EP2255000A1 - Hydrazine-modified matrices, their use in methods for isolating biomolecules - Google Patents

Hydrazine-modified matrices, their use in methods for isolating biomolecules

Info

Publication number
EP2255000A1
EP2255000A1 EP09711574A EP09711574A EP2255000A1 EP 2255000 A1 EP2255000 A1 EP 2255000A1 EP 09711574 A EP09711574 A EP 09711574A EP 09711574 A EP09711574 A EP 09711574A EP 2255000 A1 EP2255000 A1 EP 2255000A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
matrix
hydrazine
matrix according
groups
optionally
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09711574A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Roland Fabis
Ralf Himmelreich
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qiagen GmbH
Original Assignee
Qiagen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qiagen GmbH filed Critical Qiagen GmbH
Publication of EP2255000A1 publication Critical patent/EP2255000A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers

Definitions

  • European Patent Application EP-A-0 389 063 relates to a method for isolating nucleic acids from a biological source.
  • the nucleic acid-containing biological sources such as blood, cells, plasma, etc. are digested in high concentrations in the presence of chaotropic salts.
  • the nucleic acids are bound to a silica surface.
  • the nucleic acids are then washed and eluted.
  • the present invention relates to matrices having a support surface having a porous polymethacrylate homopolymer or copolymer.
  • the present invention relates to matrices with a spacer which has a single bond or double bond, an alkylene bridge containing 1 to 12 carbon atoms, optionally by one or more oxygen and / or sulfur atoms and / or amino groups and optionally by a or more carbonyl or carboxyl groups may be interrupted.
  • the present invention relates to matrices with a spacer whose alkylene bridge comprises ethylene glycol diglycidyl ether, glycerol diglycidyl ether, glycerol triglycidyl ether, ethylene glycol, polyethylene glycol, propylene glycol and / or their substituted derivatives.
  • the present invention relates to matrices having a hydrazine partial structure in which Ri, R 2 are independently hydrogen and R 3 is another covalent bond or hydrogen.
  • the present invention relates to processes for preparing the matrices according to the invention in which a linker is produced on the carrier material or on the carrier material surface, which is reacted, if appropriate, with a spacer or directly with hydrazine or a hydrazine derivative.
  • the present invention relates to the use of the matrices according to the invention in microfluidic systems or microfluidic systems which contain the matrix according to the invention.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

The invention relates to novel functionalized matrices or matrix materials comprising structures of general formula Carrier - Linker - Spacer - NR3 - NR1R2 (I), methods for the production thereof, and the use thereof for isolating biomolecules.

