EP2303934A1 - Verfahren zur enzymkatalysierten hydrolyse von polyacrylsäureestern sowie dafür zu verwendende esterasen - Google Patents

Verfahren zur enzymkatalysierten hydrolyse von polyacrylsäureestern sowie dafür zu verwendende esterasen

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Publication number
EP2303934A1
EP2303934A1 EP09780760A EP09780760A EP2303934A1 EP 2303934 A1 EP2303934 A1 EP 2303934A1 EP 09780760 A EP09780760 A EP 09780760A EP 09780760 A EP09780760 A EP 09780760A EP 2303934 A1 EP2303934 A1 EP 2303934A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
esterase
mutant
enzyme
polyacrylic acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP09780760A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Bernhard Hauer
Hans Wolfgang HÖFFKEN
Cecilia KVARNSTRÖM BRANNEBY
Helmut Schwab
Sabine Feichtenhofer
Marlene Buchebner
Brigitte Pohn
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Priority to EP09780760A priority Critical patent/EP2303934A1/de
Publication of EP2303934A1 publication Critical patent/EP2303934A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/12—Hydrolysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01001—Carboxylesterase (3.1.1.1)

Definitions

  • the present invention relates to a process for the enzyme-catalyzed hydrolysis of polyacrylic acid esters, the enzymes and mutants thereof used, the nucleic acids encoding the nucleic acids, the nucleic acids comprising vectors, the microorganisms comprising the vectors, the use of the enzymes, the vectors or the microorganisms for carrying out a Process for the enzyme-catalyzed hydrolysis of polyacrylic acid esters.
  • the present application further relates to polymeric reaction products obtainable by the process and to processes for the preparation of esterases.
  • Polyacrylates are compounds with numerous applications. For polyacrylates of homopolymers, there are rather limited applications, while it is possible with copolymers of polyacrylates, by selecting the comonomers to be used (such as methyl acrylates, styrene, acrylonitrile, vinyl acetate, vinyl chloride, vinylidene chloride and butadiene) the properties of the polyacrylates in more diverse To influence way and thus make various uses available.
  • the comonomers such as methyl acrylates, styrene, acrylonitrile, vinyl acetate, vinyl chloride, vinylidene chloride and butadiene
  • esterases are known to those skilled in the art. Esterases from Burkholderia gladioli are described, for example, in Peterson et al., J. Biotechnol. 89: 1-25 (2001), Valinger et al, J. Biotechnol. 129: 98-108 (2007), Ivancic et al, J. Biotechnol. 129: 109-122 (2007) and Reiter et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 778-785 (2000). A suitability of these esterases for the cleavage of polymeric substrates has not been described.
  • the object underlying the present invention is thus to provide a process for the enzyme-catalyzed hydrolysis of polyacrylic acid esters and enzymes suitable therefor, their nucleic acids, the vectors containing nucleic acids or the microorganisms containing vectors, and reaction products obtainable by the process.
  • esterases in particular enzymes selected from carboxylesterases, triacylipases and cutinases, in a process for the enzyme-catalyzed hydrolysis of polyacrylic acid esters and by the provision of appropriate esterases and the nucleic acids coding therefor.
  • Figure 1 shows a structural model of EstB. Two loops, identified as covering access to the catalytically active center, are highlighted and marked by arrows. The lightened and also indicated by an arrow amino acid residue represents the nucleophilic serine of the active center.
  • Figure 2 shows a structural model of EstC according to SEQ ID NO: 2, wherein phenylalanine 138 was replaced by alanine (Phe138Ala, corresponding to the mutant 1 K22 in Figure 5).
  • the backbone of the polypeptide chain is given.
  • the amino acid phenylalanine in position 138 which is indicated by an arrow, is designed as a spherical model; the amino acids indicated below as Phe138 as a spherical model correspond to the amino acids Ser112, Asp242 and His275 belonging to the catalytically active center.
  • Figure 3 shows a structural model of EstC according to SEQ ID NO: 2, wherein leucine 193 was replaced by alanine (Leu 193AIa, corresponding to the mutant 2K20 in Figure 5).
  • the backbone of the polypeptide chain is given.
  • the amino acid leucine at position 193, indicated by an arrow, is designed as a spherical model, which is shown above Leu193
  • the amino acids indicated as the calotte model correspond to the amino acids Ser112, Asp242 and His275 belonging to the catalytically active center.
  • Figure 4 shows a structural model of EstC according to SEQ ID NO: 2, wherein phenylalanine 138 was replaced by alanine, leucine 193 by alanine, and threonine 188 by serine (Phe138Ala, Leu193Ala, Thr188Ser, corresponding to mutant B48 in Figure 5).
  • the backbone of the polypeptide chain is given.
  • An arrow indicates the amino acids Phe138, Thr188 and Leu193, which are designed as a spherical model.
  • the remaining amino acids indicated as the spherical model correspond to the amino acids Ser1 12, Asp242 and His275 belonging to the catalytically active center.
  • EstB and its mutants were not tested for ⁇ -naphthyl acetate when collecting this data, but the inventors have data that all three EstB variants have activity with respect to this substrate.
  • FIG. 6 shows the enzyme-catalyzed ester cleavage of PBA after addition of crude lysate of the esterase-producing strain NJ70 (corresponding to 1000 units of EstB_NJ70) in comparison to chemical ester cleavage after addition of crude lysate after denaturation.
  • FIG. 8 shows the pH dependence of the enzyme-catalyzed ester cleavage. All measurements were performed with 1000 units of EstB_NJ70 (determined with p-NPB) and 750 ⁇ l of PBA.
  • FIG. 9 shows the temperature dependence of the enzyme-catalyzed ester cleavage. All autotitrations were performed with 1000 units of EstB_NJ70 (determined with p-NPB) and 750 ⁇ l of PBA.
  • FIG. 10 shows the reaction course of the ester cleavage by EstB_NJ70 in solution or immobilized EstB_NJ70. Shown are the results of autotitrations with 4.66 mmol PBA of either non-immobilized or Eupergit immobilized EstB_NJ70.
  • Figure 1 1 shows the cleavage of polyacrylic acid methyl esters of different chain length, wherein denatured enzyme was used for the control.
  • esterases are, unless further specification is specified, generally referred to as enzymes which catalyze the hydrolysis of ester bonds.
  • ester bond-acting enzymes are meant enzymes of class 3.1 according to EC classification.
  • Carboxylic acid ester hydrolases are understood to mean enzymes of class 3.1.1 according to EC classification.
  • Carboxylesterases are enzymes of the EC classes 3.1.1.1, 3.1.1.3 and 3.1.1.74, respectively.
  • type C esterases are enzymes which have at least 50% identity at the amino acid level with Este from Burkholderia gladioli (Reiter et al., Appl Microbiol Biotechnol 54: 778-785 (2000) according to SEQ ID NO: 2) at least 20% identity at the amino acid level with the hydroxynitrile lyase from Hevea brasiliensis (Hasslacher M et al, J Biol Chem 271: 5884-5891 (1996), GenBank Accession No.
  • an "enzyme-catalyzed hydrolysis" of a polyacrylic acid ester also includes reactions which include a partial autolysis.
  • Autolysis is a proportion of 0-90 mol%, 0-50 mol%, 0-25 mol%, 0-20 mol%, in particular 0-15 mol%, 0-10 mol%, 0 - 5 mol% or 0 - 1 mol% of the ester groups are autolytically cleaved.
  • halogen fluorine, chlorine, bromine or iodine.
  • a loop or a loop structure is understood to mean a section of amino acids following one another in the primary structure, which forms a loop-shaped structural element in the tertiary structure of the protein.
  • hydrolysis of polyacrylic acid esters or the hydrolysis activity towards polyacrylic acid esters is understood as meaning the incomplete or complete hydrolysis of the ester bonds of the polyacrylic acid esters.
  • the average molecular weight is understood as meaning the weight-average molecular weight.
  • An alternating copolymer is understood to mean a copolymer consisting of two monomers A and B, the monomers being present in a strictly alternating sequence (AB) n .
  • a random copolymer is understood as meaning a copolymer in which the incorporation of the monomers (for example A and B) into the macromolecule formed during the copolymerization occurs randomly, ie purely randomly in the sequence.
  • a gradient copolymer is understood as meaning a copolymer in which there is a gradient of the distribution of the monomer building blocks (for example of building blocks A and B) along the chains of the copolymers.
  • a block polymer is meant a polymer whose molecules consist of linearly linked blocks.
  • a block By a block is meant a portion of a polymer molecule comprising a plurality of identical repeat units and having at least one constitutional or configurational feature different from that of the adjacent portions (blocks).
  • the blocks are connected directly or by constitutional units that are not part of the blocks.
  • Block copolymers are understood as meaning block polymers which consist of more than one type of monomer and which can be described, for example, from two monomer types A and B, by the general formula -A k -B r A m -B n - , where k, I, m and n for the number of repetition units in the stand by individual blocks.
  • Graft copolymers are polymers produced by the process of graft copolymerization, the structure of which is characteristic in that they carry side chains on their main chain which are of a length such that they would already have to be addressed as polymers. Main and side chains can be chemically identical or different.
  • Alcohol derivatives are understood as meaning molecules derived from alcohols, for example alcohols in which one or more hydroxy groups have been replaced by other functional groups, such as, for example, amino groups or sulfhydryl groups.
  • a "partial" ester cleavage occurs when the originally contained (ie, generally cleavable) ester groups have not been cleaved after carrying out the process of the invention, for example, a partial cleavage may involve values of from 0.1 to 99.9% of the originally contained ester groups, such as eg at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20%, or at most 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 9 ', 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80%, eg 1 to 95, 2 to 90, 3 to 85, 4 to 80, 5 to 75, 6 to 70, 7 to 65, 8 to 60, 9 to 55, 10 to 50, 11 to 45, 12 to 40, 13 to 35, 14 to 30, 15 to 25 or 16 to 20%
  • the cleavage may be regio-nonspecific, ie
  • a “mutant of an esterase according to SEQ ID NO: X” or a “mutant derived from SEQ ID NO: X” means that, starting from this SEQ ID NO: X, this mutant is by virtue of at least one mutation described herein or at least a combination of mutations described herein.
  • a first subject of the invention relates to processes for the enzyme-catalyzed hydrolysis of polyacrylic acid esters, wherein at least one polyacrylic ester is incubated which incubates at least one polyacrylic acid ester with at least one enzyme selected from ester bond-acting enzymes (EC 3.1) until those in the polyacrylic acid ester contained ester groups partially or completely hydrolytically cleaved, and optionally isolated thereby obtained modified polymer.
  • the polyacrylic acid ester may be a homopolymer or a copolymer of two or more different monomers.
  • the enzyme is selected from carboxylic acid ester hydrolases (EC 3.1.1).
  • the carboxylic acid ester hydrolases are selected from carboxyl esterases (E.C. 3.1.1.1), triacylglycerol lipases (EC 3.1.1.3) and cutinases (EC 3.1.1.74).
  • the polyacrylic acid ester is a homopolymer or a copolymer.
  • copolymers are alternating copolymers, random copolymers, gradient copolymers, block copolymers or graft copolymers.
  • Suitable monomers of the copolymers are, for example, all monomers disclosed herein.
  • the polymer comprises monomer building blocks of the general formula I.
  • R 1 , R 2 and R 3 are the same or different and are selected from H, a straight-chain C 1 -C 2 0 hydrocarbyl radical and a branched C 3 -C 2 O hydrocarbyl radical
  • R 4 is selected from H, a straight-chain one C 1 -C 2 0 or dC 6 hydrocarbyl radical, a branched C 3 -C 20 or C 3 -C 6 hydrocarbyl radical and a cyclic C 3 -C 20 or C 5 -C 7 hydrocarbyl radical, where the hydrocarbyl radical is optionally substituted by one or more more identical or different groups selected from hydroxy, amino, epoxy groups and halogen atoms, being selected in the polymer in at least one monomer of the formula IR 4 under a straight-chain CrC 20 or -C 6 hydrocarbyl group, a branched C 3 -C 20 or C 3 -C 6 hydrocarbyl radical and a cyclic C 3 -C 20 or C 5 -
  • Straight-chain C 1 -C 2 0 hydrocarbyl radicals include methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, He- Xyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, Tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, nonodecyl and eicosyl radicals.
  • Branched C 3 -C 2 O hydrocarbyl radicals include, for example, isopropyl, isobutyl, isopentyl, 2,2-dimethylpropyl, isohexyl, 3-methylpentyl, 2,2-dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl, isoheptyl, 3-methylhexyl, 2,2-dimethylpentyl, 2,3-dimethylpentyl, 2,4-dimethylpentyl, 2,2,3-trimethylbutyl, isooctyl, 3-methylheptyl, 4-methylheptyl, 2, 2-dimethylhexyl, 2,4-dimethylhexyl, 2,5-dimethylhexyl, 2,2,3-trimethylpentyl, 2,2,4-trimethylpentyl, 2, 2, 5-trimethylpentyl and isononyl radicals.
  • C 3 -C 2 O cycloalkyl radicals are cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, cyclononyl, cyclodecyl, cycloundecyl, cyclododecyl, cyclotridecyl, cyclotetradecyl, cyclopentadecyl, cyclohe - xadecyl, cycloheptadecyl, cyclooctadecyl, cyclononadecyl and cycloeicosyl radicals.
  • Nonlimiting examples of substituted hydroxycarbyl radicals are hydroxymethyl, hydroxyethyl, hydroxypropyl, hydroxybutyl, hydroxylpentyl, hydroxyhexyl, hydroxyheptyl, hydroxoctyl, hydroxynonyl and hydroxydecyl radicals.
  • the polymer of the general formula (I) can thus be a polyol in the presence of a plurality of hydroxyl groups.
  • the hydroxycarbyl radicals are selected from carbohydrates, ie in particular polyhydroxyaldehydes and polyhydroxy ketones, which may be present as monomers, oligomers or polymers.
  • the same or different monomers may occur in a polyacrylic acid ester, and oligomers or polymers may comprise the same or different monomers.
  • Carbohydrates are known to those skilled in the art, and non-limiting examples of polyhydroxy aldehydes include threose, ribose, arabinose, xylose, lyxose, non-limiting examples of polyhydroxy ketones include dihydroxyacetone, erythrulose, ribulose, xylulose, fructose, sorbose, mannoheptulose.
  • the process according to the invention is characterized in that the polyacrylic acid ester contains, in addition to the monomers of the formula I, at least one further monomer component other than 0 to 15 mol%, which is preferably selected from N-vinylformamide , Methacrylic acid, methacrylic acid ester, itaconic acid, itaconic acid ester, vinylphosphonic acid, vinylsulfonic acid, vinyl alcohol, N-vinylimidazole, N-vinylformamide, styrene, maleic acid, maleic acid ester, ethylene, propylene acrylamide and substituted acrylamides, wherein the substituent is selected under a straight-chain CrC 2O or Ci-C ⁇ hydrocarbyl group, a branched C 3 -C 20, or C 3 -C 6 hydrocarbyl and a cyclic C 3 -C 20 or C 5 - C 7 hydrocarbyl radical, wherein the hydrocarbyl radical is optionally substituted by one
  • the acrylic acid groups of the polyacrylic acid esters are completely or substantially completely esterified before the hydrolysis.
  • the average molecular weight of the polyacrylic acid ester is up to about 3,000,000, for example from about 1,000 up to about 3,000,000, in particular up to about 200,000, 150,000, 100,000 or 50,000.
  • the polyacrylic acid ester is preferably selected from methyl polyacrylate having an average molecular weight of from about 20,000 to about 3,000,000, more preferably from about 30,000 to about 50,000, more preferably about 40,000, and polyacrylic acid butyl ester having an average molecular weight from about 20,000 to about 3,000,000, more preferably about 90,000 to about 110,000, in particular about 99,000.
  • the incubation is carried out at a pH of 5 to 14, preferably 7 to 12, 8.5 to 11, 5, in particular at a pH of 9 to 1 1 or at a pH of 7 to 9.
  • the enzyme is present in a solution, in particular in an aqueous, organic or aqueous-organic, organic-aqueous or organic solution.
  • organic-aqueous or aqueous-organic solutions comprise not only homogeneous solutions of completely miscible components (for example water and organic solvent) but also two-phase systems or multiphase systems, for example water-in-oil emulsions, oil-in-water Emulsions, water-in-oil-in-water emulsions, etc.
  • the enzyme is preferably present completely or predominantly in the aqueous phase, the polyacrylic acid ester preferably completely or predominantly in the organic phase.
  • the volume ratio of aqueous to organic component or of aqueous to organic phase is about 75:25 to 25:75, for example about 60:40 to about 40:60, about 55:45 to about 45:55, in particular about 50:50.
  • the enzyme is present in non-immobilized form.
  • the enzyme is present in immobilized form.
  • immobilized enzymes are enzymes covalently or non-covalently bound to microspheres or sheet-like shaped supports. Suitable methods for the immobilization of enzymes are known to the person skilled in the art and are described, for example, in S. Fukui, A. Tanaka, "Enzymes", in: Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th ed., Wiley-VCH, New York, Berlin, 1985, JE Prenosil, OM Kut, IJ Dünn, E.
  • Non-covalent binding of the enzyme may be, for example be achieved by labeling the enzyme with biotin and immobilized on a provided with avidin or streptavidin carrier, labeling of the enzyme by incorporation of histidine tags in its amino acid sequence and immobilized on a nickel-chelated carrier, immobilization of the enzyme by directed against the enzyme
  • Antibodies where the binding epitopes preferably chosen such that the binding between antibody and binding epitope does not or not substantially affect the access of substrate molecules to the active site
  • enzymes present in immobilized form can be part of a two-phase system or multiphase system.
  • an enzyme immobilized on a solid support may be considered as a solid phase present in a liquid phase (water or organic solvent) under a two-phase system, or the enzyme immobilized on a solid support may be a solid phase in an already two- or multi-phase liquid system (for example a water-in-oil emulsion or an oil-in-water emulsion).
  • the method is carried out in a bioreactor.
  • the enzyme is an esterase which is selected from esterases of the family VIII, type C esterases, a cutinase according to SEQ ID NO: 5 or cutinases derived therefrom, and a triacylglycerol lipase according to SEQ ID NO : 6 or triacylglycerol lipases derived therefrom.
  • the type VIII esterase is the esterase B of Burkholderia gladioli (ATCC 10248) according to SEQ ID NO: 1
  • the type C esterase is the esterase C from Burkholderia gladioli (ATCC 10248) SEQ ID NO. 2
  • the invention furthermore relates to functional mutants of said esterases.
  • the esterase is a functional mutant of an esterase according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 with comparable or increased activity compared to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 with respect to the hydrolysis of polyacrylic acid esters, and / or a functional mutant of an esterase according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 with increased stability compared to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, for example against the influence of organic solvents or with respect to the denaturation by elevated temperatures ,
  • the mutant shows in comparison with an esterase according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 an increased hydrolysis activity towards methyl polyacrylate and / or butyl acrylate.
  • the hydrolysis activity can for example be determined quantitatively by a titrati- onsassay in which an ester cleavage takes place in solution and which is compensated by the released acid groups sinking pH by adding NaOH (or another pH correcting agent).
  • Increased hydrolysis activity is present, for example, when the mutant, in comparison with the corresponding esterase according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, causes a faster adjustment of a reaction equilibrium (ie the same amount of NaOH must be added in a shorter time) and / or shifts the equilibrium towards a more complete hydrolysis (ie, more NaOH needs to be added).
  • the hydrolysis activity can further be determined semi-quantitatively in a pH shift assay by incubating the enzyme mutant or a microorganism containing the enzyme mutant with a substrate containing polyacrylic acid, which can be offered for example in an agar medium or on a filter membrane , and determination of the drop in the pH by released acid groups by color change of a simultaneously present pH indicator.
  • Increased hydrolysis activity is present when the mutant, in comparison with the corresponding esterase according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, a faster turn to low pH or a more intense envelope (larger color change to Enzyme-containing Spots around) to lower pH's.
  • the method according to the invention is characterized in that (a) the esterase is a mutant esterase according to SEQ ID NO: 1 which has at least one mutation, such as 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7 mutations, in one or more of the amino acid residues SeM 7, Gly132, Trp134, Arg155, Glu251, Ala311 and Glu316; or
  • the esterase is a mutant esterase according to SEQ ID NO: 2 which has at least one mutation, e.g. 1, 2, 3, 4 or 5 mutations in one or more of the amino acid residues Phe138, Val150, Leu160, Thr188 and Leu193.
  • the method of the invention is characterized in that the esterase is derived from SEQ ID NO: 1 and a) at least one such as e.g. 1, 2, 3, 4 or 5 mutations of the mutations Ser17Leu,
  • GIyI 32Ser Glu251 Gly, Ala31 1Val and Glu316Lys and / or b) at least one such as e.g. 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7 mutations, the mutations Pro ⁇ Leu,
  • the method according to the invention is characterized in that the esterase is derived from SEQ ID NO: 1 and
  • the method according to the invention is characterized in that the esterase is derived from SEQ ID NO: 2 and comprises one of the following mutations or combinations of mutations (i.e., one of the following single or multiple mutations): (a) Phe138Ala
  • the esterase is a deletion mutant of a type VIII ester ester or a type C esterase.
  • the esterase has a loop reduction.
  • suitable regions for a loop cut in an esterase according to SEQ ID NO: 1 are the regions Glu246 to Arg 258 and Gly312 to 323.
  • Loop cuts can be carried out by removing one or more amino acids, wherein, in the case of removing a plurality of amino acids, in turn one or more amino acids adjacent or not adjacent to SEQ ID NO: 1 can be removed.
  • Particular embodiments represent deletion mutants of the amino acid sequences given under SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 38.
  • Another object of the invention relates to the aforementioned functional esterase mutants.
  • the invention further relates to nucleic acids a) which code for functional esterase mutants, or b) which represent a) complementary nucleic acids, and / or c) nucleic acids hybridizing with a nucleic acid according to a) or b) under stringent conditions, in particular those nucleic acids which have a sequence identity of at least 80% and for a mutant esterase of the
  • Encode family VIII or a type C esterase mutant which hydrolyzes polyacrylic acid esters are included in Encode family VIII or a type C esterase mutant which hydrolyzes polyacrylic acid esters.
  • Another object of the invention relates to a vector comprising one of the aforementioned nucleic acids.
  • the nucleic acid is operably linked to a promoter.
  • Another object of the invention relates to a microorganism comprising at least one of the aforementioned vectors.
  • the invention further relates to a process for the preparation of one of the above-mentioned functional esterase mutants, wherein a) a host organism capable of expressing the esterase, for example the abovementioned microorganism which contains at least one of the abovementioned vectors, is cultivated b ) optionally inducing the expression of the esterase, and c) optionally isolating the esterase from the host organism and / or the culture medium.
  • a host organism capable of expressing the esterase for example the abovementioned microorganism which contains at least one of the abovementioned vectors
  • Another object of the invention relates to the use of one of the abovementioned esterases, one of the abovementioned vectors, or one of the abovementioned microorganisms for carrying out one of the abovementioned ester hydrolysis processes, or for the corresponding transesterification of such polyacrylic acid esters.
  • Another object of the invention relates to a polymeric reaction product which is obtainable by one of the aforementioned methods.
  • the inventive method relates to an enzyme-catalyzed hydrolysis of polyacrylic acid esters, which is also referred to herein as enzymatic ester cleavage (or in short: ester cleavage).
  • the provision of at least one polyacrylic acid ester and its incubation with at least one esterase is provided.
  • the provision is preferably carried out in a solution, wherein an aqueous solution, an organic solution (comprising one or more organic solvents) or aqueous-organic solution (wherein the organic solvent component comprises one or more organic solvents) may be present.
  • the usable organic solvents include, for example, alcohols such as methanol, ethanol, propanol, isopropanol and butanol, aromatic hydrocarbons such as benzene and Toluene, ethers, such as dimethyl ether, diethyl ether, 1, 2-dimethoxyethane, and tetrahydrofuran. Preference is given to aqueous solutions or aqueous-organic solutions. In an aqueous-organic solution, the organic solution or the sum of the organic solvent components can occupy a volume fraction of from 1 to 80% by volume, preferably from 10 to 60% by volume, and in particular about 40% by volume.
  • aqueous-organic solutions or organic-aqueous solutions may be homogeneous solutions within the scope of the invention, or two- or multi-phase systems (such as, for example, oil-in-water, water-in-oil, water-in-oil). water emulsions).
  • the solutions are preferably not gelatinous.
  • the solutions preferably have viscosities of less than 4000 mPa * s, more preferably less than 2000 mPa * s, less than 1000 mPa * s, less than 500 mPa * s, less than 400 mPa * s, less than 200 mPa * s, less than 100 mPa * s, less than 50 mPa * s, less than 25 mPa * s, less than 10 mPa * s, less than 5 mPa * s or less than 2,5 mPa * s.
  • the aqueous solution or the aqueous component of an aqueous-organic solution may be a buffer.
  • the pH of the buffer is preferably adjusted to the pH at which the enzyme-catalyzed ester cleavage is to take place. If the process according to the invention is carried out in a bioreactor in which microorganisms produce at least one esterase which cleaves the at least one polyacrylic acid ester, the pH is preferably adjusted to a value suitable for the cultivation of the microorganism. The person skilled in the art is familiar with the determination of suitable pH values.
  • Suitable buffers for use in the method according to the invention are also known to the person skilled in the art and comprise, for example, PBS, Tris-HCl buffer, triethanolamine hydrochloride / NaOH buffer, diethanolamine / HCl buffer, sodium borate / HCl buffer, glycine / NaOH buffer , Sodium carbonate / sodium bicarbonate buffer, Na 2 HPO 4 / NaOH buffer, 2- (cyclohexylamino) ethanesulfonic acid / NaOH buffer and 3- (cyclohexylamino) -1-propanesulfonic acid / NaOH buffer.
