por o consόrcio apresentar o perfil cromossόmico da faixa 7 da figura 2.
4. Leveduras conforme a reivindicacao anterior caracterizadas por os tres hibridos constitutivos do consόrcio apresentarem os perfis cromossόmicos das faixas 1 e 2, 3 e 4 e 5 e 6, da figura 2.
5. Leveduras conforme a reivindicacao 3 caracterizadas por o consόrcio ser constituido pelos hibridos Fl-IC (CBS 124238), F1-2C (CBS 124239) F1-4C (CBS 124240)
6. Leveduras conforme uma das reivindicacόes 3 a 5, caracterizadas por serem secas e encapsuladas .
7. Leveduras conforme uma das reivindicacόes 3 a 5, caracterizadas por serem secas em pό .
8. Leveduras conforme uma das reivindicacόes 3 a 5, caracterizadas por serem livres (sem desidratacao) .
9. Processo de conducao de fermentacόes vinarias em vinhos brancos ou tintos, caracterizado pela utilizacao das leveduras das reivindicacόes 3 a 7.
10. Processo de rearrancar fermentacόes paradas ou amuadas, caracterizado pela utilizacao das leveduras das reivindicacόes 3 a 7.
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J. SANTOS ET AL: "Ethanol tolerance of sugar transport, and the rectification of stuck wine fermentations", MICROBIOLOGY, vol. 154, no. 2, 1 February 2008 (2008-02-01), pages 422 - 430, XP055098082, ISSN: 1350-0872, DOI: 10.1099/mic.0.2007/011445-0 *

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