Description

HYDRAZINMODIFIZIERTE MATRICES IHRE VERWENDUNG IN VERFAHREN ZUR ISOLIERUNG VON BIOMOLEKÜLEN HYDRAZINE-MODIFIED MATRICES THEIR USE IN PROCESSES FOR ISOLATING BIOMOLECULES
Die vorliegende Erfindung betrifft funktionalisierte Matrices und Matrixmaterialien, die Strukturen der allgemeinen Formel I aufweisenThe present invention relates to functionalized matrices and matrix materials having structures of general formula I.
Träger Linker Spacer NR3 NRiR2 (I),Support Left Spacer NR 3 NRiR 2 (I),
Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung zur Isolierung von Biomolekülen.Process for their preparation and their use for the isolation of biomolecules.
Unter Biomolekülen werden gemäß der vorliegenden Erfindung ganz allgemein Moleküle verstanden, die als Produkte einer evolutionären Selektion durch geordnetes und selektives Zusammenwirken spezifische Aufgaben für einen Organismus erfüllen und die Grundlage seiner Lebensfunktionen ausmachen [vgl. Römpp, Lexikon Biochemie und Molekularbiologie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1999].According to the present invention, biomolecules are generally understood to be molecules which, as products of evolutionary selection, perform specific tasks for an organism through ordered and selective interaction and form the basis of its vital functions [cf. Römpp, Lexicon Biochemistry and Molecular Biology, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1999].
Insbesondere werden im Sinne der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren, wie z.B. Plasmid-DNA, chromosomale DNA, Gesamt-RNA, mRNA oder RNA/DNA Hybride als Biomoleküle angesehen.In particular, for the purposes of the present invention, nucleic acids, such as e.g. Plasmid DNA, chromosomal DNA, total RNA, mRNA or RNA / DNA hybrids are considered biomolecules.
Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft die Reinigung bzw. Isolierung dieser Biomoleküle aus wässrigen Systemen, die z.B. Verunreinigungen wie Fette oder Zelltrümmer enthalten.The process of the invention relates to the purification or isolation of these biomolecules from aqueous systems which are e.g. Contain impurities such as fats or cell debris.
Daneben betrifft die vorliegende Erfindung die Isolierung oder Reinigung von ggf. artifiziellen Biomolekülen aus Reaktionsmischungen, die aus Labor- oder Industriesynthetischen Umsetzungen resultieren.In addition, the present invention relates to the isolation or purification of optionally artificial biomolecules from reaction mixtures resulting from laboratory or industrial synthetic reactions.
Die Erfindung betrifft insbesondere Matrices, die die Fähigkeit aufweisen, Nukleinsäuren bei einem pH-Wert in einem ersten Intervall zu immobilisieren und bei einem pH-Wert in einem zweiten Intervall, der sich von dem ersten pH-Wert bzw. pH- Intervall unterscheidet, wieder freizusetzen. Die Erfindung betrifft daneben Verfahren zu ihrer Herstellung deren Verwendung zum Aufreinigen bzw. Isolieren der gewünschten Nukleinsäure(n).In particular, the invention relates to matrices which have the ability to immobilize nucleic acids at a pH in a first interval and at a pH in a second interval which differs from the first pH or pH. Interval differs to release again. In addition, the invention relates to processes for their preparation, their use for purifying or isolating the desired nucleic acid (s).
Der enorme wissenschaftliche Fortschritt auf dem Gebiet der molekularen Biologie - u.a. auf dem Gebiet der Gentechnologie und der molekularen Diagnostik - hat einen hohen Bedarf an schnellen, sicheren und automatisierbaren Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren geweckt.The tremendous scientific progress in the field of molecular biology - i.a. In the field of genetic engineering and molecular diagnostics - has created a high demand for fast, safe and automatable procedures for the isolation and purification of nucleic acids.
Dabei können die biologischen Proben, die u.a. zur DNA-Identifikation oder -Analyse eingesetzt werden, aus einer Vielzahl von Quellen stammen, wie z.B. Tier- und Pflanzenzellen, Faeces, Gewebe- und Knochenproben (Biopsien) oder Blut stammen. Daneben können die Proben aber auch aus dem Boden, aus Nahrungsmitteln oder aus synthetisch hergestellten Nukleinsäuremischungen gezogen werden.The biological samples, which i.a. used for DNA identification or analysis, derived from a variety of sources, e.g. Animal and plant cells, faeces, tissue and bone samples (biopsies) or blood derived. In addition, the samples can also be drawn from the soil, from food or from synthetically produced nucleic acid mixtures.
Viele molekularbiologische Verfahren, wie die reverse Transskription, Klonierung Restriktionsanalyse, Amplifikation sowie Sequenzierung erfordern zwingend, dass die in den jeweiligen Verfahren eingesetzten Nukleinsäuren im Wesentlichen frei von Verunreinigungen sind, die die entsprechenden Reaktionsabläufe bzw. Analyseverfahren negativ beeinflussen könnten. Derartige Verunreinigungen umfassen im Allgemeinen Substanzen, die den Abbau oder die Depolymerisation einer Nukleinsäure katalysieren oder initiieren, oder Substanzen, die den Nachweis der Nukleinsäure blockieren oder die Nukleinsäure maskieren. Unerwünschte Verunreinigungen umfassen daneben makromolekulare Substanzen, wie z.B. Enzyme, Proteine, Polysaccharide oder Polynukleotide sowie Substanzen mit einem niedrigem Molekulargewicht, wie Lipide, Enzyminhibitoren oder Oligonukleotide.Many molecular biology methods, such as reverse transcription, cloning, restriction analysis, amplification and sequencing, necessarily require that the nucleic acids used in the respective methods are substantially free of impurities which could adversely affect the corresponding reaction sequences or analytical methods. Such contaminants generally include substances that catalyze or initiate the degradation or depolymerization of a nucleic acid, or substances that block the detection of the nucleic acid or mask the nucleic acid. Undesirable impurities further comprise macromolecular substances, such as e.g. Enzymes, proteins, polysaccharides or polynucleotides, as well as low molecular weight substances such as lipids, enzyme inhibitors or oligonucleotides.
Weitere Verunreinigungen sind Farbstoffe (Pigmente), Spurenelemente (Metalle) oder organische Lösungsmittel.Other impurities are dyes (pigments), trace elements (metals) or organic solvents.
Diese Anforderungen haben dazu geführt, dass sich im Laufe der Jahre im Stand der Technik bereits eine Vielzahl von Aufreinigungs- und Isolierungsverfahren etabliert hat. So kann z.B. DNA durch Aussalzen in Gegenwart von Phenol und Trichlormethan gewonnen werden. Auf der anderen Seite können DNA und RNA durch den Einsatz chaotroper Salze an mineralischen Trägern (wie z.B. Silica) oder - derivatisierten - Kieselsäureharzen gewonnen werden. Dabei hat sich hinsichtlich der Verwendung in automatisierten Verfahren insbesondere der Einsatz von magnetischen Partikeln - den sog. 'Magnetic Beads' - etabliert.These requirements have led to the fact that in the prior art has already established a variety of purification and isolation methods over the years. For example, DNA can be made by salting out in the presence of phenol and Trichloromethane be obtained. On the other hand, DNA and RNA can be obtained by the use of chaotropic salts on mineral carriers (such as silica) or derivatized silica resins. In particular, the use of magnetic particles - the so-called 'magnetic beads' - has become established with regard to use in automated processes.
Zunächst erkannten Marko et al. [Analyt. Biochem. 121 (1982) 382] sowie Vogelstein et al. [Proc. Nat. Acad. Sei. 76 (1979) 615], dass, falls die DNA in Nukleinsäure- enthaltenden Extrakten hohen Konzentrationen von Natriumiodid oder Natriumperchlorat ausgesetzt wird, nur die DNA an den mechanisch fein zerkleinerten Glass-Scintillationsröhrchen sowie zerkleinerten Glasfasermembranen bzw. Glasfiberplatten bindet, während RNA und Proteine nicht binden. Die so gebundene DNA kann im einfachsten Fall mit Wasser eluiert werden. In der Folgezeit wurden demgemäß zahlreiche Schutzrechte, die auf dieser Art der DNA-Isolierung basieren, offengelegt.First, Marko et al. [Analyte. Biochem. 121 (1982) 382] and Vogelstein et al. [Proc. Nat. Acad. Be. 76 (1979) 615] that if the DNA is exposed to high concentrations of sodium iodide or sodium perchlorate in nucleic acid-containing extracts, only the DNA binds to the mechanically finely divided glass scintillation vials and comminuted glass fiber plates, while RNA and proteins do not tie. The DNA thus bound can be eluted in the simplest case with water. Subsequently, numerous patents based on this type of DNA isolation have been disclosed.
So betrifft die Europäische Offenlegungsschrift EP-A-O 389 063 ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologischen Quelle. Gemäß dieser Methode werden die Nukleinsäuren-enthaltenden biologischen Quellen, wie Blut, Zellen, Plasma etc. in Gegenwart von chaotropen Salzen in hohen Konzentrationen aufgeschlossen. Anschließend werden die Nukleinsäuren an eine Silicaoberfläche gebunden. Die Nukleinsäuren werden danach gewaschen und eluiert.Thus, European Patent Application EP-A-0 389 063 relates to a method for isolating nucleic acids from a biological source. According to this method, the nucleic acid-containing biological sources, such as blood, cells, plasma, etc. are digested in high concentrations in the presence of chaotropic salts. Subsequently, the nucleic acids are bound to a silica surface. The nucleic acids are then washed and eluted.
Das in der U. S. -Patentschrift US-A-5,155,018 offenbarte Verfahren beschreibt die Isolierung von RNA aus biologischen Quellen, die neben RNA auch DNA sowie andere Inhaltsstoffe enthalten. Dabei wird die biologische Probe angesäuert und mit einem chaotropen Agens, wie z. B. einem Guanidiniumsalz vermischt. Der Probe werden Silikatpartikel zugegeben. Unter den gegebenen Bedingungen bindet RNA an die Silikatpartikel.The process disclosed in U.S. Patent No. 5,155,018 describes the isolation of RNA from biological sources that contain RNA as well as DNA and other ingredients. In this case, the biological sample is acidified and with a chaotropic agent such. As a guanidinium mixed. Silicate particles are added to the sample. Under the given conditions, RNA binds to the silicate particles.
Anschließend wird auch in diesem Verfahren die RNA von den Partikeln abgetrennt.Subsequently, the RNA is separated from the particles in this process as well.
Colpan et al. beschreiben in der Internationalen Patentanmeldung WO-A-95/01359 ein Verfahren zur Reinigung und Trennung von Nukleinsäuregemischen durch Adsorption der Nukleinsäure aus einer alkoholhaltigen Lösung mit hoher lonenstärke. Die Adsorptionslösung enthält neben Alkohol in einer Konzentration von 1 bis 50 Vol.-% Salze in einer Konzentration von 1 bis 10 M, wobei chaotrope Salze, wie z. B. Guanidiniumthiocyanat, Natriumperchlorat, oder Guanidiniumhydrochlorid bevorzugt werden.Colpan et al. describe in International Patent Application WO-A-95/01359 a method for purifying and separating nucleic acid mixtures by adsorption of the nucleic acid from a high ionic strength alcoholic solution. The adsorption solution contains in addition to alcohol in a concentration of 1 to 50 vol .-% salts in a concentration of 1 to 10 M, wherein chaotropic salts such. As guanidinium thiocyanate, sodium perchlorate, or guanidinium hydrochloride are preferred.
Gegenstand der WO-A-95/21849 ist des Weiteren ein Verfahren zur Trennung von doppel- und oder einzelsträngigen Nukleinsäuren aus Quellen, welche diese Nukleinsäuren enthalten. Auch in diesem Verfahren werden die Nukleinsäuren an mineralischen Trägern adsorbiert unter Bedingungen, die eine Bindung der gewünschten Nukleinsäurespezies erlaubt, während die nicht gewünschte Nukleinsäurespezies nicht an diesen mineralischen Träger bindet.The subject of WO-A-95/21849 is further a method for the separation of double and / or single-stranded nucleic acids from sources containing these nucleic acids. Also in this method, the nucleic acids are adsorbed on mineral supports under conditions that allow binding of the desired nucleic acid species while the unwanted nucleic acid species does not bind to that mineral support.
Um überwiegend einzelsträngige Nukleinsäuren an einen mineralischen Träger zu binden und somit von doppelsträngigen Nukleinsäuren zu trennen, werden die Behandlungsbedingungen für die beide Nukleinsäurespezies enthaltenden Proben mit einem wässrigen Gemisch von Salzen, insbesondere chaotrope Salze und Alkohol entsprechend eingestellt. Die nicht adsorbierte doppelsträngige Nukleinsäure kann daraufhin mit bekannten Verfahren weiter aufgereinigt oder isoliert werden.In order to bind mainly single-stranded nucleic acids to a mineral carrier and thus separate from double-stranded nucleic acids, the treatment conditions for the samples containing both nucleic acid species are adjusted accordingly with an aqueous mixture of salts, in particular chaotropic salts and alcohol. The unadsorbed double-stranded nucleic acid can then be further purified or isolated by known methods.
Weitere Verfahren werden beispielsweise in den Europäischen Offenlegungsschriften EP-A-512 767 und EP-A-515 484, in den Internationalen Patentanmeldungen WO-A- 95/13368, WO-A-96/18731 und WO-A-97/10331 sowie in den US Patentschriften US-A-4,923,978 und US-A-5,057,426 offenbart.Further processes are described, for example, in European Published Applications EP-A-512 767 and EP-A-515 484, in International Patent Applications WO-A-95/13368, WO-A-96/18731 and WO-A-97/10331 and US Pat in US-A-4,923,978 and US-A-5,057,426.
Die Europäische Offenlegungsschrift EP-A-O 707 077 beschreibt das Binden sowie die nachfolgende selektive Freisetzung von Nukleinsäure aus einem Lysat mittels eines wasserlöslichen schwach basisch reagierenden Polymers, das mit der Nukleinsäure unter spezifischen Bedingungen einen Niederschlag bildet. Dieser Niederschlag kann aus der wässrigen Lösung abgetrennt werden und die Nukleinsäure kann unter Anwendung von hohen Salzkonzentrationen sowie unter Einwirkung von starken Basen oder durch Erhitzen freigesetzt werden.European Patent Application EP-A-0 707 077 describes the binding and subsequent selective release of nucleic acid from a lysate by means of a water-soluble weakly basic polymer which precipitates with the nucleic acid under specific conditions. This precipitate can be separated from the aqueous solution and the nucleic acid can be released using high salt concentrations as well as strong bases or by heating.
