EP1713910A1 - Method for chromatographic separation of a nucleic acid mixture - Google Patents

Method for chromatographic separation of a nucleic acid mixture

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Publication number
EP1713910A1
EP1713910A1 EP05706998A EP05706998A EP1713910A1 EP 1713910 A1 EP1713910 A1 EP 1713910A1 EP 05706998 A EP05706998 A EP 05706998A EP 05706998 A EP05706998 A EP 05706998A EP 1713910 A1 EP1713910 A1 EP 1713910A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
conductivity
acid mixture
plasmid dna
kci
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05706998A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Markus Müller
Jörg HUCKLENBROICH
Lothar Breitkopf
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qiagen GmbH
Original Assignee
Qiagen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qiagen GmbH filed Critical Qiagen GmbH
Priority to EP05706998A priority Critical patent/EP1713910A1/en
Publication of EP1713910A1 publication Critical patent/EP1713910A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a method for the chromatographic separation of a nucleic acid mixture, in particular for the separation and purification of plasmid DNA from other constituents of the nucleic acid mixture, in particular other nucleic acids.
  • the method according to the invention is characterized in particular by the fact that plasmid DNA can be separated from contaminating RNA without the addition of ribonucleases and by the use of inexpensive and environmentally friendly components. These parameters make it possible to use this method for the production of plasmid DNA on a large scale.
  • the present invention comprises the use of the plasmid DNA obtained by means of the method according to the invention for the production of a plasmid DNA-containing agent for use in gene therapy and genetic vaccination.
  • a fundamental problem with the purification of plasmids is the removal of other nucleic acid species from the product. This problem arises above all in areas in which a particularly pure plasmid DNA preparation is required, for example when the plasmid DNA is used in gene therapy.
  • the other nucleic acid species mentioned are, above all, the various RNAs, but also genomic DNA and ssDNA (single stranded), etc.
  • a particular difficulty is the removal of the RNA.
  • the removal of the RNA using ribonucleases is known from the prior art. The RNA is degraded to ribonucleotides by means of the ribonucleases, which can be separated from the plasmid DNA much more easily in a subsequent chromatographic separation process.
  • the massive disadvantage of this method is the use of an RNase, which is usually a foreign protein.
  • the RNase is obtained from animal material, usually from cattle.
  • the addition of animal proteins in production processes must be ruled out due to possible contamination of the product with bacterial, viral or proteinogenic pathogens. This is particularly true for bovine proteins due to the BSE problem.
  • the use of RNase and also alcohol-containing buffers is a major cost factor. This is a cost factor that should not be underestimated, particularly in the production of plasmid DNA on a large scale, that is to say in ranges of approximately> 2 g.
  • alcohol there is an additional burden on the employees involved and the environment as a significant factor.
  • the alkaline lysis described in principle by Bimborn and Dohly (Nucl. Acids Res. 7, pp. 1513-1522; 1979) is preferred, but not limited thereto.
  • Other options are lysis by heat or lysis in the presence of detergents. Lysis by high pressure (French press) has proven to be unsuitable because the high shear forces that arise result in very small fragments of genomic DNA, which are practically no longer separable from the plasmid DNA.
  • Chromatographic methods are known from the prior art for purifying the nucleic acids from such a lysate. A distinction is generally made between two methods. First, the method according to Gillespie and Vogelstein (Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 76 pp. 615 - 619; 1979) is known from the prior art. In this method, the nucleic acid is purified by binding to silica gel or diatomaceous earth in the presence of chaotropic salts, e.g. GuHCI, NaI, etc. In contrast to the anion exchanger, the
  • Proteins are not suitable for use in gene therapy.
  • the technical problem on which the method according to the invention is based is the purification of plasmid DNA from a nucleic acid mixture and the improvement in the separation of contaminants such as RNA, ssDNA and genomic DNA without using an RNase.
  • Another object of the invention is to provide a method which allows plasmids to be purified inexpensively and in an environmentally friendly manner even on a large scale.
  • the technical problem on which the invention is based is solved by a method according to the claims.
  • a) the nucleic acid mixture with one or more alkali metal salts and / or alkaline earth metal salts in an aqueous solution is adjusted to a conductivity which has a conductivity of Corresponds to 70 mS to 95 mS at a pH of 4.8 to 5.4 and at a temperature of 20 ° C, and b) the nucleic acid mixture is brought into contact with a chromatographic support material, and a) the support material is then contacted at least once with a Solution containing an alkali salt in a concentration range of 900 mM to 1800 mM based on a pH of 7 to 7.4 and / or an alkaline earth metal salt in a concentration range of 100 mM to 240 mM
  • the cells which may be prokaryotic or eukaryotic cells, must first be lysed. This can be done in the manner described above.
  • the alkaline lysis described in principle by Birnborn and Dohly (Nucl. Acids Res. 7, pp. 1513-1522; 1979) is preferred, but not limited thereto.
  • Other options are lysis by heat or lysis in the presence of detergents. Lysis by high pressure (French press) has proven to be unsuitable, since the high shear forces created result in very small fragments of genomic DNA which are practically no longer separable from the plasmid DNA.
  • a nucleic acid mixture in the sense of the invention can be a cell lysate as well as a pre-cleaned or clarified lysate, but can also be an artificial mixture in which plasmid DNA is contaminated with at least one further nucleic acid species and possibly other contaminants.
  • the nucleic acid mixture is a prokaryotic clarified lysate.
  • the method according to the invention ensures the chromatographic separation of the contaminants mentioned and provides a plasmid DNA which meets the purity requirements for use in gene therapy or genetic vaccination.
  • the person skilled in the art understands chromatography as a collective term for the physical-chemical separation of substance mixtures due to their different distribution between a stationary phase and a mobile phase.
  • an anion exchange material is used to separate the plasmid DNA from the contaminants.
  • the commercially available material QIAGEN ® QIAGEN GmbH, Hilden, Germany
  • This material enables a very efficient separation of the RNA by means of the method according to the invention, but also from eg ssDNA, from plasmid DNA.
  • RNA and ssDNA elute in a distinct peak which, in the method according to the invention, is very far from the likewise very distinct peak of the plasmid DNA.
  • the risk of co-elution of plasmid DNA and RNA or ssDNA is thus significantly reduced compared to the methods known from the prior art.
  • the chromatographic support material available under the name QIAGEN ® (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) is a modified porous inorganic material.
  • QIAGEN ® QIAGEN GmbH, Hilden, Germany
  • silica gel, diatomaceous earth, glass, aluminum oxides, titanium oxides, zirconium oxides, hydroxylapatite and organic support materials such as dextran, agarose, acrylamide, polystyrene resins or copolymers of the monomeric constituents of the materials mentioned are suitable as inorganic support materials.
  • the anion exchanger which is preferably used in the process according to the invention is, for example, by reacting one of the abovementioned support materials in a first step with a silanizing reagent of the general formula I.
  • R 1 is an alkoxy radical with 1 to 10 C atoms, in particular -OCH 3 , -OC 2 H 5 or - OC 3 H, or a halogen atom, in particular -Cl, or a dialkylamino group with identical or different alkyl radicals with 1 to 6 C- atoms;
  • R 2 and R 3 independently of one another are a hydrocarbon radical with 1 to 10 C atoms, in particular -CH 3) -C 2 H 5 or -C 3 H 7 , or an alkoxy radical with 1 to 10 C atoms, in particular -OCH 3 , -OC 2 H 5 or -OC 3 H 7 , or a halogen atom or an alkyl radical with 4 to 20 C atoms interrupted by at least one oxygen atom or an amino group, this radical also being a mono- or can be substituted several times by halogen, cyano, nitro, amino, monoalkylamino, dialkylamino, hydroxy or aryl
  • X is an amino, hydroxyl, epoxy group or a halogen atom
  • R is a hydrocarbon chain with 2 to 20 C atoms or an alkyl radical interrupted by at least one oxygen atom or an amino group, this radical also one or more times with halogen, cyano, Nitro, amino, monoalkylamino, dialkylamino, alkoxy, hydroxy, aryl and / or epoxy may be substituted
  • Y is a hydrocarbon radical with functional groups forming anion exchangers with 1 to 10 carbon atoms, one or more times with amino, monoalkylamino, dialkylamino -, Trialkylammonium can be, is, as also in EP 0 743 949, pages 4 to 5, to which reference is made here.
  • the nucleic acid mixture according to the optional step a) of the above-described method according to the invention one or more alkali salts and / or alkaline earth salts in an aqueous solution to a conductivity that corresponds to a conductivity of 70 mS to 95 mS at a pH of 4.8 to 5.4 and at a temperature of 20 ° C.
  • the salts preferably used in the process according to the invention are alkali metal salts, i.e. salts in which the cationic component or part of the cationic component originates from an element of the first main group of the Periodic Table of the Elements, and / or are alkaline earth metal salts, i.e. salts in which the cationic component or part of the cationic component comes from an element of the second main group of the periodic table of the elements.
  • the alkali salts are particularly preferably alkali halides and the alkaline earth salts are alkaline earth halides.
  • alkali halides KCl, NaCl, CsCl and / or LiCl and the alkaline earth halide CaCl 2 is particularly preferred.
  • an ammonium salt pseudoalkali metal salt
  • an ammonium salt of a carboxylic acid particularly preferably ammonium acetate
  • the salts used are very particularly preferably KCl and / or NaCl.
  • mixtures of various alkali salts and / or alkaline earth metal salts can also be used in the process according to the invention.
  • alkali salts in a concentration range from 900 mM to 1800 mM based on a pH from 7 to 7.4 and / or alkaline earth metal salts in a concentration range from 100 mM to 240 mM based on a pH of 7 to 7.4 used.
  • all aqueous solutions that appear sensible to a person skilled in the art can be used for the washing step, for example buffered systems such as, for example, but not limited to, tris, potassium acetate, borate or MOPS buffered systems, or alternatively unbuffered systems, ie the salts are only dissolved in water. Different pH values can potentially result from different buffer systems or these can be set.
