EP2416860A1 - Obtention et utilisation de principes actifs des calcaires - Google Patents

Obtention et utilisation de principes actifs des calcaires

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Publication number
EP2416860A1
EP2416860A1 EP10717188A EP10717188A EP2416860A1 EP 2416860 A1 EP2416860 A1 EP 2416860A1 EP 10717188 A EP10717188 A EP 10717188A EP 10717188 A EP10717188 A EP 10717188A EP 2416860 A1 EP2416860 A1 EP 2416860A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
organic
acid
molecules
france
rock
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP10717188A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Xavier Bourrat
Evelyne Lopez
Marthe Rousseau
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Museum National dHistoire Naturelle
Universite d Orleans UFR de Sciences
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Museum National dHistoire Naturelle
Universite d Orleans UFR de Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Museum National dHistoire Naturelle, Universite d Orleans UFR de Sciences filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP2416860A1 publication Critical patent/EP2416860A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D11/00—Solvent extraction
    • B01D11/02—Solvent extraction of solids
    • B01D11/0288—Applications, solvents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/02—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution from inanimate materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/965—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of inanimate origin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations

Definitions

  • the present invention relates to a process for extracting organic and / or organomineral molecules from a calcareous material, as well as extracts obtained by this method.
  • the extracted products are organic and / or organomineral molecules.
  • references in parentheses refer to the list of references presented at the end of the text.
  • Methods for extracting organic molecules from different sources are known in the state of the art. These are, for example, processes for extracting organic molecules from plant extracts, for example extracts of Arachis hypogaea (Fabaceae) and Phaseolus vulgaris (Fabaceae).
  • the molecules extracted with these processes can be used in various fields, for example in the pharmaceutical, cosmetics, food processing, etc.
  • Examples of organic molecules extracted in the state of the art are, for example sterols, terpenes , terpene esters, etc. These molecules are, for example, used as food additives or in cosmetic products for particular to fill gaps and / or to treat pathologies of the skin or other.
  • the decrease in estrogen levels leads to a loss of weight and bone density.
  • the decrease in bone density may also be due to pharmacological treatments, for example anti-inflammatory treatments based on corticosteroids which can lead to osteopenia that can go as far as osteoporosis.
  • the pathology associated with loss of bone mass and density is osteoporosis which causes excessive fragility of the skeleton. Osteoporosis may also be due to the acquisition of insufficient bone capital at the end of growth, or bone loss during adult life due for example to genetic, nutritional and environmental factors.
  • One of the means known in the state of the art for preventing or treating the decrease in mass and bone density is generally the administration of diets enriched with calcium.
  • Various forms of calcium are used, for example, CaCO 3 (see J. L Greger et al., "Ore use by rats fed various commercially available calcium supplements or milk.” J Nutr; 117: 717-24 1987 (Ref 1), T.
  • osteoporosis Another means known in the state of the art for treating osteopenia (osteoporosis) is the administration of anti-osteoporosis.
  • these include compounds that stimulate bone formation and calcium fixation: vitamin D, parathyroid hormone (very low dose), estrogen and strontium; of compounds that slow bone resorption: bisphosphonates and calcitonin.
  • An easily bioavailable calcium intake is always needed during these treatments. It has been shown in rats that high dose parathyroid hormone is carcinogenic.
  • vitamin D has effects on immunity that can be deleterious for men.
  • JDE dermo-epidermal junction
  • ETD Epidermal Terminal Differentiation
  • the calcium gradient increases from the germinal layer where keratinocytes are formed to the outer layers of the epidermis. Calcium binds to phospholipids, which are necessary for the keratinization process.
  • said molecules can be used, for example, for treatment and / or prevention of mass reduction. and bone density, for stimulation of activity and / or skin restructuring, complementation of the diet with consequent maintenance of calcium homeostasis.
  • the present invention specifically aims to meet these needs and disadvantages of the prior art by providing a method for extracting organic and / or organomineral molecules.
  • the process of the invention is a process for extracting organic and / or organomineral molecules from a calcareous material, comprising the following step: contacting the calcareous material with a solution, said solution comprising at least one organic solvent, water and at least one acid.
  • the inventors are the first to have discovered that limestone materials containing many organic and / or organomineral molecules accumulated during the formation of said materials had pharmaceutical and / or cosmetic properties. They have therefore developed a process for extracting these molecules in order to extract and use them.
  • the inventors have shown that the extracted molecules were able to stimulate the mechanisms of formation and bone mineralization and / or to stimulate the activity of epidermal and / or dermal cells.
  • calcareous material is any material comprising limestone. It may be for example a limestone rock.
  • the limestone material may be, for example a limestone of France selected from the group comprising a rock Orgon, France, Pierre d'Euville, France, Saint Germain, France, and from Pagny sur Meuse, France.
  • the calcareous material may be, for example a limestone selected from the group comprising the rock of Orgon, F-13660, Pierre d'Euville, F-5520, Saint Germain, F- 55140 or Pagny sur Meuse, F-55190 or Héming, F-57830.
  • the calcareous material can come from, for example quarries: de Fontvieille, F-13 990; from Salon de terme, F-13300; d'Orgon, F-13660; Cassis, F-13260; Maine de Boixe, F-16230; from Biarge to Saint Fraigne, F-16140; from Gratte-Chat to Saint Sornin, F-17600; of Subdray, F-18570; from Sainte-Croix-De-Mareuil, F-24340; from Pont-du-Gard to Remoulin F-30210; from Verfeuil, F-30630; Conques at Brouzet-les-Ales, F-30055; from Val d'Epis, F-39160; Raymond Rabier, The Tieule F-48500; Senonville, Valbois F-55300; from Pagny-sur-Meuse, F-55190; Euville, F-55200; from Saint Germain-sur-M
  • the preferred limestone rock has a measurable total organic carbon (TOC) content, but it can just as easily be very low or even undetectable.
  • the TOC content may be between 0.01 and 1.5%, for example between 0.02 and 0.8%, for example between 0.03 and 0.3%.
  • the measurement of the total organic carbon (TOC) content may be carried out by any method known to those skilled in the art. This may include, for example, the Leco (Registered Trade Mark) analysis of organic carbon in decarbonated rocks (eg Leco (Registered Trade Mark) SC-444) or an elemental analysis of concentrated organic matter using a Kerogenatron (Vinci Technologies, France) or a pyrolytic method known as Rock Eval pyrolysis which has been used here, diverted from its usual use of mineral oils or contaminations (Rock-Eval 6 turbo from Vinci Technologies, France see E. Lafargue, F. Marquis, D.
  • Leco Registered Trade Mark
  • the calcareous material may for example have an average particle size of between 0.5 and 1000 ⁇ m, preferably between 0.5 and 500 ⁇ m, more preferably less than 200 ⁇ m.
  • organic and / or organomineral molecules is understood to mean, for example, proteins, peptides, lipids or saccharides or mixtures and / or, for example, molecules rich in heteroelements, for example a protein. calcium binding protein of salts, ions, minerals, colloidal particles and / or combinations of these compounds.
  • the organic and / or organomineral molecules may be in the complex form of the natural mixture or may be separated and purified. It may be, for example, old molecules whose age corresponds to the age of the calcareous material or for example molecules related to diagenesis or formed over time, or in recent limestones.
  • extract or "rock extracts” or “calcareous rock extract” to refer equally to the organic and / or organomineral molecules as defined above.
  • they may be proteins, peptides, lipids, saccharides and / or mixtures and / or for example salts, ions, minerals, colloidal particles and / or combinations of these compounds.
  • organic solvent is understood to mean, for example, a solvent or a mixture of solvents chosen from the group comprising C1 to C6 alcohols, ethers and hydrocarbons.
  • it may be a solvent chosen from the group comprising ethanol, diethyl ether, dichloromethane, dimethylformamide (DMF) 1 dimethylsulfoxide (DMSO), acetonitrile, or a mixture of these solvents .
  • DMF dimethylformamide
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • acetonitrile or a mixture of these solvents .
  • It may also be, for example, without prejudging their nature, any fluids in the supercritical or subcritical state, having characteristics equivalent to "organic solvents", for example supercritical CO 2 or even subcritical water .
  • solvent mixture is understood to mean, for example, a mixture of at least two organic solvents, at least three organic solvents, at least four or more organic solvents.
  • the solvent mixture can be, for example, a mixture of C 1 to C 6 alcohols, a mixture of ethers, a mixture of hydrocarbons and / or a mixture of solvents chosen from the group comprising C 1 to C 6 alcohols, a mixture of ethers and a mixture of organic hydrocarbons or a mixture of these solvents.
  • any concentration of suitable solvents may be used.
  • the volume concentration of the organic solvent relative to the aqueous phase is advantageously between 1 and 99%.
  • the term "acid” is understood to mean, for example, a mineral acid and / or an organic acid.
  • the acid may be selected from the group consisting of hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid, citric acid, ethylene diamine tetraacetic acid.
  • the pH of the solution of the process of the invention may be less than 7, preferably between 0 and 7, even more preferably between 0 and 5, more preferably preferred between 1 and 4, more preferably between 1 and 3.
  • the contacting of the calcareous material with the solution may be carried out, for example, by dipping, spraying, wetting, partial or total immersion of the calcareous material with said solution.
  • the contacting of the calcareous material with the solution is carried out by total immersion of the material.
  • the contacting of the calcareous material with the solution comprising: at least one organic solvent, water and at least one acid, can be carried out, for example, at a temperature between and 90 ° C, preferably between 8 and 75 ° C, even more preferably between 8 and 30 ° C.
  • This temperature can also be chosen throughout the range required subcritical or supercritical states, if necessary.
  • the temperature is generally chosen so as not to irreversibly denature the extracted molecules.
  • the contacting of the calcareous material with the solution comprising: at least one organic solvent, water and at least one acid may be carried out, for example, for a time of between about 1 minute and 72 hours, preferably between about 1 minute and 48 hours, even more preferably between 1 minute and 12 hours.
  • the method may advantageously comprise a grinding step before contacting the calcareous material with the solution.
  • grinding means splitting the rock via, for example, industrial mechanical means or via any type of grinding where the temperature is sufficiently low so as not to denature irreversibly. the molecules extracted.
  • the grinding step can be carried out for example by following the techniques known to those skilled in the art to obtain a calcareous material with a mean particle size described above. It may be for example a grinding performed by a technique chosen from the group comprising ball milling, roller grinding, grinding. mortar / pellet, hammer milling, hammer milling, oscillating disc milling, vibro-milling, milling with two toothed rolls and / or milling with two smooth rolls.
  • the calcareous material has a particle size less than 200 microns. Indeed, this particle size can make it possible to optimize the extraction yield of the process of the invention.
  • the method may further comprise a step of recovering organic and / or organomineral molecules.
  • a filtration step This step separates the calcareous material from the solution in which the organic or organomineral molecules are extracted. It may be carried out, for example by means of a filter, for example having pores of a diameter chosen in relation to the selected particle size, for example between 0.2 and 500 ⁇ m, of a filtration which may be, for example under vacuum, or even ultrafiltration, or high performance chromatography, or any other technique chosen not to alter the extracts.
  • the recovery step of the organic and / or organomineral molecules may correspond to a concentration of the molecules by elimination of all or part of the liquid.
  • This step may comprise, for example a precipitation by a counter-solvent, a low-pressure evaporation, a sublimation after freezing (lyophilization) without this list being limiting.
  • the counter solvent may for example be a solvent as described above.
  • evaporation or sublimation at low pressure can be carried out for example at a pressure in the range of 0.1 to 5000 Pa (50 to 0.001 hPa), preferably between 0.1 and 4000. Pa, more preferably between 0.1 and 25 Pa, even more preferably between 0.1 and 20 Pa.
  • the subject of the present invention is also the organic and / or organomineral molecules obtainable by the process of the invention.
  • the present invention also relates to the use of organic and / or organomineral molecules that can be obtained by the process of the invention for the manufacture of a cosmetic composition.
  • the present invention also relates to a method of manufacturing a cosmetic composition comprising the implementation of the organic and / or organomineral molecules extraction method of the present invention and the mixture of organic and / or organomineral molecules. obtained in a cosmetically acceptable carrier.
  • the present invention also relates to a cosmetic composition comprising at least one organic and / or organomineral molecule obtained by the process of the invention and a cosmetically acceptable carrier.
  • cosmetic composition is meant any cosmetic composition that is to say a composition that can be brought into contact with the superficial parts of the human body, for example the epidermis, hair and capillary systems, external organs, teeth and mucous membranes. It may be for example a liquid composition, an emulsion, an ointment, a mousse, a paste or a gel.
  • a cosmetically acceptable support is understood to mean any compound known to those skilled in the art for manufacturing a cosmetic composition.
  • the cosmetic composition according to the invention may further comprise one or more cosmetic adjuvants chosen from ester-type conditioning agents, anti-foam agents, moisturizing agents, emollient agents, plasticizers, mineral thickeners, organic thickeners, polymeric or non-associative or non-associative, water-soluble and fat-soluble sunscreens, silicone or non-silicone filters, permanent or temporary dyes, perfumes, preservatives, ceramides, and pseudo-ceramides, vitamins and provitamines , proteins, agents sequestering agents, solubilizing agents, alkanizing agents, anti-corrosion agents, reducing or antioxidizing agents, oxidizing agents, mineral fillers.