Hinsichtlich aller oben beschriebener Isolierungs- bzw. Reinigungsverfahren ist mit Blick auf die biologischen Proben darauf hinzuweisen, dass Blut eine der in den größten Mengen verfügbare Quelle für DNA-Analysen ist, da Blutproben routinemäßig aus den unterschiedlichsten Gründen gezogen werden. Aufgrund der viskosen Beschaffenheit sowie wegen der äußerst proteinhaltigen Zusammensetzung, warf die Automatisierung der Isolierung von Nukleinsäuren aus diesem Ausgangsmaterial immer wieder unerwartete Schwierigkeiten auf - ein Umstand, der auch im Stand der Technik mehrfach belegt ist. Daneben erwies sich - hinsichtlich einer Automatisierung - die Handhabung großer Probenvolumina, die relativ geringe DNA-Mengen aufweisen, als schwierig.With regard to all the above-described isolation or purification processes, it should be pointed out with regard to the biological samples that blood is one of the in the The largest available source of DNA analysis is because blood samples are routinely drawn for a variety of reasons. Due to the viscous nature and the extremely protein-containing composition, the automation of the isolation of nucleic acids from this starting material repeatedly raised unexpected difficulties - a circumstance that has been repeatedly proven in the prior art. In addition, in terms of automation, handling large sample volumes that have relatively small amounts of DNA proved difficult.
Die vorliegende Patentanmeldung stellt sich somit die Aufgabe, die oben geschilderten und aus dem Stand der Technik bekannten Probleme wenigstens zum Teil einer Lösung zuzuführen. Somit zielt die vorliegende Erfindung im allgemeinsten Sinn auf den Bedarf an Materialien und Verfahren ab, die ein schnelles und effizientes Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäuren aus einer Mischung der gewünschten Nukleinsäuren mit Verunreinigungen ermöglichen.The present patent application thus has the task to supply the above-described and known from the prior art problems at least in part a solution. Thus, the present invention, in the most general sense, addresses the need for materials and methods that enable a rapid and efficient method of isolating nucleic acids from a mixture of the desired nucleic acids with contaminants.
Diese Aufgabe wird in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform durch funktionalisierte Matrices der allgemeinen Formel I sowie durch Verfahren zur Isolierung einer oder mehrerer Nukleinsäuren, wie z.B. Plasmid-DNA, chromosomaler DNA, Gesamt RNA, mRNA, oder RNA/DNA Hybride z.B. aus biologischen Proben die Verunreinigungen, wie Proteinen, Fetten, Zelltrümmern etc., enthalten, gelöst.This object is achieved in an embodiment according to the invention by functionalized matrices of the general formula I and by methods for isolating one or more nucleic acids, such as e.g. Plasmid DNA, chromosomal DNA, total RNA, mRNA, or RNA / DNA hybrids e.g. from biological samples containing the impurities, such as proteins, fats, cell debris, etc., dissolved.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierte Matrixmaterialien bzw. Matrices, bei der die Hydrazin-Partialstrukturen über einen sog. Linker an den Träger gebunden sind sowie Verfahren zur Herstellung der Matrices der allgemeinen Formel (I).In a further embodiment of the invention, the present invention relates to hydrazine or matrix materials or matrices modified with a hydrazine derivative in which the hydrazine partial structures are bonded to the support via a so-called linker and to processes for preparing the matrices of the general formula (I) ,
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ebenfalls ein Verfahren zum Isolieren von Biomolekülen - insbesondere von Nukleinsäuren - unter Verwendung der oben erwähnten mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierten Matrix, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen der mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierten Matrixmaterialien bzw. Matrices;According to a further aspect, the invention also relates to a method for isolating biomolecules - in particular of nucleic acids - using the above-mentioned hydrazine or with a hydrazine derivative-modified matrix, which comprises the following steps: (a) providing the matrix materials or matrices modified with hydrazine or with a hydrazine derivative;
(b) Vereinigen der Matrix mit einer Mischung enthaltend das zu isolierende Biomolekül bzw. enthaltend vorzugsweise die zu isolierende Nukleinsäure neben mindestens einer Verunreinigung;(b) combining the matrix with a mixture containing the biomolecule to be isolated or preferably containing the nucleic acid to be isolated in addition to at least one contaminant;
(c) Inkubieren der Matrix und der Mischung bei einem Adsorptions-pH, wobei das Biomolekül bzw. bevorzugt die gewünschte Nukleinsäure an der Matrix immobilisiert wird;(c) incubating the matrix and the mixture at an adsorption pH, wherein the biomolecule or preferably the desired nucleic acid is immobilized on the matrix;
(d) Trennen der Matrix mit dem Biomolekül bzw. mit der/den immobilisierten Nukleinsäure(n) von der Mischung;(d) separating the matrix with the biomolecule or immobilized nucleic acid (s) from the mixture;
(e) Vereinigen der Matrix mit dem Biomolekül bzw. mit der/den immobilisierten Nukleinsäure(n) mit einer Elutionslösung bei einem Desorptions-pH, wobei das/die gewünschte(n) Biomolekül(e) bzw. Nukleinsäure(n) von der Matrix desorbiert wird.(e) combining the matrix with the biomolecule or with the immobilized nucleic acid (s) with an elution solution at a desorption pH, wherein the desired biomolecule (s) or nucleic acid (s) from the matrix is desorbed.
Der Träger oder die Tägeroberfläche bzw. das ihm/ihr zugrundeliegende Trägermaterial kann aus jedem gewöhnlichen - polymeren - anorganischen oder organischen Material gebildet werden, einschließlich weichen Gel-artigen Trägern, wie Agarose, Polyacrylamid oder Cellulose oder hartem Trägermaterial, wie Polystyrol, Latexmethacrylat oder aus einem Metalloxid wie vorzugsweise Silica. Wenn das Trägermaterial durch Siliciumdioxid verkörpert wird, liegt es bevorzugt in Form von Kieselgel, festem Glas oder Diatomeenerde oder in Gestalt einer Mischung dieser Stoffe vor. - Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein Polymethacrylat als Homopolymer, aber auch als Copolymer mit weiteren Styrolmonomeren, Acrylaten oder Methacrylaten, sowie Quervernetzern, wie Divinylbenzol oder Ethylenglycol- dimethacrylat besonders bevorzugt.The support or support surface or substrate may be formed from any ordinary polymeric, inorganic or organic material, including soft gel-like supports such as agarose, polyacrylamide or cellulose or rigid support material such as polystyrene, latex methacrylate or other a metal oxide such as preferably silica. When the support material is embodied by silica, it is preferably in the form of silica gel, solid glass or diatomaceous earth or in the form of a mixture of these substances. For the purposes of the present invention, a polymethacrylate is particularly preferred as a homopolymer, but also as a copolymer with further styrene monomers, acrylates or methacrylates, as well as crosslinking agents, such as divinylbenzene or ethylene glycol dimethacrylate.
Bei der Verwendung von organischen, polymeren Materialien kann jedwedes Polymer ausgewählt werden, welches so funktionalisiert werden kann, dass die funktionellen Gruppen (Linker) - die ggf. bereits im Polymer als Precursor vorhanden sind oder, die innerhalb einer Folgereaktion noch erzeugt werden - mit Hydrazin bzw. mit dem gewünschten Hydrazinderivat unter Ausbildung einer kovalenten Bindung reagieren können.When using organic, polymeric materials, any polymer can be selected which can be functionalized such that the functional groups (linkers) - which may already be present as precursor in the polymer are or are generated within a subsequent reaction - can react with hydrazine or with the desired hydrazine derivative to form a covalent bond.
In einer weiteren Ausführungsform können die Linker ggf. mit einem Spacer - vorzugsweise unter Ausbildung einer kovalenten Bindung - reagieren, wobei das Hydrazin bzw. das Hydrazinderivat bereits an den Linker gebunden ist oder erst in einer weiteren Reaktion noch gebunden wird. Die Linker können erfindungsgemäß auch direkt mit Hydrazin selbst bzw. mit der gewünschten Hydrazinverbindung reagieren.In a further embodiment, the linkers may optionally react with a spacer, preferably with formation of a covalent bond, wherein the hydrazine or the hydrazine derivative is already bound to the linker or is only bound in a further reaction. According to the invention, the linkers can also react directly with hydrazine itself or with the desired hydrazine compound.
Träger bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen ein polymeres Grundgerüst, das durch die Polymerisation der Ausgangsmonomeren ggf. mit einem Quervernetzer und ggf. mit anderen Hilfsstoffen aufgebaut wird. Unter Hilfsstoffen werden erfindungsgemäß in erster Linie Stoffe verstanden, die zum Beispiel auf die chemischen oder physikalischen Eigenschaften des Polymers Einfluss nehmen. Dazu gehören beispielsweise Porenbildner, die die Porosität des Polymers beeinflussen oder Stoffe die dem Polymer magnetische Eigenschaften verleihen. Der Träger kann somit - je nach Wunsch - mit einem Material verbunden sein, das ein permanentes oder temporäres magnetisches Moment aufweist.In the context of the present invention, the term "carrier" essentially means a polymeric skeleton which, if appropriate, is formed by the polymerization of the starting monomers with a cross-linker and optionally with other auxiliaries. By auxiliaries are meant according to the invention primarily substances that influence, for example, on the chemical or physical properties of the polymer. These include, for example, pore formers which influence the porosity of the polymer or substances which impart magnetic properties to the polymer. The carrier may thus be connected, as desired, to a material having a permanent or temporary magnetic moment.
Die geometrische Form, in welcher das Polymer - welche die Matrix bildet - vorliegt, spielt hierbei weitestgehend keine Rolle. So können die Oberflächen beispielsweise in Eppendorff- oder Falcontubes, Mikrotiterplatten, PCR-Platten oder zum Beispiel auf Objektträgern erzeugt werden.The geometric shape in which the polymer - which forms the matrix - is present, plays this largely irrelevant. For example, the surfaces can be produced in Eppendorff or Falcontubes, microtiter plates, PCR plates or, for example, on microscope slides.
Die Matrix kann dabei auch als sog. Komposit ausgebildet sein, in dem das Matrixmaterial der allgemeinen Formel I beispielsweise in Kombination mit einem anorganischen Polymer - wie z.B. Silica (SiO2) - vorliegen kann oder auf einer metallischen Oberfläche - wie z.B. Gold oder Eisen - aufgebracht bzw. in jedweder anderen Form mit anderen Materialien kombiniert sein kann.The matrix can also be formed as a so-called composite in which the matrix material of general formula I can be present, for example, in combination with an inorganic polymer such as silica (SiO 2 ) or on a metallic surface such as gold or iron. applied or combined in any other form with other materials.
Ganz allgemein ist es möglich, für die Herstellung der Matrix, die funktionalisierten Polymere (Matrixmaterialien) auf jedwede hydrophile oder hydrophobe - ggf. vorbeschichtete - Oberfläche aufzubringen, was in einem breiten Anwendungsspektrum resultiert (u.a. in Multiwellsystemen wie z.B. Mikrotiterplatten oder mikrofluidische Systeme).In general, it is possible for the production of the matrix, the functionalized polymers (matrix materials) on any hydrophilic or hydrophobic - if necessary pre-coated surface, resulting in a wide range of applications (including in multiwell systems such as microtiter plates or microfluidic systems).
Im Sinne der Erfindung wird der Träger der Matrix durch ein Polymer gebildet, wobei der Begriff Polymer in seiner weitesten Definition verstanden wird. Erfindungsgemäß verkörpern Polymere im Sinne der vorliegenden Erfindung Polymerisate, Polykondensate bzw. Polyaddukte. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Träger aus Homopolymeren, Copolymeren, Terpolymeren usw. oder aus Mischungen verschiedener polymerer Bestanteile aufgebaut sein. Die ggf. verschiedenen Polymere können - falls dies gewünscht ist oder zweckmäßig erscheint - untereinander mit einem sog. Crosslinker (Quervernetzer) vernetzt sein.For the purposes of the invention, the support of the matrix is formed by a polymer, the term polymer being understood in its broadest definition. According to the invention, polymers in the context of the present invention embody polymers, polycondensates or polyadducts. According to the present invention, the carrier may be composed of homopolymers, copolymers, terpolymers, etc. or of mixtures of various polymeric constituents. The optionally different polymers can - if desired or expedient - be crosslinked with each other with a so-called. Crosslinker (cross-linker).
Beide Trägermaterialien - organisches wie auch anorganisches Trägermaterial - können dabei u.a. in Form von Partikeln, massiven Teilen - wie beispielsweise Gefäßwände von Reaktionsgefäßen -, Membranen oder in Form von Vliesen bzw. Geweben vorliegen.Both support materials - organic as well as inorganic support material - can u.a. in the form of particles, massive parts - such as vessel walls of reaction vessels -, membranes or in the form of nonwovens or tissues.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, Hydrazin - oder ein entsprechendes Derivat des Hydrazins - an ein (wasser)lösliches Polymer zu binden, wie es beispielsweise in der bereits eingangs erwähnten Europäischen Patentanmeldung EP-A-O 707 077 offenbart ist.Another possibility is to bind hydrazine - or a corresponding derivative of the hydrazine - to a (water) soluble polymer, as disclosed for example in the already mentioned European Patent Application EP-A-0 707 077.
Die mit Hydrazin bzw. mit einem oder mehrerer seiner Derivate modifizierten Oberflächen der Matrices zeigen somit prinzipiell folgenden Aufbau, wobei - wie bereits erwähnt - der Spacer ggf. entfallen kann, d.h., dass er lediglich eine Einfachbindung verkörpert:The surfaces of the matrices modified with hydrazine or with one or more of its derivatives thus show in principle the following structure, wherein - as already mentioned - the spacer may possibly be omitted, that is to say that it represents only a single bond:
Träger Linker Spacer NR3 NRiR2 (I)Support Left Spacer NR 3 NRiR 2 (I)
R3 kann dabei auch mit dem Spacer oder ggf. direkt mit dem Linker eine weitere Bindung bzw. eine Doppelbindung ausbildenR 3 can also form with the spacer or optionally directly with the linker another bond or a double bond
Träger Linker Spacer N NRi R2 Darin stellt die Trägeroberfläche einen Träger aus einem organischen oder anorganischen Material - vorzugsweise einem anorganischen oder organischen Polymeren - dar, die ggf. noch andere funktionelle Gruppen aufweisen kann.Support Left Spacer N NRi R 2 Therein, the support surface is a support of an organic or inorganic material - preferably an inorganic or organic polymer - which may optionally have other functional groups.