  • PBS Tris-HCl buffer
  • Triethanolamine hydrochloride / NaOH buffer Triethanolamine hydrochloride / NaOH buffer
  • diethanolamine / HCl buffer sodium borate / HCl buffer
  • glycine / NaOH buffer glycine / NaOH buffer
  • Sodium carbonate / sodium bicarbonate buffer Na 2 HPO 4
  • the inventive method can be carried out at all temperatures at which the esterases used are active, for example at temperatures of 5 ° C to 85 ° C, preferably from 10 0 C to 50 0 C, particularly preferably from 20 ° C to 40 0 C.
  • temperatures at which the esterases used are active for example at temperatures of 5 ° C to 85 ° C, preferably from 10 0 C to 50 0 C, particularly preferably from 20 ° C to 40 0 C.
  • Those skilled in the art are familiar with the fact that enzymes have temperature optima with regard to their stability and / or their catalytic activity, which may also vary depending on the solvent or solvent mixture used, and can determine the optimum temperature or temperature range for each esterase used determine.
  • the temperature requirements of the microorganisms can also be taken into account by the person skilled in the art in the choice of the process temperature.
  • the polyacrylic acid esters provided may be fully esterified (i.e., each acrylic acid group is esterified with an alcohol or alcohol derivative) or partially esterified (i.e., there are still free acrylic acid groups in the molecule of the polyacrylic acid ester).
  • the polyacrylic acid ester provided or the polyacrylic acid esters provided are completely esterified or substantially completely esterified. Substantially complete esterification is present if at least 75%, in particular at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% of the acrylic acid groups of the polyacrylic acid are esterified.
  • Substantially fully esterified polyacrylic acid esters accordingly have, for example, degrees of esterification of 75% to 100%, 75% to 99%, 75% to 98%, 75% to 97%, 75% to 96%, 75% to 95%, 85% to 100% %, 85% to 99%, 85% to 98%, 85% to 97%, 85% to 96%, 85% to 95%, 90% to 100%, 90% to 99%, 90% to 98%, 90% to 97%, 90% to 96%, 90% to 95%, 95% to 100%, 95% to 99%, 95% to 98%, 95% to 97% or 95% to 96%.
  • the process according to the invention can be carried out in discontinuous operation (batch operation, batch operation) or in continuous operation.
  • the batchwise operation the at least one polyacrylic acid ester and the at least one esterase are provided, the incubation is carried out and the reaction mixture is removed from the reaction vessel at a selected time and, if appropriate, sent for further processing (for example the isolation of the reaction product or the recovery of the at least one esterase).
  • the removal can take place after complete ester cleavage (ie after adjustment of an equilibrium between polyacrylic ester on the one hand and polyacrylic acid or partially esterified polyacrylic acid on the other hand) or after incomplete ester cleavage.
  • the suitable time of removal of the respective charge can be determined by the skilled person by various methods, for example by prior sampling and analysis, or by continuous monitoring of the course of the reaction by means of suitable parameters, for example the pH or the viscosity of the solution, which coincides with change as the ester cleavage progresses. If appropriate, the charge can also be withdrawn after a predetermined reaction time has elapsed. In discontinuous operation, after the first provision of the at least one polymer acrylic acid ester and the at least one esterase prior to the final removal of the reaction mixture independently one or more repeated addition of polyacrylic acid esters and / or esterase done.
  • a portion of the reaction mixture is withdrawn at certain times and the reaction mixture remaining in the reaction vessel is supplemented by addition of polyacrylic acid ester and / or esterase.
  • the times may be selected periodically or as a function of measurements of the course of the reaction.
  • a continuous removal of the reaction mixture is possible. It is known to the person skilled in the art how the individual process parameters (eg amount and time of addition or removal) are optimized in order to obtain the desired reaction product.
  • the continuous operation can be done over different periods of time, for example, over hours, days, weeks, months or years, and can be interrupted or turned off, for example, for cleaning, inspection or maintenance.
  • the isolation of the modified polymer obtained as a result of the ester cleavage is provided, this can be carried out by customary methods, for example by chromatographic methods, dialysis, chemical precipitation, extraction with solvents or evaporation of the solvent contained in the reaction mixture.
  • the at least one esterase is to be reused, it can be separated off by customary methods, preferably before the isolation of the modified polymer is carried out by possibly enzyme-damaging methods. Separation of the esterase can be carried out, for example, by affinity purification by means of esterase-binding molecules (for example antibodies), dialysis or precipitation (for example with ammonium sulfate).
  • the at least one esterase is present in immobilized form.
  • a non-covalent bond of the enzyme can, for example, he - Are enough by labeling the enzyme with biotin and immobilization to a provided with avidin or streptavidin carrier, labeling of the enzyme by incorporation of histidine tags in its amino acid sequence and immobilization to a nickel chelate provided support, immobilization of the enzyme by antibodies directed against the enzyme (wherein the binding epitopes are preferably selected so that the binding between antibody and binding epitope does not affect or not substantially affect the access of substrate molecules to the active site), production of fusion proteins from the enzyme and a Foreign protein and immobilization of the protein by antibodies directed against the foreign protein, or by adsorptive attachment to microspheres (beads) or on carrier materials.
  • Immobilization causes the esterase molecules to remain stationary in the reaction vessel (for example on the walls of the reaction vessel or on surfaces located in the reaction vessel) and only the polyacrylic acid esters or polymers modified by ester cleavage are removed when the reaction mixture is removed.
  • the esterase molecules may be freely floated in the reaction solution and interact with the polyacrylic acid ester molecules, but by various means (eg, filters or fluidized bed reactors) leaving the reaction vessel together with the polyacrylic acid ester molecules and / or the Prevented polyacrylic acid molecules.
  • removal of the microspheres together with the polyacrylic acid ester molecules and / or the polyacrylic acid molecules and a subsequent separation for example by centrifugation or filtration.
  • the process according to the invention can be carried out until the ester groups contained in the polyacrylic acid ester are partially or completely hydrolytically cleaved, in which case polyacrylic acid would be obtained in the case of complete hydrolysis. Preference is given to removal after partial hydrolysis.
  • the initially provided polyacrylic esters still contain ester groups which impart certain properties to the polymers modified in the course of the reaction.
  • the modified polymers can then be used for other purposes, for example as starting materials for further chemical modifications.
  • esterases in general and, in particular, ester bond-affecting enzymes of the EC class 3.1 can be used in accordance with the classification of the "Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology.”
  • the classification of the EC classes can be viewed in " Enzymes Nomenclature, 1992 edited by Academic Press for the "International Union of Biochemistry and Molecular Biology” under the ISBN 0-12-227164-5, with subsequent supplementary volumes, or online at http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/jcbn/index.htmW6.
  • Preferred embodiments are carboxylic ester hydrolases (EC 3.1.1), in particular carboxyl xylesterases (EC 3.1 .1 .1), triacylglycerol lipases (EC 3.1 .1 .3) and cutinases (EC 3.1.1.74).
  • carboxylic ester hydrolases EC 3.1.1
  • carboxyl xylesterases EC 3.1 .1 .1
  • triacylglycerol lipases EC 3.1 .1 .3
  • cutinases EC 3.1.1.74
  • “functional mutants” also referred to as “functional esterase mutants”, “esterase mutants” or “mutants" of the specifically disclosed esterases can be used, the functional mutants, optionally after isolation, from one producing them Microorganism, itself subject of the invention.
  • Functional mutants are in the context of the present invention, polypeptides which differ from the specifically disclosed esterases, such as.
  • those having an identity of less than 100% to the esterases according to SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 38 for example, 40% to less than 100%, 50% to less than 100%, 60% to less than 100 %, 75% to less than 100%, 85% to less than 100%, 90% to less than 100%, 95% to less than 100% or 99% to less than 100%
  • the desired enzymatic activity can be detected, for example, by cleavage of polyacrylic acid esters, for example methyl polyacrylate or butyl acrylate.
  • the desired enzymatic activity is considered to be present when the functional mutant has at least 10% of the cleavage activity of the esterase (which can be determined, for example, as the substrate per unit time reaction) referred to, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95% or 100% of this cleavage activity.
  • the desired enzymatic activity is, of course, especially when the functional mutant has a higher cleavage activity than the esterase referred to, for example up to 105%, 110%, 120%, 150%, 200% or more than 200% of the cleavage activity of the esterase in question.
  • the functional mutant is able to cleave a new substrate, ie a polyacrylic acid ester, which is not referred to by the esterase referred to, or under comparable reaction conditions (such as temperature, pH , Solvent or solvent composition, salt concentration, substrate concentration, enzyme concentration) is not cleaved.
  • a new substrate ie a polyacrylic acid ester, which is not referred to by the esterase referred to, or under comparable reaction conditions (such as temperature, pH , Solvent or solvent composition, salt concentration, substrate concentration, enzyme concentration) is not cleaved.
  • mutants are understood as meaning, in particular, altered proteins which are present in at least one of the sequence positions of the abovementioned concrete
  • Sequences have a different than the specified amino acid, but still have desired enzymatic activity.
  • “Functional mutants” thus include the by one or more, such as 1-50, 1-40, 1-30, or 1-20, ie, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 amino acid additions, substitutions, deletions and / or inversions of altered proteins obtainable, said changes being able to occur in any sequence position as long as they become one functional mutant with the property profile according to the invention.
  • Functional mutants are also present when the reactivity patterns between mutant and unchanged polypeptide match qualitatively, ie, for example, the same enzymatic parameters (such as substrate affinity, turnover number) are present, but are quantitatively different pronounced. Examples of suitable substitutions of amino acid residues are the following:
  • “Functional mutants” in the above sense are also precursors of the esterases described as well as functional derivatives and salts of the esterases.
  • the term “salts” means both salts of carboxyl groups and acid addition salts of amino groups of the protein molecules according to the invention. Salts of carboxyl groups can be prepared in a manner known per se and include inorganic salts, such as, for example, salts of sodium, calcium, ammonium, iron and zinc, and salts with organic bases, such as amines such as triethanolamine, arginine, lysine, piperidine and the like.
  • Acid addition salts such as, for example, salts with mineral acids, such as hydrochloric acid or sulfuric acid, and salts with organic acids, such as acetic acid and oxalic acid, are likewise provided by the invention.
  • "Functional derivatives" of esterases or functional esterase mutants according to the present invention may also be prepared at functional amino acid side groups or at their N- or C-terminal end by known techniques Such derivatives include, for example, aliphatic esters of carboxylic acid groups Amides of carboxylic acid groups obtainable by reaction with ammonia or with a primary or secondary amine; N-acyl derivatives of free amino groups prepared by reaction with acyl groups; or O-acyl derivatives of free hydroxy groups prepared by reaction with acyl groups.
  • “functional mutants” also include esterases accessible from other organisms, as well as naturally occurring variants.
  • regions of homologous sequence regions can be determined by sequence comparisons and functional mutants can be determined on the basis of the specific specifications of the invention.
  • organisms are Burkholderia (for example B. gladioli, B. mallei, B. pseudomallei, B. thailan- densis, B. cenocepacia, B. aurantiaca, B. vietnamensis, B. dolosa, B. multivorans, B. ambifaria ), Stigmatella (for example S. aurantiaca), Streptomyces (for example S. ambofaciens, S. coelicolo ⁇ , Saccharopolyspora (for example S. erythraea), Mycobacterium (for example M. smegmatis, M. bovis, M. tuberculosis, M. leprae)
  • Burkholderia for example B.
  • “Functional mutants” are also fusion proteins which comprise one of the abovementioned polypeptide sequences of esterases or functional mutants derived therefrom and at least one further functionally different heterologous sequence in functional N- or C-terminal linkage (ie without substantial mutual functional impairment
  • heterologous sequences are enzymes, protein A and immunoglobulins, where protein A and immunoglobulin fusions can be used, for example, for non-covalent immobilization of the functional mutants on supports (for example microspheres) ,
  • a first step gene libraries of the respective proteins are generated, using, for example, the abovementioned methods
  • the gene banks are appropriately expressed, for example by bacteria or by phage display systems suitable expression vectors to control the localization of the protein in the host, for example as intracellular proteins in the cytoplasm, as Me protein by adding a membrane anchor, or as an extracellular protein by adding a signal peptide with a signal peptidase recognition site.
  • clones expressing proteins of the desired property are then selected or screened.
  • selection only the clones that express proteins with desired properties survive, as these give the host organisms a survival advantage (for example, enzymes that allow the recovery of certain substrates or growth at certain temperatures). All clones survive in the screening (also referred to as screening), so that it is determined via suitable assays which of the clones expresses a protein with the desired property. It is known to the person skilled in the art how assays are made suitable for the respective purpose.
  • host organisms which express the proteins in question on their surface and adhere to a substrate coated with the binding partner (as opposed to host organisms expressing non-functional proteins);
  • functional mutants with catalytic properties host organisms can be cultured, for example, in microtiter plates with substrate-containing medium or on substrate-containing agar plates and the presence of functional mutants (optionally after lysing the host organisms to allow contact with the medium), for example by color reactions by conversion of the Substrate are displayed.
  • automated systems eg, microtiter plate pipetting robots, screening robots, image recognition systems for identifying colonies on agar plates
  • image recognition systems for identifying colonies on agar plates may be used to enable high throughput screening.
  • a reference protein for example a wild-type protein
  • the mutation rate at nucleotide level is chosen so that after expression of the mutated nucleic acids only a relatively small number of amino acids are mutated in the translated peptides or proteins, for example 1 to 3 amino acids.
  • the resulting mutated peptides or proteins are screened for agents with desired properties (for example higher catalytic activity for one or more substrates, an extended or altered substrate spectrum, improved stability at elevated or altered temperatures or pH values, or in certain solvents).
  • desired properties for example higher catalytic activity for one or more substrates, an extended or altered substrate spectrum, improved stability at elevated or altered temperatures or pH values, or in certain solvents.
  • desired properties for example higher catalytic activity for one or more substrates, an extended or altered substrate spectrum, improved stability at elevated or altered temperatures or pH values, or in certain solvents.
  • desired properties for example higher catalytic activity for one or more substrates, an extended or altered substrate spectrum, improved stability at elevated or altered temperatures or pH values, or in certain solvents.
  • the low mutation rate used per cycle avoids virtually all proteins losing function due to too many mutations in their amino acid sequence, and on the other hand, iterative mutation and selection mutations can accumulate beneficial mutations, ultimately providing proteins with high chances of success, which have the desired, significantly improved properties.
  • sequencing mutants having improved properties those of skill in the art will obtain sequence information indicating which sequence positions or sequence regions of a peptide or protein are important to a desired trait. Based on this information, he can deliberately place mutations in these sites or in these areas, and accordingly receive targeted mutants with desired properties.
  • mutants encompassed by the invention are homologs to the specifically disclosed esterases which have at least 40% or at least 50%, or at least 60%, such as at least 75% or in particular at least 85%, such as 90%, 95% or 99%, homology to one of the specifically disclosed sequences, eg calculated according to the algorithm of Pearson and Lipman, Proc Natl Acad, Sci. (USA) 85 (8), 1988, 2444-2448
  • a percent homology of a homologous polypeptide of the invention in particular, means percent identity of the amino acid residues relative to the total length of one of the amino acid sequences specifically described herein.
  • a “derived” amino acid sequence according to the invention means a sequence having an identity with the starting sequence of at least 80% or at least 90%, in particular about 91%, 92%, 93%, 94%, 95% %, 96%, 97%, 98% and 99%
  • the subject matter of the invention is, for example, the amino acid sequences derived from all of the amino acid sequences disclosed herein.
  • Identity or “homology” between two sequences is understood to mean the identity of the amino acid residues over the entire sequence length, such as the identity, by comparison using the Vector NTI Suite 7.1 software from Informax (USA) using the Clustal method (Higgins DG, Sharp PM, Fast and Sensitive Multiple Sequence Alignments on a Microcomputer, Comput Appl. Biosci 1989 Apr; 5 (2): 151-1) is calculated by setting the following parameters:
  • the functional mutants according to the invention comprise proteins of the abovementioned type in deglycosylated or glycosylated form as well as modified forms obtainable by altering the glycosylation pattern.
  • Homologs of the described esterases or their functional mutants according to the invention can be identified by screening combinatorial libraries of mutants such as truncation mutants.
  • a library of peptide variants can be generated by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level, such as by enzymatic ligation of a mixture of synthetic oligonucleotides.
  • methods that can be used to prepare libraries of potential homologs from a degenerate oligonucleotide sequence. The chemical synthesis of a degenerate gene sequence can be performed in a DNA synthesizer, and the synthetic gene can then be ligated into a suitable expression vector.
  • degenerate gene set allows for the provision of all sequences in a mixture that encode the desired set of potential protein sequences.
  • Methods for the synthesis of degenerate oligonucleotides are known to those skilled in the art (eg, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al. (1984) Science 198: 1056 Ike et al., (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477).
  • ester bonds of polyacrylic acid esters, ie polymeric substrates can be cleaved by esterases.
  • esterases from various organisms can be used, it being possible to cite non-limiting examples: Burkholderia (for example B. gladioli, B. mallei, B. pseudomallei, B. thailan- densis, B. cenocepacia, B. aurantiaca, B. vivnamensis, B. dolosa, B. multivorans, B. ambifraia), Stigmatella (for example S. aurantiaca), Streptomyces (for example S.
  • ambofaciens for example S. coelicolo ⁇
  • Saccharopolyspora for example S. erythraea
  • Mycobacterium for example M. smegmatis, M. bovis, M. tuberculosis, M. leprae.
  • esterases for carrying out the process according to the invention are esters of ester-binding enzymes of the EC class 3.1, in particular ester carboxylic acid hydrolases (EC 3.1.1). Particular preference is given to carboxylesterases, triacylglycerol lipases and cutinases. Further particular embodiments are esterases of family VIII (in particular esterase B from Burkholderia gladioli according to SEQ ID NO: 1 and their functional mutants) and type C esterases (in particular esterase C from Burkholderia gladioli according to SEQ ID NO: 2 and their functional mutants).
  • family VIII in particular esterase B from Burkholderia gladioli according to SEQ ID NO: 1 and their functional mutants
  • type C esterases in particular esterase C from Burkholderia gladioli according to SEQ ID NO: 2 and their functional mutants.
  • non-limiting examples of useful esterases are the sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 , SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 their basis, in turn, can be generated or derived from functional mutants.
  • These functional mutants relate in particular to esterases with a modified amino acid sequence compared to the known wild type, wherein the altered sequence provides a new esterase, which optionally allows or facilitates the access of polymeric substrates to the catalytically active center, and / or the stability of the Esterase is increased, for example, the stability at certain pH values or in various solvents or solvent mixtures.
  • the invention thus includes, inter alia, functional mutants of esterases in which structural elements are changed or removed which prevent or hinder the access of substrates to the active site, for example loops. Suitable regions for a loop cut in an esterase according to SEQ ID NO: 1 (EstB from B.gladioli), for example, the regions Glu246 to Arg 258 and Gly312 to 323.
  • loop cuts can be carried out by removing one or more amino acids, wherein in the case of removing a plurality of amino acids, in turn, one or more amino acids adjacent or not adjacent to SEQ ID NO: 1 may be removed.
  • the invention furthermore relates to functional mutants of esterases in which the access to the catalytically active center (also referred to herein as the active center), which may be tunnel-shaped, funnel-shaped, furrow-shaped or column-shaped, for molecules from the environment of the esterase was made more accessible.
  • amino acids with smaller side chains for example alanine by glycine, VaNn by alanine or glycine, leucine by VaNn, etc.
  • polyacrylic acid esters which have a rather positive charge, for example, due to basic groups substituted alcohol constituents of the ester, the access to the catalytically active center correspondingly by exchange of basic amino acids in the access area of the catalytically active center by less basic, optionally neutral or acid amino acids are facilitated or made possible.
  • suitable amino acids are In the case of their replacement by amino acids with smaller side chains, access to the active site should be improved, Tyr181, Trp348 and Trp149 in the case of SEQ ID NO: 1.
  • Leu163, Val213 and Pro168 are suitable for this purpose, wherein in the case of Pro168 in particular, the flexibility of the associated loop can also be increased by an exchange by Ala or Gly, whereby a larger substrate can be permitted.
  • Another object of the invention are functional mutants of esterases with increased stability, for example, increased pH, temperature or solvent stability. Such increased stability can be achieved, for example, by aminic acid exchanges, with which intramolecular interactions within a protein molecule become possible or enhanced for the first time, through which unstable loops of the protein molecule are better fixed or individual protein domains get better cohesion.
  • particular embodiments of the present invention are functional mutants of EstB according to SEQ ID NO: 1, in which loops lying above the catalytically active center have been eliminated or shortened by more or less complete deletion of the loop-forming amino acids.
  • FIG. 1 shows a molecular model of EstB according to SEQ ID NO: 1, in which two loops have been identified which lie between the catalytically active center and the external medium of the EstB.
  • FIG. 1 For purposes of this specification, a structural model of EstC was used on the basis of which functional mutants were produced.
  • the inventors have identified protein regions that line the access to the catalytically active center. Subsequently, by site-directed mutagenesis, single or multiple amino acids of SEQ ID NO: 2 were selectively altered to increase access and allow better access of large, polymeric substrates.
  • Phe138 ie, phenylalanine at amino acid position 138
  • Phe138 lies with its side chain between the amino acids Ser1 12, Asp242 and His275 of the catalytically active center and the external medium of the protein.
  • Phe138Ala alanine
  • the access of bulky substrate molecules, for example polyacrylic acid esters, to the catalytically active center is facilitated (corresponding to mutation 1 K22 in FIG. 5).
  • the physico-chemical properties of the protein surface at position 138 remain essentially the same as one hydrophobic amino acid is replaced by another hydrophobic amino acid.
  • Thr188 which in one embodiment was replaced by alanine (corresponding to the mutation 2K20 in FIG. 5).
  • Thr188 which is in a peripheral position of access to the catalytically active center and can still influence the access of substrate molecules to a certain degree (FIG. 4).
  • Thr188 is replaced by serine, for example in the triple mutation Phe138Ala, Leu193Ala, Thr188Ser ( Figure 4).
  • the invention includes any combination of these or the mutations indicated in FIG. 5.
  • the person skilled in the art is able, on the basis of the procedure shown here, to determine suitable positions for amino acid exchanges even in the case of proteins homologous to Este. For example, using the program "Tripos" from Sybly (St. Louis, MO, USA), he can make overlaps of the structure disclosed here of EstC and an esterase with similar 3-D structure and determine suitable positions therewith, so that the present invention
  • the invention is not limited to the specific proteins and mutations disclosed herein.
  • the invention furthermore relates to the coding nucleic acid sequences for the above-described functional esterase mutants, in particular according to SEQ ID NO: 54 to SEQ ID NO: 57.
  • nucleic acid sequences according to the invention can be prepared in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide units, for example by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleic acid units of the double helix.
  • the chemical synthesis of oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner by the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • the invention relates, for example, to all of the nucleic acid sequences derived from the nucleic acid sequences disclosed herein.
  • Identity between two nucleic acids means the identity of the nucleotides over the entire nucleic acid length, in particular the identity, which is determined by comparison with the help of the Vector NTI Suite 7.1 software from Informax (USA) using the Clustal method (see above ) is determined.
  • the invention also relates to nucleic acid sequences coding for one of the above esterases and their functional mutants, which are e.g. accessible using artificial nucleotide analogs.
  • the invention relates both to isolated nucleic acid molecules which encode esterases according to the invention or enzymatically active portions thereof, as well as nucleic acid fragments which are e.g. can be used as hybridization probes or primers for the identification or amplification of coding nucleic acids according to the invention.
  • the nucleic acid molecules according to the invention may additionally contain untranslated sequences from the 3 'and / or 5' end of the coding gene region.
  • nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules present in the natural source of the nucleic acid and, moreover, may be substantially free of other cellular material or culture medium when prepared by recombinant techniques, or free of chemical precursors or other chemicals, if it is chemically synthesized.
  • a nucleic acid molecule according to the invention can be isolated by means of standard molecular biological techniques and the sequence information provided according to the invention.
  • cDNA can be isolated from a suitable cDNA library by using one of the specifically disclosed complete sequences, or a portion thereof, as hybridization probes and standard hybridization techniques (such as described in Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., CoId Spring Harbor Laboratory, Col. Spring Harbor Laboratory Press, Col. Spring Harbor, NY, 1989).
  • nucleic acid molecule comprising any of the sequences of the invention or a portion thereof can be isolated by polymerase chain reaction, using the oligonucleotide primers prepared on the basis of this sequence.
  • the nucleic acid amplified in this way can be cloned into a suitable vector.
  • the oligonucleotides according to the invention can furthermore be prepared by standard synthesis methods, for example using an automatic DNA synthesizer.
  • the invention further comprises the nucleic acid molecules complementary to the specifically described nucleotide sequences or a portion thereof.
  • the nucleotide sequences of the invention enable the generation of probes and primers useful for the identification and / or cloning of homologous sequences in other cell types and organisms.
  • probes or primers usually comprise a nucleotide sequence region which under stringent conditions is at least about 12, preferably at least about 25, e.g. about 40, 50 or 75 consecutive nucleotides of a sense strand of a nucleic acid sequence of the invention or a corresponding antisense strand hybridizes.
  • nucleic acid sequences of the invention are derived from coding sequences of the esterases of the invention and differ therefrom by one or more, e.g. 1-50, 1-40, 1-30, or 1-20, i. e.g. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 addition, substitution, insertion or deletion of single or meh - Other nucleotides, but still encode esterases with the desired enzymatic activity.
  • nucleic acid sequences which comprise so-called silent mutations or are altered according to the codon usage of a specific parent or host organism, in comparison to a specifically mentioned sequence, as well as naturally occurring variants, such as e.g. Splice variants or allelic variants, thereof.
  • Articles are also provided by conservative nucleotide substitutions (i.e., the amino acid in question is replaced by an amino acid of like charge, size, polarity, and / or solubility).