  • the cosmetic composition may be, for example, an anti-aging composition, for example a cosmetic composition stimulating the densification of the papillary dermis and stimulating the synthesis of the proteins of the dermal-epidermal junction.
  • the present invention also relates to a process for the manufacture of a pharmaceutical composition comprising the implementation of the method for extracting organic and / or organomineral molecules of the present invention and the mixing of organic and / or organomineral molecules. obtained in a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable may be for example a medicament for increasing the regeneration of bone, cartilage or skin tissue and / or a medicament for the treatment of osteoarthritis, polyarthritis, osteoporosis, degenerative aging.
  • the present invention also relates to the use of organic and / or organomineral molecules that can be obtained by the process of the invention for the manufacture of a pharmaceutical composition and / or a drug.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one organic and / or organomineral molecule obtained by the method of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutical composition is meant a liquid composition, an emulsion, an ointment, a mousse, a paste, a scored tablet, a capsule, an effervescent tablet, a dermal patch or an injectable device, without the form is limiting.
  • pharmaceutically acceptable carrier is meant an inert diluent agent, such as sorbitol, sugar, mannitol, microcrystalline cellulose, starch, sodium, sodium phosphate, calcium carbonate, calcium phosphate, calcium sulfate, lactose, for example lactose monohydrate.
  • the drug can be used, for example, in the treatment or prevention of diseases related to a decrease in density and bone mass.
  • the drug can be used, for example, in the treatment or prevention of diseases selected from the group comprising osteopenia including genetic, osteoporosis, degenerative aging, rheumatological infections of which osteoarthritis, polyarthritis, and all diseases that affect the skeleton.
  • the drug may also be used, for example, in the treatment of cutaneous diseases, for example diseases due to genetic, psychosomatic, pathological, due to intrinsic and extrinsic aging or to environmental stress or aggression. It may be for example a disease related to solar radiation Ultraviolet (UV), Infra-Red (IR), excessive humid atmosphere, air conditioning and / or dust.
  • UV Ultraviolet
  • IR Infra-Red
  • the present invention also relates to the use of organic and / or organomineral molecules that can be obtained by the process of the invention for the manufacture of a medicament for increasing the regeneration of bone and cartilaginous tissues. or cutaneous.
  • the increase of regeneration of bone, cartilage or skin tissue can be performed in vivo and / or in vitro or for the culture of tissues, cells or cell assemblies.
  • the drug can be administered for example, topically, peroesophageal, subcutaneous or intravenous or any other appropriate mode of administration.
  • the drug may be formulated in any manner known to those skilled in the art depending on the administration.
  • the present invention also relates to the use of organic and / or organomineral molecules that can be obtained by the method of the invention, for the treatment of diseases selected from the group comprising osteopenia, osteoporosis , degenerative aging, rheumatological infections including osteoarthritis, polyarthritis, orthopedic diseases and dermatological diseases.
  • the present invention also relates to the use of organic and / or organomineral molecules that can be obtained by the method of the invention for application with an implant or on an implant for, for example, increasing regeneration.
  • tissue for example bone, cartilage or cutaneous, in all types of bone and other tissues. For example at the level of the spine, limbs (compact bone, cancellous bone), flat bones of the face and cranium, chest skeleton or others.
  • the present invention also relates to the use of organic and / or organomineral molecules that can be obtained by the process of the invention for the manufacture of bone grafts by stimulation of osteoblasts or fibroblasts (osteoinduction).
  • organic and / or organomineral molecules that can be obtained by the process of the invention for the manufacture of bone grafts by stimulation of osteoblasts or fibroblasts (osteoinduction).
  • Figure 1 shows cell culture wells.
  • the cells are cultured in the presence or in the absence of calcareous stone extract (T) obtained by a process of the prior art (IM, NAC, AGH) or one of the embodiments of the process of the invention (AGA, AGB).
  • T calcareous stone extract
  • FIG. 2A represents a section of untreated control explant maintained in a survival condition.
  • FIG. 3A represents a histological section of an explant of human skin maintained in survival for 9 days, untreated and constitutes a cutting control of FIG. 3B.
  • FIG. 3B represents a histological section of the same explant of human skin maintained in survival under the same conditions as FIG. 3A, treated for 9 days with Orgon organo-mineral extract obtained by the process described in FIG. Example 1, showing stimulation of neutral and acidic GAGs (hyaluronic acid).
  • FIG. 4A represents a control histological section of a skin explant maintained in survival for 9 days, untreated, to constitute a histological sectional control of FIG. 4B.
  • FIG. 4B represents a histological section of the same explant of human skin maintained in survival under the same conditions as for FIG. 4A treated for 9 days with Orgon organo-mineral extract and shows the stimulation of
  • the embodiment temperature of this example was 23 ° C.
  • the mixing was carried out with a Heidolph brand rotator eluent at a rotation speed of 10 revolutions per minute.
  • the extracted molecules were analyzed by plasma emission spectrometry (ICP-OES, Ultima Jobin Yvon), by analytical high performance liquid chromatography (HPLC) (Thermo, BioBasic SEC-300 column and UV 2000 detector), PyroGC / MS (THERMOfinnigan) and by SDS-PAGE electrophoresis (Mini ProteanTetra CeII, Biorad). Table 1 below summarizes the characteristics of the extracts obtained.
  • the extraction yield obtained with an example of implementation of the process of the invention was constant at approximately an average of 1.3% of extract.
  • the amounts of extract with this process were of the order of one milligram.
  • the mass extraction efficiency with the method of the prior art is of the order of 0.0056%.
  • the method of the invention allows a yield of 1.3%, ie at least several hundred times higher (about 232) to the method of the prior art.
  • the compounds of this example are identical to those of Example 1. In this example, the proportion of acid was increased relative to Example 1 and different extraction times were tested.
  • the pH of the solution was lower than that of the solution of Example 1.
  • Table 3 summarizes the conditions and the amount of organic and / or organomineral molecules obtained.
  • the quantities extracted are 600 to 800 times greater than the quantities extracted with the method of the state of the art presented in Example 2.
  • the rock / solvent ratio in the process does not change the yield to a constant amount of acid.
  • Example 5 Exemplary embodiment of the extraction method as a function of pH
  • the compounds and the production conditions are identical to those of the preceding examples.
  • 50g of Orgon rock was mixed with a solution comprising 250ml of absolute ethanol, the aqueous fraction was minimized by putting only the mineral acid, first 1ml then 2ml with a pH of about 0.
  • Different times have been tested.
  • the yield increases with the amount of acid only:
  • the extraction exists regardless of the particle size. More particularly, the yield increases when the particle size decreases and remains constant when the particle size is less than 200 .mu.m.
  • the rock extracts were obtained from the limestone of the Orgon deposit, following the three extraction conditions described in Table 8. The extraction was carried out for 15 hours. following the protocol described above. The solvent was then evaporated and the pellet lyophilized.
  • Table 8 conditions for obtaining the extracts and yield of the processes used.
  • the extract obtained according to the process of the invention corresponds to the AGA condition.
  • the condition AGB is obtained according to the method but without being optimized.
  • the condition AGH corresponds to the extract obtained according to the protocol of the aforementioned European patent.
  • mice MC3T3-E1 cells After lyophilizing the 3 extracts, their activity was tested using in vitro cell cultures of mouse MC3T3-E1 cells (ATCC, USA). It is an osteoblastic line of pre-differentiated cells, committed to the osteoblastic pathway, capable of mineralizing after reaching a maturation stage.
  • the MC3T3 cells were cultured for 25 days at 37 ° C.
  • ⁇ -MEM medium minimum essential alpha medium
  • ⁇ -MEM medium alpha-modification, Sigma M4526
  • penicillin 50 ⁇ g / ml streptomycin
  • 10% fetal calf serum HyClone-Perbio
  • 2 mM L-glutamine GibcoBRL
  • the AGA, AGB and AGH extracts were added to this culture medium, namely 200 ⁇ g of dry extract per ml of nutrient medium.
  • FIG. 1 showed a very clear stimulation of the development of the cells when the nutritive medium comprises extracts of calcareous rocks according to AGA and AGB conditions.
  • the extracts obtained with AGA and AGB conditions of rocks stimulate mineralization from 21 days as for fresh mother-of-pearl extracts (NAC).
  • the reference nutrient medium reached the same stage after 26 to 29 days.
  • the AGH extract of rock obtained with the protocol of the state of the art did not stimulate the mineralization.
  • the nacre extract (NAC) obtained according to the method of the prior art allows stimulation of the mineralization as expected and confirms the reactivity of the cells.
  • preosteoblastic cells when exposed to the extracts obtained by the process of the invention, they trigger the mechanism of bone mineralization from the 3rd week, while specific inducers do not produce the same effect at the end of the 4th week of culture.
  • the extracts of the calcareous material obtained according to the method of the invention therefore allow the stimulation of the mineralization in contrast to the extract of calcareous material obtained by the method of the patent EP 0869805 of the prior art.
  • the extracts of the rock according to the method of the invention therefore have an activity on the biological tissues.
  • the TO control group corresponded to the 3 explants that were taken at OJ (day zero).
  • the T group, untreated corresponded to the group of 6 explants that were maintained in survival conditions using the BEM culture medium.
  • CMC gel carboxymethylcellulose
  • the product group P1 corresponded to the group of 6 explants maintained in survival condition and on which were applied the CMC gel containing the mixture of rock extract according to the invention concentrated to 2%.
  • the treatment was performed by topical application of 2 mg of product to be tested by explant. This treatment was performed every day.
  • the culture media were renewed for half on D2, D5 and D7, ie 2 days after, 5 days after and 7 days after the start of the experiment.
  • Parakeratosis is mild.
  • the epidermis has 6 to 7 cell layers with a good morphology.
  • the control sections (FIG. 2A) as the starting group only have 4 to 5.
  • the relief of the dermal-epidermal junction is very clear.
  • the papillary dermis has fairly thick collagen fibers forming a dense network. It is well cellularized. After 9 days of treatment, it was noted a sharp increase in the thickness of the stratum corneum (sign of significant cell turnover and a good enough terminal differentiation) with an increase in epidermal thickness (Figure 2 B).
  • the collagen network in the papillary dermis was also denser.
  • Example 9 Example of calcareous rock characteristics
  • the calcareous rocks that can be used in the process of the invention can be chosen, for example on the basis of their content of total organic carbon (TOC), even if the technique is only indicative and generally not very sensitive and that only the extraction according to the patent counts.
  • a pyrolytic method known as Rock Eval pyrolysis was used in this example, diverted from its usual use as mineral oils or contaminations.
  • the table below shows that it is possible to detect a peak related to cracking in a neutral atmosphere of organic constituents, thanks to the FID (Flame Ionisation) detector (Ref 8) (mg of hydrocarbons formed by cracking as a function of the temperature and by the temperature of its maximum). This very low peak, on limestone rocks selected in a number of producers, does not appear on precipitated calcium carbonate (PCC) sold by VWR International.
  • FID Flume Ionisation
  • a cosmetic dermal redensification cream is prepared from the extracts obtained in Example 1. It is a stable oil-in-water emulsion in which the oily phase is dispersed in an aqueous phase with an emulsifier.
  • fatty acid ester base glucose palmitate and sucrose palmito-sterate (5%).
  • the oily phase is carried out with sunflower oil (13%) and jojoba oil (5%).
  • the aqueous phase contains bacteriostatic substances. A concentration of 2% active was used and added to the aqueous phase.
  • the preparation obtained is tested by topical application to skin explants under the conditions described in Example 8.
  • the explant sections at 9 days show with the excipient only an epidermal structure in good survival state comparable to the morphology of explants control at the beginning of the experiment (JO).
  • the application of the cosmetic cream induces a clear increase in epidermal thickness (7/8 cell layers) and in the papillary dermis, a denser collagen network.
  • the structure of the dermal-epidermal junction is significantly reshaped with a pronounced anchorage in the dermis.
  • a "pharmaceutical composition for renewal and restructuring of the cutaneous hydro lipidic barrier has been prepared for topical application to the skin, intended to achieve a natural peel without any physical abrasion and thus without weakening the protection. epidermal.
  • the excipient used is a conventional base described in the table below.
  • the pharmaceutical composition obtained is tested by topical application to skin explants under the conditions described in Example 8. After 9 days a check was made to verify that the explants treated with the excipient alone retain a structure. epidermis in good survival comparable to the morphology of explants control at the beginning of the experiment (JO).
  • the explant sections treated with the pharmaceutical composition show, after 9 days, an important cell renewal and good terminal differentiation, with a moderate increase in epidermal thickness (6/7 cell bases). In 9 days a peel is observed followed by a renewal of the cutaneous hydrolipidic barrier.
  • the protocol described in document FR 2 919 186 was applied to a sample of Orgon rock and a sample of Falun from Touraine as described in document FR 2 919 186.
  • the devices and products used in this example are identical to those used in document FR 2 919 186.
  • the two materials were ground so as to obtain an average particle size of less than 1 ⁇ m.
  • Each of the powders was introduced into deionized water containing a mixture of preservatives: potassium sorbate at 0.3% by weight, sodium benzoate at 0.4% by weight, sodium dehydroacetate at 0.1% by weight and benzyl alcohol at 0.6% by weight, in a stirred vessel and maintained at room temperature, ie at 22 ° C in a proportion of 20% by weight, as indicated in the document.