  • the concentration ranges selected here relate to a pH value of 7 to 7.4, but in principle the pH value of the washing solution can be varied in the above-mentioned pH range. It is known to the person skilled in the art that when the pH of such a washing solution is changed, the concentration of the salts contained therein must also be changed in order to achieve the same effect, in this case, therefore, the elution of the contaminants, that is to say when the method is carried out to a shift in the elution points of contaminants (eg RNA) and plasmid DNA, with the same pH value of the washing and elution solution but not to a shift in the ratio of the elution points, which means that the distance between the elution peaks of the different nucleic acid species is advantageously always the same remains.
  • contaminants eg RNA
  • the person skilled in the art can carry out the parameters required for this on the basis of his specialist knowledge without inventive step.
  • the method according to the invention comprises at least one washing step, but it is also possible to carry out a number of washing steps, which seem sensible in number to the person skilled in the art, also with washing buffers according to the invention which differ from one another.
  • At least one washing step is carried out with a solution containing KCI in a concentration range from 1100 mM to 1800 mM based on a pH of 7 to 7.4, particularly preferably at least one washing step is carried out with a solution containing KCI in a concentration range from 1300 mM to 1700 mM based on a pH of 7 to 7.4.
  • At least one washing step is carried out with a solution containing NaCl in a concentration range from 950 mM to 1200 mM based on a pH of 7 to 7.4, particularly preferably at least one washing step is carried out with a solution containing NaCl in a concentration range from 1100 mM to 1150 mM based on a pH of 7 to 7.4.
  • aqueous solutions which appear sensible to the person skilled in the art can be used, for example buffered systems such as, but not limited to, tris, potassium acetate, borate or MOPS-buffered systems, or alternatively unbuffered systems, ie the salts are only dissolved in water.
  • buffered systems such as, but not limited to, tris, potassium acetate, borate or MOPS-buffered systems, or alternatively unbuffered systems, ie the salts are only dissolved in water.
  • buffered systems such as, but not limited to, tris, potassium acetate, borate or MOPS-buffered systems, or alternatively unbuffered systems, ie the salts are only dissolved in water.
  • buffered systems such as, but not limited to, tris, potassium acetate, borate or MOPS-buffered systems, or alternatively unbuffered systems, ie the salts are only dissolved in water.
  • Different pH values can potentially result from different buffer systems or these can
  • the elution step is carried out with a solution containing KCI in a concentration of 1900 mM or higher, based on a pH of 7 to 7.4.
  • the upper limit of KCI is only limited by its solubility in the solution used.
  • the elution step is carried out with a solution containing NaCl in a concentration of 1300 mM or higher, based on a pH of 7 to 7.4.
  • the NaCI concentration is only limited by its solubility in the solution used.
  • the setting of the conductivity of the nucleic acid mixture before bringing the nucleic acid mixture into contact with the chromatographic support material is also carried out, as already mentioned above, with alkali metal salts and / or alkaline earth metal salts.
  • the nucleic acid mixture is adjusted with KCI to a conductivity which corresponds to a conductivity of 70 mS to 85 mS at a pH of 4.8 to 5.4 and at a temperature of 20 ° C., very particularly preferably one Conductivity that corresponds to a conductivity of 70 mS to 80 mS at a pH of 4.8 to 5.4 and at a temperature of 20 ° C.
  • the nucleic acid mixture is adjusted with NaCl to a conductivity which corresponds to a conductivity of 70 mS to 95 mS at a pH of 4.8 to 5.4 and at a temperature of 20 ° C., very particularly preferably a conductivity that corresponds to a conductivity of 85 mS to 95 mS at a pH of 4.8 to 5.4 and at a temperature of 20 ° C.
  • the alkali halide KCI is used in the process according to the invention at least in the washing step of the chromatographic support material identified above with c).
  • room temperature means that the process is carried out under normal process conditions, corresponding approximately to a range from 18 ° C to 25 ° C.
  • the method can be carried out at all temperatures which appear sensible to the person skilled in the art.
  • the method according to the invention is preferably suitable for the purification of plasmid DNA.
  • plasmids of different sizes do not show any significant differences in the elution points, ie in the salt concentrations at which the plasmid DNA is eluted from the chromatographic support material. It is therefore not necessary to adapt the parameters of the method, such as salt concentrations or pH values, to different plasmid sizes. Since a method is available with the subject matter of the invention in which large scale plasmid can also be obtained for the production of a plasmid DNA-containing agent for use in gene therapy or genetic vaccination, endotoxin removal can advantageously be incorporated into the method without any problems become.
  • the clarified lysate can be mixed with an endotoxin removal buffer known from the prior art (for example containing Triton X 100, Triton X 114, polymyxin, etc.) and used without change in the method according to the invention.
  • an endotoxin removal buffer known from the prior art (for example containing Triton X 100, Triton X 114, polymyxin, etc.) and used without change in the method according to the invention.
  • Illustration 1
  • the absorbance is plotted against the KCI concentration at 254 nm of the flow through an HPLC column filled with QIAGEN ® chromatography material. The elution of different nucleic acid species with increasing KCI concentration is shown. The test conditions are explained in more detail in Example 2.
  • 1 kg of biomass was obtained from 30 L of an overnight fermentation culture of E. coli DH5 ⁇ , containing pCMVß plasmid, by centrifugation.
  • the biomass was resuspended in 15 L of a resuspension buffer (10 mM EDTA; 50 mM Tris / HCl pH 8) and then incubated with 15 L of a lysis buffer (200 mM NaOH; 1% (w / v) SDS) for 10 minutes at room temperature.
  • 15 L of a neutralization buffer (3 M potassium acetate, pH 5.5) were then added.
  • the precipitate formed in this step (proteins, membrane components, genomic DNA, etc.) was then removed.
  • the lysate thus pre-clarified was then filtered, whereby a clarified lysate was produced.
  • the clarified lysate indicated consequently a pH of 5.2 and was adjusted at a temperature of 20 ° C with 3 M KCI to a conductivity of 80 mS.
  • a chromatography column was equilibrated with QIAGEN ® -Chromatographiematerial filled (column volume ca. 7 L) and washed with 10 column volumes of a Aquilibr michspuffers (20 mM potassium acetate) at a flow rate of 3.3 cm / min.
  • the clarified lysate was loaded onto the column after equilibration of the chromatography material, and the run was carried out at a flow rate of 1.1 cm / min. 5 column volumes of equilibration buffer (20 mM potassium acetate) were then again passed over the column at a flow rate of 3.3 cm / min.
  • the column was then washed directly with 10 column volumes of a KCI solution (1350 mM KCI; 50 mM Tris / HCl, pH 7.2) at a flow rate of 3.3 cm / min.
  • the plasmids were then eluted with a column volume of an elution buffer (1600 mM NaCl; 50 mM Tris / HCl, pH 7.2). After subsequent ultrafiltration / diafiltration and final sterile filtration, a yield of approximately 400 mg pCMVß resulted.
  • a Tris buffer was passed over the column in a continuous gradient (50 mM Tris / HCl; pH 7.2; gradient 0 to 3 M KCI) and the elution of DNA and RNA was determined using a photometer (absorbance measurement at 254 nm). It could be shown that partially degraded and short-chain RNA is eluted in a distinct peak (maximum at 780 mM KCI), followed by an only slightly diffuse peak of longer-chain RNA (maximum at 1120 mM KCI, end of elution at 1310 mM KCI) , The elution of the plasmid DNA reaches a maximum at 1900 mM KCI and ends at 2150 mM KCI. The results are shown as superimposed tracks in Figure 1. It is clear that the plasmids advantageously elute regardless of their size.

Abstract

The invention relates to a method for chromatographic separation of a nucleic acid mixture, particularly to the separation and purification of plasmid DNA from other components of the nucleic acid mixture, particularly other nucleic acids. The inventive method is particularly characterized in that plasmid DNA can be separated without adding ribonucleases of contaminating RNA and is also characterized by the use of low-cost environmentally-friendly components. Said parameters enable the inventive method to also be used for the large-scale production of plasmid DNA .The invention also relates to the use of plasmid DNA obtained by means of the inventive method in the production of an agent containing plasmid DNA and which can be used in gene therapy and genetic vaccination.

Description

Verfahren zur chromatographischen Trennung eines Nukleinsäuregemisches Method for the chromatographic separation of a nucleic acid mixture
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur chromatographischen Trennung eines Nukleinsäuregemisches, insbesondere zur Trennung und Aufreinigung von Plasmid-DNA von anderen Bestandteilen des Nukleinsäuregemisches, insbesondere anderen Nukleinsäuren. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich im besonderen dadurch aus, dass Plasmid-DNA ohne Zugabe von Ribonukleasen von kontaminierender RNA getrennt werden kann sowie durch die Verwendung kostengünstiger und umweltschonender Komponenten. Diese Parameter erlauben es, dieses Verfahren auch zur Produktion von Plasmid-DNA im Produktionsmaßstab ('large scale') einzusetzen. Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen Plasmid-DNA zur Herstellung eines Plasmid-DNA-haltigen Mittels zum Einsatz in der Gentherapie und genetischen Vakzinierung.The present invention relates to a method for the chromatographic separation of a nucleic acid mixture, in particular for the separation and purification of plasmid DNA from other constituents of the nucleic acid mixture, in particular other nucleic acids. The method according to the invention is characterized in particular by the fact that plasmid DNA can be separated from contaminating RNA without the addition of ribonucleases and by the use of inexpensive and environmentally friendly components. These parameters make it possible to use this method for the production of plasmid DNA on a large scale. Furthermore, the present invention comprises the use of the plasmid DNA obtained by means of the method according to the invention for the production of a plasmid DNA-containing agent for use in gene therapy and genetic vaccination.
