EP2255000A1 - Hydrazinmodifizierte matrices, ihre verwendung in verfahren zur isolierung von biomolekülen - Google Patents
Hydrazinmodifizierte matrices, ihre verwendung in verfahren zur isolierung von biomolekülenInfo
- Publication number
- EP2255000A1 EP2255000A1 EP09711574A EP09711574A EP2255000A1 EP 2255000 A1 EP2255000 A1 EP 2255000A1 EP 09711574 A EP09711574 A EP 09711574A EP 09711574 A EP09711574 A EP 09711574A EP 2255000 A1 EP2255000 A1 EP 2255000A1
- Authority
- EP
- European Patent Office
- Prior art keywords
- matrix
- hydrazine
- matrix according
- groups
- optionally
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 74
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 73
- -1 cycloalkyl radical Chemical class 0.000 claims description 72
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 70
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 70
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 70
- 150000002429 hydrazines Chemical class 0.000 claims description 46
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical group O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 30
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 24
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 16
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 15
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 14
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 13
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 12
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 11
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 claims description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 11
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 10
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 9
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 claims description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 7
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 claims description 6
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims description 6
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 6
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims description 6
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 150000002367 halogens Chemical group 0.000 claims description 6
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 claims description 6
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 claims description 5
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims description 5
- 150000002734 metacrylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 4
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 claims description 4
- UWFRVQVNYNPBEF-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4-dimethylphenyl)propan-1-one Chemical compound CCC(=O)C1=CC=C(C)C=C1C UWFRVQVNYNPBEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- IVIDDMGBRCPGLJ-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(oxiran-2-ylmethoxy)propan-1-ol Chemical compound C1OC1COC(CO)COCC1CO1 IVIDDMGBRCPGLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DBCAQXHNJOFNGC-UHFFFAOYSA-N 4-bromo-1,1,1-trifluorobutane Chemical compound FC(F)(F)CCCBr DBCAQXHNJOFNGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 3
- ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N Dialdehyde 11678 Chemical group N1C2=CC=CC=C2C2=C1[C@H](C[C@H](/C(=C/O)C(=O)OC)[C@@H](C=C)C=O)NCC2 ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N 0.000 claims description 3
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 claims description 3
- 229920001744 Polyaldehyde Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 3
- 150000001252 acrylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 3
- STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol dimethacrylate Substances CC(=C)C(=O)OCCOC(=O)C(C)=C STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 3
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 claims description 2
- 150000003440 styrenes Chemical class 0.000 claims description 2
- PAPLYSKFIALNSM-UHFFFAOYSA-N 2-[1,3-bis(oxiran-2-ylmethoxy)propan-2-yloxymethyl]oxirane;ethane-1,2-diol Chemical compound OCCO.C1OC1COCC(OCC1OC1)COCC1CO1 PAPLYSKFIALNSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 13
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 11
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 10
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 10
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 9
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 9
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 8
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 7
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000005293 ferrimagnetic effect Effects 0.000 description 4
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 4
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N Pyrrolidine Chemical compound C1CCNC1 RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 3
- 125000001316 cycloalkyl alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000001188 haloalkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N (2s)-2,6-diaminohexanoic acid;(2s)-2-hydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 2
- ARGCQEVBJHPOGB-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydrofuran Chemical compound C1OCC=C1 ARGCQEVBJHPOGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SYEWHONLFGZGLK-UHFFFAOYSA-N 2-[1,3-bis(oxiran-2-ylmethoxy)propan-2-yloxymethyl]oxirane Chemical group C1OC1COCC(OCC1OC1)COCC1CO1 SYEWHONLFGZGLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001494 2-propynyl group Chemical group [H]C#CC([H])([H])* 0.000 description 2
- PGLFPEYYIQQJOP-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O.NCCCCCC(O)=O PGLFPEYYIQQJOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 229910001566 austenite Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 150000002118 epoxides Chemical group 0.000 description 2
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- 230000005294 ferromagnetic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N hydrazine monohydrate Substances O.NN IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 2
- 229920000592 inorganic polymer Polymers 0.000 description 2
- VBMVTYDPPZVILR-UHFFFAOYSA-N iron(2+);oxygen(2-) Chemical group [O-2].[Fe+2] VBMVTYDPPZVILR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 125000002950 monocyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 229910000859 α-Fe Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000006728 (C1-C6) alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- CWLGEPSKQDNHIO-JOBJLJCHSA-N (e)-n-[(e)-benzylideneamino]-1-phenylmethanimine Chemical compound C=1C=CC=CC=1/C=N/N=C/C1=CC=CC=C1 CWLGEPSKQDNHIO-JOBJLJCHSA-N 0.000 description 1
- 125000006079 1,1,2-trimethyl-2-propenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006059 1,1-dimethyl-2-butenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006033 1,1-dimethyl-2-propenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006060 1,1-dimethyl-3-butenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005919 1,2,2-trimethylpropyl group Chemical group 0.000 description 1
- DIIIISSCIXVANO-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dimethylhydrazine Chemical class CNNC DIIIISSCIXVANO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006062 1,2-dimethyl-2-butenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006035 1,2-dimethyl-2-propenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006063 1,2-dimethyl-3-butenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005918 1,2-dimethylbutyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006065 1,3-dimethyl-2-butenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006066 1,3-dimethyl-3-butenyl group Chemical group 0.000 description 1
- ABADUMLIAZCWJD-UHFFFAOYSA-N 1,3-dioxole Chemical compound C1OC=CO1 ABADUMLIAZCWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006080 1-ethyl-1-methyl-2-propenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006074 1-ethyl-2-butenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006082 1-ethyl-2-methyl-2-propenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006037 1-ethyl-2-propenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006075 1-ethyl-3-butenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006218 1-ethylbutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000006028 1-methyl-2-butenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006048 1-methyl-2-pentenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006021 1-methyl-2-propenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006030 1-methyl-3-butenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006052 1-methyl-3-pentenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006055 1-methyl-4-pentenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006067 2,2-dimethyl-3-butenyl group Chemical group 0.000 description 1
- XBNGYFFABRKICK-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5,6-pentafluorophenol Chemical compound OC1=C(F)C(F)=C(F)C(F)=C1F XBNGYFFABRKICK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006069 2,3-dimethyl-2-butenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006070 2,3-dimethyl-3-butenyl group Chemical group 0.000 description 1
- IEJPPSMHUUQABK-UHFFFAOYSA-N 2,4-diphenyl-4h-1,3-oxazol-5-one Chemical compound O=C1OC(C=2C=CC=CC=2)=NC1C1=CC=CC=C1 IEJPPSMHUUQABK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004974 2-butenyl group Chemical group C(C=CC)* 0.000 description 1
- 125000000069 2-butynyl group Chemical group [H]C([H])([H])C#CC([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000006077 2-ethyl-2-butenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006078 2-ethyl-3-butenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006176 2-ethylbutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(C([H])([H])*)C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000006040 2-hexenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006029 2-methyl-2-butenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006049 2-methyl-2-pentenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006022 2-methyl-2-propenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006031 2-methyl-3-butenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006053 2-methyl-3-pentenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004493 2-methylbut-1-yl group Chemical group CC(C*)CC 0.000 description 1
- 125000005916 2-methylpentyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006024 2-pentenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- ZAISDHPZTZIFQF-UHFFFAOYSA-N 2h-1,4-thiazine Chemical compound C1SC=CN=C1 ZAISDHPZTZIFQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004975 3-butenyl group Chemical group C(CC=C)* 0.000 description 1
- 125000000474 3-butynyl group Chemical group [H]C#CC([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000006041 3-hexenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006050 3-methyl-2-pentenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006032 3-methyl-3-butenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006054 3-methyl-3-pentenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006057 3-methyl-4-pentenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003542 3-methylbutan-2-yl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005917 3-methylpentyl group Chemical group 0.000 description 1
- JVQIKJMSUIMUDI-UHFFFAOYSA-N 3-pyrroline Chemical compound C1NCC=C1 JVQIKJMSUIMUDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006042 4-hexenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006051 4-methyl-2-pentenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003119 4-methyl-3-pentenyl group Chemical group [H]\C(=C(/C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000006058 4-methyl-4-pentenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006043 5-hexenyl group Chemical group 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004442 acylamino group Chemical class 0.000 description 1
- 125000004423 acyloxy group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 description 1
- 150000008051 alkyl sulfates Chemical class 0.000 description 1
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 150000001480 arabinoses Chemical class 0.000 description 1
- 125000001204 arachidyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960001701 chloroform Drugs 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000582 cycloheptyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000640 cyclooctyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 1
- 125000002704 decyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfate Chemical compound COS(=O)(=O)OC VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 150000002232 fructoses Chemical class 0.000 description 1
- 125000002541 furyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002256 galaktoses Chemical class 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 150000002304 glucoses Chemical class 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O guanidinium Chemical compound NC(N)=[NH2+] ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000003187 heptyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000004404 heteroalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- LFKYBJLFJOOKAE-UHFFFAOYSA-N imidazol-2-ylidenemethanone Chemical class O=C=C1N=CC=N1 LFKYBJLFJOOKAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004491 isohexyl group Chemical group C(CCC(C)C)* 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 150000002704 mannoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001971 neopentyl group Chemical group [H]C([*])([H])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 239000004745 nonwoven fabric Substances 0.000 description 1
- 125000001400 nonyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- OXUZCBDDXOMZAM-UHFFFAOYSA-N oxathiepane Chemical compound C1CCOSCC1 OXUZCBDDXOMZAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OOFGXDQWDNJDIS-UHFFFAOYSA-N oxathiolane Chemical compound C1COSC1 OOFGXDQWDNJDIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000913 palmityl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- IZUPBVBPLAPZRR-UHFFFAOYSA-N pentachloro-phenol Natural products OC1=C(Cl)C(Cl)=C(Cl)C(Cl)=C1Cl IZUPBVBPLAPZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003538 pentan-3-yl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000001844 prenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003373 pyrazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002098 pyridazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 150000003291 riboses Chemical class 0.000 description 1
- 125000006413 ring segment Chemical group 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003548 sec-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009834 selective interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 150000003400 sorboses Chemical class 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920001897 terpolymer Polymers 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001973 tert-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RAOIDOHSFRTOEL-UHFFFAOYSA-N tetrahydrothiophene Chemical compound C1CCSC1 RAOIDOHSFRTOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002948 undecyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 125000005500 uronium group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000003742 xyloses Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
Definitions
- European Patent Application EP-A-0 389 063 relates to a method for isolating nucleic acids from a biological source.
