EP2379737A1 - Nouveaux biotraceurs et leurs utilisations pour le contrôle des installations de filtration - Google Patents

Nouveaux biotraceurs et leurs utilisations pour le contrôle des installations de filtration

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Publication number
EP2379737A1
EP2379737A1 EP09803878A EP09803878A EP2379737A1 EP 2379737 A1 EP2379737 A1 EP 2379737A1 EP 09803878 A EP09803878 A EP 09803878A EP 09803878 A EP09803878 A EP 09803878A EP 2379737 A1 EP2379737 A1 EP 2379737A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
bacteriophage
probes
grafted
electrode
biotin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09803878A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Christelle Guigui
Corinne Cabassud
Sandrine Alfenore
Stéphane MATHE
Laurence Soussan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP2379737A1 publication Critical patent/EP2379737A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
    • B01D61/145—Ultrafiltration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
    • B01D61/147—Microfiltration

Definitions

  • Membrane filtration processes are used in many fields to concentrate or purify liquids. In some applications
  • the reduction (or retention) of a filtration system is defined by the rate of selected compounds.
  • the cutoff thresholds (that is to say 90% retention of the target compound) of the membranes are currently evaluated by means of very small tracers of polymer and protein type such as PEG (polyethylene glycol) and dextrans. These tracers have properties different from those of viruses, whether in terms of size, shape or density. They are therefore not suitable for mimicking the behavior of viruses during filtration and therefore can not satisfactorily characterize the retention dynamics of the membrane systems during filtration. It is therefore necessary to provide a tracer that is easily detectable and quantifiable online and that can best mimic the filtering behavior of viruses.
  • Bacteriophages are non-pathogenic bacteria viruses for humans and their environment. They are commonly used as reference microorganisms for quantifying the virus retention of membrane systems (US Environmental Protection Agency, 2005; US 5,645,984 A, and US 5,731,164 A). Indeed, they are very similar to pathogenic viruses carried by water in terms of size, shape and surface properties. However, the existing methods for quantifying bacteriophages (counting lyses plaques, quantitative PCR, flow cytometry ...) are not fast enough and representative of the volumes filtered for the targeted applications.
  • modified bacteriophages were also considered as tracers (Gitis et al., Water Research, 36 (2002), 4227-4234 and WO2007 / 046095).
  • One of the proposed modifications resides in the grafting of fluorochromes on the surface of MS2 bacteriophages so as to be able to directly detect said fluorimetrically modified bacteriophages. This relevant approach, however, remains limited by low analyzable volumes (at most 1 ml_, the fluorimetric cell can not be fed continuously because of the highly clogging nature of any biological suspensions).
  • T4 bacteriophages The grafting of enzymes (with a molecular weight more than 200 times greater than that of fluorochromes) on the surface of T4 bacteriophages has also been envisaged.
  • the limitations lie mainly in the size of the T4 phage (measuring approximately 150 nm long and 78 nm wide) thus making the use of the tracer obsolete for the ultrafiltration or nanofiltration membranes as well as in the method.
  • associated detection by ECL chemiluminescence
  • low volumes are analyzed (of the order of 20 microliters).
  • the present invention relates to a new method for the amperometric detection of biotracers consisting of a bacteriophage marked on its surface by one or more enzymatic probe (s) grafted (s) via one or more molecule (s) activated biotin precursor (s) to one or more protein (s) of the capsid of said bacteriophage.
  • the detection method in a sample to be analyzed of biotracers according to the invention preferably comprises:
  • the electrolyte comprises a buffer for fixing the pH of the solution.
  • the detection method according to the invention is such that the low detection threshold in biotracers is generally greater than or equal to 10 2 , more preferably greater than or equal to 10 4 pfu / ml. There is no limitation of high detection in concentration in biotracers and if necessary, a dilution of the sample can be carried out before analysis.
  • any type having proteins on their surface may be suitable.
  • the phage used will preferably be chosen from phages that can easily be amplified in bacterial strains. Preferably, the selected phages have replication cycles in non-pathogenic bacteria. These phage can be selected from all known phage families.
  • the type of phage (size) will in particular be chosen according to the type of filtration to be characterized (in particular vis-à-vis the cutoff threshold of the membrane). For filtration of the microfiltration (MF), ultrafiltration (UF) and / or nanofiltration (NF) type, the phage used is very preferably the MS2 phage. But phages of higher molecular weight and size may also be suitable for the microfiltration process.
  • MS2 phage in particular are spherical viruses with an average diameter of 30 nm, covered with a protein shell called capsid and are suitable for the invention.
  • Bacteriophages can be obtained from approved organisms such as the ATCC or the Institut Pasteur.
  • bacteriophage MS2 corresponds to strain ATCC15 597-B1.
  • phrases so marked are also called biotracers.
  • phages and bacteriophages are interchangeable and refer to viruses that infect bacteria
  • a biotin molecule is attached to one or more phage capsid proteins.
  • the biotin used is modified so as to have a reactive terminal function.
  • the biotin thus modified is here called activated biotin.
  • Biotin is an extremely small molecule and hydrophilic, which allows it to easily spread to its sites hooked to react. She is widely used in biochemical tests for its ability to form covalent bonds with proteins and because of its small size. A spacer may also be introduced before the reactive terminal function of the activated biotin.
  • the biotin molecules used are activated to react with preferred sites of the phage protein capsid used.
  • biotin molecules activated to react with the primary amino groups -NH 2, in particular present in the lysine amino acids, have been chosen for phage MS2 so as to establish an amide-type covalent bond.
  • the phage capsid may be composed of proteins containing at least one lysine. This is particularly the case for MS2 phage whose capsid is composed of 180 identical proteins each having a lysine site accessible for this type of grafting (Lin et al., J. Mol Biol., 1967, 25 (3), 455- 463).
  • Activated biotin molecules can be obtained from commercial companies such as Perbio Science, such as for illustrative purposes, the EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin biotins.
  • the enzymatic probes are attached to activated biotin by a very strong interaction (characterized by a high association constant), comparable to a covalent bond over a wide pH range and temperatures.
  • any complex composed of: a support protein capable of interacting with activated biotin, and
  • the choice of the enzymatic probe generally depends on: the final size of the desired biotracer with respect to the membrane to be characterized,
  • Said enzymatic probe support proteins may for example be chosen from neutravidin, avidin or streptavidin.
  • HRP horse radish peroxidase oxido-reductase
  • the neutravidine-HRP complex marketed by Perbio Science for example, is particularly preferred.
  • biotracers according to the invention are such that:
  • phage-grafted enzyme probes are between 20 and 150, preferably between 40 and 60 depending on the synthesis conditions, and or
  • the average catalytic activity of the biotracers k ca t is between 2.10 4 and 4.10 4 min -1 .
  • an oxidation reaction of the electron donor (R) occurs in the presence of the oxidant and the biotraceur according to the invention, in the corresponding oxidized donor (O), said oxidation reaction being catalyzed by said biotracer. More specifically, the oxidation reaction is irreversibly catalyzed by the enzymatic enzyme enzyme of the biotracer.
  • the oxidized donor (O) thus formed diffuses to the working electrode.
  • a bias voltage "Vpoia ⁇ sation”, lower than the equilibrium potential of the oxidized donor (O) / electron donor (R), is applied between the working electrode and the reference electrode, so that the oxidized donor (O), which has arrived in the vicinity of the working electrode, is reduced to an electron donor compound (R), thereby generating a reduction current I (called current cathode).
  • the reduction current I measured over time, is directly proportional to the oxidized donor concentration (O) formed in solution, therefore to the total amount of enzymatic probes grafted and therefore to the total amount of grafted enzymes. Said detection method can therefore be qualitative or quantitative.
  • electron donors (R) there may be mentioned iodide or 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (commonly called TMB).
  • TMB 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • HRP hydrogen peroxide
  • the HRP enzyme irreversibly catalyzes the oxidation reaction of (R), in the presence of hydrogen peroxide, so as to form the corresponding oxidized donor (O) and water, according to the reaction: Donor of electrons (R) + H 2 O 2 -> Oxidized electron donor (O) + H 2 O
  • the ratio of the oxidant concentration to the electron donor concentration (R) may vary from 1 to 10. This choice contributes in particular to limiting the spontaneous reaction of oxidation of the electron donor (R) in the presence of the oxidant.
  • the electrolytes may be selected from any commonly used electrolyte, such as NaCl, KCl.
  • concentration of the electrolyte is generally less than 1 M, preferably less than 0.3 M.
  • the pH of the solution to be analyzed is chosen in such a way that the activity of the grafted enzyme is the most favored and that the spontaneous oxidation of the electron donor (R) is the most disadvantaged. In the case where the enzyme is HRP and the electron donor is TMB, the pH can be set between 5 and 7.
  • the buffers suitable for the invention may be chosen from any buffer usually used, such as citrate phosphate, phosphate, etc.
  • the working electrode is advantageously a rotary disc working electrode (EDT) which can be constituted in particular of platinum, of vitreous carbon or gold. It will be noted that the dimensioning of the active surface of the working electrode depends on the amount of oxidized donor (O) present in solution and therefore on the volume of the solution to be analyzed: the larger the volume of solution and the larger the active surface can be chosen great.
  • the counter-electrode is advantageously a platinum electrode.
  • the surface of the working electrode has a small surface area relative to the surface of the counter electrode.
  • the surface of the platinum counter-electrode may be 5 to 10 times larger than that of the working electrode.
  • the reference electrode may be chosen from reference electrodes commonly used in electrochemistry (such as Ag / AgCl).
  • the polarization voltage is generally such that the spontaneous oxidation of the electron donor (R) is the most disadvantaged and that the reduction of the oxidized donor (O) to the working electrode is the most favored.
  • Any potentiostat-galvanostat assembly operating in potentiostat or galvanostat mode can be used; however, the galvanostat mode for measuring the current is preferred.
  • the time of the analysis is generally between 1 and 30 minutes.
  • the present invention also relates to the filtration system control method.
  • Said method comprises:
  • biotraceur consisting of a labeled bacteriophage comprising on its surface one or more enzymatic probe (s) grafted via one or more molecule (s) of biotin activated beforehand fixed (s) to one or more protein (s) of the capsid of said bacteriophage in the diet of said system,
  • the step of detecting biotracers in the permeate (or retentate) is carried out in a sample of said permeate.
  • the detection of current in the sample to be analyzed (for example a sample of the permeate) makes it possible to identify the presence of the biotracers mimicking the viruses in the exit waters.
  • said control method makes it possible to determine the abatement of said filtration system.
  • the Ab decimal logarithm of the ratio of Ca biotracer feed concentration to the concentration of biotracers in Cp permeate is defined by abatement Ab:
  • said method further comprises:
  • the step of detecting biotracers in the permeate and / or retentate of said system and then comparing the current in the permeate (or retentate) with the current obtained in the feed.
  • the diet and the permeate (or retentate) are sampled but the analysis could be carried out online using a conventional flow amperometric cell.
  • the present invention also relates to the use of conventional amperometric cells for the detection of enzymatic activities.
  • Biotracers consisting of a labeled MS2 bacteriophage, such as:
  • said bacteriophage has proteins on the surface of its capsid
  • an activated biotin molecule is grafted to one or more of said proteins
  • One or more enzymatic probe (s) is (are) fixed on said biotin.
  • the present invention thus relates to a biotraceur consisting of a labeled bacteriophage, such that said bacteriophage is a phage MS2 which comprises on its surface one or more enzymatic probe (s) grafted (s) by the intermediate of one or more molecule (s) of activated biotin previously fixed (s) to one or more protein (s) of the capsid of said bacteriophage.
  • the biotraceur according to the invention may comprise the embodiments described above with reference to the method according to the invention.
  • the present invention also relates to the process for preparing said biotracers.
  • said method comprises the following steps:
  • the method according to the invention further comprises the step of quantifying the average number of probe (s) grafted (s) by bacteriophage.
  • the method according to the invention then makes it possible to characterize said biotracers.