  • the invention also relates to the molecules derived by sequence polymorphisms from the specifically disclosed nucleic acids. These genetic polymorphisms may exist between individuals within a population due to natural variation. These natural variations usually cause a variance of 1 to 5% in the nucleotide sequence of a gene. Furthermore, the invention also encompasses nucleic acid sequences which hybridize with or are complementary to the abovementioned coding sequences. These polynucleotides can be found by screening genomic or cDNA libraries and optionally multiply therefrom with suitable primers by means of PCR and subsequently isolated, for example with suitable probes.
  • polynucleotides of the invention can also be chemically synthesized.
  • the ability to "hybridize” to polynucleotides is understood to be the ability of a poly or oligonucleotide to bind under stringent conditions to a nearly complementary sequence, while under these conditions, non-specific binding between noncomplementary partners is avoided 70-100%, in particular 90-100%, such as 95%, 96%, 97%, 98% or 99%, complementary
  • the property of complementary sequences to be able to specifically bind to each other for example, makes in the Northern or Southern blotting technique or in primer binding in PCR or RT-PCR, usually oligonucleotides starting from a length of 30 base pairs are used, whereas stringent conditions are understood as meaning the use of a 50 in the Northern blot technique - 70 0 C, preferably 60 - 65 0 C warm wash, for example, 0.1x SSC buffer with 0.1% SDS (2Ox SSC: 3M NaCl, 0.3M Na citrate, pH 7.0 ), for the elution of nonspecifically hybridized
  • the invention furthermore relates to expression constructs comprising, under the genetic control of regulatory nucleic acid sequences, a nucleic acid sequence coding for an esterase according to the invention or a functional mutant; and vectors comprising at least one of these expression constructs.
  • such constructs according to the invention comprise a promoter 5'-upstream from the respective coding sequence and a terminator 3'-downstream. and, optionally, other common regulatory elements, each operatively linked to the coding sequence.
  • "Operational linkage” is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and optionally further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function in the expression of the coding sequence as intended.
  • Other regulatory elements include selectable markers, amplification signals, origins of replication, etc. Suitable regulatory sequences are described, for example, in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) ).
  • the natural regulatory sequence may still be present before the actual structural gene. By genetic modification, this natural regulation can optionally be switched off and the expression of the genes increased or decreased.
  • the gene construct can also be constructed more simply, ie no additional regulatory signals are inserted in front of the structural gene and the natural promoter with its regulation is not removed. Instead, the natural regulatory sequence is mutated so that regulation stops and gene expression is increased or decreased.
  • the nucleic acid sequences may be contained in one or more copies in the gene construct.
  • Examples of useful promoters are: cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq, Tf, T5, T3, gal, trc , ara, SP6, lambda PR or lambda PL promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria; and the gram-positive promoters amy and SPO2, the yeast promoters ADC1, M falpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH or the plant promoters CaMV / 35S, SSU, OCS, IiM, usp, STLS1, B33, not or the ubiquitin or phaseolin promoter.
  • inducible promoters such as light and in particular temperature-inducible promoters, such as the P r P r promoter.
  • inducible promoters such as light and in particular temperature-inducible promoters, such as the P r P r promoter.
  • all natural promoters can be used with their regulatory sequences.
  • synthetic promoters can also be used to advantage.
  • the regulatory sequences mentioned are intended to enable targeted expression of the nucleic acid sequences and protein expression. Depending on the host organism, this may mean, for example, that the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • the regulatory sequences or factors can thereby preferably positively influence the expression and thereby increase or decrease.
  • enhancement of the regulatory elements can advantageously be done at the transcriptional level by using strong transcription signals such as promoters and / or enhancers.
  • an enhancement of the translation is possible by, for example, the stability of the mRNA is improved.
  • the preparation of an expression cassette is carried out by fusion of a suitable promoter with a suitable coding nucleotide sequence and a terminator or Polyade- nyl michssignal.
  • a suitable promoter with a suitable coding nucleotide sequence and a terminator or Polyade- nyl michssignal.
  • common recombination and cloning techniques are used, as described, for example, in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColD Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY (1989) and in TJ. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Colard Spring Harbor Laboratory, Colard Spring Harbor, NY (1984) and Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).
  • the recombinant nucleic acid construct or gene construct is advantageously inserted into a host-specific vector for expression in a suitable host organism, which enables optimal expression of the genes in the host.
  • Vectors are well known to those skilled in the art and can be found, for example, in "Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., Eds. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).
  • Vectors other than plasmids are also to be understood as meaning all other vectors known to the skilled person, such as phages, viruses such as SV40, CMV, baculovirus and adenovirus, transposons, IS elements, phasmids, cosmids, and linear or circular DNA. These vectors can be autonomously replicated in the host organism or replicated chromosomally.
  • fusion expression vectors such as pGEX (Pharmacia Biotech Ine, Smith, DB and Johnson, KS (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) glutathione-S-transferase (GST), maltose E-binding protein or protein A is fused to the recombinant target protein.
  • Non-fusion protein expression vectors such as pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) and pET 11 d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California ( 1990) 60-89).
  • Yeast expression vector for expression in the yeast S. cerevisiae such as pYepSed (Baldari et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al.
  • Vectors and methods for constructing vectors suitable for use in other fungi, such as filamentous fungi include those described in detail in: van den Hondel, CA MJ. J. & Punt, PJ. (1991) Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, Applied Molecular Genetics of Fungi, JF Peberdy et al., Eds., Pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
  • Baculovirus vectors available for expression of proteins in cultured insect cells include the pAc series (Smith et al., (1983) Mol. Cell Bio! 3: 2156-2165) and the pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
  • Plant expression vectors such as those described in detail in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border” , Plant Mol. Biol. 20: 1 195-1 197; and Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 871 1-8721.
  • Mammalian expression vectors such as pCDM ⁇ (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) and pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195).
  • recombinant organisms can be produced, which are transformed, for example, with at least one vector according to the invention and can be used to produce the domains or polypeptides according to the invention.
  • the above-described recombinant constructs according to the invention are introduced into a suitable host system and expressed.
  • cloning and transfection methods such as co-precipitation, protoplast fusion, electroporation, chemical trans- formation, retroviral transfection and the like, are used to express said nucleic acids in the respective expression system. Suitable systems are described, for example, in Current Protocols in Molecular Biology, F.
  • Suitable host organisms are in principle all organisms which enable expression of the nucleic acids according to the invention, their allelic variants, their derivatives which encode functional mutants or their derivatives.
  • Host organisms are understood as meaning, for example, bacteria, fungi, yeasts, plant or animal cells.
  • Preferred organisms are bacteria, such as those of the genera Escherichia, such.
  • Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus, Pseudomonas or Burkholderia eukaryotic microorganisms such as Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, higher eukaryotic cells from animals or plants, for example Sf9, CHO or HEK293 cells
  • Invention single or aggregated to cell clusters cells from higher eukaryotic life forms such as animals or plants are also referred to as microorganisms.
  • the selection of successfully transformed organisms can be carried out by marker genes, which are also contained in the vector or in the expression cassette. Examples of such marker genes are antibiotic resistance genes and enzymes that catalyze a coloring reaction that causes staining or fluorescence of the transformed cell.
  • the invention furthermore relates to processes for the recombinant production of esterases according to the invention or functional, enzymatically active fragments thereof, in which an esterase-producing recombinant host organism is cultivated, optionally the expression of the esterase is induced and these are isolated from the culture.
  • the esterase or esterases can thus also be produced on an industrial scale, if desired.
  • the recombinant host can be cultured and fermented by known methods. Bacteria can be propagated, for example, in TB or LB medium and at a temperature of 20 to 40 0 C and a pH of 6 to 9. In detail, suitable Culturing conditions are described, for example, in T. Maniatis, EF Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Colard Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY (1989).
  • the cells are then disrupted if the esterases are not secreted into the culture medium and the product recovered from the lysate by known protein isolation techniques.
  • the cells may optionally be treated by high frequency ultrasound, high pressure, e.g. in a French pressure cell (French Press), by osmolysis, by the action of detergents, lytic enzymes or organic solvents, by homogenizers or by combining several of the listed methods.
  • Esterases can be achieved by known chromatographic techniques such as molecular sieve chromatography (gel filtration) such as Q-Sepharose chromatography, ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, as well as other conventional techniques such as ultrafiltration, crystallization, salting out, dialysis and native gel electrophoresis. Suitable methods are described, for example, in Cooper, F.G., Biochemische Harvey Methoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.
  • Such suitable modifications include, for example, anchors that function as anchors, such as tags. the modification or epitopes known as hexa-histidine anchors, which can be recognized as antigens of antibodies (described, for example, in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor (NY) Press ).
  • anchors may be used to attach the peptides to a solid support, e.g. a polymer matrix, which may for example be filled in a chromatography column, or used on a microtiter plate or on another carrier.
  • these anchors can also be used to detect the esterases.
  • conventional markers such as fluorescent dyes, enzyme markers, which after reaction with a substrate form a detectable reaction product, or radioactive markers, alone or in combination with the anchors, can be used to identify the esterases for the derivatization of the esterases.
  • the process according to the invention can be carried out in customary reactors and carried out on various scales, for example on a laboratory scale (a few milliliters to tens of liters) or on an industrial scale (liters to several thousand cubic meters). If the esterase is used in the form of an isolated, more or less purified enzyme, then a chemical reactor can be used.
  • a bioreactor is used in which, in addition to suitable process conditions for the ester cleavage, also suitable living conditions for the esterase-producing microorganisms (eg by providing a suitable nutrient medium and pH, a suitable temperature, supply of oxygen or other gases, antibiotics, etc.) are provided.
  • a bioreactor is thus suitable for providing the esterases by a whole cell system in which living microorganisms (for example prokaryotic cells such as bacteria or archaebacteria, or eukaryotic cells such as yeasts, mammalian cells or insect cells) are cultured.
  • living microorganisms for example prokaryotic cells such as bacteria or archaebacteria, or eukaryotic cells such as yeasts, mammalian cells or insect cells
  • the skilled person is familiar with the various aspects of the use of reactors, for example the upscaling of chemical or biotechnological processes from the laboratory scale to the large-scale production scale and the optimization of process parameters and may optionally resort to corresponding technical literature (for biotechnological processes, for example, Crueger and Crueger, Biotechnology - Textbook of Applied Microbiology, 2nd ed., R. Oldenbourg Verlag, Kunststoff, Vienna, 1984).
  • reaction products obtained by the inventive method are the reaction products obtained by the inventive method.
  • the reaction products may be present together with the reaction mixture used in the process according to the invention, or be partially or substantially purified.
  • Suitable purification levels may be routinely determined by those skilled in the art, as needed and further used, and include, for example, chemical purity or analytical grade.
  • Suitable methods of purification are known in the art and include, for example, precipitation and chromatographic methods.
  • the resulting reaction products, which represent polyacrylic acids or partially esterified polyacrylic acid, depending on the degree of the preceding ester cleavage, can be used, for example, in paints and coatings, such as wall paints, coatings (eg of metal surfaces, in particular in the automobile industry) and paints.
  • polymethacrylates ie, poly (methyl methacrylates)
  • acrylic glasses as well as additives for the petroleum industry, thickening agents for dispersions, and in the cosmetic industry
  • Polymethacrylates continue to be used as prostheses in dentistry, as bone cement in surgery, and as galenic adjuvants used in controlled release tablets.
  • the process according to the invention makes it possible in particular to provide regiospecifically modified polymers.
  • enzymes which hydrolytically cleave only terminal ester groups of the polymer molecule, but not ester groups located further inside the polymer molecule such selectively modified polymers can be produced comparatively easily in comparison to chemical processes.
  • a mutant Burkholderia gladioli EstC gene library (SEQ ID NO: 51) was prepared to obtain functional mutants of EstC. Mutagenesis in EstC was introduced by random mutagenesis.
  • the plasmid pMSPM1 .17 was used as a template according to the protocol in an error-prone PCR ("error-prone PCR") and sequence errors were introduced into the PCR-amplified EstC genes using the GeneMorph® II Random Mutagenesis Kit (Stratagene) Lit: Instruction Manual GeneMorph® Il Random Mutagenesis Kit (Cat # 200550)
  • the PCR-amplified genes were then purified with the Promega Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System as described and cut with the restriction enzymes Ndel and Hindill in Fermentas buffer R.
  • plasmid pMS470 ⁇ 8 (Balzer et al., Nucleic Acids Research, 1992, Vol. 20, No. 8, 1851-1858) was digested with the same restriction enzymes as vector DNA, and after thermal inactivation of the restriction enzymes (80 ° C.) .), 20 min with 1 ul CAIF Intestine alkaline phosphatase (CIAP) by Fermentas for 1 hour at 37 0 C dephosphorylated. the total DNA was loaded onto an agarose gel, the corresponding vector part a cut and cleaned with the Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System by Promega according to the protocol.
  • CIP CAIF Intestine alkaline phosphatase
  • the vector DNA and the prepared inserts were ligated with T4 DNA ligase from Fermentas at 20 ° C. for 1 hour.
  • the ligation product was then purified and de-salted with Promega's Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System, and 2 ⁇ l of the plasmid DNA in 80 ⁇ l each in competent E. coli BL21 (2.5 kV) by BioRad Micro Pulser TM. DE3) cells transformed.
  • the cells were taken up in 1 ml of SOC medium and incubated for 35 min.
  • the competent cells were prepared according to "Current Protocols in Molecular Biology” 1.8.4. Transformed clones were selected on LB-Amp plates (100 ⁇ g / ml), 10 transformants were streaked on the selection plates given above and used for a plasmid preparation according to Qiagen® Spin Miniprep Kit from Qiagen. The isolated plasmids were digested with the restriction enzymes set forth above and confirmed by agarose gel electrophoresis the presence of an insert of the correct size. In addition, the mutation rate was determined by sequencing.
  • SEQ ID NO: 40 (Phe138Ala) 5'-gctgctcttgtatatcttgctgcggccatgcctgc- 3 '
  • SEQ ID NO: 45 (Leu193Ala) 5'-gcaggcggcgttcgaggatgttgac- 3 '
  • a standard double-stranded DNA template was prepared using a standard protocol for DNA minipreparations (QIAprep Spin Miniprep Kit from Qiagen). Subsequently, the reaction mixture for the synthesis of the mutated strand was prepared by PCR according to the following list, wherein the individual components were added to the reaction vessel in the order indicated in the list and then mixed:
  • PCR fragments were purified after purification with the Promega Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System according to the protocol and digested with the restriction enzymes Ndel and Hindill in buffer R (Fermentas) and the procedure described in Example 1 also with ligated to the restriction enzymes Ndel and I-111 cleaved vector pMS470 ⁇ 8
  • the transformation plates were then incubated overnight at 37 ° C.
  • the expected number of colonies from the mutagenesis control transformation is between 50 and 800 colonies. More than 50% of the mutagenesis control transformation colonies should have all three mutations and appear as blue colonies on IPTG and X-gal containing agar plates.
  • the expected number of colonies from the experimental mutagenesis transformation is between 10 and 1000 colonies. After reaching the expected number of colonies, approximately 150 transformants were streaked on LB amp -IPTG plates (0.2 mM IPTG) and incubated overnight at 37 ° C.
  • Example 3 Activity verification by means of a filter assay
  • the EstC mutants prepared in Example 2 were tested for their ability to cleave substrates with ester bonds.
  • the corresponding plasmids were in each case transformed into the expression strain E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen). 10 colonies with the same mutation were first tested with ⁇ -naphthyl acetate.
  • the colonies and positive controls Este, EstB and the negative control E. coli BL21 [pMS470 ⁇ 8] were streaked on LB-Amp-IPTG plates (100 ⁇ g / ml ampicillin, 0.2 mM IPTG) in a fixed pattern and incubated overnight. Subsequently, the cell colonies were removed from the agar plate with a sterile paper filter (Whatman, Cat No 1001-085) and the filters were dried at 37 ° C for 10 minutes. The bacterial cells were disrupted for 25 min at room temperature with 500 ⁇ l Bug Buster (Novagen) and the filter membranes were then equilibrated for 10 min with 0.02 M potassium phosphate buffer (pH 7.0).
  • DMSO methyl methoxysulfoxide
  • NaOH 0.1 M
  • 200 ⁇ l of these substrates were dissolved in 9.5 ml screening solution each and the filter membranes prepared above were soaked with 1 ml of the prepared substrate solution.
  • FIG. 5 shows the activity of the clones used, the following symbols being used:
  • LB amp LB medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin
  • 500 ml culture medium [2xTY (10 g / L yeast extract, 16 g / L tryptone, 5 g / L NaCl)] with an aliquot of the precultile Inoculated to an OD 6 oo of 0.1 and cultured at 30 0 C until an OD 6 oo of 0.5 - 0.8 was reached. Subsequently, the expression was induced by 0.1 mM IPTG and a 16-hour incubation at 28 ° C.
  • the cells were disrupted for 5 minutes followed by a 1 minute break followed by another 5 minute sonication with a Branson Sonifier 250 with duty cycle set at 50% and power control at level 5.
  • One unit (Unit, U) esterase corresponds to the amount that results in a turnover of 1 ⁇ mol / min in this assay.
  • Example 6 Detection of the enzyme-catalysed cleavage
  • a crude lysate of strain NJ70 (containing a functional mutant esterase B from Burkholderia gladioli, EstB_NJ70, according to SEQ ID NO: 4) was prepared according to Example 4.
  • substrate solution 750 ⁇ l of PBA solution (CAS No.
  • Example 7 Inhibition of the enzyme-catalysed cleavage by polvacrylic acid
  • Sokalan PA 15 (polyacrylic acid, Mw 1200, pH 8.0), which corresponds to 1.74 mmol of monomeric acrylic acid units, were added in a parallel batch at the beginning of the measurement shown in Fig. 2, the enzymes used were of Burkholderia gladioli (SEQ ID NO: 1, WT in Fig. 7) and their functional mutants EstB_N27 (SEQ ID NO: 3) and EstB_NJ70 (SEQ ID NO: 4) are not or only minimally inhibited by Sokalan.
  • Sokalan PA 15 (polyacrylic acid, Mw 1200, pH 8.0)
  • Example 6 The pH dependence of the enzyme-catalyzed ester cleavage was carried out analogously to Example 6.
  • the crude lysates of strain NJ70 (expressing the functional mutant NJ70, ie, SEQ ID NO: 4) were prepared as described in Example 4, and a 1000 units equivalent amount of substrate solutions were added to various pH's in the range of 5 to 11 were set.
  • the crude lysates were added only after 10 min, and in any case before the addition of a significant pH correction agent consumption (NaOH) was recorded. From the results shown in Fig. 8, it can be seen that ester cleavage occurred in the range of pH 5 to pH 11.
  • Example 4 The temperature dependence of the enzyme-catalyzed ester cleavage was carried out analogously to Example 6 at a constant pH of 9.
  • crude lysates of strain NJ70 were prepared, and added to substrate solutions in an amount corresponding in each case 1000 units and autotitrated at the various temperatures in the range of 10 0 C to 50 0 C.
  • As a control for the chemical autohydrolysis substrate solution was incubated at a pH of 9 for 10 min at the indicated temperature.
  • pH change no consumption of pH correcting agent
  • 35 ml of a master mix (340 ml 0.9% NaCl solution, 220 ml toluene and 70 ml tergitol (10% in H 2 O)) containing 2 ml PBA solution (Sigma Aldrich, Mw 99,000, 25-30 Wt .-% in toluene) (corresponding to 4.66 mmol monomeric ester groups) were brought to a pH of 9 and kept at a temperature of 37 ° C.
  • 3.6 ml of EstB_NJ70-containing crude lysate were rotated for 48 hours at room temperature with 0.5 g of Eupergit C250L (Aldrich) and 30 ml of 0.5 MK 2 HPO 4 buffer (pH 9.5).
  • SEQ ID NO: 10 Esterase from Burkholderia cenocepacia (internal name: A0U6R7_9BURK @ 1)
  • SEQ ID NO: 13 esterase from Burkholderia dolosa (internal name: A2WH69_9BURK @ 1)
  • SEQ ID NO: 18 esterase from Burkholderia mallei (internal name: A1 UXM8_BURMS @ 1)
  • SEQ ID NO: 23 Esterase from Burkholderia pseudomallei (internal name: Q3JIF4_BURP1 @ 1)
  • SEQ ID NO: 26 Esterase from Burkholderia pseudomallei (internal name: A3NPJ8_BURP6 @ 1)
  • SEQ ID NO: 31 Esterase from Saccharopolyspora erythraea (internal name: A4FPB3_SACEN @ 1)
  • SEQ ID NO: 37 identified as EstB_Short4 (or EstB_N27_Short4) deletion mutant of EstB_N27 in which amino acids 317-319 (RGP) of SEQ ID NO: 3 (EstB_N27) were deleted
  • SEQ ID NO: 38 identified as EstB_Short5 (or EstB_N27_Short5) deletion mutant of EstB_N27 in which amino acids 248-255 (PLPGGHGA) of SEQ ID NO: 3 (EstB_N27) were replaced by the shorter sequence SLGTT
  • SEQ ID NO: 39 to SEQ ID NO: 49 PCR primer according to Example 2
  • SEQ ID NO: 54 Nucleic acid sequence for EstB_N27 (according to SEQ ID NO: 3)
  • SEQ ID NO: 55 Nucleic acid sequence for EstB_NJ70 (according to SEQ ID NO: 4)
  • SEQ ID NO: 56 Nucleic acid sequence for EstB_N27_Short 4 (according to SEQ ID NO: 37)
  • SEQ ID NO: 57 Nucleic acid sequence for EstB_N27_Short 5 (according to SEQ ID NO: 38)

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymkatalysierten Hydrolyse von PoIyacrylsäureestern, wobei man wenigstens einen Polyacrylsäureester bereitstellt, den wenigstens einen Polyacrylsäureester mit wenigstens einem Enzym inkubiert, das ausgewählt ist unter auf Esterbindungen einwirkenden Enzymen (EC 3.1), bis die in dem Polyacrylsäureester enthaltenen Estergruppen teilweise oder vollständig hydrolytisch gespalten sind, und gegebenenfalls das dadurch erhaltene modifizierte Polymer isoliert. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die dabei verwendeten Enzyme und Mutanten davon, die Enzyme kodierende Nukleinsäuren, die Nukleinsäuren umfassende Vektoren, die Vektoren umfassende Mikroorganismen, die Verwendung der Enzyme, der Vektoren oder der Mikroorganismen zur Durchführung eines Verfahrens zur enzymkatalysierten Hydrolyse von Polyacrylsäureestern. Die vorliegende Anmeldung betrifft weiterhin durch das Verfahren erhältliche polymere Reaktionsprodukte sowie Verfahren zur Herstellung von Esterasen.

Description

Verfahren zur enzymkatalysierten Hydrolyse von Polyacrylsäureestern sowie dafür zu verwendende Esterasen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymkatalysierten Hydrolyse von PoIy- acrylsäureestern, die dabei verwendeten Enzyme und Mutanten davon, die Enzyme kodierende Nukleinsäuren, die Nukleinsäuren umfassende Vektoren, die Vektoren umfassende Mikroorganismen, die Verwendung der Enzyme, der Vektoren oder der Mikroorganismen zur Durchführung eines Verfahrens zur enzymkatalysierten Hydrolyse von Polyacrylsäureestern. Die vorliegende Anmeldung betrifft weiterhin durch das Verfahren erhältliche polymere Reak- tionsprodukte sowie Verfahren zur Herstellung von Esterasen.
Stand der Technik
Polyacrylsäureester (Polyacrylate) sind Verbindungen mit zahlreichen Anwendungen. Für Polyacrylate aus Homopolymeren gibt es eher eingeschränkte Anwendungsmöglichkeiten, während es bei Polyacrylaten aus Copolymeren möglich ist, durch Auswahl der zu verwendenden Comonomere (wie beispielsweise Methylacrylate, Styrol, Acrylnitril, Vinylacetat, Vi- nylchlorid, Vinylidenchlorid und Butadien) die Eigenschaften der Polyacrylate in vielfältiger Weise zu beeinflussen und damit verschiedensten Verwendungsmöglichkeiten zugänglich zu machen.
Chemische Verfahren zur Spaltung von Polyacrylsäureestern, beispielsweise alkalische Verseifung (US 3,926,891 ), sind dem Fachmann bekannt. Die US-Patentanmeldung 2004/0082023 A1 beschreibt ein Verfahren zur enzymatischen Veresterung von Carbo- xylgruppen tragenden Polymeren unter Verwendung von Enzymen wie Lipasen oder Esterasen. Polyacrylate werden als mögliche Polymere nicht explizit genannt, ebenso wenig wie die Eignung des Verfahrens zur enzymkatalysierten Esterspaltung von Polyacrylatestern.
O 'S u l l iva n u n d B i rki nsh aw besch rieben d en Versuch, Poly-(n-butylcyanoacrylat)- Nanopartikel mit Hilfe von Esterase aus Schweineleber zu hydrolysieren (O'Sullivan, Birkinshaw, Polymer Degradation and Stability 78: 7-15, 2002). Belucci et al. berichteten von der schonenden Entfernung von Acrylharz-Beschichtungen von der Oberfläche von Bildern unter Verwendung von Lipase (Belluci et al., Studies in Conservation 44: 278-281 , 1999).
Dem Fachmann ist eine Vielzahl von Esterasen bekannt. Esterasen von Burkholderia gladioli sind beispielsweise beschrieben in Peterson et al., J. Biotechnol. 89:1 1-25 (2001 ), Valinger et al, J. Biotechnol. 129:98-108 (2007), Ivancic et al, J. Biotechnol. 129 :109-122 (2007) und Reiter et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 54:778-785 (2000). Eine Eignung dieser Esterasen zur Spaltung polymerer Substrate ist bisher nicht beschrieben worden.