  • Stirring was maintained for 48 hours at a temperature of 22 ° C as described in FR 2 919 186.
  • the mixture was then filtered to separate the residual mineral suspension from the liquid.
  • a tummy tuck of a woman aged 53 was used. Several lots of explants were obtained. In this example, all the extracts were applied, according to the protocol described in Example 8 above: topical application, daily, of 2 mg of CMC gel containing the rock extract according to the invention, concentrated to 1%.
  • Example 2 The Orgon rock extract as obtained in Example 1, was used to test a lot of explants referenced CA2.
  • a Saint Germain rock extract as obtained according to the same process was used to test a lot of explants referenced CB6.
  • histological sections were made by fixing the explants for 24 hours in buffered formalin, dehydration and paraffin impregnation using a dehydration automaton (Leica). 1020) and set-up (coating station (Leica EG 1160)).
  • the 5 ⁇ m sections were then made with a microtome (Minot, Leica RM2125) and glued on histological silanized glass slides superfrost (registered trademark). Staining and immunochemical markings were performed on sections under the following conditions. :
  • glycosaminoglycans are performed by staining with alcian blue-P.A.S. on the previously described sections (also known to those skilled in the art by Mowry staining).
  • Collagen I was marked on frozen sections with anti-collagen I polyclonal antibody, custom rabbit (Monosan, ref: PS 047), at 1/500 for 1 hour at room temperature with an amplifier system biotin / streptavidin, revealed in FITC. The nuclei were stained with propidium iodide. Collagen III was labeled on frozen sections with a polyclonal anti-collagen III antibody, made on goat (SBA ref: 1330-01), at 1/320 th for 2 h at room temperature with a biotin / streptavidin amplifier system. revealed in ATM. The nuclei were stained against Masson's hemlock.
  • Laminin-5 was labeled on frozen sections with an anti-laminin-5 monoclonal antibody, clone P3E4 (SBA ref: 1340-01), made on a goat, at 1/320 th for 1h30 at room temperature with an amplifying system biotin / streptavidin, revealed in FITC. The nuclei were stained with propidium iodide.
  • GAGsA acid GAGs
  • FIG. B The results are evaluated by comparison with controls made on lots of explants treated with the excipient only.
  • CA2 batch treated for 10 days with Orgon organo-mineral active obtained in Example 1 unexpectedly showed a net overexpression of acid GAGs (GAGsA) of the papillary dermis as shown in FIG. B.
  • GAGs are known to be essentially hyaluronic acids, hydration factor highly sought after in dermopharmaceutical and cosmetic.
  • GAGsN neutral GAGs
  • CoII I collagen type I
  • CoII III conjugated collagen
  • the batch CB6 treated for 10 days with the organo-mineral extract obtained from the calcareous material of the quarry of Saint Germain has compared to the control group, net overexpression of collagen IV (CoII IV) (collagen of supporting tissues), laminin 5 (Lam 5) and collagen type III or juvenile collagen (see Table 11).
  • collagen IV Collagen of supporting tissues
  • laminin 5 laminin 5
  • collagen type III or juvenile collagen see Table 11
  • the extracts obtained by the method of the present invention therefore have an effect, for example at the level of the proteins involved in the dermis and the dermo-epidermal junction by stimulating their activities.
  • extracts obtained by the process of the invention can be used, for example, in the cosmetic field, for example for an anti-aging effect by restructuring the relief of the dermal-epidermal junction. and stimulation of its activity.
  • EXAMPLE 12 Dermatological Activities of the Extracts Obtained by the Process with Different Calcareous Materials
  • Staining and labeling are obtained as described in Example 11 above on GAGs, collagens of types I, III and IV, on laminin-5.
  • Other activities are evaluated as follows.
  • the cells in mitosis were labeled with a monoclonal antibody, anti-Ki67 (clone 7B11 from Zymed, IgGI on mouse) with a biotin / streptavidin enhancer system (Vectastain RTU Universal Vector) and a revelation in VIP.
  • the G6PDH was labeled on paraffin sections fixed to Bouin with anti-bodies anti-G6PDH polyclonal (Rockland ref: 200-1153), fits on mice at 1/150 for 24 hours at room temperature (20 0 C ) with a biotin / streptavidin enhancer system revealed in fluorescein isothiocyanate (FITC). The nuclei were stained against Masson's hemlock.
  • Loricrin was marked on frozen sections with anti-bodies anti-loricrin polyclonal (Covance ref-PRB 145) fits on rabbit 1/4000 th for 1 night at 4 ° C with an amplifier system biotin / streptavidin and revealed in FITC.
  • the nuclei were stained with propidium iodide.
  • LEKTI are inhibitors of serine proteases (lympho epithelial kazal type inhibitor). They were labeled with an anti-body monoclonal anti-mouse LEKTI (Santa Cruz, sc-32330 ref), at 1/800 th for 1 night at 4 ° C with an amplifier system Vectastain Universal RTU VECTOR avidin / biotin and revealed in FITC.
  • the nuclei were stained with propidium iodide.
  • the batch DB6 was treated for 10 days with the organo-mineral active extract of the Euville stone obtained according to Example 1. It was observed with interest, a stimulation of cell proliferation in the epidermis by overexpression of Ki67 labeling of cells in mitosis and stimulation of LEKTI in the granular layer (see Table 12).
  • the batch DB2 was treated for 10 days with the extract obtained from the mother of pearl Pinctada margaritifera according to Example 1. It was observed an overexpression of collagen type I (see Table 12).
  • Table 12 Results Obtained with the Extracts Obtained by the Process of the Invention Compared with Controls
  • Example 13 Activity on the skin of extracts optimized by fractionation Various fractionated extracts were tested on human skin explants ex-vivo, under the same conditions as Example 11 and 12 above.
  • the Orgon rock extract was obtained by using the method in the following proportions: 50 g of ground Orgon limestone are brought into contact with a solution of 500 ml of MiIIi-Q water. 10 ml of dichloromethane and 2 ml of hydrochloric acid. The crude extract is used as is to treat for 9 days the explants of the batch referenced FA1. Treatment of the explants with the extract is carried out under the same conditions as that described in Examples 11 and 12 above.
  • the same extract was demineralized and used for 10 days to test a batch of explants referenced FB3.
  • Demineralization of the extract was performed by reconstituting a solution from the lyophilized powder with MiIIi-Q water, using dialysis bags (Spectrum, Spectra / Por with 0.5 kDa cut).
  • the extract dissolved in solution is dialyzed against a buffer of water MiIIi-Q ( ⁇ 1 ⁇ S / cm) renewed and maintained at room temperature with stirring until the conductivity is less than 1 ⁇ S / cm (2 micro siemens per centimeter correspond to about 1 milligram of dissolved salt per liter).
  • the batch FA1 treated for 10 days with the Orgon organo-mineral extract obtained in this example showed compared to the control group, moderate overexpression of neutral GAGs and type IV collagen. This is interpreted as a stimulation of the activity of the dermo-epidermal junction insofar as the neutral GAGs are known for constitute the reservoir of growth factors at the level of the dermal-epidermal junction (see Table 13 below). These effects are sought after in cosmetics.
  • the batch FB3 was treated with the organic fraction of the concentrated active ingredient during dialysis by elimination of soluble trace elements.
  • batch FB3 it was shown overexpression of neutral GAGs, laminin 5 and collagens type IV, III and more clearly type I collagen.
  • the concentrated organic fraction, tested on lot FB3 explains well the stimulation of the dermo-epidermal junction discovered with the crude extract obtained in this example by the method of the invention. It has also been found that overexpression of collagen I 1 is an important component of the extracellular matrix of the papillary dermis (see Table 13 below).
  • the batch FB5 was treated with the extract obtained in this example but from a calcareous material, PCC (precipitated calcium carbonate) supplied by the company VWR International SA. Surprisingly, after 10 days of treatment, the neutral GAGs, collagen IV and laminin 5 were all stimulated, all constituting the dermal-epidermal junction (see Table 13 below).
  • PCC precipitated calcium carbonate

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé d'extraction de molécules organiques et/ou organominérales à partir d'un matériau calcaire comprenant la mise en contact dudit matériau calcaire avec une solution comprenant au moins un solvant organique, de l'eau et au moins un acide, ainsi que les molécules organiques et/ou organominérales obtenues par le procédé. Les produits obtenus par le procédé trouvent une application, par exemple dans les domaines thérapeutiques et non thérapeutiques, notamment agro-alimentaire, cosmétiques et médicales.

Description

OBTENTION ET UTILISATION DE PRINCIPES ACTIFS DES CALCAIRES
DESCRIPTION
Domaine technique
[001] La présente invention se rapporte à un procédé d'extraction de molécules organiques et/ou organominérales à partir d'un matériau calcaire, ainsi qu'aux extraits obtenus par ce procédé. [002] Les produits extraits sont des molécules organiques et/ou organominérales.
[003] Le procédé et les produits obtenus par ce procédé trouvent notamment des applications dans les domaines thérapeutiques et non thérapeutiques : notamment médicales, cosmétiques et agro-alimentaires, notamment, la nutraceutique, les compléments alimentaires et/ou les alicaments.
[004] Dans la description ci-dessous, les références entre parenthèses (ReT) renvoient à la liste des références présentées à la fin du texte.
Etat de la technique
[005] Des procédés d'extractions de molécules organiques à partir de différentes sources sont connus dans l'état de la technique. Il s'agit par exemple des procédés d'extraction de molécules organiques à partir d'extraits de végétaux, par exemple des extraits de Arachis hypogaea (Fabacée) et de Phaseolus vulgaris (Fabacée). Les molécules extraites avec ces procédés peuvent être utilisées dans différents domaines, par exemple en, pharmaceutique, cosmétique, dans le domaine agroalimentaire etc.. Des exemples de molécules organiques extraites dans l'état de la technique sont, par exemple les stérols, les terpènes, des esters de terpènes etc.. Ces molécules sont, par exemple, utilisées comme additifs alimentaires ou dans des produits cosmétiques pour notamment combler des carences et/ou pour traiter des pathologies de la peau ou autre.
[006] La diminution de la masse et de la densité osseuse est un problème important en santé publique, plus particulièrement chez les femmes après la ménopause, elle intervient aussi chez les hommes seniors et plus rarement chez les enfants.
[007] En effet, après la ménopause, la diminution du taux d'oestrogènes entraîne une perte de masse et de densité osseuse. [008] La diminution de la densité osseuse peut être également due à des traitements pharmacologiques, par exemple des traitements antiinflammatoires à base de corticoïdes qui peuvent entraîner une ostéopénie pouvant aller jusqu'à l'ostéoporose.
[009] La pathologie associée à une perte de masse et de densité osseuse est l'ostéoporose qui entraîne une fragilité excessive du squelette. [0010] L'ostéoporose peut être également due à l'acquisition d'un capital osseux insuffisant à la fin de la croissance, ou à une perte osseuse lors de la vie adulte due par exemple à des facteurs génétiques, nutritionnels et environnementaux. Un des moyens connus dans l'état de la technique, pour prévenir ou traiter la diminution de la masse et de la densité osseuse est en général l'administration de régimes enrichis en calcium. Différentes formes de calcium sont utilisées, il peut s'agir par exemple de CaCO3 (voir J. L Greger et al. « Minerai utilisation by rats fed various commercially available calcium suppléments or milk. » J Nutr; 117 :717-24 1987 (Ref 1) ; T. Chevalley et al. « Effect of calcium suppléments on fémoral bone minerai density and vertebrate fracture in Vitamin D repleted elderly patients », Osteoporosis Int 4 :245-52, 1984 (Ref 2)). Certains travaux ont étudié l'effet de l'assimilation de poudres à base de corail (Blumberg S. « Is coral calcium a safe and effective supplément ? » J Am Diet Assoc Sept ; 104(9) : 1335-6 (Ref 3)), de nacre, de coquilles fossiles ( T.Okano et al. « Bioavailability of calcium from oyster shell electrolysate and DL-Calcium lactate in vitamin D-replete or vitamin D-deficient rats. Journal of Bone and Minerai Metabolism 11 (2) : 23-32 1993 (Ref 4) ; T. Miura « Calcium bioavailability of a total bone extract (TBE) and diets effects on bone metabolism in rats » Biosci. Biotechnol. Biochem 62 : 1307-12, 1998 (Ref 5) ou encore de coquille d'œuf (Y Takada « bioavailabillity of various dietary calcium compound. 2 Examination in vivo of various dietary compound, Snow brand milk products Co, Ltd Sapporo: 75-84 (Ref 6); A Schaafsmal et al. « Eggshell powder, a comparable or better source of calcium than purified calcium carbonate: piglet studies JSci Food Agric 79: 1596-600, 1999 (Ref 7)). Ces différentes formes de calcium « naturel » ont semblé montrer une assimilation « améliorée ».
[0011] Cependant, ces solutions ne sont pas suffisantes dans la mesure où elles ne permettent pas de traiter complètement certaines pathologies osseuses, notamment l'ostéoporose. De plus, les procédés permettant l'extraction de ces molécules ou leur fabrication présentent de faibles rendements nécessitant donc l'utilisation d'une grande quantité de matières premières et donc des coûts d'exploitation importants. [0012] Un autre moyen connu dans l'état de la technique pour traiter les ostéopénies (ostéoporose) est l'administration d'anti-ostéoporotiques. Il s'agit par exemple de composés qui stimulent la formation osseuse et la fixation du calcium : la vitamine D, l'hormone parathyroïdienne (à très faible dose), les estrogènes et le strontium ; de composés qui freinent la résorption osseuse : les biphosphonates et la calcitonine. Un apport de calcium facilement biodisponible est toujours nécessaire lors de ces traitements. Il a été montré chez des rats que l'hormone parathyroïdienne à haute dose est cancérigène. Par ailleurs, la vitamine D a des effets sur l'immunité qui peuvent être délétères pour homme.