  • the said Activated biotin molecules are attached to the lysines of the bacteriophage surface proteins.
  • one operates in excess of biotin so that an activated biotin molecule is attached to each accessible lysine of the proteins on the surface of the bacteriophage to be labeled.
  • the method may also comprise the subsequent purification step, preferably by steric exclusion liquid chromatography (also known as HPLC-SEC), in order to separate, collect and assay the free enzymatic probes.
  • the mass of grafted probes can then be deduced by difference between the known mass of enzymatic probes injected into the chromatography column and the mass of free enzyme probes collected at the column outlet. Knowledge of the mass of enzymatic probes grafted can thus make it possible to evaluate the average number of phage-grafted enzyme probes.
  • Such quantification can not be conducted in particular if the purification is performed by dialysis because the probes are too diluted in the dialysis water to be assayed.
  • a purification step can be carried out after the attachment of the phage activated biotin, the phages then being separated from the non-grafted activated biotin molecules. This purification step is advantageously carried out by HPLC-SEC.
  • the method may, in a preferred embodiment, include a preliminary step of producing the phages to be labeled.
  • This production step comprises the steps of:
  • Phages are amplified in the presence of host bacteria, for example according to the solid protocol recommended by the ATCC. It should be noted that this amplification can be carried out in a liquid or solid medium. The time and the Amplification conditions will depend on the type of phage used and can easily be determined by those skilled in the art.
  • Phages thus amplified are then resuspended in a liquid medium, for example in physiological saline or preferably in neutral phosphate buffer (commonly called PBS) to be purified.
  • a liquid medium for example in physiological saline or preferably in neutral phosphate buffer (commonly called PBS) to be purified.
  • PBS neutral phosphate buffer
  • the purification step may comprise lysis of the bacteria, for example with chloroform and one or more centrifugation steps followed by filtrations. Phages thus purified can be stored in a liquid medium, preferably in PBS.
  • the method may also comprise the enumeration of the phages thus amplified and purified, for example by HPLC-SEC or by phage enumeration techniques in an aqueous medium (in particular according to the ISO 10705-1 standard).
  • the present invention also relates to a kit comprising:
  • a solution comprising at least one biotraceur consisting of a labeled bacteriophage comprising on its surface one or more enzymatic probe (s) grafted via one or more activated biotin molecule (s) previously fixed (s) to one or more protein (s) of the capsid of said bacteriophage; and
  • an amperometric cell comprising a working electrode, a counter-electrode and a reference electrode,
  • the electron donors, the oxidants, the electrolytes, the buffers, the working electrode, the counter-electrode and the reference electrode may be chosen from those preferred for the method for detecting biotracers according to the invention.
  • the solution may contain a concentration of biotracers of up to 12 pfu / mL.
  • the electrolyte comprises a buffer.
  • FIG. 1 schematically represents a biotracer according to the invention, where
  • (1) represents the folding capsid protein, (2) the activated biotin molecule, (4) the enzymatic probe support protein (for example the neutravidin molecule) covalently linked to one or two molecules enzyme
  • Figure 2 shows the size distribution of a phage pool obtained according to Example 1 (after amplification and extraction with chloroform).
  • Figure 3 shows chromatograms at 254 nm of amplified and chloroform-extracted native phage suspensions at CO, CO / 4 and CO / 10 concentrations, where (1) represents the peak of native phages and (2) the protein domain.
  • Figure 4 shows the chromatograms obtained at 254 nm of biotin alone (curve 1), native phage (curve 2), phage labeled with biotin (curve 3).
  • FIG. 5 shows the 210 nm chromatograms of the enzymatic probe alone (curve 1), a purified suspension of biotin-labeled phages (curve 2), a mixture of biotracers and probes in excess (curve 3) , a mixture of biotracers and phages labeled with biotin in the case where the probes are in default (curve 4).
  • FIG. 6 shows the schematic description of a detection method, where, for illustrative purposes, MS2 phage is used and the permeate is analyzed. Alternatively, the retentate or diet could also be analyzed, and another phage could be used.
  • FIG. 7a represents an example of amperometric curves of the same tracer feed (4 increasing sampled volumes);
  • FIG. 7b represents the calibration line associated with the example (giving the measured slopes as a function of the tracer concentrations in the measuring cell, expressed in counting unit of native phages).
  • FIG. 8 shows the 210 nm chromatogram of a mixture of tracers and probes in excess (curve 3 of FIG. 5), the peaks of tracers and probes in excess of T1 and S1, respectively, and the volumes collected from each peak.
  • Figure 9 illustrates the detailed methodology applied to access the probe mass grafted on phages.
  • FIG. 10 shows an example of amperometric responses obtained by analyzing the feed and the permeates collected at the end of filtration for a microfiltration membrane (MF) and an ultrafiltration membrane (UF).
  • MF microfiltration membrane
  • UF ultrafiltration membrane
  • FIG. 11 shows an example of characterization of the dynamic retention obtained with a damaged module of hollow ultrafiltration fibers used in the production of drinking water.
  • This module consisting of 15 fibers was deliberately compromised by the laser embodiment of a circular defect of 25 microns on one of the 15 fibers.
  • a tracer step was in particular applied to about one-third of the total filtration time (which was conducted in frontal to constant transmembrane pressure) and the permeate was collected during filtration for analysis. The tracer concentrations measured in the permeate collected during filtration are given as a function of the filtration time.
  • Bacteriophage MS2 (ATCC, strain 597-B1),
  • the first step of producing the tracers is to obtain concentrated, purified and enumerated phage suspensions.
  • the obtaining of concentrated phages can be carried out according to known methods such as the ATCC protocol. Purification of amplified phage suspensions is necessary to remove any bacterial debris and / or release phages still contained in host bacteria. Indeed, bacterial debris also have lysine sites, which can react with the activated biotin molecules.
  • the first step is a chloroform extraction step to lyse the remaining bacteria without altering the bacteriophages (Adams, Bacteriophages, Intersciences Publishers, 1959).
  • Size exclusion liquid chromatography may also be used to quantify the phage concentration in the suspensions obtained (FIG. 3).
  • the analyzes are carried out with a column having a resolution range in molecular weights of between 5 and 5000 kDa (and assuming a maximum load of 40 000 kDa). Indeed, the molecular mass of the native MS2 phage is 3600 kDa (Kuzmanovic et al., Structure 2003 Nov, 11 (11): 1339-48.),
  • the eluent is neutral PBS buffer. Detections are made by UV spectrophotometry. The absorbance measured in this case in UV 254 nm is given as a function of the volume eluted. The smaller the volume eluted, the more the compound corresponding to this volume has a high molecular weight.
  • the elution peak (1) centered on approximately 11.3 mL corresponds to the native phages.
  • the peaks (2) correspond to the proteins most likely resulting from the lysis of the bacteria or the solid culture medium entrained during the suspension of the amplified phages. As the areas of the peaks (1) are directly proportional to the concentrations of the compounds in the sample, the HPLC-SEC technique can therefore also be used to quantify phage suspensions.
  • the phage suspension could also be purified from the proteins by collecting the fraction eluted between 9.5 and 14 mL. However, the purification is not completed so as not to dilute the phage suspensions.
  • the precise determination of the purified phage concentration makes it possible to determine the concentration of tracers.
  • An enumeration of the purified phage suspensions can be performed before the grafting step.
  • the protocol followed is that of ISO 10 705-1.
  • the second step in obtaining the biotraceur thus consists in labeling the phage suspensions obtained previously (ie the suspensions obtained after phage amplification, chloroform extraction, centrifugation and 0.2 ⁇ m filtration) by the biotin molecules and then eliminating them. non-grafted biotin molecules by HPLC-SEC.
  • Activated biotin introduced in a very large excess, is directly dissolved in a few ml of the phage suspension to promote contact between reagents.
  • the reaction is conducted in a glass container at room temperature, at neutral pH (that is to say that of phage storage) and protected from light. The mixture is stirred for one and a quarter hours and then stored as it is overnight at 4 ° C.
  • the mixture after grafting reaction is purified by HPLC-SEC.
  • the eluent is always neutral PBS.
  • the chromatograms are shown in Figure 4.
  • curve 1 chromatogram of biotin alone showing a characteristic peak of the molecule at around 20 ml
  • curve 2 chromatogram of the suspension of phage before grafting, showing the peak characteristic of phages at about 1 1 3 mL and the residual proteins of the suspension starting at 20 mL,
  • curve 3 chromatogram of the suspension after grafting showing a peak at about 1 1, 3 mL corresponding to the grafted phages (in fact, the biotin molecules have a molecular mass too low for the variation of molecular masses (2.8 %) between the native phages and the grafted phage is visible on the chromatograms) and a saturation peak above 20 mL corresponding to the excess of biotin.
  • the fraction corresponding to the phages labeled by the biotin molecules is collected between 9.5 and 14 mL in a glass tube and stored at 4 ° C for labeling by the enzyme probes. At this stage, it is not possible to say whether the labeling by the biotin molecules has been effective. Only a characterization of the mixture after reaction with the enzymatic probes makes it possible to conclude on the effectiveness of this grafting.
  • the third step then consists of fixing the enzymatic probes on the biotinylated phages obtained previously and then removing the unfixed enzymatic probes.
  • the enzymatic probes are reconstituted in ultra pure water and then introduced in large excess into the fraction of phage labeled with biotin.
  • the reaction is conducted at room temperature, at neutral pH, protected from light and with stirring (120 rpm) for 30 minutes.
  • the post-reaction mixture is purified by HPLC-SEC.
  • the molecular mass of the biotracers is estimated at more than 5000 kDa (taking into account the molecular masses of the enzymatic probes) but at less than 40 000 kDa (maximum charge of the chromatography column), which allows their recovery in the total exclusion peak.
  • the eluent is always neutral PBS.
  • the chromatograms (FIG. 5) obtained at 210 nm, wavelength for which the best response sensitivity of the enzymatic probes is obtained show:
  • the enzymatic probe (curve 1) characterized by a peak centered on an approximate volume of 15 ml; the suspension of biotinylated phage (curve 2) purified by HPLC-SEC characterized, as above, by a peak at approximately 1 1, 3 ml,
  • the collection of biotracers is carried out between 7.5 mL and 10 mL of elution volume (curve 3).
  • the activity of the collected batches is characterized qualitatively by spectrophotometry by testing the chosen enzymatic activity with the adapted substrate. For example, the activity HRP (oxidoreductase) was evaluated by reaction between pyrogallol and hydrogen peroxide leading to a colored product in the presence of enzymatic activity. These positive qualitative tests quickly confirm the presence and the activity of the enzymes and attest to the good manufacturing of the biotracers.
  • Biotracers are also quantitatively characterized to determine the amount of grafted probes and to measure the catalytic activity of biotracers.
  • the purification of biotracers by HPLC-SEC makes it possible to collect the fraction corresponding to the excess of probes. This fraction is then determined spectrophotometrically according to a technique well known to those skilled in the art.
  • the mass of grafted probes is then deduced by difference between the known mass of probes injected into the chromatography column and the quantity of excess probes collected. Knowledge of the mass of enzymatic probes grafted thus makes it possible to evaluate an average number of phage-grafted probes.
  • the tracers are in particular obtained by labeling a suspension of biotinylated phages purified by excess enzyme probes at a concentration C 1 of 71.46 ⁇ 1.79 ⁇ g ml -1 (according to the protocol described above), thus leading to a mixture of tracers and probes.
  • phage-grafted probes is therefore performed by spectrophotometrically assaying the mass of free probes in excess and subtracting it from the mass of probes injected into the column (initially 71.46 ⁇ 2.00 ⁇ g).
  • Figure 9 illustrates the detailed methodology used to access the probe-fixed mass mT1 to tai.
  • curves 1 and 3 are those of Figure 5, relating respectively to the enzyme probe alone and to a mixture of tracers and probes in excess.