- the nucleic acid-containing biological sources such as blood, cells, plasma, etc. are digested in high concentrations in the presence of chaotropic salts.
- the nucleic acids are bound to a silica surface.
- the nucleic acids are then washed and eluted.
- the present invention relates to matrices having a support surface having a porous polymethacrylate homopolymer or copolymer.
- the present invention relates to matrices with a spacer which has a single bond or double bond, an alkylene bridge containing 1 to 12 carbon atoms, optionally by one or more oxygen and / or sulfur atoms and / or amino groups and optionally by a or more carbonyl or carboxyl groups may be interrupted.
- the present invention relates to matrices with a spacer whose alkylene bridge comprises ethylene glycol diglycidyl ether, glycerol diglycidyl ether, glycerol triglycidyl ether, ethylene glycol, polyethylene glycol, propylene glycol and / or their substituted derivatives.
- the present invention relates to matrices having a hydrazine partial structure in which Ri, R 2 are independently hydrogen and R 3 is another covalent bond or hydrogen.
- the present invention relates to processes for preparing the matrices according to the invention in which a linker is produced on the carrier material or on the carrier material surface, which is reacted, if appropriate, with a spacer or directly with hydrazine or a hydrazine derivative.
- the present invention relates to the use of the matrices according to the invention in microfluidic systems or microfluidic systems which contain the matrix according to the invention.
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige, funktionalisierte Matrices bzw. Matrixmaterialien, die Strukturen der allgemeinen Formel (I) : Träger - Linker - Spacer - NR3 - NR1R2 aufweisen, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung zur Isolierung von Biomolekülen.
Description
HYDRAZINMODIFIZIERTE MATRICES IHRE VERWENDUNG IN VERFAHREN ZUR ISOLIERUNG VON BIOMOLEKÜLEN
Die vorliegende Erfindung betrifft funktionalisierte Matrices und Matrixmaterialien, die Strukturen der allgemeinen Formel I aufweisen
Träger Linker Spacer NR3 NRiR2 (I),
Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung zur Isolierung von Biomolekülen.
Unter Biomolekülen werden gemäß der vorliegenden Erfindung ganz allgemein Moleküle verstanden, die als Produkte einer evolutionären Selektion durch geordnetes und selektives Zusammenwirken spezifische Aufgaben für einen Organismus erfüllen und die Grundlage seiner Lebensfunktionen ausmachen [vgl. Römpp, Lexikon Biochemie und Molekularbiologie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1999].
Insbesondere werden im Sinne der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren, wie z.B. Plasmid-DNA, chromosomale DNA, Gesamt-RNA, mRNA oder RNA/DNA Hybride als Biomoleküle angesehen.
Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft die Reinigung bzw. Isolierung dieser Biomoleküle aus wässrigen Systemen, die z.B. Verunreinigungen wie Fette oder Zelltrümmer enthalten.
Daneben betrifft die vorliegende Erfindung die Isolierung oder Reinigung von ggf. artifiziellen Biomolekülen aus Reaktionsmischungen, die aus Labor- oder Industriesynthetischen Umsetzungen resultieren.
Die Erfindung betrifft insbesondere Matrices, die die Fähigkeit aufweisen, Nukleinsäuren bei einem pH-Wert in einem ersten Intervall zu immobilisieren und bei einem pH-Wert in einem zweiten Intervall, der sich von dem ersten pH-Wert bzw. pH-
Intervall unterscheidet, wieder freizusetzen. Die Erfindung betrifft daneben Verfahren zu ihrer Herstellung deren Verwendung zum Aufreinigen bzw. Isolieren der gewünschten Nukleinsäure(n).
Der enorme wissenschaftliche Fortschritt auf dem Gebiet der molekularen Biologie - u.a. auf dem Gebiet der Gentechnologie und der molekularen Diagnostik - hat einen hohen Bedarf an schnellen, sicheren und automatisierbaren Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren geweckt.
Dabei können die biologischen Proben, die u.a. zur DNA-Identifikation oder -Analyse eingesetzt werden, aus einer Vielzahl von Quellen stammen, wie z.B. Tier- und Pflanzenzellen, Faeces, Gewebe- und Knochenproben (Biopsien) oder Blut stammen. Daneben können die Proben aber auch aus dem Boden, aus Nahrungsmitteln oder aus synthetisch hergestellten Nukleinsäuremischungen gezogen werden.
Viele molekularbiologische Verfahren, wie die reverse Transskription, Klonierung Restriktionsanalyse, Amplifikation sowie Sequenzierung erfordern zwingend, dass die in den jeweiligen Verfahren eingesetzten Nukleinsäuren im Wesentlichen frei von Verunreinigungen sind, die die entsprechenden Reaktionsabläufe bzw. Analyseverfahren negativ beeinflussen könnten. Derartige Verunreinigungen umfassen im Allgemeinen Substanzen, die den Abbau oder die Depolymerisation einer Nukleinsäure katalysieren oder initiieren, oder Substanzen, die den Nachweis der Nukleinsäure blockieren oder die Nukleinsäure maskieren. Unerwünschte Verunreinigungen umfassen daneben makromolekulare Substanzen, wie z.B. Enzyme, Proteine, Polysaccharide oder Polynukleotide sowie Substanzen mit einem niedrigem Molekulargewicht, wie Lipide, Enzyminhibitoren oder Oligonukleotide.
Weitere Verunreinigungen sind Farbstoffe (Pigmente), Spurenelemente (Metalle) oder organische Lösungsmittel.
Diese Anforderungen haben dazu geführt, dass sich im Laufe der Jahre im Stand der Technik bereits eine Vielzahl von Aufreinigungs- und Isolierungsverfahren etabliert hat. So kann z.B. DNA durch Aussalzen in Gegenwart von Phenol und
Trichlormethan gewonnen werden. Auf der anderen Seite können DNA und RNA durch den Einsatz chaotroper Salze an mineralischen Trägern (wie z.B. Silica) oder - derivatisierten - Kieselsäureharzen gewonnen werden. Dabei hat sich hinsichtlich der Verwendung in automatisierten Verfahren insbesondere der Einsatz von magnetischen Partikeln - den sog. 'Magnetic Beads' - etabliert.
Zunächst erkannten Marko et al. [Analyt. Biochem. 121 (1982) 382] sowie Vogelstein et al. [Proc. Nat. Acad. Sei. 76 (1979) 615], dass, falls die DNA in Nukleinsäure- enthaltenden Extrakten hohen Konzentrationen von Natriumiodid oder Natriumperchlorat ausgesetzt wird, nur die DNA an den mechanisch fein zerkleinerten Glass-Scintillationsröhrchen sowie zerkleinerten Glasfasermembranen bzw. Glasfiberplatten bindet, während RNA und Proteine nicht binden. Die so gebundene DNA kann im einfachsten Fall mit Wasser eluiert werden. In der Folgezeit wurden demgemäß zahlreiche Schutzrechte, die auf dieser Art der DNA-Isolierung basieren, offengelegt.
So betrifft die Europäische Offenlegungsschrift EP-A-O 389 063 ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologischen Quelle. Gemäß dieser Methode werden die Nukleinsäuren-enthaltenden biologischen Quellen, wie Blut, Zellen, Plasma etc. in Gegenwart von chaotropen Salzen in hohen Konzentrationen aufgeschlossen. Anschließend werden die Nukleinsäuren an eine Silicaoberfläche gebunden. Die Nukleinsäuren werden danach gewaschen und eluiert.
Das in der U. S. -Patentschrift US-A-5,155,018 offenbarte Verfahren beschreibt die Isolierung von RNA aus biologischen Quellen, die neben RNA auch DNA sowie andere Inhaltsstoffe enthalten. Dabei wird die biologische Probe angesäuert und mit einem chaotropen Agens, wie z. B. einem Guanidiniumsalz vermischt. Der Probe werden Silikatpartikel zugegeben. Unter den gegebenen Bedingungen bindet RNA an die Silikatpartikel.
Anschließend wird auch in diesem Verfahren die RNA von den Partikeln abgetrennt.
Colpan et al. beschreiben in der Internationalen Patentanmeldung WO-A-95/01359 ein Verfahren zur Reinigung und Trennung von Nukleinsäuregemischen durch Adsorption der Nukleinsäure aus einer alkoholhaltigen Lösung mit hoher lonenstärke.
Die Adsorptionslösung enthält neben Alkohol in einer Konzentration von 1 bis 50 Vol.-% Salze in einer Konzentration von 1 bis 10 M, wobei chaotrope Salze, wie z. B. Guanidiniumthiocyanat, Natriumperchlorat, oder Guanidiniumhydrochlorid bevorzugt werden.
Gegenstand der WO-A-95/21849 ist des Weiteren ein Verfahren zur Trennung von doppel- und oder einzelsträngigen Nukleinsäuren aus Quellen, welche diese Nukleinsäuren enthalten. Auch in diesem Verfahren werden die Nukleinsäuren an mineralischen Trägern adsorbiert unter Bedingungen, die eine Bindung der gewünschten Nukleinsäurespezies erlaubt, während die nicht gewünschte Nukleinsäurespezies nicht an diesen mineralischen Träger bindet.
