EP2406391A1 - Procédé de détection, d'identification et/ou de quantification de nanotubes de carbone - Google Patents

Procédé de détection, d'identification et/ou de quantification de nanotubes de carbone

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Publication number
EP2406391A1
EP2406391A1 EP10706684A EP10706684A EP2406391A1 EP 2406391 A1 EP2406391 A1 EP 2406391A1 EP 10706684 A EP10706684 A EP 10706684A EP 10706684 A EP10706684 A EP 10706684A EP 2406391 A1 EP2406391 A1 EP 2406391A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleotide sequence
function
sample
pcr
nanotube
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP10706684A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Gilles Marchand
Dorothée JARY
Pierre Puget
François Tardif
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP2406391A1 publication Critical patent/EP2406391A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Definitions

  • the present invention belongs to the field of nanotechnologies and, in particular, to the field of nano-objects such as carbon nanotubes.
  • the present invention aims to provide a method for detecting, identifying and / or quantifying carbon nanotubes.
  • the process according to the invention is based on the functionalization of the nanotubes by a nucleotide sequence and on a biological amplification to which the nanotubes thus functionalized are subjected.
  • the method according to the invention makes it possible to obtain a very low detection limit for nanotubes and is easy to implement at the workplace and for monitoring the environment.
  • the present invention also provides a kit for implementing such a method.
  • CNTs carbon nanotubes
  • a carbon nanotube is defined as a concentric winding of one or more layers of graphene (paving of carbon hexagons).
  • SWNT single-wall nanotube
  • MWNT multiwall nanotube
  • nanotubes Due to their unique structure and their dimensions characterized by a length / diameter ratio, nanotubes have exceptional mechanical, electrical and thermal properties.
  • NTCs can already be found in tennis rackets, bicycles, TV screens and tires, just like in resins used by the aerospace industry, defense, microelectronics, etc.
  • NTC neurodegenerative disease
  • Microscopic techniques such as Scanning Tunneling Microscopy (STM), Transmission Electron Microscopy (TEM), Scanning Electron Microscopy (SEM) acronym for Scanning Electron Microscopy) or Atomic Force Microscopy (AFM) are techniques that can be used to detect CNTs.
  • STM Scanning Tunneling Microscopy
  • TEM Transmission Electron Microscopy
  • SEM Scanning Electron Microscopy
  • AFM Atomic Force Microscopy
  • Spectroscopic techniques such as Raman spectroscopy and fluorescence spectroscopy, can be adapted for routine analysis. But Raman spectroscopy shows selectivity only for some NTCs, in particular SWNTs. Weisman and colleagues have established a method for fluorescent SWNT detection in intact organisms [8]. This sensitive and selective method detects only individual SWNTs (i.e. monodisperse).
  • This sensitive and selective method detects only individual SWNTs (i.e. monodisperse).
  • the need to integrate lasers with different wavelengths into a device for detecting, identifying and possibly quantifying CNTs in particular during production processes increases the cost price of said device and CNTs.
  • the spectroscopic techniques do not make possible any discrimination between the different CNTs.
  • the present invention solves technical problems and disadvantages previously listed.
  • the inventors have focused on the detection of CNTs by conventional biochemical techniques such as amplification techniques following the functionalization of CNTs by nucleotide sequences.
  • This amplification makes it possible to reach very low detection limits. It also allows detection in real time or at the end of the reaction. It also makes it possible to quantify CNTs.
  • nucleotide sequences mainly consist of nucleotides (A, T, C, G, U or others) that can be associated in an infinity of positions thus constituting a primary sequence that can be likened to a bar code.
  • the present invention relates to a method for detecting, possibly identifying and possibly quantifying at least one carbon nanotube possibly present in a sample comprising the steps of:
  • step (b) detecting, possibly identifying and possibly quantifying the amplification product possibly obtained following step (a).
  • the carbon nanotube that the sample is likely to contain has been functionalized by a nucleotide sequence prior to sampling a sample likely to contain such a carbon nanotube and this, in particular during the process for preparing said carbon nanotube.
  • the process according to the present invention advantageously comprises the following successive steps consisting in: a1) preparing at least one carbon nanotube functionalized with at least one nucleotide sequence; bi) taking a sample that may contain said carbon nanotube;
  • step (ci) subjecting said sample to conditions allowing the amplification of said nucleotide sequence by using primers able to amplify said nucleotide sequence; and di) detecting, optionally identifying and possibly quantifying the amplification product possibly obtained following step (ci).
  • functionalization makes it possible to detect and identify the carbon nanotube present in a sample. Indeed, during the preparation of said nanotube, its functionalization with a particular nucleotide sequence allows the traceability of said nanotube. This form of implementation is particularly suitable for quality control and checking the production of CNTs.
  • the carbon nanotube that the sample is likely to contain is functionalized by a nucleotide sequence following the sampling of said sample.
  • the process according to the present invention advantageously comprises the following successive steps consisting in: ⁇ 2) bringing said sample into contact with at least one nucleotide sequence under conditions allowing the functionalization of the nanotube (s) possibly present (s) by said nucleotide sequence; b 2 ) eliminating any nucleotide sequence not involved in the functionalization;
  • the sample used may be any sample, liquid or solid, likely to contain or be contaminated by one (or more) nanotube (s) of carbon.
  • said sample is selected from the group consisting of a biological sample; a sample of city, river, sea, lake, subterranean water or air-cooled towers; an air sample; a sample of earth; a sample obtained at an industrial site or one of their mixtures.
  • biological sample is meant in the context of the present invention a sample obtained from a plant or animal organism such as a human, living or dead. This biological sample can in particular be a sample obtained from an entire plant or a part of a plant such as the stem, the roots, the flowers, the leaves, the seeds or the sap.
  • This biological sample can also be any fluid naturally secreted or excreted from a human or animal body or any fluid recovered, from a human or animal body such as blood, blood serum, blood plasma, lymph, saliva, sputum, tears, sweat, sperm, urine, stool, milk, cerebrospinal fluid, interstitial fluid, isolated bone marrow fluid, mucus respiratory tract, intestinal or genitourinary tract, cell extracts, tissue extracts and organ extracts.
  • any fluid naturally secreted or excreted from a human or animal body such as blood, blood serum, blood plasma, lymph, saliva, sputum, tears, sweat, sperm, urine, stool, milk, cerebrospinal fluid, interstitial fluid, isolated bone marrow fluid, mucus respiratory tract, intestinal or genitourinary tract, cell extracts, tissue extracts and organ extracts.
  • sample obtained on an industrial site is meant, in the context of the present invention, a sample obtained on any industrial site and, in particular, a site on which are produced, packaged and / or stored carbon nanotubes or an industrial waste site.
  • This sample may be in the form of dust collected in particular on the ground, on any production device or on any aeration filter.
  • the sample used in the context of the present invention may have a very variable volume and may have been obtained by any technique known to those skilled in the art such as extraction, aspiration, sampling or washing.
  • said sample may undergo a preparative treatment such as enzymatic treatment, grinding, dilution, solubilization, centrifugation and / or filtration.
  • a preferred enzymatic treatment consists in subjecting said sample to the action of at least one nuclease such as a RNAse, a DNAse and / or an endonuclease and this in order to eliminate any nucleotide sequence present in the sample and likely to give "false" positives, it being understood that the employed enzyme is inactive with respect to the end by which the nucleotide sequence is attached to the CNT.
  • This treatment with one (or more) nuclease (s) is particularly suitable for the second form of implementation of the method according to the invention.
  • said sample advantageously undergoes a preparative treatment aimed at isolating and / or purifying the CNTs that may be present and this, prior to their functionalization, ie before the step ( ⁇ 2 ) of the process.
  • This preparative treatment is used to eliminate any element other than a NTC present in the sample and capable of being functionalized by the nucleotide sequence and to give "false" positives.
  • Such preparative treatment is well known to those skilled in the art and consists of conventional purification such as centrifugation.
  • nucleotide sequence used herein is equivalent to the following terms and expressions: "nucleic acid”, “polynucleotide”, “nucleotide molecule”, “polynucleotide sequence”.
  • the nucleotide sequence in the context of the present invention is advantageously chosen from the group consisting of an optionally modified oligonucleotide; an optionally modified deoxyribonucleic acid (DNA), such as DNA, single-stranded or double-stranded, genomic, chromosomal, chloroplast, plasmidic, mitochondrial, recombinant or complementary; a ribonucleic acid (RNA), optionally modified, such as a messenger RNA, ribosomal, transfer; a portion and a fragment thereof.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • oligonucleotide (or DNA or RNA) modified is meant, in the context of the present invention, an oligonucleotide (or a DNA or a RNA), natural or synthetic, chemically modified in particular to increase the efficiency and selectivity during functionalization of CNTs.
  • an oligonucleotide (or a DNA or a RNA) natural or synthetic, chemically modified in particular to increase the efficiency and selectivity during functionalization of CNTs.
  • chemical modifications mention may be made of introducing an amine or a thiol at the 5 '-terminal end of the nucleotide sequence. With these functions, the nucleotide sequence can react with activated carboxylic acids [9] or maleimides [10] which have been grafted onto CNTs. Covalent bond formation was thus formed between the carbon nanotube and the nucleotide sequence.
  • nucleotide sequence likely to be used in the context of the present invention can be extracted from living organisms such as animals, plants, yeasts, bacteria, fungi or synthesized chemically. Techniques for extracting a nucleotide sequence from an organism as well as techniques for synthesizing a nucleotide sequence are well known to those skilled in the art.
  • the nucleotide sequence used in the context of the process according to the present invention is a non-natural synthetic sequence, especially prepared in a manner.
  • the nucleotide sequence which can be used in the context of the present invention advantageously comprises from 20 to 3000 nucleotides, in particular from 20 to 1000 nucleotides, in particular from 30 to 150 nucleotides and, more particularly, from 40 to 120 nucleotides.
  • the nucleotide sequence may have an identical size or comprise, for example, advantageously from 20 to 100 nucleotides, in particular from 30 to 80 nucleotides and, in particular, from 40 to 60 nucleotides.
  • Any genetic sequence encountered in nature or not is usable since this form of implementation provides a sample treatment to eliminate any nucleotide sequence present in the latter, prior to the functionalization step ( ⁇ 2) of the process.
  • the number of blocks may be variable and the state of the art in the synthesis of oligonucleotides makes it possible to envisage constructions comprising up to 2 external blocks (hereinafter referred to as B blocks) of 15 bases constituting the sequences recognized by the primers in steps (a), (ci) and (C2) and 6 internal blocks of 15 bases, for a total length of 120 bases.
  • B blocks can be generic, that is, the same consensus sequences have been chosen by all NTC producers. They are therefore identical irrespective of the origin of the CNTs and there will always be amplification during steps (a), (ci) and (C2), if CNTs are indeed present in the sample tested. They can also be specific and correspond a priori to rather general information such as the production site, each site being defined by a particular pair of primers.
  • the internal blocks mainly used during the detection steps and in particular for the hybridization on a microarray or for the hybridization of a specific probe used during the real-time PCR may have sequences corresponding to different information such as the class the toxicity of the CNT, the elimination procedure to be followed, its possible chemical modification, its number of walls, its average length or its average width.
  • the sequences used for all the coding blocks advantageously correspond to no genetic sequence encountered in nature so as not to have "false" positives.
  • the nucleotide sequence present on the CNTs may be composed of blocks of different compositions and sequences.
  • the construction of the polynucleotides may also comprise a spacer sequence.
  • spacer sequence is intended to mean a sequence of about ten bases which spaces the coding zone of the nucleotide sequence of the functionalized NTC. This spacer sequence makes it possible to reduce the steric hindrance due to the CNT which can reduce the amplification efficiency during the steps
  • the present invention applies to any type of carbon nanotubes and whatever their method of preparation.
  • the carbon nanotubes to be detected, possibly to be identified and possibly quantified via the method according to the invention may be single-layer graphene nanotubes (SWNT), graphene multilayer nanotubes (MWNT) or a mixture of SWNT nanotubes and MWNT nanotubes.
  • SWNT single-layer graphene nanotubes
  • MWNT graphene multilayer nanotubes
  • These nanotubes can have a length of between 10 nm and 10 mm, in particular between 100 nm and 10 ⁇ m, in particular between 500 nm and 3 ⁇ m.
  • the present invention requires the functionalization of carbon nanotubes by one (or more) nucleotide sequence (s). As already explained, this functionalization may take place before sampling of the sample to be tested (first embodiment of the method according to the invention) or after said sampling (second form of implementation).
  • the time interval separating the steps (ai) and (bi) or the preliminary sampling of the sample and the step ( ⁇ 2) can be of the order of a few minutes, a few hours, several weeks or even several months.
  • CNTs Functionalization of NTCs by biomolecules has been extensively studied for biological and biomedical applications.
  • the functionalization methods of CNTs can be divided into two categories: covalent functionalizations and non-covalent functionalizations such as physio-adsorptions.
  • nucleotide sequence in the context of the process according to the invention and especially in the context of the steps (a). ) and ( ⁇ 2), the nucleotide sequence covalently binds to said nanotube (s).
  • nucleotide sequence covalently binds to said nanotube (s).
