EP2209543A1 - Verwendung von schichtdoppelhydroxiden zur an- bzw. abreicherung von biomolekülen aus flüssigen oder fluiden medien - Google Patents

Verwendung von schichtdoppelhydroxiden zur an- bzw. abreicherung von biomolekülen aus flüssigen oder fluiden medien

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EP2209543A1
EP2209543A1 EP08802738A EP08802738A EP2209543A1 EP 2209543 A1 EP2209543 A1 EP 2209543A1 EP 08802738 A EP08802738 A EP 08802738A EP 08802738 A EP08802738 A EP 08802738A EP 2209543 A1 EP2209543 A1 EP 2209543A1
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EP
European Patent Office
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layered double
double hydroxide
biomolecule
hydrotalcite
biomolecules
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08802738A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kirstin Suck
Friedrich Ruf
Ulrich Sohling
Thomas Scheper
Cornelia Kasper
Kathrin Ralla
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Sued Chemie IP GmbH and Co KG
Original Assignee
Sued Chemie AG
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Publication date
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Publication of EP2209543A1 publication Critical patent/EP2209543A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
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    • B01J20/06—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising oxides or hydroxides of metals not provided for in group B01J20/04
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    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
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    • Y02C—CAPTURE, STORAGE, SEQUESTRATION OR DISPOSAL OF GREENHOUSE GASES [GHG]
    • Y02C20/00—Capture or disposal of greenhouse gases
    • Y02C20/40—Capture or disposal of greenhouse gases of CO2

Definitions

  • the present invention relates to a method for enrichment or depletion of biomolecules, in particular peptides, depspeptides, Peptidnuklemsauren (PNAs) and proteins from liquid media by means of a Schichtdoppelhydroxids.
  • the present invention relates to the use of certain layered double hydroxides for the addition or incorporation of at least one compound selected from the above group of biomolecules.
  • Biomolecules such as enzymes, hormones or antibodies, belong to the group of proteins on which almost every biological reaction depends.
  • the large-scale production of these biomolecule is done today with the help of cell culture technology in microorganisms or Saugetlerzellen in so-called fermenters.
  • the target proteins are purified in a series of steps from the rest of the cell mass. This purification can involve many steps and thus can cost up to 80% of the total cost of the process.
  • chromatographic methods are usually used to enrich the target protein in the process stream on the one hand and on the other hand to separate foreign proteins and other contaminants such as endotoxins, viruses or DNA. If the chromatography materials are used repeatedly, they must be continually checked for their separation performance or any microbial contamination.
  • Hydrotalcite belongs to the class of so-called Schichtdoppel- hydroxide (layered double hydroxides, LDH), represented by the general formula [M 2+ i x N 3+ x (OH) 2] [A n "] x / n • y H 2 O.
  • Schichtdoppel- hydroxide layered double hydroxides, LDH
  • M 2+ is a divalent alkaline earth or transition metal ion such as Mg 2+ , Ni 2+ , Cu 2+ or Zn 2+
  • N 3+ is a trivalent main group or transition metal ion such as Al 3+ , Cr 3 + , Fe 3+ or Ga 3+
  • x is a rational number between 0 and 1 and y is a positive number including 0.
  • Hydrotalcite is usually composed of magnesium and aluminum ions and carbonate as an anion Hydrotalcite has a cationic layer structure and could therefore be used as an ion exchanger for anionic proteins
  • An overview of common chromatographic materials for ion exchangers is available in: Protein purification: principles, high resolution methods, and application, 1998 2 nd edition, pages 164-165.
  • hydrotalcite in the activated, calcined form as anion exchanger or adsorbent is known from the prior art. When calcining hydrotalcite in the Usually treated for several hours at 600 0 C, with water and carbon dioxide escape. The calcined hydrotalcites have basic properties and are very heat stable.
  • US 2005/0196850 A1 describes the immobilization of the enantioselective enzyme lipase from the organism Candida rugosa on conventional Mg-Al hydrotalcite.
  • DE 102 37 518 A1 and DE 102 37 517 A1 describe a process for the treatment of biomolecules, in particular DNA, in liquid or fluid media using a calcined layered double hydroxide as sorbent.
  • the layer double hydroxides used according to the prior art as Anionenadsorptionsmittel are especially for the stable and reversible attachment or storage of biomolecules from the group of proteins, peptides, depsipeptides, Peptidnuklem- acids (PNAs), especially in active form, eg to obtain enzymatic Activity in enzymes or binding speci fi cations, eg in the case of antibodies, etc., or for accumulation or depletion of biomolecules from liquid or fluid media is not sufficiently suitable.
  • PNAs Peptidnuklem- acids
  • the object of the invention was therefore to provide stable and inexpensive layered double hydroxides, which enable a particularly efficient accumulation or incorporation of proteins, in particular for accumulation or depletion of proteins from liquid or fluid media.
  • the attached or embedded biomolecules from the group of proteins, peptides, depsipeptides, peptide nucleic acids (PNAs) should be immobilized in native or active form, if possible, in order to keep the desired properties of the biomolecule as unchanged as possible relative to the non-immobilized starting biomolecule allow. In a preferred task, it should also be possible to recover the separated biomolecules.
  • the disadvantages of the prior art should be avoided and a particularly effective interaction between the layered double hydroxide and the proteins should be ensured depending on the type of use.
  • certain layered double hydroxides with a specific ratio of Mg 2+ to Al 3+ cations represent a particularly favorable accumulation or incorporation of biomolecules selected from the group of proteins, peptides, depsipeptides, peptide nucleic acids (PNAs). and unexpectedly better suited for the immobilization of such biomolecules in "active" form.
  • Erfmdungsgelien is therefore the molar ratio of Mg 2+ to Al 3+ in Schichtdoppelhdydroxid at a maximum of 2.5: 1.
  • the present invention relates to the use of a layered double hydroxide selected from the group consisting of natural and synthetic hydrotalcites and compounds having a hydrotalcite-like structure, wherein the layered double hydroxide is in uncalcined form and m is carbonate form, and wherein the molar ratio of Mg 2+ to Al 3+ in Schichtdoppelhdydroxid at a maximum of 2.5: 1, for on or Incorporation of a compound selected from the group consisting of biomolecules, in particular peptides, depsipeptides, peptide-nuclear acids (PNAs) and proteins.
  • a layered double hydroxide selected from the group consisting of natural and synthetic hydrotalcites and compounds having a hydrotalcite-like structure, wherein the layered double hydroxide is in uncalcined form and m is carbonate form, and wherein the molar ratio of Mg 2+ to Al 3+ in Schichtdoppelhdydroxid at a maximum of 2.5: 1, for
  • the layered double hydroxides used according to the invention are thus selected from the group consisting of natural and synthetic hydrotalcites and compounds having a hydrotalcite-like structure.
  • the person skilled in the art is familiar with what is meant by hydrotalcites and compounds having a hydrotalcite-like structure.
  • a layered double hydroxide selected from the group of natural and synthetic hydrotalcites and hydrotalcite-like compounds can be used, as described, for example, in US Pat Catalysis Today, Vol. 11 (No.2) of December 2, 1991, pages 173 to 301. (“hydrotacite-like compounds”) Such compounds have a hydrotalcite-like structure.
  • the molar ratio of Mg 2+ to Al 3+ is at most 2.5: 1, preferably at most 2.3: 1, more preferably at most 2, 1: 1, in particular at most 2.0: 1, and / or the weight loss ratio of M 2+ to N 3+ , calculated as the weight ratio of the oxides MO to N 2 O 3 , at a maximum of 2.2: 1, preferably at a maximum of 2.0: 1, in particular a maximum of 1.85: 1.
  • the molar ratio of Mg 2+ to Al 3+ is at least 0.25: 1, in particular at least 0.3: 1, and / or the weight ratio of Mg 2+ to Al 3+ , calculated as the weight ratio of the oxides MgO to Al 2 O 3 , at least 0.22: 1, in particular at least 0.26: 1.
  • M 2+ is at least one divalent metal ion (Mg 2+ ) and N 3+ is at least one trivalent metal ion (Al 3+ ),
  • a n is at least one anion (carbonate),
  • x is a rational number between 0 and 1
  • n a positive number and
  • y is a positive number including 0.
  • the layered double hydroxide does not contain Zn.
  • LDHs double-layer hydroxides
  • monovalent cations such as, for example, Li +
  • monovalent cation layered double hydroxides are also covered by the present invention.
  • the layered double hydroxide is a hydrotalcite whose general empirical formula is between [Mg 2 Al (OH) 6 ] (CO 3 ) 0/5 and [Mg O / 28 alo, 72 (OH) 2 ] (CO 3 ) 0 , 72 lies
  • materials which, in addition to a hydrotalcite phase, also have a boehmite phase are particularly well suited.
  • Such a boehmite phase often occurs at high aluminum contents of the hydrotalcites.
  • both mixed phases and mixtures of materials with hydrotalcite phase and materials with boehmite phase can be used.
  • the hydrotalcite portion is 55% by weight or more.
  • the layer double hydroxides used according to the invention are present in non-calcined form. Calcination is understood in particular to mean a temperature treatment in which the double-layer structure is completely or partially lost. According to a preferred aspect, the layered double is considered uncalci- mert when there is no temperature treatments at greater than about 150 0 C, in particular more than 250 0 C, in particular more than 350 0 C, in particular more than 450 0 C, in particular more than 500 0 C has learned.
  • the interlayer anion A n ⁇ is preferably selected from the group consisting of carbonate, nitrate, halide, sulfate and phosphate or mixtures thereof, where n is a positive integer.
  • a n ⁇ (see empirical formula above) is particularly preferably carbonate or the layered double hydroxide is in carbonate form, with preferably at least 50%, more preferably at least 75% and especially preferably at least 90% of the interlayer anions A n being carbonate ions.
  • the layered double hydroxide used here has the fact that it is stable in air and thus can be easily stored.
  • the biomolecules do not comprise serum ruminal (BSA).
  • BSA serum ruminal
  • the layered double hydroxides used according to the invention can bind biomolecules in amounts which are of interest for industrial use.
  • the layered used is shown in comparison with a commercially available strong anion exchange material Macro-Prep 25 Q ® (Bio-Rad, Kunststoff) both in static and dynamic, as the system a higher Bmdungskapazitat.
  • the biomolecule could be eluted again from the layered double hydroxide in the dynamic system.
  • Static capacity is the maximum load in the equilibrium state of a static, ie non-perfused system with a long contact time between biomolecule solution and sorbent (layered double hydroxide).
  • the biomolecule in the fluid medium is incubated together with the layered double hydroxide in a suitable vessel, then centrifuged off and the amount of bound biomolecule determined in the layered double hydroxide free supernatant.
  • the capacity of an ion exchanger as a function of the flow rate is called dynamic capacity.
  • the hydrotalcite is packed into a chromatography column, the protein-containing liquid medium is pumped through the column and the breakthrough curve of the biomolecule is determined.
  • the recording of breakthrough curves serves to characterize the adsorption of the target biomolecule on the chosen sorbent. For this purpose, breakthrough curves are recorded at different fluid velocities and used to determine the dynamic capacity.
  • the column is loaded continuously with a biomolecule solution (1 mg / ml) with increasing flow rates.
  • the dynamic capacity results from the calculation of the volume at the beginning of the loading until the breakthrough of the curve (UV detector). This will be explained in more detail below in the test descriptions.
  • the layered double hydroxide used in the process according to the invention preferably has a BET surface area of more than 15 m 2 / g, more preferably more than 20 m 2 / g, particularly preferably more than 55 m 2 / g, preferably more than 65 m 2 / g, and more preferably also a pore volume of more than 0.30 ml / g, more preferably of more than 0.4 ml / g, particularly preferably in the range of 0.45-0.6 ml / g (determined according to the BJH method; cumulative pore volume for pores having a diameter in the range of 1.7 to 300 nm).