Um überwiegend einzelsträngige Nukleinsäuren an einen mineralischen Träger zu binden und somit von doppelsträngigen Nukleinsäuren zu trennen, werden die Behandlungsbedingungen für die beide Nukleinsäurespezies enthaltenden Proben mit einem wässrigen Gemisch von Salzen, insbesondere chaotrope Salze und Alkohol entsprechend eingestellt. Die nicht adsorbierte doppelsträngige Nukleinsäure kann daraufhin mit bekannten Verfahren weiter aufgereinigt oder isoliert werden.
Weitere Verfahren werden beispielsweise in den Europäischen Offenlegungsschriften EP-A-512 767 und EP-A-515 484, in den Internationalen Patentanmeldungen WO-A- 95/13368, WO-A-96/18731 und WO-A-97/10331 sowie in den US Patentschriften US-A-4,923,978 und US-A-5,057,426 offenbart.
Die Europäische Offenlegungsschrift EP-A-O 707 077 beschreibt das Binden sowie die nachfolgende selektive Freisetzung von Nukleinsäure aus einem Lysat mittels eines wasserlöslichen schwach basisch reagierenden Polymers, das mit der Nukleinsäure unter spezifischen Bedingungen einen Niederschlag bildet. Dieser Niederschlag kann aus der wässrigen Lösung abgetrennt werden und die Nukleinsäure kann unter Anwendung von hohen Salzkonzentrationen sowie unter Einwirkung von starken Basen oder durch Erhitzen freigesetzt werden.
Hinsichtlich aller oben beschriebener Isolierungs- bzw. Reinigungsverfahren ist mit Blick auf die biologischen Proben darauf hinzuweisen, dass Blut eine der in den
größten Mengen verfügbare Quelle für DNA-Analysen ist, da Blutproben routinemäßig aus den unterschiedlichsten Gründen gezogen werden. Aufgrund der viskosen Beschaffenheit sowie wegen der äußerst proteinhaltigen Zusammensetzung, warf die Automatisierung der Isolierung von Nukleinsäuren aus diesem Ausgangsmaterial immer wieder unerwartete Schwierigkeiten auf - ein Umstand, der auch im Stand der Technik mehrfach belegt ist. Daneben erwies sich - hinsichtlich einer Automatisierung - die Handhabung großer Probenvolumina, die relativ geringe DNA-Mengen aufweisen, als schwierig.
Die vorliegende Patentanmeldung stellt sich somit die Aufgabe, die oben geschilderten und aus dem Stand der Technik bekannten Probleme wenigstens zum Teil einer Lösung zuzuführen. Somit zielt die vorliegende Erfindung im allgemeinsten Sinn auf den Bedarf an Materialien und Verfahren ab, die ein schnelles und effizientes Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäuren aus einer Mischung der gewünschten Nukleinsäuren mit Verunreinigungen ermöglichen.
Diese Aufgabe wird in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform durch funktionalisierte Matrices der allgemeinen Formel I sowie durch Verfahren zur Isolierung einer oder mehrerer Nukleinsäuren, wie z.B. Plasmid-DNA, chromosomaler DNA, Gesamt RNA, mRNA, oder RNA/DNA Hybride z.B. aus biologischen Proben die Verunreinigungen, wie Proteinen, Fetten, Zelltrümmern etc., enthalten, gelöst.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierte Matrixmaterialien bzw. Matrices, bei der die Hydrazin-Partialstrukturen über einen sog. Linker an den Träger gebunden sind sowie Verfahren zur Herstellung der Matrices der allgemeinen Formel (I).
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ebenfalls ein Verfahren zum Isolieren von Biomolekülen - insbesondere von Nukleinsäuren - unter Verwendung der oben erwähnten mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierten Matrix, welches die folgenden Schritte umfasst:
(a) Bereitstellen der mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierten Matrixmaterialien bzw. Matrices;
(b) Vereinigen der Matrix mit einer Mischung enthaltend das zu isolierende Biomolekül bzw. enthaltend vorzugsweise die zu isolierende Nukleinsäure neben mindestens einer Verunreinigung;
(c) Inkubieren der Matrix und der Mischung bei einem Adsorptions-pH, wobei das Biomolekül bzw. bevorzugt die gewünschte Nukleinsäure an der Matrix immobilisiert wird;
(d) Trennen der Matrix mit dem Biomolekül bzw. mit der/den immobilisierten Nukleinsäure(n) von der Mischung;
(e) Vereinigen der Matrix mit dem Biomolekül bzw. mit der/den immobilisierten Nukleinsäure(n) mit einer Elutionslösung bei einem Desorptions-pH, wobei das/die gewünschte(n) Biomolekül(e) bzw. Nukleinsäure(n) von der Matrix desorbiert wird.
Der Träger oder die Tägeroberfläche bzw. das ihm/ihr zugrundeliegende Trägermaterial kann aus jedem gewöhnlichen - polymeren - anorganischen oder organischen Material gebildet werden, einschließlich weichen Gel-artigen Trägern, wie Agarose, Polyacrylamid oder Cellulose oder hartem Trägermaterial, wie Polystyrol, Latexmethacrylat oder aus einem Metalloxid wie vorzugsweise Silica. Wenn das Trägermaterial durch Siliciumdioxid verkörpert wird, liegt es bevorzugt in Form von Kieselgel, festem Glas oder Diatomeenerde oder in Gestalt einer Mischung dieser Stoffe vor. - Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein Polymethacrylat als Homopolymer, aber auch als Copolymer mit weiteren Styrolmonomeren, Acrylaten oder Methacrylaten, sowie Quervernetzern, wie Divinylbenzol oder Ethylenglycol- dimethacrylat besonders bevorzugt.
Bei der Verwendung von organischen, polymeren Materialien kann jedwedes Polymer ausgewählt werden, welches so funktionalisiert werden kann, dass die funktionellen Gruppen (Linker) - die ggf. bereits im Polymer als Precursor vorhanden
sind oder, die innerhalb einer Folgereaktion noch erzeugt werden - mit Hydrazin bzw. mit dem gewünschten Hydrazinderivat unter Ausbildung einer kovalenten Bindung reagieren können.
In einer weiteren Ausführungsform können die Linker ggf. mit einem Spacer - vorzugsweise unter Ausbildung einer kovalenten Bindung - reagieren, wobei das Hydrazin bzw. das Hydrazinderivat bereits an den Linker gebunden ist oder erst in einer weiteren Reaktion noch gebunden wird. Die Linker können erfindungsgemäß auch direkt mit Hydrazin selbst bzw. mit der gewünschten Hydrazinverbindung reagieren.
Träger bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen ein polymeres Grundgerüst, das durch die Polymerisation der Ausgangsmonomeren ggf. mit einem Quervernetzer und ggf. mit anderen Hilfsstoffen aufgebaut wird. Unter Hilfsstoffen werden erfindungsgemäß in erster Linie Stoffe verstanden, die zum Beispiel auf die chemischen oder physikalischen Eigenschaften des Polymers Einfluss nehmen. Dazu gehören beispielsweise Porenbildner, die die Porosität des Polymers beeinflussen oder Stoffe die dem Polymer magnetische Eigenschaften verleihen. Der Träger kann somit - je nach Wunsch - mit einem Material verbunden sein, das ein permanentes oder temporäres magnetisches Moment aufweist.
Die geometrische Form, in welcher das Polymer - welche die Matrix bildet - vorliegt, spielt hierbei weitestgehend keine Rolle. So können die Oberflächen beispielsweise in Eppendorff- oder Falcontubes, Mikrotiterplatten, PCR-Platten oder zum Beispiel auf Objektträgern erzeugt werden.
Die Matrix kann dabei auch als sog. Komposit ausgebildet sein, in dem das Matrixmaterial der allgemeinen Formel I beispielsweise in Kombination mit einem anorganischen Polymer - wie z.B. Silica (SiO2) - vorliegen kann oder auf einer metallischen Oberfläche - wie z.B. Gold oder Eisen - aufgebracht bzw. in jedweder anderen Form mit anderen Materialien kombiniert sein kann.
Ganz allgemein ist es möglich, für die Herstellung der Matrix, die funktionalisierten Polymere (Matrixmaterialien) auf jedwede hydrophile oder hydrophobe - ggf.
vorbeschichtete - Oberfläche aufzubringen, was in einem breiten Anwendungsspektrum resultiert (u.a. in Multiwellsystemen wie z.B. Mikrotiterplatten oder mikrofluidische Systeme).
Im Sinne der Erfindung wird der Träger der Matrix durch ein Polymer gebildet, wobei der Begriff Polymer in seiner weitesten Definition verstanden wird. Erfindungsgemäß verkörpern Polymere im Sinne der vorliegenden Erfindung Polymerisate, Polykondensate bzw. Polyaddukte. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Träger aus Homopolymeren, Copolymeren, Terpolymeren usw. oder aus Mischungen verschiedener polymerer Bestanteile aufgebaut sein. Die ggf. verschiedenen Polymere können - falls dies gewünscht ist oder zweckmäßig erscheint - untereinander mit einem sog. Crosslinker (Quervernetzer) vernetzt sein.
Beide Trägermaterialien - organisches wie auch anorganisches Trägermaterial - können dabei u.a. in Form von Partikeln, massiven Teilen - wie beispielsweise Gefäßwände von Reaktionsgefäßen -, Membranen oder in Form von Vliesen bzw. Geweben vorliegen.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, Hydrazin - oder ein entsprechendes Derivat des Hydrazins - an ein (wasser)lösliches Polymer zu binden, wie es beispielsweise in der bereits eingangs erwähnten Europäischen Patentanmeldung EP-A-O 707 077 offenbart ist.