[0013] Ces produits ont en général des effets secondaires non négligeables et ne peuvent en conséquence êtres utilisés que sur de courtes périodes avec une complémentation en calcium. Ces produits ne permettent donc pas de s'affranchir de prises de calcium concomitantes. Une prise de calcium excessive peut être source de problèmes en raison de fixations ectopiques : calcul rénaux, calcification aortique, etc.. L'ostéoporose peut toucher également les animaux, par exemple les chiots entre 2 et 6 mois, les vieux chiens qui ne fixent pas le calcium, les chiens nourris exclusivement à base de viande, les chevaux, par exemple les chevaux restant longtemps à l'étable. [0014] Cependant, aucune des molécules connues ou utilisées dans l'état de la technique ne permettent de traiter de manière efficace la diminution de la densité osseuse chez les animaux. De plus, les problèmes et effets secondaires connus pour les hommes surviennent également chez les animaux. [0015] Les procédés connus dans l'état de la technique permettant d'extraire les molécules utilisées pour, par exemple, le traitement de l'ostéoporose, nécessitent des quantités importantes de matières premières, par exemple de plantes, et ont des rendements d'extraction faibles et donc des coûts de mise en œuvres très importants. [0016] Une étude réalisée par l'industrie pharmaceutique a montré que près de deux tiers des principes actifs utilisés dans les médicaments proviennent des plantes ou sont copiés de la nature par voie chimique. D'autres molécules sont donc activement recherchées et avec elles des procédés permettant leurs extractions. [0017] Par ailleurs, le calcium joue un rôle important dans les différentes fonctions de la jonction dermo-épidermique (JDE). Il assure un rôle structural associé aux macromolécules qui lient la couche basale au collagène du derme. C'est un élément important de la cohésion entre le derme et l'épiderme. La JDE a un rôle régulateur, un rôle de filtre dans les échanges entre le derme et l'épiderme ; l'épiderme n'est pas vascularisé, le calcium est un élément clé dans les mécanismes de communication et de régulation.
[0018] Par ailleurs, le calcium a également un rôle dans l'ensemble du métabolisme cutané. Il s'agit notamment de la différentiation terminale épidermique (DTE) où le calcium est impliqué dans la différenciation des kératinocytes. Le gradient de calcium augmente de la couche germinative où se forment les kératinocytes vers les couches extérieures de l'épiderme. Le calcium se lie à des phospholipides, nécessaires au processus de kératinisation.
[0019] Les produits connus dans l'état de la technique permettant de stimuler la kératinisation ont de nombreux effets secondaires, par exemple une hypersensibilisation de la peau aux ultraviolets.
[0020] De plus, le rôle probablement le plus important du calcium en physiologie humaine est celui du maintien de l'homéostasie calcique (calcémie) et de messager cellulaire. [0021] Dans le domaine de l'alimentation du bétail, le calcium est aussi un élément important. Il s'agit par exemple de l'alimentation des volatiles de ponte.
[0022] II existe donc un réel besoin de trouver de nouvelles molécules palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, lesdites molécules pouvant être utilisées, par exemple, pour un traitement et/ou la prévention de la diminution de la masse et de la densité osseuse, pour la stimulation de l'activité et/ou la restructuration cutanée, la complémentation de l'alimentation avec en conséquence le maintien de l'homéostasie calcique. [0023] II existe également un réel besoin de trouver un procédé permettant l'extraction de ces molécules de la nature afin, par exemple de diminuer le coût d'extraction et de trouver de nouveaux principes actifs utilisables dans le domaine biomédical (médecine, pharmacie, parapharmacie, nutrition et autres) et/ou en cosmétique et/ou dans le domaine agroalimentaire. [0024] II y a un réel besoin de complémenter efficacement l'alimentation des animaux en découvrant de nouveaux actifs capables de favoriser l'assimilation du calcium et sa fixation, et de diminuer les coûts de production de ces molécules.
Description de l'invention [0025] La présente invention a précisément pour but de répondre à ces besoins et inconvénients de l'art antérieur en fournissant un procédé d'extraction de molécules organiques et/ou organominérales. [0026] Le procédé de l'invention est un procédé d'extraction de molécules organiques et/ou organominérales à partir d'un matériau calcaire, comprenant l'étape suivante : la mise en contact du matériau calcaire avec une solution, ladite solution comprenant : au moins un solvant organique, de l'eau et au moins un acide. [0027] Les inventeurs sont les premiers à avoir découvert que les matériaux calcaires contenant de nombreuses molécules organiques et/ou organominérales accumulées lors de la formation desdits matériaux présentaient des propriétés pharmaceutiques et/ou cosmétiques. Ils ont donc mis au point un procédé d'extraction de ces molécules afin de les extraire et de les utiliser. En outre, les inventeurs ont montré que les molécules extraites étaient capables de stimuler les mécanismes de formation et de minéralisation osseuse et/ou de stimuler l'activité des cellules épidermique et/ou dermiques.
[0028] Dans la présente invention par matériau calcaire, on entend tout matériau comprenant du calcaire. Il peut s'agir par exemple d'une roche calcaire.
[0029] De préférence, il peut s'agir de toutes les formes naturelles de roche calcaire comprenant au moins 50% de carbonate de calcium quel que soit la forme et le nom d'usage. Ces roches peuvent être, par exemple, de formes massives, friables, poudreuses ou autres. [0030] Selon l'invention, le matériau calcaire peut-être, par exemple une roche calcaire de France choisie dans le groupe comprenant une roche d'Orgon, France, de Pierre d'Euville, France, de Saint Germain, France, et de Pagny sur Meuse, France. [0031] De manière préférée, le matériau calcaire peut-être, par exemple une roche calcaire choisie dans le groupe comprenant la roche d'Orgon, F-13660, la Pierre d'Euville, F-5520, de Saint Germain, F-55140 ou de Pagny sur Meuse, F-55190 ou encore d'Héming, F-57830. La mention « F » indique l'origine France et le chiffre le code postal. [0032] Dans la présente, le matériau calcaire peut provenir, par exemple des carrières : de Fontvieille, F-13 990 ; de Salon de Provence, F- 13300 ; d'Orgon, F-13660 ; de Cassis, F-13260 ; de Maine de Boixe, F- 16230 ; de Biarge à Saint Fraigne, F-16140 ; de Gratte-Chat à Saint Sornin, F-17600 ; de Subdray, F-18570 ; de Sainte-Croix-De-Mareuil, F- 24340 ; du Pont-du-Gard à Remoulin F-30210 ; de Verfeuil, F-30630 ; des Conques à Brouzet-les-Ales, F-30055 ; de Val d'Epis, F-39160 ; Raymond Rabier, La Tieule F-48500 ; de Senonville, Valbois F-55300 ; de Pagny- sur-Meuse, F-55190 ; d'Euville, F-55200 ; de Saint Germain-sur-Meuse, F- 55140 ; d'Héming, F-57830 ; de Saint Maximin F-60740 ; d'Arancou, F- 64270 ; de Rébenacq, F-64260 ; de Roquemaure à Orange F-84100 ; des Chaux de la Tour à Coustellet F-84220 ; de Menerbes, F-84560 ; des Estaillades à Oppede, F-84580 ; de Saint Maurice La Clouère, F-86160 ; de Feriana, Tunisie.
[0033] Selon l'invention, la roche calcaire préférée a une teneur en carbone organique total (COT) mesurable, mais elle peut tout aussi bien être très faible, voire indétectable. Par exemple la teneur en COT peut être comprise entre 0,01 et 1 ,5% par exemple entre 0,02 et 0,8% ou par exemple entre 0,03 et 0,3%.
[0034] La mesure de la teneur en carbone organique total (COT) peut être effectuée par toute méthode connue de l'homme du métier . Il peut s'agir, par exemple l'analyse Leco (Marque enregistrée) du carbone organique des roches décarbonatées (par exemple Leco (Marque enregistrée) SC-444) ou encore une analyse élémentaire des matières organiques concentrées à l'aide d'un Kerogenatron (Vinci Technologies, France) ou encore une méthode pyrolytique connue sous le nom de pyrolyse Rock Eval qui a été utilisée ici, détournée de son utilisation habituelle que sont les huiles minérales ou les contaminations (Rock-Eval 6 turbo de Vinci Technologies, France ; voir E. Lafargue, F. Marquis, D. Pillot, « Rock-Eval 6 Applications in hydrocarbon exploration, production and soil contamination studies », OiI & Gas Science and Technology, 1998, 53(4), 421-37 (Réf. 8). Par exemple, pour des concentrations très faibles de matrice organique endogène, le critère retenu consiste à enregistrer l'apparition dans les calcaires d'un pic de craquage type-S2 qui n'existe pas dans un carbonate de précipitation purement chimique (e.g. tel que fourni par VWR International SA). L'analyse du COT comme l'utilisation de la pyrolyse Rock-Eval sont des méthodes indirectes qui ne déterminent en rien la nature chimique des molécules, ou leur activité. [0035] Selon l'invention, le matériau calcaire peut par exemple avoir une granulométrie moyenne comprise entre 0,5 et 1000 μm, de manière préférée entre 0,5 et 500 μm, de manière encore plus préférée inférieure à 200 μm.
[0036] Selon l'invention, par « molécules organiques et/ou organominérales » on entend, par exemple, des protéines, des peptides, des lipides ou des saccharides ou mélanges et/ou par exemple des molécules riches en hétéroéléments par exemple une protéine de liaison au calcium ( « calcium binding protein ») des sels, des ions, des minéraux, des particules colloïdales et/ou des combinaisons de ces composés. Les molécules organiques et/ou organominérales peuvent être, sous la forme complexe du mélange naturel ou séparées et purifiées. Il peut s'agir par exemple, des molécules anciennes dont l'âge correspond à l'âge du matériau calcaire ou par exemple des molécules liées à la diagenèse ou formées au cours du temps, ou dans les calcaires récents. [0037] Selon l'invention, on parle également d' « extrait » ou d' « extraits de roche » ou encore d' « extrait de roche calcaire » pour désigner de façon équivalente les molécules organiques et/ou organominérales telles que définies précédemment, par exemple, il peut s'agir de protéines, peptides, lipides, saccharides et/ ou mélange et/ou par exemple des sels, ions, minéraux, particules colloïdales et/ou des combinaisons de ces composés.
[0038] Selon l'invention, par « solvant organique » il est entendu, par exemple, un solvant ou un mélange de solvants choisi dans le groupe comprenant les alcools en C1 à C6, les éthers et les hydrocarbures. Par exemple, il peut s'agir d'un solvant choisi dans le groupe comprenant l'éthanol, l'éther diéthylique, le dichlorométhane, diméthylformamide (DMF)1 le diméthylsufoxyde (DMSO), l'acétonitrile, ou un mélange de ces solvants. Il peut également s'agir, par exemple, sans préjuger de leur nature, de tous fluides à l'état supercritique ou subcritique, ayant des caractéristiques équivalentes aux « solvants organiques », par exemple du CO2 supercritique ou encore de l'eau subcritique. [0039] Selon l'invention, par « mélange de solvants » il est entendu, par exemple, un mélange d'au moins deux solvants organiques, au moins trois solvants organiques, au moins quatre solvants organiques ou plus. Le mélange de solvants peut être, par exemple, un mélange d'alcools en C1 à C6, un mélange d'éthers, un mélange d'hydrocarbures et/ou un mélange de solvants choisis dans le groupe comprenant les alcools en C1 à C6, un mélange d'éthers et un mélange d'hydrocarbures organiques ou un mélange de ces solvants.
[0040] Selon l'invention, toute concentration de solvants appropriés peut être utilisée. La concentration volumique du solvant organique par rapport à la phase aqueuse est avantageusement comprise entre 1 et 99%.
[0041] Dans la présente invention, par « acide » on entend, par exemple, un acide minéral et/ou un acide organique. Par exemple, l'acide peut être choisi dans le groupe comprenant l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide éthylène-diamine- tétraacétique.
[0042] De préférence, dans la présente invention, le pH de la solution du procédé de l'invention peut être inférieur à 7, de manière préférée compris entre 0 et 7, de manière encore plus préférée entre 0 et 5, de manière plus préférée entre 1 et 4, de manière plus préférée entre 1 et 3. [0043] Dans la présente invention, la mise en contact du matériau calcaire avec la solution peut-être effectuée, par exemple, par trempage, aspersion, mouillage, immersion partielle ou totale du matériau calcaire avec ladite solution.