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht somit in der Bereitstellung eines Verfahrens zur enzymkatalysierten Hydrolyse von Polyacrylsäureestern sowie dafür geeigneter Enzyme, deren Nukleinsäuren, die Nukleinsäuren enthaltender Vektoren bzw. die Vektoren enthaltender Mikroorganismen, sowie durch das Verfahren erhältlicher Reaktionsprodukte.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die oben genannte Aufgabe wurde überraschenderweise gelöst durch Verwendung von Es- terasen, insbesondere unter Carboxylesterasen, Triacyllipasen und Cutinasen ausgewählten Enzymen, in einem Verfahren zur enzymkatalysierten Hydrolyse von Polyacrylsäureestern sowie durch die Bereitstellung entsprechender Esterasen und der dafür kodierenden Nukleinsäuren.
Figurenbeschreibung
Figur 1 zeigt ein Strukturmodell von EstB. Zwei Loops, die als den Zugang zum katalytisch aktiven Zentrum bedeckend identifiziert wurden, sind hell hervorgehoben und durch Pfeile markiert. Der aufgehellte und ebenfalls mit einem Pfeil kenntlich gemachte Aminosäurerest stellt das nukleophile Serin des aktiven Zentrums dar.
Figur 2 zeigt ein Strukturmodell von EstC gemäß SEQ ID NO:2, wobei Phenylalanin 138 durch Alanin ersetzt wurde (Phe138Ala; entsprechend der Mutante 1 K22 in Figur 5). Ange- geben ist das Rückgrat der Polypeptidkette. Die durch einen Pfeil gekennzeichnete Aminosäure Phenylalanin in Position 138 ist als Kalottenmodell ausgeführt, die in der Abbildung unterhalb von Phe138 als Kalottenmodell angegebenen Aminosäuren entsprechen den zum katalytisch aktiven Zentrum gehörenden Aminosäuren Ser112, Asp242 und His275.
Figur 3 zeigt ein Strukturmodell von EstC gemäß SEQ ID NO:2, wobei Leucin 193 durch Alanin ersetzt wurde (Leu 193AIa; entsprechend der Mutante 2K20 in Figur 5). Angegeben ist das Rückgrat der Polypeptidkette. Die durch einen Pfeil gekennzeichnete Aminosäure Leucin in Position 193 ist als Kalottenmodell ausgeführt, die in der Abbildung oberhalb von Leu193 als Kalottenmodell angegebenen Aminosäuren entsprechen den zum katalytisch aktiven Zentrum gehörenden Aminosäuren Ser112, Asp242 und His275.
Figur 4 zeigt ein Strukturmodell von EstC gemäß SEQ ID NO:2, wobei Phenylalanin 138 durch Alanin, Leucin 193 durch Alanin, und Threonin 188 durch Serin ersetzt wurden (Phe138Ala, Leu193Ala, Thr188Ser; entsprechend Mutante B48 in Figur 5). Angegeben ist das Rückgrat der Polypeptidkette. Durch einen Pfeil gekennzeichnet sind die als Kalottenmodell ausgeführten Aminosäuren Phe138, Thr188 und Leu193. Die übrigen als Kalottenmodell angegebenen Aminosäuren entsprechen den zum katalytisch aktiven Zentrum gehö- renden Aminosäuren Ser1 12, Asp242 und His275.
Figur 5 zeigt aktive Mutanten und Aktivitäten in der Übersicht. Die Ergebnisse wurden erhalten durch pH-Shift-Assays mit Esterase C (Fig. 5a) und Esterase B (Fig. 5b) und verschiedenen funktionalen Mutanten davon. Für die Aktivität wurden folgende Symbole verwendet: +++ = Sehr aktiv, ++ = aktiv, + = schwach aktiv, o = nicht aktiv
EstB und deren Mutanten wurden bei der Erhebung dieser Daten nicht auf α-Naphthylacetat getestet, jedoch liegen den Erfindern Daten vor, dass alle drei EstB-Varianten Aktivität hinsichtlich dieses Substrats aufweisen.
Figur 6 zeigt die enzymkatalysierte Esterspaltung von PBA nach Zugabe von Rohlysat des Esterase-produzierenden Stammes NJ70 (entsprechend 1000 Einheiten EstB_NJ70) im Vergleich zur chemischen Esterspaltung nach Zugabe von Rohlysat nach Denaturierung.
Figur 7 zeigt Autotitrationen von EstB-Esterasen (Wildtyp und Mutanten) mit dem Substrat PBA. Eine eventuell inhibierende Wirkung von Sokalan (= Polyacrylsäure) wurde untersucht.
Figur 8 zeigt die pH-Abhängigkeit der enzymkatalysierten Esterspaltung. Alle Messungen wurden mit 1000 Einheiten EstB_NJ70 (bestimmt mit p-NPB) und 750 μl PBA durchgeführt.
Figur 9 zeigt die Temperaturabhängigkeit der enzymkatalysierten Esterspaltung. Alle Autotitrationen wurden mit 1000 Einheiten EstB_NJ70 (bestimmt mit p-NPB) und 750 μl PBA durchgeführt.
Figur 10 zeigt den Reaktionsverlauf der Esterspaltung durch EstB_NJ70 in Lösung bzw. im- mobilisierte EstB_NJ70. Gezeigt sind die Ergebnisse von Autotitrationen mit 4,66 mmol PBA von entweder nicht immobilisierter oder auf Eupergit immobilisierter EstB_NJ70. Figur 1 1 zeigt die Spaltung von Polyacrylsäuremethylestern unterschiedlicher Kettenlänge, wobei zur Kontrolle denaturiertes Enzym eingesetzt wurde.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Erläuterungen allgemeiner Begriffe
Als „Esterasen" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung, sofern keine weitere Spezi- fizierung angegeben ist, allgemein Enzyme bezeichnet, welche die Hydrolyse von Esterbindungen katalysieren.
Unter „auf Esterbindungen einwirkenden Enzymen" sind Enzyme der Klasse 3.1 gemäß EC- Klassifizierung zu verstehen. Unter „Carbonsäureesterhydrolasen" sind Enzyme der Klasse 3.1.1 gemäß EC-Klassifizierung zu verstehen. Unter „Carboxylesterasen", „Triacylglycerinli- pasen" bzw. „Cutinasen" sind Enzyme der EC-Klassen 3.1.1.1 , 3.1.1.3 beziehungsweise 3.1.1.74 zu verstehen.
Für „Esterasen der Familie VIII" gilt die in Petersen et al, J Biotechnol 89:11-25 (2001 ) sowie die in Arpigny und Jaeger, Biochem J 343:177-183 (1999) angegebene Definition. Esterasen der Familie VIII sind somit gekennzeichnet durch ein aktives Zentrum (active site), die ein Ser-X-X-Lys-Motif aufweist (wobei X für jede beliebige Aminosäure steht) und somit Ähnlichkeit mit der aktiven Stelle von ß-Lactamasen der Klasse C aufweisen, wobei die Esterase- Aktivität durch einen der in Petersen et al. (ibid.) beschriebenen Esterase-Aktivitäts-Assays gegebenenfalls nachgewiesen werden kann.
Im Rahmen der Erfindung werden unter Typ C Esterasen Enzyme verstanden, die wenigstens 50% Identität auf Aminosäureebene mit Este aus Burkholderia gladioli (Reiter et al., Appl Microbiol Biotechnol 54:778-785 (2000) gemäß SEQ ID NO:2 aufweisen, weiterhin we- nigstens 20% Identität auf Aminosäure-Ebene mit der Hydroxynitril-Lyase aus Hevea brasi- liensis (Hasslacher M et al, J Biol Chem 271 :5884-5891 (1996), GenBank-Accession-Nr. AAC49184), SEQ ID NO:58, und/oder der Hydroxynitril-Lyase aus Manihot esculenta (Hughes et al., Arch Biochem Biophys 311 :96-502 (1994), Swiss-Prot-Accession-Nr. P52705), SEQ ID NO:59.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst eine „enzymkatalysierte Hydrolyse" eines Polyacrylsäureesters auch Reaktionen, die eine partielle Autolyse einschließen. Bei „partiel- ler Autolyse" wird ein Anteil von 0 - 90 Mol-%, 0 - 50 Mol-%, 0 - 25 Mol-%, 0 - 20 Mol-%, insbesondere 0 - 15 Mol-%, 0 - 10 Mol-%, 0 - 5 Mol-% oder 0 - 1 Mol-% der Estergruppen autolytisch gespalten.
Unter einem Halogen wird Fluor, Chlor, Brom oder lod verstanden.
Unter einem Loop oder einer Loop-Struktur wird ein Abschnitt von in der Primärstruktur aufeinanderfolgenden Aminosäuren verstanden, der in der Tertiärstruktur des Proteins ein schleifenförmiges Strukturelement ausbildet.
Unter der Hydrolyse von Polyacrylsäureestern oder der Hydrolyse-Aktivität gegenüber PoIy- acrylsäureestern wird die unvollständige oder vollständige Hydrolyse der Esterbindungen der Polyacrylsäureester verstanden.
Unter der Angabe „etwa" wird der angegebene Wert, gegebenenfalls mit einer Abweichung von bis zu 25% nach oben oder unten, insbesondere bis zu 10% nach oben oder unten, oder bis zu 5 % nach oben oder unten verstanden.
Unter dem mittleren Molekulargewicht wird, sofern keine anderen Angaben gemacht werden, das Gewichtsmittel des Molekulargewichts verstanden.
Unter einem alternierenden Copolymer wird ein aus zwei Monomeren A und B bestehendes Copolymer verstanden, wobei die Monomere in streng alternierender Folge (AB)n vorliegen. Unter einem statistischen Copolymer wird ein Copolymer verstanden, bei dem der Einbau der Monomere (z.B. A und B) in das bei der Copolymerisation entstehende Makromolekül statistisch, d.h. in der Reihenfolge rein zufällig erfolgt. Unter einem Gradientencopolymer wird ein Copolymer verstanden, bei dem ein Gradient der Verteilung der Monomerbausteine (z.B. der Bausteine A und B) entlang der Ketten der Copolymere besteht. Unter einem Blockpolymer wird ein Polymer verstanden, dessen Moleküle aus linear verknüpften Blöcken bestehen. Unter einem Block versteht man dabei einen Abschnitt eines Polymermoleküls, der mehrere identische Repetiereinheiten umfasst und mindestens ein konstitutionelles oder konfiguratives Merkmal besitzt, das sich von denen der angrenzenden Abschnitte (Blöcke) unterscheidet. Die Blöcke sind direkt oder durch konstitutionelle Einheiten, die nicht Teil der Blöcke sind, miteinander verbunden. Unter Blockcopolymeren werden Blockpolymere ver- standen, die aus mehr als einer Art von Monomer bestehen und die für z.B. aus zwei Monomeren-Arten A und B aufgebaute Blockcopolymere durch die allgemeine Formel -Ak-Br Am-Bn- zu beschreiben sind, wobei k, I, m und n für die Anzahl der Repetiereinheiten in den einzelnen Blöcken stehen. Unter Pfropfcopolymeren werden nach dem Verfahren der Pfropfcopolymerisation hergestellte Polymere bezeichnet, wobei für deren Aufbau charakteristisch ist, dass sie an ihrer Hauptkette Seitenketten tragen, die von einer Länge sind, dass sie bereits für sich als Polymere anzusprechen wären. Haupt- und Seitenketten können chemisch identisch oder verschiedenartig sein.
Unter Alkoholderivaten werden von Alkoholen abgeleitete Moleküle verstanden, beispielsweise Alkohole, bei denen eine oder mehrere Hydroxygruppen durch andere funktionelle Gruppen, wie beispielsweise Aminogruppen oder Sulfhydrylgruppen, ersetzt sind.
Eine „teilweise" Esterspaltung liegt vor, wenn nach Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens die ursprünglich enthaltenen (d.h. grundsätzlich spaltbaren) Estergruppen nicht gespalten worden sind. Beispielsweise kann eine teilweise Spaltung Werte von 0,1 bis 99,9 % der ursprünglich enthaltenen Estergruppen betreffen, wie z.B. mindestens 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 %, oder höchstens 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91 , 90, 9'89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81 , 80 %, wie z.B. 1 bis 95, 2 bis 90, 3 bis 85, 4 bis 80, 5 bis 75, 6 bis 70, 7 bis 65, 8 bis 60, 9 bis 55, 10 bis 50, 11 bis 45, 12 bis 40, 13 bis 35, 14 bis 30, 15 bis 25 oder 16 bis 20 %. Die Spaltung kann regio-unspezifisch, d.h. i m Wesentlich statistisch verteilt im Polymermolekül, oder regio-spezifisch, d.h. nicht- statistisch verteilt, schwerpunktmäßig in einer oder mehreren spezifischen Regionen des Moleküls, wie z.B. in einem oder mehreren terminalen Bereichen des Moleküls erfolgen.
Eine „Mutante einer Esterase gemäß SEQ ID NO: X" oder eine „Mutante abgeleitet von SEQ ID NO:X" bedeutet, dass, ausgehend von dieser SEQ ID NO:X , diese Mutante durch Vor- nehme wenigstens einer hierin beschriebenen Mutation oder wenigstens einer hierin beschriebenen Kombination von Mutationen hergestellt wird.
Es werden unter Anderem folgende Abkürzungen verwendet:
DG: 2,4-Dimethylglutarsäure-dimethylester DB: 2,4-Dimethylglutarsäure-dibutylester
PMA: Polymethylacrylat
PBA: Polybutylacrylat α-N: α-Naphthylacetat p-NPA: para-Nitrophenylacetat p-NPB: para-Nitrophenylbutyrat II. Spezielle Gegenstände der Erfindung
Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft Verfahren zur enzymkatalysierten Hydrolyse von Polyacrylsäureestern, wobei man wenigstens einen Polyacrylsäureester bereitstellt, den we- nigstens einen Polyacrylsäureester mit wenigstens einem Enzym inkubiert, das ausgewählt ist unter auf Esterbindungen einwirkenden Enzymen (EC 3.1 ), bis die in dem Polyacrylsäureester enthaltenen Estergruppen teilweise oder vollständig hydrolytisch gespalten sind, und gegebenenfalls das dadurch erhaltene modifizierte Polymer isoliert. Bei dem Verfahren kann der Polyacrylsäureester ein Homopolymer oder ein Copolymer aus zwei oder mehr unter- schiedlichen Monomeren sein.
Gemäß weiteren Ausführungsformen ist das Enzym ausgewählt unter Carbonsäureester- hydrolasen (EC 3.1.1 ). Gemäß besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die Carbon- säureesterhydrolasen ausgewählt unter Carboxylesterasen (E. C 3.1.1.1 ), Triacylglycerinlipa- sen (EC. 3.1.1.3) und Cutinasen (EC 3.1.1.74).
Gemäß weiteren Ausführungsformen ist der Polyacrylsäureester ein Homopolymer oder ein Copolymer. Beispiele für Copolymere sind alternierende Copolymere, statistische Copolyme- re, Gradientencopolymere, Blockcopolymere oder Pfropfcopolymere. Als Monomere der Copolymere kommen beispielsweise alle hier offenbarten Monomere in Frage.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens umfasst das Polymer Monomer- Bausteine der allgemeinen Formel I
R1R2C=CR3-COOR4 (I),
worin
R1, R2 und R3 gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind unter H, einem geradketti- gen C1-C20 Hydrocarbylrest und einem verzweigten C3-C2O Hydrocarbylrest, und R4 ausgewählt ist unter H, einem geradkettigen C1-C20 oder d-C6 Hydrocarbylrest, einem verzweigten C3-C20 oder C3-C6 Hydrocarbylrest und einem cyclischen C3-C20 oder C5-C7 Hydrocarbylrest, wobei der Hydrocarbylrest gegebenenfalls substituiert ist durch eine oder mehrere gleiche oder verschiedene Gruppen, die ausgewählt sind unter Hydroxy-, Amino-, Epoxidgruppen und Halogenatomen, wobei im Polymer in wenigstens einem Monomerbaustein der Formel I R4 ausgewählt ist unter einem geradkettigen CrC20 oder CrC6 Hydrocarbylrest, einem verzweigten C3-C20 oder C3-C6 Hydrocarbylrest und einem cyclischen C3-C20 oder C5-C7 Hydrocarbylrest, wobei der Hydrocarbylrest gegebenenfalls substituiert ist durch eine oder mehrere gleiche oder verschiedene Gruppen, die ausgewählt sind unter Hydroxy-, Amino-, Epoxid-, Thiolgruppen und Halogenatomen.
Geradkettige C1-C20 Hydrocarbylreste umfassen Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, He- xyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl-, Decyl-, Undecyl-, Dodecyl-, Tridecyl-, Tetradecyl-, Pentadecyl-, Hexadecyl-, Heptadecyl-, Octadecyl-, Nonodecyl- und Eicosylreste. Verzweigte C3-C2O Hydrocarbylreste umfassen beispielsweise Isopropyl-, Isobutyl-, Isopentyl-, 2,2- Dimethylpropyl-, Isohexyl-, 3-Methylpentyl-, 2,2-Dimethylbutyl-, 2,3-Dimethylbutyl-, Isoheptyl, 3-Methylhexyl-, 2,2-Dimethylpentyl-, 2,3-Dimethylpentyl-, 2,4-Dimethylpentyl-, 2,2,3- Trimethylbutyl-, Isooctyl-, 3-Methylheptyl-, 4-Methylheptyl-, 2,2-Dimethylhexyl-, 2,4- Dimethylhexyl-, 2,5-Dimethylhexyl-, 2,2,3-Trimethylpentyl-, 2,2,4-Trimethylpentyl-, 2 ,2 ,5- Trimethylpentyl- und Isononylreste. Beispiele für C3-C2O Cycloalkylreste sind Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl-, Cycloheptyl-, Cyclooctyl-, Cyclononyl-, Cyclodecyl-, Cycloundecyl-, Cyclododecyl-, Cyclotridecyl-, Cyclotetradecyl-, Cyclopentadecyl-, Cyclohe- xadecyl-, Cycloheptadecyl-, Cyclooctadecyl-, Cyclononadecyl- und Cycloeicosylreste. Nicht- limitierende Beispiele für substitutierte Hydroxycarbylreste sind Hydroxymethyl-, Hydroxye- thyl-, Hydroxypropyl-, Hydroxybutyl-, Hydroxylpentyl-, Hydroxyhexyl-, Hydroxyheptyl-, Hydro- xyoctyl-, Hydroxynonyl- und Hydroxydecylreste. Das Polymer der allgemeinen Formel (I) kann also bei Vorliegen mehrerer Hydroxylgruppen ein Polyol sein. Gemäß weiteren, nicht- limitierenden Beispielen sind die Hydroxycarbylreste ausgewählt unter Kohlenhydraten, also insbesondere Polyhydroxyaldehyden und Polyhydroxyketonen, die als Monomere, Oligome- re oder Polymere vorliegen können. Dabei können in einem Polyacrylsäureester gleiche oder unterschiedliche Monomere vorkommen, und Oligomere bzw. Polymere können gleiche oder unterschiedliche Monomere umfassen. Kohlenhydrate sind dem Fachmann bekannt, und nicht-limitierende Beispiele für Polyhydroxyaldehyde umfassen Threose, Ribose, Arabinose, Xylose, Lyxose, nicht-limitierende Beispiele für Polyhydroxyketone umfassen Dihydroxyace- ton, Erythrulose, Ribulose, Xylulose, Fructose, Sorbose, Mannoheptulose.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch ge- kennzeichnet, dass der Polyacrylsäureester zusätzlich zu den Monomeren der Formel I wenigstens eine weitere davon verschiedene Monomerkomponente in einem molaren Anteil von 0 bis 15 Mol-% enthält, welche vorzugsweise ausgewählt ist unter N-Vinylformamid, Me- thacrylsäure, Methacrylsäureester, Itaconsäure, Itaconsäureester, Vinylphosphonsäure, Vi- nylsulfonsäure, Vinylalkohol, N-Vinylimidazol, N-Vinylformamid, Styrol, Maleinsäure, Malein- säurester, Ethylen, Propylen Acrylamid und substituierten Acrylamiden, wobei der Substi- tuent ausgewählt ist unter einem geradkettigen CrC2O oder C-i-Cβ Hydrocarbylrest, einem verzweigten C3-C20 oder C3-C6 Hydrocarbylrest und einem cyclischen C3-C20 oder C5- C7Hydrocarbylrest, wobei der Hydrocarbylrest gegebenenfalls substituiert ist durch eine oder mehrere gleiche oder verschiedene Gruppen, die ausgewählt sind unter Hydroxy-, Amino-, Epoxid-, Thiolgruppen und Halogenatomen.
In einer Ausführungsform des Verfahrens sind die Acrylsäuregruppen der Polyacrylsäurees- ter vor der Hydrolyse vollständig oder im Wesentlichen vollständig verestert.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren beträgt das mittlere Molekulargewicht des Polyacryl- säureesters bis zu etwa 3.000.000, beispielsweise von etwa 1.000 bis zu etwa 3.000.000, insbesondere bis zu etwa 200.000, 150.000, 100.000 oder 50.000. Der Polyacrylsäureester ist vorzugsweise ausgewählt unter Polyacrylsäuremethylester mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 20.000 bis etwa 3.000.000, insbesondere etwa 30.000 bis etwa 50.000, insbesondere etwa 40.000, und Polyacrylsäurebutylester mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 20.000 bis etwa 3.000.000, insbesondere etwa 90.000 bis etwa 110.000, ins- besondere etwa 99.000.
In weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Inkubation bei einem pH-Wert von 5 bis 14, vorzugsweise 7 bis 12, 8,5 bis 11 ,5, insbesondere bei einem pH-Wert von 9 bis 1 1 oder bei einem pH-Wert von 7 bis 9.
Gemäß weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt das Enzym in einer Lösung vor, insbesondere in einer wässrigen , organischen oder wässrig- organischen, organisch-wässrigen oder organischen Lösung vor. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfassen organisch-wässrige oder wässrig-organische Lösungen nicht nur homogene Lösungen vollständig mischbarer Komponenten (beispielsweise Wasser und organisches Lösungsmittel), sondern auch Zweiphasensysteme oder Mehrphasensysteme, beispielsweise Wasser-in-ÖI-Emulsionen, ÖI-in-Wasser-Emulsionen, Wasser-in-ÖI-in- Wasser-Emulsionen, usw. Das Enzym liegt dabei vorzugsweise vollständig oder überwiegend in der wässrigen Phase vor, der Polyacrylsäureester vorzugsweise vollständig oder überwiegend in der organischen Phase. Gemäß besonderen Ausführungsformen beträgt das Volumenverhältnis von wässriger zu organischer Komponente bzw. von wässriger zu organischer Phase etwa 75:25 bis 25:75, beispielsweise etwa 60:40 bis etwa 40:60, etwa 55:45 bis etwa 45:55, insbesondere etwa 50:50.
Gemäß besonderen Ausführungsformen liegt das Enzym in nicht-immobilisierter Form vor. Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt das Enzym in immobilisierter Form vor. Beispiele für immobilisierte Enzyme sind kovalent oder nicht-kovalent an Mikrosphären oder flächenartig geformte Träger gebundene Enzyme. Geeignete Methode zur Immobilisierung von Enzymen sind dem Fachmann bekannt und bei- spielsweise beschrieben in S. Fukui, A. Tanaka, „Enzymes", in: Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5. Aufl., Wiley-VCH, New York, Berlin, 1985; J.E. Prenosil, O. M. Kut, IJ. Dünn, E. Heinzle, "Immobilized Biocatalysts", in: Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6. Aufl., VCH, New York, Berlin, 2003, S. 503-554; J. F. Kennedy, J.M.S Cabral, in: H.J.Rehm, G. Reed (Hrsg.), Biotechnology: A comprehensive treatise in 8 vol.; Band 7a, S. 349-404; VCH, Weinheim, 1987. Nicht-kovalente Bindung des Enzyms kann beispielsweise erreicht werden durch Markierung des Enzyms mit Biotin und Immobilisierung an einen mit Avidin oder Streptavidin versehenen Träger, Markierung des Enzyms durch Einbau von Histidin-Tags in dessen Aminosäuresequenz und Immobilisierung an einen mit Nickel-Chelat versehenen Träger, Immobilisierung des Enzyms durch gegen das Enzym gerichtete Anti- körper (wobei die Bindungsepitope vorzugsweise so gewählt sind, dass die Bindung zwischen Antikörper und Bindungsepitop den Zugang von Substratmolekülen zum aktiven Zentrum nicht oder nicht wesentlich beeinträchtigt), Herstellung von Fusionsproteinen aus dem Enzym und einem Fremdprotein und Immobilisierung des Proteins durch gegen das Fremdprotein gerichtete Antikörper. In Analogie zu den oben gemachten Ausführungen können in immobilisierter Form vorliegende Enzyme Bestandteil eines Zweiphasensystems oder Mehrphasensystems sein. Beispielsweise kann ein auf einem festen Träger (wie beispielsweise einer Mikrosphäre) immobilisiertes Enzym als feste Phase angesehen werden, die im Rahmen eines Zweiphasensystems in einer flüssigen Phase (Wasser oder organisches Lösungsmittel) vorliegt, oder das auf einem festen Träger immobilisierte Enzym kann als feste Phase in einem bereits zwei- oder mehrphasigen flüssigen System (beispielsweise einer Wasser-in-ÖI-Emulsion oder einer ÖI-in-Wasser-Emulsion) vorliegen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird das Verfahren in einem Bioreaktor durchgeführt.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Enzym eine Esterase, die ausgewählt ist unter Esterasen der Familie VIII, Typ C Esterasen, einer Cuti- nase gemäß SEQ ID NO:5 oder davon abgeleiteten Cutinasen, sowie einer Triacylglycerinli- pase gemäß SEQ ID NO:6 oder davon abgeleiteten Triacylglycerinlipasen. In einer speziel- len Ausführungsform ist die Esterase vom Typ VIII die Esterase B von Burkholderia gladioli (ATCC 10248 ) gemäß SEQ ID NO:1 , in einer weiteren speziellen Ausführungsform ist die Typ C Esterase die Esterase C aus Burkholderia gladioli (ATCC 10248) gemäß SEQ ID NO:2. Gegenstand der Erfindung sind weiterhin funktionale Mutanten der genannten Esterasen.