  • the layered double hydroxide has an average pore diameter of more than about 10 nm.
  • layered double hydroxide particles having a diameter of from about 0.5 to 100 ⁇ m, particularly preferably from 1 to 80 ⁇ m, particularly preferably from 4 to 60 ⁇ m.
  • the layered double hydroxide in the form of granules, in particular with an average particle size of 0.08 - 2.5 mm.
  • the Schichtdoppelhydroxid is equilibrated before the task of the biomolecule in the liquid medium to a pH of 5.0 to 10.0, particularly preferably from 6.0 to 9.0.
  • the Schichtdoppelhydroxid m a suitable buffer, for. B. HEPES, slurried or applied to a filter package prepared from the Schichtdoppelhydroxid with such a buffer.
  • the concentration of the buffer is preferably between 30 and 100 mmol / l.
  • the use is carried out in a chromatography process.
  • the layered double hydroxide is packed into a chromatography autoclave and the biomolecule-containing liquid medium is added to the column.
  • the column can then be flowed through by an eluent, whereby a separation of the proteins into different fractions is possible by adsorption effects. This is of particular interest for the separation of biomolecules produced in the fermentation process.
  • the elution of the biomolecule adsorbed on the column can be carried out by various methods. Via a salt gradient, different biomolecules can be obtained at different salt concentrations. The use of salt gradients reduces the electrostatic interactions between the layered double hydroxide and the biomolecule. Consequently, the biomolecule is released from the layered double hydroxide.
  • the biomolecules are eluted by changing the pH.
  • the eluent has a different pH than the liquid medium.
  • proteins are understood to mean molecules which have amino acids as building blocks. The amino acids have charged residues that can interact with charged groups on the surface of the layered double hydroxide.
  • biomolecules in particularly high concentrations on or in the layered double hydroxides.
  • biomolecules can be re-isolated or purified by elution.
  • this advantage according to the invention is particularly evident in the case of larger or long-chain oligopeptides and proteins.
  • a preferred aspect of the present invention therefore relates to the use of the above-defined layered double hydroxides for the removal or recovery of biomolecules, in particular proteins, from liquid or fluid media which contain at least one larger or long-chain biomolecule as defined below.
  • the larger or long-chain biomolecule if it is an oligopeptide or protein, at least 5 amino acids, preferably at least 50 amino acids and more preferably at least 100 amino acids.
  • biomolecules are enzymes and antibodies, components for gene therapy, etc.
  • the purification and / or separation according to the invention takes place while retaining the biological function.
  • the biomolecules also include nucleic acids, e.g. Oligo- and polynucleotides, ribonucleic acids (RNA) or deoxyribonucleic acids (DNS).
  • nucleic acids e.g. Oligo- and polynucleotides, ribonucleic acids (RNA) or deoxyribonucleic acids (DNS).
  • the above composition thus contains at least one biomolecule having a molecular weight of at least 200 D, in particular 10 kD, particularly preferably at least 40 kD.
  • biomolecules have no upper limits, so that even very large biomolecules with more than 500 kD or more than 1 MD can be deposited or stored in a particularly advantageous manner. According to one embodiment of the invention, however, it is also possible to deposit or store individual amino acids.
  • Liquid or fluid media are understood here to mean all media which make it possible to bring them into contact and thus to deposit or store the biomolecules in the layered double hydroxide.
  • aqueous or water-containing media in the form of a solution, suspension, dispersion, colloidal solution or emulsion.
  • liquids derived from biological sources or contain proteins such.
  • the samples must be prepared depending on the method, such as. B. by coarse filtration or buffering of the biomolecules. These processes are familiar to the person skilled in the art.
  • the invention relates to a method comprising the following steps:
  • the use according to the invention for the attachment or incorporation of biomolecules onto or in layered double hydroxides can be used both for enrichment (i.e., increasing the concentration of the desired biomolecule) and depletion (i.e., decreasing the concentration of the desired biomolecule).
  • the layered double hydroxide containing the biomolecule can be disposed of in a further step.
  • the disposal can take place, for example, by thermal treatment of the layered double hydroxide in order to remove the biomolecule contained, wherein after the thermal disintegration of the biomolecule, the layered double hydroxide can be disposed of in a particularly advantageous manner.
  • biomolecules from media it is possible to selectively remove or purify biomolecules from media. This plays an important role, for example, in wastewater treatment, since in most countries there are strict legal regulations on the removal of biomolecules from wastewater.
  • biomolecules in many cases it is desirable to increase the concentration of biomolecules in a medium or to obtain these biomolecules in pure form as far as possible.
  • recovery or purification of desired biomolecules is one of the standard procedures in biological and medical research.
  • the biomolecule in a further step, can be desorbed again from the layered double hydroxide or can be won, whereby the Schichtdoppelhydroxid can be used again if necessary.
  • the layer Doppelhydroxidhydroxidchen over a z. B. suitable binder to larger agglomerates, granules or molded articles are connected or applied to a carrier.
  • the shape and size of such parent structures containing the primary layered double hydroxide particles will depend on the particular application desired. It is thus possible to use all forms and sizes which are familiar to the person skilled in the art and which are suitable in individual cases. For example, agglomerates with a diameter of more than 10 .mu.m, in particular more than 50 .mu.m, may be preferred in many cases. In the case of a bedding for chromatography columns and the like, a spherical shape of the agglomerates may be advantageous.
  • a possible carrier is calcium carbonate, for example.
  • any binder which is familiar to the person skilled in the art as long as the attachment or incorporation of the proteins into or onto the layered double hydroxide particles is not excessively impaired or the stability of the particle agglomerates or shaped bodies required for the particular application is ensured.
  • binders agar-agar, alginates, chitosans, pectins, gelatins, lupine protein isolates or gluten.
  • compositions having a layered double hydroxide as defined above and at least one biomolecule as defined above.
  • Figure 1 Representation of the pH-dependent adsorption of the protein ovalbumin in an inventive Schichtdoppel- hydroxide (hydrotalcite 1) compared to the commercially available Anion (2004) (Macro-Prep 25 Q ®; Bio-Rad, Kunststoff).
  • hydrotalcite 1 Representation of the pH-dependent adsorption of the protein ovalbumin in an inventive Schichtdoppel- hydroxide (hydrotalcite 1) compared to the commercially available Anion (2004).
  • hydrotalcite 1 a 1 mg / ml ovalbumin solution in the respective buffers were used per test batch;
  • Fig. 2 Adsorption isotherm of ovalbumin on hydrotalcite 1 at pH 8, taken in 50 mM Tris buffer. 20 mg of adsorbent were incubated with 15 ml of protein solution at concentrations of 0.53-8 mg / ml for 3 hours at room temperature;
  • FIG. 3 shows a graph in which the loading of the hydrotalcite 1 used in the process according to the invention is shown as a function of the application rate for the model protein BSA (A) in comparison with a chromatography material (B) commercially available from Bio-Rad.
  • A model protein BSA
  • B chromatography material
  • Fig. 4 a graph showing the results of adsorption of the protein ovalbumin to the hydrotalcites 1, 4 and 7 in 0.05 M HEPES buffer (pH 7). For the adsorption, 7 ml of a 1 mg / ml ovalbumin solution were used per test batch;
  • Fig. 5 a graph showing the results of the desorption of the protein ovalbumin of hydrotalcite 1, 5 and 6. Zur Desorption 5 ml of 1 M NaCl in 0.05 M HEPES solution, pH 8.5 were used per test batch.
  • the reported (average) pore volumes and areas were calculated using a fully automatic nitrogen adsorption instrument (ASAP 2000, Micrometrics) according to the manufacturer's standard program (BET, BJH (IP Barrett, LG Joyner, PP Haienda, J. Am. Chem. Soc 73 (1951), 373), t-plot and DFT).
  • the percentage data on the proportion of certain pore sizes refers to the total pore volume of pores between 1.7 and 300 nm diameter (BJH Adsorption Pore Distribution Report).
  • the D90 value indicates the value at which 90% of the particles in the measured sample have a smaller or equal particle diameter.
  • the D100 value, the D50 value or the D10 value indicate the value at which 100%, 50% or 10% of the particles in the measured sample have a smaller or the same particle diameter.
  • the water content of the products at 120 ° C was determined using the method DIN / ISO 787/2.
  • This analysis is based on the total effect of the layered double hydroxide or the corresponding product. After dissolution of the solids, the individual components are analyzed and quantified using specific analytical methods such as ICP.
  • the proportion of the crystalline hydrotalcite phase or boehmite phase can be determined by quantitative X-ray diffraction. Details of this method are e.g. described in "Handbook of Clay Science", F. Bergaya, B.K. G. Therry, G. Lagaly (ed.), Elsevier, Oxford, Amsterdam, 2006, ch. 12.1: I. Srodon, Identification and Quantitative Analysis of Clay Minerals; "X-Ray Diffraction and the Identification and Analysis of Clay Minerals", D.M. Moora and R.C. Reaynolds, Oxford University Press, New York, 1997, p. 765, incorporated herein by reference.
  • Quantitative X-ray diffraction is based on Rietveld's formalization of refinement.
  • This algorithm was originally developed by HM Rietveld to refine crystal structures. The process is commonly used in mineralogy and eg the cement industry for the quantification of mineral phases in unknown samples. In the more general case, this method can be used for the quantitative determination of the contents of crystalline compounds (phases) in mixtures of different crystalline compounds (phases).
  • the Rietveld refinement algorithm is based on a calculated fit of a simulated diffraction pattern to a measured diffraction pattern. First, the existing crystalline phases (compounds) are determined by assigning peaks of the diffraction diagram.
  • the diffraction pattern is then calculated based on the crystal structure of the minerals present in the sample as well as the equipment and the sample specific parameters.
  • the parameters of the model are adjusted in order to obtain a good approximation of the calculated and the measured diffraction diagram, eg using the "least square fit" method. Details of the method are described, for example, in RA Young: “The Rietveld Method", Oxford University Press, 1995. The Rietveld method can also be used for strongly overlapping reflections in the diffraction diagram.
  • the pH of hydrotalcite is determined with a pH meter in an aqueous / ethanolic suspension. For this a 1: 1 mixture of water and Ethanaol (95%) is produced. In a vessel, 50 g of the water / ethanol mixture are weighed to the nearest 0.1 g. 1 g of hydrotalcite is weighed to the nearest 1 mg and then added quantitatively to the beaker containing the etha- transferred nol / water mixture. It is then stirred for 5 min and then read the pH on the instrument.
  • hydrotalcites were used as starting material, wherein the respective commercial reference source is indicated or the production of corresponding layered double hydroxides is also easily possible by methods familiar to the person skilled in the art (see above).
  • Al / Mg hydrotalcite in carbonate form available from Sud-Chemie AG under the name Synthal ®.
  • the Zn hydrotalcite used was prepared according to EP 1 381 567 B1, test no. 4, without a subsequent hydrothermal treatment. Chemical analyzes :
  • the hydrotalcite used in the chloride form was prepared according to Example 1 a) of DE 198 36 580 A1, wherein the amounts of MgCl 3 '6H 2 O and A1C1 3 ' 6H 2 O were varied so that a molar ratio of Mg: Al of 1.71.
  • the hydrotalcite used in the carbonate form was prepared according to Example 2 a) of DE 198 36 580 A1, wherein the amounts of MgCl 3 -OH 2 O and AlCl 3 '6H 2 O were varied so that a molar ratio of Mg: Al of 2.35.
  • Ovalbumin (Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen) is the main protein of the white component of chicken egg (60 to 65%). The molecular mass is 45 kDa and the isoelastic point is 4.6.