  • V ⁇ nj ⁇ is the volume of the mixture of tracers and probes in excess injected into the column
  • the concentration [S1] CO of excess free probes is determined in the fraction of free probes S1 excess collected (between 13.50 and 18.00 ml_) after purification, by a spectrophotometric determination with pyrogallol according to a technique well known to those skilled in the art.
  • the rS1 parameter makes it possible, by using the proportionality property of the HPLC-SEC peak areas with the masses, to access the total mass m S 1 total of free probes in excess.
  • mS1 total mS1 collected / I " S1 (6)
  • Table 1 Known or measured parameters prior to the determination of the mass mT1 to tai for this example.
  • Table 2 shows the total mass of grafted probes as well as the intermediate masses that allowed them to be calculated, for three batches of tracers made from the same batch of native phages, under the same conditions of synthesis (according to FIG. previously described protocol).
  • Table 2 Total masses mT1 to tai grafted probes for three batches of tracers made from the same batch of native phages, under the same conditions of synthesis.
  • the molecular mass M pro be of enzymatic probes used for tracer synthesis is 140 kDa.
  • N 1.67 10 14 probe molecules (1 14.3%).
  • the average amount of tracers in the tracer and excess free probe mixtures to be purified is quantifiable from the average concentration of the biotinylated phage used for the labeling of the probes (ie 2.75 1 0.27 12 pfu mL -1 deduced from the measurement of the corresponding HPLC-SEC peak areas) and the injection volume Vm j ection (in view of the fact that the dilution introduced for the labeling of the probes is negligible).
  • a similar study made from a lower native phage suspension showed better labeling efficiency.
  • Granulometric characterization of the biotracers can be carried out.
  • the biotracers synthesized from MS2 phages, labeled with biotin and with the neutravidin-HRP complex show an average diameter of 64.5 nm, which makes them perfectly relevant for ultrafiltration system characterization. or microfiltration.
  • This marking technique can therefore be generalized to any protein capsid whose structures are compatible for labeling.
  • [O] (t) [enzyme] totai-k ca t -t [equation 1] with: - [O] (t): oxidized donor concentration formed in solution at time t (in mol L -1 ),
  • [enzyme] total total concentration of grafted enzymes present in solution (in mol L -1 ),
  • kcat molar activity of the grafted enzyme (in mol mol -1, min -1 , min -1 ), 1: reaction time catalyzed by the grafted enzymes (min).
  • the k cat constant more explicitly reflects the number of oxidized donor molecules formed in solution per molecule of enzyme present in solution and per unit of time.
  • the enzyme functions at saturation.
  • [S]> 1 Ox Km (Km Michaelis-Menten constant in mol L -1 of the chosen enzyme)
  • concentration [S] fixed is always chosen to fulfill this condition regardless of the range of enzyme concentrations used.
  • This law reflects the decrease of the current with the increase of the amount of oxidized donor formed over time.
  • the transfer of the oxidized donor to the working electrode is controlled by the diffusion if the hydrodynamics within the solution is fixed by the working electrode: in this case a rotating disc electrode and the rotational speed of the electrode ⁇ (tr.min -1 ) is chosen such that, at any moment, the amount of oxidized donor O consumed at the electrode is less than 1% of the total amount of oxidized donor O present in solution.
  • TMB 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine also called TMB (SIGMA Aldrich, ref 87750), Hydrogen Peroxide (ROTH, Hydrogen Peroxide 30% Stabilized, Cat No. 8070),
  • the selected potentiostat is a MicroAutolab (Metrohm), having a resolution of 30 fA and measuring the nA repeatedly.
  • the amperometric cell is a thermally adjustable Karl Fisher glass cell (Methrom) with a flat lid to allow easier cleaning and positioning of the electrodes, with a maximum volume of 130 mL. Two cannulas for bubbling with dinitrogen can also be positioned on the lid.
  • the working electrode chosen is a Metrohm rotating disk electrode (EDT) of active surface a platinum disc of diameter 5 or 3 mm, adapted to the working volume of the cell. The working electrode has mercury contact between the rotating rod and the electrode body, thereby providing noise-minimizing signal transmission.
  • EDT Metrohm rotating disk electrode
  • the servo system of the EDT makes it possible to impose a rotational speed of between 100 and 10000 rpm.
  • the counter-electrode is an active surface platen gate chosen 6.5 times larger than that of the working electrode.
  • the reference electrode chosen is a Ag / AgCl double junction electrode. It will be noted that the cell volume, material and work electrode surface, surface and geometry parameters of the counter-electrode may vary depending on the optimization of the detection system and the different desired applications.
  • the selected enzyme admits many possible electron donors.
  • the electron donor used for this example is the TMB.
  • the enzyme is HRP
  • the oxidant is hydrogen peroxide.
  • the ratio of the hydrogen peroxide concentration to the TMB concentration is set to 5.
  • the maximum total volume of solution to be analyzed is set at 78 mL with this system.
  • the reagent concentrations: ie TMB and hydrogen peroxide are chosen so that the enzyme operates at saturation.
  • the amount of TMB is less than that of hydrogen peroxide to limit the spontaneous reaction.
  • a platinum 5 mm disc is chosen as the active surface of the working electrode.
  • the speed of rotation of the EDT is set at 1,130 rpm.
  • an analysis of the blank (that is to say TMB and hydrogen peroxide alone) is carried out to quantify the part of the spontaneous reaction on the product stream and thus on the originally measured slopes. .
  • the oxidation mechanism of TMB is a two-step mechanism
  • the measurement protocol comprises:
  • the TMBoxi is preferentially dosed.
  • the bias voltage is set at 240 mV.
  • the maximum sampleable volume is set at 60 mL.
  • the volume of the cell, deduced from the volume of the reagents, is completed with buffer electrolyte.
  • the EDT is rotated, this is sufficient to ensure mixing of the volume to be analyzed.
  • the TMB is introduced and the hydrogen peroxide in turn. Upon the introduction of hydrogen peroxide, the acquisition starts.
  • the analysis is currently conducted at room temperature without deoxygenation of the solution.
  • the acquisition time for blank is set to the maximum scan time.
  • the acquisition time for the analysis of the samples is chosen so that the number of points acquired is sufficient to have a good accuracy on the measurement of the slope Vo.
  • the duration of the analysis varies from 1 to 15 min.
  • FIG. 7a shows an example of amperometric curves.
  • Four volumes of the same biotracor feed were analyzed, corresponding to four concentrations of biotracers in the measuring cell, expressed in counting units of native phages: CO, 2.00 x CO, 4.65 x CO and 5, 80 x CO.
  • FIG. 7b represents the calibration line associated with the example (giving the slopes measured as a function of the tracer concentrations in the cell). The linearity of the slope with tracer concentration reflects the fact that, over this concentration range, grafting can be considered uniform.
  • FIG. 10 shows an example of amperometric responses obtained by analyzing the feed and the permeates collected at the end of filtration for a microfiltration membrane (MF) and an ultrafiltration membrane (UF).
  • the response obtained for the permeate MF shows that the microfiltration membrane passes tracers partially as the amperometric slope corresponding to the MF permeate is lower than the slope of the feed.
  • the UF permeate response is similar to white, which means that there was no detection of tracers in the UF permeate.
  • FIG. 11 shows an example of characterization of the dynamic retention obtained with a damaged module of hollow ultrafiltration fibers used in the production of drinking water.
  • a tracer step was in particular applied to about one-third of the total filtration time (which was conducted in frontal to constant transmembrane pressure) and the permeate was collected during filtration for analysis.
  • the tracer concentrations measured in the permeate collected during filtration are given as a function of the filtration time.
  • the results obtained show that the retention of tracers by the membrane can be dynamically monitored.
  • the concentration of tracers increased initially to reach a maximum towards the middle of the duration of the injection and then decreased.

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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux biotraceurs, leur procédé de préparation, la méthode de détection desdits biotraceurs et de contrôle de systèmes de filtration.

Description

NOUVEAUX BIOTRACEURS ET LEURS UTILISATIONS POUR LE CONTROLE
DES INSTALLATIONS DE FILTRATION
Les procédés de filtration par membrane sont utilisés dans de nombreux domaines pour concentrer ou purifier des liquides. Dans certaines applications
(traitement de l'eau, industrie agroalimentaire...), il est important de pouvoir contrôler l'état des membranes en cours d'utilisation (on parle aussi de leur intégrité) afin d'assurer la qualité du produit final.
A titre d'exemple, on peut citer les usines de production et de traitement des eaux qui sont équipées de systèmes de filtration permettant de limiter la teneur en biocontaminants et autres composés (virus, bactéries, etc.) des eaux en sortie. Ainsi, la technologie membranaire (ultrafiltration en particulier) est largement utilisée en raison de ses fortes capacités d'abattement en virus.
L'abattement (ou rétention) d'un système de filtration est défini par le taux de composés retenus.
Pour garantir le contrôle et la qualité des installations, il est nécessaire de pouvoir caractériser en ligne (directement sur les installations) et en dynamique, c'est-à-dire dans le temps, la rétention des systèmes de filtration utilisés, et ce afin de qualifier objectivement les performances de rétention des systèmes de filtration, d'augmenter les performances de garantie sanitaire des usines et de diminuer la demande en désinfectants chimiques.
Les seuils de coupure (c'est-à-dire 90% de rétention du composé cible) des membranes sont actuellement évalués grâce à des traceurs très petits, de type polymère et protéine tels que les PEG (polyéthylène glycol) et les dextrans. Ces traceurs ont des propriétés différentes de celles des virus, que ce soit en termes de taille, de forme ou de densité. Ils ne sont donc pas adaptés pour mimer le comportement des virus lors de la filtration et ne peuvent donc pas caractériser de façon satisfaisante la dynamique de rétention des systèmes membranaires en cours de filtration. Il est donc nécessaire de mettre à disposition un traceur qui soit facilement détectable et quantifiable en ligne et qui puisse mimer au mieux le comportement en filtration des virus.
Les bactériophages (encore appelés phages) sont des virus de bactéries non pathogènes pour l'homme et son environnement. Ils sont couramment utilisés comme microorganismes de référence pour quantifier la rétention en virus des systèmes membranaires (Membrane filtration guidance manual : Environmental Protection Agency, 2005 ; US 5 645 984 A, et US 5 731 164 A). En effet, ils sont très similaires à des virus pathogènes véhiculés par l'eau du point de vue de la taille, de la forme et des propriétés de surface. Cependant, les méthodes existantes pour quantifier les bactériophages (dénombrement des plages de lyses, PCR quantitative, cytométrie en flux...) ne sont pas suffisamment rapides et représentatives des volumes filtrés pour les applications visées.
Des substituts aux virus pathogènes ont été envisagés dans la littérature. On peut notamment citer des nanoparticules d'or détectées par potentiométrie (Gitis et al, Journal of Membrane Science, 276, 2006, 1999-207). Mais, malgré des tailles similaires, ces particules ne sont pas représentatives des virus car ces nanoparticules ont une densité beaucoup plus grande et une surface nettement plus lisse que les virus. D'autre part, elles sont beaucoup moins déformables. Dans une autre approche, on peut trouver des traceurs tels que des bactéries dont la surface a été modifiée avec des particules paramagnétiques de manière à pouvoir collecter et détecter lesdites bactéries par application d'un champ magnétique (US 2003/168408). Cependant la mise en œuvre de la détection de tels traceurs reste difficile. Dans une autre étude, des bactériophages modifiés ont aussi été envisagés comme traceurs (Gitis et al., Water Research, 36(2002), 4227-4234 et demande WO2007/046095). Une des modifications proposée réside dans le greffage de fluorochromes en surface de bactériophages MS2 pour pouvoir ainsi détecter directement lesdits bactériophages modifiés par fluorimétrie. Cette approche pertinente reste cependant limitée par de faibles volumes analysables (au maximum 1 ml_, la cellule fluorimétrique ne pouvant être alimentée en continue à cause du caractère fortement colmatant de toutes suspensions biologiques). Le greffage d'enzymes (de masse moléculaire plus de 200 fois plus importante que celle des fluorochromes) en surface de bactériophages T4 a également été envisagé. Dans ce cas particulier, les limitations résident principalement dans la grosseur du phage T4 (mesurant environ 150 nm de long et 78 nm de large) rendant ainsi I' utilisation du traceur obsolète pour les membranes d'ultrafiltration ou de nanofiltration ainsi que dans la méthode de détection associée (par chimiluminescence ECL) où de faibles volumes sont analysés (de l'ordre de 20 microlitres). On notera que pour un tel traceur, les auteurs n'ont pas apporté de caractérisation du traceur ainsi présenté et rien ne permet de quantifier le nombre de traceurs présents dans un échantillon et donc d'apporter des valeurs sur les seuils de détection II est donc désirable de mettre à disposition des biotraceurs les plus représentatifs possibles des virus, permettant une méthode de détection rapide, continue et compatible avec des volumes importants. De même, il est désirable de pouvoir s'assurer de la caractérisation reproductible et quantitative dudit traceur.