[0044] De préférence, la mise en contact du matériau calcaire avec la solution est effectuée par immersion totale du matériau. [0045] Selon l'invention, la mise en contact du matériau calcaire avec la solution comprenant : au moins un solvant organique, de l'eau et au moins un acide, peut-être effectuée, par exemple, à une température comprise entre 5 et 900C, de manière préférée entre 8 et 75°C, de manière encore plus préférée entre 8 et 300C. Cette température peut être également choisi dans toute la gamme nécessaire aux états subcritiques ou supercritiques, si nécessaire. La température est généralement choisie de façon à ne pas dénaturer de manière irréversible les molécules extraites. [0046] Selon l'invention, la mise en contact du matériau calcaire avec la solution comprenant : au moins un solvant organique, de l'eau et au moins un acide, peut-être effectuée, par exemple, pendant un temps compris entre environ 1 minutes et 72 heures, de préférence entre environ 1 minutes et 48 heures, de manière encore plus préférée entre 1 minutes et 12 heures. [0047] Selon l'invention, avantageusement le procédé peut comprendre en outre une étape de broyage avant la mise en contact du matériau calcaire avec la solution.
[0048] Dans la présente par « broyage », on entend fractionnement de la roche via, par exemple, des moyens mécaniques industriels ou via n'importe quel type de broyage où la température est suffisamment basse de façon à ne pas dénaturer de manière irréversible les molécules extraites.
[0049] L'étape de broyage peut être réalisée par exemple en suivant les techniques connues de l'homme de l'art pour obtenir un matériau calcaire avec une granulométrie moyenne décrite précédemment. Il peut s'agir par exemple d'un broyage réalisé par une technique choisie dans le groupe comprenant le broyage à boulet, le broyage à rouleau, le broyage mortier/pillon, le broyage à marteaux, le broyage à marteaux à percussion, le broyage à disques oscillants, le vibro-broyage, le broyage à deux cylindres dentés et/ou le broyage à deux cylindres lisses. [0050] De préférence, le matériau calcaire a une granulométrie inférieure à 200 μm. En effet, cette granulométrie peut permettre d'optimiser le rendement d'extraction du procédé de l'invention. [0051] Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre une étape de récupération des molécules organiques et/ou organominérales. Il peut s'agir par exemple, d'une étape de filtration. Cette étape permet de séparer le matériau calcaire de la solution dans laquelle les molécules organiques ou organominérales sont extraites. Elle peut être réalisée, par exemple au moyen d'un filtre, par exemple ayant des pores d'un diamètre choisi en rapport avec la granulométrie sélectionnée, compris par exemple entre 0.2 et 500 μm, d'une filtration qui peut être, par exemple sous vide, voire d'une ultrafiltration, ou de chromatographie haute performance, ou toute autre technique choisie pour ne pas altérer les extraits. [0052] De manière préférée, l'étape de récupération des molécules organiques et/ou organominérales peut correspondre à une concentration des molécules par élimination de tout ou partie du liquide. Cette étape peut comprendre, par exemple une précipitation par un contre solvant, une évaporation à faible pression, une sublimation après congélation (lyophilisation) sans que cette liste soit limitative.
[0053] Le contre solvant peut être par exemple un solvant tel que décrit précédemment. [0054] Dans la présente, l'évaporation ou la sublimation à faible pression peut être réalisée par exemple à une pression comprise dans la gamme de 0,1 à 5000 Pa (50 à 0.001 hPa), de préférence entre 0,1 et 4000 Pa, de manière plus préférée entre 0,1 et 25 Pa, de manière encore plus préférée entre 0,1 et 20 Pa. [0055] La présente invention a également pour objet les molécules organiques et/ou organominérales susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention. [0056] La présente invention a également pour objet l'utilisation des molécules organiques et/ou organominérales susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention pour la fabrication d'une composition cosmétique. [0057] La présente invention a également pour objet un procédé de fabrication d'une composition cosmétique comprenant la mise en œuvre du procédé d'extraction de molécules organiques et/ou organominérales de la présente invention et le mélange des molécules organiques et/ou organominérales obtenues dans un support cosmétiquement acceptable. [0058] La présente invention a également pour objet une composition cosmétique comprenant au moins une molécule organique et/ou organominérale obtenue par le procédé de l'invention et un support cosmétiquement acceptable. [0059] Dans la présente par « composition cosmétique » on entend toute composition à visée cosmétique c'est à dire une composition pouvant être mise en contact avec les parties superficielles du corps humain, par exemple l'épiderme, les systèmes pileux et capillaires, les organes externes, les dents et les muqueuses. [0060] II peut s'agir par exemple d'une composition liquide, une émulsion, un onguent, une mousse, une pâte ou un gel.
[0061] Dans la présente par support cosmétiquement acceptable on entend tout composé connu de l'homme du métier permettant de fabriquer une composition cosmétique. [0062] La composition cosmétique selon l'invention peut comprendre en outre un ou plusieurs adjuvants cosmétiques choisis parmi des agents conditionneurs de type esters, des agents anti-mousse, des agents hydratants, des agents émollients, des plastifiants, des agents épaississants minéraux, des agents épaississants organiques, polymériques ou non, associatifs ou non, des filtres solaires hydrosolubles et liposolubles, siliconés ou non siliconés, des colorants permanents ou temporaires, des parfums, des conservateurs, des céramides, et pseudo- céramides, des vitamines et les provitamines, des protéines, des agents séquestrants, des agents solubilisants, des agents alcanisants, des agents anti-corrosion, des agents réducteurs ou anti-oxydants, des agents oxydants, des charges minérales.
[0063] Dans la présente, la composition cosmétique peut être, par exemple, une composition anti-âge, par exemple une composition cosmétique stimulant la densification du derme papillaire et stimulant la synthèse des protéines de la jonction dermo-épidermique. [0064] La présente invention a également pour objet un procédé de fabrication d'une composition pharmaceutique comprenant la mise en œuvre du procédé d'extraction de molécules organiques et/ou organominérales de la présente invention et le mélange des molécules organiques et/ou organominérales obtenues dans un support pharmaceutiquement acceptable. [0065] Selon l'invention pharmaceutiquement acceptable peut être par exemple un médicament destiné à augmenter la régénération des tissus osseux, cartilagineux ou cutané et/ou un médicament destiné au traitement de l'arthrose, la polyarthrite, l'ostéoporose, le vieillissement dégénératif. [0066] La présente invention a également pour objet l'utilisation molécules organiques et/ou organominérales susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention pour la fabrication d'une composition pharmaceutique et/ou d'un médicament.
[0067] La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins une molécule organique et/ou organominérale obtenue par le procédé de l'invention et un support pharmaceutiquement acceptable.
[0068] Dans la présente par « composition pharmaceutique » on entend une composition liquide, une émulsion, un onguent, une mousse, une pâte, un comprimé sécable, une gélule, un comprimé effervescent, un patch dermique ou un dispositif injectable, sans que la forme soit limitative. [0069] Dans la présente par « support pharmaceutiquement » acceptable on entend un agent diluent inerte, tel que du sorbitol, du sucre, du mannitol, de la cellulose microcristalline, de l'amidon, de chlorure de sodium, du phosphate de sodium, du carbonate de calcium, du phosphate de calcium, du sulfate de calcium, du lactose, par exemple du lactose monohydrate.
[0070] Dans la présente, le médicament peut être utilisé, par exemple, dans le traitement ou la prévention de maladies liées à une diminution de la densité et de la masse osseuse.
[0071] Dans la présente, le médicament peut être utilisé, par exemple, dans le traitement ou la prévention de maladies choisies dans le groupe comprenant l'ostéopénie y compris génétique, l'ostéoporose, le vieillissement dégénératif, les infections rhumatologiques dont l'arthrose, les polyarthrites, et l'ensemble des maladies qui affectent le squelette. [0072] Le médicament peut être également utilisé, par exemple, dans le traitement de maladies cutanées, par exemple des maladies dues à des origines génétiques, psychosomatiques, pathologiques, dues au vieillissement intrinsèque et extrinsèque ou à des agressions ou des stress environnementaux. Il peut s'agir par exemple d'une maladie liée au rayonnement solaire Ultraviolet (UV), aux Infra-Rouge (IR), à une atmosphère humide excessive, à l'air conditionné et/ou à la poussière. [0073] La présente invention a également pour objet l'utilisation des molécules organiques et/ou organominérales susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention, pour la fabrication d'un médicament destiné à augmenter la régénération des tissus osseux, cartilagineux ou cutané. [0074] Dans la présente, par « augmenter la régénération des tissus osseux, cartilagineux ou cutané », il est entendu, par exemple, la reformation des tissus par stimulation de l'activité cellulaire induisant par exemple, une ostéogenèse, une restructuration de l'épiderme, une redensification du derme par production de matrice extracellulaire, de l'activité de la jonction épidermique, une régulation de l'activité de l'hypoderme, entre autres. Selon l'invention, l'augmentation de la régénération des tissus osseux, cartilagineux ou cutané peut être effectuée in vivo et/ou in vitro ou pour la culture de tissus, de cellules ou d'assemblages de cellules. [0075] Dans la présente, le médicament peut être administré par exemple, par voie topique, per-oesophagienne, sous cutanée ou intraveineuse ou tout autre mode d'administration approprié. Le médicament peut être formulé de toute manière connue par l'homme du métier selon l'administration.
[0076] La présente invention a également pour objet l'utilisation de molécules organiques et/ou organominérales susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention, pour le traitement de maladies choisies dans le groupe comprenant l'ostéopénie, l'ostéoporose, le vieillissement dégénératif, les infections rhumatologiques dont arthrose, polyarthrite, les maladies orthopédiques et les maladies dermatologiques. [0077] La présente invention a également pour objet l'utilisation de molécules organiques et/ou organominérales susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention pour l'application avec un implant ou sur un implant pour, par exemple augmenter la régénération des tissus par exemple osseux, cartilagineux ou cutanés, dans tous les types d'os et autres tissus. Par exemple au niveau du rachis, des membres (os compact, os spongieux), des os plats de la face et de la boite crânienne, du squelette thoracique ou autres. [0078] La présente invention a également pour objet l'utilisation de molécules organiques et/ou organominérales susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention pour la fabrication des greffons osseux par stimulation d'ostéoblastes ou de fibroblastes (ostéoinduction). [0079] D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, données à titre illustratif.
Brève description des figures
La figure 1 représente des puits de cultures de cellules. Les cellules sont cultivées en présence ou en absence d'extrait (T) de roches calcaires obtenu par un procédé de l'art antérieur (IM, NAC, AGH) ou un des modes de réalisation du procédé de l'invention (AGA, AGB).
La figure 2 représente des coupes histologiques de cellules après 5 jours de culture. - La figure 2 A représente une coupe d'expiant témoin non traité maintenu en condition de survie.
La figure 2 B représente une coupe d'expiant cultivé dans des conditions identiques à celle du témoin ayant reçu un traitement d'extrait de roche calcaire. - La figure 3 A représente une coupe histologique d'un explant de peau humaine maintenu en survie 9 jours, non traité et constitue un témoin de coupe de la figure 3 B.
La figure 3 B représente une coupe histologique d'un même explant de peau humaine maintenu en survie dans les mêmes conditions que la figure 3 A, traité 9 Jours avec l'extrait organo- minéral d'Orgon obtenu par le procédé décrit dans l'exemple 1 , montrant la stimulation des GAGs neutres et acides (acide hyaluronique).
La figure 4 A représente une coupe histologique témoin d'un explant de peau maintenu en survie 9 jours, non traité, pour constituer un témoin de coupe histologique de la figure 4B..
La figure 4 B représente une coupe histologique d'un même explant de peau humaine maintenu en survie dans les mêmes conditions que pour la figure 4 A traité pendant 9 jours avec l'extrait organo-minéral d'Orgon et montre la stimulation des
GAGs neutres et acides (acide hyaluronique).
EXEMPLES
Exemple 1 : Extraction de molécules organiques et/ou organominérales
[0080] Une roche de carbonate de calcium, 50g de roche d'Orgon, a été mélangée dans un récipient à bouchon, en Nalgène de 1000 ml à une solution comprenant 238ml d'éthanol absolu GPR RECTAPUR (solvant organique) de la société VWR International SAS, 12 ml d'eau milliQ obtenue avec une chaîne complète de purification d'eau de la société Thermo Scientific Barnstead (osmoseur Diamond RO et polisseur Easypur II) et 1ml d'acide minéral (HCI 37% ou 12N) de la société Carlo Erba. Le pH de la solution ainsi obtenue a été mesuré avec un pH mètre de la société Hach-Lange (Titralab 854) et était pH = 1 ,58. [0081] La température de réalisation de cet exemple était de 23 0C. [0082] Le mélange a été effectué avec un éluteur rotateur de marque Heidolph à une vitesse de rotation de 10 tours par minutes.
[0083] Dans cette expérience, trois mélanges identiques ont été effectués. Différents temps d'extractions ont été testés. [0084] L'extraction des molécules a été obtenue après des temps croissants par centrifugation à 3000g (centrifugeur CR 3.12 Jouan, France) pendant 20 minutes, réfrigérée à 4°C. Le surnageant a été ensuite filtré à l'aide d'un porte filtre pour filtration sous vide sur membrane (Whatman) avec filtre Millipore : membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF) hydrophile Durapore seuil 0.22μm. Les solutés ont été ensuite évaporés sous vide à l'aide d'un évaporateur (Bϋchi Rotovapor R-200) de manière à éliminer le solvant organique. Ils ont été enfin lyophilisés à l'aide d'un lyophilisateur Christ LyoDisplay Alpha 2-4 équipé d'un piège à -850C. Une poudre a été obtenue.