  • Bovine serum albumin (BSA):
  • Bovine serum albumin (Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen) belongs to the group of globular proteins. In particular, it ensures the maintenance of colloidotic pressure in the human organism. The molecular weight is 66 kDa and the isoelectric point is 4.6. Alkaline phosphatase:
  • This enzyme is derived from calf intestinal mucosa and is commercially available from Fluka, DE.
  • the isoeletric point is about 6 and the molecular weight is 140 kDa.
  • hydrotalcite 25 mg are equilibrated with 10 ml of the appropriate buffer at pH 5-9 (see Table I).
  • the adsorbent material suspended in the buffer is sonicated for 30 minutes and shaken at 15 rpm for one hour in an overhead mixer. The material is then centrifuged off at 4000 g for 10 min and the supernatant discarded. For washing, 10 mL redist. Water was added, the adsorbent resuspended and then shaken for 5 min at 15 rpm. The supernatant was discarded after recentrifugation at 4000 g / 10 min.
  • the photometric quantitation of proteins is based on the measurement of the UV absorption of the aromatic amino acids tyrosine (phenol group, 275 nm), tryptophan (indole group, 279 nm) and to a lesser extent phenylalanine (257 nm) at 280 nm. Depending on the amino acid composition Concentrations between 20 and 3000 ⁇ g / ml protein are detected.
  • the absorption of a calibration series of solutions of known protein concentration at 280 nm is first determined. From the linear relationship between absorption and protein concentration, the unknown protein concentration can be calculated
  • This method combines the reduction of Cu 2+ to Cu + by proteins in an alkaline medium, with the highly sensitive and selective colorimetric detection of Cu + through the use of a dichloroquinonic acid-containing reagent.
  • FIG. 1 shows the results of the pH-dependent adsorption of the protein ovalbumin onto the hydrotalcite 1 in comparison to Macro-Prep 25 Q® from Bio-Rad.
  • the hydrotalcite adsorbs about three times more ovalbumin than Macro-Prep 25 Q ® .
  • the uptake of an adsorption isotherm is investigated as a function of the equilibrium loading of the hydrotalcite on the protein concentration in the supernatant.
  • the experiment was carried out at a pH of 8 in a 50 mM Tris buffer.
  • hydrotalcite 1 was equilibrated with Tris buffer at pH 8 as described above.
  • a protein strain solution of 10 mg / ml in 50 mM Tris buffer is prepared and diluted according to the instructions given in Table 2 with the respective buffer and then added to 20 mg of the prepared sorbent (Doppeltikhydroxid).
  • 100 mg of the corresponding adsorbent material (hydrotalcite in comparison with Macro-Prep 25 Q® ) are suspended in a 1 mL Eppendorf vessel with 1 mL of the corresponding 50 mM buffer (see Table 2) and 15 mm in a sealed column with a punch down x 50 mm (Omnifit, Cambridge, England).
  • the second column end piece is placed and the column is connected to the HPLC pump SFD SDS 9404 (Schambeck SFD GmbH, Bad Honnef) so that it is flowed through by the mobile phase from bottom to top.
  • the pump is set to the flow rate for which the capacity of the adsorbent is to be determined.
  • the moving column of the column is slowly hand-tightened during equilibration with 20 mL of the appropriate buffer and then relieved by a quarter turn of the thread.
  • Example 3 adsorption of alkaline phosphatase to double tikhydroxiden with different ratio of M 2+ to 3+ N
  • adsorbents 25 mg are equilibrated with 10 ml of the appropriate buffer (50 mM) at the appropriate pH (see Table I).
  • the adsorber material suspended in the buffer is treated for 30 minutes in an ultrasonic bath and shaken at 15 rpm for 30 mm in an overhead mixer. The material is then centrifuged off at 3219 g, 10 0 C for 10 min and the supernatant discarded.
  • alkaline phosphatase The activity determination of alkaline phosphatase is based on the enzymatic cleavage of p-nitrophenyl phosphate into p-nitrophenol and inorganic phosphate. The resulting p-nitrophenol causes a yellowing, which can be detected at 405 nm.
  • the activity of the stored alkaline phosphatase is determined in the falcon tube.
  • the stored enzyme is suspended in 2.7 ml of 1.0 M diethanolamine buffer solution (pH 9.8) and treated with 0.3 ml of 150 mM p-nitrophenyl phosphate solution, a yellowing occurs. After two minutes, stop the reaction by adding 1 ml of 1 M NaOH.
  • the suspension is centrifuged off at 3219 g (10 ° C.) for 10 min and pipetted from the supernatant 34.2 ⁇ l together with 273.3 ⁇ l of buffer solution into a well of a 96-well plate. The absorbance is measured at 405 nm.
  • One unit converts 1.0 ⁇ mol of p-nitrophenyl phosphate per minute at pH 9.8 and 37 ° C.
  • hydrotalcites 1, 2 and 3 show the best adsorption performance.
  • the enzymatic activity of the alkaline phosphatase is detectable in the immobilized form in contrast to the reference material 4.
  • Example 5 Comparison of protein adsorption and desorption of ovalbumin on hydrotalcites of different molar ratios
  • hydrotalcite 1 adsorbs about 1 ⁇ more ovalbumin than the hydrotalcite 7, whereas hydrotalcite 4 (not according to the invention) shows no adsorption, see FIG. 4.
  • the samples were incubated 2x for 45 min in 1 M NaCl in 0.05 M HEPES buffer, pH 8.5. Subsequently, the adsorber material is centrifuged off at 4000 g for 10 min and the protein content in the supernatant determined on the basis of the BCA protein test. All experiments were performed in duplicate.

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Abstract

Beschrieben wird die Verwendung eines Schichtdoppelhydroxids ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus natürlichen und synthetischen Hydrotalciten und Verbindungen mit einer Hydrotalcit ähnlichen Struktur, wobei das Schichtdoppelhydroxid in uncalcinierter Form und in Carbonatform vorliegt, und wobei das Mol-Verhältnis von Mg2+ zu Al3+ im Schichtdoppelhdydroxid bei maximal 2,5:1 liegt, zur An- oder Einlagerung einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Biomolekülen, insbesondere Peptiden, Depsipeptiden, Peptidnukleinsäuren (PNAs) und Proteinen.

Description

Verwendung von Schichtdoppelhydroxiden zur An- bzw. Abreicherung von Biomolekulen aus flussigen oder fluiden Medien
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur An- bzw. Abreicherung von Biomolekulen, insbesondere Peptiden, Depsi- peptiden, Peptidnuklemsauren (PNAs) und Proteinen aus flussigen Medien mittels eines Schichtdoppelhydroxids . Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung bestimmter Schichtdoppelhydroxide zur An- oder Einlagerung mindestens einer Verbindung ausgewählt aus der vorstehenden Gruppe von Biomolekulen .
Biomolekule, wie Enzyme, Hormone oder Antikörper, gehören zur Gruppe der Proteine, von denen fast jede biologische Reaktion abhangt. Die großtechnische Herstellung dieser Biomolekule erfolgt heutzutage mit Hilfe der Zellkulturtechnik in Mikroorganismen oder Saugetlerzellen in so genannten Fermentern. Nach diesem Fermentationsprozess werden die Zielproteme in einer Reihe von Schritten von der restlichen Zellmasse aufgereinigt . Diese Aufreinigung kann viele Schritte beinhalten und somit können die Kosten dafür bis zu 80% der Gesamtkosten des Prozesses ausmachen . Zur Aufreinigung werden meist chromatographische Methoden verwendet, um einerseits das Zielprotein im Prozessstrom anzureichern und um andererseits Fremdproteine und andere Kontaminationen, wie Endotoxine, Viren oder DNA, abzutrennen. Werden die Chromatographiematerialien mehrfach verwendet, müssen sie fortwährend auf ihre Trennleistung oder eine eventuelle mikrobielle Kontamination überprüft werden. Durch Verwendung von Einmal- Materialien können die Kosten für Validierung und Reinigung teilweise eingespart werden. Für einen erfolgreichen Einsatz muss ein solches Einmal-Chromatographiematerial eine reproduzierbare hohe Trennleistung erbringen und einen niedrigen Investitionsaufwand pro Verbrauchseinheit erfordern. Es sollte hohe Bindungskapazitäten und eine schnelle Bindungskinetik für die interessierenden Zielproteine oder die störenden Kontaminationen aufweisen.
Hydrotalcit gehört zu der Klasse der sogenannten Schichtdoppel- hydroxide (layered double hydroxides, LDH) , die durch die allgemeine Formel [M2+i-xN3+ x (OH) 2] [An"]x/n • y H2O beschrieben werden. Dabei ist M2+ ein zweiwertiges Erdalkali- oder Übergangsmetallion wie Mg2+, Ni2+, Cu2+ oder Zn2+, N3+ ein dreiwertiges Hauptgruppen- oder Übergangsmetallion wie z.B. Al3+, Cr3+, Fe3+ oder Ga3+, An~ ein Anion wie z.B. NO3 ", CO3 2", Cl" oder SO4 2", x eine rationale Zahl zwischen 0 und 1 und y eine positive Zahl einschließlich 0. Hydrotalcit besteht in der Regel aus Magnesium- und Aluminiumionen und Carbonat als Anion. Hydrotalcit besitzt eine kationische Schichtstruktur und könnte sich daher als Ionenaustauscher für anionische Proteine eignen. Einen Überblick über die gängigen Chromatographiematerialien für Ionenaustauscher bietet: Protein purification: principles, high resolution methods, and application, 1998 2nd edition, Seiten 164-165.
Aus dem Stand der Technik ist die Verwendung von Hydrotalcit in in der aktivierten calcinierten Form als Anionaustauscher bzw. Adsorbens bekannt. Bei der Calcinierung wird Hydrotalcit in der Regel über mehrere Stunden bei 600 0C behandelt, wobei Wasser und Kohlendioxid entweichen. Die calcinierten Hydrotalcite haben basische Eigenschaften und sind sehr hitzestabil.
In der US 2005/0196850 Al wird die Immobilisierung des enantio- selektiven Enzyms Lipase aus dem Organismus Candida rugosa auf herkömmlichem Mg-Al-Hydrotalcit beschrieben.
Die Immobilisierung des Enzyms Lipase aus Candida rugosa auf bestimmten Mg-Al-Hydrotalciten ist ebenfalls in Basyaruddm et al., Catalysis Today 93-95 (2004), Seiten 405-410 dargestellt. Dabei wurden Hydrotalcite mit der allgemeinen Formel Mg/Al-NO3 ~ und Mg/Al-Natπumdodecylsulfat (SDS) hergestellt. Die adsorbierte Menge des Enzyms war mit 70,8% auf Mg/Al-SDS hoher als auf Mg/Al-NO3 " (36,9%).
Die DE 102 37 518 Al sowie die DE 102 37 517 Al beschreiben ein Verfahren zur Behandlung von Biomolekulen, insbesondere DNA, in flussigen oder fluiden Medien unter Verwendung eines calcinierten Schichtdoppelhydroxids als Sorptionsmittel.
Die Literaturstelle Lotsch et al . , Solid State Sciences 3 (2001), Seiten 883-886, beschäftigt sich mit der Trennung von Nukleosid-Monophosphaten unter Verwendung der preferenziellen Anionenaustauschmterkalation in Schichtdoppelhydroxiden.
