PT103948A - Híbridos de saccharomyces cerevisiae e torulaspora delbrueckii, sua utilização na condução de fermentações de vinhos tintos e brancos e/ou no rearranque de fermentações amuadas e paradas e processo de obtenção de tais híbridos. - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE À OBTENÇÃO E UTILIZAÇÃO DE HÍBRIDOS PROVENIENTES DA FUSÃO DE PROTOPLASTOS ENTRE ESTIRPES DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE E TORULASPORA DELBRUECKII, QUER PARA A CONDUÇÃO, NA TOTALIDADE, DE FERMENTAÇÕES ALCOÓLICAS EM VINHOS BRANCOS E VINHOS TINTOS, QUER PARA A RESOLUÇÃO DE AMUOS E PARAGENS DE FERMENTAÇÃO. ESTAS NOVAS ESTIRPES COMBINAM A CAPACIDADE DE CONSUMO DE AÇÚCAR DE S. CEREVISIAE COM RESISTÊNCIAS AO ETANOL INTERMÉDIAS À DAS ESTIRPES PARENTAIS, APRESENTANDO AINDA AROMAS CARACTERÍSTICOS DA ESTIRPE PARENTAL T. DELBRUECKII. A INVENÇÃO REFERE-SE TAMBÉM A TRÊS ESTIRPES ASSIM OBTIDAS, ASSIM COMO A UM CONSÓRCIO DAS MESMAS.

Description

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DESCRIÇÃO "Híbridos de Saccharomyces cerevisiae e Torulaspora delbrueckii, sua utilização na condução de fermentações de vinhos tintos e brancos e/ou no rearranque de fermentações amuadas e paradas e processo de obtenção de tais híbridos"

Dominio da invenção A presente invenção refere-se à obtenção e utilização de híbridos provenientes da fusão de protoplastos entre estirpes de Saccharomyces cerevisiae e Torulaspora delbrueckii, quer para a condução, na totalidade, de fermentações alcoólicas em vinhos brancos e vinhos tintos, quer para a resolução de amuos e paraqens de fermentação. Estas novas estirpes combinam a capacidade de consumo de açúcar de S. cerevisiae com resistências ao etanol intermédias à das estirpes parentais, apresentando ainda aromas característicos da estirpe parental T. delbrueckii. A invenção refere-se também a três estirpes assim obtidas, assim como a um consórcio das mesmas.

Antecedentes da invenção

As fermentações vínicas incompletas, designadas por fermentações amuadas e paradas, são de ocorrência frequente na indústria vínica pelo que têm um importante impacto económico nesta indústria. Vários factores, incluindo a limitação de nutrientes, temperatura e pH extremos, práticas enológicas, presença de microrganismos 2 responsáveis pela deterioração e compostos tóxicos, tais como fungicidas e etanol, são potenciais causas de fermentações incompletas (Alexandre & Charpentier, 1998/ Bisson, 1999/ Bisson & Butzke, 2000/ Varela et al 2004). Um processo fermentativo controlado ajuda a prevenir a ocorrência deste problema. Contudo, uma segunda inoculação é por vezes necessária para atingir o esgotamento total de açúcares no mosto. Neste cenário, a sensibilidade da estirpe ao etanol, geralmente presente em elevadas concentrações em mostos amuados e parados, é apontada como um dos maiores obstáculos ao sucesso do rearranque de fermentações (Cavazza et al., 2004). É hoje reconhecido que os sabores e aromas dos vinhos são fruto da uva em si, mas são também fortemente influenciados pelas leveduras presentes durante a sua produção (Borneman et al., 2007). Assim, assiste-se, cada vez mais, a uma diversificação das estirpes de Saccharomyces utilizadas na fermentação dos mostos com vista à diferenciação dos vinhos, existindo uma forte tendência para uma maior utilização de estirpes indígenas (Pretorious, 2000) . Por outro lado, tem aumentando igualmente o interesse na exploração de outras espécies de leveduras também presentes no mosto em fermentação (particularmente nas fases iniciais) mas que tradicionalmente não são responsáveis pelo processo fermentativo. Na realidade, estas espécies parecem estar menos bem adaptadas às condições do mosto em fermentação e desaparecem após o arranque da fermentação (Xufre et al., 2006) . Os aspectos que estão na base desta desvantagem competitiva relativamente a S. cerevisiae, têm sido alvo de vários estudos, não se encontrando no entanto ainda completamente esclarecidos (Mendoza et al., 2007/ 3