[0085] Les molécules extraites ont été analysées par spectrométrie d'émission au plasma (ICP-OES, Ultima Jobin Yvon), par Chromatographie Liquide à Haute Performance (HPLC) analytique (Thermo, colonne BioBasic SEC-300 et détecteur UV 2000), PyroGC/MS (THERMOfinnigan) et par électrophorèse SDS-PAGE (Mini ProteanTetra CeII, Biorad). [0086] Le tableau 1 ci-dessous résume les caractéristiques des extraits obtenus.
Tableau 1 : caractéristiques des mélanges effectués, les quantités extraites et le rendement d'extraction
[0087] Tel que démontré dans cet exemple et dans le tableau ci- dessus, le rendement d'extraction obtenu avec un exemple de mise en œuvre du procédé de l'invention était constant à environ en moyenne de 1.3% d'extrait.
Exemple 2. Extraction avec un procédé de l'art antérieur.
[0088] Le protocole décrit dans le brevet européen EP 0869805 a été appliqué sur 8 échantillons de roche d'Orgon avec deux dilutions différentes et des temps d'extraction croissants. Les dispositifs et produits utilisés dans cet exemple sont identiques à ceux utilisés dans le brevet EP
0869805.
[0089] Différents temps d'extraction ont été testés. [0090] Résultats : le tableau 2 ci-dessous résume les conditions testées
Tableau 2 : résultats des expériences d'extraction de molécules organiques avec le procédé du brevet EP 0869805.
[0091] Les quantités d'extrait avec ce procédé étaient de l'ordre du milligramme. Le rendement massique d'extraction avec le procédé de l'art antérieur est de l'ordre de 0.0056%. [0092] Tel que démontré dans l'exemple 1 , le procédé de l'invention permet d'avoir un rendement de 1 ,3%, soit au moins plusieurs centaines de fois supérieurs (environ 232) au procédé de l'art antérieur.
Exemple 3 : Extraction de molécules organiques et/ou organominérales suivant différents temps d'extraction.
[0093] Les composés de cet exemple sont identiques à ceux de l'exemple 1. Lors de cet exemple, la proportion d'acide a été augmentée par rapport à l'exemple 1 et différents temps d'extraction ont été testés.
50g de roche d'Orgon ont été mélangés à une solution comprenant 238ml d'éthanol absolu (solvant organique), 12 ml d'eau absolue et 2ml d'acide minéral (HCI à 37%). Le pH de la solution était de pH = 1 ,2.
[0094] Différents temps d'extraction ont été testés dans cet exemple.
Le pH de la solution était inférieur à celui de la solution de l'exemple 1.
[0095] Le tableau 3 ci-dessous résume les conditions et la quantité de molécules organiques et/ou organominérales obtenues.
Tableau 3 : résultats d'extraction
[0096] Dans cette expérience, il a été montré que la diminution du pH a permis une augmentation du rendement d'extraction qui était alors compris entre 2.4% et 3.3%.
[0097] Tel que démontré dans cet exemple, une diminution du pH du mélange a permis d'augmenter le rendement d'extraction. Dans cet exemple, les quantités extraites sont 600 à 800 fois supérieures aux quantités extraites avec le procédé de l'état de la technique présenté dans l'exemple 2.
[0098] Cet exemple démontre donc clairement que le procédé de l'invention permet d'augmenter de façon très importante les quantités d'extraits de roches calcaires et permet ainsi d'optimiser le procédé et de diminuer les coûts.
Exemple 4. Exemple de réalisation du procédé de l'invention avec des volumes de solvants aqueux et organiques supérieurs
[0099] Les réactifs et conditions de réalisation de cet exemple sont identiques à celle de l'exemple 1.
[00100] Dans cet exemple, 50g de roche d'Orgon ont été mélangés à une solution comprenant 476ml d'éthanol absolu (solvant organique), 24 ml d'eau absolue et 2ml d'acide minéral (HCI à 37%). Le pH de la solution était de pH = 1,51. [00101] Les résultats et le temps d'extraction sont indiqués dans le tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4 : résultats de l'extraction
[00102] Tel que démontré dans cet exemple, la proportion roche/solvant dans le procédé ne change pas le rendement à quantité d'acide constant.
Exemple 5 : Exemple de réalisation du procédé d'extraction en fonction du pH [00103] Les composés et les conditions de réalisation sont identiques à ceux des exemples précédents. 50g de roche d'Orgon a été mélangé à une solution comprenant 250ml d'éthanol absolu, la fraction aqueuse a été minimisée en mettant uniquement l'acide minéral, d'abord 1ml puis 2ml avec un pH environ égal à 0. [00104] Différents temps ont été testés. Tel que présenté dans le tableau 5, le rendement augmente avec la quantité d'acide uniquement :
1 ,2% puis 3,2%.
[00105] Par ailleurs, différentes quantités de solvants ont été testées.
[00106] Le tableau 5 ci-dessous résume les conditions et résultats obtenus.
Tableau 5 : résultats d'extraction en fonction de différentes quantités de solvant.
[00107] Tel que présenté dans le tableau 5, si la quantité de solvant organique est augmentée, le rendement reste inchangé à quantité d'acide constante, par exemple pour 500ml de solvant organique le rendement d'extraction est resté égal à environ 3%.
Exemple 6 : Extraction à partir de granulométries variables
[00108] Les conditions de réalisation sont identiques à ceux de l'exemple 1.
[00109] Les échantillons de la roche d'Orgon ont été préalablement broyés par le fournisseur (Omya SAS). Une colonne de tamisage a été utilisée pour caractériser le produit tel que reçu du fournisseur. La colonne de tamisage comprend les différents étages : 500 μm, 200 μm, 100 μm et 50 μm (fourni par OSI Inox). Le Tableau 6 donne le pourcentage de chaque fraction. Une série d'échantillons a été broyée à partir de bloc de roches. Les blocs ont été broyés en utilisant un broyeur de laboratoire (IKA-WERKE AUbasic). Le broyât est ensuite tamisé dans la même colonne de tamisage. 50 g de chacune des fractions ont été produits en broyant de plus en plus fin.
[00110] Les broyats ont ensuite été mélangés à une solution comprenant 238ml d'éthanol absolu, 12 ml d'eau absolue et 2 ml d'acide minéral (HCI à 37%). Le tableau 6 ci-dessous résume les quantités d'extraits obtenus en fonction de la taille du broyât.
Tableau 6 : caractérisation de la granulométrie de la poudre d'Orgon
[00111] La quantité d'extraits obtenue avec les différentes granulométries sont présentés dans le tableau 7 ci-dessous.
Tableau 7 : rendement d'extraction de la roche calcaire d'Orgon en fonction de la granulométrie
[00112] Tel que démontré dans cet exemple, l'extraction existe quelle que soit la granulométrie. Plus particulièrement, le rendement augmente quand la granulométrie diminue et reste constant lorsque la granulométrie est inférieure à 200μm.
Exemple 7 : étude de l'effet des extraits sur la minéralisation osseuse
[00113] Les différentes étapes de la différenciation osseuse peuvent être étudiées in vitro sur des cultures cellulaires. La capacité des extraits à stimuler les mécanismes de minéralisation osseuse a été testée selon le protocole décrit dans Bellows et al., 1991, 1992 (Refs 8, 9).
[00114] Dans cet exemple, les extraits de roches ont été obtenus à partir du calcaire du gisement d'Orgon, en suivant les trois conditions d'extraction décrites dans le tableau 8. [00115] L'extraction a été effectuée pendant 15 heures suivant le protocole décrit précédemment. Le solvant a été ensuite mis à évaporation et le culot lyophilisé.
Tableau 8 : conditions d'obtention des extraits et rendement des procédés utilisé.
- : pas présent dans la solution
[00116] L'extrait obtenu selon le procédé de l'invention correspond à la condition AGA. La condition AGB est obtenue suivant le procédé mais sans être optimisée. [00117] La condition AGH correspond à l'extrait obtenu selon le protocole du brevet européen précité.
[00118] Après avoir lyophilisé les 3 extraits, leur activité a été testée en utilisant des cultures cellulaires in vitro de cellules MC3T3-E1 de souris (ATCC, USA). Il s'agit d'une lignée ostéoblastique de cellules pré- différenciées, engagées dans la voie ostéoblastique, capables de minéraliser après avoir atteint un stade de maturation. [00119] Les cellules MC3T3 ont été cultivées pendant 25 jours à 37°C sous 5 % de CO2 dans un milieu alpha Minimum Essentiel (α-MEM médium) (alpha-modification, Sigma M4526) contenant 50 U/mL de pénicilline et 50 μg/mL de streptomycine (Gibco-lnvitrogen), 10 % de sérum de veau fœtal (HyClone-Perbio) et 2 mM L-glutamine (GibcoBRL). Les extraits AGA, AGB, AGH, ont été additionnés à ce milieu de culture, à savoir 200 μg d'extrait sec par ml de milieu nutritif. Ces tests ont été comparés au témoin sans apport (T)1 ainsi qu'à un milieu nutritif connu à l'acide ascorbique et au bétaglycérophosphate (IM).
[00120] Les résultats de cette expérience, Figure 1 , ont montré une stimulation très nette du développement des cellules lorsque le milieu nutritif comprend des extraits de roches calcaires suivant les conditions AGA, et AGB. [00121] Les extraits obtenus avec les conditions AGA et AGB de roches stimulent la minéralisation dès 21 jours comme pour les extraits de nacre fraîche (NAC). Le milieu nutritif de référence a atteint le même stade au bout de 26 à 29 jours. Par contre l'extrait AGH de roche obtenu avec le protocole de l'état de la technique n'a pas stimulé la minéralisation. L'extrait de nacre (NAC) obtenu selon le procédé de l'art antérieur permet une stimulation de la minéralisation comme attendue et confirme la réactivité des cellules. [00122] Tel que démontré dans cet exemple, lorsque les cellules préostéoblastiques sont exposées aux extraits obtenus par le procédé de l'invention, elles déclenchent le mécanisme de minéralisation osseuse dès la 3ème semaine, alors que les inducteurs spécifiques ne produisent le même effet qu'à la fin de la 4ème semaine de culture.
[00123] Les extraits du matériau calcaire obtenus selon le procédé de l'invention permettent donc la stimulation de la minéralisation au contraire de l'extrait de matériau calcaire obtenu par le procédé du brevet EP 0869805 de l'art antérieur. Les extraits de la roche selon le procédé de l'invention possèdent donc bien une activité sur les tissus biologiques.
Exemple 8 : Effet des extraits de roches sur des explants de peau humaine.
[00124] Dans cet exemple, les applications cosmétiques ont été démontrées sur des explants de peau humaine maintenus en condition de survie. Les explants provenaient d'une plastie abdominale d'une femme âgée de 38 ans. 21 explants de peau entière ont été mis en survie en milieu BEM selon le procédé Bio-EC, France.
[00125] 3 groupes de 6 explants et 1 groupe de 3 explants ont été formés tel que présenté ci-dessous:
Témoin TO 3 explants lot non traité T 6 explants gel de CMC E 6 explants produit P1 P1 6 explants
[00126] Le groupe témoin TO correspondait aux 3 explants qui ont été prélevés à JO (jour zéro).
[00127] Le groupe T, non traité correspondait au groupe de 6 explants qui ont été maintenus en condition de survie à l'aide du milieu de culture BEM.
[00128] Le groupe E, gel de CMC (carboxyméthylcellulose) correspondait au groupe de 6 explants qui ont été maintenus en condition de survie et sur lesquels ont été appliqués l'excipient à savoir le gel CMC, sans actifs.
[00129] Le groupe produit P1 correspondait au groupe de 6 explants maintenus en condition de survie et sur lesquels ont été appliqués le gel CMC contenant le mélange d'extrait de roche suivant l'invention concentré à 2%.
[00130] Le traitement a été réalisé par application topique de 2 mg de produit à tester par explant. Ce traitement a été réalisé tous les jours. Les milieux de culture ont été renouvelés pour moitié à J2, J5 et J7, c'est à dire 2 jours après, 5 jours après et 7 jours après le début de l'expérience.
[00131] A JO, les 3 explants du groupe TO ont été prélevés et coupés en deux. Une partie a été fixée au formol tamponné pour l'observation de la morphologie générale. L'autre a été congelée et conservée à -800C. A J5 et à J9, 3 explants de chaque groupe ont été prélevés et traités de la même manière.
[00132] Des préparations histologiques ont été réalisées suivant les protocoles classiquement utilisés : coupes en paraffine après coloration au trichrome de Masson, variante de Goldner selon le mode opératoire MO-H- 157. Les observations de la morphologie générale présentée ici ont été réalisées en microscopie optique, à l'aide d'un microscope Leica type DMLB, à l'objectif x 40. Les prises de vue ont été réalisées avec une caméra tri CCD Sony DXC 390P et stockées à l'aide du logiciel d'archivage de données Leica IM 1000. [00133] Comparés aux explants témoins non traités, après 5 jours les explants qui ont subi l'application des extraits de roche montrent que le stratum corneum est modérément épais et feuilleté, légèrement kératinisé en surface et très nettement à sa base (Figure 2 B). La parakératose est légère. L'épiderme présente 6 à 7 assises cellulaires avec une bonne morphologie. Les coupes témoins (Figure 2 A) comme le groupe de départ n'en présente que 4 à 5. Le relief de la jonction dermo-épidermique est très net. Le derme papillaire présente des fibres de collagène assez épaisses formant un réseau dense. Il est bien cellularisé. [00134] Après 9 jours de traitement, il a été noté une nette augmentation de l'épaisseur du stratum corneum (signe d'un important renouvellement cellulaire et d'une assez bonne différenciation terminale) avec une augmentation de l'épaisseur épidermique (Figure 2 B). Le réseau de collagène, dans le derme papillaire, était également plus dense.