  • several identical or different nucleotide sequences can be covalently attached to the same CNT.
  • this covalent bond may be indirect.
  • the functionalization of the CNTs by one (or more) nucleotide sequence (s) is via a spacer.
  • spacer is meant in the context of the present invention a chemical compound capable of covalently bonding, on the one hand, to a CNT and, on the other hand, to a nucleotide sequence.
  • spacer thus comprises two distinct chemical functions capable of forming a covalent bond, one with a group carried by the CNT and the other with a group carried by the nucleotide sequence.
  • the covalent and indirect bond is via a spacer having at least two different chemical functions, identical or different, selected from the group consisting of a carboxyl function (capable of reacting with an amine function or alcohol), an aryl group (such that pyrene, naphthalene or polyaromatics), a radical entity, a hydroxyl function or an alcohol function (capable of reacting with a carboxyl or isocyanate function), an amine function (capable of reacting with an ester function), an ester function (capable of reacting with with an amino function), an aldehyde function (capable of reacting with a hydrazide function), a hydrazide function (capable of reacting with an aldehyde function), a ketone function (capable of reacting with two alcohol functions, acetalysis), an epoxy function (capable of reacting with an amine function), an isocyanate function (capable of reacting with a hydroxyl function), a maleimide
  • aryl group is meant, in the context of the present invention, an aromatic or heteroaromatic carbon structure, optionally mono- or polysubstituted, of 3 to 30 carbon atoms, consisting of one (or more) ring (s) aromatic (s) or heteroaromatic (s) each having 3 to 8 atoms, the (or) heteroatom (s) may be N, O, P or S.
  • the substituent (s) may contain one or more heteroatoms, such as N, O, F, Cl, P, Si, Br or S as well as C1-C6 alkyl groups.
  • polyaromatic aryl is meant an aryl as previously defined having from 2 to 10 aromatic (s) or heteroaromatic (s) cycle (s) and especially from 2 to 5 aromatic or heteroaromatic cycle (s).
  • alkyl group is meant, in the context of the present invention, a linear, branched or cyclic, optionally substituted alkyl group, of 1 to 16 carbon atoms, in particular of 1 to 12 carbon atoms, in particular of 1 to 8 carbon atoms, especially 1 to 6 carbon atoms and, more particularly, 1 to 3 carbon atoms.
  • the substituent (s) may contain one or more heteroatoms, such as N, O, F, Cl, P, Si, Br or S as well as C1-C6 alkyl groups.
  • the alkyl group used in the context of the present invention is a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group or a cyclopropyl group.
  • spacers that may be used in the context of the present invention, mention may be made of the spacers described in particular in international application WO 03/053846 [12] p-azidobenzoyl hydrazide, N- ⁇ -maleimidocaproic acid Sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxylate and N- (p-maleimidophenyl) -isocyanate.
  • CNTs have very little reactivity
  • the covalent functionalization of CNTs by biomolecules such as a nucleotide sequence is often done in two steps: the generation of reactive sites on CNTs followed by the reaction of these sites with biomolecules or spacers .
  • the functionalization step comprises two substeps consisting in: (i) subjecting the sample or said nanotube (s) to conditions allowing the formation of at least one reactive entity on the surface of a carbon nanotube, and then
  • the reactive entity formed on the surface of a CNT during step (i) has a group chosen from the group consisting of a carboxyl function, a polyaromatic aryl type aryl group, a radical entity and a hydroxyl function. , an alcohol function, an amine function, an ester function, an aldehyde function, a hydrazide function, a ketone function, an epoxy function, an isocyanate function, a maleimide function, a diene and a thiol function or an alkyl group such as above defined, substituted by such a grouping.
  • Concerning step (i) there are reviews in the literature on the covalent functionalization of CNTs [13].
  • oxidation CNTs with strong oxidants such as HNO 3 / H 2 SO 4 [14], H 2 O 2 [15], KMnO 4 / H 2 SO 4 [16], etc.
  • HNO 3 / H 2 SO 4 [14] H 2 O 2 [15]
  • KMnO 4 / H 2 SO 4 [16] oxidation CNTs with strong oxidants
  • oxygen functions such as alcohol, carboxyl and ketone functions on the ends or defects of the CNTs
  • NTCs carrying one (or more) reactive entity (s) such as previously defined (s) can then react directly with a
  • step (ii) and in the case of a reaction involving a spacer, the latter may react with the nucleotide sequence, before, during or after the reaction of said spacer with the CNT.
  • nucleotide sequence binds non-covalent to said nanotube (s). Indeed, several nucleotide sequences, identical or different, can bind non-covalently to the same CNT.
  • the hydrophobic aromatic surface of the CNTs can be functionalised by nucleotide sequences non-covalently outside or inside the CNTs.
  • one (or more) nucleotide sequence (s) can enter the cavity of an open MWNT, and the transport of this (or these) nucleotide sequence (s) to the The interior of the MWNT can be monitored by fluorescence [20].
  • the immobilization of the nucleotide sequences on the CNTs is then through hydrophobic interactions and Van der Waal interactions, the hydrophobic interaction playing a more important role.
  • non-covalent functionalization lies in the fact that it retains the structure of the CNTs. It is thus possible to compare the properties of CNTs before and after functionalization, such as electronic and spectroscopic properties, which may be important for some applications.
  • this non-covalent bond may be indirect.
  • the functionalization of CNTs by one (or more) nucleotide sequence (s) may be via an intermediate molecule capable of binding non-covalently to said CNT and of binding, covalently or non-covalently, to said nucleotide sequence.
  • said intermediate molecule covalently binds to said nucleotide sequence and this via a group selected from the group consisting of a carboxyl function, an aryl group, a radical entity, a hydroxyl function, an alcohol function, an amine function, an ester function, an aldehyde function, a hydrazide function, a ketone function, an epoxy function, an isocyanate function, a maleimide function, a diene and a thiol function or via an alkyl group as defined above, substituted with such a group.
  • a group selected from the group consisting of a carboxyl function, an aryl group, a radical entity, a hydroxyl function, an alcohol function, an amine function, an ester function, an aldehyde function, a hydrazide function, a ketone function, an epoxy function, an isocyanate function, a maleimide function, a diene and a thiol function or via an al
  • pyrene adsorbs strongly on the surface of the NTC by " ⁇ - ⁇ stacking".
  • intermediate molecules there may be mentioned a pyrene derivative having at least one group as defined above and, in particular, the ester of 1-pyrenebutyric acid and N-hydroxysuccinimide capable of reacting with a amino function carried by said nucleotide sequence.
  • step (b2) consists in eliminating any nucleotide sequence having not functionalized a NTC and this, to avoid "false" positives due to free nucleotide sequences.
  • step (b2) can comprise at least one washing, at least one centrifugation and / or at least one filtration, or any other means within the reach of the person skilled in the art in its current practice such as dialysis or ' ultrafiltration .
  • a buffer for the appropriate washing (s) depending on the type of functionalization used (covalent or non-covalent).
  • this buffer may be water or PBS.
  • the methods of amplification of a nucleotide sequence are well known today and rely on the use of a polymerase enzyme which has the property of faithfully copying a genetic sequence of a polynucleotide from a priming zone (double-stranded area).
  • the amplification implemented in steps (a), (ci) or (C2) can also be amplification by polymerase chain reaction or PCR (acronym for "Polymerase Chain Reaction ”) that any PCR variant known to those skilled in the art such as asymmetric PCR, interlaced thermal asymmetric PCR, temperature gradient PCR, endpoint PCR, multiplex PCR, time PCR real (or quantitative) RT-PCR (acronym for "Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction"), a multiplexed RT-PCR, a NASBA (acronym for
  • the amplification method implemented in the context of the present invention may also include improvements such as "hot start”, “touchdown” techniques or the use of dUTP instead of dTTPs for decontamination by the UNG. (acronym for "Uracil-DNA glycosylase”) of any new sample.
  • RT-PCR reverse transcription followed by polymerase chain reaction.
  • An RT-PCR thus comprises two steps: a reverse transcription step, ie a synthesis of a single-stranded DNA complementary to an RNA sequence, implementing a reverse transcriptase followed by a chain amplification step by polymerase.
  • multiplex PCR is meant an amplification method for amplifying more than one amplicon at a time. This technique uses a set of amplification primer pairs, each primer pair being designed or adapted to amplify a different nucleotide sequence.
  • multiplex RT-PCR is meant a multiplex PCR as defined above preceded by reverse transcription as previously defined.
  • Real-time PCR is understood to mean an amplification method that makes it possible to detect and / or to quantify the presence of the amplicons during the cycles of PCR notably thanks to a fluorescent marker. Amplification of the amplicons or the signal related to the amount of amplicons formed during the PCR cycles is used for the detection and / or quantification of a given nucleotide sequence in the solution subjected to PCR.
  • NASBA is meant a method of RNA amplification without temperature change by employing a promoter primer for T7-RNA polymerase, reverse transcriptase, dNTPs (deoxyribonucleotide triphosphate) and NTPs (ribonucleotide triphosphates), and that a RNAse-H.
  • LCR is meant an amplification method involving a DNA ligase and two primers complementary to the target and adjacent DNA which are linked together by the DNA ligase.
  • TMA is meant an isothermal method of RNA amplification requiring two enzymes which are a reverse transcriptase and an RNA polymerase and two primers with a primer containing a promoter sequence for the RNA polymerase and the other primer capable of to bind to the neosynthesized DNA sequence.
  • the conditions used in steps (a), (ci) and (C2) include in particular the presence of a reaction medium and temperature conditions.
  • the reaction mixture used during steps (a), (Ci) and (C 2 ) may be any PCR reagent mixture or any commercially available PCR variant as the kits sold by the companies. Roche Applied Science or Applied Biosystems.
  • (C2) may have any of the reaction mixtures described in the state of the art for PCR or any PCR variant. Those skilled in the art will be able to prepare such a reaction mixture depending on the type of PCR implemented during steps (a), (ci) and (C2) according to the invention.
  • the reaction mixture comprises one or more element (s) chosen from at least one enzyme selected from the group consisting of a DNA or RNA polymerase such as Taq polymerase or T7-RNA polymerase, a reverse transcriptase, a RNAse-H and a DNA ligase; a salt such as TRIS (for "trishydroxymethylaminomethane"), KCl, NaCl or MgCl 2; optionally labeled deoxyribonucleotide triphosphates such as dATP, dGTP, dTTP, dCTP and optionally dUTP; optionally labeled ribonucleotide triphosphates such as ATP, GTP, TTP, UTP, CTP; at least one pair of primers, specific or degenerate, which may comprise from 10 to 100 base pairs, in particular from 15 to 50 base pairs and, in particular, from 15 to 35 base pairs; and an oligo-dT or specific primer especially useful for reverse transcription or for T7
  • reaction mixture may contain other additives and in particular additives known to improve the effectiveness of a PCR such as BSA (for "Bovine Serum Albumin"), betaine, formamide, dimethylsulfoxide, gelatin, glycerol, spermidine, ammonium sulfate, Acetamide or Amide C2, Tween-20, polyethylene glycol (PEG) 6000, proteins such as "Single Strand binding protein from CoIi TM marketed by Sigma Aldrich (increase in the specificity of the reaction), or the "Gene32 Protein T4 from E.
  • BSA for "Bovine Serum Albumin”
  • betaine formamide
  • dimethylsulfoxide gelatin
  • glycerol glycerol
  • spermidine ammonium sulfate
  • Acetamide or Amide C2 Triethyl
  • Tween-20 polyethylene glycol (PEG) 6000
  • proteins such as "Single Strand binding protein from CoIi TM marketed by Sigma Al
  • CoIi B infected with T4aml34 phage / amBL292 / amE219" marketed by Roche Applied Science increase in production yield of long PCR products, or the yield of the reaction in the presence of inhibitors such as humic acid), RNase inhibitors such as Ribonuclease Inhibitor or Diethyl pyrocarbonate which improve the yield of the transcriptic step. reverse on RT-PCR.
  • This reaction mixture may contain, when the amplification of steps (a), (ci) and (C2) is a multiplexed RT-PCR or a multiplexed PCR, from 2 to 100 different primer pairs, each pair of primers being specific or degenerate and may comprise from 10 to 100 base pairs, in particular from 15 to 50 base pairs and, in particular, from 15 to 35 base pairs.
  • An example of a reaction mixture that can be used for PCR amplification during steps (a), (ci) and (C2) of the invention comprises between 50 and 100 mM Tris, between 10 and 100 mM and, advantageously, 50 mM KCl (or NaCl), between 1 and 5 mM MgCl 2 , between 20 ⁇ M and 1 mM of a mixture of dNTPs containing dCTP , dATTP, dTTP, dGTP and optionally dUTP, between 0.01 and 0.2 U / ⁇ l of the Taq Polymerase hot start or not, primers comprising from 10 to 100 base pairs, in particular from 15 to 50 base pairs and in particular from 15 to 35 base pairs and which may be specific or degenerate. Each primer is advantageously present in this reaction mixture at a concentration of between 1 and 200 nM and in particular between 10 and 100 nM.
  • the latter can last from 5 to 90 min, typically 30 min, and is carried out at a temperature between and 60 ° C.