Nissen e Arneborg, 2003; Nissen et al., 2004). A técnica da fusão de protoplastos é conhecida desde pelo menos a década de 80 do século passado. A metodologia da fusão de protoplastos permite a troca de material genético entre células cujo cruzamento entre si não é viável espontaneamente. O interesse nesta técnica ressurgiu nos últimos anos (Coloretti et al., 2006; Giudici et al., 2005; Nakazawa e Iwano, 2004) dado que não são conhecidos impedimentos legais e não parece haver impedimentos sociais à utilização de estirpes obtidas por este método e que o mesmo oferece a vantagem de combinar genomas inteiros.

Objectivos da invenção O principal objectivo da invenção é a disponibilização de uma levedura capaz de conjugar as caracteristicas organolépticas desejáveis das ditas leveduras não-Saccharomyces com a capacidade de conduzir uma fermentação vinária até o seu termo, como é caracteristico de espécies de Saccharomyces.

Adicionalmente pretende-se que tal levedura seja apta tanto à condução de fermentações completas de vinhos, nomeadamente brancos e tintos, desde o inicio, como a provocar o rearranque de fermentações amuadas ou paradas.

Descrição da invenção

Segundo a invenção, foram obtidas três novas estirpes (denominadas F1-1C, F1-2C e F1-4C), recorrendo à fusão de 4 protoplastos entre estirpes de S. cerevisiae PYCC 5792 e T. delbrueckii Bio-J32, com características únicas, capazes de solucionar os problemas acima mencionados. As novas estirpes apresentam uma taxa de crescimento superior à da estirpe parental T. delbrueckii, mantendo contudo as suas caracteristicas organolépticas, para além de preservarem a maioria do genoma da levedura tradicionalmente utilizada em fermentações vinicas: S. cerevisiae.

Segundo a presente invenção pode proceder-se à utilização directa das novas estirpes (F1-1C, F1-2C e Fl-4C) e/ou de um consórcio das mesmas, denominado F-ST1, na condução de fermentações alcoólicas em vinhos tintos e vinhos brancos, bem como em cenários de paragens e amuos de fermentação. As estirpes construídas apresentam, em termos de capacidade de consumo de açúcares, uma capacidade equivalente à verificada para a estirpe parental S. cerevisiae PYCC 5792, à excepção de Fl-lC. A resistência ao etanol é equiparada à estirpe parental T. delbrueckii Bio-J32, no caso da estirpe Fl-lC e do consórcio F-ST1, sendo a resistência das estirpes F1-2C e F1-4C semelhante à da estirpe parental S. cerevisiea PYCC 5792. As caracteristicas organolépticas da estirpe parental T. delbrueckii estão presentes nas três estirpes e no consórcio. As estirpes apresentam a vantagem de assegurar o consumo de açúcares dentro do mesmo intervalo de tempo que a estirpe parental S. cerevisiae PYCC 5792 e a de possuir as mesmas caracteristicas organolépticas exibidas pela estirpe parental T. delbrueckii Bio-J32. Quando testado à escala de adega, na condução total de fermentações, o consórcio apresenta uma cinética de fermentação bastante semelhante a uma cultura starter de S. cerevisiae largamente utilizada em adegas (Figura 1), sendo 5 capaz de finalizar a fermentação no mesmo intervalo de tempo da cultura starter. De facto, a utilização segundo a invenção revela-se extremamente atractiva por um lado, na condução total de fermentações alcoólicas, com a conjugação dos traços organoléoticos e da alta capacidade de consumo de açúcares e, por outro lado, no rearranque de fermentações amuadas e paradas, possibilitando, por acção das respectivas leveduras, o consumo total de açúcares e a contribuição para o perfil aromático do vinho.