Gemäß weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Esterase eine funktionale Mutante einer Esterase gemäß SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 mit gegenüber SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:2 vergleichbarer oder gesteigerter Aktivität hinsichtlich der Hydrolyse von Polyacrylsäureestern, und/oder eine funktionale Mutante einer Esterase gemäß SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 mit gegenüber SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:2 erhöhter Stabilität, beispielsweise gegenüber Einfluss von organischen Lösungsmitteln oder bezüglich der Denaturierung durch erhöhte Temperaturen.
Gemäß weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt die Mutante im Vergleich mit einer Esterase gemäß SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 eine gesteigerte Hydrolyse-Aktivität gegenüber Polyacrylsäuremethylester und/oder Polyacrylsäurebutylester. Die Hydrolyse-Aktivität kann beispielsweise quantitativ ermittelt werden durch einen Titrati- onsassay, bei dem eine Esterspaltung in Lösung stattfindet und der durch die freiwerdenden Säuregruppen absinkende pH-Wert durch Zugabe von NaOH (oder eines anderen pH- Korrekturmittels) kompensiert wird. Eine gesteigerte Hydrolyse-Aktivität liegt beispielsweise vor, wenn die Mutante im Vergleich mit der entsprechenden Esterase gemäß SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 eine schnellere Einstellung eines Reaktionsgleichgewichts herbeiführt (d.h. die gleiche Menge NaOH in kürzerer Zeit zugegeben werden muss) und/oder das Gleichgewicht in Richtung einer vollständigeren Hydrolyse verschiebt (d.h. mehr NaOH zugegeben werden muss). Die Hydrolyse-Aktivität kann weiterhin halb-quantitativ in einem pH- Shift-Assay bestimmt werden durch Inkubation der Enzym-Mutante oder eines die Enzym- Mutante produzierenden Mikroorganismus mit einem Polyacrylsäureester enthaltenden Substrat, das beispielsweise in einem Agarmedium oder auf einer Filtermembran angeboten werden kann, und Bestimmung des Abfalls des pH-Wertes durch freiwerdende Säuregruppen durch Farbumschlag eines gleichzeitig anwesenden pH-Indikators. Eine gesteigerte Hydrolyse-Aktivität liegt vor, wenn die Mutante im Vergleich mit der entsprechenden Estera- se gemäß SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 einen schnelleren Umschlag zu niedrigen pH- Werten oder einen intensiveren Umschlag (größere Farbumschlagshöfe um Enzym-haltige Stellen herum) zu niedrigeren pH-Werten bewirkt.
Gemäß weiteren Ausführungsformen ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekenn- zeichnet, dass (a) die Esterase eine Mutante einer Esterase gemäß SEQ ID N0:1 ist, die wenigstens eine Mutation, wie z.B. 1 , 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Mutationen, in einem oder mehreren der Aminosäurereste SeM 7, Gly132, Trp134, Arg155, Glu251 , Ala311 und Glu316 aufweist; oder
(b) die Esterase eine Mutante einer Esterase gemäß SEQ ID NO:2 ist, die wenigstens eine Mutation, wie z.B. 1 , 2, 3, 4 oder 5 Mutationen, in einem oder mehreren der Aminosäurereste Phe138, Val150, Leu160, Thr188 und Leu193 aufweist.
In weiteren Ausführungsformen ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Esterase von SEQ ID NO:1 abgeleitet ist und a) wenigstens eine, wie z.B. 1 , 2, 3, 4 oder 5 Mutationen, der Mutationen Ser17Leu,
GIyI 32Ser, Glu251 GIy, Ala31 1VaI und Glu316Lys und/oder b) wenigstens eine, wie z.B. 1 , 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Mutationen, der Mutationen ProδLeu,
Gly132Ser, Trp134Arg, Arg155Cys, Glu251 Gly, Ala31 1Val und Glu316Lys umfasst.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Esterase von SEQ ID NO:1 abgeleitet ist und
(a) die Mutationen Ser17Leu, Gly132Ser, Glu251 Gly, Ala31 1VaI und Glu316Lys; oder (b) die Mutationen ProδLeu, Gly132Ser, Trp134Arg, Arg155Cys, Glu251 Gly, Ala31 1Val und Glu316Lys umfasst.
Besondere Ausführungsformen stellen dabei Esterasen gemäß SEQ ID NO:3 bzw. SEQ ID NO:4 dar.
In weiteren besonderen Ausführungsformen ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Esterase von SEQ ID NO:2 abgeleitet ist und eine der nachfolgenden Mutationen oder Kombinationen von Mutationen (d.h. eine der nachfolgend aufgelisteten Ein - oder Mehrfachmutationen) umfasst: (a) Phe138Ala
(b) Phe138Ala, Thr188Ser
(c) Phe138Ala, Leu160Ala, Thr188Ser
(d) Leu 193AIa
(e) Leu193Ala, Phe138Ala, Thr188Ser, Val150Ala (f) Leu193Ala, Phe138Ala, Thr188Ser
(g) Leu193Ala, Phe138Ala, Thr188Ser, Leu160Ala, Val150Ala (h) VaM 50AIa (i) Val150Ala, Thr188Ser
C) Leu193Ala, Phe138Val
(k) Leu193Ala, Phe138Val , Thr188Ser, Val150Ala
(I) Leu193Ala, Thr188Ser
(m) Leu193Ala, Phe138Val , Thr188Ser
(n) Leu193Ala, Phe138Val , Thr188Ser, Leu160Ala
(o) Phe138Val, Val150Ala, Thr188Ser
(P) Phe138Val
(q) Phe138Val, Thr188Ser
Gemäß weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Esterase eine Deletionsmutante einer Esterase vom Typ VIII oder einer Typ C Esterase. Vorzugsweise weist die Esterase dabei eine Loop-Kürzung auf. Geeignete Bereiche für eine Loop- Kürzung bei einer Esterase gemäß SEQ ID NO:1 (EstB von B. gladioli) stellen beispielsweise die Bereiche Glu246 bis Arg 258 und Gly312 bis 323. Dabei können Loop-Kürzungen durchgeführt werden durch Entfernen einer oder mehrerer Aminosäuren, wobei im Fall des Entfer- nens mehrerer Aminosäuren wiederum ein oder mehrere in SEQ ID NO:1 benachbart oder nicht benachbart gelegene Aminosäuren entfernt werden können. Besondere Ausführungsformen stellen Deletionsmutanten der unter SEQ ID NO:37 und SEQ ID NO:38 angegebenen Aminosäuresequenzen dar.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die zuvor genannten funktionalen Esterase- Mutanten.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Nukleinsäuren, a) die für funktionale Esterase-Mutanten kodieren, oder b) die zu a) komplementäre Nukleinsäuren darstellen, und/oder c) mit einer Nukleinsäure gemäß a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleinsäuren, insbesondere solche Nukleinsäuren, welche eine Sequenz- identität von wenigstens 80 % aufweisen und für eine Mutante einer Esterase der
Familie VIII oder eine Typ C Esterase-Mutante kodieren, die Polyacrylsäureester hydrolysiert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft einen Vektor, umfassend eine der vorstehend genannten Nukleinsäuren. Gemäß einer besonderen Ausführungsform ist die Nukleinsäure operativ mit einem Promotor verknüpft. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft einen Mikroorganismus, umfassend wenigstens einen der vorstehend genannten Vektoren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer der vor- stehend genannten funktionalen Esterase-Mutanten, wobei man a) eine zur Expression der Esterase befähigten Wirtsorganismus, beispielsweise den vorstehend genannten Mikroorganismus, der wenigstens einen der vorstehend genannten Vektoren enthält, kultiviert b) gegebenenfalls die Expression der Esterase induziert, und c) gegebenenfalls die Esterase aus dem Wirtsorganismus und/oder dem Kulturmedium isoliert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer der vorstehend genannten Esterasen, eines der vorstehend genannten Vektoren, oder eines der vorstehend genannten Mikroorganismen zur Durchführung eines der vorstehend genannten Esterhydrolyse-Verfahren, oder zur korrespondierenden Umesterung solcher Polyacrylsäureester .
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein polymeres Reaktionsprodukt, das erhältlich ist durch eines der vorstehend genannten Verfahren.
IM. Weitere Angaben zur Ausführung der Erfindung
1. Verfahren zur enzymkatalvsierten Hydrolyse von Polyacrylsäureestern
Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft eine enzymkatalysierte Hydrolyse von Polyacrylsäureestern, die hier auch als enzymatische Esterspaltung (oder in Kurzform: Esterspaltung) bezeichnet wird.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Bereitstellung wenigstens eines Po- lyacrylsäureesters und dessen Inkubation mit wenigstens einer Esterase vorgesehen. Die Bereitstellung erfolgt vorzugsweise in einer Lösung, wobei eine wässrige Lösung, eine organische Lösung (umfassend ein oder mehrere organische Lösungsmittel) oder wässrig- organische Lösung (wobei die organische Lösungsmittelkomponente ein oder mehrere orga- nische Lösungsmittel umfasst) vorliegen kann. Zu den verwendbaren organischen Lösungsmitteln gehören beispielsweise Alkohole, wie beispielsweise Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol und Butanol, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie beispielsweise Benzol und Toluol, Ether, wie beispielsweise Dimethylether, Diethylether, 1 ,2-Dimethoxyethan, und Tetrahydrofuran. Bevorzugt sind wässrige Lösungen oder wässrig-organische Lösungen. In einer wässrig-organischen Lösung kann die organische Lösung bzw. die Summe der organischen Lösungsmittelkomponenten einen Volumenanteil von 1 bis 80 Vol.-%, vorzugsweise von 10 bis 60 Vol.-%, und insbesondere von etwa 40 Vol. -% einnehmen. Die wässrig- organischen Lösungen bzw. organisch-wässrigen Lösungen können im Rahmen der Erfindung homogene Lösungen sein, oder Zwei- oder Mehrphasensysteme (wie beispielsweise Öl-in-Wasser-, Wasser-in-ÖI-, Wasser-in-ÖI-in-Wasser-Emulsionen). Um einen einfachen Kontakt zwischen Enzym und Polyacrylsäureester zu ermöglichen, sind die Lösungen vor- zugsweise nicht gelartig. Die Lösungen weisen vorzugsweise Viskositäten von weniger als 4000 mPa*s, insbesondere weniger als 2000 mPa*s, weniger als 1000 mPa*s, weniger als 500 mPa*s, weniger als 400 mPa*s, weniger als 200 mPa*s, weniger als 100 mPa*s, weniger als 50 mPa*s, weniger als 25 mPa*s, weniger als 10 mPa*s, weniger als 5 mPa*s oder weniger als 2,5 mPa*s auf. Die wässrige Lösung oder die wässrige Komponente einer wäss- rig-organischen Lösung kann einen Puffer darstellen. Der pH-Wert des Puffers wird vorzugsweise eingestellt auf den pH-Wert, bei dem die enzymkatalysierte Esterspaltung erfolgen soll. Wird das erfindungsgemäße Verfahren in einem Bioreaktor durchgeführt, in dem Mikroorganismen die wenigstens eine Esterase produzieren, welche den wenigstens einen Polyacrylsäureester spaltet, so wird der pH-Wert vorzugsweise auf einen für die Kultivierung des Mikroorganismus geeigneten Wert eingestellt. Der Fachmann ist mit dem Ermitteln geeigneter pH-Werte vertraut. Geeignete Puffer zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren sind dem Fachmann ebenfalls bekannt und umfassen beispielsweise PBS, Tris-HCI- Puffer, Triethanolamin-Hydrochlorid/NaOH-Puffer, Diethanolamin/HCI-Puffer, Natriumbo- rat/HCI-Puffer, Glycin/NaOH-Puffer, Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat-Puffer, Na2HPO4/NaOH-Puffer, 2-(Cyclohexylamino)ethansulfonsäure/NaOH-Puffer und 3- (Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure/NaOH-Puffer. Dem Fachmann sind weitere Puffersysteme bekannt, die beispielsweise beschrieben sind in Harris und Angal (Hrsg.), Protein purification methods - a practical approach, IRL Press at Oxford University Press, 1. Aufl. (Nachdruck) 1990.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei allen Temperaturen durchgeführt werden, bei der die verwendeten Esterasen aktiv sind, beispielsweise bei Temperaturen von 5°C bis 85°C, vorzugsweise von 100C bis 500C, besonders bevorzugt von 20°C bis 400C. Der Fachmann ist mit der Tatsache vertraut, dass Enzyme Temperaturoptima hinsichtlich ihrer Stabilität und/oder ihrer katalytischen Aktivität haben, die gegebenenfalls auch in Abhängigkeit vom verwendeten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch variieren können, und kann für jede verwendete Esterase die optimale Temperatur oder den optimalen Temperaturbereich bestimmen. Wird das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt unter Verwendung von Mikroorganismen, welche die wenigstens eine, zur hydrolytischen Spaltung des Polyacrylsäure- esters verwendete Esterase produzieren, so können die Temperaturerfordernisse der Mikroorganismen durch den Fachmann bei der Wahl der Verfahrenstemperatur ebenfalls berück- sichtigt werden.
Die bereitgestellten Polyacrylsäureester können vollständig verestert sein (d.h. jede Acryl- säuregruppe ist mit einem Alkohol oder Alkoholderivat verestert) oder teilweise verestert sein (d.h. es liegen noch freie Acrylsäuregruppen im Molekül des Polyacrylsäureesters vor). Ge- maß bevorzugten Ausführungsformen ist der bereitgestellte Polyacrylsäureester bzw. sind die bereitgestellten Polyacrylsäureester vollständig verestert oder im Wesentlichen vollständig verestert. Im Wesentlichen vollständige Veresterung liegt vor, wenn mindestens 75%, insbesondere mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% der Acrylsäuregrup- pen der Polyacrylsäure verestert sind. Im Wesentlichen vollständig veresterte Polyacrylsäureester weisen dementsprechend beispielsweise Veresterungsgrade von 75% bis 100%, 75% bis 99%, 75% bis 98%, 75% bis 97%, 75% bis 96%, 75% bis 95%, 85% bis 100%, 85% bis 99%, 85% bis 98%, 85% bis 97%, 85% bis 96%, 85% bis 95%, 90% bis 100%, 90% bis 99%, 90% bis 98%, 90% bis 97%, 90% bis 96%, 90% bis 95%, 95% bis 100%, 95% bis 99%, 95% bis 98%, 95% bis 97% oder 95% bis 96% auf.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann im diskontinuierlichen Betrieb (Chargenbetrieb, Batch-Betrieb) oder im kontinuierlichen Betrieb erfolgen. Im diskontinuierlichen Betrieb werden der wenigstens eine Polyacrylsäureester und die wenigstens eine Esterase bereitge- stellt, die Inkubation durchgeführt und das Reaktionsgemisch zu einem gewählten Zeitpunkt aus dem Reaktionsgefäß entnommen und gegebenenfalls der Weiterverarbeitung zugeführt (beispielsweise des Isolierung des Reaktionsproduktes oder der Rückgewinnung der wenigstens einen Esterase). Die Entnahme kann nach vollständig verlaufener Esterspaltung (d.h. nach Einstellung eines Gleichgewichts zwischen Polyacrylsäureester einerseits und Polyac- rylsäure oder teilweise veresterter Polyacrylsäure andererseits) oder nach unvollständig verlaufener Esterspaltung erfolgen. Den geeigneten Zeitpunkt der Entnahme der jeweiligen Charge kann der Fachmann über verschiedene Methoden bestimmen, beispielsweise durch vorherige Probenentnahme und -analyse, oder durch kontinuierliche Überwachung des Reaktionsverlaufs mittels geeigneter Parameter, beispielsweise des pH-Wertes oder der Visko- sität der Lösung, die sich mit fortschreitender Esterspaltung ändern. Die Charge kann gegebenenfalls auch nach Ablauf einer vorbestimmten Reaktionsdauer entnommen werden. Im diskontinuierlichen Betrieb kann nach erstmaliger Bereitstellung des wenigstens einen PoIy- acrylsäureesters und der wenigstens einen Esterase vor der endgültigen Entnahme des Reaktionsgemisches unabhängig voneinander eine ein- oder mehrmalige erneute Zugabe von Polyacrylsäureester und/oder Esterase erfolgen. Im kontinuierlichen Betrieb wird nach der erstmaligen Bereitstellung des wenigstens einen Polyacrylsäureesters und der wenigstens einen Esterase zu bestimmten Zeitpunkten ein Teil des Reaktionsgemisches entnommen und das im Reaktionsgefäß verbleibende Reaktionsgemisch durch Zugabe von Polyacrylsäureester und/oder Esterase ergänzt. Die Zeitpunkte können periodisch oder in Abhängigkeit von Messungen des Reaktionsverlaufs gewählt sein. Ebenfalls möglich ist eine kontinuierliche Zugabe des wenigstens einen Polyacrylsäureesters und/oder der wenigstens einen Esterase. Unabhängig davon ist auch eine kontinuierliche Entnahme des Reaktionsgemisches möglich. Dem Fachmann ist bekannt, wie die einzelnen Prozessparameter (z.B. Menge und Zeitpunkt der Zugabe oder Entnahme) optimiert werden, um das gewünschte Reaktionsprodukt zu erhalten. Der kontinuierliche Betrieb kann über unterschiedlich lange Zeiträume erfolgen, beispielsweise über Stunden, Tage, Wochen, Monate oder Jahre, und kann beispielsweise für Reinigungs-, Inspektions- oder Wartungsarbeiten unterbrochen oder abgestellt werden.
Sofern die Isolierung des als Ergebnis der Esterspaltung erhaltenen modifizierten Polymers vorgesehen ist, kann diese über fachübliche Methoden erfolgen, beispielsweise durch chro- matographische Methoden, Dialyse, chemische Fällung, Extraktion mit Lösungsmitteln oder Evaporation des im Reaktionsgemisch enthaltenen Lösungsmittels. Soll die wenigstens eine Esterase wiederverwendet werden, so kann diese über fachübliche Methoden abgetrennt werden, vorzugsweise bevor die Isolierung des modifizierten Polymers durch möglicherweise enzymschädigende Methoden erfolgt. Eine Abtrennung der Esterase kann beispielsweise erfolgen durch Affinitätsreinigung mittels Esterase-bindender Moleküle (beispielsweise Antikörper), Dialyse oder Fällung (beispielsweise mit Ammoniumsulfat). Gemäß weiteren Ausführungsformen liegt die wenigstens eine Esterase in immobilisierter Form vor. Dem Fachmann sind verschiedene Verfahren der Immobilisierung bekannt, die beispielsweise beschrieben sind in S. Fukui, A. Tanaka, „Enzymes", in: Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5. Aufl., Wiley-VCH, New York, Berlin, 1985; J.E. Prenosil, O.M. Kut, IJ. Dünn, E. Heinzle, "Immobilized Biocatalysts", in: Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6. Aufl., VCH, New York, Berlin, 2003, S. 503-554; J. F. Kennedy, J.M.S Cabral, in: H.J.Rehm, G. Reed (Hrsg.), Biotechnology: A comprehensive treatise in 8 vol.; Band 7a, S. 349-404; VCH, Weinheim, 1987. Eine nicht-kovalente Bindung des Enzyms kann beispielsweise er- reicht werden durch Markierung des Enzyms mit Biotin und Immobilisierung an einen mit Avidin oder Streptavidin versehenen Träger, Markierung des Enzyms durch Einbau von Histidin-Tags in dessen Aminosäuresequenz und Immobilisierung an einen mit Nickel-Chelat versehenen Träger, Immobilisierung des Enzyms durch gegen das Enzym gerichtete Antikörper (wobei die Bindungsepitope vorzugsweise so gewählt sind, dass die Bindung zwischen Antikörper und Bindungsepitop den Zugang von Substratmolekülen zum aktiven Zentrum nicht oder nicht wesentlich beeinträchtigt), Herstellung von Fusionsproteinen aus dem Enzym und einem Fremdprotein und Immobilisierung des Proteins durch gegen das Fremdprotein gerichtete Antikörper, oder durch adsorptive Anheftung an Mikrosphären (Beads) oder auf Trägermaterialien. Durch die Immobilisierung wird bewirkt, dass die Esterasemoleküle stationär im Reaktionsgefäß verbleiben (beispielsweise auf den Wänden des Reaktionsgefäßes oder auf im Reaktionsgefäß befindlichen Oberflächen) und bei der Entnahme des Reaktionsgemisches nur die Polyacrylsäureester beziehungsweise die durch Esterspaltung modifizierten Polymere entnommen werden. Alternativ können sich die Esterasemoleküle bei Anheftung an Mikrosphären frei flotierend in der Reaktionslösung befinden und mit den Polyacrylsäureestermolekülen in Wechselwirkung treten, werden jedoch durch verschiedene Maßnahmen (beispielsweise Filter oder Verwendung von Wirbelbettreaktoren) am Ver- lassen des Reaktionsgefäßes zusammen mit den Polyacrylsäureestermolekülen und/oder den Polyacrylsäuremolekülen gehindert. Ebenfalls möglich ist die Entnahme der Mikrosphären zusammen mit den Polyacrylsäureestermolekülen und/oder den Polyacrylsäuremolekülen und eine anschließende Abtrennung, beispielsweise durch Zentrifugation oder Filtration.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann durchgeführt werden, bis die in dem Polyacrylsäureester enthaltenen Estergruppen teilweise oder vollständig hydrolytisch gespalten sind, wobei man im Falle einer vollständigen Hydrolyse Polyacrylsäure erhalten würde. Bevorzugt ist die Entnahme nach teilweiser Hydrolyse. In diesem Fall enthalten die anfangs bereitgestellten Polyacrylsäureester noch Estergruppen, die den im Reaktionsverlauf modifizierten Polyme- ren bestimmte Eigenschaften verliehen. Die modifizierten Polymere können anschließend für weitere Zwecke verwendet werden, beispielsweise als Ausgangsstoffe für weitere chemische Modifikationen.
2. Enzyme
Im erfindungsgemäßen Verfahren können Esterasen im allgemeinen und insbesondere auf Esterbindungen einwirkende Enzyme der EC-Klasse 3.1 gemäß der Einteilung des „No- menclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology" verwendet werden. Die Einteilung der EC-Klassen ist einzusehen in „Enzyme Nomenclature, 1992 herausgegeben von Academic Press für die „International Union of Biochemistry and Molecular Biology" unter der ISBN 0-12-227164-5, mit nachfolgenden Ergänzungsbänden, oder online im Internet unter http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/jcbn/index.htmW6. Bevorzugte Ausführungsformen sind Carbonsäureesterhydrolasen (E. C. 3.1.1 ), insbesondere Carbo- xylesterasen (E. C. 3.1 .1 .1 ), Triacylglycerinlipasen (E. C. 3.1 .1 .3) und Cutinasen (E. C. 3.1.1.74).
Für die erfindungsgemäßen Verfahren können auch „funktionale Mutanten" (auch als „funktionale Esterase-Mutanten", „Esterase-Mutanten" oder „Mutanten" bezeichnet) der konkret offenbarten Esterasen verwendet werden, wobei die funktionalen Mutanten, gegebenenfalls nach Isolierung aus einem diese produzierenden Mikroorganismus, selbst Gegenstand der Erfindung sind. Funktionale Mutanten sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Polypeptide, die sich von den konkret offenbarten Esterasen unterscheiden, wie z. B. solche mit einer Identität von weniger als 100% zu den Esterasen gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO:38 (beispielsweise 40 % bis weniger als 100%, 50% bis weniger als 100%, 60 % bis weniger als 100%, 75% bis weniger als 100%, 85 % bis weniger als 100%, 90% bis weniger als 100%, 95% bis weniger als 100% oder 99% bis weniger als 100%), welche aber weiterhin die gewünschte enzymatische Aktivität besitzen. Die gewünschte enzymatische Aktivität kann beispielsweise nachgewiesen werden durch Spaltung von Polyacrylsäureestern, beispielsweise Polyacrylsäuremethylester oder Polyacrylsäurebutylester. Die gewünschte enzymatische Aktivität wird als vorliegend angesehen, wenn die funktionale Mutante wenigs- tens 10% der Spaltungsaktivität der Esterase (die beispielsweise bestimmt werden kann als Umsetzung des Substrats pro Zeiteinheit), auf die Bezug genommen wird, aufweist, insbesondere wenigstens 20%, wenigstens 30%, wenigstens 40%, wenigstens 50%, wenigstens 60%, wenigstens 70%, wenigstens 80%, wenigstens 90%, wenigstens 95% oder 100% dieser Spaltungsaktivität. Die gewünschte enzymatische Aktivität liegt selbstverständlich insbe- sondere auch dann vor, wenn die funktionale Mutante eine höhere Spaltungsaktivität aufweist als die Esterase, auf die Bezug genommen wird, beispielsweise bis zu 105%, 1 10%, 120%, 150%, 200% oder mehr als 200% der Spaltungsaktivität der betreffenden Esterase. Sie liegt weiterhin auch dann vor, wenn die funktionale Mutante in der Lage ist, ein neues Substrat zu spalten, also einen Polyacrylsäureester, der von der Esterase, auf die Bezug genommen wird, nicht oder unter vergleichbaren Reaktionsbedingungen (wie beispielsweise Temperatur, pH-Wert, Lösungsmittel oder Lösungsmittelzusammensetzung, Salzkonzentration, Substratkonzentration, Enzymkonzentration) nicht gespalten wird.