Die gemäß Stand der Technik als Anionenadsorptionsmittel verwendeten Schichtdoppelhydroxide sind jedoch insbesondere zur stabilen und reversiblen An- bzw. Einlagerung von Biomolekulen aus der Gruppe der Proteine, Peptide, Depsipeptide, Peptidnuklem- sauren (PNAs), insbesondere in aktiver Form, z.B. unter Erhalt von enzymatischer Aktivität bei Enzymen oder von Bm- dungsspezifitaten z.B. bei Antikörpern etc., oder zur An- bzw. Abreicherung von Biomolekulen aus flussigen oder fluiden Medien nicht ausreichend geeignet. So besteht ein standiger Bedarf an verbesserten Materialien auf diesem Gebiet. Aufgabe der Erfindung war es daher, stabile und kostengünstige Schichtdoppelhydroxide bereitzustellen, die eine besonders effiziente An- bzw. Einlagerung von Proteinen, insbesondere zur An- bzw. Abreicherung von Proteinen aus flussigen oder fluiden Medien, ermöglichen. Nach einer weiteren Aufgabe sollen die an- bzw. eingelagerten Biomolekule aus der Gruppe der Proteine, Peptide, Depsipeptide, Peptidnukleinsauren (PNAs) möglichst in nativer oder aktiver Form immobilisiert werden, um die gewünschten Eigenschaften des Biomolekuls gegenüber dem nicht immobilisierten Ausgangs-Biomolekul möglichst unverändert zu lassen. In einer bevorzugten Aufgabenstellung soll es auch möglich sein, die abgetrennten Biomolekule zurück zu gewinnen. Dabei sollen die Nachteile des Standes der Technik vermieden und es soll eine besonders wirkungsvolle Interaktion zwischen dem Schichtdoppelhydroxid und den Proteinen je nach Art der Verwendung sichergestellt werden.
überraschenderweise wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung gefunden, dass bestimmte Schichtdoppelhydroxide mit einem spezifischen Verhältnis an Mg2+ zu Al3+ Kationen eine besonders gunstige An- oder Einlagerung von Biomolekulen, ausgewählt aus der Gruppe der Proteine, Peptide, Depsipeptide, Peptidnukleinsauren (PNAs) aufweisen und unerwartet besser zur Immobilisierung solcher Biomolekule in „aktiver" Form geeignet sind.
Erfmdungsgemaß liegt daher das Mol-Verhaltnis von Mg2+ zu Al3+ im Schichtdoppelhdydroxid bei maximal 2,5:1.
So betrifft die vorliegende Erfindung nach einem ersten Aspekt die Verwendung eines Schichtdoppelhydroxids ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus naturlichen und synthetischen Hydrotalciten und Verbindungen mit einer Hydrotalcit ähnlichen Struktur, wobei das Schichtdoppelhydroxid in uncalcinierter Form und m Carbo- natform vorliegt, und wobei das Mol-Verhaltnis von Mg2+ zu Al3+ im Schichtdoppelhdydroxid bei maximal 2,5:1 liegt, zur An- oder Einlagerung einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Biomolekulen, insbesondere Peptiden, Depsipeptiden, Peptid- nuklemsauren (PNAs) und Proteinen.
Die erfindungsgemaß verwendeten Schichtdoppelhydroxide sind somit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus natürlichen und synthetischen Hydrotalciten und Verbindungen mit einer Hydrotalcit ähnlichen Struktur. Dem Fachmann ist geläufig, was unter Hydrotalciten und Verbindungen mit einer Hydrotalcit ähnlichen Struktur zu verstehen ist. Nach einem bevorzugten Aspekt kann erfindungsgemaß, solange das erfindungswesentliche Verhältnis von Mg2+ zu Al3+ eingehalten ist, ein Schichtdoppel- hydroxid, ausgewählt aus der Gruppe der natürlichen und der synthetischen Hydrotalcite und der Hydrotalcit-ahnlichen Verbindungen verwendet werden, wie sie beispielsweise in der Literaturstelle Catalysis Today, Vol. 11 (No.2) vom 2. Dezember 1991, Seiten 173 bis 301, beschrieben sind ( "hydrotacite-like Compounds) . Solche Verbindungen weisen eine Hydrotalcit-ahnliche Struktur auf.
Zur Herstellung der Hydrotalcite bzw. der Verbindungen mit einer Hydrotalcit ähnlichen Struktur kann dabei grundsätzlich jedes dem Fachmann geläufige Verfahren eingesetzt werden, wie es beispielsweise in der vorstehenden Literaturstelle Catalysis Today (a.a.O.) auf den Seiten 173 bis 301, insbesondere 201 bis 212, in der DE 20 61 114, den US-A-5, 399, 329 und 5,578,286, der DE 101 19 233 oder der WO 01/12570 sowie m Handbook of Clay Science, F Bergaya, B. K. G. Theng and G. Lagaly, Developments in Clay Science, Vol. 1, Chapter 13.1, Layered Double Hydroxides, C. Forano, T. Hibino, F. Leroux, C. Taviot-Gueho, Handbook of Clay Science, 2006 beschrieben ist.
Bevorzugt liegt das Mol-Verhaltnis von Mg2+ zu Al3+ bei maximal 2,5:1, vorzugsweise maximal 2,3:1, weiter bevorzugt maximal 2, 1 : 1 , insbesondere maximal 2,0:1, und/oder das Gewichtsver- hältnis von M2+ zu N3+, berechnet als das Gewichtsverhältnis der Oxide MO zu N2O3, bei maximal 2,2:1, bevorzugt bei maximal 2,0:1, insbesondere maximal 1,85:1.
Weiter wird bevorzugt, dass das Mol-Verhältnis von Mg2+ zu Al3+ bei mindestens 0,25:1, insbesondere mindestens 0,3:1 liegt, und/oder das Gewichtsverhältnis von Mg2+ zu Al3+, berechnet als das Gewichtsverhältnis der Oxide MgO zu AI2O3, bei mindestens 0,22:1, insbesondere mindestens 0,26:1 liegt.
Besonders bevorzugt wird dabei ein Schichtdoppelhydroxid (LDH) der allgemeinen Summenformel
[M1-X 2+Nx 3+ ( OH ) 2 ] x+ [An- ] x/n • yH2O
verwendet, wobei M2+ mindestens ein zweiwertiges Metallion (Mg2+) und N3+ mindestens ein dreiwertiges Metallion (Al3+) darstellt, An~ mindestens ein Anion (Carbonat), x eine rationale Zahl zwischen 0 und 1, n eine positive Zahl und y eine positive Zahl einschließlich 0 bedeuten.
Für solche Materialien haben sich besonders vorteilhafte Sorptionseigenschaften für die o.g. Gruppe der Proteine und verwandter Biomoleküle gezeigt. Nach einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Schichtdoppelhydroxid kein Zn.
Es können erfindungsgemäß auch solche Doppelschichthydroxide (LDHs) verwendet werden, die auch einwertige Kationen, wie z.B. Li+, enthalten, die die zweiwertigen Kationen teilweise oder ganz ersetzen können. Somit sind auch Schichtdoppelhydroxide mit einwertigen Kationen von der vorliegenden Erfindung erfasst.
Nach einer besonders vorteilhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Schichtdoppelhydroxid ein Hydrotalcit dessen allgemeine Summenformel zwischen [Mg2Al(OH)6] (CO3) 0/5 und [MgO/28Alo,72 (OH)2] (CO3) 0,72 liegt Es wurde nach einer vorteilhaften Ausfuhrungsform auch gefunden, dass Materialien, die neben einer Hydrotalcitphase auch eine Boehmitphase aufweisen, besonders gut geeignet sind. Eine solche Boehmitphase tritt bei hohen Alumimumgehalten der Hydrotalcite häufig auf. Es kann aber erfmdungsgemaß auch eine Mischung eines Hydrotalcits und eines Boehmits hergestellt und verwendet werden. Somit können sowohl Mischphasen als auch Mischungen aus Materialien mit Hydrotalcitphase und Materialien mit Boehmitphase eingesetzt werden. Vorzugsweise liegt der Hydrotalcitanteil bei 55 Gew.-% oder mehr.
Die erfmdungsgemaß verwendeten Schichtdoppelhydroxide liegen in nicht calcinierter Form vor. Unter Calcinierung wird dabei insbesondere eine Temperaturbehandlung verstanden, bei der die Dop- pelschichtstruktur ganz oder teilweise verloren geht. Nach einem bevorzugten Aspekt wird das Schichtdoppelhydroxide als uncalci- mert angesehen, wenn es keine Temperaturbehandlungen bei mehr als etwa 150 0C, insbesondere mehr als 250 0C, insbesondere mehr als 3500C, insbesondere mehr als 450 0C, insbesondere mehr als 5000C erfahren hat.
Das Zwischenschichtanion An~ ist vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Carbonat, Nitrat, Halogenid, Sulfat und Phosphat oder deren Gemischen ausgewählt, wobei n eine positive ganze Zahl ist. Besonders bevorzugt ist An~ (siehe Summenformel oben) Carbonat oder das Schichtdoppelhydroxid liegt in Carbonatform vor, wobei bevorzugt mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 75 % und insbesondere bevorzugt mindestens 90 % der Zwischen- schichtanionen An~ Carbonationen sind.
So wurde überraschend gefunden, dass die erfmdungsgemaß verwendeten uncalcinierten Doppelschichthydroxide in der Carbonatform gegenüber solchen mit anderen Zwischenschichtanionen vorteilhafte Sorptionseigenschaften bei der An- oder Einlagerung der o.g. Gruppe der Biomolekule, insbesondere in „aktiver" bzw. nativer Form aufweisen.
Unter „aktiver" oder „nativer" Form wird dabei erfmdungsgemaß verstanden, dass das Biomolekul in der an- oder eingelagerten (immobilisierten) Form an dem Schichtdoppelhydroxid möglichst die gleichen Eigenschaften und Aktivitäten aufweist, die das nicht immobilisierte (sorbierte) Biomolekul (in Losung) aufweist. Z.B. soll möglichst bei Enzymen deren enzymatische Aktivität und Selektivität erhalten bleiben, und bei Antikörpern deren Bmdungsspezifitat (en) .
Als weiteren Vorteil weist das hier verwendete Schichtdoppelhydroxid auf, dass es an der Luft stabil ist und somit leicht gelagert werden kann.
Nach einem bevorzugten erfmdungsgemaßen Aspekt umfassen die Biomolekule nicht Rmderserumalbumm (BSA) .
Die erfmdungsgemaß verwendeten Schichtdoppelhydroxide können Biomolekule in Mengen binden, die für die technische Anwendung interessant sind. So zeigt sich im Vergleich mit einem kommerziell erhältlichen starken Anionaustauscher-Material Macro-Prep 25 Q® (Bio-Rad, München) sowohl im statischen, als auch dynamischen System das verwendete Schichtdoppelhydroxid eine höhere Bmdungskapazitat . Als weiterer Vorteil konnte das Biomolekul im dynamischen System wieder vom Schichtdoppelhydroxid eluiert werden. Als statische Kapazität wird die maximale Beladung im Gleichgewichtszustand eines statischen, d.h. nicht durchströmten Systems mit einer langen Kontaktzeit zwischen Biomo- lekullosung und Sorbens (Schichtdoppelhyroxid) bezeichnet. Im statischen System wird das Biomolekul im fluiden Medium zusammen mit dem Schichtdoppelhyroxid in einem geeigneten Gefäß inku- biert, anschließend abzentrifugiert und im Schichtdoppelhyro- xid-freien überstand die Menge an gebundenem Biomolekul bestimmt . Die Kapazität eines Ionentauschers in Abhängigkeit von der Flussrate bezeichnet man als dynamische Kapazität. Im dynamischen System wird der Hydrotalcit in eine Chromatographiesaule gepackt, das Protein-enthaltende flussige Medium durch die Säule gepumpt und die Durchbruchskurve des Biomolekuls ermittelt. Die Aufnahme von Durchbruchskurven dient dazu, die Adsorption des Zielbiomolekuls auf dem gewählten Sorbens zu charakterisieren. Hierzu werden Durchbruchskurven bei unterschiedlichen Fluid- geschwindigkeiten aufgenommen und anhand dieser die dynamische Kapazität bestimmt. Zur Bestimmung der dynamischen Bin- dungskapazitat wird die Säule mit einer Biomolekullosung (1 mg/ml) bei steigenden Flussraten kontinuierlich beladen. Die dynamische Kapazität ergibt sich anhand der Kalkulation des Volumens zu Beginn der Beladung bis zum Eintreten des Durchbruchs der Kurve (UV-Detektor) . Dies wird nachstehend in den Versuchsbeschreibungen genauer erläutert.