  • steps (a), (ci) and (c 2 ) are not an isothermal amplification, thermal cycles are necessary. All conditions of temperature and duration for the various cycles (denaturation, hybridization and elongation), known to those skilled in the art and appropriate to the type of PCR used during these steps, are usable.
  • the amplification during steps (a), (ci) and (C 2 ) and in particular PCR can comprise two temperatures with a hybridization-elongation stage of between 50 and 70 ° C., advantageously 60 ° C., maintained for 5 to 300 seconds and a denaturation plateau at 95 ° C held for 1 to 30 seconds; comprising three temperatures with a hybridization plateau of between 50 and 65 ° C., advantageously 60 ° C., maintained for 5 to 300 seconds, an elongation stage between 65 ° C.
  • reaction during steps (a), (ci) and (C2) can be carried out in standard commercial plastic tubes and in particular with any thermocycler.
  • the reaction volumes are in this case between 5 and 100 .mu.l.
  • the reaction during steps (a), (ci) and (C2) can be carried out using a microsystem suitable for PCR or RT-PCR such as a "PCR chip".
  • the reaction volumes are much smaller and typically between 10 ni and 1 .mu.l.
  • microsystems have the advantage of being very small and adapted for the development of portable analysis systems that can be used directly on the implementation site of the method according to the invention such as a production site of NTC or a research laboratory [21].
  • Preamplification of the sample in larger volume on the microsystem or not can be performed if necessary to improve the detection limit of the method. In this case, ten PCR cycles can be performed for this pre-amplification step.
  • the detection of the (or any) product (s) amplified during steps (a), (ci) and (C2) can be done during steps (b), (di) and (d). 2 ), using all methods suitable for the detection of an amplification product.
  • steps (b), (di) and (d 2 ) we can mention: the electrophoresis-type methods that make it possible to detect the amplification product after migration in a gel or other suitable matrix, the migration distance being related to the size of said product; hybridization methods on solid surfaces; and or
  • the reaction mixture obtained following steps (a), (ci) and (C2) and optionally containing at least one amplification product is brought into contact with a device whose surface has was previously functionalized with oligonucleotides of known sequence.
  • the surface can be functionalized with oligonucleotides of different sequences by locating each deposit in the form of spots, for example.
  • Commercial devices such as Affymetrix chips, or Agilent chips are particularly usable.
  • Conventional techniques for the deposition of oligonucleotides on solid surfaces (Spotting with an oligonucleotide robot on a functionalized surface or in situ synthesis) are suitable for the preparation of detection devices by hybridization.
  • reaction mixture obtained following steps (a), (ci) and (C2) and possibly containing at least one amplification product can be deposited either without modification on the device or by adding a solution for optimizing the reaction mixture for hybridization in terms of selectivity for oligonucleotide sequence and hybridization kinetics.
  • This optimized buffer may contain one or more species known in the state of the art and chosen from among the monovalent salt (s) such as by for example NaCl or KCl; a
  • any element that does not hybridize with the oligonucleotides attached to the surface is removed by a rinsing step.
  • Various methods can then be used to detect whether there has been hybridization between certain oligonucleotides attached to the surface and an amplification product obtained in solution after steps (a), (ci) and (C2). It is possible to use marked primers and / or labeled dNTPs during the amplification of steps (a), (ci) and (C2).
  • the markers may contain detectable species such as radioactive or fluorescent molecules. In this case, the detection is done directly after the hybridization and rinsing phases. Also, when amplification, some dNTPs or NTPs carry a function (ex: biotin) that can be recognized by an enzyme or a protein-enzyme conjugate.
  • the enzyme catalyzes the transformation of the substrate into a product and the product is detected optically or electrically. It is also possible to directly detect the hybridization by electrical methods if the functionalized device for hybridization allows it. It is also possible to proceed to a second step after hybridization-washing for the detection such as a secondary hybridization or a reaction with a substrate bound to the amplification product obtained after the steps (a), (ci) and (C2) . The detection of the substrate can then be done by enzymatic reactions. Thus said secondary hybridization can be done with a detection probe carrying an enzyme and a substrate is provided for this enzyme. The enzyme catalyzes the transformation of the substrate into product and the product is detected optically or electrically.
  • the method advantageously implemented is the use of labeled primers and / or dNTPs labeled with fluorescent molecules and fluorescence detection of the hybridization product.
  • steps (a) and (b), (ci) and (di) or (C2) and (cb) occur simultaneously or almost simultaneously since the detection and possible quantification can be performed at each thermal cycle ie during amplification or end point ie after the last thermal cycle so after amplification.
  • At least one labeled probe specific for the amplification product that can be obtained following step (a), (ci) or (C2) can be added to the reaction medium.
  • labeled probe is meant, in the context of the present invention, a fluorescent probe capable of binding either on the double-stranded DNA (SYBR technology where there is an intercalant) or on a specific DNA sequence (Taqman and Beacon technology).
  • the specific labeled probes can be of any kind among the probes known and described in the state of the art.
  • specific labeled probes that may be used in the context of the present invention, mention may be made of TaqMan probes, molecular beacons, Scorpion probes and LNA probes and any other probe that makes it possible to carry out real-time PCRs.
  • the detection will be by fluorescence measurement at each thermal cycle or end point, that is to say after the last thermal cycle.
  • PCR with non-specific detection using a double-stranded DNA intercalator can be initially performed: it makes it possible to demonstrate a double-stranded structure involving a primer of the reaction mixture and a nucleotide sequence present in the sample. If this non-specific detection is positive, a second analysis can be performed using real-time PCR and / or DNA hybridization to find out which nucleotide sequence (s) is (are) present. (s) in the sample.
  • kits of elements comprising: at least one element chosen from at least one enzyme such as a thermostable DNA or RNA polymerase such as Taq polymerase or T7-RNA polymerase, a reverse transcriptase, an RNase-H and a DNA ligase; a salt such as TRIS (for "trishydroxymethylaminomethane"), KCl, NaCl or MgCl 2; optionally labeled deoxyribonucleotide triphosphates such as dATP, dGTP, dTTP, dCTP and optionally dUTP; optionally labeled ribonucleotide triphosphates such as ATP, CTP, TTP, UTP and GTP; at least one pair of optionally labeled, specific or degenerate primers, which may comprise from 10 to 100 base pairs, in particular from 15 to 50 base pairs and, in particular, from 15 to 35 base pairs; an oligo-dT or specific primers, which may comprise from 10 to 100 base pairs
  • Said kit may further comprise one or more additives as previously described and / or one or more device (s) and microdevice (s) such as previously described (FIG. s).
  • Figure 1 provides a representative diagram of the functionalization of CNTs by DNA.
  • Figure 2 shows the fluorescence during the real-time PCR in a 65 ni on-chip chip operating by electrowetting (rhombic curve) and in a conventional plastic tube for real-time PCR with 10 ⁇ l of solution (curve with squares ).
  • FIG. 3 presents a reference curve for the quantitative detection of nanotubes functionalized with the threshold cycle (or "Ct” for “Cycle treshold”) as a function of the concentration of functionalized nanotubes expressed as nanotubes / ⁇ l.
  • the nanotubes used are multiwall nanotubes (MWNT) supplied by Arkema. DNA was synthesized with an amine at the 5'-terminal end.
  • MWNT multiwall nanotubes
  • the protocol for the covalent functionalization of MWNTs by DNA comprises three steps represented in FIG. 1 and consisting of: oxidation of MWNTs to generate carboxylic groups on MWNTs; activation of the carboxylic groups with N-hydroxysuccinimide (NHS); the coupling of the activated carboxylic groups with the amines of the DNA.
  • steps represented in FIG. 1 consisting of: oxidation of MWNTs to generate carboxylic groups on MWNTs; activation of the carboxylic groups with N-hydroxysuccinimide (NHS); the coupling of the activated carboxylic groups with the amines of the DNA.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DMF dicyclohexylcarbodiimide
  • DMAP 4-Dimethylaminopyridine
  • MWNT Activated with I 1 DNA Activated MWNTs ( ⁇ 2 mg) were dispersed in DMF (5 ml) by sonication. 10 ⁇ l of oligonucleotides (76 bases, 100 ⁇ M) were diluted in 3 ml of Na 2 HPO 4 (0.2 M). The oligonucleotide solution was added dropwise into the activated MWNT suspension with magnetic stirring.
  • the coupling reaction was carried out at room temperature for 18 h. After the reaction, the functionalized MWNTs were recovered on a filtration membrane and rinsed 3 times with DMF and 3 times with deionized water (15 ml each rinse).
  • Activated MWNTs and functionalized MWNTs were characterized by Attenuated Total Reflection Infrared (ATR-IR) spectroscopy and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS).
  • ATR-IR Attenuated Total Reflection Infrared
  • XPS X-ray photoelectron spectroscopy
  • the functionalized MWNTs i.e. coupled with the DNA were characterized by XPS.
  • the functioning of the microsystem is based on the principle of electrowetting and allows the following unit microfluidic steps to be carried out: formation of drops of known and reproducible volume, displacement of drops, mixing of two drops of possibly different solutions with homogenization in a few seconds [21] .
  • the whole of the chip was heated during the thermal cycles of PCR.
  • PCR with a suspension of NTC functionalized with oligonucleotides was performed on the chip.
  • the sequence of the oligonucleotide grafted onto the CNTs is 5 '-NH2-C6-TTTTTCGGGTAACGTCAATGAG CAAAAAAATATCATTGGTGTCGGATACCCAAGGAGCATGTATTAGGCACGCCGC-3' (SEQ ID NO: 1 in the attached sequence listing).
  • the sequences of the primers are CGGGTAACGTCAATG AGCAAA (forward primer, SEQ ID No. 2 in the attached sequence listing) and GCGGCGTGCCTAATACATGC (reverse primer, SEQ ID No. 3 in the attached sequence listing) and that of the probe: -FAM-CACCAATGATATTTT-MGB-3 '(SEQ ID NO: 4 in the attached sequence listing).
  • the reaction mixture contains the AmpliTaq GoId enzyme buffer without MgCl 2 Ix (ABI), BSA at 0.8 mg / mL, MgCl 2 at 3 mM, nucleotides (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) at 200 ⁇ M, betaine 450 mM and AmpliTaq gold 0.5 U / ⁇ l (ABI).
  • the sample is first mixed in tube with the PCR reagents for the first step of denaturation and activation of Taq Polymerase (10 min at 95 ° C).
  • This solution is then introduced on the chip through a hole of the cover and by activation of the electrodes.
  • a drop of 65 ⁇ L of this solution is then formed by activation of the electrodes and then the thermal cycles are carried out (95 ° C 10 sec, 60 ° C dry) by heating the whole chip with a Peltier element in contact with the chip. Reading from the fluorescence of the drop is at the end of each thermal plateau at 60 ° C. with an optical microscope.
  • sample + reagents for the PCR 10 .mu.l of the same initial reaction mixture (sample + reagents for the PCR) was placed in a reaction tube for the PCR and this one was carried out with a real-time commercial PCR apparatus (Stratagene Mx3005P) with thermal cycles of 60 0 C 60 sec, 95 ° C 60 sec.
  • PCR was performed with successive dilutions of oligonucleotide labeled NTCs prepared according to item 1 above.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé et un kit pour détecter, éventuellement identifier et éventuellement quantifier au moins un nanotube de carbone éventuellement présent dans un échantillon comprenant les étapes consistant à : (a) soumettre ledit échantillon à des conditions permettant l'amplification d'une séquence nucléotidique en utilisant des amorces aptes à amplifier ladite séquence nucléotidique, ledit nanotube de carbone éventuellement présent ayant été fonctionnalisé par ladite séquence nucléotidique préalablement à ladite étape (a), et (b) détecter, éventuellement identifier et éventuellement quantifier le produit d'amplification éventuellement obtenu suite à l'étape (a).

Description

PROCÉDÉ DE DÉTECTION, D'IDENTIFICATION ET/OU DE QUANTIFICATION DE NANOTUBES DE CARBONE
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention appartient au domaine des nanotechnologies et, notamment, au domaine des nano-objets tels que des nanotubes de carbone.
En effet, la présente invention vise à fournir un procédé permettant de détecter, d'identifier et/ou de quantifier des nanotubes de carbone. Le procédé selon l'invention est basé sur la fonctionnalisation des nanotubes par une séquence nucléotidique et sur une amplification biologique à laquelle les nanotubes ainsi fonctionnalisés sont soumis. Le procédé selon l'invention permet d'obtenir une limite de détection des nanotubes très basse et est facile à mettre en œuvre sur le lieu de travail et pour la surveillance de l'environnement. La présente invention propose également un kit pour la mise en œuvre d'un tel procédé.
ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE
Grâce à leurs propriétés exceptionnelles, les nanotubes de carbone (NTC) sont des nanomatériaux très étudiés aujourd'hui. Des milliers de publications scientifiques concernant les NTC sortent chaque année.
Rappelons, tout d'abord, qu'un nanotube de carbone est défini comme un enroulement concentrique d'une ou de plusieurs couches de graphène (pavage d'hexagones de carbone) . On parle d'un nanotube monoparoi ou SWNT (acronyme anglais pour « Single Wall NanoTube ») lorsqu'il s'agit d'une seule couche de graphène et d'un nanotube multi-paroi ou MWNT (acronyme anglais pour « Multi Wall NanoTube ») dans le cas de plusieurs couches de graphène. De par leur structure unique et leurs dimensions caractérisées par un rapport longueur/diamètre élevé, les nanotubes présentent des propriétés mécaniques, électriques et thermiques exceptionnelles.