Ein grundlegendes Problem der Aufreinigung von Plasmiden ist die Entfernung anderer Nukleinsäurespezies aus dem Produkt. Dieses Problem stellt sich vor allem in Bereichen, in denen eine besonders reine Plasmid-DNA-Präparation erforderlich ist, z.B. bei einem Einsatz der Plasmid-DNA in der Gentherapie. Die erwähnten anderen Nukleinsäurespezies sind vor allem die verschiedenen RNAs, aber auch genomische DNA und ssDNA (Single stranded), etc. Eine besondere Schwierigkeit stellt die Entfernung der RNA dar. Aus dem Stand der Technik ist die Entfernung der RNA mit Hilfe von Ribonukleasen bekannt. Die RNA wird mittels der Ribonukleasen zu Ribonukleotiden abgebaut, welche in einem nachfolgenden chromatographischen Trennverfahren wesentlich leichter von der Plasmid-DNA getrennt werden können. Der massive Nachteil dieser Methode ist die Verwendung einer RNase, welche üblicherweise ein Fremdprotein darstellt. Die RNase wird aus tierischem Material, üblicherweise aus Rindern, gewonnen. Besonders bei der Herstellung von parenteralen Therapeutika zur Applikation am Menschen ist die Zugabe tierischer Proteine in Produktionsprozesse aufgrund einer möglichen Kontamination des Produktes mit bakteriellen, viralen oder proteinogenen Pathogenen auszuschließen. Dies gilt aufgrund der BSE-Problematik besonders für bovine Proteine. Darüber hinaus stellt die Verwendung von RNase und auch von alkoholhaltigen Puffern einen großen Kostenfaktor dar. Gerade in der Produktion von Plasmid-DNA im großen Maßstab (large scale), also in Bereichen von etwa >2 g, ist dies ein nicht zu unterschätzender Kostenfaktor. Bei Verwendung von Alkoholen kommt zusätzlich eine Belastung der involvierten Mitarbeiter und der Umwelt als bedeutender faktor hinzu.A fundamental problem with the purification of plasmids is the removal of other nucleic acid species from the product. This problem arises above all in areas in which a particularly pure plasmid DNA preparation is required, for example when the plasmid DNA is used in gene therapy. The other nucleic acid species mentioned are, above all, the various RNAs, but also genomic DNA and ssDNA (single stranded), etc. A particular difficulty is the removal of the RNA. The removal of the RNA using ribonucleases is known from the prior art. The RNA is degraded to ribonucleotides by means of the ribonucleases, which can be separated from the plasmid DNA much more easily in a subsequent chromatographic separation process. The massive disadvantage of this method is the use of an RNase, which is usually a foreign protein. The RNase is obtained from animal material, usually from cattle. Especially in the production of parenteral therapeutic agents for application to humans, the addition of animal proteins in production processes must be ruled out due to possible contamination of the product with bacterial, viral or proteinogenic pathogens. This is particularly true for bovine proteins due to the BSE problem. In addition, the use of RNase and also alcohol-containing buffers is a major cost factor. This is a cost factor that should not be underestimated, particularly in the production of plasmid DNA on a large scale, that is to say in ranges of approximately> 2 g. When using alcohol, there is an additional burden on the employees involved and the environment as a significant factor.
Ein generelles Problem bei der Aufreinigung von Nukleinsäuren aus prokaryontischen, aber auch aus eukaryontischen Zellen besteht in der zunächst durchzuführenden Lyse der Zellen, um eine Freisetzung der Nukleinsäuren zu bewirken. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die von Bimborn und Dohly (Nucl. Acids Res. 7, pp. 1513 - 1522; 1979) grundsätzlich beschriebene alkalische Lyse bevorzugt, jedoch nicht darauf beschränkt. Weitere Möglichkeiten sind die Lyse durch Hitze oder Lyse in Anwesenheit von Detergenzien. Als ungeeignet hat sich die Lyse durch hohen Druck (French Press) erwiesen, das die entstehenden hohen Scheerkräfte sehr kleine Fragmente genomischer DNA entstehen, die praktisch nicht mehr von der Plasmid-DNA zu trennen sind.A general problem in the purification of nucleic acids from prokaryotic, but also from eukaryotic cells, is the lysis of the cells to be carried out first, in order to bring about a release of the nucleic acids. In the process according to the invention, the alkaline lysis described in principle by Bimborn and Dohly (Nucl. Acids Res. 7, pp. 1513-1522; 1979) is preferred, but not limited thereto. Other options are lysis by heat or lysis in the presence of detergents. Lysis by high pressure (French press) has proven to be unsuitable because the high shear forces that arise result in very small fragments of genomic DNA, which are practically no longer separable from the plasmid DNA.
Zur Aufreinigung der Nukleinsäuren aus einem solchen Lysat sind chromatographische Verfahren aus dem Stand der Technik bekannt. Hierbei sind generell zwei Verfahren zu unterscheiden. Zum einen ist die Methode nach Gillespie und Vogelstein (Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 76 pp. 615 - 619; 1979) aus dem Stand der Technik bekannt. Bei dieser Methode erfolgt eine Aufreinigung der Nukleinsäure durch Bindung an Silicagel oder Diatomeenerde in Anwesenheit von chaotropen Salzen, wie z.B. GuHCI, NaI, etc. Im Gegensatz zum Anionenaustauscher erfolgt dieChromatographic methods are known from the prior art for purifying the nucleic acids from such a lysate. A distinction is generally made between two methods. First, the method according to Gillespie and Vogelstein (Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 76 pp. 615 - 619; 1979) is known from the prior art. In this method, the nucleic acid is purified by binding to silica gel or diatomaceous earth in the presence of chaotropic salts, e.g. GuHCI, NaI, etc. In contrast to the anion exchanger, the
Bindung der DNA in Anwesenheit von hohen Salzkonzentrationen, wogegen dieBinding of DNA in the presence of high salt concentrations, whereas the
Elution bei niedrigen Salzkonzentrationen erfolgt. Da bei dieser Methode die Bindung der Nukleinsäuren nach dem 'alles oder nichts'-Prinzip abläuft, ist keine quantitativeElution takes place at low salt concentrations. Since the nucleic acids are bound according to the 'all or nothing' principle in this method, it is not quantitative
Separation von RNA, ssDNA und Proteinen möglich. Daher sind die mittels dieser Methode gewonnenen DNA-Proben aufgrund ihrer Kontaminationen mit RNA undSeparation of RNA, ssDNA and proteins possible. Therefore, the DNA samples obtained using this method are contaminated with RNA and
Proteinen nicht für einen Einsatz in der Gentherapie geeignet.Proteins are not suitable for use in gene therapy.
Zum zweiten ist die Reinigung mittels eines Anionenaustauschers zu nennen, wie sie in EP 0268 946 beschrieben ist. Hierbei werden Zellen, wie z.B. Bakterien, vorzugsweise mittels alkalischer Lyse aufgeschlossen. Die zellulären Proteine und genomische DNA werden mit Hilfe von Detergenzien und anschließender Zentrifugation abgetrennt. So gewonnene, Plasmid-DNA enthaltende Überstände werden als geklärtes Lysat (cleared lysate) bezeichnet. Das geklärte Lysat wird über eine Anionen-Austauscher-Säule (z.B. QIAGEN®, QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland) aufgereinigt, wobei eine quantitative Abtrennung von RNA und ssDNA erfolgt.Secondly, the cleaning by means of an anion exchanger, as described in EP 0268 946, should be mentioned. Here cells, such as bacteria, preferably digested by alkaline lysis. The cellular proteins and genomic DNA are separated with the help of detergents and subsequent centrifugation. Supernatants obtained in this way and containing plasmid DNA are referred to as cleared lysate. The cleared lysate is purified via an anion exchange column (eg QIAGEN ®, QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) using a quantitative separation of RNA and ssDNA occurs.
Das dem erfindungsgemäßen Verfahren zu Grunde liegende technische Problem ist die Aufreinigung von Plasmid-DNA aus einem Nukleinsäuregemisch und die Verbesserung der Trennung von Kontaminanten wie RNA, ssDNA und genomischer DNA ohne Verwendung einer RNase. Eine weitere der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe ist es, ein Verfahren bereitzustellen, dass eine Aufreinigung von Plasmiden auch im 'large scale' kostengünstig und umweltschonend erlaubt.The technical problem on which the method according to the invention is based is the purification of plasmid DNA from a nucleic acid mixture and the improvement in the separation of contaminants such as RNA, ssDNA and genomic DNA without using an RNase. Another object of the invention is to provide a method which allows plasmids to be purified inexpensively and in an environmentally friendly manner even on a large scale.
Überraschenderweise wird das der Erfindung zu Grunde liegende technische Problem durch ein Verfahren gemäß der Ansprüche gelöst. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zur Trennung der Plasmid-DNA von den übrigen Bestandteilen des Nukleinsäuregemisches, insbesondere anderen Nukleinsäurespezies, a) gegebenenfalls das Nukleinsäuregemisch mit einem oder mehreren Alkalisalzen und/oder Erdalkalisalzen in einer wässrigen Lösung auf eine Leitfähigkeit eingestellt wird, die einer Leitfähigkeit von 70 mS bis 95 mS bei einem pH von 4,8 bis 5,4 und bei einer Temperatur von 20°C entspricht, und b) das Nukleinsäuregemisch mit einem chromatographischen Trägermaterial in Kontakt gebracht wird, und a) das Trägermaterial anschließend mindestens einmal mit einer Lösung enthaltend ein Alkalisalz in einem Konzentrationsbereich von 900 mM bis 1800 mM bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4 und/oder ein Erdalkalisalz in einem Konzentrationsbereich von 100 mM bis 240 mM bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4 gewaschen wird, und c) die an das chromatographischen Trägermaterial gebundene Plasmid DNA anschließend mit einer Lösung enthaltend ein Alkalisalz in einer Konzentration von 1300 mM oder höher bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4 und/oder ein Erdalkalisalz in einer Konzentration von 270 mM oder höher bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4 eluiert wird.Surprisingly, the technical problem on which the invention is based is solved by a method according to the claims. In the method according to the invention, in order to separate the plasmid DNA from the other constituents of the nucleic acid mixture, in particular other nucleic acid species, a) the nucleic acid mixture with one or more alkali metal salts and / or alkaline earth metal salts in an aqueous solution is adjusted to a conductivity which has a conductivity of Corresponds to 70 mS to 95 mS at a pH of 4.8 to 5.4 and at a temperature of 20 ° C, and b) the nucleic acid mixture is brought into contact with a chromatographic support material, and a) the support material is then contacted at least once with a Solution containing an alkali salt in a concentration range of 900 mM to 1800 mM based on a pH of 7 to 7.4 and / or an alkaline earth metal salt in a concentration range of 100 mM to 240 mM based on a pH of 7 to 7.4, and c) the plasmid DNA bound to the chromatographic support material then with a Lö solution containing an alkali salt in a concentration of 1300 mM or higher based on a pH of 7 to 7.4 and / or an alkaline earth metal salt in a concentration of 270 mM or higher based on a pH of 7 to 7.4.