Das im erfindungsgemaßen Verfahren verwendete Schichtdoppel- hydroxid weist vorzugsweise eine BET-Oberflache von mehr als 15 m2/g, weiter bevorzugt mehr als 20 m2/g, besonders bevorzugt mehr als 55 m2/g, vorzugsweise von mehr als 65 m2/g, und weiter bevorzugt auch ein Porenvolumen von mehr als 0,30 ml/g, besonders bevorzugt von mehr als 0,4 ml/g, insbesondere bevorzugt im Bereich von 0,45-0,6 ml/g (bestimmt nach der BJH-Methode; kumulatives Porenvolumen für Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 1,7 bis 300 nm) auf.
Nach einer bevorzugten erfindungsgemaßen Ausfuhrungsform weist das Schichtdoppelhydroxid einen mittleren Porendurchmesser von mehr als etwa 10 nm auf.
Besonders bevorzugt werden erfindungsgemaß Schichtdoppelhydro- xid-Partikel mit einem Durchmesser zwischen etwa 0,5 bis 100 μm, besonders bevorzugt zwischen 1 und 80 μm, insbesondere bevorzugt zwischen 4 und 60 μm verwendet. Nach einer anderen bevorzugten Ausfuhrungsform liegt das Schichtdoppelhydroxid in Form eines Granulates vor, insbesondere mit einer mittleren Teilchengroße von 0,08 - 2,5 mm.
Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform wird das Schichtdoppelhydroxid vor der Aufgabe des Biomolekuls im flussigen Medium auf einen pH-Wert von 5,0 bis 10,0, insbesondere bevorzugt von 6,0 bis 9,0 equilibriert . Dazu wird das Schichtdoppelhydroxid m einem geeigneten Puffer, z. B. HEPES, aufgeschlämmt oder eine aus dem Schichtdoppelhydroxid hergestellte Filterpackung mit einem derartigen Puffer beaufschlagt. Die Konzentration des Puffers ist dabei vorzugsweise zwischen 30 bis 100 mmol/1.
Gemäß einer weiteren Ausfuhrungsform der erfmdungsgemaßen Verwendung erfolgt der Einsatz in einem Chromatographie-Verfahren. Dabei wird das Schichtdoppelhydroxid in eine Chromatographiesau- Ie gepackt und das Biomolekul-haltige flussige Medium auf die Säule gegeben. Die Säule kann dann von einem Elutionsmittel durchströmt werden, wobei durch Adsorptionseffekte eine Auftrennung der Proteine in unterschiedliche Fraktionen möglich ist. Dies ist insbesondere interessant für die Abtrennung von Biomo- lekulen, die im Fermentationsprozess hergestellt wurden.
Die Elution der auf der Säule adsorbierten Biomolekule kann über verschiedene Verfahren erfolgen. Über einen Salzgradienten können verschiede Biomolekule bei unterschiedlichen Salzkonzentra- tionen gewonnen werden. Durch den Einsatz von Salzgradienten werden die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen dem Schichtdoppelhydroxid und dem Biomolekul herabgesetzt. Folglich wird das Biomolekul vom Schichtdoppelhydroxid abgelost.
Nach einer weiteren Ausfuhrungsform werden die Biomolekule durch Änderung des pH-Wertes eluiert. Dabei hat das Elutionsmittel einen anderen pH-Wert als das flussige Medium. Unter Proteinen werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Moleküle verstanden, die als Bausteine Aminosäuren aufweisen. Die Aminosäuren haben geladene Reste, die mit geladenen Gruppen auf der Oberflache des Schichtdoppelhydroxids wechselwirken können.
Wie vorstehend erwähnt, lassen sich mit Hilfe der vorliegenden Erfindung Biomolekule in besonders hohen Konzentrationen an bzw. in die Schichtdoppelhydroxide an- bzw. einlagern. In einem weiteren Schritt können die Biomolekule durch Elution wieder isoliert bzw. aufgereinigt werden. Dieser erfindungsgemaße Vorteil kommt naturlich insbesondere bei größeren bzw. langerkettigen Oligopeptiden und Proteinen zur Geltung.
Ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher die Verwendung der vorstehend definierten Schichtdoppelhydroxide zur Entfernung bzw. Gewinnung von Biomolekulen, insbesondere Proteinen, aus flussigen oder fluiden Medien, die mindestens ein größeres oder langkettiges Biomolekul wie nachstehend definiert enthalten. Vorzugsweise weist das größere bzw. langkettige Biomolekul, wenn es sich um ein Oligopeptid oder Protein handelt, mindestens 5 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 50 Aminosäuren und besonders bevorzugt mindestens 100 Aminosäuren auf.
Nicht beschrankende Beispiele geeigneter Biomolekule sind Enzyme und Antikörper, Komponenten zur Gentherapie etc.. Vorzugsweise erfolgt die erfindungsgemaße Aufreinigung und/oder Trennung unter Erhalt der biologischen Funktion. Nach einem Aspekt der Erfindung zahlen zu den Biomolekulen aber auch Nukleinsäuren, z.B. Oligo- und Polynukleotide, Ribonukleinsäuren (RNS) oder Desoxyribonukleinsäuren (DNS).
Nach einem besonders vorteilhaften erfmdungsgemaßen Aspekt enthalt die vorstehende Zusammensetzung somit mindestens ein Biomolekul mit einem Molekulargewicht von mindestens 200 D, insbesondere 10 kD, besonders bevorzugt mindestens 40 kD. Der Große des Biomoleküls sind dabei im Rahmen der Erfindung nach oben keine Grenzen gesetzt, so dass auch sehr große Biomolekule mit mehr als 500 kD oder mehr als 1 MD besonders vorteilhaft an- bzw. eingelagert werden können. Nach einer erfindungsgemaßen Ausfuhrungsform können aber auch einzelne Aminosäuren an- bzw. eingelagert werden.
Unter flussigen oder fluiden Medien werden dabei alle Medien verstanden, die ein In-Kontakt-Bringen und somit eine An- bzw. Einlagerung der Biomolekule in das Schichtdoppelhydroxid ermöglichen. Insbesondere handelt es sich in der Praxis hierbei um wassrige bzw. wasserhaltige Medien in Form einer Losung, Suspension, Dispersion, kolloidalen Losung oder Emulsion.
Typische Beispiele hierfür sind Flüssigkeiten, die aus biologischen Quellen stammen oder Proteine enthalten wie z. B. Prozessbrauchwasser, Fermentationsruckstande bzw. -medien, Biomolekule enthaltende Medien aus der medizinischen oder biologischen Forschung.
Gegebenenfalls müssen die Proben je nach Verfahren vorbereitet werden, wie z. B. durch eine Grobfiltration oder Pufferung der Biomolekule. Diese Verfahren sind dem Fachmann gelaufig.
Nach einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst:
a.) m-Kontakt-Bringen eines flussigen oder fluiden Mediums, enthaltend mindestens ein Biomolekul, wie in einem der vorstehenden Ansprüche definiert, mit dem Schichtdoppelhydroxid wie hierin definiert;
b.) Ermöglichen der An- bzw. Einlagerung des mindestens einen Biomolekuls an bzw. in das Schichtdoppelhydroxid; c.) Abtrennen des an- bzw. eingelagerten Biomolekuls mit dem Schichtdoppelhydroxid;
d. ) gegebenenfalls Wiedergewinnung bzw. Elution des mindestens einen Biomolekuls von dem Schichtdoppelhydroxid.
Die erfindungsgemaße Verwendung zur An- bzw. Einlagerung von Biomolekulen an bzw. in Schichtdoppelhydroxide kann sowohl zur Anreicherung (d.h. Erhöhung der Konzentration des/der gewünschten Biomolekuls) als auch Abreicherung (d.h. Verringerung der Konzentration des/der gewünschten Biomolekuls) genutzt werden.
Wenn die erfindungsgemaße Verwendung auf eine Entfernung oder Entsorgung von Biomolekulen abzielt, kann in einem weiteren Schritt das die Biomolekule enthaltende Schichtdoppelhydroxid entsorgt werden. Die Entsorgung kann dabei beispielsweise durch thermische Behandlung des Schichtdoppelhydroxids erfolgen, um die enthaltenen Biomolekule zu entfernen, wobei nach der thermischen Desintegration der Biomolekule das Schichtdoppelhydroxid besonders vorteilhaft entsorgt werden kann.
So ist es nach einem ersten erfmdungsgemaßen Aspekt möglich, Biomolekule gezielt aus Medien zu entfernen bzw. aufzureinigen. Dies spielt beispielsweise bei der Abwasseraufbereitung eine große Rolle, da hier in den meisten Staaten strenge gesetzliche Vorschriften zur Entfernung von Biomolekulen aus Abwassern bestehen.
Genauso ist es in vielen Fallen erwünscht, die Konzentration an Biomolekulen m einem Medium zu erhohen bzw. diese Biomolekule möglichst in reiner Form zu gewinnen. Beispielsweise gehört die Gewinnung bzw. Aufreinigung gewünschter Biomolekule zu den Standardprozeduren in der biologischen und medizinischen Forschung. Dabei kann erfmdungsgemaß in einem weiteren Schritt das Biomo- lekul von dem Schichtdoppelhydroxid wieder desorbiert bzw. ge- wonnen werden, wodurch das Schichtdoppelhydroxid ggf. erneut eingesetzt werden kann.
Nach einem weiteren erfindungsgemaßen Aspekt können die Schicht- doppelhydroxidteilchen über ein z. B. geeignetes Bindemittel zu größeren Agglomeraten, Granulaten bzw. Formkorpern verbunden oder auf einen Trager aufgebracht werden. Die Form und Große solcher übergeordneter Strukturen, die die primären Schichtdop- pelhydroxidteilchen enthalten, richtet sich nach der jeweils gewünschten Anwendung. Es können somit alle dem Fachmann gelaufigen und im Einzelfall geeigneten Formen und Großen eingesetzt werden. Beispielsweise können in vielen Fallen Agglomerate mit einem Durchmesser von mehr als 10 μm, insbesondere mehr als 50 μm bevorzugt sein. Bei einer Schuttung für Chromatographiesaulen und dergleichen kann dabei eine Kugelform der Agglomerate vorteilhaft sein. Ein möglicher Trager ist beispielsweise Calciumcarbonat .
Auch kann jedes dem Fachmann gelaufige Bindemittel verwendet werden, solange die An- bzw. Einlagerung der Proteine in bzw. an die Schichtdoppelhydroxidteilchen nicht zu stark beeinträchtigt wird bzw. die für die jeweilige Anwendung zu erfordernde Stabilität der Teilchenagglomerate bzw. Formkorper gewahrleistet ist. Beispielsweise, ohne hierauf beschrankt zu sein, können als Bindemittel verwendet werden: Agar-Agar, Alginate, Chitosane, Pektine, Gelatinen, Lupinenproteinisolate oder Gluten.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung mit einem Schichtdoppelhydroxid wie vorstehend definiert und mindestens einem Biomolekul wie vorstehend definiert .