[00135] Tel que présenté dans cet exemple, une étude de la morphologie générale sur explants de peau humaine a été conduite dans des conditions standard non optimisées. Elle a montré une très nette activité stimulante épidermique et dermique avec l'extrait de roche dès 5 jours d'application et renforcée après 9 jours (non illustré) : meilleur ancrage avec une restructuration de la stratification cellulaire épidermique, une restauration du relief de la jonction dermo-épidermique ainsi qu'un réseau de collagène plus dense dans le derme papillaire. [00136] Cet exemple démontre donc clairement que l'extrait obtenu par la présente invention permet, en plus de stimuler la formation, la minéralisation et la régulation de la masse osseuse, d'avoir un effet restructurant et régulateur de l'ensemble de l'activité cutanée.
Exemple 9 : Exemple de caractéristiques de roche calcaire [00137] Les roches calcaires qui peuvent être utilisées dans le procédé de l'invention peuvent être choisies, par exemple sur la base de leur teneur en carbone organique total (COT), même si la technique n'est qu'indicative et généralement pas très sensible et que seule l'extraction suivant le brevet compte. [00138] Une méthode pyrolytique connue sous le nom de pyrolyse Rock Eval a été utilisée dans cet exemple, détournée de son utilisation habituelle que sont les huiles minérales ou les contaminations. Le tableau ci-dessous montre qu'il est possible de détecter un pic lié au craquage sous atmosphère neutre de constituants organiques, grâce au détecteur FID (Ionisation de Flamme) (Ref 8) (mg d'hydrocarbures formés par craquage en fonction de la température et par la température de son maximum). Ce pic même très faible, sur les roches calcaires sélectionnées chez un certain nombre de producteurs, n'apparaît pas sur le carbonate de calcium précipité (CCP) vendu par VWR International.
Tableau 9 : exemples de caractéristiques de roches calcaires
- : non testé [00139] Tel que démontré dans le tableau ci-dessus, les différentes roches testées présentent toutes un pic de pyrolyse comparable à celui de la roche d'Orgon.
[00140] Ces roches sont des carbonates de calcium (calcite) qui peuvent être utilisées dans le procédé de l'invention.
Exemple 9 Composition cosmétique
[00141] Une crème de redensification dermique cosmétique est préparée à partir des extraits obtenus dans l'exemple 1. Il s'agit d'une émulsion huile-dans-eau stable où la phase huileuse est dispersée dans une phase aqueuse avec un émulsionnant à base d'ester d'acide gras : palmitate de glucose et du palmito-stérate de saccharose (5%). La phase huileuse est réalisée avec de l'huile de tournesol (13%) et de l'huile de jojoba (5%). La phase aqueuse contient des substances bactériostatiques. Une concentration de 2% d'actif a été utilisée et ajoutée dans la phase aqueuse.
[00142] La préparation obtenue est testée par application topique sur des explants de peau dans les conditions décrites dans l'exemple 8. Les coupes d'expiants à 9 jours montrent avec l'excipient seul une structure épidermique en bon état de survie comparable à la morphologie des explants témoin à au début de l'expérimentation (JO). L'application de la crème cosmétique induit une nette augmentation de l'épaisseur épidermique (7/8 assises cellulaires) et dans le derme papillaire, un réseau de collagène plus dense. La structure de la jonction dermo-épidermique est nettement remodelée avec un ancrage prononcé dans le derme.
Exemple 10 : Composition pharmaceutique :
[00143] Une " composition pharmaceutique de renouvellement et restructuration de la barrière hydro lipidique cutanée a été préparée pour une application topique sur la peau, destinée à réaliser un peeling naturel sans aucune abrasion physique et donc sans fragilisation de la protection épidermique. L'excipient utilisé est une base classique décrite dans le tableau ci-dessous.
Tableau 10 : base de la composition pharmaceutique
[00144] Les actifs ont été additionnés à hauteur de 2% sur la base des extraits obtenus au cours de l'exemple 3.
[00145] La composition pharmaceutique obtenue est testée par application topique sur des explants de peau dans les conditions décrites dans l'exemple 8. Après 9 jours une vérification a été effectuée afin de vérifier que les explants traités avec l'excipient seul conservent une structure épidermique en bon état de survie comparable à la morphologie des explants témoins au début de l'expérimentation (JO). Les coupes d'expiants traitées avec la composition pharmaceutique montrent après 9 jours un important renouvellement cellulaire et une bonne différenciation terminale, avec une augmentation modérée de l'épaisseur épidermique (6/7 assises cellulaires). En 9 jours un peeling est observé suivi d'un renouvellement de la barrière hydrolipidique cutanée.
Exemple 10 : Exemple comparatif : extraction avec un procédé de l'art antérieur décrit dans le document FR 2 919 186 [00146] Le protocole décrit dans le document FR 2 919 186 a été appliqué sur un échantillon de roche d'Orgon et un échantillon de Falun de Touraine tel que décrit dans le document FR 2 919 186. [00147] Les dispositifs et produits utilisés dans cet exemple sont identiques à ceux utilisés dans le document FR 2 919 186. Les deux matériaux ont été broyés de manière à obtenir une granulométrie moyenne inférieure à 1 μm. Chacune des poudres a été introduite dans de l'eau déminéralisée contenant un mélange de conservateurs : sorbate de potassium à 0,3% en poids, benzoate de Sodium à 0,4% en poids, déhydroacétate de sodium à 0,1% en poids et alcool benzylique à 0,6% en poids, dans une cuve munie d'un agitateur et maintenue à température ambiante, c'est-à-dire à 22°C dans une proportion de 20% en poids, comme indiqué dans le document FR 2 919 186. Le pH de la solution a été vérifié afin de confirmer que celui-ci était bien neutre, comme décrit dans le document précité, c'est-à-dire pH= 7,1. L'agitation a été maintenue pendant 48 heures à une température de 22°C comme indiqué dans le document FR 2 919 186. Le mélange a été ensuite filtré afin de séparer la suspension minérale résiduelle du liquide. [00148] Une analyse des minéraux en solution a été ensuite réalisée sur le liquide par ICP/AES (Jobin Yvon Ultima 2 (marque déposée)) pour évaluer le rendement d'extraction avec le procédé du document FR 2 919 186. Dans l'échantillon de falun, les inventeurs ont mesuré une valeur de 205 mg de Ca par litre et 23,5 mg de Si par litre de solution (1396 mg de résidu après lyophilisation). Ils ont trouvé une valeur de 245 mg de Ca pour la roche d'Orgon et une valeur de Si indétectable. Le rendement massique par rapport à la masse de roche d'Orgon est de 0,0012% par ce procédé de l'art antérieur décrit dans le document FR 2 919 186. Le rendement massique obtenu pour le falun de Touraine par le même procédé de l'art antérieur est de 0,007%. [00149] Ainsi comme démontré dans cet exemple, le rendement d'extraction du procédé de l'invention permet d'obtenir un rendement plus de 1000 fois supérieur aux procédés décrits dans l'art antérieur. Exemple 11 : Activités cosmétiques des extraits obtenus par le procédé de l'invention suivant la provenance du matériau calcaire
[00150] Cet exemple est réalisé dans les mêmes conditions que l'exemple 8, ci-dessus.
[00151] Une plastie abdominale d'une femme âgée de 53 ans a été utilisée. Plusieurs lots d'expiants ont été obtenus. Dans cet exemple, tous les extraits ont été appliqués, suivant le protocole décrit dans l'exemple 8 ci-dessus: application topique, tous les jours, de 2 mg de gel CMC contenant l'extrait de roche suivant l'invention, concentré à 1%.
[00152] L'extrait de roche d'Orgon tel qu'obtenu dans l'exemple 1 , a été utilisé pour tester un lot d'expiants référencé CA2.
[00153] Un extrait de roche de Saint Germain tel qu'obtenu suivant le même procédé a été utilisé pour tester un lot d'expiants référencé CB6. [00154] Après traitement pendant 5, 9 ou 10 jours sur les explants, des coupes histologiques ont été réalisées par fixation des explants 24 heures dans du formol tamponné, déshydratation et imprégnation en paraffine à l'aide d'un automate de déshydratation (Leica 1020) et mise en bloc (station d'enrobage (Leica EG 1160)). Les coupes de 5 μm ont été ensuite réalisées au microtome (Minot, Leica RM2125) et collées sur des lames de verre histologiques silanisées superfrost (marque déposée). Les colorations et les marquages immunochimiques ont été réalisés sur les coupes dans les conditions suivantes. :
- La visualisation des glycosaminoglycanes (GAGs) est effectuée par coloration au bleu alcian-P.A.S. sur les coupes précédemment décrites (également connu de l'homme de l'art par coloration de Mowry).
- Le collagène I a été marqué sur coupes congelées avec un anticorps polyclonal anti-collagène I, fait sur lapin, (Monosan, ref : PS 047), au 1/500ème pendant 1h à température ambiante avec un système amplificateur biotin/streptavidin, révélé en FITC. Les noyaux ont été contre colorés à l'iodure de propidium. - Le collagène III a été marqué sur coupes congelées avec un anticorps polyclonal anti- collagène III, fait sur chèvre (SBA ref : 1330-01), au 1/320ème pendant 2 h à température ambiante avec un système amplificateur biotin/streptavidin, révélé en DAB. Les noyaux ont été contre colorés à l'hémalun de Masson.
- Le collagène IV a été marqué sur coupes congelées avec un anticorps polyclonal anti- collagène IV, fait sur chèvre (SBA ref : 1340-01), au 1/60ème pendant 2 h à température ambiante avec d'un système amplificateur biotin/streptavidin, révélé en fluorescéine isothiocyanate (FITC). Les noyaux ont été contre colorés à l'iodure de propidium.
- La laminine-5 a été marquée sur coupes congelées avec un anticorps monoclonal anti-laminine-5, clone P3E4 (SBA ref : 1340- 01), fait sur chèvre, au 1/320ème pendant 1h30 à température ambiante avec un système amplificateur biotin/streptavidin, révélé en FITC. Les noyaux ont été contre colorés à l'iodure de propidium.
[00155] Les résultats sont évalués par comparaison avec des témoins réalisés sur des lots d'expiants traités avec l'excipient uniquement. [00156] Le lot CA2 traité pendant 10 jours avec l'actif organo-minéral d'Orgon obtenu dans l'exemple 1 a montré de façon inattendue, une surexpression nette des GAGs acides (GAGsA) du derme papillaire tel que représenté sur la figure 3 B. Ces GAGs sont connus pour être essentiellement des acides hyaluroniques, facteur hydratant très recherché en dermopharmaceutique et cosmétique.
[00157] II a été également observé une surexpression modérée des GAGs neutres (GAGsN) (réserve de facteur de croissance), du collagène de type I (CoII I) et III (CoII III) (collagène juvénile). Ces effets peuvent avantageusement produire une stimulation de la densification du derme papillaire, un effet anti-ride recherché en cosmétique (voir Tableau 11).
[00158] Le lot CB6 traité pendant 10 jours avec l'extrait organo-minéral obtenu à partir du matériau calcaire de la carrière de Saint Germain a montré par rapport au lot témoin, une surexpression nette du collagène IV (CoII IV) (collagène des tissus de soutien), de la laminine 5 (Lam 5) et du collagène de type III ou collagène juvénile (voir le tableau 11).
Tableau 11 : résultats obtenus avec les extraits obtenus par le procédé de l'invention par rapport à des témoins
Diminution légère: ^ ; modérée : ^^ ; assez nette :^^^ ; nette :^^v
Augmentation : légère :/71 ; modérée \PP ; assez nette : PPP \ nette :
PPPP ou Inchangé :*» [00159] Tel que démontré dans cet exemple, les extraits obtenus par le procédé de la présente invention ont donc un effet, par exemple au niveau des protéines impliquées dans le derme et la jonction dermo-épidermique en stimulant leurs activités.
[00160] Aussi, cet exemple démontre clairement que les extraits obtenus par le procédé de l'invention peuvent être utilisés, par exemple, dans le domaine cosmétique, par exemple pour un effet anti-âge par restructuration du relief de la jonction dermo-épidermique et stimulation de son activité.
[00161] Cet exemple démontre que dans des conditions non optimisées des extraits tels qu'obtenus par le procédé à partir de différents matériaux calcaires ont une activité ciblée à divers niveaux dermo-épidermique.
Exemple 12 : Activités dermatologiques des extraits obtenues par le procédé avec différents matériaux calcaires [00162] Les tests d'activité de cet exemple sont réalisés sur des explants de peau humaine maintenue en survie dans les mêmes conditions que ceux de l'exemple 11 précédent. [00163] Des colorations et des marquages sont obtenus comme décrit dans l'exemple 11 précédents sur les GAGs, les collagènes de types I, III et IV, sur la laminine-5. D'autres activités sont évaluées comme suit. [00164] Les cellules en mitose ont été marquées avec un anti-corps monoclonal, anti-Ki67 (clone 7B11 de chez Zymed, IgGI sur souris) avec un système amplificateur biotin/streptavidine (Vectastain RTU Universal Vector) et une révélation en VIP.