Ainsi, la présente invention concerne une nouvelle méthode de détection par ampérométrie de biotraceurs constitués d'un bactériophage marqué en sa surface par une ou plusieurs sonde(s) enzymatiques greffée(s) par l'intermédiaire d'une ou plusieurs molécule(s) de biotine activée préalablement fixée(s) à une ou plusieurs protéine(s) de la capside dudit bactériophage. Ainsi, le procédé de détection dans un échantillon à analyser de biotraceurs selon l'invention comprend préférentiellement :
- la préparation d'une cellule ampérométrique comprenant :
- une électrode de travail,
- une contre-électrode, - une électrode de référence, ces trois électrodes étant reliées par un potentiostat-galvanostat ;
- une solution comprenant l'échantillon à analyser et au moins un biotraceur comme défini ci-avant,
- un électrolyte, - un oxydant,
- un donneur d'électrons (R), et
- la mesure par ampérométrie du courant ainsi généré.
Préférentiellement, l'électrolyte comprend un tampon permettant de fixer le pH de la solution. Préférentiellement, la méthode de détection selon l'invention est telle que le seuil bas de détection en biotraceurs est généralement supérieur ou égal à 102, plus préférentiellement supérieur ou égal à 104 pfu/ml_. Il n'y a pas de limitation de détection haute en concentration en biotraceurs et si besoin, une dilution de l'échantillon peut être réalisée avant analyse.
A titre de phages convenant à l'invention, tout type possédant des protéines à leur surface peut convenir.
Le phage utilisé sera préférentiellement choisi parmi des phages pouvant être facilement amplifiés dans des souches bactériennes. De préférence, les phages choisis ont des cycles de réplication dans des bactéries non pathogènes. Ces phages peuvent être choisis dans toutes les familles de phages connues. Le type de phage (taille) sera notamment choisi en fonction du type de filtration à caractériser (en particulier vis-à-vis du seuil de coupure de la membrane). Pour une filtration de type microfiltration (MF), ultrafiltration (UF) et/ou nanofiltration (NF), le phage utilisé est tout préférentiellement le phage MS2. Mais des phages de taille et de masses moléculaires plus élevées peuvent également convenir au procédé de microfiltration.
Ainsi, les phages MS2 en particulier sont des virus sphériques d'un diamètre moyen de 30 nm, recouverts d'une coque protéique appelée capside et conviennent à l'invention. Les bactériophages peuvent être obtenus auprès d'organismes agréés tels que l'ATCC ou l'Institut Pasteur. Ainsi, le bactériophage MS2 correspond à la souche ATCC15 597-B1.
Les phages ainsi marqués sont également appelés biotraceurs.
Les termes phages et bactériophages sont interchangeables et se rapportent à des virus qui infectent des bactéries
Une molécule de biotine est fixée sur une ou plusieurs protéines de la capside du phage. La biotine utilisée est modifiée de façon à présenter une fonction terminale réactive. Ladite biotine ainsi modifiée est ici appelée biotine activée. La biotine est une molécule extrêmement petite et hydrophile, ce qui lui permet de diffuser aisément vers ses sites d'accroché pour y réagir. Elle est largement utilisée dans le cadre de tests biochimiques pour sa capacité à former des liaisons covalentes avec les protéines et en raison de sa petite taille. Un spacer peut par ailleurs être introduit avant la fonction terminale réactive de la biotine activée. Les molécules de biotine utilisées sont activées pour réagir avec des sites privilégiés de la capside protéique du phage utilisé. A titre d'exemple, des molécules de biotine activées pour réagir avec les groupes aminés primaires -NH2, notamment présents dans les acides aminés lysines ont été choisies pour le phage MS2 de façon à établir une liaison covalente de type amide. En effet, la capside des phages peut être composée de protéines contenant au moins une lysine. Il en est ainsi notamment des phages MS2 dont la capside est composée de 180 protéines identiques possédant chacun un site lysine accessible pour ce type de greffage (Lin et al., J. Mol. Biol., 1967, 25(3), 455-463).
Les molécules de biotine activées peuvent être obtenues auprès de sociétés commerciales telles que Perbio Science, telles que à titre illustratif, les biotines EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin.
Les sondes enzymatiques sont fixées à la biotine activée par une interaction très forte (caractérisée par une constante d'association élevée), comparable à une liaison covalente dans une large gamme de pH et de températures.
A titre de sondes enzymatiques, on peut utiliser tout complexe composé de : - une protéine support apte à interagir avec la biotine activée, et
- une enzyme de type oxydo-réductase.
Le choix de la sonde enzymatique (complexe enzyme/protéine support) dépend généralement de : - la taille finale du biotraceur désirée vis-à-vis de la membrane à caractériser,
- la sensibilité liée à la détection de l'enzyme, - et des interactions desdites molécules avec la membrane du système de filtration à caractériser.
Lesdites protéines support de la sonde enzymatique peuvent par exemple être choisies parmi la neutravidine, l'avidine ou la streptavidine.
A titre d'enzyme, on peut notamment citer l'oxydo-réductase « Horse Radish Peroxydase » (HRP), communément employée en immunologie pour sa forte activité et sa faible masse moléculaire.
Ainsi, à titre de sondes enzymatiques, on préfère notamment le complexe neutravidine-HRP, commercialisé par Perbio Science par exemple.
Préférentiellement, les biotraceurs selon l'invention sont tels que :
- ils sont disponibles dans une suspension où sont absentes des sondes libres, et/ou - le nombre moyen de sondes enzymatiques greffées par phage est compris entre 20 et 150, de préférence compris entre 40 et 60 en fonction des conditions de synthèse, et/ou
- l'activité catalytique moyenne des biotraceurs kcat est comprise entre 2.104 et 4.104 min"1.
En mettant en œuvre le procédé selon l'invention, il se produit une réaction d'oxydation du donneur d'électrons (R) en présence de l'oxydant et du biotraceur selon l'invention, en le donneur oxydé (O) correspondant, ladite réaction d'oxydation étant catalysée par ledit biotraceur. Plus précisément, la réaction d'oxydation est catalysée de façon irréversible par l'enzyme de la sonde enzymatique du biotraceur.
Le donneur oxydé (O) ainsi formé diffuse vers l'électrode de travail. Une tension de polarisation « Vpoiaπsation », inférieure au potentiel d'équilibre du couple oxydo-réducteur donneur oxydé (O) / donneur d'électrons (R), est appliquée entre l'électrode de travail et l'électrode de référence, de sorte que le donneur oxydé (O), arrivé au voisinage de l'électrode de travail, est réduit en composé donneur d'électrons (R), générant ainsi un courant de réduction I (appelé courant cathodique). Le courant de réduction I, mesuré au cours du temps est directement proportionnel à la concentration en donneur oxydé (O) formé en solution, donc à la quantité totale de sondes enzymatiques greffées et donc à la quantité totale d'enzymes greffées. Ladite méthode de détection peut donc être qualitative ou quantitative.
A titre de donneurs d'électrons (R), on peut notamment citer l'iodure ou le 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (appelé communément TMB). A titre d'oxydant, il convient de choisir un oxydant permettant de réaliser la réaction d'oxydo-réduction catalysée par l'enzyme de la sonde enzymatique greffée sur le biotraceur. Ainsi, le peroxyde d'hydrogène convient avantageusement pour l'enzyme HRP. L'enzyme HRP catalyse en effet de façon irréversible la réaction d'oxydation de (R), en présence de peroxyde d'hydrogène, de façon à former le donneur oxydé (O) correspondant et de l'eau, selon la réaction : Donneur d'électrons (R) + H2O2 -> Donneur d'électrons oxydé (O) + H2O
Le rapport de la concentration en oxydant sur la concentration en donneur d'électrons (R) peut varier de 1 à 10. Ce choix contribue notamment à limiter la réaction spontanée d'oxydation du donneur d'électrons (R) en présence de l'oxydant.
Les électrolytes peuvent être choisis parmi tout électrolyte habituellement utilisé, tel que NaCI, KCI. La concentration de l'électrolyte est généralement inférieure à 1 M, préférentiellement inférieure à 0,3 M. Le pH de la solution à analyser est choisi de telle manière que l'activité de l'enzyme greffée soit la plus favorisée et que l'oxydation spontanée du donneur d'électrons (R) soit la plus défavorisée. Dans le cas où l'enzyme est la HRP et le donneur d'électrons est le TMB, le pH peut être fixé entre 5 et 7.
Les tampons convenant à l'invention peuvent être choisis parmi tout tampon habituellement utilisé, tels que citrate-phosphate, phosphate, etc.
L'électrode de travail est avantageusement une électrode de travail à disque tournant (EDT) qui peut être notamment constituée de platine, de carbone vitreux ou d'or. On notera que le dimensionnement de la surface active de l'électrode de travail dépend de la quantité de donneur oxydé (O) présent en solution et donc du volume de la solution à analyser : plus le volume de solution est grand et plus la surface active peut être choisie grande. La contre-électrode est avantageusement une électrode de platine.
Généralement, la surface de l'électrode de travail présente une surface faible par rapport à la surface de la contre-électrode. Ainsi, à titre illustratif, la surface de la contre-électrode de platine peut être de 5 à 10 fois plus grande que celle de l'électrode de travail. L'électrode de référence peut être choisie parmi les électrodes de référence habituellement utilisées en électrochimie (telles que Ag/AgCI).
La tension de polarisation est généralement telle que l'oxydation spontanée du donneur d'électrons (R) soit la plus défavorisée et que la réduction du donneur oxydé (O) à l'électrode de travail soit la plus favorisée. Tout montage potentiostat-galvanostat fonctionnant en mode potentiostat ou galvanostat peut être utilisé ; on préfère cependant le mode galvanostat permettant de mesurer le courant. Le temps de l'analyse est généralement compris entre 1 et 30 minutes.
La présente invention concerne également le procédé de contrôle de système de filtration.
Ledit procédé comprend :
- l'introduction d'au moins un biotraceur constitué d'un bactériophage marqué comprenant à sa surface une ou plusieurs sonde(s) enzymatique(s) greffée(s) par l'intermédiaire d'une ou plusieurs molécule(s) de biotine activée préalablement fixée(s) à une ou plusieurs protéine(s) de la capside dudit bactériophage dans l'alimentation dudit système,
- l'étape de détection de biotraceurs dans le perméat (ou rétentat) dudit système de filtration selon l'invention.
Préférentiellement, l'étape de détection de biotraceurs dans le perméat (ou rétentat) est réalisée dans un échantillon dudit perméat. La détection de courant dans l'échantillon à analyser (par exemple un échantillon du perméat) permet d'identifier la présence des biotraceurs mimant les virus dans les eaux de sortie.
Lorsqu'une quantification des biotraceurs dans le perméat (ou rétentat) est désirée, cela peut être notamment réalisé par l'étape comprenant la comparaison du courant mesuré à des valeurs de référence.