Die mit Hydrazin bzw. mit einem oder mehrerer seiner Derivate modifizierten Oberflächen der Matrices zeigen somit prinzipiell folgenden Aufbau, wobei - wie bereits erwähnt - der Spacer ggf. entfallen kann, d.h., dass er lediglich eine Einfachbindung verkörpert:
Träger Linker Spacer NR3 NRiR2 (I)
R3 kann dabei auch mit dem Spacer oder ggf. direkt mit dem Linker eine weitere Bindung bzw. eine Doppelbindung ausbilden
Träger Linker Spacer N NRi R2
Darin stellt die Trägeroberfläche einen Träger aus einem organischen oder anorganischen Material - vorzugsweise einem anorganischen oder organischen Polymeren - dar, die ggf. noch andere funktionelle Gruppen aufweisen kann.
Der Linker verkörpert im einfachsten Fall eine Einfachbindung, kann jedoch in Abhängigkeit von der gewählten Ausgangsfunktionalität eine bis zu sechsgliedrige Alkylenbrücke, die neben - ggf. mit Halogen-, Hydroxy-, Amino- und Thiolgruppen - substituierten Methylengruppen, Partialstrukturen ausgewählt aus der Gruppe folgender Strukturelemente, umfassend -O-, -NH-, -S-, -C(=O)-, -C(=O)-C(=O)-, - C(=O)-O-, -C(=O)-C(=O)-O-, -C(=S)-O-, -C(=O)-S-, -C(=O)-N-, -NH-C(=O)-NH- enthält.
Der Spacer stellt im einfachsten Fall eine Einfach- oder Doppelbindung, eine 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthaltende Alkylenbrücke, die ggf. durch Sauerstoff- oder Schwefelatome oder auch Aminogruppen unterbrochen sein kann, dar und die ggf. eine oder mehrere Carbonyl- oder Carboxylgruppen aufweisen kann. Als Beispiele seien Dialdehyd-, Polyaldehyd-, Dicarboxy- oder Polycarboxy-Partialstrukturen genannt. Daneben seien Ethylenglykol-diglycidylether-, Glycerol-diglycidylether-, Glycerol-triglycidylether-strukturen neben Ethylenglykol, Polyethylenglykol, Propylenglykol und Polpropylenglykol sowie deren Derivate als Spacer genannt.
An den ggf. vorhandenen Spacer ist über eine kovalente Einfach- oder über eine Doppelbindung die Hydrazin-Partialstruktur gebunden, in der die Substituenten R1, R2 und ggf. R3 unabhängig voneinander Wasserstoff, CrC6-Alkyl, C3-C6-Alkenyl, C3- C-6-Alkinyl, einen höheren Alkylrest, einen Cycloalkylrest oder einen Aryl- bzw. Aralkylrest bedeuten können.
Erfindungsgemäß kommt den oben genannten Substituenten - sofern nicht anders angegeben - im Sinne der vorliegenden Erfindung folgende Bedeutung zu:
CrC6-Alkyl - im Allgemeinen auch nur als „Alkyl" bezeichnet - steht im allgemeinen für einen monovalenten, verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatom(en), der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) - vorzugsweise Fluor - oder einer oder mehreren Hydroxygruppe(n) substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden
sein können. Als Beispiele seien folgende unsubstituierten Kohlenwasserstoffreste genannt:
Methyl, Ethyl, Propyl, 1 -Methylethyl (/so-Propyl), Butyl, 1 -Methylpropyl, 2- Methylpropyl, 1 ,1 -Dimethylethyl, n-Pentyl, 1 -Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3- Methylbutyl, 1 ,1 -Dimethylpropyl, 1 ,2-Dimethylpropyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1 - Ethylpropyl, Hexyl, 1 -Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1 ,1 -Dimethylbutyl, 1 ,2-Dimethylbutyl, 1 ,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3- Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1 -Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1 ,1 ,2-Trimethylpropyl, 1 ,2,2-Trimethylpropyl, 1 -Ethyl-1 -methylpropyl und 1 -Ethyl-2-methyl-propyl.
Entsprechendes gilt für andere - beispielsweise kleinere oder größere - Alkylreste, wie z.B. CrC-3-Alkyl oder C4-C6-Alkyl bzw. analog für höhere Alkylreste, welche für einen monovalenten verzweigten oder unverzweigten C7-C2o-Alkyrest der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) - vorzugsweise Fluor - substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können, stehen können. Als Beispiele seien folgende bevorzugte unsubstituierten Kohlenwasserstoffreste genannt: verzweigtes oder unverzweigtes Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tetradecyl, Hexadecyl, Dodecadecyl und Eicosyl.
Halogenalkyl steht für die entsprechenden CrC6- oder die höheren Alkylreste, die mit einem oder mehreren Halogenatom(en) - unabhängig voneinander gleich oder verschieden - substituiert sein können.
C3-C6-Alkenyl steht im allgemeinen für einen verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 3 bis 6 Kohlenstoffatom(en), mit einer oder ggf. mehreren Doppelbindungen, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) - vorzugsweise Fluor - substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können. Als Beispiele seien folgende Kohlenwasserstoffreste genannt:
2-Propenyl (AIIyI), 2-Butenyl, 3-Butenyl, 1 -Methyl-2-propenyl, 2-Methyl-2-propenyl, 2- Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1 -Methyl-2-butenyl, 2-Methyl-2-butenyl, 3-Methyl- 2-butenyl, 1 -Methyl-3-butenyl, 2-Methyl-3-butenyl, 3-Methyl-3-butenyl, 1 ,1 - Dimethyl-
2-propenyl, 1 ,2-Dimethyl-2-propenyl, 1 -Ethyl-2-propenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4- Hexenyl, 5-Hexenyl, 1 -Methyl-2-pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl, 3- Methyl-2-pentenyl, 4-Methyl-2-pentenyl, 1 -Methyl-3-pentenyl, 2-Methyl-3-pentenyl, 3-Methyl-3-pentenyl, 4-Methyl-3-pentenyl, 1 -Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-pentenyl, 4-Methyl-4-pentenyl, 1 ,1 -Dimethyl-2-butenyl, 1 ,crotyl1 -Dimethyl-2-butenyl, 1 ,1 - Dimethyl-3-butenyl, 1 ,2- Dimethyl-2-butenyl, 1 ,2-Dimethyl-3-butenyl, 1 ,3-Dimethyl-2-butenyl, 1 ,3-Dimethyl-3- butenyl, 2,2-Dimethyl-3-butenyl, 2,3-Dimethyl-2-Butenyl, 2,3-Dimethyl-3-butenyl, 1 - Ethyl-2-butenyl, 1 -Ethyl-3-butenyl, 2-EthyM -butenyl, 2- Ethyl-2-butenyl, 2-Ethyl-3- butenyl, 1 ,1 ,2-Trimethyl-2-propenyl, 1 -Ethyl-1 -methyl-2-propenyl und 1 -Ethyl-2- methyl-2-propenyl.
C3-C6-Alkinyl steht im allgemeinen für einen verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 3 bis 6 Kohlenstoffatom(en), mit einer oder ggf. mehreren Dreifachbindungen, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) - vorzugsweise Fluor - substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können. Als Beispiele seien folgende Kohlenwasserstoffreste genannt:
2-Propinyl (Propargyl), 2-Butinyl, 3-Butinyl, 1 -Methyl-2-propinyl, 2-Methyl-2-propinyl, 2-Pentinyl, 3-pentinyl, 4-Pentinyl, 1 -Methyl-2-butinyl, 2-Methyl-2-butinyl, 3-Methyl-2- butinyl, 1 -Methyl-3-butinyl, 2-Methyl-3-butinyl, 3-Methyl-3-butinyl, 1 ,1 -Dimethyl-2- propinyl, 1 ,2-Dimethyl-2-propinyl, 1 -Ethyl-2-propinyl, 2-Hexinyl, 3-Hexinyl, 4-Hexinyl, 5-Hexinyl, 1 -Methyl-2-pentinyl, 2-Methyl-2-pentinyl, 3-Methyl-2-pentinyl, 4-Methyl-2- pentinyl, 1 -Methyl-3-pentinyl, 2-Methyl-3-pentinyl, 3-Methyl-3-pentinyl, 4-Methyl-3- pentinyl, 1 -Methyl-4-pentinyl, 3-Methyl-4-pentinyl, 4-Methyl-4-pentinyl, 1 ,1 -Dimethyl- 2-butinyl, 1 ,1 -Dimethyl-2-butinyl, 1 ,1 -Dimethyl-3-butinyl, 1 ,2-Dimethyl-2-butinyl, 1 ,2- Dimethyl-3-butinyl, 1 ,3-Dimethyl-2-butinyl, 1 ,3-Dimethyl-3-butinyl, 2,2-Dimethyl- 3- butinyl, 2,3-Dimethyl-2-butinyl, 2,3-Dimethyl-3-butinyl, 1 -Ethyl-2-butinyl, 1 -Ethyl-3- butinyl, 2-Ethyl-1 -butinyl, 2-Ethyl-2-butinyl, 2-Ethyl-3-butinyl, 1 ,1 ,2-Trimethyl-2- propinyl, 1 -Ethyl-1 -methyl-2-propinyl und 1 -Ethyl-2-methyl-2-propinyl.
Alkylen steht im Allgemeinen für einen unverzweigten, divalenten Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen oder für einen verzweigten,
divalenten Kohlenwasserstoffrest von 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie z.B. 2- Methylpropylen, Pentylen und ähnliche.
Entsprechendes gilt für die ungesättigten C3-C6-Alkenylen- und C3-C6- Alkinylenbrücken.
Cycloalkyl steht - sofern nicht anders definiert - für einen gesättigten monovalenten cyclischen Kohlenwasserstoffrest, der drei bis acht Kohlenstoffatome aufweisen und der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) - vorzugsweise Fluor - oder einer oder mehreren Hydroxygruppe(n) substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können. Als Beispiele seien genannt: Cyclopropyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl oder Cyclooctyl. Dabei kann die Kohlenstoffkette durch ein oder mehrere Heteroatome - wie z.B. Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel - unterbrochen sein. Als Beispiele seien genannt 1 ,4- Dioxixan (Dioxan), 2,5-Dihydorfuran, Tetrahydrofuran, γ-Pyran, 2H-1 ,3-Dioxol, Tetrahydropyrrol, 2,5-Dihydropyrrol, Piperidin, Piperazin, Tetrahydrothiophen, Morpholin, 1 ,2-Oxathiolan, 1 ,3-Thiazol, 1 H-4,1 ,2-Thiadiazin, 1 ,2-Oxathiepan, γ- Thiopyran, 1 ,4-Thiazixin (1 ,4-Thiazin).