Der Linker verkörpert im einfachsten Fall eine Einfachbindung, kann jedoch in Abhängigkeit von der gewählten Ausgangsfunktionalität eine bis zu sechsgliedrige Alkylenbrücke, die neben - ggf. mit Halogen-, Hydroxy-, Amino- und Thiolgruppen - substituierten Methylengruppen, Partialstrukturen ausgewählt aus der Gruppe folgender Strukturelemente, umfassend -O-, -NH-, -S-, -C(=O)-, -C(=O)-C(=O)-, - C(=O)-O-, -C(=O)-C(=O)-O-, -C(=S)-O-, -C(=O)-S-, -C(=O)-N-, -NH-C(=O)-NH- enthält.The linker embodies in the simplest case a single bond, but depending on the selected starting functionality one up to six-membered alkylene bridge, in addition to - optionally substituted with halogen, hydroxyl, amino and thiol groups - substituted methylene, partial structures selected from the group of the following structural elements comprising -O-, -NH-, -S-, -C (= O) -, -C (= O) -C (= O) -, - C (= O) -O-, -C (= O) -C (= O) -O-, -C (= S) -O-, -C (= O) -S-, -C (= O) -N-, -NH-C (= O) -NH- contains.
Der Spacer stellt im einfachsten Fall eine Einfach- oder Doppelbindung, eine 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthaltende Alkylenbrücke, die ggf. durch Sauerstoff- oder Schwefelatome oder auch Aminogruppen unterbrochen sein kann, dar und die ggf. eine oder mehrere Carbonyl- oder Carboxylgruppen aufweisen kann. Als Beispiele seien Dialdehyd-, Polyaldehyd-, Dicarboxy- oder Polycarboxy-Partialstrukturen genannt. Daneben seien Ethylenglykol-diglycidylether-, Glycerol-diglycidylether-, Glycerol-triglycidylether-strukturen neben Ethylenglykol, Polyethylenglykol, Propylenglykol und Polpropylenglykol sowie deren Derivate als Spacer genannt.The spacer is in the simplest case a single or double bond, an alkylene bridge containing 1 to 12 carbon atoms, which may optionally be interrupted by oxygen or sulfur atoms or amino groups, and which may optionally have one or more carbonyl or carboxyl groups. Examples which may be mentioned are dialdehyde, polyaldehyde, dicarboxy or polycarboxy partial structures. In addition, ethylene glycol diglycidyl ether, glycerol diglycidyl ether, glycerol triglycidyl ether structures in addition to ethylene glycol, polyethylene glycol, propylene glycol and polypropylene glycol and their derivatives may be mentioned as spacers.
An den ggf. vorhandenen Spacer ist über eine kovalente Einfach- oder über eine Doppelbindung die Hydrazin-Partialstruktur gebunden, in der die Substituenten R1, R2 und ggf. R3 unabhängig voneinander Wasserstoff, CrC6-Alkyl, C3-C6-Alkenyl, C3- C-6-Alkinyl, einen höheren Alkylrest, einen Cycloalkylrest oder einen Aryl- bzw. Aralkylrest bedeuten können.The optionally present spacer hydrazine partial structure is a covalent single bond or a double bound, in which the substituents R 1, R 2 and optionally R 3 are independently hydrogen, CrC 6 alkyl, C 3 -C 6 Alkenyl, C 3 -C 6 -alkynyl, a higher alkyl radical, a cycloalkyl radical or an aryl or aralkyl radical.
Erfindungsgemäß kommt den oben genannten Substituenten - sofern nicht anders angegeben - im Sinne der vorliegenden Erfindung folgende Bedeutung zu:According to the invention, the abovementioned substituents, unless stated otherwise, have the following meaning in the context of the present invention:
CrC6-Alkyl - im Allgemeinen auch nur als „Alkyl" bezeichnet - steht im allgemeinen für einen monovalenten, verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatom(en), der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) - vorzugsweise Fluor - oder einer oder mehreren Hydroxygruppe(n) substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können. Als Beispiele seien folgende unsubstituierten Kohlenwasserstoffreste genannt:C 1 -C 6 -alkyl, also generally referred to as "alkyl", is generally a monovalent, branched or unbranched hydrocarbon radical having 1 to 6 carbon atoms, optionally with one or more halogen atoms - preferably fluorine or - one or more hydroxy group (s) may be substituted, the same or different could be. Examples which may be mentioned are the following unsubstituted hydrocarbon radicals:
Methyl, Ethyl, Propyl, 1 -Methylethyl (/so-Propyl), Butyl, 1 -Methylpropyl, 2- Methylpropyl, 1 ,1 -Dimethylethyl, n-Pentyl, 1 -Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3- Methylbutyl, 1 ,1 -Dimethylpropyl, 1 ,2-Dimethylpropyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1 - Ethylpropyl, Hexyl, 1 -Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1 ,1 -Dimethylbutyl, 1 ,2-Dimethylbutyl, 1 ,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3- Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1 -Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1 ,1 ,2-Trimethylpropyl, 1 ,2,2-Trimethylpropyl, 1 -Ethyl-1 -methylpropyl und 1 -Ethyl-2-methyl-propyl.Methyl, ethyl, propyl, 1-methylethyl (/ so-propyl), butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1, 1-dimethylethyl, n-pentyl, 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, 1, 1-dimethylpropyl, 1, 2-dimethylpropyl, 2,2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, hexyl, 1-methylpentyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl, 4-methylpentyl, 1, 1-dimethylbutyl, 1, 2-dimethylbutyl, 1,3-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl, 1-ethylbutyl, 2-ethylbutyl, 1, 1, 2-trimethylpropyl, 1, 2,2-trimethylpropyl, 1 - Ethyl 1-methylpropyl and 1-ethyl-2-methyl-propyl.
Entsprechendes gilt für andere - beispielsweise kleinere oder größere - Alkylreste, wie z.B. CrC-3-Alkyl oder C4-C6-Alkyl bzw. analog für höhere Alkylreste, welche für einen monovalenten verzweigten oder unverzweigten C7-C2o-Alkyrest der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) - vorzugsweise Fluor - substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können, stehen können. Als Beispiele seien folgende bevorzugte unsubstituierten Kohlenwasserstoffreste genannt: verzweigtes oder unverzweigtes Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tetradecyl, Hexadecyl, Dodecadecyl und Eicosyl.The same applies to other - for example, smaller or larger - alkyl radicals, such as CrC- 3- alkyl or C 4 -C 6 alkyl or analogously for higher alkyl radicals, which is a monovalent branched or unbranched C 7 -C 2 o-alky optionally with one or more halogen atom (s) - preferably fluorine - may be substituted, which may be the same or different, may be. Examples which may be mentioned are the following preferred unsubstituted hydrocarbon radicals: branched or unbranched heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tetradecyl, hexadecyl, dodecadecyl and eicosyl.
Halogenalkyl steht für die entsprechenden CrC6- oder die höheren Alkylreste, die mit einem oder mehreren Halogenatom(en) - unabhängig voneinander gleich oder verschieden - substituiert sein können.Haloalkyl represents the corresponding C 1 -C 6 - or the higher alkyl radicals which may be substituted by one or more halogen atoms - independently of one another or different.
C3-C6-Alkenyl steht im allgemeinen für einen verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 3 bis 6 Kohlenstoffatom(en), mit einer oder ggf. mehreren Doppelbindungen, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) - vorzugsweise Fluor - substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können. Als Beispiele seien folgende Kohlenwasserstoffreste genannt:C 3 -C 6 alkenyl is generally a branched or unbranched hydrocarbon radical having 3 to 6 carbon atom (s), with one or more double bonds, which may be optionally substituted with one or more halogen atom (s) - preferably fluorine - substituted that can be the same or different from each other. As examples, the following hydrocarbon radicals may be mentioned:
2-Propenyl (AIIyI), 2-Butenyl, 3-Butenyl, 1 -Methyl-2-propenyl, 2-Methyl-2-propenyl, 2- Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1 -Methyl-2-butenyl, 2-Methyl-2-butenyl, 3-Methyl- 2-butenyl, 1 -Methyl-3-butenyl, 2-Methyl-3-butenyl, 3-Methyl-3-butenyl, 1 ,1 - Dimethyl- 2-propenyl, 1 ,2-Dimethyl-2-propenyl, 1 -Ethyl-2-propenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4- Hexenyl, 5-Hexenyl, 1 -Methyl-2-pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl, 3- Methyl-2-pentenyl, 4-Methyl-2-pentenyl, 1 -Methyl-3-pentenyl, 2-Methyl-3-pentenyl, 3-Methyl-3-pentenyl, 4-Methyl-3-pentenyl, 1 -Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-pentenyl, 4-Methyl-4-pentenyl, 1 ,1 -Dimethyl-2-butenyl, 1 ,crotyl1 -Dimethyl-2-butenyl, 1 ,1 - Dimethyl-3-butenyl, 1 ,2- Dimethyl-2-butenyl, 1 ,2-Dimethyl-3-butenyl, 1 ,3-Dimethyl-2-butenyl, 1 ,3-Dimethyl-3- butenyl, 2,2-Dimethyl-3-butenyl, 2,3-Dimethyl-2-Butenyl, 2,3-Dimethyl-3-butenyl, 1 - Ethyl-2-butenyl, 1 -Ethyl-3-butenyl, 2-EthyM -butenyl, 2- Ethyl-2-butenyl, 2-Ethyl-3- butenyl, 1 ,1 ,2-Trimethyl-2-propenyl, 1 -Ethyl-1 -methyl-2-propenyl und 1 -Ethyl-2- methyl-2-propenyl.2-propenyl (AIIyI), 2-butenyl, 3-butenyl, 1-methyl-2-propenyl, 2-methyl-2-propenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 4-pentenyl, 1-methyl-2-butenyl , 2-methyl-2-butenyl, 3-methyl-2-butenyl, 1-methyl-3-butenyl, 2-methyl-3-butenyl, 3-methyl-3-butenyl, 1,1-dimethyl 2-propenyl, 1, 2-dimethyl-2-propenyl, 1-ethyl-2-propenyl, 2-hexenyl, 3-hexenyl, 4-hexenyl, 5-hexenyl, 1-methyl-2-pentenyl, 2-methyl 2-pentenyl, 3-methyl-2-pentenyl, 4-methyl-2-pentenyl, 1-methyl-3-pentenyl, 2-methyl-3-pentenyl, 3-methyl-3-pentenyl, 4-methyl-3 pentenyl, 1-methyl-4-pentenyl, 3-methyl-4-pentenyl, 4-methyl-4-pentenyl, 1, 1-dimethyl-2-butenyl, 1, crotyl-1-dimethyl-2-butenyl, 1, 1 - Dimethyl 3-butenyl, 1, 2-dimethyl-2-butenyl, 1, 2-dimethyl-3-butenyl, 1, 3-dimethyl-2-butenyl, 1, 3-dimethyl-3-butenyl, 2,2- Dimethyl-3-butenyl, 2,3-dimethyl-2-butenyl, 2,3-dimethyl-3-butenyl, 1-ethyl-2-butenyl, 1-ethyl-3-butenyl, 2-ethylm-butenyl, 2- Ethyl 2-butenyl, 2-ethyl-3-butenyl, 1, 1, 2-trimethyl-2-propenyl, 1-ethyl-1-methyl-2-propenyl and 1-ethyl-2-methyl-2-propenyl.
C3-C6-Alkinyl steht im allgemeinen für einen verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 3 bis 6 Kohlenstoffatom(en), mit einer oder ggf. mehreren Dreifachbindungen, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) - vorzugsweise Fluor - substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können. Als Beispiele seien folgende Kohlenwasserstoffreste genannt:C 3 -C 6 -alkynyl generally represents a branched or unbranched hydrocarbon radical having 3 to 6 carbon atoms, with one or optionally several triple bonds, which may optionally be substituted by one or more halogen atom (s) - preferably fluorine that can be the same or different from each other. As examples, the following hydrocarbon radicals may be mentioned:
2-Propinyl (Propargyl), 2-Butinyl, 3-Butinyl, 1 -Methyl-2-propinyl, 2-Methyl-2-propinyl, 2-Pentinyl, 3-pentinyl, 4-Pentinyl, 1 -Methyl-2-butinyl, 2-Methyl-2-butinyl, 3-Methyl-2- butinyl, 1 -Methyl-3-butinyl, 2-Methyl-3-butinyl, 3-Methyl-3-butinyl, 1 ,1 -Dimethyl-2- propinyl, 1 ,2-Dimethyl-2-propinyl, 1 -Ethyl-2-propinyl, 2-Hexinyl, 3-Hexinyl, 4-Hexinyl, 5-Hexinyl, 1 -Methyl-2-pentinyl, 2-Methyl-2-pentinyl, 3-Methyl-2-pentinyl, 4-Methyl-2- pentinyl, 1 -Methyl-3-pentinyl, 2-Methyl-3-pentinyl, 3-Methyl-3-pentinyl, 4-Methyl-3- pentinyl, 1 -Methyl-4-pentinyl, 3-Methyl-4-pentinyl, 4-Methyl-4-pentinyl, 1 ,1 -Dimethyl- 2-butinyl, 1 ,1 -Dimethyl-2-butinyl, 1 ,1 -Dimethyl-3-butinyl, 1 ,2-Dimethyl-2-butinyl, 1 ,2- Dimethyl-3-butinyl, 1 ,3-Dimethyl-2-butinyl, 1 ,3-Dimethyl-3-butinyl, 2,2-Dimethyl- 3- butinyl, 2,3-Dimethyl-2-butinyl, 2,3-Dimethyl-3-butinyl, 1 -Ethyl-2-butinyl, 1 -Ethyl-3- butinyl, 2-Ethyl-1 -butinyl, 2-Ethyl-2-butinyl, 2-Ethyl-3-butinyl, 1 ,1 ,2-Trimethyl-2- propinyl, 1 -Ethyl-1 -methyl-2-propinyl und 1 -Ethyl-2-methyl-2-propinyl.2-propynyl (propargyl), 2-butynyl, 3-butynyl, 1-methyl-2-propynyl, 2-methyl-2-propynyl, 2-pentynyl, 3-pentynyl, 4-pentynyl, 1-methyl-2-butynyl , 2-methyl-2-butynyl, 3-methyl-2-butynyl, 1-methyl-3-butynyl, 2-methyl-3-butynyl, 3-methyl-3-butynyl, 1, 1-dimethyl-2-propynyl , 1, 2-dimethyl-2-propynyl, 1-ethyl-2-propynyl, 2-hexynyl, 3-hexynyl, 4-hexynyl, 5-hexynyl, 1-methyl-2-pentynyl, 2-methyl-2-pentynyl , 3-methyl-2-pentynyl, 4-methyl-2-pentynyl, 1-methyl-3-pentynyl, 2-methyl-3-pentynyl, 3-methyl-3-pentynyl, 4-methyl-3-pentynyl, 1 Methyl 4-pentynyl, 3-methyl-4-pentynyl, 4-methyl-4-pentynyl, 1,1-dimethyl-2-butynyl, 1,1-dimethyl-2-butynyl, 1,1-dimethyl-3 -butynyl, 1, 2-dimethyl-2-butynyl, 1, 2-dimethyl-3-butynyl, 1, 3-dimethyl-2-butynyl, 1, 3-dimethyl-3-butynyl, 2,2-dimethyl-3 butynyl, 2,3-dimethyl-2-butynyl, 2,3-dimethyl-3-butynyl, 1-ethyl-2-butynyl, 1-ethyl-3-butynyl, 2-ethyl-1-butynyl, 2-ethyl 2-butynyl, 2-ethyl-3-butynyl, 1, 1, 2-trimethyl-2-propynyl, 1-ethyl-1-m ethyl 2-propynyl and 1-ethyl-2-methyl-2-propynyl.
Alkylen steht im Allgemeinen für einen unverzweigten, divalenten Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen oder für einen verzweigten, divalenten Kohlenwasserstoffrest von 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie z.B. 2- Methylpropylen, Pentylen und ähnliche.Alkylene is generally an unbranched, divalent hydrocarbon radical having 1 to 12 carbon atoms or a branched, divalent hydrocarbon radical of 3 to 6 carbon atoms, such as 2-methylpropylene, pentylene and the like.
Entsprechendes gilt für die ungesättigten C3-C6-Alkenylen- und C3-C6- Alkinylenbrücken.The same applies to the unsaturated C 3 -C 6 -alkenylene and C 3 -C 6 -alkynylene bridges.
Cycloalkyl steht - sofern nicht anders definiert - für einen gesättigten monovalenten cyclischen Kohlenwasserstoffrest, der drei bis acht Kohlenstoffatome aufweisen und der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) - vorzugsweise Fluor - oder einer oder mehreren Hydroxygruppe(n) substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können. Als Beispiele seien genannt: Cyclopropyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl oder Cyclooctyl. Dabei kann die Kohlenstoffkette durch ein oder mehrere Heteroatome - wie z.B. Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel - unterbrochen sein. Als Beispiele seien genannt 1 ,4- Dioxixan (Dioxan), 2,5-Dihydorfuran, Tetrahydrofuran, γ-Pyran, 2H-1 ,3-Dioxol, Tetrahydropyrrol, 2,5-Dihydropyrrol, Piperidin, Piperazin, Tetrahydrothiophen, Morpholin, 1 ,2-Oxathiolan, 1 ,3-Thiazol, 1 H-4,1 ,2-Thiadiazin, 1 ,2-Oxathiepan, γ- Thiopyran, 1 ,4-Thiazixin (1 ,4-Thiazin).Cycloalkyl is, unless defined otherwise, a saturated monovalent cyclic hydrocarbon radical having from three to eight carbon atoms and which may be optionally substituted with one or more halogen atom (s) - preferably fluorine - or one or more hydroxy group (s), among themselves may be the same or different. Examples include: cyclopropyl, cyclohexyl, cycloheptyl or cyclooctyl. The carbon chain may be replaced by one or more heteroatoms - e.g. Nitrogen, oxygen or sulfur - be interrupted. Examples which may be mentioned are 1, 4-dioxixane (dioxane), 2,5-dihydrofuran, tetrahydrofuran, γ-pyran, 2H-1,3-dioxole, tetrahydropyrrole, 2,5-dihydropyrrole, piperidine, piperazine, tetrahydrothiophene, morpholine, 1 , 2-oxathiolane, 1, 3-thiazole, 1 H-4,1, 2-thiadiazine, 1, 2-oxathiepan, γ-thiopyran, 1, 4-thiazixin (1, 4-thiazine).
Als bevorzugte Beispiele für sauerstoffhaltige, heterocyclische und Hydroxi- substituierte cyclische Systeme seien u.a. beispielsweise die Kohlenhydrate (Pentosen wie auch Hexosen) angeführt, wie z.B.: Arabinosen, Xylosen oder Ribosen bzw. Glucosen, Mannosen, Galactosen, Fructosen oder Sorbosen.As preferred examples of oxygen-containing, heterocyclic and hydroxy substituted cyclic systems may be mentioned i.a. for example, the carbohydrates (pentoses as well as hexoses), such as: arabinoses, xyloses or riboses or glucoses, mannoses, galactoses, fructoses or sorboses.