Unter "funktionalen Mutanten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere veränderte Pro- teine, welche in wenigstens einer der Sequenzpositionen der oben genannten konkreten
Sequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen, jedoch trotzdem gewünschte enzymatische Aktivität besitzen. "Funktionale Mutanten" umfassen somit die durch eine oder mehrere, wie z.B. 1-50, 1-40, 1-30, oder 1-20, d.h. z.B. 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 1 7, 1 8, 1 9, 20 Aminosäure-Additionen, -Substitutionen, - Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen veränderten Proteine, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer funktio- nalen Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Mutanten liegen insbesondere auch dann vor, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche enzymatische Parameter (wie beispielsweise Substrataffinität, Wechselzahl) vorliegen, jedoch quantitativ unterschiedlich stark ausgeprägt sind. Beispiele für geeignete Substitutionen von Aminosäu- reresten sind folgende:
Ursprünglicher Rest Beispiele der Substitution
AIa VaI, GIy, Ser
Arg Lys
Asn GIn; His
Asp GIu
Cys Ser
GIn Asn
GIu Asp
GIy Pro
His Asn ; GIn
Ne Leu; VaI
Leu Ne; VaI
Lys Arg ; GIn ; GIu
Met Leu ; Ne
Phe Met ; Leu ; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp ; Phe
VaI Ne; Leu
„Funktionale Mutanten" im obigen Sinne sind auch Präkursoren der beschriebenen Esterasen sowie funktionale Derivate und Salze der Esterasen. Unter dem Ausdruck „Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogrup- pen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. „Funktionale Derivate" von in der Erfindung beschriebenen Ester- äsen oder erfindungsgemäßer funktionaler Esterase-Mutanten können an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen.
"Funktionale Mutanten" umfassen natürlich auch Esterasen, welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleiche Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung funktionale Mutanten ermitteln. Beispiele für Organismen sind Burkholderia (beispielsweise B. gladioli, B. mallei, B. pseudomallei, B. thailan- densis, B. cenocepacia, B. aurantiaca, B. vietnamensis, B. dolosa, B. multivorans, B. ambifa- ria), Stigmatella (beispielsweise S. aurantiaca), Streptomyces (beispielsweise S. ambofa- ciens, S. coelicoloή, Saccharopolyspora (beispielsweise S. erythraea), Mycobacterium (beispielsweise M. smegmatis, M. bovis, M. tuberculosis, M. leprae)
„Funktionale Mutanten" sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der oben genannten Polypeptidsequenzen von Esterasen oder davon abgeleiteter funktionaler Mutanten und we- nigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nicht-Iimitierende Beispiele für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Enzyme, Protein A und Immunglobuline, wobei Protein A- und Immunglobulin-Fusionen beispielsweise zur nicht-kovalenten Immobilisierung der funktiona- len Mutanten auf Trägern (beispielsweise Mikrosphären) verwendet werden können.
Dem Fachmann sind darüber hinaus Verfahren zur Erzeugung funktionaler Mutanten bekannt. Methoden zur Veränderung von Genen und somit zur Veränderung der durch diese kodierten Proteine sind dem Fachmann seit langem geläufig, beispielsweise die ortsspezifi- sehe Mutagenese, bei der gezielt einzelne oder mehrere Nukleotide eines Gens ausgetauscht werden (Trower MK (Hrsg.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey), die Sättigungsmutagenese, bei der an jeder beliebigen Stelle eines Gens ein Codon für eine beliebige Aminosäure ausgetauscht oder hinzugefügt werden kann (Kegler- Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valcärel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541 ; Barik S (1995) Mol Bio- technol 3:1 ), die fehleranfällige Polymerase-Kettenreaktion (error-prone PCR), bei der Nukleotidsequenzen durch fehlerhaft arbeitende DNA-Polymerasen mutiert werden (Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739); das Passagieren von Genen in Mutator- Stämmen, in denen beispielsweise aufgrund defekter DNA-Reperaturmechanismen eine erhöhte Mutationsrate von Nukleotidsequenzen auftritt (Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E. coli mutator strain. In: Trower MK (Hrsg.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey), oder DNA-Shuffling, bei dem ein Pool aus nahe verwandeten Genen gebildet und verdaut wird und die Bruchstücke als Templates (Matrizen) für eine Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden, bei der durch wiederholte Strangtrennung und Wiederannäherung letztendlich Mosaikgene voller Länge erzeugt werden (Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91 :10747). Je nach verwendeter Technik kann der Fachmann völlig zufällige oder auch gezieltere Mutationen in Gene oder auch nicht kodierende Nukleinsäureberei- che (die beispielsweise für die Regulation der Expression wichtig sind) einbringen und anschließend Genbanken erstellen. Die dazu erforderlichen molekularbiologischen Methoden sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in Sambrook und Russell, Mo- lecular Cloning. 3. Edition, CoId Spring Harbor Laboratory Press 2001.
Unter Anwendung der sogenannten gerichteten Evolution („directed evolution"; beschrieben unter anderem in Reetz MT und Jaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200:31 ; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing industrial enzymes by di- rected evolution, In: Demain AL, Davies JE (Hrsg.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiology) kann der Fachmann auch in gezielter Weise und auch in großem Maßstab funktionale Mutanten erzeugen. Dabei werden in einem ersten Schritt zunächst Genbanken der jeweiligen Proteine erzeugt, wobei beispielsweise die oben angegebenen Methoden zur Anwendung kommen können. Die Genbanken werden auf geeignete Weise exprimiert, beispielsweise durch Bakterien oder durch Phagen-Display- Systeme. Dem Fachmann sind weiterhin Methoden bekannt, um durch Wahl geeigneter Expressionsvektoren die Lokalisierung des Proteins im Wirt zu steuern, beispielsweise als intrazelluläre Proteine im Cytoplasma, als Membranprotein durch Hinzufügen eines Membranankers, oder als extrazelluläres Protein durch Hinzufügen eines Signalpeptids mit Erken- nungsstelle für eine Signalpeptidase. In einem zweiten Schritt werden anschließend Klone, die Proteine mit gewünschter Eigenschaft exprimieren, selektiert oder gescreent. Bei der Selektion überleben nur die Klone, die Proteine mit gewünschten Eigenschaften exprimieren, da diese den Wirtsorganismen einen Überlebensvorteil verschaffen (beispielsweise Enzyme, welche die Verwertung bestimmter Substrate ermöglichen oder das Wachstum bei bestimmten Temperaturen). Beim Screening (auch als Screenen bezeichnet) überleben alle Klone, so dass über geeignete Assays bestimmt wird, welcher der Klone ein Protein mit gewünsch- ter Eigenschaft exprimiert. Dem Fachmann ist bekannt, wie Assays für den jeweiligen Zweck geeignet gestaltet werden. Beispielsweise kann bei der Suche nach Proteinen mit bestimmten Bindungseigenschaften auf Wirtsorganismen gescreent werden, welche die fraglichen Proteine auf ihrer Oberfläche exprimieren und auf einem mit dem Bindungspartner beschichteten Substrat haften (im Gegensatz zu Wirtsorganismen, die nicht funktionsfähige Proteine exprimieren); bei der Suche nach funktionalen Mutanten mit katalytischen Eigenschaften können Wirtsorganismen beispielsweise in Mikrotierplatten mit substrathaltigem Medium oder auf substrathaltigen Agarplatten kultiviert werden und das Vorliegen von funktionalen Mutanten (gegebenenfalls nach Lyse der Wirtsorganismen, um Kontakt mit dem Medium zu ermöglichen) beispielsweise durch Farbreaktionen nach Umsatz des Substrat angezeigt werden. In diesem Zusammenhang können automatisierte Systeme (z.B. Pipettierroboter für Mikrotiterplatten, Screeningroboter, Bilderkennungssysteme zur Identifizierung von Kolonien auf Agarplatten) zum Einsatz kommen, um ein Screening mit hohem Durchsatz (High Throughput Screening) zu ermöglichen. Die betreffenden Gene von Wirtsorganismen, die funktionale Mutanten mit Eigenschaften exprimieren, welche den gewünschten Eigenschaf- ten weitgehend entsprechen, werden einer weiteren Mutationsrunde unterworfen. Die Schritte der Mutation und der Selektion oder des Screenings andererseits können iterativ solange wiederholt werden, bis die vorliegenden funktionalen Mutanten die gewünschten Eigenschaften in ausreichendem Maße aufweisen.
Durch ein iteratives Vorgehen ist es möglich, gezielt auf Proteine mit gewünschten Eigenschaften zu screenen, obwohl die Einführung von vielen Mutationen in eine Proteinsequenz mit höherer Wahrscheinlichkeit zum Verlust einer Funktion führt als zum Erwerb bzw. der Verbesserung einer erwünschten Funktion. Im Rahmen des iterativen Vorgehens geht man von einem Referenzprotein aus, beispielsweise einem Wildtyp-Protein, und erstellt auf der Grundlage von dessen Nukleotidsequenz eine Genbibliothek mit Mutationen. Dabei wird die Mutationsrate auf Nukleotidebene so gewählt, dass nach Expression der mutierten Nukleinsäuren nur eine relativ geringe Anzahl von Aminosäuren in den translatierten Peptiden oder Proteinen mutiert sind, beispielsweise 1 bis 3 Aminosäuren. Die erhaltenen mutierten Peptide oder Proteine werden auf Vertreter mit gewünschten Eigenschaften gescreent (beispiels- weise eine höhere katalytische Aktivität für ein oder mehrere Substrate, ein erweitertes oder verändertes Substratspektrum, eine verbesserte Stabilität bei erhöhten oder veränderten Temperaturen oder pH-Werten oder in bestimmten Lösungsmitteln). Auf der Grundlage der Sequenzen von gefundenen Peptiden oder Proteinen mit solchen gewünschten Eigenschaften (die gegebenenfalls nur schwach ausgeprägt sind) wird eine zweite Genbibliothek erstellt, in der wiederum eine relativ geringe Rate von Mutationen eingeführt wird, und die daraus translatierten Proteine werden erneut auf die gewünschte Eigenschaft gescreent. Dieser Zyklus aus dem Erstellen einer mutierten Genbibliothek und dem Screenen der daraus exprimierten Peptide oder Proteine auf gewünschte Eigenschaften kann beliebig oft wiederholt werden. Einerseits wird durch die pro Zyklus verwendete geringe Mutationsrate vermieden, dass praktisch alle Proteine aufgrund zu vieler Mutationen in deren Aminosäuresequenz einen Funktionsverlust aufweisen, andererseits können durch die iterative Wiederholung von Mutation und Selektion günstige Mutationen akkumuliert werden und so letztendlich mit hohen Erfolgsaussichten Proteine bereitgestellt werden, welche die gewünschten, deutlich verbesserten Eigenschaften aufweisen. Durch die Sequenzanalyse von Mutanten mit verbesserten Eigenschaften erhält der Fachmann darüber hinaus Sequenzinformation, die ihm anzeigen, welche Sequenzpositionen oder Sequenzbereiche eines Peptids oder Proteins für eine gewünschte Eigenschaft wichtig sind. Basierend auf diesen Informationen kann er Mutationen bewusst an diesen Stellen oder in diesen Bereichen setzen und dementsprechend noch zielgerichteter Mutanten mit gewünschten Eigenschaften erhalten. Beispiele in der Literatur für die Erzeugung von Proteinen mit gewünschten Eigenschaften, aus denen auch dafür in Frage kommende Methoden der Erzeugung von Mutationen ersichtlich werden, sind beschrieben in Zhao und Arnold, Protein Engineering 12:47-53 (1999) oder May et al., Na- ture Biotechnology 18:317-320 (2000):
Weitere erfindungsgemäß mit umfasste „funktionale Mutanten" sind Homologe zu den konkret offenbarten Esterasen. Diese besitzen wenigstens 40 % oder wenigstens 50%, oder wenigstens 60 %, wie z.B. wenigstens 75% oder insbesondere wenigstens 85 %, wie z.B. 90%, 95% oder 99%, Homologie zu einer der konkret offenbarten Sequenzen, z.B. berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sei. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. Eine prozentuale Homologie eines erfindungsgemäßen homologen Polypeptids bedeutet insbesondere prozentuale Identität der Aminosäurereste bezogen auf die Gesamtlänge einer der hierin konkret beschriebenen Aminosäuresequenzen.
Unter einer „abgeleiteten" Aminosäuresequenz wird erfindungsgemäß, wenn keine anderen Angaben gemacht werden, eine Sequenz verstanden, die mit der Ausgangssequenz eine Identität von mindestens 80% oder mindestens 90%, insbesondere etwa 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% und 99% aufweist. Gegenstand der Erfindung sind beispielsweise die von allen hier offenbarten Aminosäuresequenzen abgeleiteten Aminosäuresequenzen. Unter „Identität" bzw. „Homologie" zwischen zwei Sequenzen wird Identität der Aminosäurereste über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, wie z.B. die Identität, die durch Vergleich mit Hilfe der Vector NTI Suite 7.1 Software der Firma Informax (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2): 151-1 ) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Multiple alignment parameters:
Gap opening penalty 10
Gap extension penalty 10
Gap Separation penalty ränge 8
Gap Separation penalty off
% identity for alignment delay 40
Residue specific gaps off
Hydrophilic residue gap off
Transition weighing 0
Pairwise alignment parameters:
FAST algorithm on
K-tuplesize 1
Gap penalty 3
Window size 5
Number of best diagonals 5
Der Fachmann kann diese Werte in Abhängigkeit von den konkret zu vergleichenden Sequenzen falls erforderlich weiter variieren.
Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen die erfindungsgemäßen funktiona- len Mutanten Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glykosylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.
Homologe der beschriebenen Esterasen oder von deren erfindungsgemäßen funktionalen Mutanten können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine Bank von Peptid-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11 :477).
Im Rahmen der Untersuchungen, die der vorliegenden Erfindung zugrunde lagen, stellten die Erfinder überraschend fest, dass Esterbindungen von Polyacrylsäureestern, also polymerer Substrate, von Esterasen gespalten werden können. Dabei können Esterasen aus verschie- denen Organismen verwendet werden, wobei als nicht-limitierende Beispiele genannt werden können: Burkholderia (beispielsweise B. gladioli, B. mallei, B. pseudomallei, B. thailan- densis, B. cenocepacia, B. aurantiaca, B. vietnamensis, B. dolosa, B. multivorans, B. ambifa- ria), Stigmatella (beispielsweise S. aurantiaca), Streptomyces (beispielsweise S. ambofa- ciens, S. coelicoloή, Saccharopolyspora (beispielsweise S. erythraea), Mycobacterium (bei- spielsweise M. smegmatis, M. bovis, M. tuberculosis, M. leprae).
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugte Esterasen sind auf Esterbindungen einwirkende Enzyme der EC-Klasse 3.1 , insbesondere Carbonsäure- esterhydrolasen (EC 3.1.1 ). Besonders bevorzugt sind Carboxylesterasen, Triacylglycerin- lipasen und Cutinasen. Weitere besondere Ausführungsformen stellen Esterasen der Familie VIII (insbesondere Esterase B von Burkholderia gladioli gemäß SEQ ID NO:1 und deren funktionale Mutanten) sowie Typ C Esterasen (insbesondere Esterase C von Burkholderia gladioli gemäß SEQ ID NO:2 und deren funktionale Mutanten) dar. Weitere, nicht- limitierende Beispiele für verwendbare Esterasen sind die Sequenzen gemäß SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, auf deren Grundlage wiederum funktionale Mutanten erzeugt oder abgeleitet werden können. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden somit weiterhin funktionale Mutanten bekannter Esterasen hergestellt, die ebenfalls in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können und darüber hinaus - gegebenenfalls nach Isolierung aus einem die funktionalen Mutanten produzierenden Mikroorganismus - selbst Gegenstand der Erfindung sind.
Diese funktionalen Mutanten betreffen insbesondere Esterasen mit gegenüber dem bekannten Wildtyp veränderter Aminosäuresequenz, wobei durch die veränderte Sequenz eine neue Esterase bereitgestellt wird, bei der gegebenenfalls der Zugang von polymeren Substraten zum katalytisch aktiven Zentrum ermöglicht oder erleichtert wird, und/oder die Stabili- tat der Esterase erhöht wird, beispielsweise die Stabilität bei bestimmten pH-Werten oder in verschiedenen Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen Gegenstand der Erfindung sind somit unter anderem funktionale Mutanten von Esterasen, bei denen Strukturelemente verändert oder entfernt werden, die den Zugang von Substraten zum aktiven Zentrum verhindern oder erschweren, beispielsweise Loops. Geeignete Bereiche für eine Loop-Kürzung bei einer Esterase gemäß SEQ ID NO:1 (EstB von B.gladioli) stellen beispielsweise die Bereiche Glu246 bis Arg 258 und Gly312 bis 323. Dabei können Loop-Kürzungen durchgeführt werden durch Entfernen einer oder mehrerer Aminosäuren, wobei im Fall des Entfernens mehrerer Aminosäuren wiederum eine oder mehrere in SEQ ID NO:1 benachbart oder nicht benachbart gelegene Aminosäuren entfernt werden können. Gegenstand der Erfindung sind weiterhin funktionale Mutanten von Esterasen, bei denen der Zugang zum katalytisch aktiven Zentrum (hier auch als aktives Zentrum bezeichnet), der beispielsweise tunnel-, trichter-, furchen- oder spaltenförmig ausgebildet sein kann, für Moleküle aus der Umgebung der Esterase besser zugänglich gemacht wurde. Dies kann beispielsweise erfolgen, indem Aminosäuren mit großen Seitenketten, die Bestandteil des Zugangs zum katalytisch aktiven Zentrum sind, entfernt oder durch Aminosäuren mit kleineren Seitenketten ersetzt werden (beispielsweise Alanin durch Glycin, VaNn durch Alanin oder Glycin, Leucin durch VaNn, etc.). Dadurch wird der räumliche Zugang von Teilbereichen von Polyacrylsäureestern, die Makromoleküle mit großer Raumausfüllung darstellen, zum katalytischen Zentrum ermöglicht oder erleichtert. Mit Hinblick auf die Ladung von Polyacrylsäureestern, die aufgrund noch freier Carboxylgruppen eine negative Ladung aufweisen können, kann dies weiterhin geschehen durch Austausch von sauren Aminosäuren im Zugangsbereich des aktiven Zentrums durch neutrale oder basische Aminosäuren. Mit Hinblick auf Polyacrylsäureester, die beispielsweise aufgrund von mit basischen Gruppen substituierten Alkoholbestandteilen des Esters eine eher positive Ladung aufweisen, kann der Zugang zum katalytisch aktiven Zent- rum entsprechend durch Austausch von basischen Aminosäuren im Zugangsbereich des katalytisch aktiven Zentrums durch weniger basische, gegebenenfalls neutrale oder saure Aminosäuren erleichtert oder ermöglicht werden. Beispielsweise sind geeignete Aminosäu- ren, bei deren Austausch durch Aminosäuren mit kleineren Seitenketten der Zugang zum aktiven Zentrum verbessert werden sollte, Tyr181 , Trp348 undTrp149 im Falle von SEQ ID NO:1. Bei SEQ ID NO:2 kommen dafür beispielsweise Leu163, Val213 und Pro168 in Frage, wobei insbesondere im Falle von Pro168 durch einen Austausch durch AIa oder GIy auch die Flexibilität des zugehörigen Loops erhöht werden kann, wodurch ein größeres Substrat zugelassen werden kann. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind funktionale Mutanten von Esterasen mit erhöhter Stabilität, beispielsweise erhöhter pH-, Temperatur- oder Lösungsmittelstabilität. Eine solche erhöhte Stabilität kann beispielsweise erreicht werden durch Aminsäureaustausche, mit denen intramolekulare Wechselwirkungen innerhalb eines Proteinmoleküls erstmals möglich werden oder verstärkt werden, durch die instabile Loops des Proteinmoleküls besser fixiert werden oder einzelne Proteindomänen einen besseren Zusammenhalt erhalten.
Dementsprechend ist sind besondere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung funkti- onale Mutanten von EstB gemäß SEQ ID NO:1 , bei denen über dem katalytisch aktiven Zentrum liegende Loops durch mehr oder weniger vollständige Deletion des Loop-bildenden Aminosäuren beseitigt oder verkürzt wurden. In Fig. 1 ist ein Molekülmodell von EstB gemäß SEQ ID NO:1 gezeigt, bei dem zwei Loops identifiziert wurden, die zwischen dem katalytisch aktiven Zentrum und dem Außenmedium der EstB liegen.
Weitere besondere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind dementsprechend funktionale Mutanten von EstC gemäß SEQ ID NO:2. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde ein Strukturmodell von EstC verwendet, auf dessen Grundlage funktionale Mutanten hergestellt wurden. In diesem Zusammenhang wurden von den Erfindern Proteinbe- reiche identifiziert, die den Zugang zum katalytisch aktiven Zentrum auskleiden. Anschließend wurden durch ortsspezifische Mutagenese gezielt einzelne oder mehrere Aminosäuren von SEQ ID NO:2 verändert, um den Zugang zu erweitern und einen besseren Zutritt von großen, polymeren Substraten zu ermöglichen. Als eine den Zugang zum aktiven Zentrum auskleidende Aminosäure wurde Phe138 (d.h. das Phenylalanin an der Aminosäureposition 138) identifiziert (Fig. 2). In Fig. 2 ist zu erkennen, dass Phe138 mit seiner Seitenkette zwischen den Aminosäuren Ser1 12, Asp242 und His275 des katalytisch aktiven Zentrums und dem Außenmedium des Proteins liegt. Durch den Austausch von Phe138 mit Alanin (Phe138Ala) wird angesichts der kleineren Seitengruppe von Alanin der Zugang raumbeanspruchender Substratmoleküle, beispielsweise Polyacrylsäureester, zum katalytisch aktiven Zentrum erleichtert (entsprechend der Mutation 1 K22 in Fig. 5). Die physikochemischen Eigenschaften der Proteinoberfläche an der Position 138 bleiben im Wesentlichen gleich, da eine hydrophobe Aminosäure durch eine andere hydrophobe Aminosäure ersetzt wird. Als weitere, den Zugang zum katalytisch aktiven Zentrum behindernde Aminosäure wurde erfindungsgemäß Leu193 identifiziert (Fig. 4), die bei einer Ausführungsform durch Alanin ersetzt wurde (entsprechend der Mutation 2K20 in Fig. 5). Als weiteres Beispiel ist Thr188 zu nennen, das in einer Randlage des Zugangs zum katalytisch aktiven Zentrum liegt und den Zu- tritt von Substratmolekülen noch zu einem gewissen Grad beeinflussen kann (Fig. 4). Gemäß einer Ausführungsform wird Thr188 durch Serin ersetzt, beispielsweise in der Dreifachmutation Phe138Ala, Leu193Ala, Thr188Ser (Fig. 4). Von der Erfindung umfasst sind beliebige Kombinationen dieser oder der in Fig. 5 angegebenen Mutationen. Der Fachmann ist anhand der hier aufgezeigten Vorgehensweise in der Lage, geeignete Positionen für Ami- nosäureaustausche auch bei zu Este homologen Proteinen zu ermitteln. Beispielsweise kann er unter Verwendung des Programms „Tripos" von Sybly (St. Louis, MO, USA) Überlagerungen der hier offenbarten Struktur von EstC und einer Esterase mit ähnlicher 3-D- Struktur vornehmen und bei dieser geeignete Positionen ermitteln, so dass die vorliegende Erfindung nicht auf die hier konkret offenbarten Proteine und Mutationen beschränkt ist.
3. Nukleinsäuren
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin die kodierenden Nukleinsäuresequenzen für die oben beschriebenen funktionalen Esterase-Mutanten, wie insbesondere gemäß SEQ ID NO: 54 bis SEQ ID NO:57.
Alle erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA) sind in an sich bekannter Weise durch chemi- sehe Synthese aus den Nukleotidbausteinen, wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seiten 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Unter einer „abgeleiteten" Nukleinsäuresequenz wird erfindungsgemäß, wenn keine anderen Angaben gemacht werden, eine Sequenz verstanden, die mit der Ausgangssequenz eine
Identität von mindestens 80% oder mindestens 90%, insbesondere etwa 91 %, 92%, 93%,
94%, 95%, 96%, 97%, 98% und 99% aufweist. Gegenstand der Erfindung sind beispielswei- se alle von den hier offenbarten Nukleinsäuresequenzen abgeleiteten Nukleinsäuresequen- zen.
Unter „Identität" zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleotide über die je- weils gesamte Nukleinsäurelänge verstanden, insbesondere die Identität, die durch Vergleich mit Hilfe der Vector NTI Suite 7.1 Software der Firma Informax (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (siehe oben) ermittelt wird.
Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen, kodierend für eine der obigen Esterasen und deren funktionalen Mutanten, welche z.B. unter Verwendung künstlicher Nukleotidanaloga zugänglich sind.
Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungsgemäße Esterasen oder enzymatisch aktive Abschnitte davon kodieren, sowie Nukleinsäurefragmen- te, die z.B. als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßer kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden können.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem nicht-translatierte Sequenzen vom 3'- und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthalten.
Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombi- nante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemi- kalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels molekularbiologischer Standard- Techniken und der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise kann cDNA aus einer geeigneten cDNA-Bank isoliert werden, indem eine der konkret offenbarten vollständigen Sequenzen oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungs- sonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies lässt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine der erfin- dungsgemäßen Sequenzen oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor klo- niert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können ferner durch Standard-Syntheseverfahren, z.B. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.
Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequenzen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologen Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z.B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.
Weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen sind abgeleitet von kodierenden Sequenzen der erfindungsgemäßen Esterasen und unterscheiden sich davon durch eine oder mehrere, wie z.B. 1-50, 1-40, 1-30, oder 1-20, d.h. z.B. 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder meh- rerer Nukleotide, kodieren aber weiterhin für Esterasen mit der gewünschten enzymatischen Aktivität.
Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eines speziellen Ur- Sprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z.B. Spleißvarianten oder Allelvari- anten, davon. Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotid-Substitutionen (d.h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequenzen.
Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den konkret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Polymorphismen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Variation existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidsequenz eines Gens. Weiterhin umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuresequenzen, welche mit oben genannten kodierenden Sequenzen hybridisieren oder dazu komplementär sind. Diese Polynukleotide lassen sich bei Durchmusterung von genomischen oder cDNA-Banken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschließend bei- spielsweise mit geeigneten Sonden isolieren. Eine weitere Möglichkeit bietet die Transformation geeigneter Mikroorganismen mit erfindungsgemäßen Polynukleotiden oder Vektoren, die Vermehrung der Mikroorganismen und damit der Polynukleotide und deren anschließende Isolierung. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Polynukleotide auch auf chemischem Wege synthetisiert werden.