Grâce à ces propriétés, de plus en plus d'applications utilisant les NTC sont transférées du laboratoire à un produit commercial. Ainsi, les NTC peuvent être déjà trouvés dans les raquettes de tennis, les vélos, les écrans de TV et les pneumatiques, tout comme dans des résines utilisées par l'industrie aérospatiale, la défense, la micro-électronique, etc....
La production de NTC augmentera sans doute de façon importante dans les prochaines années. Par exemple, Bayer, l'un des principaux fournisseurs de NTC, a annoncé une capacité de production de 3000 t de NTC par an en 2012. Dans ce contexte, l'exposition aux NTC, surtout pour les chercheurs dans les laboratoires et les ouvriers industriels, augmentera considérablement au cours des prochaines années. Les NTC pourront également très certainement être disséminés dans l'environnement avec donc des risques éventuels pour la population humaine mais également pour la faune et/ou la flore. En effet, actuellement, un débat intense existe au sujet de la toxicité des NTC : pour certains, les NTC ne sont pas toxiques [1,2] alors que, pour d'autres, ils le sont [3-5] .
Il est donc devenu important de mettre au point une technique pour détecter, quantifier et identifier les NTC sur le lieu de travail et dans l'environnement. La détection des NTC proprement dite est un domaine très peu développé qui n'a fait l'objet que de très peu d'études. En effet, à cause de leurs dimensions nanométriques, les NTC sont très difficilement détectables par des techniques classiques. Ainsi, par exemple, ils ne peuvent pas être détectés par la microscopie optique à contraste de phase, une technique standard pour la détection de fibres [6] . Toutefois, des scientifiques ont proposé la détection des NTC par d'autres méthodes microscopiques ou spectroscopiques [7] .
Les techniques microscopiques, telles que la microscopie à effet tunnel ou STM (acronyme anglais pour « Scanning Tunneling Microscopy ») , la microscopie électronique en transmission ou TEM (acronyme anglais pour « Transmission Electron Microscopy ») , la microscopie électronique à balayage ou SEM (acronyme anglais pour « Scanning Electron Microscopy ») ou la microscopie à force atomique ou AFM (acronyme anglais pour « Atomic Force Microscopy ») , sont des techniques qui peuvent être utilisées pour détecter des NTC. Toutefois, ces techniques ont des sensibilité et sélectivité relativement bonnes. Mais, les conditions d'utilisation de ces techniques sont très critiques pour des analyses de routine. En particulier, cela nécessite que l'on connaisse déjà avec exactitude la localisation des nanotubes de carbone, les techniques précitées n'étant efficaces qu'à la confirmation de la présence dudit NTC. Egalement, elles ne peuvent être mises en œuvre avec des dispositifs portables. Enfin, elles ne permettent pas une identification des nanotubes, ce qui peut être gênant en cas d'incident mais également pour gérer un procédé de production.
Les techniques spectroscopiques, telles que les spectroscopies Raman et de fluorescence, peuvent être adaptées pour l'analyse de routine. Mais la spectroscopie Raman ne montre une sélectivité que pour certains NTC, en particulier les SWNT. Weisman et collaborateurs ont établi une méthode de détection des SWNT par fluorescence dans des organismes intacts [8] . Cette méthode sensible et sélective ne permet de détecter que des SWNT individuels (i.e. monodispersés) . De plus, la nécessité d'intégrer des lasers avec différentes longueurs d'onde dans un dispositif pour détecter, identifier et éventuellement quantifier des NTC notamment lors des procédés de production augmente le prix de revient dudit dispositif et des NTC. Enfin, les techniques spectroscopiques ne rendent possible aucune discrimination entre les différents NTC.
Il existe donc un réel besoin pour un procédé permettant de détecter, éventuellement d' identifier et éventuellement de quantifier un ou plusieurs NTC et ce avec une grande sélectivité et une grande sensibilité. EXPOSE DE L'INVENTION
La présente invention permet de résoudre des problèmes techniques et inconvénients précédemment listés. En effet, les inventeurs se sont intéressés à la détection des NTC par des techniques biochimiques classiques telles que des techniques d'amplification suite à la fonctionnalisation des NTC par des séquences nucléotidiques .
Cette amplification permet d'atteindre des limites de détection très basses. Elle permet également de réaliser une détection en temps réel ou bien en fin de réaction. Elle permet aussi de quantifier les NTC.
D'autre part, la fonctionnalisation des NTC par des séquences nucléotidiques permet une identification de ces NTC. En effet, les séquences nucléotidiques sont principalement constituées de nucléotides (A, T, C, G, U ou autres) pouvant être associés dans une infinité de positions constituant ainsi une séquence primaire pouvant être assimilée à un code barre.
Par conséquent, la présente invention concerne un procédé pour détecter, éventuellement identifier et éventuellement quantifier au moins un nanotube de carbone éventuellement présent dans un échantillon comprenant les étapes consistant à :
(a) soumettre ledit échantillon à des conditions permettant l'amplification d'une séquence nucléotidique en utilisant des amorces aptes à amplifier ladite séquence nucléotidique, ledit nanotube de carbone éventuellement présent ayant été fonctionnalisé par ladite séquence nucléotidique préalablement à ladite étape (a) , et
(b) détecter, éventuellement identifier et éventuellement quantifier le produit d'amplification éventuellement obtenu suite à l'étape (a) .
Dans une première forme de mise en œuvre de la présente invention, le nanotube de carbone que l'échantillon est susceptible de contenir a été fonctionnalisé par une séquence nucléotidique préalablement au prélèvement d'un échantillon susceptible de contenir un tel nanotube de carbone et ce, notamment lors du procédé de préparation dudit nanotube de carbone. Ainsi, le procédé selon la présente invention comprend avantageusement les étapes successives suivantes consistant à : ai) préparer au moins un nanotube de carbone fonctionnalisé par au moins une séquence nucléotidique ; bi) prélever un échantillon susceptible de contenir ledit nanotube de carbone ;
Ci) soumettre ledit échantillon à des conditions permettant l'amplification de ladite séquence nucléotidique en utilisant des amorces aptes à amplifier ladite séquence nucléotidique ; et di) détecter, éventuellement identifier et éventuellement quantifier le produit d'amplification éventuellement obtenu suite à l'étape (ci) . Dans cette forme de mise en œuvre, la fonctionnalisation permet de détecter et d' identifier le nanotube de carbone présent dans un échantillon. En effet, lors de la préparation dudit nanotube, sa fonctionnalisation par une séquence nucléotidique particulière permet la traçabilité dudit nanotube. Cette forme de mise en œuvre est particulièrement adaptée au contrôle qualité et à la vérification de la production des NTC. On peut envisager que, lors de leur préparation, différents lots de NTC répartis en fonction de critères tels que leur nature, leur site de production, leur procédé de préparation, leur classe de toxicité, la procédure d'élimination à suivre, leur éventuelle modification chimique, leur nombre de parois, leur longueur moyenne, leur largeur moyenne soient marqués par des séquences nucléotidiques particulières et spécifiques à chacun des lots. Ainsi, lors de la mise en œuvre du procédé selon l'invention, un mélange d'amorces aptes à amplifier ces séquences nucléotidiques peut être utilisé lors de l'étape (bi) afin d' identifier avec précision les nanotubes présents dans l'échantillon.
Dans une seconde forme de mise en œuvre de la présente invention, le nanotube de carbone que l'échantillon est susceptible de contenir est fonctionnalisé par une séquence nucléotidique suite au prélèvement dudit échantillon. Ainsi, dans cette forme de mise en œuvre, le procédé selon la présente invention comprend avantageusement les étapes successives suivantes consistant à : β2) mettre en contact ledit échantillon avec au moins une séquence nucléotidique dans des conditions permettant la fonctionnalisation du (ou des) nanotube(s) éventuellement présent (s) par ladite séquence nucléotidique ; b2) éliminer toute séquence nucléotidique non impliquée dans la fonctionnalisation ;
C2) soumettre ledit échantillon à des conditions permettant l'amplification de ladite séquence nucléotidique en utilisant des amorces aptes à amplifier ladite séquence nucléotidique ; et d2) détecter et éventuellement quantifier le produit d'amplification éventuellement obtenu suite à 1' étape (C2) .
Tout ce qui suit comme les définitions et les variantes s'applique au procédé selon la présente invention et notamment à ces deux formes de mise en œuvre, sauf indication contraire explicite.
Dans le cadre de la présente invention, l'échantillon mis en œuvre peut être tout échantillon, liquide ou solide, susceptible de contenir ou d'être contaminé par un (ou plusieurs) nanotube(s) de carbone. Avantageusement, ledit échantillon est choisi dans le groupe constitué par un échantillon biologique ; un échantillon d'eau de ville, de rivière, de mer, de lac, souterraine ou de tours aéro-réfrigérées ; un prélèvement aérien ; un échantillon de terre ; un échantillon obtenu sur un site industriel ou un de leurs mélanges. Par « échantillon biologique », on entend dans le cadre de la présente invention un échantillon obtenu à partir d'un organisme végétal ou animal tel qu'un humain, vivant ou mort. Cet échantillon biologique peut notamment être un échantillon obtenu à partir d'une plante entière ou d'une partie de plante comme la tige, les racines, les fleurs, les feuilles, les graines ou la sève. Cet échantillon biologique peut également être tout fluide naturellement sécrété ou excrété d'un corps humain ou animal ou tout fluide récupéré, à partir d'un corps humain ou animal tel que du sang, du sérum sanguin, du plasma sanguin, de la lymphe, de la salive, un crachat, des larmes, de la sueur, du sperme, de l'urine, des selles, du lait, du liquide céphalo-rachidien, du liquide interstitiel, un fluide isolé de moelle osseuse, un mucus ou fluide du tractus respiratoire, intestinal ou génito-urinaire, des extraits cellulaires, des extraits de tissus et des extraits d'organes.
Par « échantillon obtenu sur un site industriel », on entend, dans le cadre de la présente invention, un prélèvement obtenu sur tout site industriel et, en particulier, un site sur lequel sont produits, conditionnés et/ou stockés des nanotubes de carbone ou un site de rejets industriels. Ce prélèvement peut se présenter sous la forme de poussières notamment récupérées au sol, sur tout appareil de production ou sur tout filtre d'aération.
L'échantillon mis en œuvre dans le cadre de la présente invention peut présenter un volume très variable et peut avoir été obtenu par toute technique connue de l'homme du métier telle qu'une extraction, une aspiration, un prélèvement ou un lavage. De plus, avant la mise en œuvre du procédé selon l'invention, ledit échantillon peut subir un traitement préparatif tel qu'un traitement enzymatique, un broyage, une dilution, une solubilisation, une centrifugation et/ou une filtration. Un traitement enzymatique préféré consiste à soumettre ledit échantillon à l'action d'au moins une nucléase telle qu'une RNAse, une DNAse et/ou une endonucléase et ce afin d'éliminer toute séquence nucléotidique présente dans l'échantillon et susceptible de donner des « faux » positifs, étant entendu que l'enzyme employée est inactive vis-à-vis de l'extrémité par laquelle la séquence nucléotidique est fixée au NTC. Ce traitement par une (ou des) nucléase (s) est particulièrement adapté pour la seconde forme de mise en œuvre du procédé selon l'invention.
Dans le cadre de la seconde forme de mise en œuvre de la présente invention, ledit échantillon subit avantageusement un traitement préparatif visant à isoler et/ou à purifier les NTC éventuellement présents et ce, préalablement à leur fonctionnalisation i.e. préalablement à l'étape (β2) du procédé. Ce traitement préparatif est utilisé afin d'éliminer tout élément autre qu'un NTC présent dans l'échantillon et susceptible d'être fonctionnalisé par la séquence nucléotidique et de donner des « faux » positifs. Un tel traitement préparatif est bien connu de l'homme du métier et consiste en une purification classique comme une centrifugation. L'expression « séquence nucléotidique » utilisée dans la présente est équivalente aux termes et expressions suivants : « acide nucléique », « polynucléotide », « molécule nucléotidique », « séquence polynucléotidique ». La séquence nucléotidique dans le cadre de la présente invention est avantageusement choisie dans le groupe constitué par un oligonucléotide, éventuellement modifié ; un acide désoxyribonucléique (ADN) , éventuellement modifié, tel qu'un ADN, simple-brin ou double-brin, génomique, chromosomique, chloroplastique, plasmidique, mitochondrial, recombinant ou complémentaire ; un acide ribonucléique (ARN), éventuellement modifié, tel qu'un ARN messager, ribosomal, de transfert ; une portion et un fragment de ceux-ci.