Breve descrição dos desenhos A figura 1 ilustra a cinética de fermentação de uma cultura starter de S. cerevisiae e do consórcio F-ST1, em mosto de vindima do ano 2006. Nas abcissas "d" representa dias e nas ordenadas "D" representa a densidade. A figura 2 ilustra os perfis cromossómicos obtidos por electroforese em campo pulsado das seguintes estirpes: F1-1C (faixas 1 e 2); F1-2C (faixas 3 e 4); F1-4C (faixas 5 e 6); F-STl (faixa 7).

Descrição pormenorizada de um modo preferencial de concretização A presente invenção e respectivas metodologias são seguidamente descritas com base num modo preferencial de concretização: 1. Selecção das estirpes parentais. 6 A estirpe parental S. cerevisiae PYCC 5792 foi seleccionada por ser uma estirpe enológica amplamente utilizada em rearranques de fermentação. A estirpe parental T. delbrueckii Bio-J32 foi seleccionada pela sua elevada resistência ao etanol e potenciais caracteristicas organolépticas. 2. Produção de protoplastos

As células de ambas as estirpes parentais foram recolhidas por centrifugação, lavadas duas vezes com água desionizada fria e ressuspendidas a uma concentração final 108 cel/ml numa solução contendo 0,1 M Tris/HCl, 0,01 M EDTA, 1 M KC1, 0,1 M β-Mercaptoetanol, pH 7. Esta suspensão foi incubada a 30°C, durante 30 minutos, com agitação lenta (70 rpm) e foi novamente centrifugada, seguindo-se uma lavagem com KC1 1M. As células foram posteriormente ressuspendidas na solução P (Tampão K fosfato, pH 7,5 0,05 M; KC1 1 M; Liticase 200 U/ml) e incubadas a 30°C, durante 120 minutos, com agitação lenta (7 0 rpm) . A formação de protoplastos foi acompanhada por observação no microscópio de contraste de fase.

Seguidamente centrifugou-se a suspensão a 6000 g durante 10 minutos e lavou-se 3 vezes com KC1 1 M. Ressuspenderam-se os protoplastos em CaCl2 0,4 M a uma concentração final de 5xl07 cel/ml. 3. Fusão de Protoplastos

Para obtenção de protoplastos hibridos, juntou-se 1 ml de cada uma das suspensões de protoplastos de S. cerevisiae PYCC 5792 e T. delbrueckii Bio-J32 preparadas e centrifugou-se novamente a 2500 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi eliminado e ressuspendeu-se o sedimento no volume residual de cerca de 0,2 ml. Adicionaram-se 2 ml de 7 PEG 35%, contendo 15% de DMSO, e incubou-se a 30°C durante 30 minutos, com agitação lenta. Retiraram-se 200 μΐ da suspensão de protoplastos os quais foram adicionados a 8 ml de solução 1,5%; Agar, 1 M KC1 a 45°C, e imediatamente distribuído em placas de meio YPD com etanol (18%, v/v), de modo a formar uma fina camada superficial. As placas foram incubadas a 30°C, durante 4 a 5 dias, até obtenção de colónias. 4. Avaliação dos híbridos seleccionados quanto à capacidade de consumo de fructose A avaliação da capacidade de consumo de fructose dos híbridos foi comparada com a capacidade fermentativa exibida pelas estirpes parentais. As fermentações foram relalizadas em balões Erlenmeyer de 250 ml contendo 150 ml de meio SF, tapados com rolhas de borracha, a 20 °C e 120 rpm. Nestes ensaios utilizou-se um inoculo (4xl06 células/ml) de células de cultura em fase estacionária (D. 0.640 nm de aproximadamente 4), crescidas em meio YPD. O meio SF, com um pH ajustado para 3,7 apresenta a seguinte composição: frutose (2,5%, p/v), extracto de levedura (1%, p/v), peptona (2%, p/v), etanol (12%, v/v) e ácido acético (0,06%, v/v). Foram retiradas amostras ao longo do tempo, centrifugadas à velocidade de 16000 g durante 5 minutos, congelando-se em seguida o sobrenadante a -20°C. O doseamento de açúcares foi realizado pelo método do DNS. Este método foi descrito por Sumner (1944). A tabela 1 apresenta o consumo de frutose no meio SF ((2,5%, p/v) de frutose) ao fim de 3, 6, 7 e 10 dias pelas estirpes S. cerevisiae PYCC 5792, F1-1C, F1-2C e pelo consórcio F-ST1.