Als bevorzugte Beispiele für sauerstoffhaltige, heterocyclische und Hydroxi- substituierte cyclische Systeme seien u.a. beispielsweise die Kohlenhydrate (Pentosen wie auch Hexosen) angeführt, wie z.B.: Arabinosen, Xylosen oder Ribosen bzw. Glucosen, Mannosen, Galactosen, Fructosen oder Sorbosen.
Aryl steht im allgemeinen für einen monovalenten monocyclischen oder bicyclischen aromatischen Substituenten mit 6 bis 10 Ringatomen, der ggf. unabhängig voneinander mit einem oder mehreren, vorzugsweise mit ein oder zwei Substituenten ausgewählt aus der Gruppe enthaltend CrC6-Alkyl, CrC6-Halogenalkyl, CrC6- Alkenyl, d-C6-Alkinyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Halogen, Cyano, Nitro, Acyloxy, Amino, mono-alkylsubstitutiertes Amin, di-alkylsubstituiertes Amin, Acylamino, Hydroxylamino, Amidino, Guanidino, -OR [worin R Wasserstoff, CrC6- Alkyl, d-Ce-Halogenalkyl, C3-C6-Alkenyl, C3-C6-Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl], - S(O)nR [worin eine ganze Zahl 0, 1 oder 2 bedeuten kann und R Wasserstoff, CrC6- Alkyl, d-Ce-Halogenalkyl, C3-C6-Alkenyl, C3-C6-Alkinyl, Aycloalkyl, Cycloalkylalkyl
bedeuten kann], -C(O)R [worin R Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, CrC6- Halogenalkyl bedeuten kann], -COOR [worin R Wasserstoff, CrC6-Alkyl, CrC6- Halogenalkyl, C3-C6-Alkenyl, C3-C6-Alkinyl, Cycloalkyl, CrC6-Halogenalkyl bedeuten kann], -(Alkylen)COOR [worin R Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, CrC6- Halogenalkyl bedeuten kann], -CONR1R" oder -(Alkylen)CONR'R" [worin R' bzw. R" unabhängig voneinander Wasserstoff, CrC6-Alkyl, CrC6-Halogenalkyl, C3-C6- Alkenyl, C3-C6-Alkinyl, Cycloalkyl, Halogenalkyl bedeuten können].
Aryl steht - sofern nicht anders angegeben - auch für einen aromatischen ein- oder mehrkernigen Rest mit 4 bis 22 C-Kohlenstoffatomen, der ein oder zwei Heteroatome enthalten kann. Als Beispiele seien genannt: Naphthyl, Anthracyl bzw. Pyrolyl, Furanyl, Thiophenyl, Pyridinyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl oder Pyrazinyl.
Aralkyl bedeutet im Sinne der vorstehenden Definition einen ein- oder mehrkernigen Arylrest - wie oben definiert -, der über eine CrC6-Alkylen-, C3-C6-Alkenylen- oder eine C3-C6- Alkinylenbrücke, für welche die Definition der CrC6-Alkyl-, C3-C6-Alkenyl und C3-C6- Alkinylgruppen - wie oben ausgeführt - entsprechend gelten, an die Hydrazin-Partialstruktur gebunden ist. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird die Benzylgruppe bevorzugt.
Halogen steht - sofern nicht anders angegeben - für Fluor, Chlor, Brom oder lod, vorzugsweise jedoch für Fluor und Chlor.
Die erfindungsgemäßen mit Hydrazin bzw. mit seinen Abkömmlingen derivatisierten Trägeroberflächen lassen sich in Abhängigkeit von der chemischen Funktionalität der auf der Oberfläche befindlichen Gruppen in Analogie zu bereits aus dem Stand der Technik wohlbekannten Verfahren zu den gewünschten Produkten umsetzen.
Zunächst lassen sich die für die Derivatisierung des Trägers benötigten Hydrazinderivate mit aus dem Stand der Technik bekannten Standartmethoden leicht herstellen.
So liefert die Umsetzung von Hydrazin mit Alkylhalogeniden [Alkyl-X] (X=Halogen) und -Sulfaten (X=Sulfat) im Normalfall das unsymmetrische bis-Substitutionsprodukt [H2N-N(Alkyl)3 +X" bzw. H2N-N(Alkyl)2].
Um auf der anderen Seite Monoalkylhydrazine zu erhalten, kann beispielsweise von Benzaldazin ausgegangen werden, das in einer möglichen Alternative mit einem Alkylsulfat zu dem entsprechenden Monoalkylsalz umgesetzt werden kann. Nach hydrolytischer Spaltung kann das gewünschte Hydrazinderivat vom Typ H2N- NH(Alkyl) leicht zugänglich gemacht werden.
Symmetrisch substituierte Hydrazinderivate können unter Zuhilfenahme von Schutzgruppen ebenfalls auf unkomplizierte Weise synthetisiert werden. So lassen sich z.B. über zweifach Acyl-geschützte Hydrazinderivate vom Typ H(Acyl)N- NH(Acyl) durch Umsetzung mit Dimethylsulfat und nachfolgender saurer Verseifung das entsprechende symmetrisch substituierte Dimethylhydrazin herstellen.
Daneben erschließt die Reduktion von Dialkylnitrosaminen vom Typ RaRbN-NO einen weiteren einfachen Zugang zur Herstellung von unsymmetrisch substituierten Hydrazinderivaten.
Alle oben aufgezeigten Synthesewege sind - neben zahlreichen anderen - aus dem Stand der Technik wohlbekannt und verkörpern allgemeines Fachwissen [s. z.B. : R. C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Weinheim 1989].
Die so hergestellten Hydrazinderivate lassen sich mit einer Vielzahl von funktionellen Gruppen, die der Träger per se schon aufweisen kann oder, die in einem eigenem Reaktionsschritt auf der Trägeroberfläche erzeugt werden - bzw. die über den Spacer eingebaut werden -, umsetzen.
So führt die Umsetzung von Carbonylfunktionen mit geeignet substituierten Hydrazinderivaten - wie aus dem Stand der Technik ebenfalls wohlbekannt ist - zu den entsprechenden Hydrazonen, die - sofern gewünscht - in einem weiteren Schritt nochmals derivatisiert werden können.
Des Weiteren ist es möglich, geeignete Carboxylfunktionen - ggf. in Gegenwart eines Kopplungsreagenzes - wie z.B. EDC [N-Ethyl-N'-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid], HBTU [2-(1 H-Benzotriazol-1 -yl)- 1 ,1 ,3,3-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat] oder TSTU [N,N,N',N'-Tetramethyl- O-(succinimidyl)uronium-Tetrafluoroborat] - mit Hydrazin bzw. mit dessen Derivaten umzusetzen.
Daneben können von vornherein aktivierte Carboxylgruppen auf dem Trägermaterial eingesetzt werden - wie z.B. Säurehalogenide oder -anhydride oder Carbonylimidazole.
Weitere Möglichkeiten umfassen den Einsatz von Tresylgruppen, Azlacton- und Pentafluorphenol-aktivierten Trägern. Dabei wird der Einsatz aktivierter Carboxylgruppen erfindungsgemäß bevorzugt.
Im Sinne der Erfindung werden Epoxidgruppen als funktionelle Gruppen für die Umsetzung mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat besonders bevorzugt.
Bei der Umsetzung mit Hydrazin bzw. mit Hydrazinderivaten tritt unter Ausbildung einer Hydroxylfunktion sowie einer kovalenten Bindung zur Hydrazin-Partialstruktur eine Öffnung des Epoxidrings ein.
Die oben erwähnten funktionellen Gruppen können dabei Partialstrukturen des Linkers - vorzugsweise wenn der Spacer lediglich eine kovalente Einfachbindung oder eine Doppelbindung verkörpert - darstellen, oder aber sie verkörpern ihrerseits Partialstrukturen des Spacers und werden somit erst nach der Einführung des Spacers verfügbar.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zur Aufreinigung bzw. Isolierung von Nukleinsäuren beinhaltend: das Bereitstellen der erfindungsgemäßen mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierten Matrix, die in dem Verfahren eingesetzt werden soll. Der nachfolgende Immobilisierungsschritt besteht in einem Zusammenführen der Matrix mit der Mischung, welche die zu isolierende Nukleinsäure neben mindestens einer Verunreinigung enthält, bei einem ersten pH-
Wert unter Bedingungen, unter denen die gewünschte Nukleinsäure an der Matrix adsorbiert wird, trennen der Matrix mit der immobilisierten Nukleinsäure von der Mischung und desorbieren der Nukleinsäure bei einem Desorptions-pH, wobei die gewünschte(n) Nukleinsäure(n) von der Matrix desorbiert wird (werden).
Entsprechend dem ersten Teilschritt des oben beschriebenen Verfahrens - nämlich der Adsorption der Nukleinsäure an die mit Hydrazin und/oder mit einem oder mehreren Hydrazinderivat(en) modifizierten Matrix - verkörpert der Komplex, der aus der Nukleinsäure mit der Partialstruktur des Hydrazins bzw. der Hydrazinderivate ausgebildet wird, einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Dabei hängen die exakten Reaktionsbedingungen - die notwendig sind, um Adsorption und Desorption der Nukleinsäuren an bzw. Matrix sicher zu stellen - von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich von der Beschaffenheit der Matrix, der Natur der gewünschten Nukleinsäure (DNA oder RNA, Molekulargewicht und Nukleotidsequenz-Zusammensetzung, dem pKb und pKa der basischen bzw. ggf. vorhandenen sauren Partialstrukturen, der Dichte der dieser Strukturen auf der Oberfläche und nicht zuletzt von der Fähigkeit der so modifizierten Matrix an die Nukleinsäure(n) zu binden).