Par « oligonucléotide (ou ADN ou ARN) modifié », on entend, dans le cadre de la présente invention, un oligonucléotide (ou un ADN ou un ARN) , naturel ou synthétique, modifié chimiquement notamment pour augmenter l'efficacité et la sélectivité lors de la fonctionnalisation des NTC. Ainsi, à titre d'exemple de modifications chimiques, on peut citer l'introduction d'une aminé ou d'un thiol à l'extrémité 5' -terminale de la séquence nucléotidique. Avec ces fonctions, la séquence nucléotidique peut réagir avec des acides carboxyliques activés [9] ou des maléimides [10] qui ont été greffés sur les NTC. On a ainsi formation de liaison covalente entre le nanotube de carbone et la séquence nucléotidique. La séquence nucléotidique susceptible d'être utilisée dans le cadre de la présente invention peut être extraite d'organismes vivants tels qu'animaux, végétaux, levures, bactéries, champignons ou synthétisée chimiquement. Les techniques permettant d'extraire une séquence nucléotidique d'un organisme tout comme les techniques permettant de synthétiser une séquence nucléotidique sont bien connues de l'homme du métier .
De façon particulièrement avantageuse, la séquence nucléotidique mise en œuvre dans le cadre du procédé selon la présente invention est une séquence synthétique non naturelle, notamment préparée à façon.
La séquence nucléotidique susceptible d'être utilisée dans le cadre de la présente invention comprend avantageusement de 20 à 3000 nucléotides, notamment de 20 à 1000 nucléotides, en particulier de 30 à 150 nucléotides et, plus particulièrement, de 40 à 120 nucléotides.
Dans le cadre de la seconde forme de mise en œuvre du procédé selon l'invention, la séquence nucléotidique peut avoir une taille identique ou comprendre, par exemple, avantageusement de 20 à 100 nucléotides, notamment de 30 à 80 nucléotides et, en particulier, de 40 à 60 nucléotides. Toute séquence génétique rencontrée dans la nature ou non est utilisable puisque cette forme de mise en œuvre prévoit un traitement de l'échantillon visant à éliminer toute séquence nucléotidique présente dans ce dernier, préalablement à la fonctionnalisation à l'étape (β2) du procédé . De plus, il est possible de coder de l'information sur cette séquence nucléotidique et ce, notamment dans le cadre de la première forme de mise en œuvre du procédé selon l'invention. Dans ce cas, ladite séquence nucléotidique associe plusieurs blocs, chaque bloc comprenant entre 10 et 20 bases. Le nombre de blocs peut être variable et l'état de l'art en synthèse d' oligonucléotides permet d'envisager des constructions comprenant jusqu'à 2 blocs externes (ci-après désignés blocs B) de 15 bases constituant les séquences reconnues par les amorces lors des étapes (a) , (ci) et (C2) et 6 blocs internes de 15 bases, pour une longueur totale de 120 bases. Les deux blocs B peuvent être génériques, c'est-à-dire que les mêmes séquences consensus ont été choisies par tous les producteurs de NTC. Elles sont donc identiques quelle que soit l'origine des NTC et il y aura toujours amplification lors des étapes (a) , (ci) et (C2) , si des NTC sont effectivement présents dans l'échantillon testé. Ils peuvent également être spécifiques et correspondre a priori à des informations plutôt générales telles que le site de production, chaque site étant défini par un couple d'amorces particulier.
Les blocs internes principalement utilisés lors des étapes de détection et notamment pour l'hybridation sur microarray ou bien pour l'hybridation d'une sonde spécifique utilisée lors de la PCR en temps réel, peuvent avoir des séquences correspondant à différentes informations telles que la classe de toxicité du NTC, la procédure d'élimination à suivre, son éventuelle modification chimique, son nombre de parois, sa longueur moyenne ou sa largeur moyenne. Les séquences utilisées pour tous les blocs codant ne correspondent avantageusement à aucune séquence génétique rencontrée dans la nature pour ne pas avoir de « faux » positifs. Si cela ne s'avère pas possible, seuls les blocs B seront conçus pour ne coder pour aucune séquence rencontrée dans le monde du vivant ou au moins pour des espèces susceptibles d'être présentes et amplifiées par PCR lors de tests de routine, tels que des bactéries, des virus, des pollens, etc.... Ainsi, selon l'invention, la séquence nucléotidique présente sur les NTC peut être composée de blocs de compositions et de séquences différentes.
La construction des polynucléotides pourra également comprendre une séquence espaceur. Par « séquence espaceur », on entend, dans le cadre de la présente invention, une séquence d'une dizaine de bases qui espace la zone codante de la séquence nucléotidique du NTC fonctionnalisé. Cette séquence espaceur permet de diminuer l'encombrement stérique dû au NTC qui peut diminuer le rendement d'amplification lors des étapes
La présente invention s'applique à tout type de nanotubes de carbone et ce quel que soit leur procédé de préparation. Ainsi, les nanotubes de carbone à détecter, éventuellement à identifier et éventuellement à quantifier via le procédé selon l'invention peuvent être des nanotubes à une seule couche de graphène (SWNT) , des nanotubes à plusieurs couches de graphène (MWNT) ou un mélange de nanotubes SWNT et de nanotubes MWNT. Ces nanotubes peuvent présenter une longueur comprise entre 10 nm et 10 mm, notamment entre 100 nm et 10 μm, en particulier entre 500 nm et 3 μm.
L'homme du métier connait différentes techniques permettant de préparer de tels nanotubes de carbone. A titre d'exemples, on peut citer les procédés physiques basés sur la sublimation du carbone tels que des méthodes d'arc électrique, d'ablation laser ou utilisant un four solaire et les procédés chimiques consistant à pyrolyser des sources carbonées sur des catalyseurs métalliques et s' apparentant au procédé de dépôt chimique en phase vapeur (CVD) tels que notamment le procédé de pyrolyse objet de la demande internationale WO 2004/000727 [11] .
La présente invention nécessite la fonctionnalisation des nanotubes de carbone par une (ou plusieurs) séquence (s) nucléotidique (s) . Comme déjà expliqué, cette fonctionnalisation peut avoir lieu avant le prélèvement de l'échantillon à tester (première forme de mise en œuvre du procédé selon l'invention) ou après ledit prélèvement (seconde forme de mise en œuvre) . L'intervalle de temps séparant les étapes (ai) et (bi) ou le prélèvement préalable de l'échantillon et l'étape (β2) peut être de l'ordre de quelques minutes, quelques heures, plusieurs semaines, voire plusieurs mois.
La fonctionnalisation des NTC par des biomolécules a été beaucoup étudiée pour des applications biologiques et biomédicales. Les méthodes de fonctionnalisation des NTC peuvent être divisées en deux catégories : les fonctionnalisations covalentes et les fonctionnalisations non covalentes telles que des physio-adsorptions .
Par conséquent, dans une première variante, lors de la fonctionnalisation du (ou des) NTC par une (ou plusieurs) séquence (s) nucléotidique (s) dans le cadre du procédé selon l'invention et notamment dans le cadre des étapes (ai) et (β2) , la séquence nucléotidique se lie de façon covalente au (x) dit (s) nanotube (s) . De même, plusieurs séquences nucléotidiques, identiques ou différentes, peuvent se fixer de façon covalente à un même NTC.
De façon avantageuse, cette liaison covalente peut être indirecte. En effet, la fonctionnalisation des NTC par une (ou plusieurs) séquence (s) nucléotidique (s) se fait via un espaceur. Par « espaceur », on entend dans le cadre de la présente invention un composé chimique susceptible de se lier, de façon covalente, d'une part, à un NTC et, d'autre part, à une séquence nucléotidique. Un tel espaceur comprend donc deux fonctions chimiques distinctes et capables de former une liaison covalente, une avec un groupement porté par le NTC et l'autre avec un groupement porté par la séquence nucléotidique. Avantageusement, la liaison covalente et indirecte se fait via un espaceur présentant au moins deux fonctions chimiques distinctes, identiques ou différentes, choisies dans le groupe constitué par une fonction carboxyle (susceptible de réagir avec une fonction aminé ou alcool) , un groupe aryle (tel que le pyrène, le naphtalène ou les polyaromatiques) , une entité radicalaire, une fonction hydroxyle ou une fonction alcool (susceptible de réagir avec une fonction carboxyle ou isocyanate) , une fonction aminé (susceptible de réagir avec une fonction ester) , une fonction ester (susceptible de réagir avec une fonction aminé) , une fonction aldéhyde (susceptible de réagir avec une fonction hydrazide) , une fonction hydrazide (susceptible de réagir avec une fonction aldéhyde) , une fonction cétone (susceptible de réagir avec deux fonctions alcool, acetalysation) , une fonction époxy (susceptible de réagir avec une fonction aminé) , une fonction isocyanate (susceptible de réagir avec une fonction hydroxyle) , une fonction maléimide (susceptible de réagir avec une fonction thiol, une fonction aminé ou un diène) , un diène (susceptible de réagir avec une fonction maléimide) et une fonction thiol (susceptible de réagir avec une fonction maléimide ou une autre fonction thiol) . Par « groupe aryle », on entend, dans le cadre de la présente invention, une structure carbonée aromatique ou hétéroaromatique, éventuellement mono- ou polysubstituée, de 3 à 30 atomes de carbone, constituée d'un (ou plusieurs) cycle (s) aromatique (s) ou hétéroaromatique (s) comportant chacun de 3 à 8 atomes, le (ou les) hétéroatome (s) pouvant être N, O, P ou S . Le (ou les) substituant (s) peut (vent) contenir un ou plusieurs hétéroatome (s) , tels que N, O, F, Cl, P, Si, Br ou S ainsi que des groupes alkyles en Ci à Ce. Par « aryle polyaromatique », on entend un aryle tel que précédemment défini présentant de 2 à 10 cycle (s) aromatique (s) ou hétéroaromatique (s) et notamment de 2 à 5 cycle (s) aromatique (s) ou hétéroaromatique (s) .
L'état de la technique connaît différents espaceurs, disponibles commercialement, utilisables dans le cadre de la présente invention. Ledit espaceur peut être constitué d'un groupe alkyle présentant au moins deux fonctions chimiques distinctes, identiques ou différentes, telles que précédemment définies. Par « groupe alkyle », on entend, dans le cadre de la présente invention un groupe alkyle linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitué, de 1 à 16 atomes de carbone, notamment de 1 à 12 atomes de carbone, en particulier, de 1 à 8 atomes de carbone, tout particulièrement, de 1 à 6 atomes de carbone et, plus particulièrement, de 1 à 3 atomes de carbone. Le (ou les) substituant (s) peut (vent) contenir un ou plusieurs hétéroatome (s) , tels que N, O, F, Cl, P, Si, Br ou S ainsi que des groupes alkyles en Ci à Ce. Avantageusement, le groupe alkyle mis en œuvre dans le cadre de la présente invention est un groupe méthyle, un groupe éthyle, un groupe propyle, un groupe isopropyle ou un groupe cyclopropyle .
A titre d'exemples d' espaceurs utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer, les espaceurs notamment décrits dans la demande internationale WO 03/053846 [12] le p-azidobenzoyl hydrazide, l'acide N-ε-maleimidocaproïque, le suifosuccinimidyl 4- (N-maleimidométhyl) -cyclohexane-1- carboxylate et le N- (p-maleimidophényl) -isocyanate . Comme les NTC sont très peu réactifs, la fonctionnalisation covalente des NTC par des biomolécules telles qu'une séquence nucléotidique se fait souvent en deux étapes : la génération de sites réactifs sur les NTC suivie de la réaction de ces sites avec les biomolécules ou les espaceurs.
Ainsi, dans le cadre du procédé selon la présente invention, l'étape de fonctionnalisation comprend deux sous-étapes consistant à : (i) soumettre l'échantillon ou le (s) dit (s) nanotube(s) à des conditions permettant la formation d'au moins une entité réactive à la surface d'un nanotube de carbone, puis
(ii) mettre en contact ledit échantillon ou le (s) dit (s) nanotube (s) avec au moins une séquence nucléotidique et éventuellement avec un espaceur tel que précédemment défini.
Avantageusement, l'entité réactive formée à la surface d'un NTC lors de l'étape (i) présente un groupement choisi dans le groupe constitué par une fonction carboxyle, un groupe aryle de type aryle polyaromatique, une entité radicalaire, une fonction hydroxyle, une fonction alcool, une fonction aminé, une fonction ester, une fonction aldéhyde, une fonction hydrazide, une fonction cétone, une fonction époxy, une fonction isocyanate, une fonction maléimide, un diène et une fonction thiol ou un groupe alkyle tel que précédemment défini, substitué par un tel groupement. Concernant l'étape (i) , il existe des revues dans la littérature sur la fonctionnalisation covalente des NTC [13] .
On relève ici quelques exemples de méthodes susceptibles d'être mises en œuvre lors de l'étape (i) car générant des entités réactives à la surface de NTC et permettant de greffer des biomolécules telles que des séquences nucléotidiques par la suite : l'oxydation des NTC par des oxydants forts tels que HNO3/H2SO4 [14], H2O2 [15], KMnO4/H2SO4 [16], etc. Une telle oxydation en phase liquide permet de générer des fonctions oxygénées telles que des fonctions alcool, carboxyle et cétone sur les extrémités ou défauts des NTC ; - l'arylation des NTC par du diazonium
[17] ; la fonctionnalisation des NTC par cycloaddition 13-dipolaire [18] ; la fonctionnalisation des NTC par cycloaddition [2+1] [19] .