[00165] La G6PDH a été marquée sur coupes paraffine fixée au Bouin avec un anti-corps polyclonal anti-G6PDH (Rockland ref : 200-1153), fait sur souris, au 1/150ème pendant 24h à température ambiante (200C) avec un système amplificateur biotine/streptavidine révélé en Fluorescéine isothiocyanate (FITC). Les noyaux ont été contre colorés à l'hémalun de Masson. [00166] La loricrine a été marquée sur coupes congelées avec un anti- corps polyclonal anti-loricrine (Covance ref PRB-145) fait sur lapin au 1/4000ème pendant 1 nuit à 4°C avec un système amplificateur biotine/streptavidine et révélé en FITC. Les noyaux ont été contre colorés à l'iodure de propidium. [00167] Les LEKTI sont des inhibiteurs de protéases à serine (lympho epithelial kazal type inhibitor). Ils ont été marqués à l'aide d'un anti-corps monoclonal de souris anti-LEKTI (Santa Cruz, ref sc-32330), au 1/800ème pendant 1 nuit à 4°C avec un système amplificateur Vectastain RTU Universal VECTOR avidine/biotine et révélé en FITC. Les noyaux ont été contre colorés à l'iodure de propidium. [00168] Le lot DA2 traité pendant 9 jours avec l'extrait organo-minéral d'Orgon obtenu dans l'exemple 1 , a montré de façon inattendue, une régulation du turnover complet de stratification épidermique en 9 jours avec conservation d'une excellente morphologie de l'épiderme, tel que représenté sur la figure 4 B. Une nouvelle peau a donc été reconstituée en 9 jours par simple application topique de l'extrait organo-minéral d'Orgon, la peau se renouvelle naturellement trois fois plus lentement, en 28 jours. [00169] Les extraits obtenus par le procédé de l'invention peuvent donc d'être utilisé dans le cas de brûlures de peau, de stimulation d'expiants humains en croissance, stimulation de tissus de synthèse in vitro, etc
[00170] Le lot DB6 a été traité pendant 10 jours avec l'actif organo- minéral extrait de la pierre d'Euville obtenu suivant l'exemple 1. Il a été observé avec intérêt, une stimulation de la prolifération cellulaire dans l'épiderme par une surexpression du marquage Ki67 des cellules en mitose et une stimulation des LEKTI dans la couche granulaire (voir le tableau 12).
[00171] Le lot DB2 a été traité pendant 10 jours avec l'extrait obtenu à partir de la nacre de Pinctada margaritifera suivant l'exemple 1. Il a été observé une surexpression des collagènes de type I (voir le tableau 12). Tableau 12 : résultats obtenus avec les extraits obtenus par le procédé de l'invention par rapport à des témoins
Diminution légère: ^ ; modérée : ^^ ; assez nette ^^^ ; nette ^^v Augmentation : légère :/71 ; modérée : ss> ; assez nette : s1/*/* ; nette : s>/*?sι ou Inchangé :**
[00172] Cet exemple démontre que les extraits obtenus par le procédé de l'invention à partir de différents matériaux calcaires de provenances variées ont des effets spécifiques de stimulation de la peau humaine. Il montre que l'âge du matériau peut, en outre, produire des effets bénéfiques : le calcaire d'Orgon (110 millions d'années) stimule, en outre, la production d'acide hyaluronique (GAGsA).
Exemple 13 : Activité sur la peau des extraits optimisés par fractionnement [00173] Différents extraits fractionnés ont été testés sur des explants de peau humaine ex-vivo, dans les mêmes conditions que l'exemple 11 et 12 précédents.
[00174] Dans cet exemple l'extrait de la roche d'Orgon a été obtenu en utilisant le procédé dans les proportions suivantes : 50 g du calcaire d'Orgon broyés sont mis en contact avec une solution de 500ml d'eau MiIIi- Q, 10 ml de dichlorométhane et 2ml d'acide chlorhydrique. [00175] L'extrait brut est utilisé tel quel pour traiter pendant 9 jours les explants du lot référencé FA1. Le traitement des explants par l'extrait est effectué dans les mêmes conditions que celui décrit dans les exemples 11 et 12 précédents.
[00176] Le même extrait a été déminéralisé et utilisé pendant 10 jours pour tester un lot d'expiants référencé FB3. La déminéralisation de l'extrait a été réalisée en reconstituant une solution à partir de la poudre lyophilisée avec de l'eau MiIIi-Q, en utilisant des sacs de dialyse (Spectrum, Spectra/Por avec une coupure à 0,5 kDa). L'extrait mis en solution est dialyse contre un tampon d'eau MiIIi-Q (<1 μS/cm) renouvelée et maintenu à température ambiante sous agitation jusqu'à ce que la conductivité soit inférieure à 1 μS/cm (2 micro siemens par centimètre correspondent à environ 1 milligramme de sel dissous par litre).
[00177] Le même procédé d'extraction a été utilisé avec le matériau calcaire CCP fourni par la société VWR International SA. L'extrait total est utilisé pour traiter pendant 10 jours un lot d'expiants référencé FB5. [00178] Une série de colorations et de marquages immunochimiques est réalisée sur les coupes d'expiants de peau après traitements des trois lots : FA1 , FB3 et FB5, dans les conditions décrites dans les exemples 11 et 12 précédents.
[00179] Le lot FA1 traité pendant 10 jours avec l'extrait organo-minéral d'Orgon obtenu dans cet exemple, a montré par rapport au lot témoin, une surexpression modérée des GAGs neutres et du collagène de type IV. Ceci s'interprète comme une stimulation de l'activité de la jonction dermo- épidermique dans la mesure où les GAGs neutres sont connus pour constituer le réservoir des facteurs de croissance au niveau de la jonction dermo-épidermique (voir le tableau 13 ci-dessous). Ces effets sont recherchés en cosmétique.
[00180] Le lot FB3 a été traité avec la fraction organique de l'actif concentré au cours de la dialyse par élimination des oligo-éléments solubles. Dans le lot FB3, il a été montré une surexpression des GAGs neutres, de la laminine 5 et des collagènes de type IV, III et de façon plus nette du collagène de type I. La fraction organique concentrée, testée sur le lot FB3 explique bien la stimulation de la jonction dermo-épidermique découverte avec l'extrait brut obtenu dans cet exemple par le procédé de l'invention. Il a également été constaté, une surexpression du collagène I1 composante importante de la matrice extracellulaire du derme papillaire (voir le tableau 13 ci-dessous).
[00181] Le lot FB5 a été traité avec l'extrait obtenu dans cet exemple mais à partir d'un matériau calcaire, CCP (carbonate de calcium précipité) fourni par la société VWR International SA. Il a été montré de façon surprenante après 10 jours de traitement une stimulation les GAGs neutres, du collagène IV et de la laminine 5, tous constituant la jonction dermo-épidermique (voir le tableau 13 ci-dessous).
Tableau 13 : résultats obtenus avec les extraits obtenus par le procédé de l'invention par rapport à des témoins
Tableau 13 (suite) : résultats obtenus avec les extraits obtenus par le procédé de l'invention par rapport à des témoins
Diminution légère: ^ ; modérée : ^ ; assez nette :^^ ; nette :^wv Augmentation : légère :/71 ; modérée :/71'71 ; assez nette : ??P \ nette : /71T1/"/1 ou Inchangé :«*
[00182] Cet exemple démontre que le fractionnement des extraits obtenus avec le procédé de l'invention, peut permettre d'obtenir des effets amplifiés et/ou des effets ciblés sur un compartiment précis ou une fonction précise des cellules et/ou des processus physiologiques de la peau.
Listes des références
(ReH) L Greger et al. « Minerai utilisation by rats fed various commercially available calcium suppléments or milk. » J Nutr; 117 717-24 1987
(Réf 2) T. Chevalley et al. « Effect of calcium suppléments on fémoral bone minerai density and vertebrate fracture in Vitamin D depleted elderly patients », Osteoporosis IntΛ :245-52, 1984
(Réf 3) Blumberg S. « Is coral calcium a safe and effective supplément? » JAm DietAssoc Sept ; 104(9) : 1335-6
(Réf 4) T.Okano et al. « Bioavailability of calcium from oyster shell electrolysate and DL-Calcium lactate in vitamin D-replete or vitamin D-deficient rats. Journal of Bone and Minerai Metabolism 11 (2) : 23-32 1993
(Réf 5) T. Miura « Calcium bioavailability of a total bone extract (TBE) and diets effects on bone metabolism in rats » Biosci. Biotechnol. Biochem 62 : 1307-12, 1998
(Réf 6) Y Takada « bioavailabillity of various dietary calcium compound. 2 Examination in vivo of various dietary compound », Snow brand milk products Co, Ltd sapporo : 75- 84
(Réf 7) A Schaafsmal et al. « Eggshell powder, a comparable or better source of calcium than purified calcium carbonate: piglet studies », JSci Food Agric 79: 1596-600, 1999
(Réf 8) E. Lafargue, F. Marquis, D. Pillot, « Rock-Eval 6 Applications in hydrocarbon exploration, production and soil contamination studies », OiI & Gas Science and Technology, 1998, 53(4), 421-37
(Réf 9) Bellows CG, Heersche JN, Aubin JE. Bone Miner. Inorganic phosphate added exogenously or released from beta- glycerophosphate initiâtes mineralization of osteoid nodules in vitro. Apr; 17(1): 15-29, 1992
(Réf 10) Bellows CG, Aubin JE, Heersche JN. Initiation and progression of mineralization of bone nodules formed in vitro: the rôle of alkaline phosphatase and organic phosphate Bone Miner. Jul;14(1):27-40, 1991
REVENDICATIONS

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'extraction de molécules organiques et/ou organominérales à partir d'un matériau calcaire caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact dudit matériau calcaire avec une solution, ladite solution comprenant : au moins un solvant organique, de l'eau et au moins un acide, ladite solution ayant un pH compris entre 0 et 5.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel le solvant organique est choisi dans le groupe comprenant les alcools en C1 à C6, les éthers et les hydrocarbures
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le solvant est choisi dans le groupe comprenant l'éthanol, l'éther diethylique, le dichloromethane, diméthylformamide (DMF), le diméthylsufoxyde (DMSO), et l'acétonitrile.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le ou les acide(s) est (sont) choisi(s) dans le groupe comprenant les acides minéraux et les acides organiques.
5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel l'acide est choisi dans le groupe comprenant l'acide chlorhydrique, l'acide acétique, l'acide sulfurique, l'acide citrique, l'acide éthylène-diamine-tétraacétique.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la concentration dudit, au moins un, solvant organique dans ladite solution est compris entre 1 et 99%.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la mise en contact est effectuée à une température comprise entre 5 et 900C.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit matériau calcaire est broyé préalablement à la mise en contact dudit matériau avec ladite solution.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit matériau calcaire a une granulométrie moyenne comprise entre 0,5 et 500 μm.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le matériau calcaire est une roche calcaire.
11. Procédé selon la revendication 8, dans lequel la roche calcaire une roche calcaire de France choisie dans le groupe comprenant une roche d'Orgon, France, de Pierre d'Euville, France, de Saint Germain, France, et de Pagny sur Meuse, France, de Sainte Croix de Mareuil, France.
12. Molécules organiques et/ou organominérales susceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.
13. Procédé de fabrication d'une composition cosmétique comprenant la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 et le mélange des molécules organiques et/ou organominérales dans un support cosmétiquement acceptable.
14. Procédé de fabrication d'une composition pharmaceutique comprenant la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 et le mélange des molécules organiques et/ou organominérales dans un support pharmaceutiquement acceptable.
15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel la composition pharmaceutique est un médicament destiné à augmenter la régénération des tissus osseux, cartilagineux ou cutané.
16. Procédé selon la revendication 14, dans lequel la composition pharmaceutique est un médicament destiné au traitement de l'arthrose, la polyarthrite, l'ostéoporose, le vieillissement dégénératif.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5662954A (en) * 1994-07-05 1997-09-02 Joiner; Margie Method for preparing mineral-enriched citrate compositions
FR2743075B1 (fr) * 1995-12-28 1998-03-27 Centre Nat Rech Scient Procede de preparation de substances actives a partir de la nacre, produits obtenus, utiles notamment comme medicaments
FR2799125B1 (fr) * 1999-10-05 2002-01-18 Centre Nat Rech Scient Procede de preparation d'une composition par extraction de nacre, comprenant l'integralite des composants de la nacre, composition obtenue par ce procede et son utilisation en pharmacie et cosmetique.
FR2899478A1 (fr) * 2006-04-05 2007-10-12 Innovation Et De Rech Applique Procede d'extraction de molecules de nacre, compositions et utilisation
FR2900343B1 (fr) * 2006-04-26 2008-07-04 Robert Wan Luxury Ltd Composition inhibitrice de proteases, notamment la papainee, la cathepsine k et la cathepsine b, et procede de purification de molecules inhibitrices de proteases
FR2919186B1 (fr) * 2007-07-23 2009-12-04 Soc D Production Et De Conditi Composition cosmetique et/ou dermopharmaceutique et/ou alimentaire renfermant un melange d'elements mineraux naturels et leurs utilisations

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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