Weiterhin ist es nicht ausgeschlossen, dass Verunreinigungen in der Mischung bei der Adsorption der Nukleinsäure(n) nachteilig mit dem Bindungsschritt interferieren.
Die hier eingesetzten Mischungen, welche die gewünschten Nukleinsäuren enthalten, können zum einen aus synthetisch hergestellten Reaktionsmischungen - wie sie z.B. bei der PCR anfallen - oder - wie bereits eingangs erwähnt - aus biologischen Proben stammen.
Als biologische Proben mit Nukleinsäuren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung zellfreies Probenmaterial, Plasma, Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise Blut, Serum, Zellen, Leukozytenfraktionen, Crusta Phlogistica, Sputum, Urin, Sperma, Faeces, Abstriche, Punktate, Gewebeproben jeder Art - wie z. B. Biopsien -, Gewebeteile und Organe, Lebensmittelproben, die freie oder gebundene Nukleinsäuren oder Nukleinsäurehaltige Zellen enthalten, Umweltproben, die freie
oder gebundene Nukleinsäuren oder Nukleinsäure-haltige Zellen enthalten - wie z. B. Organismen (Ein- oder Mehrzeller; Insekten etc.), Pflanzen und Pflanzenteile, Bakterien, Viren, Hefen und andere Pilze, andere Eukaryonten und Prokaryonten etc. verstanden.
Bei der Verwendung derartiger Proben ist es allerdings zunächst erforderlich, die Zellen zu zerstören, um die Nukleinsäuren für den Adsorptionsschritt verfügbar zu machen.
Wenn es sich bei der gewünschten Nukleinsäure um RNA handelt, müssen die Adsorptionsbedingungen so eingestellt werden, dass die Adsorption der gewünschten RNA gefördert wird. Wenn neben der RNA auch noch DNA in der Mischung zugegen ist, können die Adsorptionsbedingungen so eingestellt werden, dass bevorzugt die Bindung einer Spezies - in diesem Fall insbesondere RNA - an die Matrix gefördert wird. Die spezifischen Adsorptionsbedingungen, die allerdings erforderlich sind, um die Adsorption und letztendlich die Desorption von RNA zu ermöglichen, hängt von den Eigenschaften der Matrix ab und muss für jeden unterschiedlichen Typ einer Matrix bestimmt werden.
Die erfindungsgemäß eingesetzte Matrix, liegt bevorzugt in einer Form vor, die von der Mischung, welche die gewünschte Nukleinsäure neben anderen Substanzen/Verunreinigungen enthält, durch Einwirken einer externen Kraft getrennt werden kann, nachdem die Mischung mit der Matrix vermischt worden ist. Für den Fachmann ist verständlich, dass die Art der externen Kraft, die sich für die Trennung der Matrix aus der Mischung eignet, von der Form und von den physikalischen Eigenschaften der Matrix, abhängig ist. Zum Beispiel kann im einfachsten Fall, die Trennung unter der Einwirkung von Schwerkraft erfolgen, wenn die Matrix beispielsweise in der Form der festen Phase eines chromatographischen Trennsystems vorliegt.
Auf der anderen Seite kann die Matrix - ggf. chargenweise - zu der Mischung aus der Nukleinsäure und Verunreinigung(en) - zugegeben werden und anschließend durch Dekantieren oder Filtrieren - wieder abgetrennt werden.
Die externe Kraft, die in dem erfindungsgemäßen Isolierungsverfahren angewendet wird, kann eine Flüssigkeit darstellen, die unter einem hohen Druck steht, wobei die Matrix die stationäre Phase einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie bildet.
Andere Formen von externen Kräften, die sich zum Einsatz in dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren eignen, beinhalten Vakuumfiltration, Zentrifugation oder bevorzugt Magnetkraft.
Bei dem Einsatz von Magnetkraft, kommen vorzugsweise Matrices in Frage, die ein permanent oder temporär magnetisches Material aufweisen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise ferro- oder ferrimagnetische Partikel verwendet, vorzugsweise ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus: γ-Fe2O3 (Maghämit), Cr2O3, sowie Ferrite, insbesondere vom Typ (M2O)Fe2O3, wobei M2+ ein divalentes Übergangsmetallkation und vorzugsweise Fe3O4 (Magnetit) ist. Andere ferro- oder ferrimagnetische Partikel können jedoch ebenfalls verwendet werden. Diese Partikel weisen einen mittleren Teilchendurchmesser von kleiner 5 μm, vorzugsweise von kleiner 1 μm und besonders bevorzugt in einem Intervall zwischen 0,0 und 0,8 μm sowie ganz besonders bevorzugt in einem Bereich von 7 bis 300 nm auf.
Beispiele geeigneter, kommerziell erhältlicher ferro- oder ferrimagnetischer Partikel werden durch magnetische Partikel auf der Basis von γ-Fe2O3- wie Bayoxide® E AB 21 , auf der Basis von ferrimagnetischem Magnetit als Typ Bayoxide® E 8706, E 8707, E 8710 und E 8713H (erhältlich von der Lanxess AG, Leverkusen, Bundesrepublik Deutschland) sowie als Magnetpigment 340 sowie als Magnetpigment 345 (erhältlich von der BASF AG, Ludwigshafen am Rhein, Bundesrepublik Deutschland) verkörpert.
Darüber hinaus können auch superparamagnetische Materialien eingesetzt werden. Als superparamagnetische Materialien kommen Fe, Fe3O4, Fe2O3, superparamagnetische Ferrite Co, Ni, sowie binäre und oder ternäre Verbindungen (Legierungen) in Frage.
Beispielhaft seien hier Eisenoxidkristalle mit einem Durchmesser von 300 Angström und kleiner genannt.
Die erfindungsgemäße Matrix kann in Reinigungs- oder Isolierungsverfahren von Nukleinsäuren eingesetzt werden, die in konventionellen Größenordnungen satt finden und die beispielsweise aus den eingangs erwähnten Stand der Technik bekannt sind. Die erfindungsgemäße Matrix eignet sich aber auch zur Verwendung in oder in Verbindung mit mikrofluidischen Systemen, wie sie aus dem Stand der Technik hinlänglich zur Nukleinsäureaufreinigung bzw. -detektion bekannt sind.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung verdeutlichen, ohne sie zu beschränken:
1. Herstellung von Hydrazin-modifizierten Beads
1.1. Direkte Modifizierung mit Hydrazin
5 g poröser magnetischer Beads, die aus einem Eisenoxidkern mit einer Umhüllung bestehend aus einem Polymethacrylat umgeben sind, werden in einem 250 ml Kolben in 100 ml entsalztem Wasser suspendiert und mit 10 ml Hydrazin-Hydrat versetzt. Die Suspension wird durch das zweimalige Anlegen eines Wasserstrahlvakuums entgast und über einen Zeitraum von ca. 12 Stunden unter leichtem Rühren auf eine Temperatur von 70 0C erhitzt. Die aus der Umsetzung resultierenden Hydrazin-modifizierten Beads werden in eine Glasfritte übergeführt und jeweils zweimal mit entsalztem Wasser, mit 10 mM Salzsäure sowie mit 100 mM Natriumphosphat (pH 6,0) und entsalztem Wasser gewaschen und anschließend in 100 ml entsalztem Wasser suspendiert.
1.2. Indirekte Modifizierung mit Hydrazin
5 g poröser magnetischer Beads, die aus einem Eisenoxidkern mit einer Umhüllung bestehend aus einem Polymethacrylat umgeben sind, werden in einem 250 ml Kolben in 100 ml entsalztem Wasser suspendiert und mit 5 g 6-Aminohexansäure
versetzt. Die Suspension wird durch das zweimalige Anlegen eines Wasserstrahlvakuums entgast und über einen Zeitraum von ca. 12 Stunden unter leichtem Rühren auf einer Temperatur von 70 0C erhitzt. Die Suspension wird durch das zweimalige Anlegen eines Wasserstrahlvakuums entgast und über einen Zeitraum von ca. 12 Stunden unter leichtem Rühren auf eine Temperatur von 70 0C erhitzt. Die aus der Umsetzung resultierenden mit 6-Aminohexansäure (6- Aminocapronsäure) modifizierten Beads werden in eine Glasfritte übergeführt und jeweils zweimal mit entsalztem Wasser, mit 10 mM Salzsäure sowie mit 100 mM Natriumphosphat (pH 6,0) und entsalztem Wasser gewaschen und anschließend in 100 ml entsalztem Wasser suspendiert. Danach werden 10 ml Hydrazin-Hydrat, 1 ml einer 10OmM Lösung von Natriumphosphat in Wasser (pH 6,0) enthaltend 50 mg/ml N-Hydroxysuccinimid, 1 ml einer 10OmM Lösung von Natriumphosphat in Wasser (pH 6,0) enthaltend 50 mg/ml EDC zugefügt. Nach erfolgter Zugabe wird das Reaktionsgemisch am Rotationsverdampfer über einen Zeitraum von zwei Stunden bei Raumtemperatur (ca. 25 0C) gerührt. Die aus der Umsetzung resultierenden indirekt mit Hydrazin modifizierten Beads werden in eine Glasfritte übergeführt und jeweils zweimal mit entsalztem Wasser, mit 10 mM Salzsäure sowie mit 100 mM Natriumphosphat (pH 6,0) und entsalztem Wasser gewaschen und anschließend in 100 ml entsalztem Wasser suspendiert.