De plus, la réalisation de valeurs de référence par l'étalonnage du courant en fonction de la quantité (ou concentration) de traceurs permet d'accéder par simple mesure du courant à la quantité (ou concentration) des biotraceurs dans l'échantillon analysé,
Selon un mode de réalisation particulier, ledit procédé de contrôle permet de déterminer l'abattement dudit système de filtration. On définit par abattement Ab le logarithme décimal du rapport de la concentration d'alimentation en biotraceurs Ca sur la concentration en biotraceurs dans le perméat Cp :
Ab = log (Ca/Cp) [équation 0]
Pour cela, ledit procédé comprend en outre :
- l'étape de détection de biotraceurs dans l'alimentation dudit système, puis
- l'étape de détection de biotraceurs dans le perméat et/ou rétentat dudit système, puis la comparaison du courant dans le perméat (ou rétentat) avec le courant obtenu dans l'alimentation. Préférentiellement, on opère par échantillonnage de l'alimentation et du perméat (ou rétentat) mais l'analyse pourrait être conduite en ligne en utilisant une cellule ampérométrique classique à écoulement.
Selon un autre objet, la présente invention concerne également l'utilisation de cellules ampérométriques classiques pour la détection d'activités enzymatiques. Les biotraceurs constitués d'un bactériophage de type MS2 marqué, tel que :
- ledit bactériophage présente des protéines à la surface de sa capside,
- une molécule de biotine activée est greffée à une ou plusieurs desdites protéines, et
- une ou plusieurs sonde(s) enzymatique(s) est(sont) fixée(s) sur ladite biotine.
Selon un autre objet, la présente invention concerne donc un biotraceur constitué d'un bactériophage marqué, tel que ledit bactériophage est un phage MS2 qui comprend à sa surface une ou plusieurs sonde(s) enzymatique(s) greffée(s) par l'intermédiaire d'une ou plusieurs molécule(s)de biotine activée préalablement fixée(s) à une ou plusieurs protéine(s) de la capside dudit bactériophage. Préférentiellement, le biotraceur selon l'invention peut comprendre les modes de réalisation décrits ci-avant en référence avec le procédé selon l'invention.
Selon un autre objet, la présente invention concerne également le procédé de préparation desdits biotraceurs.
Ainsi, ledit procédé comprend les étapes suivantes :
- accrochage d'une molécule de biotine activée à une ou plusieurs protéine(s) présente(s) à la surface du bactériophage à marquer, puis
- greffage d'une ou plusieurs sonde(s) enzymatique(s) à ladite (auxdites) biotine(s).
Selon un aspect particulier, le procédé selon l'invention comprend en outre l'étape de quantification du nombre moyen de sonde(s) greffée(s) par bactériophage. Le procédé selon l'invention permet alors de caractériser lesdits biotraceurs.
Les techniques d'accrochage de la biotine et de la fixation de la sonde enzymatique sont bien connues de l'homme du métier. Préférentiellement, lesdites molécules de biotine activées sont accrochées aux lysines des protéines de surface du bactériophage.
Selon un mode préférentiel, on opère en excès de biotine de sorte qu'une molécule de biotine activée est accrochée à chaque lysine accessible des protéines à la surface du bactériophage à marquer.
Le procédé peut également comprendre l'étape ultérieure de purification, préférentiellement par chromatographie liquide d'exclusion stérique (appelée aussi HPLC-SEC), afin de séparer, collecter et doser les sondes enzymatiques libres. La masse de sondes greffées peut alors être déduite par différence entre la masse connue de sondes enzymatiques injectée dans la colonne à chromatographie et la masse de sondes enzymatiques libres collectée en sortie de colonne. La connaissance de la masse de sondes enzymatiques greffées peut ainsi permettre d'évaluer le nombre moyen de sondes enzymatiques greffées par phage. Une telle quantification ne peut notamment pas être conduite si la purification est réalisée par dialyse car les sondes sont trop diluées dans les eaux de dialyse pour pouvoir être dosées.
Si nécessaire, une étape de purification peut être réalisée après l'accrochage de la biotine activée aux phages, les phages étant alors séparés des molécules de biotine activée non greffées. Cette étape de purification est avantageusement réalisée par HPLC-SEC.
Le procédé, peut dans un mode de réalisation préféré, comporter une étape préliminaire de production des phages à marquer. Cette étape de production comprend les étapes consistant à :
- amplifier les phages à marquer ;
- mettre en suspension les phages ainsi amplifiés ;
- purifier les phages.
Les phages sont amplifiés en présence de bactéries hôtes, par exemple selon le protocole par voie solide recommandé par l'ATCC. On notera que cette amplification peut être réalisée en milieu liquide ou solide. Le temps et les conditions d'amplification dépendront du type de phage utilisé et pourront facilement être déterminés par l'homme du métier.
Les phages ainsi amplifiés sont ensuite remis en suspension en milieu liquide, par exemple dans de l'eau physiologique ou préférentiellement dans du tampon phosphate neutre (appelé communément PBS) pour être purifiés.
L'étape de purification peut comprendre une lyse des bactéries, par exemple au chloroforme et une ou plusieurs étapes de centrifugation suivies de filtrations. Les phages ainsi purifiés peuvent être conservés en milieu liquide, préférentiellement dans du PBS. Le procédé peut également comprendre le dénombrement des phages ainsi amplifiés et purifiés, par exemple par HPLC-SEC ou par des techniques de dénombrement de phage en milieu aqueux (notamment selon la norme ISO 10705-1 ).
Selon un autre objet, la présente invention concerne également un kit comprenant :
- une solution comprenant au moins un biotraceur constitué d'un bactériophage marqué, comprenant à sa surface une ou plusieurs sonde(s) enzymatique(s) greffée(s) par l'intermédiaire d'une ou plusieurs molécule(s) de biotine activée préalablement fixée(s) à une ou plusieurs protéine(s) de la capside dudit bactériophage; et
- une cellule ampérométrique comprenant une électrode de travail, une contre-électrode et une électrode de référence,
- un électrolyte, - un donneur d'électrons (R) et, un oxydant.
Les donneurs d'électrons, les oxydants, les électrolytes, les tampons, l'électrode de travail, la contre-électrode et l'électrode de référence peuvent être choisis parmi ceux préférés pour le procédé de détection de biotraceurs selon l'invention.
La solution peut contenir une concentration de biotraceurs allant jusqu'à 1012 pfu/mL.
Préférentiellement, l'électrolyte comprend un tampon. L'invention sera mieux comprise à l'aide des figures suivantes :
La figure 1 représente schématiquement un biotraceur selon l'invention, où
(1 ) représente la protéine du capside du pliage, (2) la molécule de biotine activée, (4) la protéine support de la sonde enzymatique (à titre d'exemple la molécule de neutravidine) reliée de manière covalente à une ou deux molécules d'enzymes
HRP C (5), (3) constituant la sonde enzymatique.
La figure 2 représente la distribution en taille d'un lot de phages obtenu selon l'exemple 1 (après amplification et extraction au chloroforme). La figure 3 représente les chromatogrammes à 254 nm de suspensions de phages natifs amplifiés et extraits au chloroforme aux concentrations CO, CO/4 et CO/10, où (1 ) représente le pic des phages natifs et (2) le domaine des protéines.
La figure 4 présente les chromatogrammes obtenus à 254 nm de la biotine seule (courbe 1 ), des phages natifs (courbe 2), des phages marqués par la biotine (courbe 3).
La figure 5 représente les chromatogrammes à 210 nm de la sonde enzymatique seule (courbe 1 ), d'une suspension purifiée de phages marqués par la biotine (courbe 2), d'un mélange de biotraceurs et de sondes en excès (courbe 3), d'un mélange de biotraceurs et de phages marqués par la biotine dans le cas où les sondes sont en défaut (courbe 4).
La figure 6 représente le descriptif schématique d'une méthode de détection, où, à titre illustratif, un phage MS2 est utilisé et le perméat est analysé. De façon alternative, le rétentat ou l'alimentation pourraient également être analysés, et un autre phage pourrait être utilisé. La figure 7a représente un exemple de courbes ampérométriques d'une même alimentation en traceurs (4 volumes croissants échantillonnés) ; la figure 7b représente la droite de calibration associée à l'exemple (donnant les pentes mesurées en fonction des concentrations en traceurs dans la cellule de mesure, exprimées en unité de dénombrement de phages natifs). La figure 8 montre le chromatogramme à 210 nm d'un mélange de traceurs et de sondes en excès (courbe 3 de la Figure 5), les pics de traceurs et de sondes en excès respectivement T1 et S1 , ainsi que les volumes collectés de chaque pic. La figure 9 illustre la méthodologie détaillée appliquée pour accéder à la masse de sondes greffée sur les phages.
La figure 10 montre un exemple de réponses ampérométriques obtenues en analysant l'alimentation et les perméats collectés en fin de filtration pour une membrane de microfiltration (MF) et une membrane d'ultrafiltration (UF).
La figure 11 montre un exemple de caractérisation de la rétention en dynamique obtenu avec un module endommagé de fibres creuses d'ultrafiltration utilisées en production d'eaux potables. Ce module constitué de 15 fibres a volontairement été compromis par la réalisation au laser d'un défaut circulaire de 25 μm sur l'une des 15 fibres. Lors de cette expérience, un échelon de traceurs a en particulier été appliqué sur environ un tiers du temps total de la filtration (qui a été conduite en frontal à pression transmembranaire constante) et le perméat a été collecté au cours de la filtration pour analyse. Les concentrations en traceurs mesurées dans le perméat collecté en cours de filtration sont données en fonction du temps de filtration.
Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et non limitatif de la présente invention.
EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation du biotraceur Un biotraceur est représenté à la Figure 1. - Réactifs :
- Bactériophages MS2 (ATCC, souche 15 597-B1 ),
- Bactéries E. co// K-12 non pathogènes (disponible au LISBP),
- Biotine activée (Perbio Science, EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, réf. 21335),
- Sondes enzymatiques de type Neutravidine-HRP (Perbio Science, ImmunoPure NeutrAvidin, HRP Conjugated, réf. 31 001 ),
- Tampon commercial PBS neutre (Perbio Science, BupH Phosphate Buffered Saline Packs, réf. 28 372),
- Pyrogallol (Sigma Aldrich, réf. 25 4002), - Peroxyde d'hydrogène (Roth, Hydrogen Peroxide 30 % stabilisé, réf. 8070),
- Sels nécessaires à la réalisation de tampons et électrolytes : o NaCI (Roth, réf. 3957), o Na2HPO4, 2H2O (Roth, réf. 4984), o NaH2PO4, 2H2O (Roth, réf. T879)
• Matériel utilisé :
- Spectrophotomètre à plaques (Multiscan Ascent),
- Appareillage de chromatographie liquide Akta-Purifier avec caractérisations UV (210, 254 et 280 nm) et système de collecte (GE Healthcare),
- Colonne de chromatographie liquide par exclusion de taille : colonne Superose6 (GE Healthcare, réf. 10/300 GL),
- Granulomètre NanoSizer ZS (Malvern Instruments).
- Méthodes :
- Protocole ATCC d'amplification des phages par voie solide,
- Norme ISO 10 705-1 sur le dénombrement des phages en milieux aqueux.
La première étape de réalisation des traceurs réside dans l'obtention de suspensions de phages concentrées, purifiées et dénombrées.
o Purification des phages :
L'obtention des phages concentrés peut être réalisée selon des méthodes connues telles que le protocole de l'ATCC. La purification des suspensions de phages amplifiés est nécessaire pour éliminer tous débris bactériens et/ou libérer les phages encore contenus dans des bactéries hôtes. En effet, les débris bactériens présentent également des sites lysines, susceptibles de réagir avec les molécules de biotine activées.
Deux étapes de purification sont nécessaires. La première étape est une étape d'extraction au chloroforme pour lyser les bactéries restantes sans altérer les bactériophages (Adams, Bacteriophages, Intersciences Publishers, 1959).
L'ensemble chlororoforme/ suspensions est centrifugé deux fois à 9000 rpm. Le surmageant est récupéré puis filtré sur filtre stérile à 0,2 microns. Les suspensions sont stockées à 4°C dans leur tampon PBS neutre et dans des contenants en verre pour limiter les phénomènes d'adsorption des protéines. Les conditions de stockage des phages ont été choisies selon les données de la littérature (Feng et al., Ind. Microbiol . Biotechnol., 30, 549-552, 2003) pour minimiser la détérioration de la capside à long terme.