Unter der Eigenschaft, an Polynukleotide „hybridisieren" zu können, versteht man die Fähigkeit eines PoIy- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen zu 70-100%, insbesondere zu 90-100%, wie z.B. 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicherweise werden dazu Oligonukleoti- de ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt. Unter stringenten Bedingungen versteht man beispielsweise in der Northern-Blot-Technik die Verwendung einer 50 - 70 0C, vorzugsweise 60 - 65 0C warmen Waschlösung, beispielsweise 0,1x SSC-Puffer mit 0,1% SDS (2Ox SSC: 3M NaCI, 0,3M Na-Citrat, pH 7,0), zur Elution unspezifisch hybridisierter cDNA- Sonden oder Oligonukleotide. Dabei bleiben, wie oben erwähnt, nur in hohem Maße komplementäre Nukleinsäuren aneinander gebunden. Die Einstellung stringenter Bedingungen ist dem Fachmann bekannt und ist z.B. in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Bio- logy, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.
4. Expressionskonstrukte und Vektoren
Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für eine erfindungsgemäße Esterase oder eine funktionale Mutante kodierende Nukleinsäuresequenz; sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.
Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorse- quenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz. Unter einer „operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Enhancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Me- thods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Zusätzlich zu den artifiziellen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulationssequenz vor dem eigentlichen Strukturgen noch vorhanden sein. Durch genetische Veränderung kann diese natürliche Regulation gegebenenfalls ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht oder erniedrigt werden. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor das Strukturgen inser- tiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wird nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert oder verringert wird. Die Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Beispiele für brauchbare Promotoren sind: cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq-, Tf-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, lambda-PR- oder lambda-PL-Promotor, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden; sowie die gram-positiven Promotoren amy und SPO2, die Hefepromotoren ADC1 , M Falpha , AC, P-60, CYC1 , GAPDH oder die Pflanzenpromotoren CaMV/35S, SSU, OCS, IiM, usp, STLS1 , B33, not oder der Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor. Besonders bevorzugt ist die Verwendung induzierbarer Promotoren, wie z.B. licht- und insbesondere temperaturinduzierbarer Promotoren, wie der PrPrPromotor. Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulations- Sequenzen verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Die genannten regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsäuresequenzen und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirts- Organismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyade- nylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) sowie in TJ. Silhavy, M. L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Pro- tocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.
Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden.
Als Beispiele für geeignete Expressionsvektoren können genannt werden:
Übliche Fusionsexpressionsvektoren, wie pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. und Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), bei denen Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose E- bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusioniert wird.
Nicht-Fusionsprotein-Expressionsvektoren wie pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301 -315) und pET 1 1 d (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89). Hefe-Expressionsvektor zur Expression in der Hefe S. cerevisiae , wie pYepSed (Baldari et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:1 13-123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwen- düng in anderen Pilzen, wie filamentösen Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C. A. MJ. J. & Punt, PJ. (1991 ) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (bspw. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al., (1983) Mol. Cell Bio!.. 3:2156-2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170:31-39).
Pflanzen-Expressionsvektoren, wie solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20:1 195-1 197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12:871 1- 8721.
Säugetier-Expressionsvektoren, wie pCDMδ (Seed, B. (1987) Nature 329:840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195).
Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryontische und eukaryotische Zellen sind in Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Molecular cloning: A La- boratory Manual, 2. Auflage, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.
5. Rekombinante Wirtsorganismen
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Organismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäßen Domänen oder Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, chemische Trans- formation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.
Als Wirtsorganismen sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ihrer Allelvarianten, ihrer Ableitungen, die funktionale Mutan- ten kodieren, oder ihrer Derivate ermöglichen. Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Bevorzugte Organismen sind Bakterien, wie solche der Gattungen Escherichia, wie z. B. Escherichia coli, Strep- tomyces, Bacillus, Pseudomonas oder Burkholderia, eukaryotische Mikroorganismen, wie Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryotische Zellen aus Tieren oder Pflan- zen, beispielsweise Sf9-, CHO- oder HEK293-Zellen, wobei im Rahmen der vorliegenden Erfindung einzelne oder zu Zellhaufen aggregierte oder gewachsene Zellen aus höheren eukaryotischen Lebensformen wie Tieren oder Pflanzen ebenfalls als Mikroorganismen bezeichnet werden. Die Selektion erfolgreich transformierter Organismen kann durch Markergene erfolgen, die ebenfalls im Vektor oder in der Expressionskassette enthalten sind. Beispiele für solche Markergene sind Gene für Antibiotikaresistenz und für Enzyme, die eine farbgebende Reaktion katalysieren, die ein Anfärben oder eine Fluoreszenz der transformierten Zelle bewirkt. Diese können dann mittels automatischer Zellsortierung selektiert werden. Erfolgreich mit einem Vektor transformierte Mikroorganismen, die ein entsprechendes Antibiotikaresistenz- gen (z.B. G418 oder Hygromycin) tragen, lassen sich durch entsprechende Antibiotikaenthaltende Medien oder Nährböden selektieren. Markerproteine, die an der Zelloberfläche präsentiert werden, können zur Selektion mittels Affinitätschromatographie genutzt werden.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur rekombinanten Herstellung erfin- dungsgemäßer Esterasen oder funktioneller, enzymatisch aktiver Fragmente davon, wobei man einen Esterase-produzierenden rekombinanten Wirtsorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Esterase induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Esterase oder die Esterasen können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist. Der rekombinante Wirt kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 4O0C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, MoIe- cular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.
Die Zellen werden dann, falls die Esterasen nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z.B. in einer French-Druckzelle (French Press), durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homo- genisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.
Eine Aufreinigung der Esterasen kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose- Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.
Besonders geeignet ist es, zur Isolierung des rekombinanten Esterase Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die z.B. einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fun- gierende sogenannte "Tags", wie z.B. die als Hexa-Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. CoId Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Peptide an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule ein- gefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.
Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Esterasen verwendet werden. Zur Erkennung der Esterasen können außerdem übliche Marker, wie Fluoreszenzfarbstoffe, En- zymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bil- den, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Esterasen verwendet werden. 6. Reaktoren
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in fachüblichen Reaktoren durchgeführt und in ver- schiedenen Maßstäben durchgeführt werden, beispielsweise im Labormaßstab (wenige Milliliter bis Dutzende von Litern) oder im industriellen Maßstab (Liter bis mehrere Tausend Kubikmeter). Wird die Esterase in Form eines isolierten, mehr oder weniger aufgereinigten Enzyms verwendet, so kann ein chemischer Reaktor verwendet werden. Wird im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren die verwendete Esterase von einem Mikroorganismus produ- ziert und gegebenenfalls in das Reaktionsmedium abgegeben, so dass dort die Esterspaltung stattfinden kann, so wird ein Bioreaktor (Fermenter) verwendet, in dem neben geeigneten Verfahrensbedingungen für die Esterspaltung auch geeignete Lebensbedingungen für die Esterase produzierenden Mikroorganismen (z.B. durch Bereitstellung eines geeigneten Nährmediums und pH-Werts, einer geeignete Temperatur, Versorgung mit Sauerstoff oder anderen Gasen, Antibiotika, etc.) bereitgestellt werden. Ein Bioreaktor ist somit geeignet für die Bereitstellung der Esterasen durch ein Ganzzellsystem, in dem lebende Mikroorganismen (beispielsweise prokaryotische Zellen wie Bakterien oder Archaebakterien, oder euka- ryotische Zellen wie Hefen, Säugetierzellen oder Insektenzellen) kultiviert werden. Der Fachmann ist vertraut mit den verschiedenen Aspekten der Verwendung von Reaktoren, beispielsweise dem Upscaling von chemischen oder biotechnologischen Verfahren vom Labormaßstab bis hin zum großtechnischen Produktionsmaßstab sowie der Optimierung von Prozessparameter und kann gegebenenfalls auf entsprechende Fachliteratur zurückgreifen (für biotechnologische Verfahren beispielsweise Crueger und Crueger, Biotechnologie - Lehrbuch der angewandten Mikrobiologie, 2. Aufl., R. Oldenbourg Verlag, München, Wien, 1984).
7. Reaktionsprodukte
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Reaktionsprodukte. Die Reaktionsprodukte können zusammen mit dem im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Reaktionsgemisch vorliegen, oder teilweise oder weitgehend aufgereinigt werden. Geeignete Aufreinigungsgrade können vom Fachmann je nach Bedarf und weiterem Verwendungszweck routinemäßig bestimmt werden und um umfassen beispielsweise chemische Reinheit oder Analysenreinheit. Geeignete Methoden zur Aufreinigung sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise Fällung und chromatographische Methoden. Die erhaltenen Reaktionsprodukte, die je nach Grad der vorangegangenen Esterspaltung Polyacrylsäuren oder teilweise veresterte Polyacrylsäure darstellen, können beispielsweise eingesetzt werden in Farben und Beschichtungen, wie Wandfarben, Beschichtungen (z.B. von Metalloberflächen, insbesondere in der Automobilindustrie) und Lacken. Weitere Anwendungen finden sich in der Papierindustrie (z.B. zur Beeinflussung der Druckfähigkeit, des Aussehens oder des Glanzes), bei Klebstoffen und Mitteln zur Versiegelung oder Abdichtung, in der Textilindustrie (z.B. als Bindemittel für Pigmentfärbungen oder Bedruckungsvor- gänge) oder in der Lederindustrie (beispielsweise, um Lederoberflächen hydrophob zu ma- chen). Weitere Anwendungen umfassen die Herstellung von Textil- und Glasfasern, Poliermittel für Fußböden, Autos oder Schuhe, Zusatzstoffe für hydraulische Bindemittel, Mörtel oder Beton. Polyacrylate werden weiterhin eingesetzt beim Pflanzenschutz und dem Aussprühen von Düngemitteln sowie als Matrizes für Ionenaustauscher. Anwendungen von Po- lymethacrylaten (d.h. Poly(methylmethacrylaten) umfassen insbesondere die sogenannten Acrylgläser sowie weiterhin Zusatzstoffe für die Erdölindustrie, Verdickungsmittel für Dispersionen und in der kosmetischen Industrie. Polymethacrylate werden weiterhin als Prothesen in der Zahnheilkunde, als Knochenzement in der Chirurgie und als galenische Hilfsstoffe bei Tabletten mit kontrollierter Freisetzung eingesetzt.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es insbesondere möglich, regiospezifisch veränderte Polymere bereitzustellen. Überraschenderweise wurde gefunden, dass unter Verwendung von Enzymen, die nur endständige Estergruppen des Polymermoleküls hydrolytisch spalten, nicht jedoch weiter im Inneren des Polymermoleküls befindliche Estergruppen, derartig selektiv modifizierte Polymere im Vergleich zu chemischen Verfahren vergleichsweise einfach hergestellt werden können.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die nachfolgenden, nicht-limitierenden Beispiele näher erläutert.
Experimenteller Teil
Beispiel 1 : Herstellung einer EstC-Genbank
Es wurde eine Genbibliothek mit mutierter EstC von Burkholderia gladioli (SEQ ID NO:51 ) hergestellt, um funktionale Mutanten von EstC zu erhalten. Dabei wurden durch zufällige Mutagenese („random mutagenesis") Mutationen in EstC eingeführt, wobei das Plasmid pMSPM1 .17 in einer fehleranfälligen PCR („error-prone PCR") als Template laut Protokoll eingesetzt wurde und unter Verwendung des GeneMorph® Il Random Mutagenesis Kit (Stratagene) Sequenzfehler in die PCR-amplifizierten EstC-Gene eingebracht wurden. Lit: Instruction Manual GeneMorph® Il Random Mutagenesis Kit (Cat# 200550). Anschließend wurden die PCR-amplifizierten Gene mit dem Promega Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System laut Protokoll gereinigt und mit den Restriktionsenzymen Ndel und Hindill in Puffer R von Fermentas geschnitten. Unabhängig davon wurde als Vektor-DNA das Plasmid pMS470Δ8 (Balzer et al., Nucleic Acids Research, 1992, Vol. 20, No. 8, 1851-1858) mit den gleichen Restriktionsenzymen verdaut, und nach thermischer Inaktivierung der Restriktions- enzyme (800C, 20 min.) mit 1 μl CaIf Intestine Alkaline Phosphatase (CIAP) von Fermentas für 1 Stunde bei 37 0C dephosphoryliert. Die gesamte DNA wurde auf ein Agarosegel aufgetragen, der entsprechende Vektorteil ausgeschnitten und mit dem Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System von Promega laut Protokoll aufgereinigt. Anschließend wurden die Vektor- DNA und die hergestellten Inserts mit T4 DNA Ligase von Fermentas 1 Stunde bei 200C ligiert. Das Ligationsprodukt wurde anschließend mit dem Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System von Promega gereinigt und entsalzt und mit dem Micro PulserTM von BioRad durch Elektroporation (2,5kV) je 2 μl der Plasmid-DNA in 80μl in kompetente E. coli BL21 (DE3) Zellen transformiert. Sofort nach dem Elektroschock wurden die Zellen in 1 ml SOC Medium aufgenommen und für 35 min. bei 37°C und 550 rpm auf einem Eppendorf „Thermomixer comfort" regeneriert. Die kompetenten Zellen wurden hergestellt laut „Current Protocols in Molecular Biology" 1.8.4. Transformierte Klone wurde auf LB-Amp Platten (100μg/ml) selek- tioniert, 10 Transformanten auf den oben angegebenen Selektionsplatten ausgestrichen und für eine Plasmidpräparation gemäß QIAprep® Spin Miniprep Kit von Qiagen verwendet. Die isolierten Plasmide wurden mit den oben angegebenen Restriktionsenzymen verdaut und durch Agarose-Gelelektrophorese das Vorliegen eines Inserts der korrekten Größe bestätigt. Zusätzlich wurde durch Sequenzierung die Mutationsrate bestimmt.
Beispiel 2: Herstellung von mutierten EstC-Varianten durch ortspezifische Mutagenese
Für die ortsspezifische Mutagenes wurde der „QuickChange Multi-Site-directed Kit" von Stratagene (Katalog-Nr. #200514 und #100515) verwendet, der eine schnelle und zuverlässige Methode für die ortsspezifische Mutagenese einer Plasmid-DNA an bis zu fünf Stellen gleichzeitig bietet. Für die Mutation jeder einzelnen Stelle ist ein einziges mutagenes Oligo- nukleotid erforderlich, wobei ein doppelsträngiges DNA-Template verwendet wird. Folgende mutagene Oligonucleotid-Primer, die gemäß den Empfehlungen im Protokoll des QuickChange Multi-Site-directed Kit entworfen und von Invitrogen synthetisiert wurden, wurden verwendet, wobei die erzeugten Mutationen in Klammern angegeben sind: SEQ ID NO:39:
(Phe138Val) 5'-gctgctcttgtatatcttgctgcggtcatgcctgc- 3'
SEQ ID NO:40: (Phe138Ala) 5'-gctgctcttgtatatcttgctgcggccatgcctgc- 3'
SEQ ID N0:41 :
(GIu 154AIa) 5'-gtaagagcaccagcaaaccatggcgaaatgctggc- 3'
SEQ ID NO:42:
(Leu 163AIa) 5'-ctggcctcggcgatctgcgccagccct- 3' SEQ ID NO:43:
(Leu 189AIa) 5'-cggcctatctcgccacggcgaagca- 3'
SEQ ID NO:44:
(Leu 189AlaLeu 193AIa) 5'-gccacggcgaagcaggcggcgttcgaggatgttga- 3'
SEQ ID NO:45: (Leu193Ala) 5'-gcaggcggcgttcgaggatgttgac- 3'
SEQ ID NO:46:
(VaI 150AIa) 5'-gtacctggtcttgattacgcgagagctcct- 3'
SEQ ID NO:47:
(Thr188Ser) 5'-gcctatctcgcctcgctgaagcagg- 3' SEQ ID NO:48:
(Leu 160AIa) 5'-cgaaatggcggcctcgctgatctgc- 3'
SEQ ID NO:50:
(Thr188AlaLeu189AlaLeu 193AIa) 5'-tatctcgcctcggcgaagcaggcggcgttcgagga-3'
Für die ortspezifische Mutagenese wurde unter Verwendung eines üblichen Protokolls für DNA-Minipräparationen (QIAprep Spin Miniprep Kit von Qiagen) doppelsträngiges DNA- Template hergestellt. Anschließend wurde die Reaktionsmischung für die Synthese des mutierten Strangs über PCR gemäß folgender Aufstellung hergestellt, wobei die einzelnen Bestandteile in der Reihenfolge, die in der Aufstellung angegeben ist, in das Reaktionsgefäß gegeben und anschließend gemischt wurden:
Experimentelle Reaktion: 2,5 μl 10xQuikChange Multi-Reaktionspuffer 2,0 μl ds-DNA Template: pMS470[£sfC] (50 ng) 1 ,0 μl dNTP-Mix
1 ,0 μl QuikChange Multi-Enzymmischung x μl mutagene Primer (bei Verwendung von 1-3 Primern wurden ca. 100 ng jedes Primers, bei Verwendung von 4-5 Primern ca. 50 ng jedes Primers zugegeben) x μl zweifach destilliertes H2O für ein Endvolumen von 25 μl
Kontrollreaktion:
2,5 μl 10xQuikChange Multi-Reaktionspuffer
18,5 μl zweifach destilliertes H2O
1 ,0 μl (50 ng/μl) QuikChange Multi-Kontrolltemplate
1 ,0 μl QuikChange Multi-Kontrolprimermischung (100 ng/μl pro Primer)
1 ,0 μl dNTP-Mix
1 ,0 μl QuikChange Multi-Enzymmischung
Die Reaktionen unter Verwendung der in der nachfolgenden Tabelle 1 angegebenen Parameter durchgeführt, wobei für die Kontrollreaktion eine Dauer von 8 Minuten für die Strang- synthese verwendet wurde:
Tabelle 1 :
Anschließend wurde zu jeder Reaktionsmischung der jeweiligen Amplifizierungsreaktionen 1 μl des Restriktionsenzyms Dpnl gegeben. Jede Reaktionsmischung wurde durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren vorsichtig und gründlich gemischt. Anschließend wurden die Reaktionsmischungen in einer Mikrozentrifuge 1 min zentrifugiert und unmittelbar danach 1 h bei 37°C inkubiert, um die elterliche (nicht-mutierte) doppelsträngige DNA zu verdauen.
Anschließend wurden die erhaltenen PCR-Fragmente nach der Reinigung mit dem Promega Wizard SV Gel und PCR Clean-Up System laut Protokoll gereinigt und mit den Restriktionsenzymen Ndel und Hindill in Puffer R (Fermentas) verdaut und über die in Beispiel 1 beschriebene Vorgehensweise in ebenfalls mit den Restriktionsenzymen Ndel und I— lind 111 geschnittenen Vektor pMS470Δ8 ligiert
Anschließend erfolgte eine Transformation von XLI O-GoId Ultra-kompetenten Zellen gemäß den Herstellerangaben (Stratagene). Für jede Transformationsreaktion wurde ein geeignetes Volumen gemäß den Angaben in Tabelle 2 auf LBamp-Platten ausplattiert. Für die Kontrolle der Mutagenese wurden die Zellen auf LBamp-Platten ausplattiert, die mit 80 μg/ml X-gal und 20 mM IPTG hergestellt worden waren.
Tabelle 2
Die Transformationsplatten wurden anschließend über Nacht bei 37°C inkubiert. Die zu erwartende Kolonienanzahl aus der Mutagenese-Kontrolltransformation liegt zwischen 50 und 800 Kolonien. Mehr als 50% der Kolonien aus der Mutagenese- Kontrolltransformation sollten alle drei Mutationen aufweisen und als blaue Kolonien auf IPTG- und X-gal-haltigen Agarplatten erscheinen. Die zu erwartende Kolonienanzahl aus der experimentellen Mutagenese-Transformation liegt zwischen 10 und 1000 Kolonien. Nach Erreichen der erwarteten Kolonienanzahl wurden etwa 150 Transformanten auf LBamp-IPTG- Platten (0,2 mM IPTG) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Beispiel 3: Aktivitätsnachweis mittels Filterassay
Die in Beispiel 2 hergestellten EstC-Mutanten wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, Substrate mit Esterbindungen zu spalten. Dazu wurden die entsprechenden Plasmide in jeweils in den Expressionsstamm E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen) transformiert. 10 Kolonien mit der gleichen Mutation wurden zuerst mit α-Naphtylacetat getestet.
a) Farbassay mit Fast Blue B auf Spaltung von Naphtolestern
Dazu wurden die Kolonien sowie Positivkontrollen Este, EstB und die Negativkontrolle E. coli BL21 [pMS470Δ8] auf LB-Amp-IPTG-Platten (100 μg/ml Ampicillin, 0,2 mM IPTG) in einem festgelegten Muster ausgestrichen und über Nacht inkubiert. Anschließend wurden die Zellkolonien mit einem sterilen Papierfilter (Whatman, Cat No 1001-085) von der Agarplatte abgezogen und die Filter 10 Minuten bei 37°C getrocknet. Die Bakterienzellen wurden 25 min bei Raumtemperatur mit 500 μl Bug Buster (Novagen) aufgeschlossen und die Filtermembranen anschließend 10 min mit 0,02 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) äquilibriert. Für den Test mit α-Naphtylacetat wurden 5 ml Puffer (0,05 M Tris-HCI, pH 7,0) mit 100 μl Substratlö- sung (10mg/ml α-Naphtylacetat in Aceton) und 100 μl Farblösung (10mg/ml Fast Blue B Salz in H2O) in einer Glaspetrischale gemischt und die Filtermembranen getränkt. Die Bildung eines violett-roten Farbkörpers zeigte die Aktivität der Esterase an.
b) pH-Shift Assay
Die, mit dem Substrat α-Naphtylacetat, jeweils aktivsten Klone wurden auf die Substrate Po- lymethylacrylat (PMA), Polybutylacrylat (PBA) sowie 2,4-Dimethylglutarsäure-dimethylester (DG) und 2,4-Dimthylglutarsäure-dibutylester (DB) getestet. Dazu wurden wie oben be- schrieben, Kolonien auf Agarplatten angezüchtet, und wie in Beispiel 3a beschrieben auf Papierfilter übertragen.
Für die Herstellung der Substratlösung wurde zunächst eine Screening-Lösung vorbereitet, die 400 μL Phosphatpuffer (0.1 M, pH = 7.0), 800 μL Aqua dest., 500 μL DMSO, 750 μL Phenolrot (10 g/l) und 400 μL NaOH (0.1 M) enthielt. Für pH-Shift-Assays mit DG bezie- hungsweise DB wurden jeweils 200 μl dieser Substrate in jeweils 9,5 ml Screening-Lösung gelöst und die oben vorbereiteten Filtermembranen mit 1 ml der so zubereiteten Substratlösung getränkt. Für pH-Shift-Assays mit den Substraten PMA beziehungsweise PBA wurden diese jeweils auf trockene Membranen pipettiert, die oben hergestellten Filtermembranen mit den lysierten Zellkolonien wurden mit 1 ml der Screening-Lösung getränkt und auf die Membranen mit den Substraten gelegt. Nach Inkubation bei RT wurde der durch Bildung von Säuregruppen nach Esterspaltung ausgelöste Farbumschlag von rot nach gelb bestimmt. Der Farbumschlag konnte ab ca. 20 Minuten detektiert werden.
In Fig. 5 ist die Aktivität der verwendeten Klone angegeben, wobei folgende Symbole ver- wendet wurden:
+++: sehr aktiv
++: aktiv
+: schwach aktiv o: nicht aktiv
Beispiel 4: Herstellung von Esterase enthaltenden bakteriellen Rohlvsaten
Zur Herstellung von enzymhaltigem bakteriellen Rohlysat wurden als Vorkultur zunächst 30 ml LB-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt (nachfolgend: LBamp) in einem 100 ml Er- lenmeyerkolben mit einer Bakterienkolonie beimpft und über Nacht auf einem Schütteltisch bei 37°C und 180 U/min kultiviert. Für die anschließende Hauptkultur wurden 500 ml Kulturmedium [2xTY (10g/L Hefeextrakt, 16g/L Trypton, 5g/L NaCI)] mit einem Aliquot der Vorkul- tur auf eine OD6oo von 0,1 beimpft und bei 300C kultiviert, bis eine OD6oo von 0,5 - 0,8 erreicht war. Anschließend erfolgte eine Induktion der Expression durch 0,1 mM IPTG und eine 16-stündige Inkubation bei 28°C. Die Bakterienkultur wurde danach 30 min bei 4°C in 1000 ml Zentrifugenbechern bei 4000 U/min (= 3062 x g) zentrifugiert und die Pellets jeweils in 20 ml 0, 1 M Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert. Zum Aufschließen der Zellen erfolgte eine 5- minütige Ultraschallbehandlung, gefolgt von 1 min Pause und einer weiteren 5-minütigen Ultraschallbehandlung mit einem Branson Sonifier 250, wobei der Duty Cycle auf 50% und die Leistungskontrolle auf Stufe 5 eingestellt waren. Das erhaltene Aufschlussprodukt wurde 1 h bei 40 000 U/min ( = 1 17734 x g) zentrifugiert, unter Verwendung einer Membran mit einer Porengröße von 0,2 μm sterilfiltiert und bis zur Verwendung bei -200C aufbewahrt.
Beispiel 5: Standardisierung der Enzymaktivität
Wie in Beispiel 4 hergestelltes Rohlysat wurde in einem photometrischen Assay zur Spaltung von para-Nitrophenylbutyrat (p-NPB) als Substrat verwendet (wobei der Fachmann aufgrund seines Fachwissen in der Lage ist, Assays auf der Grundlage anderer geeigneter Substrate, wie beispielsweise para-Nitrophenylacetat, p-NPA, zu entwickeln). Bei diesem Test zur Este- rase-Aktivitätsbestimmung mit para-Nitrophenylestern wurden in einer Küvette 980μl Puffer (1 M Tris-Puffer, pH 7.0) mit 10μl Enzymlösung (oder Verdünnung der Enzymlösung mit 1 M Tris-Puffer, pH 7.0) gemischt. Die Reaktion wurde mit 10μl Substratlösung (400 mM para- Nitrophenylester in DMSO) gestartet und in einem Beckmann UV Spektrophotometer bei der Wellenlänge von 405nm die Zunahme des para-Nitrophenols verfolgt.