Ces NTC porteurs d'une (ou plusieurs) entité (s) réactive (s) telle (s) que précédemment définie (s) peuvent ensuite réagir directement avec une
(ou plusieurs) séquence (s) nucléotidique (s) ou avec un (ou plusieurs) espaceur(s) tel (s) que précédemment défini (s) . Lors de l'étape (ii) et dans le cas d'une réaction impliquant un espaceur, ce dernier peut réagir avec la séquence nucléotidique, avant, pendant ou après la réaction dudit espaceur avec le NTC. Dans une seconde variante du procédé selon la présente invention, lors de la fonctionnalisation du
(ou des) NTC par une (ou plusieurs) séquence (s) nucléotidique (s) dans le cadre du procédé selon l'invention et notamment dans le cadre des étapes (ai) et (β2) , la séquence nucléotidique se lie de façon non covalente au (x) dit (s) nanotube (s) . En effet, plusieurs séquences nucléotidiques, identiques ou différentes, peuvent se fixer de façon non covalente à un même NTC.
Grâce à la surface aromatique hydrophobique des NTC, ces derniers peuvent être fonctionnalisés par des séquences nucléotidiques de façon non covalente à l'extérieur ou à l'intérieur des NTC. Par exemple, une (ou plusieurs) séquence (s) nucléotidique (s) peu (ven) t pénétrer dans la cavité d'un MWNT ouvert, et le transport de cette (ou ces) séquence (s) nucléotidique (s) à l'intérieur du MWNT peut être suivi par fluorescence [20] . L' immobilisation des séquences nucléotidiques sur les NTC se fait alors par des interactions hydrophobiques et des interactions Van der Waal, l'interaction hydrophobique jouant un rôle plus important .
L'avantage d'une fonctionnalisation non covalente réside dans le fait qu'elle conserve la structure des NTC. Il est, ainsi, possible de comparer les propriétés des NTC avant et après la fonctionnalisation, telles que les propriétés électroniques et spectroscopiques, ce qui peut être important pour certaines applications. De façon avantageuse, cette liaison non covalente peut être indirecte. En effet, la fonctionnalisation des NTC par une (ou plusieurs) séquence (s) nucléotidique (s) peut se faire via une molécule intermédiaire capable de se lier de façon non covalente audit NTC et de se lier, de façon covalente ou non covalente, à ladite séquence nucléotidique. Plus particulièrement, ladite molécule intermédiaire se lie de façon covalente à ladite séquence nucléotidique et ce via un groupement choisi dans le groupe constitué par une fonction carboxyle, un groupe aryle, une entité radicalaire, une fonction hydroxyle, une fonction alcool, une fonction aminé, une fonction ester, une fonction aldéhyde, une fonction hydrazide, une fonction cétone, une fonction époxy, une fonction isocyanate, une fonction maléimide, un diène et une fonction thiol ou via un groupe alkyle tel que précédemment défini, substitué par un tel groupement.
En effet, il est connu que le pyrène s'adsorbe fortement sur la surface des NTC par « π—π stacking ». A titre d'exemple de molécules intermédiaires, on peut donc citer un dérivé de pyrène présentant au moins un groupement tel que précédemment défini et, notamment, l'ester de l'acide 1- pyrènebutyrique et du N-hydroxysuccinimide capable de réagir avec une fonction aminé portée par ladite séquence nucléotidique.
Dans le cadre de la seconde forme de mise en œuvre de la présente invention, l'étape (b2) consiste à éliminer toute séquence nucléotidique n'ayant pas fonctionnalisé un NTC et ce, pour éviter des « faux » positifs dus à des séquences nucléotidiques libres. L'homme du métier connaît différentes techniques susceptibles d'être utilisées pour cette élimination. Avantageusement, l'étape (b2) peut comprendre au moins un lavage, au moins une centrifugation et/ou au moins une filtration, ou tout autre moyen à la portée de l'homme du métier dans sa pratique courante tel que la dialyse ou l' ultrafiltration . L'homme du métier saura choisir un tampon pour le (ou les) lavage (s) adéquat en fonction du type de fonctionnalisation mise en œuvre (covalente ou non covalente) . A titre d'exemples, ce tampon peut être de l'eau ou du PBS.
Les méthodes d'amplification d'une séquence nucléotidique sont bien connues aujourd'hui et reposent sur l'utilisation d'une enzyme de type polymérase qui a la propriété de recopier fidèlement une séquence génétique d'un polynucléotide à partir d'une zone amorce (zone double brin) . Aussi, dans le cadre de la présente invention, l'amplification mise en œuvre aux étapes (a) , (ci) ou (C2) peut aussi bien être une amplification par réaction en chaîne par polymérase ou PCR (acronyme anglais pour « Polymérase Chain Reaction ») classique que toute variante de PCR connue de l'homme du métier telle qu'une PCR asymétrique, une PCR asymétrique thermique entrelacée, une PCR en gradient de température, une PCR en point final, une PCR multiplexe, une PCR en temps réel (ou quantitative) , une RT-PCR (acronyme anglais pour « Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction ») , une RT-PCR multiplexe, une NASBA (acronyme anglais pour
« Nucleic Acid Séquence Based Amplification ») , une LCR
(acronyme anglais pour « Ligase Chain Reaction ») ou une TMA (acronyme anglais pour « Transcription Mediated
Amplification ») . La méthode d'amplification mise en œuvre dans le cadre de la présente invention peut également comprendre des améliorations telles que les techniques « Hot start », « Touchdown » ou l'utilisation de dUTP à la place des dTTP pour la décontamination par l'UNG (acronyme anglais pour « Uracil-DNA glycosylase ») de tout nouvel échantillon.
Par « RT-PCR », on entend une transcription inverse suivie d'une amplification en chaîne par polymerase. Une RT-PCR comporte donc deux étapes : une étape de transcription inverse, i.e. de synthèse d'un ADN simple brin complémentaire d'une séquence d'ARN, mettant en œuvre une transcriptase inverse suivie d'une étape d'amplification en chaîne par polymerase. Par « PCR multiplexe », on entend une méthode d'amplification visant à amplifier plus d'un amplicon à la fois. Cette technique utilise un ensemble de paires d'amorces d'amplification, chaque paire d'amorces étant conçue ou adaptée pour amplifier une séquence nucléotidique différente.
Par « RT-PCR multiplexe », on entend une PCR multiplexe telle que précédemment définie précédée d'une transcription inverse telle que précédemment définie . Par « PCR en temps réel », on entend une méthode d'amplification qui permet de détecter et/ou de quantifier la présence des amplicons durant les cycles de PCR notamment grâce à un marqueur fluorescent. L'augmentation des amplicons ou du signal lié à la quantité d' amplicons formés durant les cycles de PCR est utilisée pour la détection et/ou la quantification d'une séquence nucléotidique donnée dans la solution soumise à la PCR.
Par « NASBA », on entend une méthode d'amplification d'ARN sans changement de température en employant une amorce promoteur pour la T7-ARN polymérase, une transcriptase inverse, des dNTP (désoxyribonucléotide triphosphate) et des NTP (ribonucléotides triphosphates) , ainsi qu'une RNAse-H.
Par « LCR », on entend une méthode d'amplification mettant en œuvre une ADN ligase et deux amorces complémentaires de l'ADN cible et adjacentes qui sont liées ensemble par l'ADN ligase.
Par « TMA », on entend une méthode isotherme d'amplification d'ARN nécessitant deux enzymes que sont une transcriptase inverse et une ARN polymérase et deux amorces avec une amorce contenant une séquence promotrice pour l'ARN polymérase et l'autre amorce capable de se lier à la séquence d'ADN néosynthétisée .
II convient de souligner que les étapes d'amplification (a), (ci) et (C2) sont mises en œuvre en présence des NTC éventuellement présents.
Les conditions mises en œuvre aux étapes (a), (ci) et (C2) comprennent notamment la présence d'un milieu réactionnel et des conditions de température. Le mélange réactionnel mis en œuvre lors des étapes (a), (Ci) et (C2) peut être tout mélange de réactifs pour PCR ou toute variante de PCR, disponible dans le commerce tel (le) que les kits vendus par les sociétés Roche Applied Science ou Applied Biosystems.
En variante, le mélange réactionnel mis en œuvre lors de l'amplification des étapes (a), (ci) et
(C2) peut avoir n'importe quelle composition parmi tous les mélanges réactionnels décrits dans l'état de l'art pour la PCR ou toute variante de PCR. L'homme du métier saura préparer un tel mélange réactionnel en fonction du type de PCR mis en œuvre lors des étapes (a) , (ci) et (C2) selon l'invention.
Le mélange réactionnel comprend un (ou plusieurs) élément (s) choisi (s) parmi au moins une enzyme choisie dans le groupe constitué par une ADN ou ARN polymérase telle que la Taq polymérase ou la T7-ARN polymérase, une transcriptase inverse, une RNAse-H et une ADN ligase ; un sel tel que du TRIS (pour « trishydroxyméthylaminométhane ») , du KCl, du NaCl ou du MgCl2 ; des déoxyribonucléotides triphosphates éventuellement marqués tels que dATP, dGTP, dTTP, dCTP et éventuellement dUTP ; des ribonucléotides triphosphates éventuellement marqués tels que ATP, GTP, TTP, UTP, CTP ; au moins une paire d'amorces, spécifique ou dégénérée, pouvant comprendre de 10 à 100 paires de base, notamment de 15 à 50 paires de base et, en particulier, de 15 à 35 paires de base ; et une amorce oligo-dT ou spécifique notamment utile pour la transcription inverse ou pour la T7-ARN polymérase. En outre, le mélange réactionnel peut contenir d'autres additifs et notamment des additifs connus pour améliorer l'efficacité d'une PCR tels que de la BSA (pour « Bovine Sérum Albumin ») , de la bétaine, du formamide, du diméthylsulfoxyde, de la gélatine, du glycerol, de la spermidine, du sulfate d'ammonium, de l'Acetamide ou Amide C2, du Tween-20, du polyéthylène glycol (PEG) 6000, des protéines telles que la « Single Strand binding protein from E. CoIi » commercialisée par Sigma Aldrich (augmentation de la spécificité de la réaction) , ou la « T4 Gene32 Protein from E. CoIi B infected with phage T4aml34/amBL292/amE219 » commercialisée par Roche Applied Science (augmentation du rendement de production des longs produits de PCR, ou le rendement de la réaction en présence d' inhibiteurs tels que l'acide humique) , des inhibiteurs de RNases tels que le « Ribonuclease Inhibitor » ou le Diéthyl pyrocarbonate qui améliorent le rendement de l'étape de transcription inverse lors d'une RT-PCR.
Ce mélange réactionnel peut contenir, lorsque l'amplification des étapes (a), (ci) et (C2) est une RT-PCR multiplexe ou une PCR multiplexe, de 2 à 100 paires d'amorces différentes, chaque paire d'amorces étant spécifique ou dégénérée et pouvant comprendre de 10 à 100 paires de base, notamment de 15 à 50 paires de base et, en particulier, de 15 à 35 paires de base.
Un exemple de mélange réactionnel utilisable pour une amplification par PCR lors des étapes (a), (ci) et (C2) de l'invention comprend entre 50 et 100 mM de Tris, entre 10 et 100 mM et, avantageusement, 50 mM de KCl (ou de NaCl) , entre 1 et 5 mM de MgCl2, entre 20 μM et 1 mM d'un mélange de dNTP contenant des dCTP, dATP, dTTP, dGTP et éventuellement dUTP, entre 0,01 et 0,2 U/μl de la Taq Polymérase hot start ou non, des amorces comprenant de 10 à 100 paires de base, notamment de 15 à 50 paires de base et, en particulier, de 15 à 35 paires de base et pouvant être spécifiques ou dégénérés. Chaque amorce est avantageusement présente, dans ce mélange réactionnel, à une concentration comprise entre 1 et 200 nM et, en particulier, entre 10 et 100 nM.
Si l'amplification lors des étapes (a), (ci) et (C2) met en œuvre une transcription inverse, cette dernière peut durer de 5 à 90 min, typiquement 30 min, et s'effectue à une température comprise entre 25 et 600C.
Lorsque l'amplification mise en œuvre aux étapes (a), (ci) et (c2) n'est pas une amplification isotherme, des cycles thermiques sont nécessaires. Toutes conditions de température et de durée pour les différents cycles (dénaturation, hybridation et élongation) , connues de l'homme du métier et appropriées au type de PCR utilisé lors de ces étapes, sont utilisables.
Ainsi, l'amplification lors des étapes (a), (ci) et (C2) et notamment la PCR peut : comprendre deux températures avec un palier d' hybridation—élongation compris entre 50 et 700C, avantageusement 600C, maintenu pendant 5 à 300 secondes et un palier de dénaturation à 95°C maintenu pendant 1 à 30 secondes ; comprendre trois températures avec un palier d'hybridation compris entre 50 et 65°C, avantageusement de 600C, maintenu pendant 5 à 300 secondes, un palier d'élongation entre 65°C et 75°C, avantageusement de 720C, maintenu pendant 5 à 300 secondes et un palier de dénaturation à 95°C maintenu pendant 1 à 30 secondes ; - ou être des cycles « touch down » consistant à diminuer progressivement la température d'hybridation de 1°C par cycle par exemple.