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele sowie unter Bezugnahme auf die beigefugten Figuren naher erläutert. Dabei zeigt: Fig. 1: Darstellung der pH-abhängigen Adsorption des Proteins Ovalbumin an ein erfindungsgemäßes Schichtdoppel- hydroxid (Hydrotalcit 1) im Vergleich zum kommerziell erhältlichen Aniontauscher (Macro-Prep 25 Q®; Bio-Rad, München) . Zur Adsorption wurden pro Versuchsansatz 5 ml einer 1 mg/ml Ovalbuminlösung in den jeweiligen Puffern eingesetzt;
Fig. 2: Adsorptionsisotherme von Ovalbumin an Hydrotalcit 1 bei pH 8, aufgenommen in 50 mM Tris-Puffer. 20 mg Ad- sorbens wurden mit 15 ml Proteinlösung mit Konzentrationen von 0,53-8 mg/ml für 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert;
Fig. 3: eine Graphik, in welcher die Beladung des im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Hydrotalcits 1 in Abhängigkeit von der Auftragungsgeschwindigkeit für das Modellprotein BSA (A) im Vergleich zu einem von der Firma Bio-Rad kommerziell erhältlichem Chromatographiematerial (B) dargestellt ist. 25 ml einer BSA-Lösung (1 mg/ml) in 50 mM HEPES-Puffer (pH 7) wurden mit unterschiedlichen Flussraten durch eine mit 100 mg Adsorbens gepackte Säule gepumpt. Die Elution wurde mit 25 ml 100 mM Phosphatpuffer, pH 12 durchgeführt;
Fig. 4: eine Grafik mit den Ergebnissen der Adsorption des Proteins Ovalbumin an die Hydrotalcite 1, 4 und 7 in 0,05 M HEPES-Puffer (pH 7). Zur Adsorption wurden pro Versuchsansatz 7 ml einer 1 mg/ml Ovalbuminlösung eingesetzt;
Fig. 5: eine Grafik mit den Ergebnissen der Desorption des Proteins Ovalbumin von Hydrotalcit 1, 5 und 6. Zur Desorption wurden pro Versuchsansatz 5 ml einer 1 M NaCl in 0,05 M HEPES-Losung, pH 8,5 eingesetzt.
Analysenmθthoden:
Oberfläche/Porenvoliimen :
Die vorliegend angegebenen BET-Oberflachen wurden nach DIN 66131 bestimmt .
Die angegebenen (mittleren) Porenvolumina und -flachen wurden unter Verwendung eines vollautomatischen Stickstoff- Adsorptionsmessgerates (ASAP 2000, Firma Micrometrics) nach dem Standardprogramm des Herstellers (BET, BJH (I. P. Barrett, L. G. Joyner, P. P. Haienda, J. Am. Chem. Soc. 73 (1951), 373), t-plot und DFT) bestimmt. Die prozentualen Angaben zum Anteil bestimmter Porengroßen beziehen sich auf das Gesamtporenvolumen an Poren zwischen 1,7 und 300 nm Durchmesser (BJH Adsorption Pore Distribution Report) .
Bestimmung der Teilchengrößenverteilung (nach Malvern)
Dabei handelt es sich um ein gängiges Verfahren. Es wurde ein Mastersizer der Firma Malvern Instruments Ltd, UK, entsprechend der Angaben des Herstellers eingesetzt. Die Messungen wurden mit der vorgesehenen Probenkammer ("dry powder feeder") in Luft durchgeführt und die auf das Probenvolumen bezogenen Werte (wie die durchschnittliche Teilchengroße D50) ermittelt. Der D90-Wert gibt den Wert an, bei dem 90% der Teilchen in der gemessenen Probe einen kleineren oder gleichen Teilchendurchmesser aufweisen. Entsprechend geben der D100-Wert, der D50-Wert bzw. der D10-Wert den Wert an, bei dem 100%, 50% bzw. 10% der Teilchen in der gemessenen Probe einen kleineren oder gleichen Teilchendurchmesser aufweisen.
Wassergehalt::
Der Wassergehalt der Produkte bei 120 °C wurde unter Verwendung der Methode DIN/ISO 787/2 ermittelt.
Tül omonfaranalyao ;
Diese Analyse beruht auf dem TotalaufSchluss des Schichtdoppel- hydroxids bzw. des entsprechenden Produkts. Nach dem Auflösen der Feststoffe werden die Einzelkomponenten mit spezifischen Analysemethoden, wie beispielsweise ICP, analysiert und quantifiziert .
Bestimmung der Hydrotalcit- und Boehmitphasen:
Der Anteil der kristallinen Hydrotalcit-Phase oder Boehmit-Phase kann durch quantitative Röntgenbeugung bestimmt werden. Details dieser Methode sind z.B. beschrieben im "Hand Book of Clay Science", F. Bergaya, B. K. G. Therry, G. Lagaly (Hrsg.), Elsevier, Oxford, Amsterdam, 2006, Kap. 12.1: I. Srodon, Identification and Quantitative Analysis of Clay Minerals; "X-Ray Diffrac- tion and the Identification and Analysis of Clay Minerals", D.M. Moora und R. C. Reaynolds, Oxford University Press, New York, 1997, S. 765, hier durch Bezugnahme aufgenommen.
Die quantitative Röntgenbeugung basiert auf dem Rietveld-Verfei- nerungsformalismus . Dieser Algorithmus wurde ursprünglich von H. M. Rietveld zur Verfeinerung von Kristallstrukturen entwickelt. Das Verfahren wird allgemein in der Mineralogie und z.B. der Zementindustrie für die Quantifizierung der mineralischen Phasen in unbekannten Proben verwendet. Im allgemeineren Fall lässt sich diese Methode zur quantitativen Bestimmung der Gehalte von kristallinen Verbindungen (Phasen) in Mischungen aus verschiedenen kristallinen Verbindungen (Phasen) einsetzen. Der Rietveld-Verfeinerungsalgorithmus basiert auf einer berechneten Anpassung eines simulierten Beugungsmusters auf ein gemessenes Beugungsdiagramm. Zuerst werden die vorhandenen kristallinen Phasen (Verbindungen) durch Zuordnung von Peaks des Beugungsdiagramms bestimmt. Auf der Basis der bestimmten Mineralien wird anschließend das Beugungsdiagramm auf der Basis der Kristallstruktur der in der Probe vorhandenen Mineralien sowie der Ausrüstung und der probenspezifischen Parameter berechnet. In den nächsten Schritten werden die Parameter des Modells ange- passt, um eine gute Angleichung des berechneten und des gemessenen Beugungsdiagramms zu erhalten, z.B. unter Verwendung des "least square fit"-Verfahrens . Details des Verfahrens sind z.B. beschrieben in R.A. Young: "The Rietveld Method", Oxford Univer- sity Press, 1995. Das Rietveld-Verfahren kann auch für stark überlappende Reflektionen im Beugungsdiagramm angewendet werden.
Zur Anwendung dieses Verfahrens bei der Analyse von mineralischen Proben wird verwiesen z.B. auf D. K. McCarthy, "Quantitative Mineral Analysis of Clay-bearing Mixtures", in: "The Reynolds Cup" Contest. IUCr CPD Newsletter, 27, 2002, 12-16.
In der Praxis erfolgt die quantitative Bestimmung der verschiedenen kristallinen Verbindungen (Phasen) in unbekannten Proben mittels im Handel erhältlicher Software, z.B. "Seifert Auto- Quan", erhältlich von Seifert/GE Inspection Technologies, Ahrensburg, Deutschland.
pH-Wert-Bestimmung:
Der pH-Wert von Hydrotalcit wird mit einem pH-Meter in einer wässrigen/ethanolischen Suspension bestimmt. Dazu wird eine 1:1- Mischung aus Wasser und Ethanaol (95 %) hergestellt. In einem Gefäß werden 50 g der Wasser/Ethanol-Mischung auf 0,1 g genau eingewogen. 1 g Hydrotalcit wird auf 1 mg genau eingewogen und anschließend quantitativ in das Becherglas mit der Etha- nol/Wasser-Mischung überführt. Es wird dann 5 min gerührt und anschließend der pH- Wert am Instrument abgelesen.
Es wurden die nachstehenden Hydrotalcite als Ausgangsmaterial verwendet, wobei die jeweilige kommerzielle Bezugsquelle angegeben ist bzw. die Herstellung entsprechender Schichtdoppelhydro- xide auch nach dem Fachmann geläufigen Verfahren (siehe oben) leicht möglich ist.
1. Hydrotalcit 1:
Ein Al/Mg-Hydrotalcit in der Carbonatform, erhältlich von der Firma Süd-Chemie AG unter der Bezeichnung Synthal®.
Chemische Analysen:
Physikalische Analysen:
1. kumulatives Porenvolumen nach BHJ für Poren mit einem Durchmesser zwischen 1,7 und 300 nm. Dxe Calcinierung von Hydrotalcit 1 (als Vergleichsmaterial, s.u.) wurde entsprechend der DE 102 37 518 A bei 600 °C über 4 h durchgeführt .
2. Hydrotalcite 2 , 3 und 4 :
Kommerziell erhältliche Hydrotalcite der Firma Sasol Germany GmbH, DE:
3. Kommerziell erhältlicher Anionaustauscher (Vergleich)
Produkt Macro-Prep 25 Q® der Firma Bio-Rad Laboratories GmbH, München :
Funktionelle Gruppe: -N+ (CH3) 3
Macro-Prep 25 (f Starkes Amonenaustausch-Material Partikelgroße: 50 μm Porendurchmesser 1000 A
4. Hydrotalcite 5, 6 und 7 (Vergleich)
4.1. Hydrotalcit 5 (Zn-Hydrotalcit) :
Der verwendete Zn-Hydrotalcit wurde entsprechend der EP 1 381 567 Bl, Versuch Nr. 4 hergestellt, ohne eine anschließende Hydrothermalbehandlung . Chemische Analysen :
4.2. Hydrotalcit 6 (Cl-Hydrotalcit) :
Der verwendete Hydrotalcit in der Chloridform wurde entsprechend Beispiel 1 a) der DE 198 36 580 Al hergestellt, wobei die Mengen an MgCl3'6H2O und A1C13'6H2O so variiert wurden, dass sich ein Mol-Verhältnis Mg: Al von 1,71 ergab.
Chemische Analyse:
Physikalische Analysen:
4.3 Hydrotalcit 7 (Carbonat-Hydrotalcit) :
Der verwendete Hydrotalcit in der Carbonatform wurde entsprechend Beispiel 2 a) der DE 198 36 580 Al hergestellt, wobei die Mengen an MgCl3-OH2O und A1C13'6H2O so variiert wurden, dass sich ein Mol-Verhältnis Mg:Al von 2,35 ergab. Chemische Analyse:
Physikalische Analysen:
5.Verwendete Modellproteine :
Ovalbumin:
Ovalbumin (Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen) ist das Hauptprotein vom weißen Bestandteil des Hühnereis (60 bis 65 %) . Die molekulare Masse betragt 45 kDa und der isoeletrische Punkt ist 4,6.
Rinderserumalbumin (BSA) :
Rinderserumalbumin (Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen) gehört zur Gruppe der globularen Proteine. Es sorgt vor allem im menschlichen Organismus für die Aufrechterhaltung des kolloidos- motischen Drucks. Das Molekulargewicht betragt 66 kDa und der isoelektrische Punkt liegt bei 4,6. Alkalische Phosphatase:
Dieses Enzym wird aus Kälberdarmschleimhaut gewonnen und ist kommerziell von der Firma Fluka, DE erhältlich. Der isoeletri- sche Punkt liegt bei ca. 6 und das Molekulargewicht beträgt 140 kDa.
Beispiel 1. Bestimmung der Protein-Bindekapazität im statischen System
Vorbereitung des Hydrotalcits
Zunächst werden 25 mg Hydrotalcit mit 10 ml der entsprechenden Puffer bei pH 5-9 equilibriert (siehe Tabelle I). Das im Puffer suspendierte Adsorbermaterial wird 30 min im Ultraschallbad behandelt und bei 15 Upm für eine Stunde in einem Überkopf-Mischer geschüttelt. Das Material wird anschließend bei 4000 g für 10 min abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Zum Waschen werden 10 mL bidest. Wasser zugegeben, das Adsorbermaterial resuspendiert und anschließend 5 min bei 15 Upm geschüttelt. Der Überstand wurde nach erneutem Zentrifugieren bei 4000 g/10 min verworfen .