Aryl steht im allgemeinen für einen monovalenten monocyclischen oder bicyclischen aromatischen Substituenten mit 6 bis 10 Ringatomen, der ggf. unabhängig voneinander mit einem oder mehreren, vorzugsweise mit ein oder zwei Substituenten ausgewählt aus der Gruppe enthaltend CrC6-Alkyl, CrC6-Halogenalkyl, CrC6- Alkenyl, d-C6-Alkinyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Halogen, Cyano, Nitro, Acyloxy, Amino, mono-alkylsubstitutiertes Amin, di-alkylsubstituiertes Amin, Acylamino, Hydroxylamino, Amidino, Guanidino, -OR [worin R Wasserstoff, CrC6- Alkyl, d-Ce-Halogenalkyl, C3-C6-Alkenyl, C3-C6-Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl], - S(O)nR [worin eine ganze Zahl 0, 1 oder 2 bedeuten kann und R Wasserstoff, CrC6- Alkyl, d-Ce-Halogenalkyl, C3-C6-Alkenyl, C3-C6-Alkinyl, Aycloalkyl, Cycloalkylalkyl bedeuten kann], -C(O)R [worin R Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, CrC6- Halogenalkyl bedeuten kann], -COOR [worin R Wasserstoff, CrC6-Alkyl, CrC6- Halogenalkyl, C3-C6-Alkenyl, C3-C6-Alkinyl, Cycloalkyl, CrC6-Halogenalkyl bedeuten kann], -(Alkylen)COOR [worin R Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, CrC6- Halogenalkyl bedeuten kann], -CONR1R" oder -(Alkylen)CONR'R" [worin R' bzw. R" unabhängig voneinander Wasserstoff, CrC6-Alkyl, CrC6-Halogenalkyl, C3-C6- Alkenyl, C3-C6-Alkinyl, Cycloalkyl, Halogenalkyl bedeuten können].Aryl in general represents a monovalent monocyclic or bicyclic aromatic substituent having from 6 to 10 ring atoms which is optionally substituted independently with one or more, preferably with one or two substituents selected from the group consisting of -C 6 alkyl, -C 6 -haloalkyl, CrC 6 - alkenyl, C 1 -C 6 alkynyl, heteroalkyl, cycloalkyl, cycloalkylalkyl, halogen, cyano, nitro, acyloxy, amino, monoalkyl-substituted amine, di-alkyl-substituted amine, acylamino, hydroxylamino, amidino, guanidino, -OR [wherein R is hydrogen, -C 6 - alkyl, d-Ce-haloalkyl, C 3 -C 6 alkenyl, C 3 -C 6 alkynyl, cycloalkyl, cycloalkylalkyl] - can mean S (O) nR [where an integer of 0, 1 or 2 and R is hydrogen, -C 6 - alkyl, d-Ce-haloalkyl, C 3 -C 6 alkenyl, C 3 -C 6 alkynyl, Aycloalkyl, cycloalkylalkyl can mean], -C (O) R [where R is hydrogen, alkyl, alkenyl, cycloalkyl, -C 6 - haloalkyl can mean], -COOR [wherein R is hydrogen, -C 6 alkyl, -C 6 - haloalkyl, C 3 -C 6 -alkenyl, C 3 -C 6 alkynyl, cycloalkyl, CrC may mean 6 haloalkyl], - (alkylene) COOR [wherein R represents hydrogen, alkyl, alkenyl, cycloalkyl, -C 6 - haloalkyl can mean], -CONR 1 R "or - (alkylene) CONR'R" [wherein R 'and R "are independently hydrogen, -C 6 alkyl, -C 6 haloalkyl, C 3 -C 6 - alkenyl, C 3 -C 6 alkynyl, cycloalkyl, May mean haloalkyl].
Aryl steht - sofern nicht anders angegeben - auch für einen aromatischen ein- oder mehrkernigen Rest mit 4 bis 22 C-Kohlenstoffatomen, der ein oder zwei Heteroatome enthalten kann. Als Beispiele seien genannt: Naphthyl, Anthracyl bzw. Pyrolyl, Furanyl, Thiophenyl, Pyridinyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl oder Pyrazinyl.Aryl is - unless stated otherwise - also an aromatic mononuclear or polynuclear radical having 4 to 22 carbon atoms, which may contain one or two heteroatoms. Examples include: naphthyl, anthracyl or pyrolyl, furanyl, thiophenyl, pyridinyl, pyridazinyl, pyrimidinyl or pyrazinyl.
Aralkyl bedeutet im Sinne der vorstehenden Definition einen ein- oder mehrkernigen Arylrest - wie oben definiert -, der über eine CrC6-Alkylen-, C3-C6-Alkenylen- oder eine C3-C6- Alkinylenbrücke, für welche die Definition der CrC6-Alkyl-, C3-C6-Alkenyl und C3-C6- Alkinylgruppen - wie oben ausgeführt - entsprechend gelten, an die Hydrazin-Partialstruktur gebunden ist. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird die Benzylgruppe bevorzugt.In the sense of the foregoing definition aralkyl means a mono- or polycyclic aryl radical - as defined above - via a -C 6 alkylene, C 3 -C 6 alkenylene or C 3 -C 6 - Alkinylenbrücke for which the definition the CrC 6 alkyl, C 3 -C 6 alkenyl and C 3 -C 6 alkynyl groups - as stated above - are correspondingly bonded to the hydrazine partial structure. For the purposes of the present invention, the benzyl group is preferred.
Halogen steht - sofern nicht anders angegeben - für Fluor, Chlor, Brom oder lod, vorzugsweise jedoch für Fluor und Chlor.Halogen is - unless otherwise stated - fluorine, chlorine, bromine or iodine, but preferably fluorine and chlorine.
Die erfindungsgemäßen mit Hydrazin bzw. mit seinen Abkömmlingen derivatisierten Trägeroberflächen lassen sich in Abhängigkeit von der chemischen Funktionalität der auf der Oberfläche befindlichen Gruppen in Analogie zu bereits aus dem Stand der Technik wohlbekannten Verfahren zu den gewünschten Produkten umsetzen.The support surfaces of the invention derivatized with hydrazine or with its derivatives can be converted into the desired products, depending on the chemical functionality of the groups present on the surface, in analogy to methods already well known in the art.
Zunächst lassen sich die für die Derivatisierung des Trägers benötigten Hydrazinderivate mit aus dem Stand der Technik bekannten Standartmethoden leicht herstellen. So liefert die Umsetzung von Hydrazin mit Alkylhalogeniden [Alkyl-X] (X=Halogen) und -Sulfaten (X=Sulfat) im Normalfall das unsymmetrische bis-Substitutionsprodukt [H2N-N(Alkyl)3 +X" bzw. H2N-N(Alkyl)2].First, the hydrazine derivatives required for the derivatization of the carrier can be readily prepared by standard methods known in the art. Thus, the reaction of hydrazine with alkyl halides [alkyl-X] (X = halogen) and sulfates (X = sulfate) normally gives the asymmetric bis-substitution product [H 2 NN (alkyl) 3 + X " or H 2 NN ( Alkyl) 2 ].
Um auf der anderen Seite Monoalkylhydrazine zu erhalten, kann beispielsweise von Benzaldazin ausgegangen werden, das in einer möglichen Alternative mit einem Alkylsulfat zu dem entsprechenden Monoalkylsalz umgesetzt werden kann. Nach hydrolytischer Spaltung kann das gewünschte Hydrazinderivat vom Typ H2N- NH(Alkyl) leicht zugänglich gemacht werden.On the other hand, in order to obtain monoalkylhydrazines, it is possible to start, for example, from benzaldazine, which in a possible alternative can be reacted with an alkylsulfate to give the corresponding monoalkylsalt. After hydrolytic cleavage, the desired hydrazine derivative of type H 2 N-NH (alkyl) can be readily made available.
Symmetrisch substituierte Hydrazinderivate können unter Zuhilfenahme von Schutzgruppen ebenfalls auf unkomplizierte Weise synthetisiert werden. So lassen sich z.B. über zweifach Acyl-geschützte Hydrazinderivate vom Typ H(Acyl)N- NH(Acyl) durch Umsetzung mit Dimethylsulfat und nachfolgender saurer Verseifung das entsprechende symmetrisch substituierte Dimethylhydrazin herstellen.Symmetrically substituted hydrazine derivatives can also be synthesized in an uncomplicated manner with the aid of protective groups. Thus, for example, via doubly acyl-protected hydrazine derivatives of the type H (acyl) N-NH (acyl) by reaction with dimethyl sulfate and subsequent acid saponification to produce the corresponding symmetrically substituted dimethylhydrazine.
Daneben erschließt die Reduktion von Dialkylnitrosaminen vom Typ RaRbN-NO einen weiteren einfachen Zugang zur Herstellung von unsymmetrisch substituierten Hydrazinderivaten.In addition, the reduction of dialkylnitrosamines of type R a R b N-NO opens up a further easy access to the preparation of unsymmetrically substituted hydrazine derivatives.
Alle oben aufgezeigten Synthesewege sind - neben zahlreichen anderen - aus dem Stand der Technik wohlbekannt und verkörpern allgemeines Fachwissen [s. z.B. : R. C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Weinheim 1989].All of the above-mentioned synthetic routes are - among many others - well known in the art and embody general knowledge [s. e.g. : R.C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Weinheim 1989].
Die so hergestellten Hydrazinderivate lassen sich mit einer Vielzahl von funktionellen Gruppen, die der Träger per se schon aufweisen kann oder, die in einem eigenem Reaktionsschritt auf der Trägeroberfläche erzeugt werden - bzw. die über den Spacer eingebaut werden -, umsetzen.The hydrazine derivatives thus prepared can be reacted with a multiplicity of functional groups which the carrier can already have per se or which are produced in a separate reaction step on the carrier surface or which are incorporated via the spacer.
So führt die Umsetzung von Carbonylfunktionen mit geeignet substituierten Hydrazinderivaten - wie aus dem Stand der Technik ebenfalls wohlbekannt ist - zu den entsprechenden Hydrazonen, die - sofern gewünscht - in einem weiteren Schritt nochmals derivatisiert werden können. Des Weiteren ist es möglich, geeignete Carboxylfunktionen - ggf. in Gegenwart eines Kopplungsreagenzes - wie z.B. EDC [N-Ethyl-N'-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid], HBTU [2-(1 H-Benzotriazol-1 -yl)- 1 ,1 ,3,3-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat] oder TSTU [N,N,N',N'-Tetramethyl- O-(succinimidyl)uronium-Tetrafluoroborat] - mit Hydrazin bzw. mit dessen Derivaten umzusetzen.Thus, the implementation of carbonyl functions with suitably substituted hydrazine derivatives - as well known from the prior art - to the corresponding hydrazones, which - if desired - can be derivatized again in a further step. Furthermore, it is possible to use suitable carboxyl functions-optionally in the presence of a coupling reagent-such as EDC [N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride], HBTU [2- (1H-benzotriazol-1-yl ) - 1, 1, 3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate] or TSTU [N, N, N ', N'-tetramethyl-O- (succinimidyl) uronium tetrafluoroborate] - implement with hydrazine or with its derivatives.
Daneben können von vornherein aktivierte Carboxylgruppen auf dem Trägermaterial eingesetzt werden - wie z.B. Säurehalogenide oder -anhydride oder Carbonylimidazole.In addition, activated carboxyl groups can be used on the support material from the outset - e.g. Acid halides or anhydrides or carbonylimidazoles.
Weitere Möglichkeiten umfassen den Einsatz von Tresylgruppen, Azlacton- und Pentafluorphenol-aktivierten Trägern. Dabei wird der Einsatz aktivierter Carboxylgruppen erfindungsgemäß bevorzugt.Other possibilities include the use of tresyl groups, azlactone and pentafluorophenol activated carriers. The use of activated carboxyl groups is preferred according to the invention.
Im Sinne der Erfindung werden Epoxidgruppen als funktionelle Gruppen für die Umsetzung mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat besonders bevorzugt.For the purposes of the invention, epoxide groups are particularly preferred as functional groups for the reaction with hydrazine or with a hydrazine derivative.
Bei der Umsetzung mit Hydrazin bzw. mit Hydrazinderivaten tritt unter Ausbildung einer Hydroxylfunktion sowie einer kovalenten Bindung zur Hydrazin-Partialstruktur eine Öffnung des Epoxidrings ein.During the reaction with hydrazine or with hydrazine derivatives, an opening of the epoxide ring occurs, forming a hydroxyl function and a covalent bond to the hydrazine partial structure.
Die oben erwähnten funktionellen Gruppen können dabei Partialstrukturen des Linkers - vorzugsweise wenn der Spacer lediglich eine kovalente Einfachbindung oder eine Doppelbindung verkörpert - darstellen, oder aber sie verkörpern ihrerseits Partialstrukturen des Spacers und werden somit erst nach der Einführung des Spacers verfügbar.The above-mentioned functional groups may represent partial structures of the linker - preferably if the spacer embodies only a single covalent bond or a double bond - or they themselves represent partial structures of the spacer and thus become available only after the introduction of the spacer.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zur Aufreinigung bzw. Isolierung von Nukleinsäuren beinhaltend: das Bereitstellen der erfindungsgemäßen mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierten Matrix, die in dem Verfahren eingesetzt werden soll. Der nachfolgende Immobilisierungsschritt besteht in einem Zusammenführen der Matrix mit der Mischung, welche die zu isolierende Nukleinsäure neben mindestens einer Verunreinigung enthält, bei einem ersten pH- Wert unter Bedingungen, unter denen die gewünschte Nukleinsäure an der Matrix adsorbiert wird, trennen der Matrix mit der immobilisierten Nukleinsäure von der Mischung und desorbieren der Nukleinsäure bei einem Desorptions-pH, wobei die gewünschte(n) Nukleinsäure(n) von der Matrix desorbiert wird (werden).The present invention furthermore relates to a process for purifying or isolating nucleic acids, comprising: providing the hydrazine or hydrazine derivative-modified matrix according to the invention which is to be used in the process. The subsequent immobilization step consists in combining the matrix with the mixture containing the nucleic acid to be isolated in addition to at least one contaminant at a first pH. Under conditions in which the desired nucleic acid is adsorbed to the matrix, the matrix separates with the immobilized nucleic acid from the mixture and desorbs the nucleic acid at a desorption pH, desorbing the desired nucleic acid (s) from the matrix (become).
Entsprechend dem ersten Teilschritt des oben beschriebenen Verfahrens - nämlich der Adsorption der Nukleinsäure an die mit Hydrazin und/oder mit einem oder mehreren Hydrazinderivat(en) modifizierten Matrix - verkörpert der Komplex, der aus der Nukleinsäure mit der Partialstruktur des Hydrazins bzw. der Hydrazinderivate ausgebildet wird, einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung.According to the first sub-step of the above-described method - namely the adsorption of the nucleic acid to the matrix modified with hydrazine and / or with one or more hydrazine derivative (s) - embodies the complex formed from the nucleic acid with the partial structure of the hydrazine or hydrazine derivatives becomes, a further object of the present invention.
Dabei hängen die exakten Reaktionsbedingungen - die notwendig sind, um Adsorption und Desorption der Nukleinsäuren an bzw. Matrix sicher zu stellen - von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich von der Beschaffenheit der Matrix, der Natur der gewünschten Nukleinsäure (DNA oder RNA, Molekulargewicht und Nukleotidsequenz-Zusammensetzung, dem pKb und pKa der basischen bzw. ggf. vorhandenen sauren Partialstrukturen, der Dichte der dieser Strukturen auf der Oberfläche und nicht zuletzt von der Fähigkeit der so modifizierten Matrix an die Nukleinsäure(n) zu binden).The exact reaction conditions - which are necessary to ensure adsorption and desorption of the nucleic acids or matrix - depend on various factors, including the nature of the matrix, the nature of the desired nucleic acid (DNA or RNA, molecular weight and nucleotide sequence). Composition, the pK b and pK a of the basic or possibly present acid partial structures, the density of these structures on the surface and not least of the ability of the matrix so modified to bind to the nucleic acid (s)).