ε = (para-Nitrophenol) 1 1.86mM"1cm"1 (bestimmt bei pH 7.0)
Formel für die Berechnung der Aktivität:
AAbs/minx V .
U I ml = x Verdünnung ε x l x v
Eine Einheit (Unit, U) Esterase entspricht der Menge, die in diesem Assay einem Umsatz von 1 μmol/min führt.
Beispiel 6: Nachweis der enzymkatalvsierten Spaltung Zum Unterscheidung von enzymkatalysierter Substratspaltung und chemischer Substratspaltung wurde ein Rohlysat des Stammes NJ70 (enthaltend eine funktionale Mutante der Esterase B von Burkholderia gladioli, EstB_NJ70, gemäß SEQ ID NO:4) gemäß Beispiels 4 hergestellt. Als Substratlösung 750 μl PBA-Lösung (CAS Nr: 9003-49-0, Sigma Aldrich, 25-30 Gew.-% in Toluol) (entsprechend 1 ,75 mmol monomere Estergruppen) zu 35 ml eines Mastermix (340 ml 0,9% NaCI, 220 ml Toluol, 70 ml Emulgen (10%ige Lösung in H2O), pH 7) Emulgen 913, Lot. 2265, Kao Cemicals, Osaka Japan, alternativ kann Tergitol NP-9 von Al- rich verwendet werden) gegeben und der pH-Wert der Lösung mit 10 mM NaOH-Lösung auf 10 eingestellt. Anschließend wurden 500 μl Rohlysat (entsprechend 1000 Einheiten gemäß dem in Beispiel 5 etablierten Standard) zugegeben und die Absenkung des pH-Werts durch im Zuge der Spaltung der Esterbindungen freiwerdende Säuregruppen durch Zugabe von 10 mM NaOH kompensiert. Zur Bestimmung der chemischen Autolyse wurden in einem unabhängigen Ansatz 500 μl Rohlysat mit durch 30-minütiges Kochen bei 800C denaturiertem Enyzm zugegeben. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt. Nach Zugabe von aktivem Enzym ist aufgrund der freiwerdenden Säuregruppen eine hohe Zugabe von 10 mM NaOH erforderlich, um den pH-Wert auf 10 zu halten (Kurve mit Rautensymbolen in Fig. 6). Dagegen erfolgt bei Zugaben von denaturiertem Enzym nur eine geringe Esterspaltung durch chemische Autolyse (Kurve mit Dreiecken in Fig. 6). Der sprunghafte Anstieg an pH- Korrekturmittelverbrauch (NaOH) unmittelbar nach Zugabe von Rohlysat mit denaturiertem Enzym kann durch den pH-Wert des Rohlysats von 7 erklärt werden.
Beispiel 7: Inhibierung der enzymkatalvsierten Spaltung durch Polvacrylsäure
Die entsprechenden Versuche erfolgten analog zu Beispiel 6 in wässriger Lösung, wobei durch die enzymkatalysierte Spaltung von Esterbindungen des vorgegebenen Substrats Polybutylacrylat (PBA) Säuregruppen gebildet wurden. Diese führten zu einem Absinken des pH-Werts, der durch Zugabe von 10 mM NaOH kompensiert wurde. Die zugegebene Menge NaOH spiegelt also den Verlauf der Reaktion wieder. Alle Messungen wurden in 35 ml Reaktionsansatz bei pH = 9.0 und einer Temperatur von 37°C durchgeführt. Es wurden 350 Einheiten der Esterase EstB_NJ70 (SEQ ID NO:4) und 750 μl der PBA-Lösung eingesetzt, was 1 ,75 mmol monomeren Estergruppen entspricht. Als Titrationslösung wurde 1 OmM NaOH verwendet.
Zur Bestimmung einer möglichen Produkthemmung wurden in einem Parallelansatz zu Beginn der Messung 850 μl einer 20%igen Sokalan-Lösung zugesetzt (Sokalan PA: 15 (PoIy- acrylsäure, Mw 1200, pH 8.0), was 1 ,74mmol monomeren Acrylsäureeinheiten entspricht. Wie aus den Fig. 2 gezeigten Ergebnissen ersichtlich ist, wurden die eingesetzten Enzyme von Burkholderia gladioli (SEQ ID NO:1 ; WT in Fig. 7) sowie deren funktionale Mutanten EstB_N27 (SEQ ID NO:3) bzw. EstB_NJ70 (SEQ ID NO:4) durch Sokalan nicht oder nur minimal inhibiert.
Beispiel 8: pH-Abhängigkeit der enzvmkatalvsierten Esterspaltung
Die pH-Abhängigkeit der enzymkatalysierten Esterspaltung wurde analog zu Beispiel 6 durchgeführt. Die Rohlysate des Stammes NJ70 (der die funktionale Mutante NJ70, d.h. SEQ ID NO:4 exprimiert) wurden wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt und eine 1000 Einheiten entsprechende Menge zu Substratlösungen gegeben, die auf verschiedene pH- Werte im Bereich von 5 bis 1 1 eingestellt waren. Zur Erfassung einer möglichen chemischen Autohydrolyse bei höheren pH-Werten (im Bereich von etwa pH - 9.0 - pH 1 1 .0) wurden die Rohlysate erst nach 10 min zugegeben, wobei in keinem Fall vor der Zugabe ein nennenswerter pH-Korrekturmittelverbrauch (NaOH) zu verzeichnen war. Aus den in Fig. 8 gezeigten Ergebnissen ist zu ersehen, dass im Bereich von pH 5 bis pH 11 eine Esterspaltung erfolgte.
Beispiel 9: Temperaturabhängigkeit der enzvmkatalvsierten Esterspaltung
Die Temperaturabhängigkeit der enzymkatalysierten Esterspaltung wurde analog Beispiel 6 bei konstantem pH-Wert 9 durchgeführt. Wie in Beispiel 4 beschrieben, wurden Rohlysate des Stammes NJ70 hergestellt, und in einer jeweils 1000 Einheiten entsprechenden Menge zu Substratlösungen gegeben und bei den verschiedenen Temperaturen im Bereich von 100C bis 500C autotitriert. Als Kontrolle für die chemische Autohydrolyse wurde Substratlösung mit einem pH von 9 für 10 min bei der angegebenen Temperatur inkubiert. Bei ausbleibender pH-Änderung (kein Verbrauch an pH-Korrekturmittel) wurde auf fehlende Autohydrolyse geschlossen. Aus den in Fig. 9 gezeigten Daten ist zu ersehen, dass ein Tempe- raturoptimum im Bereich von 200C bis 400C lag, insbesondere bei 300C.
Beispiel 10: Enzymatische Aktivität immobilisierter Esterase
35 ml eines Mastermixes (340 ml_ 0,9% NaCI-Lösung, 220 ml_ Toluol und 70 ml_ Tergitol (10% in H2O)), der 2 ml PBA-Lösung enthielt (Sigma Aldrich , Mw 99 000, 25-30 Gew.-% in Toluol) (entsprechend 4,66 mmol monomere Estergruppen), wurden auf einen pH-Wert von 9 eingestellt und bei einer Temperatur von 37°C gehalten. 3,6 ml EstB_NJ70 enthaltendes Rohlysat wurden mit 0,5 g Eupergit C250L (Aldrich) und 30 ml 0,5 M K2HPO4-Puffer (pH 9,5) 48 h bei Raumtemperatur rotiert. Anschließend wurde die Suspension abgesaugt und das Matrixmaterial mit 0,1 M Tris-Puffer (pH 7,0) gewaschen. Anschließend wurde eine Eine Proteinbestimmung nach Bradford ergab, dass 86% des Proteins an den Träger gebunden hatten. Jeweils zu 35 ml des oben genannten Reaktionsansatzes wurden 50 Einheiten EstB_NJ70, eine 50 Einheiten auf Eupergit immobilisierte EstB_NJ70, 50 Einheiten auf Eupergit immobilisierte und denaturierte EstB_NJ70 bzw. die entsprechende Menge Eupergit ohne immobilisiertes Enzym zugegeben. Die Kompensation des pH-Werts erfolgte durch Zugabe von 10 mM NaOH. Wie in Fig. 10 gezeigt war bei Zugabe der beiden Kontrollen (Eupergit ohne EstB_ NJ70 bzw. mit denaturiertem EstB_NJ70) eine geringfügige Freisetzung von Säuregruppen zu verzeichnen. Die Zugabe von EstB_NJ70 bzw. immobilisierter EstB_ NJ70 führte dagegen zu einer deutlich höheren Freisetzung von Säuregruppen, wobei der Reaktionsverlauf bei EstB_NJ70 einer Sättigungskurve mit vergleichsweise hoher anfänglicher Reaktionsgeschwindigkeit und späterer Verlangsamung entsprach, während der Reaktionsverslauf bei immobilisierter EstB_ NJ70 mit anfänglich geringerer Geschwindigkeit erfolgte, dafür aber während des Messzeitraums konstant blieb.
Beispiel 11 : Esterspaltung bei kurzkettigen und langkettigen Substraten
Jeweils 35 ml des in Beispiel 10 angegebenen Reaktionsansatzes wurden auf eine pH-Wert von 9,0 und eine Temperatur von 37°C eingestellt. Anschließend wurden jeweils 350 Einheiten der in den Figur 1 1 angegebenen Esterasen sowie entweder kurzkettiges PMA (Sigma Aldrich) mit einem Molekulargewicht von 30.000 (PMAkurz in Fig. 1 1 ) oder langkettiges PMA (PMAkurz in Fig.11 ) mit einem Molekulargewicht von 40000 zugegeben, was in beiden Fällen 1 ,75 mmol monomerer Estergruppen entsprach, und die Reaktion entweder bis zur Einstellung eines Gleichgewichts (Fig. 6) oder über den angegebenen Zeitraum (Fig. 1 1 ) durchgeführt. Die Kompensation des durch die Esterspaltung absinkenden pH-Wertes er- folgte durch Zugabe von 10 mM NaOH, wobei bei Fig.11 aus dem Verbrauch an NaOH der prozentuale Anteil der hydrolysierten Estergruppen berechnet wurde. Aus Fig. 1 1 ist zu ersehen, dass sowohl kurzkettiges als auch langkettiges PMA enzymatisch gespalten wird. Im Falle denaturierter Enzyme (NJ70_den in Fig. 1 1 ) ist die Änderung im Korrekturmittelverbrauch (NaOH) auf die Zugabe der jeweiligen Komponente zum Reaktionsansatz zu er- klären, da dieser keine Pufferkapazität aufweist, so dass sich bereits kleinste Menge von Lösungen mit abweichendem pH-Wert auf den Gesamt-pH-Wert auswirken. Auf die Offenbarung der in vorliegender Beschreibung zitierten Druckschriften wird ausdrücklich Bezug genommen.
Übersicht über die verwendeten SEQ ID NOs und Stammbezeichnungen
SEQ ID NO:1
Proteinsequenz (Wildtyp) von EstB aus Burkholderia gladioli
SEQ ID NO:2
Proteinsequenz (Wildtyp) von Este aus Burkholderia gladioli
SEQ ID NO:3
Mutierte Proteinsequenz (interne Bezeichnung: N27; EstB_N27), bei der gegenüber dem Wildtyp EstB (SEQ ID NO:1 ) folgende Aminosäureaustausche vorgenommen wurden: Ser17Leu; Gly132Ser; Glu251 Gly; Ala31 1Val; Glu316Lys
SEQ ID NO:4
Mutierte Proteinsequenz (interne Bezeichnung: NJ70; NJ_70; EstB_NJ70), bei der gegen- über dem Wildtyp EstB (SEQ ID NO:1 ) folgende Aminosäureaustausche vorgenommen wurden: ProδLeu; Gly132Ser; Trp134Arg; Arg155Cys; Glu251 Gly; Ala311Val; Glu316Lys
SEQ ID NO:5 Cutinase aus Humicola insolens
SEQ ID NO:6
Lipase B aus Candida antarctica
SEQ ID NO:7
Esterase aus Burkholderia ambifaria (interne Bezeichnung: A0TF86_9BURK@1 )
SEQ ID NO:8
Esterase aus Burkholderia cenocepacia (interne Bezeichnung: Q1 BK05_BURCA@1 )
SEQ ID NO:9
Esterase aus Burkholderia cenocepacia (interne Bezeichnung: A2W245_9BURK@1 )
SEQ ID NO:10 Esterase aus Burkholderia cenocepacia (interne Bezeichnung: A0U6R7_9BURK@1)
SEQ ID N0:11
Esterase aus Burkholderia cenocepacia (interne Bezeichnung: A0B440_BURCH@1)
SEQ ID N0:12
Esterase aus Burkholderia cepacia (interne Bezeichnung: Q0B5R9_BURCM@1)
SEQ ID N0:13 Esterase aus Burkholderia dolosa (interne Bezeichnung: A2WH69_9BURK@1 )
SEQ ID N0:14
Esterase aus Burkholderia mallei (interne Bezeichnung: ZP_00928253@1)
SEQ ID N0:15
Esterase aus Burkholderia mallei (interne Bezeichnung: Q629M1_BURMA@1)
SEQ ID N0:16
Esterase aus Burkholderia mallei (interne Bezeichnung: A5XMR0_BURMA@1)
SEQ ID N0:17
Esterase aus Burkholderia mallei (interne Bezeichnung: A3MH33_BURM7@1)
SEQ ID N0:18 Esterase aus Burkholderia mallei (interne Bezeichnung: A1 UXM8_BURMS@1 )
SEQ ID N0:19
Esterase aus Burgholderia multivorans (interne Bezeichnung: A0UE35_9BURK@1)
SEQ ID NO:20
Esterase aus Burkholderia pseudomallei (interne Bezeichnung: ZP_0131527@1)
SEQ ID N0:21
Esterase aus Burkholderia pseudomallei (interne Bezeichnung: ZP_01209854@1)
SEQ ID NO:22
Esterase aus Burkholderia pseudomallei (interne Bezeichnung: ZP_00893464@1)
SEQ ID NO:23 Esterase aus Burkholderia pseudomallei (interne Bezeichnung: Q3JIF4_BURP1 @1 )
SEQ ID NO:24
Esterase aus Burkholderia pseudomallei (interne Bezeichnung: A4LP64_BURPS@1 )
SEQ ID NO:25
Esterase aus Burkholderia pseudomallei (interne Bezeichnung: A3PA33_BURP0@1 )
SEQ ID NO:26 Esterase aus Burkholderia pseudomallei (interne Bezeichnung: A3NPJ8_BURP6@1 )
SEQ ID NO:27
Esterase aus Burkholderia sp. (interne Bezeichnung: Q39BM9_BURS3@1 )
SEQ ID NO:28
Esterase aus Burkholderia thailandensis (interne Bezeichnung: Q2T2Q0_BURTA@1 )
SEQ ID NO:29
Esterase aus Burkholderia vietnamensis (interne Bezeichnung: A4JKI4_BURVG@1 )
SEQ ID NO:30
Esterase aus Mycobacterium smegmatis (interne Bezeichnung: A0R6Y0_MYCS2@1 )
SEQ ID N0:31 Esterase aus Saccharopolyspora erythraea (interne Bezeichnung: A4FPB3_SACEN@1 )
SEQ ID NO:32
Esterase aus Saccharopolyspora erythraea (interne Bezeichnung: A4FDC0_SACEN@1 )
SEQ ID NO:33
Esterase aus Saccharopolyspora erythraea (interne Bezeichnung: A4F6M6_SACEN@1 )
SEQ ID NO:34
Esterase aus Stigmatella aurantiaca (interne Bezeichnung: Q096X7_STIAU@1 )
SEQ ID NO:35
Esterase aus Streptomyces ambofaciens (interne Bezeichnung: A3KIK7_STRAM@1 ) SEQ ID NO:36
Esterase aus Streptomyces coelicolor (interne Bezeichnung: NP_630279@1 )
SEQ ID NO:37 als EstB_Short4 (oder EstB_N27_Short4) bezeichnete Deletionsmutante von EstB_N27, bei der die Aminosäuren 317-319 (RGP) von SEQ ID NO:3 (EstB_N27) entfernt wurden
SEQ ID NO:38 als EstB_Short5 (oder EstB_N27_Short5) bezeichnete Deletionsmutante von EstB_N27, bei der die Aminosäuren 248-255 (PLPGGHGA) von SEQ ID NO:3 (EstB_N27) durch die kürzere Sequenz SLGTT ersetzt wurden
SEQ ID NO:39 bis SEQ ID NO:49: PCR-Primer gemäß Beispiel 2
SEQ ID NO:50
Nukleinsäuresequenz von EstB (gemäß SEQ ID NO:1 )
SEQ ID NO:51
Nukleinsäuresequenz von EstC (gemäß SEQ ID NO:2)
SEQ ID NO:52
Nukleinsäuresequenz von Cutinase (gemäß SEQ ID NO:5)
SEQ ID NO:53
Nukleinsäuresequenz von Lipase B (gemäß SEQ ID NO:6)
SEQ ID NO:54 Nukleinsäuresequenz für EstB_N27 (gemäß SEQ ID NO:3) SEQ ID NO:55 Nukleinsäuresequenz für EstB_NJ70 (gemäß SEQ ID NO:4)
SEQ ID NO:56 Nukleinsäuresquenz für EstB_N27_Short 4 (gemäß SEQ ID NO:37)
SEQ ID NO:57 Nukleinsäuresequenz für EstB_N27_Short 5 (gemäß SEQ ID NO:38)
SEQ ID NO:58
Hydroxynitril-Lyase aus Hevea brasiliensis (GenBank-Nr. AAC49184)
SEQ ID NO:59
Hydroxynitril-Lyase aus Manihot esculenta (SwissProt-Nr. P52705)

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur enzymkatalysierten Hydrolyse von Polyacrylsäureestern, wobei man a) wenigstens einen Polyacrylsäureester bereitstellt, b) den wenigstens einen Polyacrylsäureester zur hydrolytischen Spaltung von in dem
Polyacrylsäureester enthaltenen Estergruppen mit wenigstens einem Enzym inkubiert, das ausgewählt ist unter auf Esterbindungen einwirkenden Enzymen (EC 3.1 ); und gegebenenfalls c) das modifizierte Polymer isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das Enzym ausgewählt ist unter Carbonsäu- reesterhydrolasen (EC 3.1.1 ), insbesondere unter Carboxylesterasen (E. C. 3.1.1.1 ), Tri- acylglycerinlipasen (EC. 3.1.1.3) und Cutinasen (3.1.1.74).
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Polyacrylsäureester ein Homo- oder Co- polymer ist.
4: Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Polyacrylsäureester ein alternierendes Copolymer, ein statistisches Copolymer, ein Gradientencopolymer, ein Blockcopolymer oder ein Pfropfcopolymer ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polymer Monomer- Bausteine der allgemeinen Formel I
R1R2C=CR3-COOR4 (I) umfasst, worin
R1, R2 und R3 gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind unter H, einem gerad- kettigen C1-C20 Hydrocarbylrest und einem verzweigten C3-C2O Hydrocarbylrest, und R4 ausgewählt ist unter H, einem geradkettigen C1-C20 Hydrocarbylrest, einem verzweig- ten C3-C20 Hydrocarbylrest und einem cyclischen C3-C20 Hydrocarbylrest, wobei der
Hydrocarbylrest gegebenenfalls substituiert ist durch eine oder mehrere gleiche oder verschiedene Gruppen, die ausgewählt sind unter Hydroxy-, Amino-, Epoxid-, Thiolgrup- pen und Halogenatomen, wobei im Polymer in wenigstens einem Monomerbaustein der Formel I R4 nicht für H steht.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Polyacrylsäureester zusätzlich zu den Monomeren der Formel I wenigstens eine weitere davon verschiedene Monomerkomponente in einem molaren Anteil von 0 bis 15 Mol-% enthält, welche vor- zugsweise ausgewählt ist unter N-Vinylformamid, Methacrylsäure, Methacrylsäureester, Itaconsäure, Itaconsäureester, Vinylphosphonsäure, Vinylsulfonsäure, Vinylalkohol, N- Vinylimidazol, N-Vinylformamid, Styrol, Maleinsäure, Maleinsäureester, Ethylen und/oder Propylen, und Acrylamid und substituierten Acrylamiden, wobei der Substituent ausge- wählt ist unter einem geradkettigen C1-C20 Hydrocarbylrest, einem verzweigten C3-C20
Hydrocarbylrest und einem cyclischen C3-C2O Hydrocarbylrest, wobei der Hydrocarbylrest gegebenenfalls substituiert ist durch eine oder mehrere gleiche oder verschiedene Gruppen, die ausgewählt sind unter Hydroxy-, Amino-, Epoxid, Thiolgruppen und Halogenatomen.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym ausgewählt ist unter einer Esterase der Familie VIII, einer Typ C Esterase, einer Cutinase gemäß SEQ ID NO:5 oder einer davon abgeleiteten Cutinase, und einer Triacylglycerinlipase gemäß SEQ ID NO:6 oder einer davon abgeleiteten Triacylglycerin- lipase.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym ausgewählt ist unter einem Protein gemäß SEQ ID NO:1 (Esterase B von Burkholderia gladioli), SEQ ID NO:2 (Esterase C von Burkholderia gladioli) oder davon abgeleiteten funktionalen Mutanten.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Mutante einer Esterase gemäß SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 mit gegenüber SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:2 vergleichbarer oder gesteigerter Aktivität hinsichtlich der Hydrolyse von Polyacrylsäureestern, und/oder eine Mutante einer Esterase gemäß SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 mit gegenüber SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:2 erhöhter Stabilität ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 und 9, wobei die Mutante im Vergleich mit einer Esterase gemäß SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 eine gesteigerte Hydrolyse-Aktivität gegenüber Polyacrylsäuremethylester und/oder Polyacrylsäurebutylester zeigt.
1 1. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass
(a) die Mutante einer Esterase gemäß SEQ ID NO:1 wenigstens eine Mutation in ei- nem oder mehreren der Aminosäurereste Ser17, Gly132, Trp134, Arg155,
Glu251 , Ala31 1 und Glu316 aufweist; oder
(b) die Mutante einer Esterase gemäß SEQ ID NO:2 wenigstens eine Mutation in einem oder mehreren der Aminosäurereste Phe138, Val150, Leu160, Thr188 und Leu 193 aufweist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Mutante von SEQ ID NO:1 abgeleitet ist und
(a) wenigstens eine der Mutationen Ser17Leu, Gly132Ser, Glu251 Gly, Ala31 1Val und Glu316Lys umfasst; und/oder
(b) wenigstens eine der Mutationen ProδLeu, Gly132Ser, Trp134Arg, Arg155Cys, Glu251 Gly, Ala31 1Val und Glu316Lys umfasst.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Mut- ante von SEQ ID NO:2 abgeleitet ist und eine der nachfolgenden Mutationen oder Kombinationen von Mutationen umfasst:
(a) Phe138Ala (b) Phe138Ala, Thr188Ser (c) Phe138Ala, Leu160Ala, Thr188Ser (d) Leu 193AIa
(e) Leu193Ala, Phe138Ala, Thr188Ser, Val150Ala
(f) Leu 193AIa, Phe138Ala, Thr188Ser
(g) Leu193Ala, Phe138Ala, Thr188Ser, Leu160Ala, Val150Ala (h) VaH 50AIa (i) VaM 50AIa, Thr188Ser
(j) Leu193Ala, Phe138Val
(k) Leu193Ala, Phe138Val, Thr188Ser, VaH 50AIa
(l) Leu193Ala, Thr188Ser
(m) Leu193Ala, Phe138Val, Thr188Ser (n) Leu193Ala, Phe138Val, Thr188Ser, Leu160Ala
(o) Phe138Val, VaM 50AIa, Thr188Ser
(p) Phe138Val
(q) Phe138Val, Thr188Ser
14. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutante eine Deletions- mutante einer Esterase der Familie VIII oder einer Typ C Esterase ist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Deletionsmutante wenigstens eine Loop-Kürzung aufweist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Deletionsmutante eine unter SEQ ID NO:37 und SEQ ID NO:38 ausgewählte Aminosäuresequenz aufweist.
17. Funktionale Esterase-Mutante gemäß der Definition in einem der Ansprüche 8 bis 16.
18. Nukleinsäure, die a) für eine für eine Esterase-Mutante gemäß Anspruch 17 kodiert, oder b) eine zu a) komplementäre Nukleinsäure darstellt, oder c) mit einer Nukleinsäure gemäß a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, insbesondere eine Sequenzidentität von wenigstens 80% aufweist und für eine Mutante einer Esterase der Familie VIII oder für eine Typ C Esterase-Mutante kodiert, welche Polyacrylsäureester hydrolysiert.
19. Vektor, umfassend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 18.
20. Vektor gemäß Anspruch 19, wobei die Nukleinsäure operativ mit einem Promotor verknüpft ist.
21. Mikroorganismus, umfassend wenigstens einen Vektor gemäß Anspruch 19 oder 20.
22. Verfahren zur Herstellung einer Esterase gemäß Anspruch 17, wobei man a) einen zur Expression der Esterase befähigten Wirtsorganismus gemäß Anspruch 21 kultiviert b) gegebenenfalls die Expression der Esterase induziert, und c) gegebenenfalls die Esterase aus dem Wirtsorganismus und/oder dem Kulturmedium isoliert.
23. Verwendung einer Esterase gemäß der Definition in einem der Ansprüche 7 bis 17, ei- nes Vektors gemäß Anspruch 19 oder 20, oder eines Mikroorganismus gemäß Anspruch
21 zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
24. Polymeres Reaktionsprodukt, erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16.
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