La réaction lors des étapes (a) , (ci) et (C2) peut être conduite dans des tubes plastiques standards du commerce et notamment avec n'importe quel thermocycleur . Les volumes de réaction sont dans ce cas compris entre 5 et 100 μl .
La réaction lors des étapes (a) , (ci) et (C2) peut être conduite en utilisant un microsystème adapté pour la PCR ou la RT-PCR tel qu'une « PCR chip ». Dans ce cas, les volumes réactionnels sont beaucoup plus petits et compris typiquement entre 10 ni et 1 μl . De plus, de tels microsystèmes ont l'avantage d'être très petits et adaptés pour le développement de systèmes d'analyse portables et utilisables directement sur le site de mise en œuvre du procédé selon l'invention tel qu'un site de production de NTC ou un laboratoire de recherche [21] . Une préamplification de l'échantillon en plus grand volume sur le microsystème ou pas peut être réalisée si nécessaire pour améliorer la limite de détection de la méthode. Dans ce cas, une dizaine de cycles PCR peuvent être réalisés pour cette étape de préamplification. Elle pourra être effectuée en mode monoplexe, c'est-à-dire avec un seul couple d'amorces par mélange réactionnel et en effectuant autant de réactions en parallèle que de couples d'amorces testés. Elle pourra également être effectuée en mode multiplexe, c'est-à-dire avec l'ensemble ou une partie des amorces testées dans le même mélange réactionnel. Dans ce denier mode, des modifications du protocole PCR en termes de concentration d'amorces, de temps et de température des plateaux d' hybridation—élongation pourront être effectuées car il a été montré qu'il est ainsi possible de réaliser cette étape de préamplification en conservant le ratio en concentration des différentes matrices géniques. Il a également été montré que cette méthode est efficace pour un très grand nombre de séquences d' amorces sans optimisation de séquences pour l'amplification multiplexe .
La détection du (ou des) éventuel (s) produit (s) amplifié (s) lors des étapes (a), (ci) et (C2) peut se faire, lors des étapes (b) , (di) et (d2) , en utilisant toutes les méthodes adaptées à la détection d'un produit d'amplification.
A titre d'exemples de méthodes utilisables lors des étapes (b) , (di) et (d2) , nous pouvons citer : - les méthodes type électrophorèse qui permettent la détection du produit d'amplification après migration dans un gel ou toute autre matrice adaptée, la distance de migration étant reliée à la taille dudit produit ; les méthodes d'hybridation sur surface solide ; et/ou
- la PCR en temps réel.
Ces différentes méthodes peuvent éventuellement être utilisées successivement. Elles seront utilisées en se reposant sur les méthodes de mises en oeuvre connues et décrites dans l'état de l'art.
Dans le cas de l'hybridation sur surface solide, le mélange réactionnel obtenu suite aux étapes (a) , (ci) et (C2) et contenant éventuellement au moins un produit d'amplification est mis en contact avec un dispositif dont la surface a été préalablement fonctionnalisée avec des oligonucléotides de séquence connue. La surface peut être fonctionnalisée avec des oligonucléotides de séquences différentes en localisant chaque dépôt sous forme de spots par exemple. Des dispositifs commerciaux tels que les puces Affymetrix, ou les puces Agilent sont notamment utilisables. Les techniques classiques de dépôt d' oligonucléotides sur surface solide (« Spotting » avec un robot des oligonucléotides sur surface fonctionnalisée ou synthèse in situ) sont adaptées à la préparation des dispositifs de détection par hybridation.
Le mélange réactionnel obtenu suite aux étapes (a) , (ci) et (C2) et contenant éventuellement au moins un produit d'amplification peut être déposé soit sans modification sur le dispositif, soit en ajoutant une solution permettant d'optimiser le mélange réactionnel pour l'hybridation en termes de sélectivité vis-à-vis de la séquence des oligonucléotides et de la cinétique d'hybridation. Ce tampon optimisé peut contenir une (ou plusieurs) espèce (s) connue (s) dans l'état de l'art et choisie (s) parmi le (s) sel (s) monovalent (s) tel (s) que par exemple NaCl ou KCl ; une
(ou plusieurs) espèce (s) permettant de tamponner le pH de la solution ; des additifs permettant de réduire l'adsorption non spécifique d' oligonucléotides recherchés ou marqués avec un fluorophore tels que de l'ADN exogène ; des protéines connues pour saturer les surfaces par adsorption ; et des additifs connus pour accélérer la réaction d'hybridation tels que des agents de condensation de l'ADN connus comme le PEG, les ions multivalents—spermine, spermidine, magnésium, cobalt hexamine, etc.... A la fin de cette réaction d'hybridation, tout élément ne s' étant pas hybride avec les oligonucléotides fixés sur la surface sont éliminés par une étape de rinçage.
Différentes méthodes peuvent alors être utilisées pour détecter s'il y a eu hybridation entre certains oligonucléotides fixés sur la surface et un produit d'amplification obtenu en solution après les étapes (a), (ci) et (C2) . Il est possible d'utiliser des amorces marquées et/ou des dNTP marqués lors de l'amplification des étapes (a), (ci) et (C2) . Les marqueurs peuvent contenir des espèces détectables telles que des molécules radioactives ou fluorescentes. Dans ce cas, la détection se fait directement après les phases d'hybridation et de rinçage. Egalement, lors de l'amplification, certains dNTP ou NTP sont porteurs d'une fonction (ex : biotine) qui pourra être reconnue par une enzyme ou un conjugué protéine-enzyme. Une fois la reconnaissance faite, l'enzyme catalyse la transformation du substrat en produit et on détecte le produit par voie optique ou électrique. Il est également possible de détecter directement l'hybridation par des méthodes électriques si le dispositif fonctionnalisé pour l'hybridation le permet. II est également possible de procéder à une seconde étape après hybridation — lavage pour la détection telle qu'une hybridation secondaire ou une réaction avec un substrat lié au produit d'amplification obtenu après les étapes (a) , (ci) et (C2) . La détection du substrat peut alors se faire par des réactions enzymatiques . Ainsi ladite hybridation secondaire peut se faire avec une sonde de détection porteuse d'une enzyme et l'on fournit un substrat à cette enzyme. L'enzyme catalyse la transformation du substrat en produit et on détecte le produit par voie optique ou électrique. La méthode avantageusement mise en œuvre est l'utilisation d'amorces marquées et/ou de dNTP marqués avec des molécules fluorescentes et détection par fluorescence du produit d'hybridation.
Lorsque la PCR en temps réel est utilisée, les étapes (a) et (b) , (ci) et (di) ou (C2) et (cb) se font simultanément ou quasi-simultanément puisque la détection et l'éventuelle quantification peuvent être réalisées à chaque cycle thermique i.e. durant l'amplification ou en point final i.e. après le dernier cycle thermique donc après l'amplification.
Dans le cas de la PCR en temps réel, au moins une sonde marquée spécifique du produit d'amplification susceptible d'être obtenu suite à l'étape (a), (ci) ou (C2) peut être ajoutée au milieu réactionnel .
Par « sonde marquée », on entend, dans le cadre de la présente invention, une sonde fluorescente susceptible de se fixer soit sur l 'ADN double brin (technologie SYBR où l'on a un intercalant) ou sur une séquence d'ADN précise (technologie Taqman et Beacon) . Les sondes marquées spécifiques peuvent être de n' importe quelle sorte parmi les sondes connues et décrites dans l'état de l'art. A titre d'exemples de sondes marquées spécifiques utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les sondes TaqMan, les molecular Beacons, les sondes Scorpion et les sondes LNA et tout autre sonde permettant de réaliser des PCR en temps réel. La détection se fera par mesure de fluorescence à chaque cycle thermique ou en point final, c'est-à-dire après le dernier cycle thermique .
Le choix entre les différentes méthodes de détection se fera en fonction de l'information recherchée. Lorsque peu d'information est recherchée, par exemple lorsqu' il est nécessaire de tester simultanément entre une dizaine et une centaine de combinaisons de séquences, la PCR en temps réel est particulièrement adaptée. En revanche, lorsque le nombre de combinaisons de séquences recherchées est important, jusqu'à plusieurs dizaines de milliers, la PCR suivie d'une hybridation sur puce est préférable. Des criblages successifs pourront être réalisés. Par exemple, une PCR avec une détection non spécifique en utilisant un agent intercalant de l'ADN double brin peut être initialement effectuée : elle permet de mettre en évidence une structure double brin impliquant une amorce du mélange réactionnel et une séquence nucléotidique présente dans l'échantillon. Si cette détection non spécifique est positive, une deuxième analyse peut être effectuée en utilisant une PCR en temps réel et/ou l'hybridation sur puce à ADN pour connaître quelle (s) séquence (s) nucléotidique (s) est (sont) présente (s) dans l'échantillon.
Lorsque la quantification des NTC fonctionnalisés est souhaitée lors des étapes (b) , (di) et (cb) , il est nécessaire de réaliser simultanément une PCR en temps réel avec une gamme d' oligonucléotides à des concentrations connues. La concentration d' oligonucléotides dans l'échantillon testé peut ainsi être déduite de la gamme référence. Le taux de marquage des NTC étant, par ailleurs, connu, la concentration de NTC dans l'échantillon testé peut ainsi être déterminée .
la présente invention concerne enfin l'utilisation d'un kit d'éléments comprenant : - au moins un élément choisi parmi au moins une enzyme telle qu'une ADN ou ARN polymérase thermostable comme la Taq polymérase ou la T7-ARN polymérase, une transcriptase inverse, une RNase-H et une ADN ligase ; un sel tel que du TRIS (pour « trishydroxyméthylaminométhane ») , du KCl, du NaCl ou du MgCl2 ; des déoxyribonucléotides triphosphates éventuellement marqués tels que dATP, dGTP, dTTP, dCTP et éventuellement dUTP ; des ribonucléotides triphosphates éventuellement marqués tels que ATP, CTP, TTP, UTP et GTP ; au moins une paire d'amorces éventuellement marquées, spécifiques ou dégénérées, pouvant comprendre de 10 à 100 paires de base, notamment de 15 à 50 paires de base et, en particulier, de 15 à 35 paires de base ; une amorce oligo-dT ou spécifique notamment utile pour la transcription inverse ou pour la T7-ARN polymérase et une sonde marquée ; éventuellement au moins une séquence nucléotidique, et pour détecter, identifier et éventuellement quantifier au moins un nanotube de carbone dans un échantillon .
Ledit kit peut en outre comprendre un (ou plusieurs) additif (s) tel (s) que précédemment décrit (s) et/ou un (ou plusieurs) dispositif (s) et microdispositif (s) tel (s) que précédemment décrit (s) .
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS La Figure 1 propose un schéma représentatif de la fonctionnalisation des NTC par l'ADN.
La Figure 2 présente la fluorescence lors de la PCR en temps réel dans une goutte de 65 ni sur puce fonctionnant par électromouillage (courbe avec losanges) et dans un tube plastique classique pour la PCR en temps réel avec 10 μl de solution (courbe avec carrés) .
La Figure 3 présente une courbe de référence pour la détection quantitative de nanotubes fonctionnalisés avec le cycle seuil (ou « Ct » pour « Cycle treshold ») en fonction de la concentration de nanotubes fonctionnalisés exprimée en poids de nanotubes/ μl .
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS
1. Fonctionnalisation covalente des NTC avec de l'ADN.
Dans cet exemple, les nanotubes mis en œuvre sont des nanotubes multiparois (MWNT) fournis par Arkema. L'ADN a été synthétisé avec une aminé à l'extrémité 5' -terminale .
Le protocole de la fonctionnalisation covalente des MWNT par l'ADN comporte trois étapes représentées à la Figure 1 et consistant en : l'oxydation des MWNT pour générer des groupes carboxyliques sur les MWNT ; l'activation des groupes carboxyliques par du N-hydroxysuccinimide (NHS) ; - le couplage des groupes carboxyliques activés avec les aminés de l'ADN.
Trois lots de MWNT ont été réalisés, dont deux servent de contrôle à la fonctionnalisation, en variant les paramètres de cette dernière :
• Lot A pour lequel l'étape d'oxydation a été omise ;
• Lot B pour lequel, suite à l'étape d'oxydation, l'agent de couplage (NHS et DCC) a été omis pendant l'étape d' activation ;
• Lot C pour lequel les trois étapes complètes ont été réalisées.
1.1. Oxydation des nanotubes . Quinze mg de MWNT ont été ajoutés dans
20 ml de H2SO4 + HNO3 (3:1) . Le mélange a été soumis à un traitement par les ultrasons pendant 5 h (bain d'ultrasons) à 300C. La suspension de nanotubes a été diluée dans de l'eau et filtrée sur une membrane (0,2 μm) . Les MWNT ont été récupérés de la membrane et rincés plusieurs fois à l'eau.