Weiterhin ist es nicht ausgeschlossen, dass Verunreinigungen in der Mischung bei der Adsorption der Nukleinsäure(n) nachteilig mit dem Bindungsschritt interferieren.Furthermore, it is not excluded that impurities in the mixture upon adsorption of the nucleic acid (s) adversely interfere with the binding step.
Die hier eingesetzten Mischungen, welche die gewünschten Nukleinsäuren enthalten, können zum einen aus synthetisch hergestellten Reaktionsmischungen - wie sie z.B. bei der PCR anfallen - oder - wie bereits eingangs erwähnt - aus biologischen Proben stammen.The mixtures used here which contain the desired nucleic acids can, on the one hand, be prepared from synthetically prepared reaction mixtures, as described, for example, in US Pat. incurred in the PCR - or - as already mentioned - come from biological samples.
Als biologische Proben mit Nukleinsäuren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung zellfreies Probenmaterial, Plasma, Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise Blut, Serum, Zellen, Leukozytenfraktionen, Crusta Phlogistica, Sputum, Urin, Sperma, Faeces, Abstriche, Punktate, Gewebeproben jeder Art - wie z. B. Biopsien -, Gewebeteile und Organe, Lebensmittelproben, die freie oder gebundene Nukleinsäuren oder Nukleinsäurehaltige Zellen enthalten, Umweltproben, die freie oder gebundene Nukleinsäuren oder Nukleinsäure-haltige Zellen enthalten - wie z. B. Organismen (Ein- oder Mehrzeller; Insekten etc.), Pflanzen und Pflanzenteile, Bakterien, Viren, Hefen und andere Pilze, andere Eukaryonten und Prokaryonten etc. verstanden.As biological samples with nucleic acids for the purposes of the present invention cell-free sample material, plasma, body fluids such as blood, serum, cells, leukocyte fractions, Crusta phlogistica, sputum, urine, semen, faeces, smears, punctates, tissue samples of any kind - such. Biopsies, tissues and organs, food samples containing free or bound nucleic acids or nucleic acid containing cells, environmental samples that are free or bound nucleic acids or nucleic acid-containing cells - such. B. Organisms (single or multi-celled insects, etc.), plants and parts of plants, bacteria, viruses, yeasts and other fungi, other eukaryotes and prokaryotes, etc. understood.
Bei der Verwendung derartiger Proben ist es allerdings zunächst erforderlich, die Zellen zu zerstören, um die Nukleinsäuren für den Adsorptionsschritt verfügbar zu machen.However, with the use of such samples, it is first necessary to disrupt the cells to make the nucleic acids available for the adsorption step.
Wenn es sich bei der gewünschten Nukleinsäure um RNA handelt, müssen die Adsorptionsbedingungen so eingestellt werden, dass die Adsorption der gewünschten RNA gefördert wird. Wenn neben der RNA auch noch DNA in der Mischung zugegen ist, können die Adsorptionsbedingungen so eingestellt werden, dass bevorzugt die Bindung einer Spezies - in diesem Fall insbesondere RNA - an die Matrix gefördert wird. Die spezifischen Adsorptionsbedingungen, die allerdings erforderlich sind, um die Adsorption und letztendlich die Desorption von RNA zu ermöglichen, hängt von den Eigenschaften der Matrix ab und muss für jeden unterschiedlichen Typ einer Matrix bestimmt werden.If the desired nucleic acid is RNA, the adsorption conditions must be adjusted to promote adsorption of the desired RNA. If, in addition to the RNA, DNA is also present in the mixture, the adsorption conditions can be adjusted such that the binding of a species, in this case in particular RNA, to the matrix is preferably promoted. However, the specific adsorption conditions required to allow the adsorption and ultimately the desorption of RNA depend on the properties of the matrix and must be determined for each different type of matrix.
Die erfindungsgemäß eingesetzte Matrix, liegt bevorzugt in einer Form vor, die von der Mischung, welche die gewünschte Nukleinsäure neben anderen Substanzen/Verunreinigungen enthält, durch Einwirken einer externen Kraft getrennt werden kann, nachdem die Mischung mit der Matrix vermischt worden ist. Für den Fachmann ist verständlich, dass die Art der externen Kraft, die sich für die Trennung der Matrix aus der Mischung eignet, von der Form und von den physikalischen Eigenschaften der Matrix, abhängig ist. Zum Beispiel kann im einfachsten Fall, die Trennung unter der Einwirkung von Schwerkraft erfolgen, wenn die Matrix beispielsweise in der Form der festen Phase eines chromatographischen Trennsystems vorliegt.The matrix used in the invention is preferably in a form which can be separated from the mixture containing the desired nucleic acid, among other substances / impurities, by the action of an external force after the mixture has been mixed with the matrix. It will be understood by those skilled in the art that the type of external force that is suitable for separating the matrix from the mixture depends on the shape and physical properties of the matrix. For example, in the simplest case, the separation may be under the action of gravity, for example when the matrix is in the form of the solid phase of a chromatographic separation system.
Auf der anderen Seite kann die Matrix - ggf. chargenweise - zu der Mischung aus der Nukleinsäure und Verunreinigung(en) - zugegeben werden und anschließend durch Dekantieren oder Filtrieren - wieder abgetrennt werden. Die externe Kraft, die in dem erfindungsgemäßen Isolierungsverfahren angewendet wird, kann eine Flüssigkeit darstellen, die unter einem hohen Druck steht, wobei die Matrix die stationäre Phase einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie bildet.On the other hand, the matrix can be added to the mixture of the nucleic acid and impurity (s), if appropriate in batches, and then separated again by decanting or filtering. The external force employed in the isolation process of the present invention can be a high pressure liquid which forms the stationary phase of high pressure liquid chromatography.
Andere Formen von externen Kräften, die sich zum Einsatz in dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren eignen, beinhalten Vakuumfiltration, Zentrifugation oder bevorzugt Magnetkraft.Other forms of external forces suitable for use in the method proposed by the invention include vacuum filtration, centrifugation or, preferably, magnetic force.
Bei dem Einsatz von Magnetkraft, kommen vorzugsweise Matrices in Frage, die ein permanent oder temporär magnetisches Material aufweisen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise ferro- oder ferrimagnetische Partikel verwendet, vorzugsweise ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus: γ-Fe2O3 (Maghämit), Cr2O3, sowie Ferrite, insbesondere vom Typ (M2O)Fe2O3, wobei M2+ ein divalentes Übergangsmetallkation und vorzugsweise Fe3O4 (Magnetit) ist. Andere ferro- oder ferrimagnetische Partikel können jedoch ebenfalls verwendet werden. Diese Partikel weisen einen mittleren Teilchendurchmesser von kleiner 5 μm, vorzugsweise von kleiner 1 μm und besonders bevorzugt in einem Intervall zwischen 0,0 und 0,8 μm sowie ganz besonders bevorzugt in einem Bereich von 7 bis 300 nm auf.When using magnetic force, preferably matrices are in question, which have a permanently or temporarily magnetic material. In the context of the present invention, preference is given to using ferromagnetic or ferrimagnetic particles, preferably selected from the group consisting of: γ-Fe 2 O 3 (maghemite), Cr 2 O 3 , and also ferrites, in particular of the type (M 2 O) Fe 2 O 3 , wherein M 2+ is a divalent transition metal cation and preferably Fe 3 O 4 (magnetite). However, other ferromagnetic or ferrimagnetic particles may also be used. These particles have an average particle diameter of less than 5 .mu.m, preferably less than 1 .mu.m, and more preferably in an interval between 0.0 and 0.8 .mu.m, and most preferably in a range of 7 to 300 nm.
Beispiele geeigneter, kommerziell erhältlicher ferro- oder ferrimagnetischer Partikel werden durch magnetische Partikel auf der Basis von γ-Fe2O3- wie Bayoxide® E AB 21 , auf der Basis von ferrimagnetischem Magnetit als Typ Bayoxide® E 8706, E 8707, E 8710 und E 8713H (erhältlich von der Lanxess AG, Leverkusen, Bundesrepublik Deutschland) sowie als Magnetpigment 340 sowie als Magnetpigment 345 (erhältlich von der BASF AG, Ludwigshafen am Rhein, Bundesrepublik Deutschland) verkörpert.Examples of suitable commercially available ferro- or ferrimagnetic particles are magnetic particles on the basis of γ-Fe 2 O 3 - as Bayoxide ® E AB 21, on the basis of ferrimagnetic magnetite as type Bayoxide ® E 8706, E 8707, E 8710 and E 8713H (available from Lanxess AG, Leverkusen, Federal Republic of Germany) and as Magnetic Pigment 340 and as Magnetic Pigment 345 (available from BASF AG, Ludwigshafen am Rhein, Federal Republic of Germany).
Darüber hinaus können auch superparamagnetische Materialien eingesetzt werden. Als superparamagnetische Materialien kommen Fe, Fe3O4, Fe2O3, superparamagnetische Ferrite Co, Ni, sowie binäre und oder ternäre Verbindungen (Legierungen) in Frage. Beispielhaft seien hier Eisenoxidkristalle mit einem Durchmesser von 300 Angström und kleiner genannt.In addition, superparamagnetic materials can also be used. As superparamagnetic materials are Fe, Fe 3 O 4 , Fe 2 O 3 , superparamagnetic ferrites Co, Ni, and binary and or ternary compounds (alloys) in question. By way of example, iron oxide crystals having a diameter of 300 angstroms and smaller may be mentioned here.
Die erfindungsgemäße Matrix kann in Reinigungs- oder Isolierungsverfahren von Nukleinsäuren eingesetzt werden, die in konventionellen Größenordnungen satt finden und die beispielsweise aus den eingangs erwähnten Stand der Technik bekannt sind. Die erfindungsgemäße Matrix eignet sich aber auch zur Verwendung in oder in Verbindung mit mikrofluidischen Systemen, wie sie aus dem Stand der Technik hinlänglich zur Nukleinsäureaufreinigung bzw. -detektion bekannt sind.The matrix according to the invention can be used in purification or isolation processes of nucleic acids which are saturated in conventional orders of magnitude and which are known, for example, from the prior art mentioned at the outset. However, the matrix according to the invention is also suitable for use in or in connection with microfluidic systems, as are well known from the prior art for nucleic acid purification or detection.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung verdeutlichen, ohne sie zu beschränken:The following examples are intended to illustrate the invention without limiting it:
1. Herstellung von Hydrazin-modifizierten Beads1. Preparation of hydrazine-modified beads
1.1. Direkte Modifizierung mit Hydrazin1.1. Direct modification with hydrazine
5 g poröser magnetischer Beads, die aus einem Eisenoxidkern mit einer Umhüllung bestehend aus einem Polymethacrylat umgeben sind, werden in einem 250 ml Kolben in 100 ml entsalztem Wasser suspendiert und mit 10 ml Hydrazin-Hydrat versetzt. Die Suspension wird durch das zweimalige Anlegen eines Wasserstrahlvakuums entgast und über einen Zeitraum von ca. 12 Stunden unter leichtem Rühren auf eine Temperatur von 70 0C erhitzt. Die aus der Umsetzung resultierenden Hydrazin-modifizierten Beads werden in eine Glasfritte übergeführt und jeweils zweimal mit entsalztem Wasser, mit 10 mM Salzsäure sowie mit 100 mM Natriumphosphat (pH 6,0) und entsalztem Wasser gewaschen und anschließend in 100 ml entsalztem Wasser suspendiert.5 g of porous magnetic beads, which are surrounded by an iron oxide core with a sheath consisting of a polymethacrylate, are suspended in 100 ml of deionized water in a 250 ml flask and mixed with 10 ml of hydrazine hydrate. The suspension is degassed by applying a water jet vacuum twice and heated to a temperature of 70 0 C over a period of about 12 hours with gentle stirring. The hydrazine-modified beads resulting from the reaction are transferred to a glass frit and washed twice with deionized water, with 10 mM hydrochloric acid and with 100 mM sodium phosphate (pH 6.0) and demineralized water and then suspended in 100 ml of deionized water.
1.2. Indirekte Modifizierung mit Hydrazin1.2. Indirect modification with hydrazine
5 g poröser magnetischer Beads, die aus einem Eisenoxidkern mit einer Umhüllung bestehend aus einem Polymethacrylat umgeben sind, werden in einem 250 ml Kolben in 100 ml entsalztem Wasser suspendiert und mit 5 g 6-Aminohexansäure versetzt. Die Suspension wird durch das zweimalige Anlegen eines Wasserstrahlvakuums entgast und über einen Zeitraum von ca. 12 Stunden unter leichtem Rühren auf einer Temperatur von 70 0C erhitzt. Die Suspension wird durch das zweimalige Anlegen eines Wasserstrahlvakuums entgast und über einen Zeitraum von ca. 12 Stunden unter leichtem Rühren auf eine Temperatur von 70 0C erhitzt. Die aus der Umsetzung resultierenden mit 6-Aminohexansäure (6- Aminocapronsäure) modifizierten Beads werden in eine Glasfritte übergeführt und jeweils zweimal mit entsalztem Wasser, mit 10 mM Salzsäure sowie mit 100 mM Natriumphosphat (pH 6,0) und entsalztem Wasser gewaschen und anschließend in 100 ml entsalztem Wasser suspendiert. Danach werden 10 ml Hydrazin-Hydrat, 1 ml einer 10OmM Lösung von Natriumphosphat in Wasser (pH 6,0) enthaltend 50 mg/ml N-Hydroxysuccinimid, 1 ml einer 10OmM Lösung von Natriumphosphat in Wasser (pH 6,0) enthaltend 50 mg/ml EDC zugefügt. Nach erfolgter Zugabe wird das Reaktionsgemisch am Rotationsverdampfer über einen Zeitraum von zwei Stunden bei Raumtemperatur (ca. 25 0C) gerührt. Die aus der Umsetzung resultierenden indirekt mit Hydrazin modifizierten Beads werden in eine Glasfritte übergeführt und jeweils zweimal mit entsalztem Wasser, mit 10 mM Salzsäure sowie mit 100 mM Natriumphosphat (pH 6,0) und entsalztem Wasser gewaschen und anschließend in 100 ml entsalztem Wasser suspendiert.5 g of porous magnetic beads surrounded by an iron oxide core with a sheath consisting of a polymethacrylate are suspended in 100 ml of deionized water in a 250 ml flask and 5 g of 6-aminohexanoic acid added. The suspension is degassed by applying a water jet vacuum twice and heated over a period of about 12 hours with gentle stirring at a temperature of 70 0 C. The suspension is degassed by applying a water jet vacuum twice and heated to a temperature of 70 0 C over a period of about 12 hours with gentle stirring. The resulting from the reaction with 6-aminohexanoic acid (6-aminocaproic acid) modified beads are transferred to a glass frit and washed twice with deionized water, with 10 mM hydrochloric acid and with 100 mM sodium phosphate (pH 6.0) and deionized water and then in Suspended 100 ml of deionized water. Thereafter, 10 ml of hydrazine hydrate, 1 ml of a 10 mM solution of sodium phosphate in water (pH 6.0) containing 50 mg / ml N-hydroxysuccinimide, 1 ml of a 10OmM solution of sodium phosphate in water (pH 6.0) containing 50 mg / ml EDC added. After the addition, the reaction mixture is stirred on a rotary evaporator over a period of two hours at room temperature (about 25 0 C). The resulting indirectly from the reaction with hydrazine beads are transferred into a glass frit and washed twice with deionized water, with 10 mM hydrochloric acid and with 100 mM sodium phosphate (pH 6.0) and deionized water and then suspended in 100 ml of deionized water.