Pour quantifier la taille des phages, une caractérisation granulométrique est réalisée avec un ZetaSizer Nano ZS (Malvern) (figure 2). La courbe de distribution de taille montre un pic unique, reproductible, centré sur une valeur moyenne de 31 nm (valeur moyennée sur les cinq acquisitions). Ce diamètre moyen est tout à fait en accord avec les données de la littérature.
La chromatographie liquide d'exclusion stérique (HPLC-SEC) peut être également utilisée pour quantifier la concentration en phage dans les suspensions obtenues (figure 3). Les analyses sont réalisées avec une colonne ayant une gamme de résolution en masses moléculaires comprise entre 5 et 5000 kDa (et admettant une charge maximale de 40 000 kDa). En effet, la masse moléculaire des phages MS2 natifs est de 3600 kDa (Kuzmanovic et al., Structure. 2003 Nov;1 1 (1 1 ):1339-48.),
. L'éluant est du tampon PBS neutre. Les détections sont faites par spectrophotométrie UV. L'absorbance mesurée dans ce cas en UV 254 nm est donnée en fonction du volume élue. Plus le volume élue est petit et plus le composé correspondant à ce volume a une masse moléculaire élevée. Sur la figure 3, le pic d'élution (1 ) centré sur environ 1 1 ,3 mL correspond aux phages natifs. Les pics (2) correspondent aux protéines issues très probablement de la lyse des bactéries ou du milieu de culture solide entraîné lors de la mise en suspension des phages amplifiés. Les aires des pics (1 ) étant directement proportionnelles aux concentrations des composés dans l'échantillon, la technique de HPLC-SEC pourra donc aussi être utilisée pour quantifier des suspensions de phages.
La suspension de phages pourrait également être purifiée des protéines en collectant la fraction éluée entre 9,5 et 14 mL. Cependant, la purification n'est pas menée à son terme afin de ne pas diluer les suspensions de phages. o Dénombrement :
La détermination précise de la concentration en phages purifiés permet la détermination de la concentration en traceurs. Un dénombrement des suspensions de phages purifiées peut être réalisé avant l'étape de greffage. Le protocole suivi est celui de la norme ISO 10 705-1.
La seconde étape de l'obtention du biotraceur consiste donc à marquer les suspensions de phages obtenus précédemment (i.e. les suspensions obtenues après amplification des phages, extraction au chloroforme, centrifugation et filtration à 0,2 μm) par les molécules de biotine puis à éliminer les molécules de biotine non greffées par HPLC-SEC.
La biotine activée, introduite en très large excès, est directement dissoute dans quelques mL de la suspension de phages pour favoriser le contact entre réactifs. La réaction est conduite dans un récipient en verre à température ambiante, à pH neutre (c'est-à-dire celui de conservation des phages) et à l'abri de la lumière. Le mélange est agité pendant une heure et quart puis stocké tel quel une nuit minimum à 4°C.
Pour éliminer les molécules de biotine non greffées, le mélange après réaction de greffage est purifié par HPLC-SEC. L'éluant est toujours du PBS neutre. Les chromatogrammes sont représentés à la figure 4.
On distingue 3 courbes :
- courbe 1 : chromatogramme de la biotine seule faisant apparaître un pic caractéristique de la molécule aux environs de 20 mL,
- courbe 2 : chromatogramme de la suspension de phage avant greffage faisant apparaître le pic caractéristique des phages à environ 1 1 ,3 mL et les protéines résiduelles de la suspension à partir de 20 mL,
- courbe 3 : chromatogramme de la suspension après greffage faisant apparaître un pic à environ 1 1 ,3 mL correspondant aux phages greffés (en effet, les molécules de biotine ont une masse moléculaire trop faible pour que la variation de masses moléculaire (2,8 %) entre les phages natifs et les phages greffés soit visible sur les chromatogrammes) et un pic à saturation au-delà de 20 mL correspondant à l'excès de biotine. La fraction correspondante aux phages marqués par les molécules de biotine est collectée entre 9,5 et 14 mL dans un tube en verre et stockée à 4°C en vue du marquage par les sondes enzymatiques. A ce stade, il n'est pas possible de dire si le marquage par les molécules de biotine a été effectif. Seule une caractérisation du mélange après réaction avec les sondes enzymatiques permet de conclure à l'efficacité de ce greffage.
La troisième étape consiste alors à fixer les sondes enzymatiques sur les phages biotinylés obtenus précédemment puis à éliminer les sondes enzymatiques non fixées. Les sondes enzymatiques sont reconstituées dans de l'eau ultra pure puis introduites en grand excès dans la fraction de phages marqués par la biotine. La réaction est conduite à température ambiante, à pH neutre, à l'abri de la lumière et sous agitation (120 rpm) pendant 30 minutes.
Pour éliminer les sondes enzymatiques non greffées, le mélange post- réactionnel est purifié par HPLC-SEC. En effet, la masse moléculaire des biotraceurs est estimée à plus de 5000 kDa (compte-tenu des masses moléculaires des sondes enzymatiques) mais à moins de 40 000 kDa (charge maximale de la colonne de chromatographie), ce qui permet leur récupération dans le pic d'exclusion total. L'éluant est toujours du PBS neutre. Les chromatogrammes (figure 5) obtenus à 210 nm, longueur d'onde pour laquelle on obtient la meilleure sensibilité de réponse des sondes enzymatiques montrent :
- la sonde enzymatique (courbe 1 ) caractérisée par un pic centré sur un volume approximatif de 15 mL , - la suspension de phages biotinylés (courbe 2) purifiés par HPLC-SEC caractérisée comme précédemment par un pic à environ 1 1 ,3 mL,
- la suspension de biotraceurs synthétisés après greffage de sondes enzymatiques en large excès (courbe 3) : on distingue le pic du biotraceur centré aux environs de 8,5 mL et l'excès de sondes enzymatiques (pic centré sur 15 mL) (remarque : un très léger décalage est visible entre ce dernier pic et celui de la courbe 1 car les lots de sondes utilisées dans les deux cas ne présentaient pas exactement les mêmes caractéristiques : cf fournisseur). En comparant les courbes 2 et 3, on constate un déplacement net du pic des phages biotinylés (1 1 ,3 ml_) vers les plus petits volumes (8,5 ml_), avec un écart significatif ΔV = 2,8 ml_. Ceci traduit une augmentation de la masse moléculaire des phages natifs et garantit l'efficacité des greffages biotine et sondes enzymatiques et donc l'obtention des biotraceurs.
Dans le cas où les sondes enzymatiques sont introduites par défaut, l'analyse par HPLC-SEC permet de visualiser les phages biotinylés non greffés (courbe 4, épaulement pic à 8,5 ml_ et pic à 1 1 ml_).
La collecte des biotraceurs est réalisée entre 7,5 mL et 10 mL de volume d'élution (courbe 3). L'activité des lots collectés est caractérisée qualitativement par spectrophotométrie en testant l'activité enzymatique choisie avec le substrat adapté. A titre d'exemple, l'activité HRP (oxydo-réductase) a été évaluée par réaction entre le pyrogallol et le peroxyde d'hydrogène conduisant à un produit coloré en présence de l'activité enzymatique. Ces tests qualitatifs positifs confirment rapidement la présence et l'activité des enzymes et attestent de la bonne fabrication des biotraceurs.
Les biotraceurs sont également caractérisés quantitativement pour déterminer la quantité de sondes greffées et mesurer l'activité catalytique des biotraceurs. La purification des biotraceurs par HPLC-SEC permet en effet de collecter la fraction correspondant à l'excédent de sondes. Cette fraction est alors dosée par spectrophotométrie selon une technique bien connue de l'homme du métier. La masse de sondes greffées est alors déduite par différence entre la masse connue de sondes injectées dans la colonne à chromatographie et la quantité de sondes en excès collectée. La connaissance de la masse de sondes enzymatiques greffées permet ainsi d'évaluer un nombre moyen de sondes greffées par phage. On peut alors si besoin, exprimer la quantité de traceurs en équivalent de sondes enzymatiques greffées, ce qui permet alors par spectrophotométrie de mesurer l'activité catalytique des sondes greffées (en d'autres termes l'activité catalytique des biotraceurs) selon une technique bien connue de l'homme du métier. La même étude peut se faire aussi par la méthode ampérométrique selon l'exemple 2. On notera que des purifications successives des lots de biotraceurs ont été menées pour s'assurer de l'efficacité du procédé de purification.
Un exemple de quantification des sondes greffées est détaillé ici. Les traceurs sont notamment obtenus en marquant une suspension de phages biotinylés purifiée par des sondes enzymatiques en excès à une concentration C1 de 71.46 ± 1.79 μg ml_"1 (selon le protocole décrit précédemment), conduisant donc à un mélange de traceurs et de sondes enzymatiques en excès. Deux pics sont distingués à l'issue de la purification par HPLC-SEC du mélange de traceurs et de sondes en excès (Figure 8) : le pic de traceurs (pic d'exclusion total) qui sera nommé T1 et le pic de sondes libres en excès (centré sur 15.09 ± 0.07 mL) qui sera nommé S1. Les sondes en excès seront désormais appelées sondes libres en excès par opposition aux sondes fixées sur les phages dans le cas des traceurs. La détermination de la masse de sondes greffée sur les phages est donc réalisée en dosant par spectrophotométrie la masse de sondes libres en excès et en la soustrayant à la masse de sondes injectée dans la colonne (soit initialement 71.46 ± 2.00 μg).
Bien que la séparation des pics de traceurs et de sondes libres en excès soit effective (avec un coefficient de séparation moyen < R > = 1.29 ± 0.1 %), mais aussi que la concentration de sondes libres utilisée pour le marquage (soit 71.46 ±
1.79 μg mL"1) ait été optimisée (de manière à ce que la réaction de greffage soit totale et que l'excédent de sondes soit minimisé), les deux pics présentent tout de même une zone moins résolue (entre 12.00 et 13.50 mL de volume d'élution) où les pics ne reviennent pas à la ligne de base (Figure 8). Ainsi, une partie seulement de chaque pic (VCOιιτi et VCOιιsi respectivement) est collectée et dosée; en particulier, les volumes collectés VCOιιτi (entre 7.50 et 10.00 mL de volume d'élution) et VCOιιsi (entre 13.50 et 18.00 mL de volume d'élution) sont définis de telle sorte que le risque de souillure soit minimal entre la fraction collectée du pic de traceurs T1 et la fraction collectée du pic de sondes libres en excès S1.
La Figure 9 illustre la méthodologie détaillée employée pour accéder à la masse mT1totai de sondes fixée sur les phages. Dans la Figure 9, les courbes 1 et 3 sont celles de la Figure 5, relatives respectivement à la sonde enzymatique seule et à un mélange de traceurs et de sondes en excès. On désignera par :
• Ci la concentration de sondes libres utilisée pour le marquage des sondes,
• Vιnjθctιon le volume du mélange de traceurs et de sondes en excès injecté dans la colonne,
• mSO la masse de sondes injectée dans la colonne,
• [S1 ]coiiθctéθ la concentration de sondes dans la fraction collectée de sondes libres en excès S1 ,
• mS1 collectée la masse collectée de sondes libres en excès, • mS1 total la masse totale de sondes libres en excès,
• mS1 T1 la masse de sondes libres en excès présentes dans la fraction collectée de traceurs T1 ,
• rS1 le rapport de l'aire collectée sous le pic de sondes en excès S1 sur l'aire totale sous le pic S1 , • mT1 total la masse de sonde greffée sur les phages.