Zur Gewinnung eines Nukleinsäuregemisches müssen die Zellen, wobei es prokaryontische oder eukaryontische Zellen sein können, zunächst lysiert werden. Dies kann in der oben beschriebenen Weise geschehen. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die von Birnborn und Dohly (Nucl. Acids Res. 7, pp. 1513 - 1522; 1979) grundsätzlich beschriebene alkalische Lyse bevorzugt, jedoch nicht darauf beschränkt. Weitere Möglichkeiten sind die Lyse durch Hitze oder Lyse in Anwesenheit von Detergenzien. Als ungeeignet hat sich die Lyse durch hohen Druck (French Press) erwiesen, da durch die entstehenden hohen Scheerkräfte sehr kleine Fragmente genomischer DNA entstehen, die praktisch nicht mehr von der Plasmid- DNA zu trennen sind.To obtain a nucleic acid mixture, the cells, which may be prokaryotic or eukaryotic cells, must first be lysed. This can be done in the manner described above. In the process according to the invention, the alkaline lysis described in principle by Birnborn and Dohly (Nucl. Acids Res. 7, pp. 1513-1522; 1979) is preferred, but not limited thereto. Other options are lysis by heat or lysis in the presence of detergents. Lysis by high pressure (French press) has proven to be unsuitable, since the high shear forces created result in very small fragments of genomic DNA which are practically no longer separable from the plasmid DNA.
Ein Nukleinsäuregemisch im Sinne der Erfindung kann dabei ein Zelllysat ebenso wie ein vorgereinigtes oder geklärtes Lysat sein, kann aber auch ein artifizielles Gemisch darstellen, bei dem Plasmid-DNA mit mindestens einer weiteren Nukleinsäurespezies und gegebenenfalls anderen Kontaminanten verunreinigt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei dem Nukleinsäuregemisch um ein prokaryontisches geklärtes Lysat.A nucleic acid mixture in the sense of the invention can be a cell lysate as well as a pre-cleaned or clarified lysate, but can also be an artificial mixture in which plasmid DNA is contaminated with at least one further nucleic acid species and possibly other contaminants. In a preferred embodiment of the method according to the invention, the nucleic acid mixture is a prokaryotic clarified lysate.
Das erfindungsgemäße Verfahren gewährleistet die chromatographische Abtrennung der erwähnten Kontaminanten und liefert eine Plasmid-DNA, die die Anforderungen an die Reinheit zum Einsatz in der Gentherapie oder genetischen Vakzinierung erfüllt. Chromatographie versteht der Fachmann dabei als Sammelbegriff für die physikalisch-chemische Trennung von Substanzgemischen aufgrund ihrer unterschiedlichen Verteilung zwischen einer stationären Phase und einer mobilen Phase. In dem hier gegenständliche Verfahren wird zur Trennung der Plasmid-DNA von den Kontaminanten ein Anionenaustauscher-Material verwendet. Überraschenderweise zeigt insbesondere das im Handel erhältliche Material QIAGEN® (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland) seine Eignung im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt zu werden. Dieses Material ermöglicht mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens eine sehr effiziente Abtrennung der RNA, aber auch von z.B. ssDNA, von Plasmid-DNA. RNA und ssDNA eluieren bei hier näher definierten Bedingungen in einem distinkten Peak, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren sehr weit von dem ebenfalls sehr distinkten Peak der Plasmid-DNA entfernt liegt. Die Gefahr einer Coelution von Plasmid-DNA und RNA bzw. ssDNA ist somit im Vergleich zu den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren deutlich verringert.The method according to the invention ensures the chromatographic separation of the contaminants mentioned and provides a plasmid DNA which meets the purity requirements for use in gene therapy or genetic vaccination. The person skilled in the art understands chromatography as a collective term for the physical-chemical separation of substance mixtures due to their different distribution between a stationary phase and a mobile phase. In the process presented here, an anion exchange material is used to separate the plasmid DNA from the contaminants. Surprisingly, especially the commercially available material QIAGEN ® (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) its suitability in the inventive method is to be used. This material enables a very efficient separation of the RNA by means of the method according to the invention, but also from eg ssDNA, from plasmid DNA. Under conditions defined in more detail here, RNA and ssDNA elute in a distinct peak which, in the method according to the invention, is very far from the likewise very distinct peak of the plasmid DNA. The risk of co-elution of plasmid DNA and RNA or ssDNA is thus significantly reduced compared to the methods known from the prior art.
Das unter der Bezeichnung QIAGEN® (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland) erhältliche chromatographische Trägermaterial ist ein modifiziertes poröses anorganisches Material. Für ein chromatographische Trägermaterial im erfindungsgemäßen Verfahren kommen als anorganische Trägermaterialien Silicagel, Diatomeenerde, Glas, Aluminiumoxide, Titanoxide, Zirkonoxide, Hydroxylapatit und als organische Trägermaterialien solche wie Dextran, Agarose, Acrylamid, Polystyrolharze oder Copolymere aus den monomeren Bestandteilen der genannten Materialien in Frage.The chromatographic support material available under the name QIAGEN ® (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) is a modified porous inorganic material. For a chromatographic support material in the process according to the invention, silica gel, diatomaceous earth, glass, aluminum oxides, titanium oxides, zirconium oxides, hydroxylapatite and organic support materials such as dextran, agarose, acrylamide, polystyrene resins or copolymers of the monomeric constituents of the materials mentioned are suitable as inorganic support materials.
Der Anionenaustauscher, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise eingesetzt wird, ist beispielsweise durch die Umsetzung eines der oben genannten Trägermaterialien in einem ersten Schritt mit einem Silanisierungsreagenz der allgemeinen Formel IThe anion exchanger which is preferably used in the process according to the invention is, for example, by reacting one of the abovementioned support materials in a first step with a silanizing reagent of the general formula I.
R1R2R3SiR4 (I)R 1 R 2 R 3 SiR 4 (I)
wobeiin which
R1 ein Alkoxyrest mit 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere -OCH3, -OC2H5 oder - OC3H , oder ein Halogenatom, insbesondere -Cl, oder eine Dialkylaminogruppe mit identischen oder unterschiedlichen Alkylresten mit 1 bis 6 C-Atomen; R2 und R3 unabhängig voneinander ein Kohlenwasserstoff rest mit 1 bis 10 C- Atomen, insbesondere -CH3) -C2H5 oder -C3H7, oder ein Alkoxyrest mit 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere -OCH3, -OC2H5 oder -OC3H7, oder ein Halogenatom oder ein durch mindestens ein Sauerstoffatom oder eine Aminogruppe unterbrochener Alkylrest mit 4 bis 20 C-Atomen, wobei dieser Rest auch ein ein- oder mehrfach durch Halogen, Cyano, Nitro, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Hydroxy oder Aryl substituiert sein kann; R4 eine Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 20 C-Atomen oder ein durch mindestens ein Sauerstoffatom oder eine Aminogruppe unterbrochener Alkylrest, wobei dieser Rest auch ein- oder mehrfach mit Halogen, Cyano, Nitro, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Alkoxy, Hydroxy, Aryl und/oder Epoxy substituiert sein kann, insbesondereR 1 is an alkoxy radical with 1 to 10 C atoms, in particular -OCH 3 , -OC 2 H 5 or - OC 3 H, or a halogen atom, in particular -Cl, or a dialkylamino group with identical or different alkyl radicals with 1 to 6 C- atoms; R 2 and R 3 independently of one another are a hydrocarbon radical with 1 to 10 C atoms, in particular -CH 3) -C 2 H 5 or -C 3 H 7 , or an alkoxy radical with 1 to 10 C atoms, in particular -OCH 3 , -OC 2 H 5 or -OC 3 H 7 , or a halogen atom or an alkyl radical with 4 to 20 C atoms interrupted by at least one oxygen atom or an amino group, this radical also being a mono- or can be substituted several times by halogen, cyano, nitro, amino, monoalkylamino, dialkylamino, hydroxy or aryl; R 4 is a hydrocarbon chain with 1 to 20 carbon atoms or an alkyl radical interrupted by at least one oxygen atom or an amino group, this radical also one or more times with halogen, cyano, nitro, amino, monoalkylamino, dialkylamino, alkoxy, hydroxy, aryl and / or epoxy may be substituted, in particular
O / \ CH2 - CH2 - CH2 - O - CH2 - CH - CH2 ist,O / \ CH 2 - CH 2 - CH 2 - O - CH 2 - CH - CH 2 ,
gefolgt von einem zweiten Schritt, wobei der im ersten Schritt modifizierte Träger umgesetzt wird mit einem Reagenz der allgemeinen Formel IIfollowed by a second step, the carrier modified in the first step being reacted with a reagent of the general formula II
X-R-Y (II)X-R-Y (II)
wobeiin which
X eine Amino-, Hydroxy-, Epoxy-Gruppe oder ein Halogenatom, R eine Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 20 C-Atomen oder ein durch mindestens ein Sauerstoffatom oder eine Aminogruppe unterbrochener Alkylrest, wobei dieser Rest auch ein- oder mehrfach mit Halogen, Cyano, Nitro, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Alkoxy, Hydroxy, Aryl und/oder Epoxy substituiert sein kann, Y ein Kohlenwasserstoffrest mit Anionenaustauscher bildenden funktionellen Gruppen mit 1 bis 10 C-Atomen, der ein- oder mehrfach mit Amino-, Monoalkylamino-, Dialkylamino-, Trialkylammonium substituiert sein kann, ist, wie auch in EP 0 743 949, Seite 4 bis 5, auf die hier inhaltlich Bezug genommen wird, beschrieben.X is an amino, hydroxyl, epoxy group or a halogen atom, R is a hydrocarbon chain with 2 to 20 C atoms or an alkyl radical interrupted by at least one oxygen atom or an amino group, this radical also one or more times with halogen, cyano, Nitro, amino, monoalkylamino, dialkylamino, alkoxy, hydroxy, aryl and / or epoxy may be substituted, Y is a hydrocarbon radical with functional groups forming anion exchangers with 1 to 10 carbon atoms, one or more times with amino, monoalkylamino, dialkylamino -, Trialkylammonium can be, is, as also in EP 0 743 949, pages 4 to 5, to which reference is made here.