2. Biologische Anwendungen2. Biological applications
2. Biologische Anwendungen2. Biological applications
2.1. DNA-Aufreinigung Hydrazin-modifizierten Beads2.1. DNA purification Hydrazine-modified beads
10 μg pUC21 (1 μg/μl) werden jeweils zu den folgenden Puffersystemen zugefügt:10 μg pUC21 (1 μg / μl) are added to each of the following buffer systems:
a) 390 μl 100 M Ammoniumacetat (pH 5,5) b) 390 μl eines Puffergemischs aus einem Tris-haltigen EDTA Puffers (pH 7,8 - 8,2), einer Natriumhydroxidhaitigen SDS-Lösung (pH 13) und eines Essigsäure-haltigen Kaliumacetatpuffers (pH 5,4 - 5,6) [Puffer P1/P2/P3 der Fa. QIAGEN in Hilden (DE)], filtriert, P1 : 50 mM Tris/Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA P2: 200 mM NaOH; 1 % SDS P3: 3 M K-Acetat pH 5.5:a) 390 μl 100 M ammonium acetate (pH 5.5) b) 390 μl of a buffer mixture consisting of a Tris-containing EDTA buffer (pH 7.8-8.2), a sodium hydroxide-containing SDS solution (pH 13) and an acetic acid containing potassium acetate buffer (pH 5.4-5.6) [buffer P1 / P2 / P3 from QIAGEN in Hilden (DE)], filtered, P1: 50 mM Tris / Cl, pH 8.0; 10mM EDTA P2: 200mM NaOH; 1% SDS P3: 3M K-acetate pH 5.5:
Nach der Zugabe von 20 μl einer Bead-Suspension (49 mg/ml) wird die Mischung über einen ein Zeitraum von zwei Minuten auf einem Thermorüttler bei 1100 rpm inkubiert. Die Beads werden mittels Magnetkraft in der Suspension separiert und der Überstand wird verworfen. Danach werden 300 μl RNase-freies Wasser zugefügt und die Suspension wird über einen ein Zeitraum von einer Minute auf einem Thermorüttler bei 1 100 rpm vermischt. Die Beads werden mittels Magnetkraft in der Suspension separiert und der Überstand wird verworfen. Danach werden 100 μl TRIS (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1 ,3-propandiol) Puffer (pH 9.5) zugefügt und die die Suspension wird über einen ein Zeitraum von einer Minute auf einem Thermorüttler bei 1 100 rpm vermischt. Danach wird die flüssige Phase (Eluat) von den Beads mittels einer handelsüblichen magnetischen Trennvorrichtung getrennt. Dieser Elutionsschritt wird wiederholt und danach der DNA-Gehalt durch Bestimmung der optischen Dichte (OD) und Gelelektrophorese ermittelt. After adding 20 μl of a bead suspension (49 mg / ml), the mixture is incubated over a period of two minutes on a thermo-agitator at 1100 rpm. The beads are separated by magnetic force in the suspension and the supernatant is discarded. Thereafter, 300 .mu.l RNase-free water are added and the suspension is mixed over a period of one minute on a Thermorüttler at 1 100 rpm. The beads are separated by magnetic force in the suspension and the supernatant is discarded. Thereafter, 100 .mu.l TRIS (2-amino-2- (hydroxymethyl) -1, 3-propanediol) buffer (pH 9.5) are added and the suspension is mixed over a period of one minute on a Thermorüttler at 1 100 rpm. Thereafter, the liquid phase (eluate) is separated from the beads by means of a commercially available magnetic separation device. This elution step is repeated and then the DNA content determined by determining the optical density (OD) and gel electrophoresis.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit Hydrazin-modifizierte Matrices gemäß der allgemeinen Formel IThe present invention thus relates to hydrazine-modified matrices according to the general formula I.
Träger Linker Spacer NRS -NR1 R2 (I)Support Left Spacer NR S -NR 1 R 2 (I)
worinwherein
die Trägeroberfläche des Trägers aus einem anorganischen oder organischen Trägermaterial gebildet wird,the carrier surface of the carrier is formed from an inorganic or organic carrier material,
der Linker eine funktionelle Gruppe ist, die über eine kovalente Bindung mit der Trägeroberfläche oder mit dem Trägermaterial gebunden ist und entweder über den Spacer oder direkt an die Hydrazin-Partialstruktur gebunden ist, die Substituenten R-i, R2 und R3 unabhängig voneinander Wasserstoff, CrC6-Alkyl, C3-C6-Alkenyl, C3-C6-Alkinyl, einen höheren Alkylrest, einen Cycloalkylrest oder Aryl bzw. Aralkyl und im Falle von R3 eine auch eine weitere kovalente Bindung bedeuten können.the linker is a functional group which is bonded via a covalent bond to the carrier surface or to the carrier material and is bound either via the spacer or directly to the hydrazine partial structure, the substituents Ri, R 2 and R 3 independently of one another are hydrogen, C 1 -C 6 -alkyl, C 3 -C 6 -alkenyl, C 3 -C 6 -alkynyl, a higher alkyl radical, a cycloalkyl radical or aryl or aralkyl and in the case of R 3 may also mean another covalent bond.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Matrix mit einer Trägeroberfläche, die aus einem polymeren anorganischen oder organischen Trägermaterial gebildet wird.In a preferred embodiment, the present invention relates to a matrix having a support surface formed from a polymeric inorganic or organic support material.
In einer bevorzugteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einer Trägeroberfläche, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Agarosen, Polyacrylamide, Cellulosen, Polyacrylate, Polymethacrylate, Polystyrole, Latexmethacrylate und/oder Metalloxide.In a more preferred embodiment, the present invention relates to matrices having a support surface selected from the group comprising agaroses, polyacrylamides, celluloses, polyacrylates, polymethacrylates, polystyrenes, latex methacrylates and / or metal oxides.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform betriff die vorliegende Erfindung Matrices, die eine Trägeroberfläche aufweisen, die ausgewählt ist aus der Gruppe Polymethacrylat-Homopolymer und Copolymeren des Polymethacrylats mit Styrolen, Acrylaten oder weiteren Methacrylatderivaten, sowie ggf. mit Quervernetzern.In a further preferred embodiment, the present invention relates to matrices which have a carrier surface which is selected from the group polymethacrylate homopolymer and copolymers of polymethacrylate with styrenes, acrylates or further methacrylate derivatives, and optionally with crosslinking agents.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betriff die vorliegende Erfindung Matrices, die eine Trägeroberfläche aufweisen, die einen Quervernetzer besitzen, der aus der Gruppe Divinylbenzol oder Ethylenglycol-dimethacrylat ausgewählt ist.In a particularly preferred embodiment, the present invention relates to matrices having a support surface which have a crosslinker selected from the group consisting of divinylbenzene or ethylene glycol dimethacrylate.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform betriff die vorliegende Erfindung Matrices, die eine Trägeroberfläche aufweisen, die ein poröses Polymethacrylat Homopolymer oder Copolymer besitzt.In a further particularly preferred embodiment, the present invention relates to matrices having a support surface having a porous polymethacrylate homopolymer or copolymer.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices deren Matrixoberfläche aus Siliciumdioxid oder Silica ist bzw. Siliciumdioxid oder Silica aufweist.In another preferred embodiment, the present invention relates to matrices whose matrix surface is silica or silica or comprises silica or silica.
In einer bevorzugteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices, deren Trägeroberfläche in Form von Kieselgel, festem Glas oder Diatomeenerde oder als Mischung dieser Stoffe vorliegt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einem Linker, der eine kovalente Bindung oder eine bis zu sechsgliedrige Alkylenbrücke, die ggf. mit einer oder mehreren Halogen-, Hydroxy-, Amino- und Thiolgruppen substituiert sein kann und die ggf. durch eine oder mehrere weitere funktionelle Gruppen unterbrochen sein kann, ist.In a more preferred embodiment, the present invention relates to matrices whose support surface is in the form of silica gel, solid glass or diatomaceous earth or as a mixture of these substances. In a further preferred embodiment, the present invention relates to matrices with a linker which is a covalent bond or an up to six-membered alkylene bridge, which may optionally be substituted by one or more halogen, hydroxy, amino and thiol groups and optionally by one or more other functional groups may be interrupted.
In einer bevorzugteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einem Linker, dessen funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe -O- , -NH-, -S-, -C(=O)-, -C(=O)-C(=O)-, -C(=O)-O-, -C(=O)-C(=O)-O-, -C(=S)-O-, -C(=O)- S-, -C(=O)-N-, -NH-C(=O)-NH-.In a more preferred embodiment, the present invention relates to matrices having a linker whose functional groups are selected from the group -O-, -NH-, -S-, -C (= O) -, -C (= O) -C ( = O) -, -C (= O) -O-, -C (= O) -C (= O) -O-, -C (= S) -O-, -C (= O) -S- , -C (= O) -N-, -NH-C (= O) -NH-.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einem Spacer, der eine Einfachbindung oder Doppelbindung, eine 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthaltende Alkylenbrücke, die ggf. durch ein oder mehrere Sauerstoff- und/oder Schwefelatome und/oder Aminogruppen und die ggf. durch eine oder mehrere Carbonyl- oder Carboxylgruppen unterbrochen sein kann, darstellt.In a preferred embodiment, the present invention relates to matrices with a spacer which has a single bond or double bond, an alkylene bridge containing 1 to 12 carbon atoms, optionally by one or more oxygen and / or sulfur atoms and / or amino groups and optionally by a or more carbonyl or carboxyl groups may be interrupted.
In einer bevorzugteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einem Spacer, dessen Carbonylgruppen durch Dialdehyd- und Polyaldehydgruppen verkörpert werden können.In a more preferred embodiment, the present invention relates to matrices having a spacer whose carbonyl groups can be represented by dialdehyde and polyaldehyde groups.
In einer weiteren bevorzugteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einem Spacer, dessen Carboxylgruppen Carboxyl-, Dicarboxy- oder Polycarboxylgruppen sein können.In a further more preferred embodiment, the present invention relates to matrices with a spacer whose carboxyl groups may be carboxyl, dicarboxy or polycarboxyl groups.
In einer weiteren bevorzugteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einem Spacer dessen Alkylenbrücke Ethylenglykol-diglycidylether-, Glycerol-diglycidylether-, Glycerol-triglycidylether-Ethylenglykol-, Polyethylenglykol-, Propylenglykol- und/oder deren substituierte Derivate aufweist.In a further preferred embodiment, the present invention relates to matrices with a spacer whose alkylene bridge comprises ethylene glycol diglycidyl ether, glycerol diglycidyl ether, glycerol triglycidyl ether, ethylene glycol, polyethylene glycol, propylene glycol and / or their substituted derivatives.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einer Hydrazin-Partialstruktur, in der R-i, R2 unabhängig voneinander Wasserstoff und R3 eine weitere kovalente Bindung oder Wasserstoff bedeutet. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Matrices in dem auf dem Trägermaterial oder auf der Trägermaterialoberfläche ein Linker erzeugt wird, der gegebenenfalls mit einem Spacer oder direkt mit Hydrazin oder einem Hydrazinderivat umgesetzt wird.In a preferred embodiment, the present invention relates to matrices having a hydrazine partial structure in which Ri, R 2 are independently hydrogen and R 3 is another covalent bond or hydrogen. In a further embodiment, the present invention relates to processes for preparing the matrices according to the invention in which a linker is produced on the carrier material or on the carrier material surface, which is reacted, if appropriate, with a spacer or directly with hydrazine or a hydrazine derivative.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Matrices zum Isolieren von Biomolekülen.In a further embodiment, the present invention relates to the use of the matrices according to the invention for isolating biomolecules.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Isolieren von Biomolekülen mit den erfindungsgemäßen Matrices, das folgende Schritte umfasst:In a further embodiment, the present invention relates to methods for isolating biomolecules with the matrices according to the invention, comprising the following steps:
(a) Bereitstellen der mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierten Matrix;(a) providing the matrix modified with hydrazine or with a hydrazine derivative;
(b) Vereinigen der Matrix mit einer Mischung enthaltend das zu isolierende Biomolekül bzw. enthaltend vorzugsweise die zu isolierende Nukleinsäure neben mindestens einer Verunreinigung;(b) combining the matrix with a mixture containing the biomolecule to be isolated or preferably containing the nucleic acid to be isolated in addition to at least one contaminant;
(c) Inkubieren der Matrix und der Mischung bei einem Adsorptions-pH, wobei das Biomolekül bzw. bevorzugt die gewünschte Nukleinsäure an der Matrix immobilisiert wird;(c) incubating the matrix and the mixture at an adsorption pH, wherein the biomolecule or preferably the desired nucleic acid is immobilized on the matrix;
(d) Trennen der Matrix mit dem Biomolekül bzw. mit der/den immobilisierten Nukleinsäure(n) von der Mischung;(d) separating the matrix with the biomolecule or immobilized nucleic acid (s) from the mixture;
(e) Vereinigen der Matrix mit dem Biomolekül bzw. mit der/den immobilisierten Nukleinsäure(n) mit einer Elutionslösung bei einem Desorptions-pH, wobei das/die gewünschte(n) Biomolekül(e) bzw. Nukleinsäure(n) von der Matrix desorbiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäure(n) mit den erfindungsmäßen Matrices.(e) combining the matrix with the biomolecule or with the immobilized nucleic acid (s) with an elution solution at a desorption pH, wherein the desired biomolecule (s) or nucleic acid (s) from the matrix is desorbed. In a preferred embodiment, the present invention relates to a method for isolating nucleic acid (s) with the matrices according to the invention.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Nukleinsäuren, die in Form eines Komplexes mit einer Hydrazinpartialstruktur oder der Partialstruktur eines Hydrzinderivats der erfindungsgemäßen Matrix gebunden sind.In a further embodiment, the present invention relates to nucleic acids which are bound in the form of a complex with a hydrazine partial structure or the partial structure of a hydrazine derivative of the matrix according to the invention.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Matrices in mikrofluidischen Systemen bzw. mikrofluidische Systeme, die die erfindungsgemäße Matrix enthalten. In another embodiment, the present invention relates to the use of the matrices according to the invention in microfluidic systems or microfluidic systems which contain the matrix according to the invention.