Tabela 1

Estirpes 3 dias Consumo 6 dias (g/L) 7 dias 10 dias S. cerevisiae PYCC 5792 S. cerevisiae PYCC 5792 (cel. Imobilizadas) 11,08 23, 34 22,11 23,76 F-ST1 11,01 23, 82 F-ST1 (cel. Imobilizadas) 18,45 24,00 F1-1C 3,47 9, 94 F1-2C 6, 97 24,27 5. Avaliação dos híbridos seleccionados quanto à resistência ao etanol

Foram recolhidas, por centrifugação, células de cultura em fase exponencial (D.O.640 nm de aproximadamente 0,4) e transferidas para meio YPD contendo etanol (18%, v/v) e ácido acético (0,06%, v/v), incubado a 20° C e 140 rpm. Foram retiradas amostras periodicamente num intervalo de duas horas e plaqueadas, em duplicado, em placas de YPDA com a seguinte composição: extracto de levedura (0,5%, p/v) , peptona (1,0%, p/v), glucose (2,0%, p/v) e agar (2,0%, p/v). As placas foram incubadas a 30°C durante 48 horas ou até as colónias estarem suficientemente crescidas. 6. Análise dos perfis cromossómicos dos híbridos seleccionados 9

Para a extracção e preparação do DNA, foi usado o método de Schwartz e Cantor (1984), com algumas modificações. As células foram recolhidas, lavadas duas vezes com EDTA (50 mM, pH 8) e ressupendidas a uma concentração de aproximadamente 109 cel/ml. A esta suspensão foi adicionado Zymoliase (3 mg/ml), seguida de agarose de baixo ponto de fusão (2%, p/v) e rapidamente se verteu a suspensão para moldes adequados até solidificar. Os blocos em forma de disco foram em seguida imersos numa solução de EDTA (0.45M, pH 8) e β-mercaptoetanol (7.5%), e incubados durante a noite a 37°C. Depois de lavados três vezes com tampão TE (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA pH 8) os discos foram submersos numa solução de digestão com a seguinte composição: proteinase K (1 mg/ml), EDTA (0.5 M) , Tris (10 mM, pH 8) e sarcosil(l% p/v), e incubados durante 24 horas a 50°C. Seguiram-se três novas lavagens com EDTA (50 mM, pH 8) e os discos foram carregados num gel de agarose (1%, p/v). A electroforese foi efectuada a 12°C, em tampão TBE (Bio-Rad) , e com pulsos que variaram dos 900s aos 60s, com a duração total de 55 horas.

Porto, 12 de Junho de 2008

Claims (8)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo de obtenção de leveduras com propriedades organolépticas e resistência ao etanol melhoradas caracterizado pela geração conjunta de um consórcio de três híbridos distintos de Saccharomyces cerevisiae e Torulaspora delbrueckii, por fusão de protoplastos.

2. Processo segundo a reivindicação anterior, caracterizado pelo isolamento de cada um dos três híbridos constitutivos do consórcio a partir deste.

3. Leveduras obtidas segundo o processo da reivindicação 1 caracterizadas por o consórcio apresentar o perfil cromossómico da faixa 7 da figura 2.

4. Leveduras conforme a reivindicação anterior caracterizadas por os três híbridos constitutivos do consórcio apresentarem os perfis cromossómicos das faixas 1 e 2, 3 e 4 e 5 e 6, da figura 2.

5. Leveduras conforme a reivindicação 3 e/ou a reivindicação 4, caracterizadas por serem secas e encapsuladas.

6. Leveduras conforme a reivindicação 3 e/ou a reivindicação 4, caracterizadas por serem secas em pó.

7. Leveduras conforme a reivindicação 3 e/ou a reivindicação 4, caracterizadas por serem livres (sem desidratação). Processo de condução de fermentações vinárias em vinhos 2 brancos ou tintos, caracterizado pela utilização das leveduras das reivindicações 3 a 7.

9. Processo de rearrancar fermentações paradas ou amuadas, caracterizado pela utilização das leveduras das reivindicações 3 a 7. Porto, 11 de Abril de 2008