Dans un premier temps, la concentration [S1 ]COιiectée de sondes libres en excès est déterminée dans la fraction de sondes libres en excès S1 collectée (entre 13.50 et 18.00 ml_) après la purification, par un dosage spectrophotométrique au pyrogallol selon une technique bien connue de l'homme du métier. Pour cela, l'activité enzymatique spécifique kcatSoNDEHPLC des sondes libres utilisées pour la réalisation des traceurs a été préalablement mesurée, après passage dans la colonne HPLC, par spectrophotométrie au pyrogallol : la détermination de la concentration de sondes libres en excès dans la fraction de sondes libres en excès S1 collectée est donc conduite en prenant kcatsoNDEHPLC (dans l'exemple présenté ici, kcatSoNDEHPLC = 4.76 104 min"1, ± 2.1 %). Le volume collecté Vcoiisi de la fraction de sondes libres en excès S1 étant connu, il est donc possible d'accéder à la masse mS1 Coiiectée de sondes libres en excès collectée. mS1 collectée = [S1 ]collectée - VC0||S1 (5) Puis, le paramètre rS1 permet, en utilisant la propriété de proportionnalité des aires de pics HPLC-SEC avec les masses, d'accéder à la masse totale m S 1 total de sondes libres en excès. mS1 total = mS1 collectée / I"S1 (6) Dans l'étape 2, la masse totale mT1 totai de sondes greffées est calculée en retranchant la masse totale mS1 totai de sondes libres en excès à la masse mSO de sondes injectée initialement. mT1 total = mSO - mS1 total (7)
Les valeurs des paramètres connus ou mesurés au préalable de la détermination de la masse totale mT1totai de sondes greffées pour cet exemple, sont récapitulées dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 : Paramètres connus ou mesurés au préalable de la détermination de la masse mT1totai pour cet exemple.
Le tableau 2 ci-dessous présente les masses mT1totai totales de sondes greffées ainsi que les masses intermédiaires ayant permis leur calcul, pour trois lots de traceurs réalisés à partir du même lot de phages natifs, dans les mêmes conditions de synthèse (selon le protocole décrit précédemment). Tableau 2 : Masses totales mT1totai de sondes greffées pour trois lots de traceurs réalisés à partir du même lot de phages natifs, dans les mêmes conditions de synthèse.
En conclusion, la démarche adoptée a permis d'accéder à la masse moyenne totale < mT1totai> de sondes greffée (soit 38.83 1 3.92 μg), qui représente 54.3 % de la masse totale mSO de sondes introduite initialement dans la colonne (soit 71.46 1 2.00 μg). Ce résultat traduit l'efficacité du marquage et confirme le fait qu'en injectant initialement deux fois moins de sondes (soit, 35.30 1 0.82 μg), tous les phages biotinylés ne sont pas marqués par les sondes alors en défaut (Figure 5, courbe 4). D'autre part, les résultats du tableau 2 permettent de répondre quantitativement sur la bonne reproductibilité du protocole de synthèse des traceurs.
A ce stade, il est alors possible de déterminer le nombre moyen de sondes fixées par phage. Selon les données fournisseur, la masse moléculaire Mprobe des sondes enzymatiques utilisées pour la synthèse des traceurs est 140 kDa. Ainsi, la masse moyenne totale < mT1totai> de sondes greffées correspond à un nombre moyen total N de molécules de sondes greffées : N = 1.67 1014 molécules de sondes (1 14.3%). De plus, la quantité moyenne Q de traceurs dans les mélanges de traceurs et de sondes libres en excès à purifier, exprimée en équivalent pfu, est quantifiable à partir de la concentration moyenne des phages biotinylés utilisés pour le marquage des sondes (i.e. 2.75 1 0.27 1012 pfu mL"1 déduite de la mesure des aires de pics HPLC-SEC correspondantes) et du volume d'injection Vmjection (compte-tenu du fait que la dilution introduite pour le marquage des sondes est négligeable). Ainsi, la quantité moyenne Q de traceurs injectée dans la colonne est : Q = 2.75 1012 pfu (CV = 10.1 %). Le nombre moyen Nb de sondes fixées par phages se déduit donc en divisant N par Q, soit Nb = 61 1 18 ; ce qui correspond à près d'un tiers des 180 sites de fixation disponibles sur la capside des phages. En particulier, une étude similaire réalisée à partir d'une suspension de phages natifs plus faible a montré une meilleure efficacité de marquage.
La reproductibilité de la méthode de marquage exposée ci-dessus a été évaluée sur neuf lots de biotraceurs réalisés à partir du même lot de phages natifs dans les mêmes conditions. Les résultats obtenus (une étude qualitative répliquée
4 fois et 2 études quantitatives : l'une répliquée 3 fois et l'autre 2 fois) attestent d'une très bonne reproductibilité de la méthode décrite.
Une caractérisation granulométrique des biotraceurs peut être réalisée. A titre d'exemple, les biotraceurs synthétisés à partir de phages MS2, marqués à la biotine et par le complexe neutravidine-HRP montrent un diamètre moyen de 64,5 nm, ce qui les rend parfaitement pertinents pour la caractérisation de système d'ultrafiltration ou de microfiltration. Cette technique de marquage peut donc être généralisée à toute capside protéique dont les structures sont compatibles pour un marquage.
Exemple 2 : détection ampérométrique
• Première étape :
En solution, si l'enzyme fonctionne à saturation (soit sans limitation due au substrat) et que la réaction catalysée est irréversible, on peut écrire :
[O](t) = [enzyme]totaiθ- kcat -t [équation 1] avec : - [O](t) : concentration en donneur oxydé formé en solution au temps t (en mol. L"1),
- [enzyme]totaiθ : concentration totale en enzymes greffées présentes en solution (en mol. L"1),
- kcat : activité molaire de l'enzyme greffée (en mol. mol"1. min"1 soit min"1), - 1 : temps de la réaction catalysée par les enzymes greffées (min).
La constante kcat traduit plus explicitement le nombre de molécules de donneur oxydé formé en solution par molécule d'enzyme présente en solution et par unité de temps. Pour l'enzyme choisie, dont la cinétique peut être modélisée par une cinétique de type Michaelis-Menten (donnée de la littérature : Veitch et al. Phytochemistry 65, 249-259 (2004), vérifiée expérimentalement), l'enzyme fonctionne à saturation lorsque la concentration en substrat [S] n'est pas limitante : [S] > 1 Ox Km (Km = constante de Michaelis-Menten en mol. L"1 de l'enzyme choisie). Dans le cadre de l'étude, la concentration [S] fixée est toujours choisie de manière à remplir cette condition quelle que soit la gamme des concentrations en enzyme utilisées.
• Seconde étape :
D'autre part, dans le cas d'un régime contrôlé par la diffusion, le courant généré au temps t : l(t), lié à la réduction du donneur oxydé sur l'électrode, est le courant limite de diffusion. Ce courant est un courant cathodique de réduction, donc compté négativement et suit la loi suivante : l(t) = - n.F.S.Do.[0](t)/δ [équation 2] avec :
- l(t) : courant de réduction généré au temps t (A ou Cs"1),
- [O](t) : concentration en donneur oxydé formé en solution au temps t (mol. m"3),
- n : nb d'e- échangés (-), - F : cte de Faraday (C.mol"1),
- S : surface active d'électrode (m2),
- Do : coefficient de diffusion de O vers l'EDT (m2.s"1),
- δ : couche de diffusion (m).
Cette loi traduit la diminution du courant avec l'augmentation de la quantité de donneur oxydé formé au cours du temps.
Le transfert du donneur oxydé vers l'électrode de travail est contrôlé par la diffusion si l'hydrodynamique au sein de la solution est fixée par l'électrode de travail : en l'occurrence une électrode à disque tournant et que la vitesse de rotation de l'électrode ω (tr.min"1) est choisie telle que, à tout moment, la quantité de donneur oxydé O consommé à l'électrode soit inférieure à 1 % de la quantité totale de donneur oxydé O présente en solution.
En introduisant l'équation 1 dans l'équation 2, il vient donc : l(t) = - n.F.S.Do.kcat.t.[enzyme]totaiθ /δ [équation 3\ Au bout d'un certain temps, ce courant se stabilise (cela est du à l'oxydation totale du donner d'électrons R). Dans ces conditions, la concentration en donneur oxydé O est constante et le courant limite de diffusion est constant. On l'appelle 5 courant limite de diffusion en régime stationnaire et on le note Istationnare
D'après l'équation 3, il apparaît donc si que si l'on choisit un temps t suffisant pour que le courant soit significatif, il est possible de corréler le courant mesuré à ce temps là à la quantité d'enzymes totale présente en solution.
Cependant, pour plus de précision et pour se dédouaner de tout souci de 10 référence en courant, on peut préférer travailler avec la pente à l'origine Vo (A.s"1) définie en dérivant l'équation 3 par rapport au temps :
Vo = (dl/dt)t=o = - n.F.S.Do.kcat-[enzyme]totaiθ/δ = constante [équation 4] Soit en valeur absolue : I Vo | = | (dl/dt)t=o I = n.F.S.Do.kcat-[enzyme]totaiθ/δ [équation 5] 15
Ainsi, en mesurant expérimentalement la pente Vo et avec une courbe d'étalonnage obtenu par ampérométrie et/ou par spectrophotométrie, il est possible d'accéder à la quantité d'enzymes greffées dans la cellule de mesure et donc à la quantité de biotraceurs dans la cellule de mesure et par des
20 considérations de volumes à la quantité en traceurs dans l'échantillon.
Afin d'expliciter l'emploi conjoint du biotraceur et de la méthode de détection dans l'étude visée, un schéma général est présenté en Figure 6.
Une telle étude menée à des temps différents permet de connaître l'évolution de la concentration en biotraceurs dans le perméat au cours de la filtration. 25 L'alimentation et le rétentat (ou concentrât) peuvent analysés selon la même démarche.
1. 1. Système et protocole de mesure
30 a. Réactifs et matériels
' Réactifs :
- 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine encore appelé TMB (SIGMA Aldrich, réf. 87750), - Peroxyde d'hydrogène (ROTH, Hydrogen Peroxide 30 % stabilisé, réf. 8070),
- Sels nécessaires à la réalisation de tampons et électrolytes : o NaCI (Roth, réf. 3957), o Na2HPO4, 2H2O (Roth, réf. 4984), o NaH2PO4, 2H2O (Roth, réf. T879), o Acide citrique (Sigma, réf. 251275).
• Matériel : Un système complet de détection ampérométrique (Metrohm).
Le potentiostat choisi est un MicroAutolab (Metrohm), ayant une résolution de 30 fA et mesurant le nA de manière répétable. La cellule ampérométrique est une cellule en verre de Karl Fisher thermostatable (Methrom) à couvercle plat pour permettre un nettoyage et un positionnement des électrodes plus facile, de volume maximum 130 mL. Deux canules permettant un barbotage en diazote peuvent également être positionnées sur le couvercle. L'électrode de travail choisie est une électrode à disque tournant (EDT) Metrohm de surface active un disque platine de diamètre 5 ou 3 mm, adapté au volume de travail de la cellule. L'électrode de travail présente un contact mercure entre la tige tournante et le corps d'électrode, assurant ainsi une transmission du signal minimisant le bruit. Le système d'asservissement de l'EDT permet d'imposer une vitesse de rotation comprise entre 100 et 10000 rpm. La contre-électrode est une grille de platine de surface active choisie 6,5 fois plus grande que celle de l'électrode de travail. L'électrode de référence choisie est une électrode Ag/AgCI à double jonction. On notera que les paramètres volume de cellule, matériau et surface de l'électrode de travail, surface et géométrie de la contre-électrode peuvent varier en fonction de l'optimisation du système de détection et les différentes applications désirées.
b. Protocole de mesure
L'enzyme choisie admet de nombreux donneurs d'électrons possibles. Dans le cadre de l'application et au vu de la littérature (Volpe et al., Analyst, June 1998, Vol. 123 (1303-1307)), le donneur d'électrons utilisé pour cet exemple est le TMB. L'enzyme étant la HRP, l'oxydant est le peroxyde d'hydrogène. Le rapport de la concentration en peroxyde d'hydrogène sur la concentration en TMB est fixé à 5.