In einer bevorzugten Ausführung wird das Nukleinsäuregemisch gemäß des fakultativen Schritts a) des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem oder mehreren Alkalisalzen und/oder Erdalkalisalzen in einer wässrigen Lösung auf eine Leitfähigkeit eingestellt, die einer Leitfähigkeit von 70 mS bis 95 mS bei einem pH von 4,8 bis 5,4 und bei einer Temperatur von 20°C entspricht. Dem Fachmann ist bekannt, dass die Leitfähigkeit einer salzhaltigen Lösung in Abhängigkeit von der jeweiligen Temperatur und dem pH-Wert deutlich variieren kann und er kann aufgrund der ihm geläufigen Gesetzmäßigkeiten eine entsprechende Anpassung der Leitfähigkeiten bei Veränderungen der Temperatur und/oder des pH-Wertes vornehmen, sodass eine Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens auch bei Veränderung dieser Parameter problemlos möglich ist.In a preferred embodiment, the nucleic acid mixture according to the optional step a) of the above-described method according to the invention one or more alkali salts and / or alkaline earth salts in an aqueous solution to a conductivity that corresponds to a conductivity of 70 mS to 95 mS at a pH of 4.8 to 5.4 and at a temperature of 20 ° C. It is known to the person skilled in the art that the conductivity of a saline solution can vary significantly depending on the respective temperature and the pH value and, on the basis of the laws familiar to him, he can make a corresponding adjustment of the conductivities when the temperature and / or the pH value changes , so that the method according to the invention can be carried out without problems even when these parameters are changed.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise eingesetzten Salze sind Alkalisalze, also Salze, bei denen die kationische Komponente bzw. ein Teil der kationischen Komponente aus einem Element der ersten Hauptgruppe des Periodensystems der Elemente stammt, und/oder sind Erdalkalisalze, also Salze, bei denen die kationische Komponente bzw. ein Teil der kationischen Komponente aus einem Element der zweiten Hauptgruppe des Periodensystems der Elemente stammt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den Alkalisalzen um Alkalihalogenide und bei den Erdalkalisalzen um Erdalkalihalogenide. Besonders bevorzugt ist die Verwendung der Alkalihalogenide KCI, NaCI, CsCI und/oder LiCI sowie des Erdalkalihalogenids CaCI2. Alternativ zu den Alkali- bzw. Erdalkalisalzen kann auch ein Ammoniumsalz (Pseudoalkalisalz), bevorzugt ein Ammoniumsalz einer Carbonsäure, besonders bevorzugt Ammoniumacetat in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei den verwendeten Salzen um KCI und/oder NaCI. Neben den einzelnen Salzen können in dem erfindungsgemäßen Verfahren auch Gemische aus verschiedenen Alkalisalzen und/oder Erdalkalisalzen verwendet werden.The salts preferably used in the process according to the invention are alkali metal salts, i.e. salts in which the cationic component or part of the cationic component originates from an element of the first main group of the Periodic Table of the Elements, and / or are alkaline earth metal salts, i.e. salts in which the cationic component or part of the cationic component comes from an element of the second main group of the periodic table of the elements. The alkali salts are particularly preferably alkali halides and the alkaline earth salts are alkaline earth halides. The use of the alkali halides KCl, NaCl, CsCl and / or LiCl and the alkaline earth halide CaCl 2 is particularly preferred. As an alternative to the alkali or alkaline earth metal salts, an ammonium salt (pseudoalkali metal salt), preferably an ammonium salt of a carboxylic acid, particularly preferably ammonium acetate, can also be used in the process according to the invention. The salts used are very particularly preferably KCl and / or NaCl. In addition to the individual salts, mixtures of various alkali salts and / or alkaline earth metal salts can also be used in the process according to the invention.
In dem oben beschriebenen Waschschritt c) zur Elution der Kontaminanten werden Alkalisalze in einem Konzentrationsbereich von 900 mM bis 1800 mM bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4 und/oder Erdalkalisalze in einem Konzentrationsbereich von 100 mM bis 240 mM bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4 eingesetzt. Für den Waschschritt können grundsätzlich alle für den Fachmann sinnvoll erscheinenden wässrigen Lösungen eingesetzt werden, z.B. gepufferte Systeme wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, Tris-, Kaliumacetat-, Borat- oder MOPS-gepufferte Systeme, oder alternativ ungepufferte Systeme, d.h. die Salze werden ausschließlich in Wasser gelöst. Aus unterschiedlichen Puffersystemen können potentiell auch unterschiedliche pH-Werte resultieren bzw. diese können eingestellt werden. Die hier gewählten Konzentrationsbereiche beziehen sich auf einen pH-Wert von 7 bis 7,4, grundsätzlich kann der pH-Wert der Waschlösung in dem oben erwähnten pH- Bereich aber variiert werden. Dem Fachmann ist bekannt, dass bei Veränderung des pH-Wertes einer solchen Waschlösung auch die Konzentration der darin enthaltenen Salze geändert werden muss, um den gleichen Effekt, in diesem Fall also die Elution der Kontaminanten, zu erzielen, d.h. es kommt bei Durchführung des Verfahrens zu einer Verschiebung der Elutionspunkte von Kontaminanten (z.B. RNA) und Plasmid- DNA, bei gleichem pH-Wert von Wasch- und Elutionslösung nicht aber zu einer Verschiebung des Verhältnisses der Elutionspunkte, was bedeutet, dass der Abstand der Elutionspeaks der unterschiedlichen Nukleinsäurespezies vorteilhafterweise immer gleich bleibt. Die hierzu erforderlichen Parameter kann der Fachmann anhand seines Fachwissens ohne erfinderisches Zutun vornehmen. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst mindestens einen Waschschritt, es können aber auch mehrere, in der Anzahl dem Fachmann sinnvoll erscheinend, Waschschritte, auch mit untereinander verschiedenen erfindungsgemäßen Waschpuffern, durchgeführt werden.In the washing step c) described above for elution of the contaminants, alkali salts in a concentration range from 900 mM to 1800 mM based on a pH from 7 to 7.4 and / or alkaline earth metal salts in a concentration range from 100 mM to 240 mM based on a pH of 7 to 7.4 used. In principle, all aqueous solutions that appear sensible to a person skilled in the art can be used for the washing step, for example buffered systems such as, for example, but not limited to, tris, potassium acetate, borate or MOPS buffered systems, or alternatively unbuffered systems, ie the salts are only dissolved in water. Different pH values can potentially result from different buffer systems or these can be set. The concentration ranges selected here relate to a pH value of 7 to 7.4, but in principle the pH value of the washing solution can be varied in the above-mentioned pH range. It is known to the person skilled in the art that when the pH of such a washing solution is changed, the concentration of the salts contained therein must also be changed in order to achieve the same effect, in this case, therefore, the elution of the contaminants, that is to say when the method is carried out to a shift in the elution points of contaminants (eg RNA) and plasmid DNA, with the same pH value of the washing and elution solution but not to a shift in the ratio of the elution points, which means that the distance between the elution peaks of the different nucleic acid species is advantageously always the same remains. The person skilled in the art can carry out the parameters required for this on the basis of his specialist knowledge without inventive step. The method according to the invention comprises at least one washing step, but it is also possible to carry out a number of washing steps, which seem sensible in number to the person skilled in the art, also with washing buffers according to the invention which differ from one another.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird mindestens ein Waschschritt durchgeführt mit einer Lösung enthaltend KCI in einem Konzentrationsbereich von 1100 mM bis 1800 mM bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4, besonders bevorzugt wird mindestens ein Waschschritt durchgeführt mit einer Lösung enthaltend KCI in einem Konzentrationsbereich von 1300 mM bis 1700 mM bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4.In a preferred embodiment, at least one washing step is carried out with a solution containing KCI in a concentration range from 1100 mM to 1800 mM based on a pH of 7 to 7.4, particularly preferably at least one washing step is carried out with a solution containing KCI in a concentration range from 1300 mM to 1700 mM based on a pH of 7 to 7.4.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird mindestens ein Waschschritt durchgeführt mit einer Lösung enthaltend NaCI in einem Konzentrationsbereich von 950 mM bis 1200 mM bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4, besonders bevorzugt wird mindestens ein Waschschritt durchgeführt mit einer Lösung enthaltend NaCI in einem Konzentrationsbereich von 1100 mM bis 1150 mM bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4. In dem oben beschriebenen Elutionsschritt d) zur Elution der Plasmid-DNA werden Alkalisalze in einer Konzentration von 1300 mM oder höher bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4 und oder Erdalkalisalze in einer Konzentration von 270 mM oder höher bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4 eingesetzt. Für den Elutionsschritt können analog zum Waschschritt grundsätzlich alle für den Fachmann sinnvoll erscheinenden wässrigen Lösungen eingesetzt werden, z.B. gepufferte Systeme wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, Tris-, Kaliumacetat-, Borat- oder MOPS- gepufferte Systeme, oder alternativ ungepufferte Systeme, d.h. die Salze werden ausschließlich in Wasser gelöst. Aus unterschiedlichen Puffersystemen können potentiell auch unterschiedliche pH-Werte resultieren bzw. diese können eingestellt werden. Die hier gewählten Konzentrationsbereiche beziehen sich auf einen pH-Wert von 7 bis 7,4, grundsätzlich kann der pH-Wert der Elutionslösung in dem oben erwähnten pH-Bereich aber variiert werden. Dem Fachmann ist bekannt, dass bei Veränderung des pH-Wertes einer solchen Elutionslösung auch die Konzentration der darin enthaltenen Salze geändert werden muss, um den gleichen Effekt, in diesem Fall also die Elution der Plasmid-DNA, zu erzielen, d.h. es kommt bei Durchführung des Verfahrens zu einer Verschiebung der Elutionspunkte von Kontaminanten (z.B. RNA) und Plasmid-DNA, bei gleichem pH-Wert von Wasch- und Elutionslösung nicht aber zu einer Verschiebung des Verhältnisses der Elutionspunkte, was bedeutet, dass der Abstand der Elutionspeaks der unterschiedlichen Nukleinsäurespezies vorteilhafterweise immer gleich bleibt. Die hierzu erforderlichen Parameter kann der Fachmann anhand seines Fachwissens ohne erfinderisches Zutun vornehmen.In a further preferred