Vorbereitung der Modellproteine
Von den Modellproteinen werden jeweils Stammlösungen mit einer Konzentration von 2 mg/ml in bidestilliertem Wasser angesetzt. Die Proteinlösungen werden im Verhältnis 1:1 mit den in Tabelle 1 angegebenen 100 mM Puffern der pH-Werte 5-9 zu einem Gesamtvolumen von 10 ml verdünnt, so dass die Proteinendkonzentration 1 mg/ml und die Pufferendkonzentration 50 mM ist. Tabelle 1: Auflistung der Puffer (Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen), welche zur Equilibrierung (100 mM) und Adsorption (50 mM) verwendet wurden
Bestimmung der Proteinkonzentration über UV-Messung
Die photometrische Quantifizierung von Proteinen basiert auf der Messung der UV-Absorption der aromatischen Aminosäuren Tyrosin (Phenolgruppe, 275 nm) , Tryptophan (Indolgruppe, 279 nm) und in geringerem Maße Phenylalanin (257 nm) bei 280 nm. Es können je nach der Aminosäurezusammensetzung Konzentrationen zwischen 20 und 3000 μg/ml Protein nachgewiesen werden.
Um eine unbekannte Proteinkonzentration zu ermitteln, wird zunächst die Absorption einer Kalibrationsreihe von Lösungen bekannter Proteinkonzentration bei 280 nm bestimmt. Aus dem linearen Zusammenhang zwischen Absorption und Proteinkonzentration lässt sich die unbekannte Proteinkonzentration errechnen
Für die photometrische quantitative Auswertung werden von den Modellproteinen Standardreihen in den in Tabelle 1 angegebenen 50 mM Puffern der entsprechenden pH-Werte hergestellt. Proteinbestimmung mit BCA (Protein Assay Kit der Firma Pier- ce; Thermo Fisher Scientific Inc., US)
Diese Methode kombiniert die Reduktion von Cu2+ zu Cu+ durch Proteine in einem alkalischen Medium, mit der hoch sensitiven und selektiven kolorimetrischen Detektion von Cu+ durch den Einsatz eines Dichinchoninsäure enthaltenden Reagenzes.
Durchführung
25 μl Proben- bzw. Standardlösung werden in die Kavität einer Microtiterplatte pipettiert. 200 μl Arbeitsreagenz (Reagenz A: Reagenz B = 50:1) wird dazugegeben und die Mischung homogenisiert. Nach 30 min Inkubation bei 370C im Thermomixer wird die Extinktion bei 550 nm im Plattenfotometer gemessen.
Untersuchung der pH-Abhängigkeit der Proteinadsorption
Zu jeweils 25 mg des equilibrierten Doppelschichthydroxids bzw. Macro-Prep 25 Q® (siehe oben) werden 10 ml der Proteinlösung (1 mg/ml) gegeben. Die Proben werden drei Stunden bei 0,5 üpm geschüttelt. Anschließend wird das Adsorbermaterial bei 4000 g für 10 min abzentrifugiert und der Proteingehalt im Überstand anhand der UV-Absorption bei 280 mn bestimmt. Alle Versuche wurden in Dreifachbestimmung durchgeführt.
In Figur 1 sind die Ergebnisse der pH-abhängigen Adsorption des Proteins Ovalbumin an den Hydrotalcit 1 im Vergleich zu Macro-Prep 25 Q® der Firma Bio-Rad dargestellt. Der Hydrotalcit adsorbiert ca. dreimal mehr Ovalbumin als Macro-Prep 25 Q®. Aufnahme einer Adsorptionsisoth«
Die Aufnahme einer Adsorptionsisotherme wird in Abhängigkeit der Gleichgewichtsbeladung des Hydrotalcits von der Proteinkonzentration im Überstand untersucht. Der Versuch wurde bei einem pH- Wert von 8 in einem 50 mM Tris-Puffer durchgeführt.
Zunächst wurde Hydrotalcit 1 wie oben beschrieben mit dem Tris- Puffer bei pH 8 equilibriert . Es wird eine Proteinstammlosung mit 10 mg/mL in 50 mM Tris-Puffer hergestellt und nach der in Tabelle 2 angegebenen Vorschrift mit dem jeweiligen Puffer verdünnt und anschließend zu 20 mg des vorbereiteten Sorbens (Dop- pelschichthydroxid) gegeben.
Tabelle 2: Vorschrift zur Verdünnung der Proteinstammlosung für die Aufnahme der Protein-Adsorptionsisotherme
Das Protein wird für drei Stunden bei 0,5 Upm in einem Uberkopf- Mischer mit dem Adsorbens mkubiert, dann bei 4000 g für 10 mm abzentπfugiert und der Proteingehalt im Überstand bei 280 nm bestimmt. Die Messwerte sind als Mittelwerte von einer Dreifachbestimmung in Figur 2 dargestellt. Beispiel 2: Adsorption von Proteinen im dynamischen System
Equilibrieren des Adsorbermaterials
100 mg des entsprechenden Adsorbermaterials (Hydrotalcit im Vergleich zu Macro-Prep 25 Q®) werden in einem 1 mL-Eppendorfgefaß mit 1 mL des entsprechenden 50 mM Puffers (siehe Tabelle 2) suspendiert und in eine mit einem Stempel nach unten verschlossene Säule 15 mm x 50 mm (Omnifit, Cambridge, England) pipettiert. Das zweite Saulenendstuck wird aufgesetzt und die Säule wird mit der HPLC-Pumpe SFD SDS 9404 (Schambeck SFD GmbH, Bad Honnef) so verbunden, dass sie von der mobilen Phase von unten nach oben durchströmt wird. Die Pumpe wird auf die Flussrate eingestellt, für welche die Kapazität des Adsorbens ermittelt werden soll. Der bewegliche Stempel der Säule wird wahrend der Equilibrierung mit 20 mL des entsprechenden Puffers langsam handfest angezogen und anschließend um eine viertel Gewindedrehung entlastet.
Bestimmung der Proteinbindekapazitäten
Zur Untersuchung der Beladung der Adsorbentien mit BSA im dynamischen System werden 25 mL einer BSA-Losung (1 mg/mL) in 50 mM Puffer bei variablen Flussraten durch eine mit 100 mg Adsorbens gepackte Säule gepumpt. Die Adsorption wird bei pH 7 durchgeführt. Nach der Adsorption wird mit 25 mL Puffer gewaschen (keine pH-Wert-Anderung) .
Die Elution wird mit 25 mL eines 100 mM Phosphatpuffers (pH 12) durchgeführt. Der Proteingehalt im Durchlauf wird photometrisch bei 280 nm gegen eine Standardreihe von BSA bestimmt.
Die für den Hydrotalcit 1 der Firma Sudchemie AG und Macro-Prep 25 Q® der Firma Bio-Rad ermittelten flussratenabhangigen Beladungen und Elutionen von BSA sind m Figur 3 dargestellt. Dabei zeigte sich, dass die Bindekapazitat des Hydrotalcits bis zu lOfach hoher war im Vergleich zum Aniontauscher Macro-Prep 25
Tabelle 3: Versuchsschema
Beispiel 3: Adsorption von alkalischer Phosphatase an Doppel- schichthydroxiden mit unterschiedlichem Verhältnis von M2+ zu N3+
Die Sorption von alkalischer Phosphatase an die Hydrotalcite 1 bis 4 wurde wie nachstehend angegeben durchgeführt.
Vorbereitung der Adsorbentien
Zunächst werden 25 mg der Adsorbentien mit 10 ml der entsprechenden Puffer (50 mM) bei entsprechendem pH-Wert equilibriert (siehe Tabelle I). Das im Puffer suspendierte Adsorbermaterial wird 30 min im Ultraschallbad behandelt und bei 15 Upm für 30 mm in einem Uberkopf-Mischer geschüttelt. Das Material wird anschließend bei 3219 g, 100C für 10 min abzentrifugiert und der Überstand verworfen.
Tab. 5: Auflistung der Puffer (Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen) , welche zur Equilibrierung und Adsorption (50 mM) verwendet wurden
Enzymadsorption
Zu jeweils 25 mg der equilibrierten Adsorbentien werden 10 ml der Enzymlosung (1 mg/ml) gegeben und für 30 min bei 40C und 15 Upm im Uberkopfschuttler inkubiert. Danach wird das Adsorberma- terial bei 3219 g (100C) für 10 mm abzentrifugiert und der Proteingehalt im überstand nach der BCA-Methode bestimmt. Anschließend wird das Adsorbens mxt 10 ml des entsprechenden Puffers für 5 min bei 40C und 15 Upm im Uberkopfschuttler gewaschen und bei 3219 g (100C) abzentrifugiert. Vom Waschwasser wird ebenfalls der Proteingehalt ermittelt. Alle Versuche werden in Dreifachbe- stxmmungen durchgeführt. Nachdem der Überstand restlos entfernt ist, wird das Adsorbens im Aktivitatstest eingesetzt.
Zusatzlich wurde die enzymatische Aktivität der adsorbierten alkalischen Phosphatase bestimmt. Hierzu wurde folgende Methode eingesetzt :
Aktivitatsbestimmung der getragerten alkalischen Phosphatase (aus Kalberdarmschleimhaut ) (Firma Sigma-Aldrich GmbH, Taufkir- chen)
Die Aktivitatsbestimmung der alkalischen Phosphatase beruht auf der enzymatisehen Spaltung von p-Nitrophenyl-Phosphat in p-Nitrophenol und anorganisches Phosphat. Durch das entstandene p-Nitrophenol tritt eine Gelbfärbung auf, welche bei 405 nm de- tektiert werden kann.
Um jeweils konstante Reaktionszeiten zu gewährleisten, wird die Reaktion durch Zugabe von NaOH gestoppt.
Durchfuhrung :
Die Aktivitatsbestimmung der getragerten alkalischen Phosphatase wird im Falcon-Tube durchgeführt. Das getragerte Enzym wird in 2,7 ml 1,0 M Diethanolamm-Pufferlosung (pH 9,8) suspendiert und mit 0,3 ml 150 mM p-Nitrophenyl-Phosphat-Losung versetzt, wobei eine Gelbfärbung auftritt. Nach zwei Minuten wird die Reaktion durch Zugabe von 1 ml 1 M NaOH gestoppt. Die Suspension wird bei 3219 g (100C) für 10 min abzentrifugiert und aus dem Überstand 34,2 μl zusammen mit 273,3 μl Pufferlösung in eine Kavität einer 96-Loch-Platte pipettiert. Die Extinktion wird bei 405 nm gemessen.
Durchführung Standard ungeträgerte alkalische Phosphatase:
In eine Kavität einer 96-Loch-Platte werden 7,5 μl Enzymlösung und 200 μl der 1,0 M Diethanolamin-Pufferlösung (pH 9,8) pipettiert und mit 25 μl der 150 mM p-Nitrophenyl-Phosphat-Lösung versetzt. Nach zwei Minuten wird die Reaktion mit 75 μl 1 M NaOH gestoppt. Die Extinktion wird bei 405 nm gemessen.
Durchführung Blindwert:
In eine Kavität einer 96-Loch-Platte werden 25 μl der 150 mM p- Nitrophenyl-Phosphat-Lösung, 200 μl der 1,0 M Diethanolamin- Pufferlösung (pH 9,8) und 75 μl 1 M NaOH pipettiert. Die Extinktion wird bei 405 nm gemessen.
Unit Definition:
Eine Unit setzt 1,0 μmol p-Nitrophenylphosphat pro Minute bei pH 9,8 und 37°C um.