Ensuite, ils ont été traités par du HCl (20 mL, 1 M) pour transformer les groupements carboxylates portés par les MWNT en groupements carboxyliques. Les MWNT ainsi traités i.e. MWNT oxydés ont été séchés sous vide à température ambiante. 1.2. Synthèse des MWNT activés. Environ 2,4 mg de MWNT oxydés (~ 0,2 mmol C) ont été dispersés dans 40 ml de DMF. La suspension a été purgée par N2 pendant 30 min. Du NHS (46 mg, 0,4 mmol) a été solubilisé dans 10 ml de DMF. La solution de NHS a été ajoutée dans les nanotubes en suspension avec une seringue.
Ensuite, du dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (82,4 mg, 0,4 mmol) a été solubilisé dans 10 ml de DMF, et ajouté dans les MWNT en suspension. Le mélange a été agité pendant 30 min à température ambiante. De la 4- Diméthylaminopyridine (DMAP) (2,4 mg, 0,02 mmol) a été solubilisée dans 10 ml de DMF et ajoutée, goutte à goutte, aux MWNT en suspension. La réaction a été maintenue à température ambiante sous N2 pendant 18 h. Après la réaction, les MWNT activés ont été récupérés sur une membrane de filtration, et rincés par du DMF. Puis, ils ont été séchés sous vide.
1.3 Couplage de MWNT activés avec I1ADN. Les MWNT activés (~ 2 mg) ont été dispersés dans du DMF (5 ml) par un traitement aux ultrasons. 10 μl d' oligonucléotides (76 bases, 100 μM) ont été dilués dans 3 ml de Na2HPO4 (0,2 M) . La solution d' oligonucléotides a été ajoutée, goutte à goutte, dans la suspension de MWNT activés sous agitation magnétique .
La réaction de couplage a été réalisée à température ambiante pendant 18 h. Après la réaction, les MWNT fonctionnalisés ont été récupérés sur une membrane de filtration et rincés 3 fois par du DMF et 3 fois par de l'eau désionisée (15 ml à chaque rinçage) .
Les MWNT activés et les MWNT fonctionnalisés ont été caractérisés par spectroscopie InfraRouge à Réflexion Totale Atténuée (ou ATR-IR pour « Attenuated Total Reflection Infrared ») et par spectroscopie photoélectronique X (ou XPS pour « X-ray photoelectron spectroscopy ») .
Le spectre ATR-IR des MWNT activés montre un pic d' adsorption correspondant à la liaison C=O, caractéristique des groupes NHS.
Les MWNTs fonctionnalisés i.e. couplés avec l'ADN ont été caractérisés par XPS. Le pourcentage d'élément phosphore, qui n'existe pas dans les MWNT activés, est de 0,23%. Ce pourcentage correspond à un rendement de greffage de 10 à 100 oligonucléotides par MWNT selon la taille des MWNT.
2. Détection de NTC fonctionnalisés avec un oligonucléotide par PCR sur microsystème.
La détection par PCR en temps réel a été réalisée sur un microsystème permettant la manipulation de gouttes de très petit volume (65 ni) .
Le fonctionnement du microsystème repose sur le principe d' électromouillage et permet de réaliser les étapes microfluidiques unitaires suivantes : formation de gouttes de volume connu et reproductible, déplacement de gouttes, mélange de deux gouttes de solutions éventuellement différentes avec homogénéisation en quelques secondes [21] . Lors de la PCR réalisée avec une solution de NTC fonctionnalisés avec des oligonucléotides, l'ensemble de la puce a été chauffé pendant les cycles thermiques de PCR. Une PCR avec une suspension de NTC fonctionnalisés avec des oligonucléotides a été réalisée sur la puce. La séquence de l' oligonuclétide greffé sur les NTC est 5' -NH2-C6-TTTTTCGGGTAACGTCAATGAG CAAAAAAATATCATTGGTGTCGGATACCCAAGGAGCATGTATTAGGCACGCCGC- 3' (SEQ ID NO. 1 dans la liste de séquences en annexe) . Les séquences des amorces sont CGGGTAACGTCAATG AGCAAA (primer forward, SEQ ID NO. 2 dans la liste de séquences en annexe) et GCGGCGTGCCTAATACATGC (primer reverse, SEQ ID NO. 3 dans la liste de séquences en annexe) et celle de la sonde : 5-FAM-CACCAATGATATTTT- MGB-3' (SEQ ID NO. 4 dans la liste de séquences en annexe) . Le mélange réactionnel contient le tampon de l'enzyme AmpliTaq GoId sans MgCl2 Ix (ABI), de la BSA à 0,8 mg/mL, du MgCl2 à 3 mM, des nucléotides (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) à 200 μM, de la bétaine à 450 mM et de l'AmpliTaq gold 0,5 U/μl (ABI) .
L'échantillon est tout d'abord mélangé en tube avec les réactifs PCR pour la première étape de dénaturation et activation de la Taq Polymerase (10 min à 95°C) . Cette solution est ensuite introduite sur la puce à travers un trou du capot et par activation des électrodes. Une goutte de 65 ni de cette solution est ensuite formée par activation des électrodes puis les cycles thermiques sont effectués (95°C 10 sec, 600C 20 sec) en chauffant l'ensemble de la puce avec un élément Peltier en contact avec la puce. La lecture de la fluorescence de la goutte se fait à la fin de chaque palier thermique à 600C avec un microscope optique.
En parallèle, 10 μl du même mélange réactionnel initial (échantillon + réactifs pour la PCR) a été placé dans un tube réactionnel pour la PCR et celle-ci a été réalisée avec un appareil commercial de PCR en temps réel (Stratagene Mx3005P) avec des cycles thermiques de 600C 60 sec, 95°C 60 sec.
Pour finir, le signal de fluorescence obtenu dans la goutte de 65 ni a été comparé au signal obtenu dans 10 μl de solution dans un tube plastique classique avec un appareil de PCR en temps réel commercial (MX3005P Stratagene) . Il apparaît que le signal normalisé obtenu dans les deux cas est absolument similaire (Figure 2) .
3. Exemple de quantification de NTC fonctionnalisés par PCR en tube.
Une PCR a été réalisée avec des dilutions successives de NTC marqués avec un oligonucléotide et préparés conformément au point 1 ci-dessus.
La quantité de NTC initialement utilisée pour le marquage est connue et il est donc possible de relier chaque cycle seuil (Ct) obtenu lors de cette PCR avec la concentration de NTC dans la dispersion lors de la PCR. Il est ainsi possible d'établir des courbes étalon, comme celle présentée Figure 3, permettant ensuite de donner un résultat quantitatif après analyse d'un échantillon inconnu en reliant le Ct obtenu avec la concentration de NTC. En se basant sur la courbe de référence de la Figure 3, un nouvel échantillon donnant un Ct de 31 contient 10~3 pg/μl de nanotubes fonctionnalisés.
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Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé pour détecter, éventuellement identifier et éventuellement quantifier au moins un nanotube de carbone éventuellement présent dans un échantillon comprenant les étapes consistant à :
(a) soumettre ledit échantillon à des conditions permettant l'amplification d'une séquence nucléotidique en utilisant des amorces aptes à amplifier ladite séquence nucléotidique, ledit nanotube de carbone éventuellement présent ayant été fonctionnalisé par ladite séquence nucléotidique préalablement à ladite étape (a) , et
(b) détecter, éventuellement identifier et éventuellement quantifier le produit d'amplification éventuellement obtenu suite à l'étape (a) .
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes successives suivantes consistant à : ai) préparer au moins un nanotube de carbone fonctionnalisé par au moins une séquence nucléotidique ; bi) prélever un échantillon susceptible de contenir ledit nanotube de carbone ;
Ci) soumettre ledit échantillon à des conditions permettant l'amplification de ladite séquence nucléotidique en utilisant des amorces aptes à amplifier ladite séquence nucléotidique ; et di) détecter, éventuellement identifier et éventuellement quantifier le produit d'amplification éventuellement obtenu suite à l'étape (ci) .
3) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes successives suivantes consistant à : a2) mettre en contact ledit échantillon avec au moins une séquence nucléotidique dans des conditions permettant la fonctionnalisation du (ou des) nanotube(s) éventuellement présent (s) par ladite séquence nucléotidique ; b2) éliminer toute séquence nucléotidique non impliquée dans la fonctionnalisation ; C2) soumettre ledit échantillon à des conditions permettant l'amplification de ladite séquence nucléotidique en utilisant des amorces aptes à amplifier ladite séquence nucléotidique ; et d2) détecter et éventuellement quantifier le produit d'amplification éventuellement obtenu suite à l' étape (C2) .
4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit échantillon est choisi dans le groupe constitué par un échantillon biologique ; un échantillon d'eau de ville, de rivière, de mer, de lac, souterraine ou de tours aéro-réfrigérées ; un prélèvement aérien ; un échantillon de terre ; un échantillon obtenu sur un site industriel ou un de leurs mélanges. 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite séquence nucléotidique est choisie dans le groupe constitué par un oligonucléotide, éventuellement modifié ; un acide désoxyribonucléique (ADN) , éventuellement modifié ; un acide ribonucléique (ARN) , éventuellement modifié ; une portion et un fragment de ceux-ci .
6) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, lors de la fonctionnalisation du (ou des) nanotube(s) par ladite séquence nucléotidique, cette dernière se lie de façon covalente au (x) dit (s) nanotube (s) .
7) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, lors de la fonctionnalisation du (ou des) nanotube (s) par ladite séquence nucléotidique, cette dernière se lie de façon covalente et indirecte au (x) dit (s) nanotube (s) .
8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite liaison covalente et indirecte se fait via un espaceur comprenant deux fonctions chimiques distinctes et capables de former une liaison covalente, une avec un groupement porté par le NTC et l'autre avec un groupement porté par la séquence nucléotidique.
9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que lesdites fonctions chimiques, identiques ou différentes, sont choisies dans le groupe constitué par une fonction carboxyle, un groupe aryle, une entité radicalaire, une fonction hydroxyle, une fonction alcool, une fonction aminé, une fonction ester, une fonction aldéhyde, une fonction hydrazide, une fonction cétone, une fonction époxy, une fonction isocyanate, une fonction maléimide, un diène et une fonction thiol.
10) Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que ladite étape de fonctionnalisation comprend deux sous-étapes consistant à :
(i) soumettre l'échantillon ou le (s) dit (s) nanotube(s) à des conditions permettant la formation d'au moins une entité réactive à la surface d'un nanotube de carbone, puis
(ii) mettre en contact ledit échantillon ou le (s) dit (s) nanotube (s) avec au moins une séquence nucléotidique et éventuellement avec un espaceur tel que défini à l'une quelconque des revendications 8 ou 9.
11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ladite entité réactive formée à la surface d'un NTC lors de l'étape (i) présente : un groupement choisi dans le groupe constitué par une fonction carboxyle, un groupe aryle, une entité radicalaire, une fonction hydroxyle, une fonction alcool, une fonction aminé, une fonction ester, une fonction aldéhyde, une fonction hydrazide, une fonction cétone, une fonction époxy, une fonction isocyanate, une fonction maléimide, un diène et une fonction thiol ou
- un groupe alkyle substitué par un tel groupement .
12) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que, lors de la fonctionnalisation du (ou des) nanotube(s) par ladite séquence nucléotidique, cette dernière se lie de façon non-covalente au (x) dit (s) nanotube (s) .
13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que, lors de la fonctionnalisation du (ou des) nanotube (s) par ladite séquence nucléotidique, cette dernière se lie de façon non-covalente et indirecte au (x) dit (s) nanotube (s) .
14) Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ladite liaison non covalente et indirecte se fait via une molécule intermédiaire capable de se lier de façon non covalente audit NTC et de se lier, de façon covalente ou non covalente, à ladite séquence nucléotidique.
15) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite amplification est choisie parmi une amplification par réaction en chaîne par polymérase ou PCR (acronyme anglais pour « Polymérase Chain Reaction ») , une PCR asymétrique, une PCR asymétrique thermique entrelacée, une PCR en gradient de température, une PCR en point final, une PCR multiplexe, une PCR en temps réel, une RT-PCR (acronyme anglais pour « Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction ») , une RT-PCR multiplexe, une NASBA (acronyme anglais pour « Nucleic Acid Séquence Based Amplification ») , une LCR (acronyme anglais pour « Ligase Chain Reaction ») ou une TMA (acronyme anglais pour « Transcription Mediated Amplification ») .
16) Utilisation d'un kit d'éléments comprenant :
- au moins un élément choisi parmi au moins une enzyme telle qu'une ADN ou ARN polymerase thermostable comme la Taq polymerase ou la T7-ARN polymerase, une transcriptase inverse, une RNase-H et une ADN ligase ; un sel tel que du TRIS (pour « trishydroxyméthylaminométhane ») , du KCl, du NaCl ou du MgCl2 ; des déoxyribonucléotides triphosphates éventuellement marqués tels que dATP, dGTP, dTTP, dCTP et éventuellement dUTP ; des ribonucléotides triphosphates éventuellement marqués tels que ATP, CTP, TTP, UTP et GTP ; au moins une paire d'amorces éventuellement marquées, spécifiques ou dégénérées ; une amorce oligo-dT ou spécifique notamment utile pour la transcription inverse ou pour la T7-ARN polymerase et une sonde marquée ; éventuellement au moins une séquence nucléotidique, et pour détecter, identifier et éventuellement quantifier au moins un nanotube de carbone dans un échantillon.
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