2. Biologische Anwendungen
2. Biologische Anwendungen
2.1. DNA-Aufreinigung Hydrazin-modifizierten Beads
10 μg pUC21 (1 μg/μl) werden jeweils zu den folgenden Puffersystemen zugefügt:
a) 390 μl 100 M Ammoniumacetat (pH 5,5) b) 390 μl eines Puffergemischs aus einem Tris-haltigen EDTA Puffers (pH 7,8 - 8,2), einer Natriumhydroxidhaitigen SDS-Lösung (pH 13) und eines Essigsäure-haltigen Kaliumacetatpuffers (pH 5,4 - 5,6) [Puffer P1/P2/P3 der Fa. QIAGEN in Hilden (DE)], filtriert,
P1 : 50 mM Tris/Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA P2: 200 mM NaOH; 1 % SDS P3: 3 M K-Acetat pH 5.5:
Nach der Zugabe von 20 μl einer Bead-Suspension (49 mg/ml) wird die Mischung über einen ein Zeitraum von zwei Minuten auf einem Thermorüttler bei 1100 rpm inkubiert. Die Beads werden mittels Magnetkraft in der Suspension separiert und der Überstand wird verworfen. Danach werden 300 μl RNase-freies Wasser zugefügt und die Suspension wird über einen ein Zeitraum von einer Minute auf einem Thermorüttler bei 1 100 rpm vermischt. Die Beads werden mittels Magnetkraft in der Suspension separiert und der Überstand wird verworfen. Danach werden 100 μl TRIS (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1 ,3-propandiol) Puffer (pH 9.5) zugefügt und die die Suspension wird über einen ein Zeitraum von einer Minute auf einem Thermorüttler bei 1 100 rpm vermischt. Danach wird die flüssige Phase (Eluat) von den Beads mittels einer handelsüblichen magnetischen Trennvorrichtung getrennt. Dieser Elutionsschritt wird wiederholt und danach der DNA-Gehalt durch Bestimmung der optischen Dichte (OD) und Gelelektrophorese ermittelt.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit Hydrazin-modifizierte Matrices gemäß der allgemeinen Formel I
Träger Linker Spacer NRS -NR1 R2 (I)
worin
die Trägeroberfläche des Trägers aus einem anorganischen oder organischen Trägermaterial gebildet wird,
der Linker eine funktionelle Gruppe ist, die über eine kovalente Bindung mit der Trägeroberfläche oder mit dem Trägermaterial gebunden ist und entweder über den Spacer oder direkt an die Hydrazin-Partialstruktur gebunden ist,
die Substituenten R-i, R2 und R3 unabhängig voneinander Wasserstoff, CrC6-Alkyl, C3-C6-Alkenyl, C3-C6-Alkinyl, einen höheren Alkylrest, einen Cycloalkylrest oder Aryl bzw. Aralkyl und im Falle von R3 eine auch eine weitere kovalente Bindung bedeuten können.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Matrix mit einer Trägeroberfläche, die aus einem polymeren anorganischen oder organischen Trägermaterial gebildet wird.
In einer bevorzugteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einer Trägeroberfläche, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Agarosen, Polyacrylamide, Cellulosen, Polyacrylate, Polymethacrylate, Polystyrole, Latexmethacrylate und/oder Metalloxide.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform betriff die vorliegende Erfindung Matrices, die eine Trägeroberfläche aufweisen, die ausgewählt ist aus der Gruppe Polymethacrylat-Homopolymer und Copolymeren des Polymethacrylats mit Styrolen, Acrylaten oder weiteren Methacrylatderivaten, sowie ggf. mit Quervernetzern.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betriff die vorliegende Erfindung Matrices, die eine Trägeroberfläche aufweisen, die einen Quervernetzer besitzen, der aus der Gruppe Divinylbenzol oder Ethylenglycol-dimethacrylat ausgewählt ist.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform betriff die vorliegende Erfindung Matrices, die eine Trägeroberfläche aufweisen, die ein poröses Polymethacrylat Homopolymer oder Copolymer besitzt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices deren Matrixoberfläche aus Siliciumdioxid oder Silica ist bzw. Siliciumdioxid oder Silica aufweist.
In einer bevorzugteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices, deren Trägeroberfläche in Form von Kieselgel, festem Glas oder Diatomeenerde oder als Mischung dieser Stoffe vorliegt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einem Linker, der eine kovalente Bindung oder eine bis zu sechsgliedrige Alkylenbrücke, die ggf. mit einer oder mehreren Halogen-, Hydroxy-, Amino- und Thiolgruppen substituiert sein kann und die ggf. durch eine oder mehrere weitere funktionelle Gruppen unterbrochen sein kann, ist.
In einer bevorzugteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einem Linker, dessen funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe -O- , -NH-, -S-, -C(=O)-, -C(=O)-C(=O)-, -C(=O)-O-, -C(=O)-C(=O)-O-, -C(=S)-O-, -C(=O)- S-, -C(=O)-N-, -NH-C(=O)-NH-.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einem Spacer, der eine Einfachbindung oder Doppelbindung, eine 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthaltende Alkylenbrücke, die ggf. durch ein oder mehrere Sauerstoff- und/oder Schwefelatome und/oder Aminogruppen und die ggf. durch eine oder mehrere Carbonyl- oder Carboxylgruppen unterbrochen sein kann, darstellt.
In einer bevorzugteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einem Spacer, dessen Carbonylgruppen durch Dialdehyd- und Polyaldehydgruppen verkörpert werden können.
In einer weiteren bevorzugteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einem Spacer, dessen Carboxylgruppen Carboxyl-, Dicarboxy- oder Polycarboxylgruppen sein können.
In einer weiteren bevorzugteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einem Spacer dessen Alkylenbrücke Ethylenglykol-diglycidylether-, Glycerol-diglycidylether-, Glycerol-triglycidylether-Ethylenglykol-, Polyethylenglykol-, Propylenglykol- und/oder deren substituierte Derivate aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einer Hydrazin-Partialstruktur, in der R-i, R2 unabhängig voneinander Wasserstoff und R3 eine weitere kovalente Bindung oder Wasserstoff bedeutet.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Matrices in dem auf dem Trägermaterial oder auf der Trägermaterialoberfläche ein Linker erzeugt wird, der gegebenenfalls mit einem Spacer oder direkt mit Hydrazin oder einem Hydrazinderivat umgesetzt wird.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Matrices zum Isolieren von Biomolekülen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Isolieren von Biomolekülen mit den erfindungsgemäßen Matrices, das folgende Schritte umfasst:
(a) Bereitstellen der mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierten Matrix;
(b) Vereinigen der Matrix mit einer Mischung enthaltend das zu isolierende Biomolekül bzw. enthaltend vorzugsweise die zu isolierende Nukleinsäure neben mindestens einer Verunreinigung;
(c) Inkubieren der Matrix und der Mischung bei einem Adsorptions-pH, wobei das Biomolekül bzw. bevorzugt die gewünschte Nukleinsäure an der Matrix immobilisiert wird;
(d) Trennen der Matrix mit dem Biomolekül bzw. mit der/den immobilisierten Nukleinsäure(n) von der Mischung;
(e) Vereinigen der Matrix mit dem Biomolekül bzw. mit der/den immobilisierten Nukleinsäure(n) mit einer Elutionslösung bei einem Desorptions-pH, wobei das/die gewünschte(n) Biomolekül(e) bzw. Nukleinsäure(n) von der Matrix desorbiert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäure(n) mit den erfindungsmäßen Matrices.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Nukleinsäuren, die in Form eines Komplexes mit einer Hydrazinpartialstruktur oder der Partialstruktur eines Hydrzinderivats der erfindungsgemäßen Matrix gebunden sind.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Matrices in mikrofluidischen Systemen bzw. mikrofluidische Systeme, die die erfindungsgemäße Matrix enthalten.
Claims
1. Hydrazin-modifizierte Matrix gemäß der allgemeinen Formel I
Träger Linker Spacer NR3 NR1 R2 (I)
worin
die Trägeroberfläche aus einem polymeren anorganischen oder organischen Trägermaterial gebildet wird,
der Linker eine funktionelle Gruppe ist, die über eine kovalente Bindung mit der Trägeroberfläche oder mit dem Trägermaterial des Trägers gebunden ist und entweder über Spacer oder direkt an die Hydrazin-Partialstruktur gebunden ist,
die Substituenten R-i, R2 und R3 unabhängig voneinander Wasserstoff, CrC6-Alkyl, C3-C6-Alkenyl, C3-C6-Alkinyl, einen höheren Alkylrest, einen Cycloalkylrest oder Aryl bzw. Aralkyl und im Falle von R3 eine auch eine weitere kovalente Bindung bedeuten können.
2. Matrix nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Träger aus einem polymeren anorganischen oder organischen Trägermaterial gebildet wird.
3. Matrix nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägeroberfläche ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Agarosen, Polyacrylamide, Cellulosen, Polyacrylate, Polymethacrylate, Polystyrole, Latexmethacrylate und/oder Metalloxide.
4. Matrix nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägeroberfläche ausgewählt ist aus der Gruppe Polymethacrylat-Homopolymer und Copolymeren des Polymethacrylats mit Styrolen, Acrylaten oder weiteren Methacrylatderivaten, sowie mit Quervernetzern.
5. Matrix nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, der Quervernetzer ausgewählt ist aus der Gruppe Divinylbenzol oder Ethylenglycol-dimethacrylat.
6. Matrix nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägeroberfläche ein poröses Polymethacrylat Homopolymer oder Copolymer ist.
7. Matrix nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Metalloxid Siliciumdioxid oder Silica ist.
8. Matrix nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Siliciumdioxid in Form von Kieselgel, festem Glas oder Diatomeenerde oder als Mischung dieser Stoffe vorliegt.
9. Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker eine kovalente Bindung oder eine bis zu sechsgliedrige Alkylenbrücke, die ggf. mit einer oder mehreren Halogen-, Hydroxy-, Amino- und Thiolgruppen substituiert sein kann und die ggf. durch eine oder mehrere weitere funktionelle Gruppen unterbrochen sein kann, ist.