Die Aktivität wird über das Lambert-Beersche-Gesetz aus der gemessenen Extinktion berechnet. (molarer dekadischer Extinkti- onskoeffiezient ε=18500 mol-l*cm-l) und im Verhältnis zur Aktivität der ungeträgerten alkalischen Phosphatase angegeben.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 wiedergegeben. Tabelle 4 :
* Mittelwert aus pH 7 und pH 9, gemessen mit BCA Test
Es zeigt sich, dass die erfmdungsgemaßen Hydrotalcite 1, 2 und 3 die beste Adsorptionsleistung zeigen. Auch ist hier die enzymatische Aktivität der alkalischen Phosphatase im Gegensatz zu dem Vergleichsmatenal 4 auch in der immobilisierten Form nachweisbar.
Die Untersuchung von zwei weiteren Hydrotalcit-Materialien, die nach herkömmlichen Synthesevorschriften mit und ohne Hydrothermalsynthese bei einem Mg:Al-Verhaltnis von 1:3 hergestellt wurden, zeigten ebenfalls eine vorteilhafte Adsorption der alkalischen Phosphatase und eine gute Aktivität des immobilisierten Enzyms .
Beispiel 4 : Vergleich Proteinadsorption und -desorption an Hydrotalcit 1 in nicht-calcinerter Form und calcinierter Form.
Zu jeweils 25 mg des equilibrierten Doppelschichthydroxids wurden 5 ml der Proteinlosung (1 mg/ml) gegeben. Die Proben werden drei Stunden bei 0,5 Upm geschüttelt. Anschließend wird das Adsorbermatenal bei 4000 g für 10 mm abzentrifu- giert und der Proteingehalt im Überstand anhand der UV- Absorption bei 280 nm bestimmt. Alle Versuche wurden in Doppelbestimmung durchgeführt. Zur Desorption wurden die Proben der Adsorption bei pH 5 verw- det . Dabei wurden die Proben für 1 h bei Raumtemperatur in einer 20%igen Glycennlosung bei 0,5 Upm mkubiert. Anschließend wird das Adsorbermaterial bei 4000 g für 10 mm abzentrifugiert und der Proteingehalt im Überstand anhand der UV-Absorption bei 280 mn bestimmt. Alle Versuche wurden in Doppelbestimmung durchgeführt .
Es zeigte sich, dass vom nicht-calcinierten Hydrotalcit 1 u- berraschend ca. 15% mehr Ovalbumm desorbiert werden konnten als vom calcinierten Hydrotalcit 1.
Beispiel 5 : Vergleich Proteinadsorption und -desorption von Ovalbumin an Hydrotalciten unterschiedlicher Molverhältnisse
Zu jeweils 25 mg des äquilibrierten Hydrotalcit 1, 4 und 7 werden 7 ml der Proteinlosung (1 mg/ml) in 0,05 M HEPES- Puffer, pH 7 gegeben. Die Proben werden 1 Stunde bei 0,5 Upm geschüttelt. Anschließend wird das Adsorbermaterial bei 4000 g für 10 min abzentrifugiert und der Proteingehalt im Überstand anhand des BCA-Protemtests bestimmt. Alle Versuche wurden in Doppelbestimmung durchgeführt.
Der Hydrotalcit 1 adsorbiert ca. Ix mehr an Ovalbumin als der Hydrotalcit 7, wahrend Hydrotalcit 4 (nicht erfindungsgemaß ) keine Adsorption zeigte, siehe Fig. 4.
Zur Desorption wurden die Proben 2x 45 mm m 1 M NaCl in 0,05 M HEPES-Puffer, pH 8,5 mkubiert. Anschließend wird das Adsorbermaterial bei 4000 g für 10 mm abzentrifugiert und der Proteingehalt im Überstand anhand des BCA-Protemtests bestimmt. Alle Versuche wurden in Doppelbestimmung durchgeführt. Es zeigte sich, dass vom Hydrotalcit 1 überraschend ca. 35% mehr Ovalbumin desorbiert werden konnte als von Hydrotalcit 4 und Hydrotalcit 7.
Beispiel 6 : Vergleich Protβindβsorption von Hydrotalciten in der Zink-, Chlorid- und Carbonatfoπn
Zu jeweils 25 mg des equilibrierten Hydrotalcits 1, 5 bzw. 6 werden 7 ml der Proteinlösung (1 mg/ml) in 0,05 M HEPES- Puffer, pH 7 gegeben. Die Proben werden 1 Stunde bei 0,5 Upm geschüttelt. Anschließend wird das Adsorbermaterial bei 4000 g für 10 min abzentrifugiert und der Proteingehalt im Überstand anhand des BCA-Proteintests bestimmt. Alle Versuche wurden in Doppelbestimmung durchgeführt.
Zur Desorption wurden die Proben 2x 45 min in 1 M NaCl in 0,05 M HEPES-Puffer, pH 8,5 inkubiert. Anschließend wird das Adsorbermaterial bei 4000 g für 10 min abzentrifugiert und der Proteingehalt im Überstand anhand des BCA-Proteintests bestimmt. Alle Versuche wurden in Doppelbestimmung durchgeführt.
Die Ergebnisse in Figur 5 zeigen, dass die Reversibilität der Bindung nur bei dem erfindungsgemäßen Hydrotalcit 1 (in der Carbonatform) gegeben ist.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines Schichtdoppelhydroxids ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus natürlichen und synthetischen Hydrotalciten und Verbindungen mit einer Hydrotalcit ähnlichen Struktur, wobei das Schichtdoppelhydroxid in uncalcinierter Form und in Carbonatform vorliegt, und wobei das Mol- Verhältnis von Mg2+ zu Al3+ im Schichtdoppelhdydroxid bei maximal 2,5:1 liegt, zur An- oder Einlagerung einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Biomolekülen, insbesondere Peptiden, Depsipeptiden, Peptidnukleinsäuren (PNAs) und Proteinen.
2. Verwendung eines Schichtdoppelhydroxids gemäß Anspruch 1, wobei das Mol-Verhältnis von Mg2+ zu Al3+ bei maximal 2,3:1, weiter bevorzugt maximal 2,1:1, insbesondere maximal 2,0:1 liegt, und/oder das Gewichtsverhältnis der Oxide MgO zu AI2O3, bei maximal 2,2:1, bevorzugt bei maximal 2,0:1, insbesondere maximal 1,85:1 liegt.
3. Verwendung eines Schichtdoppelhydroxids gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Mol-Verhältnis von M2+ zu N3+ bei mindestens 0,25:1, insbesondere mindestens 0,3:1 liegt.
4. Verwendung eines Schichtdoppelhydroxids gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Schichtdoppelhydroxid neben einer Hydrotalcitphase auch eine Boehmitphase aufweist, oder Mischungen aus Materialien mit Hydrotalcitphase und Materialien mit Boehmitphase eingesetzt werden, wobei vorzugsweise der Hydrotalcitanteil bei 55 Gew.-% oder mehr liegt .
5. Verwendung eines Schichtdoppelhydroxids gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Proteine nicht Rinderserumalbumin (BSA) umfassen.
6. Verwendung eines Schichtdoppelhydroxids gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei bevorzugt mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 75 % und insbesondere bevorzugt mindestens 90 % der Zwischenschichtanionen An~ Carbonationen sind.
7. Verwendung eines Schichtdoppelhydroxids gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Schichtdoppelhydroxid die Formel
[M1-X 2+Nx 3+ ( OH ) 2 ] x+ [An- ] x/n • yH2O
aufweist, worin M2+, N3+ und An~ wie in den Ansprüchen 1 und 6 definiert sind, und x eine rationale Zahl zwischen 0 und 1, n eine positive Zahl und y eine positive Zahl einschließlich 0 bedeuten, und wobei
bevorzugt x von 0,28 bis 0,72 und y von 0,2 bis 10 ist,
besonders bevorzugt x 0,3 - 0,55 ist.
8. Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei
(i) das Schichtdoppelhydroxid in Form eines Granulates vorliegt, insbesondere mit einer mittleren Teilchengröße von 0,08 - 2 mm; und/oder
(ii) der Durchmesser der einzelnen Partikel des Schichtdoppelhydroxids 0,5 bis 100 μm, bevorzugt 1 bis 80 μm und besonders bevorzugt 4 bis 60 um beträgt; und/oder
(iii) das Schichtdoppelhydroxid eine BET-Oberflache von mehr als 15 m2/g, bevorzugt mehr als 55 und besonders bevorzugt mehr als 65 rτ\2/g aufweist; und/oder
(iv) das Porenvolumen nach der BJH-Methode mehr als 0,3 ml/g, bevorzugt mehr als 0,4 ml/g und besonders bevorzugt von 0,45-0,6 ml/g beträgt; und/oder (v) der mittlere Porendurchmesser nach der BJH-Methode mehr als 10 nm beträgt; und/oder
(vi) die Partikel des Schichtdoppelhydroxids über ein Bindemittel zu größeren Agglomeraten, Granulaten oder Formkörpern verbunden oder auf einen Träger aufgebracht sind.
9. Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Proteine enzymatische Aktivität aufweisen.
10. Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche bei der Chromatographie, der Anreicherung, Abreicherung oder der Entfernung oder Gewinnung einer oder mehrerer wie im Anspruch 1 oder 10 definierter Verbindungen.
11. Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die wie im Anspruch 1 oder 10 definierten Verbindungen aus flüssigen oder fluiden Medien stammen, die mindestens ein wie in Anspruch 1 oder 10 definiertes Biomolekül enthalten, wobei das Biomolekül
(i) mindestens 5 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 50 Aminosäuren und besonders bevorzugt mindestens 100 Aminosäuren aufweist, sofern es sich um ein O- ligopeptid oder Protein handelt; und/oder
(ii) ein Molekulargewicht von mindestens 200 D, bevorzugt mindestens 10 kD, weiterhin bevorzugt mindestens 40 kD, noch weiter bevorzugt mindestens 500 kD und besonders bevorzugt mindestens 1 MD aufweist.
12. Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche zusammen mit einem Puffer,
(i) der einen pH-Wert von 5,0 bis 10,0, insbesondere von 6,0 bis 9,0 aufweist; und/oder (ii) der eine Konzentration von 30 bis 100 mmol/1 aufweist .
13. Zusammensetzung umfassend ein wie in den vorstehenden Ansprüchen definiertes Schichtdoppelhydroxid und ein wie in einem der Ansprüche 1, 10 oder 12 definiertes Biomolekül.
14. Verfahren umfassend die folgenden Schritte
(i) In-Kontakt-Bringen eines flüssigen oder fluiden Mediums, enthaltend mindestens ein Biomolekül, mit einem wie in einem der vorstehenden Ansprüche definierten Schichtdoppelhydroxid als Sorptionsmittel;
(ii) Ermöglichen der An- oder Einlagerung des mindestens einen Biomoleküls an oder in das Schichtdoppelhydroxid; und
(iii) Abtrennen des an- oder eingelagerten Biomoleküls mit dem Schichtdoppelhydroxid.
15. Verfahren gemäß Anspruch 14, umfassend den weiteren Schritt der Wiedergewinnung und/oder Elution des mindestens einen Biomoleküls von dem Schichtdoppelhydroxid.
16. Verfahren gemäß Anspruch 14 oder 15, wobei vor dem Schritt
(i)
a) das Schichtdoppelhydroxid mit einem Puffer auf pH 5,0 bis 9,0, insbesondere von pH 6,0 bis 8,0 equilibriert wird, wobei der Puffer optional eine Konzentration von 30 bis 100 mmol/1 aufweist; und/oder
b) das Schichtdoppelhydroxid gegebenenfalls nach Ausführung des Schrittes (a) in eine Chromatographiesäule gepackt wird.
17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16 zur Anreicherung, Abreicherung oder der Entfernung oder Gewinnung einer oder mehrerer wie im Anspruch 1, 10 oder 12 definierter Verbindungen .
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