embodiment, at least one washing step is carried out with a solution containing NaCl in a concentration range from 950 mM to 1200 mM based on a pH of 7 to 7.4, particularly preferably at least one washing step is carried out with a solution containing NaCl in a concentration range from 1100 mM to 1150 mM based on a pH of 7 to 7.4. In the elution step d) described above for the elution of the plasmid DNA, alkali salts in a concentration of 1300 mM or higher based on a pH of 7 to 7.4 and or alkaline earth metal salts in a concentration of 270 mM or higher based on a pH of 7 used up to 7.4. For the elution step, analogously to the washing step, in principle all aqueous solutions which appear sensible to the person skilled in the art can be used, for example buffered systems such as, but not limited to, tris, potassium acetate, borate or MOPS-buffered systems, or alternatively unbuffered systems, ie the salts are only dissolved in water. Different pH values can potentially result from different buffer systems or these can be set. The concentration ranges chosen here relate to a pH value of 7 to 7.4, but in principle the pH value of the elution solution can be varied in the above-mentioned pH range. It is known to the person skilled in the art that when the pH of such an elution solution is changed, the concentration of the salts contained in it must also be changed in order to achieve the same effect, in this case the elution of the plasmid DNA, that is to say when it is carried out of the method to shift the elution points of contaminants (e.g. RNA) and plasmid DNA, but not to shift the ratio of the elution points at the same pH value of the washing and elution solution, which means that the distance between the elution peaks of the different nucleic acid species advantageously always stays the same. The person skilled in the art can carry out the parameters required for this on the basis of his specialist knowledge without inventive step.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Elutionsschritt durchgeführt mit einer Lösung enthaltend KCI in einer Konzentration von 1900 mM oder höher bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4. Dabei ist die Konzentration von KCI nach oben nur durch seine Löslichkeit in der verwendeten Lösung begrenzt.In a preferred embodiment, the elution step is carried out with a solution containing KCI in a concentration of 1900 mM or higher, based on a pH of 7 to 7.4. The upper limit of KCI is only limited by its solubility in the solution used.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Elutionsschritt durchgeführt mit einer Lösung enthaltend NaCI in einer Konzentration 1300 mM oder höher bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4. Dabei ist die Konzentration von NaCI nach oben nur durch seine Löslichkeit in der verwendeten Lösung begrenzt. Die Einstellung der Leitfähigkeit des Nukleinsäuregemisches vor in Kontakt bringen des Nukleinsäuregemisches mit dem chromatographischen Trägermaterial erfolgt, wie oben bereits erwähnt, ebenfalls mit Alkalisalzen und/oder Erdalkalisalzen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Nukleinsäuregemisch mit KCI auf eine Leitfähigkeit eingestellt, die einer Leitfähigkeit von 70 mS bis 85 mS bei einem pH von 4,8 bis 5,4 und bei einer Temperatur von 20°C entspricht, ganz besonders bevorzugt auf eine Leitfähigkeit, die einer Leitfähigkeit von 70 mS bis 80 mS bei einem pH von 4,8 bis 5,4 und bei einer Temperatur von 20°C entspricht. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Nukleinsäuregemisch mit NaCI auf eine Leitfähigkeit eingestellt, die einer Leitfähigkeit von 70 mS bis 95 mS bei einem pH von 4,8 bis 5,4 und bei einer Temperatur von 20°C entspricht, ganz besonders bevorzugt auf eine Leitfähigkeit, die einer Leitfähigkeit von 85 mS bis 95 mS bei einem pH von 4,8 bis 5,4 und bei einer Temperatur von 20°C entspricht.In a further preferred embodiment, the elution step is carried out with a solution containing NaCl in a concentration of 1300 mM or higher, based on a pH of 7 to 7.4. The NaCI concentration is only limited by its solubility in the solution used. The setting of the conductivity of the nucleic acid mixture before bringing the nucleic acid mixture into contact with the chromatographic support material is also carried out, as already mentioned above, with alkali metal salts and / or alkaline earth metal salts. In a particularly preferred embodiment, the nucleic acid mixture is adjusted with KCI to a conductivity which corresponds to a conductivity of 70 mS to 85 mS at a pH of 4.8 to 5.4 and at a temperature of 20 ° C., very particularly preferably one Conductivity that corresponds to a conductivity of 70 mS to 80 mS at a pH of 4.8 to 5.4 and at a temperature of 20 ° C. In a further particularly preferred embodiment, the nucleic acid mixture is adjusted with NaCl to a conductivity which corresponds to a conductivity of 70 mS to 95 mS at a pH of 4.8 to 5.4 and at a temperature of 20 ° C., very particularly preferably a conductivity that corresponds to a conductivity of 85 mS to 95 mS at a pH of 4.8 to 5.4 and at a temperature of 20 ° C.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren mindestens in dem oben mit c) gekennzeichneten Waschschritt des chromatographischen Trägermaterials das Alkalihalogenid KCI eingesetzt.In a preferred embodiment, the alkali halide KCI is used in the process according to the invention at least in the washing step of the chromatographic support material identified above with c).
Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt bei Raumtemperatur durchgeführt. Raumtemperatur bedeutet im vorliegenden Falle, dass das Verfahren bei normalen Prozessbedingungen durchgeführt wird, entsprechend etwa einem Rahmen von 18°C bis 25°C. Grundsätzlich kann das Verfahren bei allen dem Fachmann sinnvoll erscheinenden Temperaturen durchgeführt werden.The process according to the invention is preferably carried out at room temperature. In the present case, room temperature means that the process is carried out under normal process conditions, corresponding approximately to a range from 18 ° C to 25 ° C. In principle, the method can be carried out at all temperatures which appear sensible to the person skilled in the art.
Vorzugsweise eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Aufreinigung von Plasmid-DNA. Überraschender- und vorteilhafterweise hat sich gezeigt, dass Plasmide unterschiedlichster Größe keine signifikanten Unterschiede in den Elutionspunkten, d.h. in den Salzkonzentrationen, bei welchen eine Elution der Plasmid-DNA vom chromatographischen Trägermaterial erfolgt, zeigen. Eine Adaption der Parameter des Verfahrens, wie beispielsweise Salzkonzentrationen oder pH-Werte, an unterschiedliche Plasmidgrößen ist somit nicht erforderlich. Da mit dem Erfindungsgegenstand ein Verfahren zur Verfügung steht, in dem auch im 'large scale' Plasmid zur Herstellung eines Plasmid-DNA-haltigen Mittels zum Einsatz in der Gentherapie oder genetischen Vakzinierung gewonnen werden können, kann vorteilhafterweise eine Endotoxinentfernung völlig problemlos in das Verfahren eingebaut werden. Hierzu können nahezu alle aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren benutzt werden. Beispielsweise kann das geklärte Lysat mit einem aus dem Stand der Technik bekannten Endotoxin-Entfernungspuffer (z.B. enthaltend Triton X 100, Triton X 114, Polymyxin, etc.) versetzt werden und ohne Änderung im vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahrens weiter verwendet werden.The method according to the invention is preferably suitable for the purification of plasmid DNA. Surprisingly and advantageously, it has been found that plasmids of different sizes do not show any significant differences in the elution points, ie in the salt concentrations at which the plasmid DNA is eluted from the chromatographic support material. It is therefore not necessary to adapt the parameters of the method, such as salt concentrations or pH values, to different plasmid sizes. Since a method is available with the subject matter of the invention in which large scale plasmid can also be obtained for the production of a plasmid DNA-containing agent for use in gene therapy or genetic vaccination, endotoxin removal can advantageously be incorporated into the method without any problems become. Almost all methods known from the prior art can be used for this. For example, the clarified lysate can be mixed with an endotoxin removal buffer known from the prior art (for example containing Triton X 100, Triton X 114, polymyxin, etc.) and used without change in the method according to the invention.
Abbildungenpictures
Abbildung 1 :Illustration 1 :
Aufgetragen ist die Extinktion bei 254 nm des Durchflusses einer mit QIAGEN®- Chromatographiematerial gefüllten HPLC-Säule gegen die KCI-Konzentration. Dargestellt ist die Elution unterschiedlicher Nukleinsäurespezies mit steigender KCI- Konzentration. Die Versuchsbedingungen sind in Beispiel 2 näher erläutert.The absorbance is plotted against the KCI concentration at 254 nm of the flow through an HPLC column filled with QIAGEN ® chromatography material. The elution of different nucleic acid species with increasing KCI concentration is shown. The test conditions are explained in more detail in Example 2.
BeispieleExamples
Beispiel 1: Aufreiniqunq von pCMVß aus E.coli DH5ocExample 1: Purification of pCMVß from E.coli DH5oc
Aus 30 L einer Übernacht-Fermentationskultur von E.coli DH5α, enthaltend pCMVß- Plasmid, wurde durch Zentrifugation 1 kg Biomasse gewonnen. Die Biomasse wurde in 15 L eines Resuspendierungspuffers (10 mM EDTA; 50 mM Tris/HCI pH 8) resuspendiert und anschließend mit 15 L eines Lysepuffers (200 mM NaOH; 1 % (w/v) SDS) für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss wurden 15 L eines Neutralisationspuffers (3 M Kaliumacetat, pH 5,5) zugegeben. Das in diesem Schritt entstandene Präzipitat (Proteine, Membranbestandteile, genomische DNA, etc.) wurde anschließend entfernt. Das so vorgeklärte Lysat wurde anschließend noch filtriert, wodurch ein geklärtes Lysat erzeugt wurde. Das geklärte Lysat wies in der Folge einen pH von 5,2 auf und wurde bei einer Temperatur von 20°C mit 3 M KCI auf eine Leitfähigkeit von 80 mS eingestellt.1 kg of biomass was obtained from 30 L of an overnight fermentation culture of E. coli DH5α, containing pCMVß plasmid, by centrifugation. The biomass was resuspended in 15 L of a resuspension buffer (10 mM EDTA; 50 mM Tris / HCl pH 8) and then incubated with 15 L of a lysis buffer (200 mM NaOH; 1% (w / v) SDS) for 10 minutes at room temperature. 15 L of a neutralization buffer (3 M potassium acetate, pH 5.5) were then added. The precipitate formed in this step (proteins, membrane components, genomic DNA, etc.) was then removed. The lysate thus pre-clarified was then filtered, whereby a clarified lysate was produced. The clarified lysate indicated consequently a pH of 5.2 and was adjusted at a temperature of 20 ° C with 3 M KCI to a conductivity of 80 mS.