Claims

Patentansprüche claims
1. Hydrazin-modifizierte Matrix gemäß der allgemeinen Formel I1. hydrazine-modified matrix according to the general formula I.
Träger Linker Spacer NR3 NR1 R2 (I)Support Left Spacer NR 3 NR 1 R 2 (I)
worinwherein
die Trägeroberfläche aus einem polymeren anorganischen oder organischen Trägermaterial gebildet wird,the carrier surface is formed from a polymeric inorganic or organic carrier material,
der Linker eine funktionelle Gruppe ist, die über eine kovalente Bindung mit der Trägeroberfläche oder mit dem Trägermaterial des Trägers gebunden ist und entweder über Spacer oder direkt an die Hydrazin-Partialstruktur gebunden ist,the linker is a functional group which is bonded via a covalent bond to the carrier surface or to the carrier material of the carrier and is bound either via spacers or directly to the hydrazine partial structure,
die Substituenten R-i, R2 und R3 unabhängig voneinander Wasserstoff, CrC6-Alkyl, C3-C6-Alkenyl, C3-C6-Alkinyl, einen höheren Alkylrest, einen Cycloalkylrest oder Aryl bzw. Aralkyl und im Falle von R3 eine auch eine weitere kovalente Bindung bedeuten können.the substituents Ri, R 2 and R 3 independently of one another are hydrogen, C 1 -C 6 -alkyl, C 3 -C 6 -alkenyl, C 3 -C 6 -alkynyl, a higher alkyl radical, a cycloalkyl radical or aryl or aralkyl and in the case of R 3 may also mean another covalent bond.
2. Matrix nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Träger aus einem polymeren anorganischen oder organischen Trägermaterial gebildet wird.2. Matrix according to claim 1, characterized in that the carrier is formed from a polymeric inorganic or organic carrier material.
3. Matrix nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägeroberfläche ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Agarosen, Polyacrylamide, Cellulosen, Polyacrylate, Polymethacrylate, Polystyrole, Latexmethacrylate und/oder Metalloxide.3. Matrix according to claim 2, characterized in that the carrier surface is selected from the group comprising agaroses, polyacrylamides, celluloses, polyacrylates, polymethacrylates, polystyrenes, latex methacrylates and / or metal oxides.
4. Matrix nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägeroberfläche ausgewählt ist aus der Gruppe Polymethacrylat-Homopolymer und Copolymeren des Polymethacrylats mit Styrolen, Acrylaten oder weiteren Methacrylatderivaten, sowie mit Quervernetzern. 4. A matrix according to claim 3, characterized in that the carrier surface is selected from the group polymethacrylate homopolymer and copolymers of polymethacrylate with styrenes, acrylates or other methacrylate derivatives, as well as crosslinkers.
5. Matrix nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, der Quervernetzer ausgewählt ist aus der Gruppe Divinylbenzol oder Ethylenglycol-dimethacrylat.5. A matrix according to claim 4, characterized in that the cross-linking agent is selected from the group divinylbenzene or ethylene glycol dimethacrylate.
6. Matrix nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägeroberfläche ein poröses Polymethacrylat Homopolymer oder Copolymer ist.6. A matrix according to claim 4, characterized in that the carrier surface is a porous polymethacrylate homopolymer or copolymer.
7. Matrix nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Metalloxid Siliciumdioxid oder Silica ist.7. Matrix according to claim 2, characterized in that the metal oxide is silica or silica.
8. Matrix nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Siliciumdioxid in Form von Kieselgel, festem Glas oder Diatomeenerde oder als Mischung dieser Stoffe vorliegt.8. A matrix according to claim 7, characterized in that the silica is present in the form of silica gel, solid glass or diatomaceous earth or as a mixture of these substances.
9. Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker eine kovalente Bindung oder eine bis zu sechsgliedrige Alkylenbrücke, die ggf. mit einer oder mehreren Halogen-, Hydroxy-, Amino- und Thiolgruppen substituiert sein kann und die ggf. durch eine oder mehrere weitere funktionelle Gruppen unterbrochen sein kann, ist.9. A matrix according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the linker is a covalent bond or up to six-membered alkylene bridge, which may optionally be substituted with one or more halogen, hydroxy, amino and thiol groups and optionally may be interrupted by one or more other functional groups.
10. Matrix nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe -O-, -NH-, -S-, -C(=O)-, -C(=O)-C(=O)-, -C(=O)-O-, -C(=O)-C(=O)-O-, -C(=S)-O-, -C(=O)-S-, -C(=O)-N-, -NH-C(=O)-NH-.10. A matrix according to claim 9, characterized in that the functional groups are selected from the group -O-, -NH-, -S-, -C (= O) -, -C (= O) -C (= O ) -, -C (= O) -O-, -C (= O) -C (= O) -O-, -C (= S) -O-, -C (= O) -S-, - C (= O) -N-, -NH-C (= O) -NH-.
1 1. Matrix nach einem Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Spacer eine Einfachbindung oder Doppelbindung, eine 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthaltende Alkylenbrücke, die ggf. durch ein oder mehrere Sauerstoff- und/oder Schwefelatome und/oder Aminogruppen und ggf. durch eine oder mehrere Carbonyl- oder Carboxylgruppen unterbrochen sein kann.1 1. A matrix according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the spacer is a single bond or double bond, an alkylene bridge containing 1 to 12 carbon atoms, optionally by one or more oxygen and / or sulfur atoms and / or amino groups and optionally may be interrupted by one or more carbonyl or carboxyl groups.
12. Matrix nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Carbonylgruppen Dialdehyd- und Polyaldehydgruppen sein können.12. The matrix of claim 1 1, characterized in that the carbonyl groups may be dialdehyde and polyaldehyde groups.
13. Matrix nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Carboxylgruppen Carboxyl-, Dicarboxy- oder Polycarboxylgruppen sein können. 13. The matrix of claim 1 1, characterized in that the carboxyl groups may be carboxyl, dicarboxy or polycarboxylic.
14. Matrix nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Alkylenbrücke Ethylenglykol-diglycidylether-, Glycerol-diglycidylether-, Glycerol-triglycidylether- Ethylenglykol-, Polyethylenglykol-, Propylenglykol- und/oder deren substituierte Derivate aufweist.14. Matrix according to claim 1 1, characterized in that the alkylene bridge ethylene glycol diglycidyl ether, glycerol diglycidyl ether, glycerol triglycidyl ether ethylene glycol, polyethylene glycol, propylene glycol and / or their substituted derivatives.
15. Matrix nach einem der Ansprüche 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, dass R-i, R2 unabhängig voneinander Wasserstoff und R3 eine weitere kovalente Bindung oder Wasserstoff bedeutet.15. A matrix according to any one of claims 1-14, characterized in that Ri, R 2 is independently hydrogen and R 3 is a further covalent bond or hydrogen.
16. Verfahren zur Herstellung von Matrices gemäß einem der Ansprüche 1 - 15, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Trägermaterial oder auf der Trägermaterialoberfläche ein Linker erzeugt wird und gegebenenfalls mit einem Spacer oder direkt mit Hydrazin oder einem Hydrazinderivat umgesetzt wird.16. A process for the preparation of matrices according to any one of claims 1-15, characterized in that on the carrier material or on the carrier material surface, a linker is generated and optionally reacted with a spacer or directly with hydrazine or a hydrazine derivative.
17. Verwendung einer modifizierten Matrix gemäß einem der Ansprüche 1 - 15 zum Isolieren von Biomolekülen.17. Use of a modified matrix according to any one of claims 1-15 for isolating biomolecules.
18. Verfahren zum Isolieren von Biomolekülen mit einer mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierten Matrix gemäß einem der Ansprüche 1 - 15, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:18. A process for isolating biomolecules with a hydrazine or with a hydrazine derivative modified matrix according to any one of claims 1-15, characterized in that it comprises the following steps:
(a) Bereitstellen der mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierten Matrix;(a) providing the matrix modified with hydrazine or with a hydrazine derivative;
(b) Vereinigen der Matrix mit einer Mischung enthaltend das zu isolierende Biomolekül neben mindestens einer Verunreinigung;(b) combining the matrix with a mixture containing the biomolecule to be isolated in addition to at least one contaminant;
(c) Inkubieren der Matrix und der Mischung bei einem Adsorptions-pH, wobei das Biomolekül an der Matrix immobilisiert wird;(c) incubating the matrix and the mixture at an adsorption pH, wherein the biomolecule is immobilized on the matrix;
(d) Trennen der Matrix mit dem Biomolekül von der Mischung; (e) Vereinigen der Matrix mit dem Biomolekül mit einer Elutionslösung bei einem Desorptions-pH, wobei das/die gewünschte(n) Biomolekül(e) von der Matrix desorbiert wird.(d) separating the matrix with the biomolecule from the mixture; (e) combining the matrix with the biomolecule with an elution solution at a desorption pH, desorbing the desired biomolecule (s) from the matrix.
19. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Biomolekül eine oder mehrere Nukleinsäure(n) darstellt.19. The method according to claim 16, characterized in that the biomolecule represents one or more nucleic acid (s).
20. Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie in Form eines Komplexes mit einer Hydrazinpartialstruktur oder der Partialstruktur eines Hydrzinderivats einer Matrix gemäß einem der Ansprüche 1 - 15 gebunden ist.20. Nucleic acid characterized in that it is bound in the form of a complex with a hydrazine partial structure or the partial structure of a hydrazine derivative of a matrix according to any one of claims 1-15.
21. Mikrofluidisches System enthaltend eine Matrix nach einem der Ansprüche 1 - 15. 21. A microfluidic system containing a matrix according to any one of claims 1-15.
EP09711574A 2008-02-22 2009-02-20 Hydrazine-modified matrices, their use in methods for isolating biomolecules Withdrawn EP2255000A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102008010692A DE102008010692A1 (en) 2008-02-22 2008-02-22 New matrices, processes for their preparation and their use in methods of isolating biomolecules
PCT/EP2009/052051 WO2009103794A1 (en) 2008-02-22 2009-02-20 Hydrazine-modified matrices and use thereof in methods for isolating biomolecules

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2255000A1 true EP2255000A1 (en) 2010-12-01

Family

ID=40547448

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP09711574A Withdrawn EP2255000A1 (en) 2008-02-22 2009-02-20 Hydrazine-modified matrices, their use in methods for isolating biomolecules

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20110054054A1 (en)
EP (1) EP2255000A1 (en)
DE (1) DE102008010692A1 (en)
WO (1) WO2009103794A1 (en)

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US155018A (en) 1874-09-15 Improvement in scaffolds
US923978A (en) 1908-06-03 1909-06-08 Kops Bros Flexible fibrous material.
DE3639949A1 (en) 1986-11-22 1988-06-09 Diagen Inst Molekularbio METHOD FOR SEPARATING LONG CHAIN NUCLEIC ACIDS
NL8900725A (en) 1989-03-23 1990-10-16 Az Univ Amsterdam METHOD AND COMBINATION OF AGENTS FOR INSULATING NUCLEIC ACID.
GB9003253D0 (en) 1990-02-13 1990-04-11 Amersham Int Plc Precipitating polymers
CA2067711C (en) 1991-05-03 2000-08-08 Daniel Lee Woodard Solid phase extraction purification of dna
DE4321904B4 (en) 1993-07-01 2013-05-16 Qiagen Gmbh Method for chromatographic purification and separation of nucleic acid mixtures
GB9323305D0 (en) 1993-11-11 1994-01-05 Medinnova Sf Isoaltion of nucleic acid
EP0743950B1 (en) 1994-02-11 2001-12-12 QIAGEN GmbH Process for separating double-stranded/single-stranded nucleic acid structures
US5582988A (en) 1994-09-15 1996-12-10 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using weakly basic polymer and amplification of same
GB9425138D0 (en) 1994-12-12 1995-02-08 Dynal As Isolation of nucleic acid
US5783686A (en) 1995-09-15 1998-07-21 Beckman Instruments, Inc. Method for purifying nucleic acids from heterogenous mixtures
DE102006003603B4 (en) * 2006-01-25 2010-02-04 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Crosslinkable multifunctional supports for (low molecular weight) ligands and their use in analytics, as well as processes for their preparation and crosslinking
US8242058B2 (en) * 2006-07-21 2012-08-14 Wisconsin Alumni Research Foundation Reagents and methods for appending functional groups to proteins

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FAVOROV ET AL: "Purification of alginases by affinity chromatography on a bio-gel alginate column", INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, PERGAMON, vol. 4, no. 20, 1 January 1973 (1973-01-01), pages 107 - 110, XP023404655, ISSN: 0020-711X, [retrieved on 19730101], DOI: 10.1016/0020-711X(73)90001-3 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2009103794A1 (en) 2009-08-27
US20110054054A1 (en) 2011-03-03
DE102008010692A1 (en) 2009-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1031626B1 (en) Method for stabilising and/or isolating nucleic acids
DE69817484T2 (en) METHOD FOR INSULATING SPECIFIC BIOLOGICAL SUBSTANCES BY MEANS OF MAGNETIC SILICA PARTICLES
DE60012506T2 (en) MIXED BED FIXED PHASE AND ITS USE FOR THE ISOLATION OF NUCLEIC ACIDS
DE69734263T2 (en) Process for isolating ribonucleic acids.
EP1820793B1 (en) Process of stabilization of nucleic acids in biological materials
EP0775150B1 (en) Endotoxin reduction or removal process
EP1141273B1 (en) Method for isolating dna from biological materials
EP2256195A1 (en) Nucleic acid purification method
EP2465934A1 (en) Extraction of nucleic acids
DE19912799B4 (en) Superparamagnetic adsorption material and its use
EP3228710B1 (en) Purification of nucleic acids from a sample comprising nucleic acids and endotoxin
DE60123828T2 (en) LYSATE CLARIFICATION AND NUCLEIC ACID INSULATION WITH SILANIZED SILICAMATRIZES
EP1771562A2 (en) Method for purifying and isolating nucleic acids using cationic detergents
EP2255000A1 (en) Hydrazine-modified matrices, their use in methods for isolating biomolecules
EP1713910A1 (en) Method for chromatographic separation of a nucleic acid mixture
EP1242816A2 (en) Chromatography material and a method using same
EP2247626A1 (en) Novel matrix materials, methods for the production thereof, and use thereof in methods for isolating biomolecules
DE60223243T2 (en) ACETATE-FREE PURIFICATION OF PLASMID DNA USING HYDROXYAPATITE
DE102015211394B4 (en) Device and method for extracting nucleic acids
EP1709172B1 (en) Method and kit for isolating rna
DE102010031404A1 (en) Method for rapid delivery of ingredients from biological samples
DE102007009347B4 (en) Method for isolating nucleic acids
WO2005066361A1 (en) Method for enriching and stabilising components which contain dna and which are made of biological materials
CN105237656A (en) Method for purifying sodium hyaluronate
DE10103652A1 (en) Magnetic polyvinyl alcohol carrier, useful for isolating and purifying nucleic acid, is modified with germanium compound for improved reversible binding

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20100922

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL BA RS

17Q First examination report despatched

Effective date: 20110204

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20120913