Le volume total maximal de solution à analyser est fixé à 78 mL avec ce système. Les concentrations de réactifs : c'est-à-dire TMB et peroxyde d'hydrogène sont choisis de manière à ce que l'enzyme fonctionne à saturation.
La quantité de TMB est inférieure à celle du peroxyde d'hydrogène pour limiter la réaction spontanée. L'électrolyte tampon choisi est un tampon citrate-phosphate pH = 5 à 0,1 mol. L"1 contenant aussi 0,1 mol. L"1 d'électrolyte NaCI. Un disque de 5 mm en platine est choisi comme surface active de l'électrode de travail. La vitesse de rotation de l'EDT est fixée à 1 130 rpm.
Avant toute mesure, une analyse du blanc (c'est-à-dire TMB et peroxyde d'hydrogène seuls en présence) est effectuée pour quantifier la part de la réaction spontanée sur le courant produit et donc sur les pentes à l'origine mesurées.
Le mécanisme d'oxydation du TMB est un mécanisme à deux étapes
(Josephy et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 257, n°7, Issue of April
10, pp. 36669-3675, 1982) générant deux formes oxydées du TMB : un composé intermédiaire oxydé partiellement noté TMBoxi lors de la première étape, et un composé oxydé totalement noté TMBox2 lors de la seconde étape.
Il est au choix possible de doser TMBoxi ou TMBox2. Dans le cas où TMBox2 est dosé (Fanjul-Bolado et al., Anal. Bioanal. Chem. (2005) 382: 297- 302), le protocole de mesure comprend :
- une étape d'incubation de la solution contenant au moins un biotraceur, les réactifs : TMB et peroxyde d'hydrogène, et l'électrolyte tampon. Cette étape d'incubation est réalisée dans la cellule de mesure ampérométrique pendant 1 à 30 min sous agitation,
- une étape de rajout d'acide phosphorique concentré de manière à oxyder tout le TMBoxi possiblement présent en solution en TMBox2, - une étape de mesure de courant dans la minute suivant l'introduction de l'acide phosphorique. Dans cet exemple, le TMBoxi est préférentiellement dosé. Pour analyser un échantillon, celui-ci est introduit dans la cellule de mesure. La tension de polarisation est fixée à 240 mV. Le volume maximal échantillonable est fixé à 60 mL. Le volume de la cellule, déduit du volume des réactifs, est complété avec de l'électrolyte tampon. L'EDT est mise en rotation, cela suffit pour assurer le mélange du volume à analyser. Puis, le TMB est introduit et le peroxyde d'hydrogène à son tour. Dès l'introduction du peroxyde d'hydrogène, l'acquisition démarre. L'analyse est actuellement menée à température ambiante sans désoxygénation de la solution. Le temps d'acquisition pour le blanc est fixé à la durée maximale d'analyse. Le temps d'acquisition pour l'analyse des échantillons est choisi de manière à ce que le nombre de points acquis soit suffisant pour avoir une bonne précision sur la mesure de la pente Vo. La durée de l'analyse varie de 1 à 15 min.
La figure 7a montre un exemple de courbes ampérométriques. Quatre volumes d'une même alimentation en biotraceurs ont été analysés, correspondant à quatre concentrations en biotraceurs dans la cellule de mesure, exprimées en unité de dénombrement de phages natifs : CO, 2,00 x CO, 4,65 x CO et 5,80 x CO. La figure 7b représente la droite de calibration associée à l'exemple (donnant les pentes mesurées en fonction des concentrations en traceurs dans la cellule). La linéarité de la pente avec la concentration en traceurs traduit le fait que, sur cette gamme de concentrations, le greffage peut être considéré comme uniforme.
La figure 10 montre un exemple de réponses ampérométriques obtenues en analysant l'alimentation et les perméats collectés en fin de filtration pour une membrane de microfiltration (MF) et une membrane d'ultrafiltration (UF). En particulier, la réponse obtenue pour le perméat MF met en évidence que la membrane de microfiltration laisse passer des traceurs partiellement comme la pente ampérométrique correspondant au perméat MF est plus faible que la pente de l'alimentation. La réponse relative au perméat UF est quant à elle similaire au blanc, ce qui signifie qu'il n'y a pas eu de détection des traceurs dans le perméat UF. Les résultats présentés en Figure 10 soulignent donc la capacité de la méthode développée à caractériser différents comportements membranaires. La figure 1 1 montre un exemple de caractérisation de la rétention en dynamique obtenu avec un module endommagé de fibres creuses d'ultrafiltration utilisées en production d'eaux potables. Lors de cette expérience, un échelon de traceurs a en particulier été appliqué sur environ un tiers du temps total de la filtration (qui a été conduite en frontal à pression transmembranaire constante) et le perméat a été collecté au cours de la filtration pour analyse. Les concentrations en traceurs mesurées dans le perméat collecté en cours de filtration sont données en fonction du temps de filtration. Notamment, les résultats obtenus montrent que l'on peut suivre en dynamique la rétention des traceurs par la membrane. Ainsi, il a pu être observé que la concentration en traceurs a augmenté dans un premier temps pour atteindre un maximum vers le milieu de la durée de l'injection puis a diminué.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection par ampérométrie dans un échantillon à analyser d'un biotraceur constitué d'un bactériophage marqué comprenant à sa surface une ou plusieurs sonde(s) enzymatique(s) greffée(s) par l'intermédiaire d'une ou plusieurs molécule(s) de biotine activée préalablement fixée(s) à une ou plusieurs protéine(s) de la capside dudit bactériophage.
2. Procédé selon la revendication 1 , tel que ledit procédé de détection comprend: - la préparation d'une cellule ampérométrique comprenant :
- une électrode de travail,
- une contre-électrode,
- une électrode de référence, ces trois électrodes étant reliées par un potentiostat-galvanostat ; - une solution comprenant l'échantillon à analyser et au moins un biotraceur comme défini ci-avant,
- un électrolyte,
- un oxydant,
- un donneur d'électrons (R), et
- la mesure par ampérométrie du courant ainsi généré.
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le donneur d'électron est choisi parmi le groupe composé de l'iodure ou du 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine.
4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, dans lequel l'électrode de travail est constituée d'un matériau choisi dans le groupe composé de platine, carbone vitreux ou or.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2, 3 ou 4, dans lequel la contre électrode est une électrode de platine.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, dans lequel l'oxydant est le peroxyde d'hydrogène.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes tel que le bactériophage est un phage MS2.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, tel que l'électrolyte comprend en outre un tampon.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, tel que lesdites molécules de biotine activées sont choisies parmi les biotines aptes à réagir avec les groupes aminés primaires.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes tel que ladite sonde enzymatique est un complexe contenant :
- une protéine-support apte à interagir avec la biotine activée, et
- une enzyme de type oxydo-réductase.
11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel ladite protéine-support est choisie parmi la neutravidine, l'avidine ou la streptavidine.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11 , tel que ladite enzyme est la Horse Radish Peroxydase (HRP).
13. Procédé de contrôle d'un système de filtration comprenant :
- l'introduction de un ou plusieurs biotraceur(s) constitué(s) d'un bactériophage marqué comprenant à sa surface une ou plusieurs sonde(s) enzymatique(s) greffée(s) par l'intermédiaire d'une ou plusieurs molécule(s) de biotine activée(s) préalablement fixée(s) à une ou plusieurs protéine(s) de la capside dudit bactériophage dans l'alimentation dudit système,
- l'étape de détection de(s)dit(s) biotraceur(s) dans le perméat et/ou dans le rétentat dudit système de filtration par ampérométrie, selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.
14. Procédé selon la revendication 13, comprenant en outre:
- l'étape de détection de biotraceurs dans l'alimentation dudit système, puis
- la comparaison du courant obtenu dans le perméat et/ou rétentat avec le courant obtenu dans l'alimentation.
15. Biotraceur constitué d'un bactériophage MS2 marqué, ledit bactériophage comprenant à sa surface une ou plusieurs sondes enzymatique(s) greffée(s) par l'intermédiaire d'une ou plusieurs molécule(s) de biotine activée préalablement fixée(s) à une ou plusieurs protéine(s) de la capside dudit bactériophage.
16. Biotraceur selon la revendication 15, tel que la(les) sonde(s) enzymatique(s) et/ou la(les) molécule(s) de biotine activée(s) sont telles que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.
17. Procédé de préparation du biotraceur selon l'une quelconque des revendications 15 au 16 comprenant les étapes suivantes :
- accrochage d'une ou plusieurs molécule(s) de biotine activée(s) à au moins une protéine présente à la surface du bactériophage à marquer, puis - greffage d'une sonde enzymatique à ladite (auxdites) biotine(s).
18. Procédé selon la revendication 17 comprenant en outre l'étape de purification du biotraceur marqué ainsi obtenu.
19. Procédé selon la revendication 18 tel que ladite purification est effectuée par HPLC-SEC.
20. Procédé selon la revendication 17, 18 ou 19, comportant en outre une étape préliminaire de production des bactériophages à marquer par amplification, puis mise en suspension et purification.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, dans lequel ladite molécule de biotine activée est accrochée à une lysine des protéines de surface du bactériophage.
22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 21 comprenant en outre l'étape de quantification du nombre moyen de sonde(s) greffée(s) par bactériophage.
23. Kit comprenant : - une solution comprenant au moins un biotraceur constitué d'un bactériophage marqué comprenant à sa surface une ou plusieurs sonde(s) enzymatique(s) greffée(s) par l'intermédiaire d'une ou plusieurs molécule(s) de biotine activée préalablement fixée(s) à une ou plusieurs protéine(s) de la capside dudit bactériophage, et - une cellule ampérométrique comprenant une électrode de travail, une contre- électrode, une électrode de référence,
- un électrolyte,
- un donneur d'électron, et
- un oxydant.
24. Kit selon la revendication 23 comprenant en outre un tampon.
25. Kit selon la revendication 23 ou 24 tel que ladite solution, les dites électrodes et/ou biotraceur sont tels que définis selon l'une quelconque des revendications 2 à 12.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9828626B2 (en) 2015-07-10 2017-11-28 Pall Corporation Dendrimer conjugates for determining membrane retention level and/or pore structure
CN105238765A (zh) * 2015-10-29 2016-01-13 广州呼研所生物技术有限公司 大肠杆菌噬菌体ms2内标质控品的制备、应用和试剂盒
US10768177B2 (en) * 2018-08-29 2020-09-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Bacteriophage-based electrochemical biosensor

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61501489A (ja) * 1984-03-19 1986-07-24 ユニバ−シテイ　オブ　イリノイ 認識及び同定剤としてのバクテリオファ−ジ
DE4003543A1 (de) 1990-02-06 1991-08-08 Orpegen Med Molekularbioforsch Verfahren zur abreicherung von viren in loesungen und zur bestimmung der abreicherungsrate von viren
US5731164A (en) 1991-08-06 1998-03-24 Sanorell Pharma Gmbh & Co. method of checking the rate of removal of pyrogenic substances, in particular viruses, from organic material
JP3803945B2 (ja) * 1997-10-02 2006-08-02 株式会社三菱化学ヤトロン 過酸化水素分析型酵素電極
US7011758B2 (en) * 2002-02-11 2006-03-14 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Methods and systems for membrane testing
DE10223960A1 (de) * 2002-05-29 2003-12-11 Kist Europe Forschungsges Mbh Enzymimmunoassay
US8206946B2 (en) * 2003-03-24 2012-06-26 Mary Beth Tabacco Fluorescent virus probes for identification of bacteria
US8855955B2 (en) * 2005-09-29 2014-10-07 Custom Array, Inc. Process and apparatus for measuring binding events on a microarray of electrodes
WO2007046095A2 (fr) * 2005-10-17 2007-04-26 Yissum, Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Procede permettant de controler l'integrite des membranes
JP4892686B2 (ja) * 2007-02-27 2012-03-07 国立大学法人富山大学 酵素センサ、該酵素センサを使用した分析方法及びキット

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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