Eine Chromatographiesäule wurde mit QIAGEN®-Chromatographiematerial gefüllt (Säulenvolumen ca. 7 L) und mit 10 Säulenvolumina eines Aquilibrierungspuffers (20 mM Kaliumacetat) bei einer Flussrate von 3,3 cm/min äquilibriert. Das geklärte Lysat wurde nach der Äquilibrierung des Chromatographiematerials auf die Säule geladen, der Lauf erfolgte mit einer Flussrate von 1 ,1 cm/min. Anschließend wurden noch einmal 5 Säulevolumina Äquilibrierungspuffer (20 mM Kaliumacetat) mit einer Flussrate von 3,3 cm/min über die Säule gegeben.A chromatography column was equilibrated with QIAGEN ® -Chromatographiematerial filled (column volume ca. 7 L) and washed with 10 column volumes of a Aquilibrierungspuffers (20 mM potassium acetate) at a flow rate of 3.3 cm / min. The clarified lysate was loaded onto the column after equilibration of the chromatography material, and the run was carried out at a flow rate of 1.1 cm / min. 5 column volumes of equilibration buffer (20 mM potassium acetate) were then again passed over the column at a flow rate of 3.3 cm / min.
Die Säule wurde direkt im Anschluss mit 10 Säulenvolumina einer KCI-Lösung (1350mM KCI; 50 mM Tris/HCI, pH 7,2) bei einer Flussrate von 3,3 cm/min gewaschen. Darauf folgend wurden die Plasmide mit einem Säulenvolumen eines Elutionspuffers (1600 mM NaCI; 50 mM Tris/HCI, pH 7,2) eluiert. Nach anschließender Ultra-/Diafiltration und finaler Sterilfiltration ergab sich eine Ausbeute von ca. 400 mg pCMVß.The column was then washed directly with 10 column volumes of a KCI solution (1350 mM KCI; 50 mM Tris / HCl, pH 7.2) at a flow rate of 3.3 cm / min. The plasmids were then eluted with a column volume of an elution buffer (1600 mM NaCl; 50 mM Tris / HCl, pH 7.2). After subsequent ultrafiltration / diafiltration and final sterile filtration, a yield of approximately 400 mg pCMVß resulted.
Beispiel 2:Example 2:
In 4 unterschiedlichen Ansätzen wurden je 600 μg eines aufgereinigten Plasmids (1 : Plasmid A [3266 bp]; 2: Plasmid B [7200 bp];3: Plasmid C [7687 bp]; 4: Plasmid D [19535 bp]) zusammen mit jeweils 600 μg aufgereinigter RNA (E.coli HB101) in 5 ml 60 mM Kaliumacetat gelöst.In 4 different batches, 600 μg each of a purified plasmid (1: plasmid A [3266 bp]; 2: plasmid B [7200 bp]; 3: plasmid C [7687 bp]; 4: plasmid D [19535 bp]) together with 600 μg each of purified RNA (E.coli HB101) dissolved in 5 ml of 60 mM potassium acetate.
Eine HPLC-Säule (Säulenvolumen 4,4 ml) wurde mit QIAGEN®- Chromatographiematerial gefüllt und mit 2 Säulenvolumina (Flussrate 1 ml/min) Äquilibrierungspuffer (60 mM Kaliumacetat) äquilibriert. Anschließend wurden in 4 einzelnen Säulen mit jeweils frisch gepackten HPLC-Säulen die 5 ml des Plasmid- RNA-Gemisches mit 1 ml/min durch die Säule gegeben, die Säule anschließend mit 3 Säulenvolumina 60 mM Kaliumacetat gespült. In einem kontinuierlichen Gradienten wurde ein Tris-Puffer über die Säule gegeben (50 mM Tris/HCI; pH 7,2; Gradient 0 bis 3 M KCI) und die Elution von DNA und RNA mittels eines Photometers (Extinktionsmessung bei 254 nm) bestimmt. Dabei konnte gezeigt werden, dass bereits teilweise degradierte und kurzkettige RNA in einem distinkten Peak (Maximum bei 780 mM KCI) eluiert wird, gefolgt von einem nur leicht diffusen Peak längerkettiger RNA (Maximum bei 1120 mM KCI, Ende der Elution bei 1310 mM KCI). Die Elution der Plasmid-DNA erreicht ein Maximum bei 1900 mM KCI und endet bei 2150 mM KCI. Die Ergebnisse sind als übereinandergelegte Spuren in Abbildung 1 dargestellt. Es wird deutlich, dass die Plasmide vorteilhafterweise unabhängig von ihrer Größe eluieren. An HPLC column (column volume 4.4 ml) was filled with QIAGEN ® chromatography material and equilibrated with 2 column volumes (flow rate 1 ml / min) equilibration buffer (60 mM potassium acetate). The 5 ml of the plasmid-RNA mixture were then passed through the column at 4 ml in 4 individual columns, each with freshly packed HPLC columns, and the column was then rinsed with 3 column volumes of 60 mM potassium acetate. A Tris buffer was passed over the column in a continuous gradient (50 mM Tris / HCl; pH 7.2; gradient 0 to 3 M KCI) and the elution of DNA and RNA was determined using a photometer (absorbance measurement at 254 nm). It could be shown that partially degraded and short-chain RNA is eluted in a distinct peak (maximum at 780 mM KCI), followed by an only slightly diffuse peak of longer-chain RNA (maximum at 1120 mM KCI, end of elution at 1310 mM KCI) , The elution of the plasmid DNA reaches a maximum at 1900 mM KCI and ends at 2150 mM KCI. The results are shown as superimposed tracks in Figure 1. It is clear that the plasmids advantageously elute regardless of their size.

Claims

Ansprüche Expectations
1. Verfahren zur chromatographischen Trennung eines Nukleinsäuregemisches, wobei Plasmid-DNA von anderen Bestandteilen des Gemisches, insbesondere anderen Nukleinsäuren, getrennt wird, dadurch gekennzeichnet, dass b) gegebenenfalls das Nukleinsäuregemisch mit einem oder mehreren Alkalisalzen und/oder Erdalkalisalzen in einer wässrigen Lösung auf eine Leitfähigkeit eingestellt wird, die einer Leitfähigkeit von 70 mS bis 95 mS bei einem pH von 4,8 bis 5,4 und bei einer Temperatur von 20°C entspricht, und c) das Nukleinsäuregemisch mit einem chromatographischen Trägermaterial in Kontakt gebracht wird, und d) das Trägermaterial anschließend mindestens einmal mit einer Lösung enthaltend ein Alkalisalz in einem Konzentrationsbereich von 900 mM bis 1800 mM bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4 und/oder ein Erdalkalisalz in einem Konzentrationsbereich von 100 mM bis 240 mM bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4 gewaschen wird, und e) die an das chromatographischen Trägermaterial gebundene Plasmid DNA anschließend mit einer Lösung enthaltend ein Alkalisalz in einer Konzentration von 1300 mM oder höher bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4 und/oder ein Erdalkalisalz in einer Konzentration von 270 mM oder höher bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4 eluiert wird.1. A method for the chromatographic separation of a nucleic acid mixture, wherein plasmid DNA is separated from other constituents of the mixture, in particular other nucleic acids, characterized in that b) optionally the nucleic acid mixture with one or more alkali salts and / or alkaline earth salts in an aqueous solution onto a Conductivity is set which corresponds to a conductivity of 70 mS to 95 mS at a pH of 4.8 to 5.4 and at a temperature of 20 ° C, and c) the nucleic acid mixture is brought into contact with a chromatographic support material, and d ) the carrier material then at least once with a solution containing an alkali salt in a concentration range of 900 mM to 1800 mM based on a pH of 7 to 7.4 and / or an alkaline earth metal in a concentration range of 100 mM to 240 mM based on a pH of 7 to 7.4 is washed, and e) bound to the chromatographic support material then a plasmid DNA with a solution containing an alkali salt in a concentration of 1300 mM or higher based on a pH of 7 to 7.4 and / or an alkaline earth metal salt in a concentration of 270 mM or higher based on a pH of 7 to 7, 4 is eluted.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Alkalisalz ein Alkalihalogenid ist und das Erdalkalisalz ein Erdalkalihalogenid ist.2. The method according to claim 1, characterized in that the alkali metal salt is an alkali metal halide and the alkaline earth metal salt is an alkaline earth metal halide.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Alkalihalogenid NaCI, KCI, CsCI und/oder LiCI ist und das Erdalkalihalogenid CaCI2 ist.3. The method according to claim 2, characterized in that the alkali halide is NaCI, KCI, CsCI and / or LiCI and the alkaline earth halide is CaCI 2 .
4. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäuregemisch mit KCI auf eine Leitfähigkeit eingestellt wird, die einer Leitfähigkeit von 70 mS bis 85 mS bei einem pH von 4,8 bis 5,4 und bei einer Temperatur von 20°C entspricht. 4. The method according to claims 1 to 3, characterized in that the nucleic acid mixture is adjusted with KCI to a conductivity that has a conductivity of 70 mS to 85 mS at a pH of 4.8 to 5.4 and at a temperature of 20 ° C corresponds.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäuregemisch mit KCI auf eine Leitfähigkeit eingestellt wird, die einer Leitfähigkeit von 70 mS bis 80 mS bei einem pH von 4,8 bis 5,4 und bei einer Temperatur von 20°C entspricht.5. The method according to claim 4, characterized in that the nucleic acid mixture is adjusted with KCI to a conductivity which corresponds to a conductivity of 70 mS to 80 mS at a pH of 4.8 to 5.4 and at a temperature of 20 ° C ,
6. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäuregemisch mit NaCI auf eine Leitfähigkeit eingestellt wird, die einer Leitfähigkeit von 70 mS bis 95 mS bei einem pH von 4,8 bis 5,4 und bei einer Temperatur von 20°C entspricht.6. The method according to claims 1 to 3, characterized in that the nucleic acid mixture is adjusted with NaCl to a conductivity which has a conductivity of 70 mS to 95 mS at a pH of 4.8 to 5.4 and at a temperature of 20 ° C corresponds.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäuregemisch mit NaCI auf eine Leitfähigkeit eingestellt wird, die einer Leitfähigkeit von 85 mS bis 95 mS bei einem pH von 4,8 bis 5,4 und bei einer Temperatur von 20°C entspricht.7. The method according to claim 6, characterized in that the nucleic acid mixture is adjusted with NaCl to a conductivity which corresponds to a conductivity of 85 mS to 95 mS at a pH of 4.8 to 5.4 and at a temperature of 20 ° C. ,
8. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der/die Waschschritt e aus Schritt b) von Anspruch 1 mit einer Lösung enthaltend KCI in einem Konzentrationsbereich von 1100 mM bis 1800 mM bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4 durchgeführt wird/werden.8. The method according to claims 1 to 7, characterized in that the washing step (s) from step b) of claim 1 with a solution containing KCI in a concentration range from 1100 mM to 1800 mM based on a pH of 7.4 to 7.4 will be carried out.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der/die Waschschritt e aus Schritt b) von Anspruch 1 mit einer Lösung enthaltend KCI in einem Konzentrationsbereich von 1300 mM bis 1700 mM bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4 durchgeführt wird/werden.9. The method according to claim 8, characterized in that the washing step (s) from step b) of claim 1 is carried out with a solution containing KCI in a concentration range from 1300 mM to 1700 mM based on a pH of 7 to 7.4 / become.
10. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der/die Waschschritt/e aus Schritt b) von Anspruch 1 mit einer Lösung enthaltend NaCI in einem Konzentrationsbereich von 950 mM bis 1200 mM bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4 durchgeführt wird/werden.10. The method according to claims 1 to 7, characterized in that the washing step (s) from step b) of claim 1 with a solution containing NaCl in a concentration range from 950 mM to 1200 mM based on a pH of 7 to 7, 4 will be carried out.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der/die Waschschritt/e aus Schritt b) von Anspruch 1 mit einer Lösung enthaltend NaCI in einem Konzentrationsbereich von 1100 mM bis 1150 mM bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4 durchgeführt wird/werden. 11. The method according to claim 10, characterized in that the washing step (s) from step b) of claim 1 is carried out with a solution containing NaCl in a concentration range from 1100 mM to 1150 mM based on a pH of 7 to 7.4 /become.
12. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass der Elutionsschritt aus Schritt c) von Anspruch 1 mit einer Lösung enthaltend KCI in einer Konzentration von 1900 mM oder höher bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4 durchgeführt wird.12. The method according to claims 1 to 11, characterized in that the elution step from step c) of claim 1 is carried out with a solution containing KCI in a concentration of 1900 mM or higher, based on a pH of 7 to 7.4.
13. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass der Elutionsschritt aus Schritt c) von Anspruch 1 mit einer Lösung enthaltend NaCI in einer Konzentration von 1300 mM oder höher bezogen auf einen pH von 7 bis 7,4 durchgeführt wird.13. The method according to claims 1 to 11, characterized in that the elution step from step c) of claim 1 is carried out with a solution containing NaCl in a concentration of 1300 mM or higher, based on a pH of 7 to 7.4.
14. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das chromatographische Trägermaterial ein Anionenaustauscher ist.14. The method according to claims 1 to 13, characterized in that the chromatographic support material is an anion exchanger.
15. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass als chromatographische Trägermaterial Silicagel, Diatomeenerde, Glas, Aluminiumoxide,15. The method according to claims 1 to 14, characterized in that the chromatographic support material is silica gel, diatomaceous earth, glass, aluminum oxides,
Titanoxide, Zirkonoxide, Hydroxylapatit, Dextran, Agarose, Acrylamid, Polystyrolharze oder Copolymere der genannten Materialien verwendet werden.Titanium oxides, zirconium oxides, hydroxylapatite, dextran, agarose, acrylamide, polystyrene resins or copolymers of the materials mentioned can be used.
16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das chromatographische Trägermaterial erhältlich ist durch Umsetzung eines der in16. The method according to claim 15, characterized in that the chromatographic support material is obtainable by reacting one of the in
Anspruch 15 genannten Trägermaterialien in einem ersten Schritt mit einem Silanisierungsreagenz der allgemeinen Formel I Claim 15 carrier materials mentioned in a first step with a silanizing reagent of the general formula I.
wobei R1 ein Alkoxyrest mit 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere -OCH3, -OC2H5 oder - OCßH?, oder ein Halogenatom, insbesondere -Cl, oder eine Dialkylaminogruppe mit identischen oder unterschiedlichen Alkylresten mit 1 bis 6 C-Atomen; R2 und R3 unabhängig voneinander ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 C- Atomen, insbesondere -CH3, -C2H5 oder -C3H7, oder ein Alkoxyrest mit 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere -OCH3, -OC2H5 oder -OC3H7, oder ein Halogenatom oder ein durch mindestens ein Sauerstoffatom oder eine Aminogruppe unterbrochener Alkylrest mit 4 bis 20 C-Atomen, wobei dieser Rest auch ein ein- oder mehrfach durch Halogen, Cyano, Nitro, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Hydroxy oder Aryl substituiert sein kann; R4 eine Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 20 C-Atomen oder ein durch mindestens ein Sauerstoffatom oder eine Aminogruppe unterbrochener Alkylrest, wobei dieser Rest auch ein- oder mehrfach mit Halogen, Cyano, Nitro, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Alkoxy, Hydroxy, Aryl und/oder Epoxy substituiert sein kann, insbesonderewherein R 1 is an alkoxy radical with 1 to 10 C atoms, in particular -OCH 3 , -OC 2 H 5 or - OC ß H ?, or a halogen atom, in particular -Cl, or a dialkylamino group with identical or different alkyl radicals with 1 to 6 carbon atoms; R 2 and R 3 independently of one another are a hydrocarbon radical with 1 to 10 C atoms, in particular -CH 3 , -C 2 H 5 or -C 3 H 7 , or an alkoxy radical with 1 to 10 C atoms, in particular -OCH 3 , -OC 2 H 5 or -OC 3 H 7 , or a halogen atom or an alkyl radical with 4 to 20 C atoms interrupted by at least one oxygen atom or an amino group, this radical also being a mono- or can be substituted several times by halogen, cyano, nitro, amino, monoalkylamino, dialkylamino, hydroxy or aryl; R 4 is a hydrocarbon chain with 1 to 20 carbon atoms or an alkyl radical interrupted by at least one oxygen atom or an amino group, this radical also one or more times with halogen, cyano, nitro, amino, monoalkylamino, dialkylamino, alkoxy, hydroxy, aryl and / or epoxy may be substituted, in particular
O / \ - CH2 - CH2 - CH2 - O - CH2 - CH - CH2 - ist,O / \ - CH 2 - CH 2 - CH 2 - O - CH2 - CH - CH 2 -,
gefolgt von einem zweiten Schritt, wobei der im ersten Schritt modifizierte Träger umgesetzt wird mit einem Reagenz der allgemeinen Formel IIfollowed by a second step, the carrier modified in the first step being reacted with a reagent of the general formula II
X-R-Y (II)X-R-Y (II)
wobei X eine Amino-, Hydroxy-, Epoxy-Gruppe oder ein Halogenatom, R eine Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 20 C-Atomen oder ein durch mindestens ein Sauerstoffatom oder eine Aminogruppe unterbrochener Alkylrest, wobei dieser Rest auch ein- oder mehrfach mit Halogen, Cyano, Nitro, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Alkoxy, Hydroxy, Aryl und/oder Epoxy substituiert sein kann, Y ein Kohlenwasserstoffrest mit Anionenaustauscher bildenden funktioneilen Gruppen mit 1 bis 10 C-Atomen, der ein- oder mehrfach mit Amino-, Monoalkylamino-, Dialkylamino-, Trialkylammonium substituiert sein kann, ist.where X is an amino, hydroxyl, epoxy group or a halogen atom, R is a hydrocarbon chain having 2 to 20 carbon atoms or an alkyl radical interrupted by at least one oxygen atom or an amino group, this radical also being used one or more times with halogen, cyano , Nitro, amino, monoalkylamino, dialkylamino, alkoxy, hydroxyl, aryl and / or epoxy may be substituted, Y is a hydrocarbon radical with functional groups with 1 to 10 C atoms forming anion exchangers, one or more times with amino, monoalkylamino, Dialkylamino-, Trialkylammonium can be substituted.
17. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren bei Raumtemperatur durchgeführt wird.17. The method according to claims 1 to 16, characterized in that the method is carried out at room temperature.
18. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens in Schritt b) von Anspruch 1 als Salz KCI verwendet wird. 18. The method according to claims 1 to 3, characterized in that at least in step b) of claim 1 is used as the salt KCI.
19. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass in den Schritten a), c) und d) des Anspruchs 1 auch Gemische verschiedener Alkalisalze und/oder Erdalkalisalze verwendet werden können.19. The method according to claim 1, characterized in that in steps a), c) and d) of claim 1, mixtures of different alkali metal salts and / or alkaline earth metal salts can also be used.
20. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäuregemisch ein geklärtes Lysat prokaryontischer Zellen ist.20. The method according to claims 1 to 19, characterized in that the nucleic acid mixture is a clarified lysate of prokaryotic cells.
21. Verwendung des Verfahrens gemäß der Ansprüche 1 bis 20 zur Auf reinigung von Plasmid-DNA.21. Use of the method according to claims 1 to 20 for the purification of plasmid DNA.
22. Verwendung der mittels eines Verfahrens gemäß der Ansprüche 1 bis 20 gewonnen Plasmide zur Herstellung eines Plasmid-DNA-haltigen Mittels zum Einsatz in der Gentherapie oder genetischen Vakzinierung. 22. Use of the plasmids obtained by means of a method according to claims 1 to 20 for the production of an agent containing plasmid DNA for use in gene therapy or genetic vaccination.
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