10. Matrix nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe -O-, -NH-, -S-, -C(=O)-, -C(=O)-C(=O)-, -C(=O)-O-, -C(=O)-C(=O)-O-, -C(=S)-O-, -C(=O)-S-, -C(=O)-N-, -NH-C(=O)-NH-.
1 1. Matrix nach einem Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Spacer eine Einfachbindung oder Doppelbindung, eine 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthaltende Alkylenbrücke, die ggf. durch ein oder mehrere Sauerstoff- und/oder Schwefelatome und/oder Aminogruppen und ggf. durch eine oder mehrere Carbonyl- oder Carboxylgruppen unterbrochen sein kann.
12. Matrix nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Carbonylgruppen Dialdehyd- und Polyaldehydgruppen sein können.
13. Matrix nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Carboxylgruppen Carboxyl-, Dicarboxy- oder Polycarboxylgruppen sein können.
14. Matrix nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Alkylenbrücke Ethylenglykol-diglycidylether-, Glycerol-diglycidylether-, Glycerol-triglycidylether- Ethylenglykol-, Polyethylenglykol-, Propylenglykol- und/oder deren substituierte Derivate aufweist.
15. Matrix nach einem der Ansprüche 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, dass R-i, R2 unabhängig voneinander Wasserstoff und R3 eine weitere kovalente Bindung oder Wasserstoff bedeutet.
16. Verfahren zur Herstellung von Matrices gemäß einem der Ansprüche 1 - 15, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Trägermaterial oder auf der Trägermaterialoberfläche ein Linker erzeugt wird und gegebenenfalls mit einem Spacer oder direkt mit Hydrazin oder einem Hydrazinderivat umgesetzt wird.
17. Verwendung einer modifizierten Matrix gemäß einem der Ansprüche 1 - 15 zum Isolieren von Biomolekülen.
18. Verfahren zum Isolieren von Biomolekülen mit einer mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierten Matrix gemäß einem der Ansprüche 1 - 15, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:
(a) Bereitstellen der mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierten Matrix;
(b) Vereinigen der Matrix mit einer Mischung enthaltend das zu isolierende Biomolekül neben mindestens einer Verunreinigung;
(c) Inkubieren der Matrix und der Mischung bei einem Adsorptions-pH, wobei das Biomolekül an der Matrix immobilisiert wird;
(d) Trennen der Matrix mit dem Biomolekül von der Mischung; (e) Vereinigen der Matrix mit dem Biomolekül mit einer Elutionslösung bei einem Desorptions-pH, wobei das/die gewünschte(n) Biomolekül(e) von der Matrix desorbiert wird.
19. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Biomolekül eine oder mehrere Nukleinsäure(n) darstellt.
20. Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie in Form eines Komplexes mit einer Hydrazinpartialstruktur oder der Partialstruktur eines Hydrzinderivats einer Matrix gemäß einem der Ansprüche 1 - 15 gebunden ist.
21. Mikrofluidisches System enthaltend eine Matrix nach einem der Ansprüche 1 - 15.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE102008010692A DE102008010692A1 (de) | 2008-02-22 | 2008-02-22 | Neue Matrices, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in Verfahren zur Isolierung von Biomolekülen |
| PCT/EP2009/052051 WO2009103794A1 (de) | 2008-02-22 | 2009-02-20 | Hydrazinmodifizierte matrices, ihre verwendung in verfahren zur isolierung von biomolekülen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EP2255000A1 true EP2255000A1 (de) | 2010-12-01 |
Family
ID=40547448
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EP09711574A Withdrawn EP2255000A1 (de) | 2008-02-22 | 2009-02-20 | Hydrazinmodifizierte matrices, ihre verwendung in verfahren zur isolierung von biomolekülen |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20110054054A1 (de) |
| EP (1) | EP2255000A1 (de) |
| DE (1) | DE102008010692A1 (de) |
| WO (1) | WO2009103794A1 (de) |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US155018A (en) | 1874-09-15 | Improvement in scaffolds | ||
| US923978A (en) | 1908-06-03 | 1909-06-08 | Kops Bros | Flexible fibrous material. |
| DE3639949A1 (de) | 1986-11-22 | 1988-06-09 | Diagen Inst Molekularbio | Verfahren zur trennung von langkettigen nukleinsaeuren |
| NL8900725A (nl) | 1989-03-23 | 1990-10-16 | Az Univ Amsterdam | Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur. |
| GB9003253D0 (en) | 1990-02-13 | 1990-04-11 | Amersham Int Plc | Precipitating polymers |
| CA2067711C (en) | 1991-05-03 | 2000-08-08 | Daniel Lee Woodard | Solid phase extraction purification of dna |
| DE4321904B4 (de) | 1993-07-01 | 2013-05-16 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen |
| GB9323305D0 (en) | 1993-11-11 | 1994-01-05 | Medinnova Sf | Isoaltion of nucleic acid |
| US6180778B1 (en) | 1994-02-11 | 2001-01-30 | Qiagen Gmbh | Process for the separation of double-stranded/single-stranded nucleic acid structures |
| US5582988A (en) | 1994-09-15 | 1996-12-10 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Methods for capture and selective release of nucleic acids using weakly basic polymer and amplification of same |
| GB9425138D0 (en) | 1994-12-12 | 1995-02-08 | Dynal As | Isolation of nucleic acid |
| US5783686A (en) | 1995-09-15 | 1998-07-21 | Beckman Instruments, Inc. | Method for purifying nucleic acids from heterogenous mixtures |
| DE102006003603B4 (de) * | 2006-01-25 | 2010-02-04 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Vernetzbare multifunktionelle Träger für (niedermolekulare) Liganden und deren Anwendung in der Analytik sowie Verfahren zu deren Herstellung und Vernetzung |
| US8242058B2 (en) * | 2006-07-21 | 2012-08-14 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Reagents and methods for appending functional groups to proteins |
-
2008
- 2008-02-22 DE DE102008010692A patent/DE102008010692A1/de not_active Withdrawn
-
2009
- 2009-02-20 WO PCT/EP2009/052051 patent/WO2009103794A1/de not_active Ceased
- 2009-02-20 EP EP09711574A patent/EP2255000A1/de not_active Withdrawn
- 2009-02-20 US US12/866,857 patent/US20110054054A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| FAVOROV ET AL: "Purification of alginases by affinity chromatography on a bio-gel alginate column", INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, PERGAMON, vol. 4, no. 20, 1 January 1973 (1973-01-01), pages 107 - 110, XP023404655, ISSN: 0020-711X, [retrieved on 19730101], DOI: 10.1016/0020-711X(73)90001-3 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2009103794A1 (de) | 2009-08-27 |
| DE102008010692A1 (de) | 2009-08-27 |
| US20110054054A1 (en) | 2011-03-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1031626B1 (de) | Verfahren zur Stabilisierung und/oder Isolierung von Nukleinsäuren | |
| DE69817484T2 (de) | Verfahren zur isolierung bestimmter biologischer stoffe mittels magnetischer silika-partikel | |
| DE60012506T2 (de) | Mischbett-festphase und dessen verwendung zur isolation von nukleinsäuren | |
| DE69734263T2 (de) | Verfahren zur Isolierung von Ribonucleinsäuren. | |
| EP1820793B1 (de) | Verfahren zur Stabilisierung von Nukeinsäuren in biologischen Materialien | |
| EP0775150B1 (de) | Verfahren zur abreicherung oder entfernung von endotoxinen | |
| EP1141273B1 (de) | Methode zur isolierung von dna aus biologischen materialien | |
| DE60013317T2 (de) | Magnetteilchen-zusammenstellung | |
| WO2007065933A1 (de) | Magnetische polymerpartikel | |
| EP2256195A1 (de) | Nukleinsäureaufreinigungsverfahren | |
| EP2465934A1 (de) | Extraktion von Nukleinsäuren | |
| WO2006084753A1 (de) | Verfahren zur isolierung von nukleinsäuren, wobei die nukleinsäuren bei erhöhter temperatur an einer matrix immobilisiert werden | |
| EP3228710B1 (de) | Aufreinigung von nukleinsäure aus einer nukleinsäure und endotoxin enthaltenden probe | |
| DE19912799A1 (de) | Superparamagnetisches Adsorptionsmaterial, seine Herstellung und Verwendung | |
| DE60123828T2 (de) | Lysat-klärung und nukleinsäureisolierung mit silanisierten silicamatrizes | |
| EP1242816B1 (de) | Chromatographiematerial und verfahren unter verwendung desselben | |
| EP1771562B1 (de) | Verfahren zur reinigung und isolierung von nukleinsäuren unter verwendung kationischer detergentien | |
| EP2255000A1 (de) | Hydrazinmodifizierte matrices, ihre verwendung in verfahren zur isolierung von biomolekülen | |
| EP2247626A1 (de) | Neue matrixmaterialien, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in verfahren zur isolierung von biomolekülen | |
| EP1713910A1 (de) | Verfahren zur chromatographischen trennung eines nukleinsäuregemisches | |
| EP1709172B1 (de) | Verfahren und kit zur isolierung von rna | |
| CN105237656A (zh) | 一种提纯透明质酸钠的方法 | |
| DE102015211394B4 (de) | Vorrichtung und Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren | |
| DE102010031404A1 (de) | Verfahren zur schnellen Bereitstellung von Inhaltsstoffen aus biologischen Proben | |
| EP1697540A1 (de) | Verfahren zur anreicherung und stabilisierung von dna-haltigen bestandteilen aus biologischen materialien |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUAI | Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase |
Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012 |
|
| 17P | Request for examination filed |
Effective date: 20100922 |
|
| AK | Designated contracting states |
Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR |
|
| AX | Request for extension of the european patent |
Extension state: AL BA RS |
|
| 17Q | First examination report despatched |
Effective date: 20110204 |
|
| DAX | Request for extension of the european patent (deleted) | ||
| STAA | Information on the status of an ep patent application or granted ep patent |
Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN |
|
| 18D | Application deemed to be withdrawn |
Effective date: 20120913 |