EP2114400A2 - Utilisation du riluzole et de ses dérivés pour fabriquer de nouveaux médicaments - Google Patents

Utilisation du riluzole et de ses dérivés pour fabriquer de nouveaux médicaments

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EP2114400A2
EP2114400A2 EP07872459A EP07872459A EP2114400A2 EP 2114400 A2 EP2114400 A2 EP 2114400A2 EP 07872459 A EP07872459 A EP 07872459A EP 07872459 A EP07872459 A EP 07872459A EP 2114400 A2 EP2114400 A2 EP 2114400A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
use according
riluzole
cells
treatment
pathology
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07872459A
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German (de)
English (en)
Inventor
Ammar Achour
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Association Pour Le Developpement de la Biotherapie Experimentale Et Appliquee (adbea)
Original Assignee
Association Pour Le Developpement de la Biotherapie Experimentale Et Appliquee (adbea)
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Filing date
Publication date
Application filed by Association Pour Le Developpement de la Biotherapie Experimentale Et Appliquee (adbea) filed Critical Association Pour Le Developpement de la Biotherapie Experimentale Et Appliquee (adbea)
Publication of EP2114400A2 publication Critical patent/EP2114400A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/428—Thiazoles condensed with carbocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to the use of riluzole and its derivatives, to produce new drugs for restoring and regulating disrupted immune functions in patients with pathologies associated with such dysfunctions, such as infectious diseases or cancers.
  • Riluzole or 6- (trifluoromethoxy) -2-aminobenzothiazole) has the formula (A)
  • Therapeutic activities have already been reported for riluzole and salts thereof, for example activities such as anticonvulsants, anoxolytics and hypnotics (EP 050551).
  • the application WO 94/20103 also describes their use for the treatment of neurosida, dementia disorders, cognitive disorders, neuropathies, myopathy, ocular disorders and all the neurological symptoms related to the HIV-1 virus.
  • riluzole as well as derivatives of this product, were capable of restoring immune function in patients suffering from pathologies associated with deregulations of this function.
  • these compounds are capable of inducing the proliferation of lymphocytes and / or ensuring their survival. in patients with such pathologies and to inhibit cell apoptosis induced by infections.
  • Riluzole is also capable of inducing the expression of interferon ⁇ / ⁇ and interleukin 15, to treat a dysfunction related to a pathology of exogenous or endogenous origin. It is more particularly a pathology associated with an aggression of iatrogenic origin, induced by the action of immunosuppressants such as cyclosporine or by the action of corticosteroids.
  • the invention therefore aims to provide a new use of riluzole or its pharmaceutically acceptable salts for the manufacture of drugs to restore immune function for the treatment of infectious diseases or cancers.
  • salts with mineral acids such as hydrochloride, sulfate, nitrate, phosphate or organic acids such as acetate, propionate, succinate, citrate, oxalate, benzoate, fumarate, maleate, methanesulphonate, isethionate, theophylline-acetate, salicylate, phenolphthalate, methylene-bis- ⁇ -oxynaphthoate or substitution derivatives of these acids.
  • mineral acids such as hydrochloride, sulfate, nitrate, phosphate or organic acids such as acetate, propionate, succinate, citrate, oxalate, benzoate, fumarate, maleate, methanesulphonate, isethionate, theophylline-acetate, salicylate, phenolphthalate, methylene-bis- ⁇ -oxynaphthoate or substitution derivatives of these acids.
  • the drugs manufactured according to the invention can be used in vivo, or ex vivo, or, in the context of tests, in vitro.
  • these drugs can be used in the form of tablets, pills, powders (gelatin capsules, cachets) or granules.
  • the active ingredient according to the invention is mixed with one or more inert diluents such as starch, cellulose, sucrose, lactose or silica, under an argon stream.
  • these compositions may also comprise substances other than diluents, for example one or more lubricants such as magnesium stearate or talc, a dye, a coating (dragees) or a varnish.
  • Liquid form compositions include pharmaceutically acceptable solutions, suspensions, emulsions, syrups and elixirs containing inert diluents such as water, ethanol, glycerol, vegetable oils or paraffin oil. These compositions may include substances other than thinners, eg wetting agents, sweeteners, thickeners, flavorings or stabilizers.
  • compositions used in the form of drops or nebulisates are used in the form of drops or nebulisates.
  • the sterile compositions for parenteral administration may preferably be aqueous or nonaqueous solutions, suspensions or emulsions.
  • a solvent or vehicle mention may be made of water, propylene glycol, a polyethylene glycol, vegetable oils, in particular olive oil, injectable organic esters, for example ethyl oleate or other suitable organic solvents.
  • These compositions may also contain adjuvants, in particular wetting agents, isotonic agents, emulsifiers, dispersants and stabilizers.
  • Sterilization can be carried out in several ways, for example by aseptic filtration, by incorporating sterilizing agents into the composition, by irradiation or by heating. They can also be prepared as sterile solid compositions which can be dissolved at the time of use in sterile water or any other sterile injectable medium.
  • the drugs will advantageously be in the form of ointments, creams, gels or patches.
  • the above medicaments advantageously contain, as active principle, 25 to 100 mg of riluzole or a pharmaceutically acceptable salt of this derivative, these compounds being used alone or in combination, in a given treatment with other medicaments. .
  • riluzole or its salts makes it possible to have high-value drugs for the treatment of conditions resulting or at the origin of dysfunctions resulting in cell death or associated with such disturbances, as well as for any pathological situation caused by drugs, cancers or radiation, or physiological, such as old age and, in general, all situations in which the survival and function of immune cells are impaired or need to be reestablished.
  • these include the treatment
  • - pathology related to viral aggression including the treatment of viral or retroviral infections and their virological and immune symptoms, induced, for example, by HIV type 1 or 2, including opportunistic infections and lymphocyte function. and the regulation of immune system, or by the viruses of hepatitis A, B, C, or by herpes, or HTLV I or II,
  • parasitic aggression such as leishmaniasis, malaria or bilhariosis
  • tumor origin such as a hematological tumor such as myeloma, or tissue.
  • the drugs of the invention are also of great interest in the case of allogeneic liver transplants.
  • the drugs manufactured according to the invention are capable of inducing the production of ⁇ / ⁇ interferons and of IL-15.
  • the doses used in these treatments depend on the desired effect, the duration of treatment and the route of administration used. They will generally be between 50 and 200 mg per day orally for an adult with unit doses ranging from 25 to 100 mg of active substance.
  • the dosage will be determined according to age, weight and all other factors specific to the subject to be treated.
  • the dosage forms of this composition comprise in practice, per unit dose or multiple unit doses, an amount of active substance or mixture of active substances corresponding to a concentration of active substance or mixture of active substances of approximately 1 to 100 nM for a test. in vitro.
  • the person skilled in the art will adjust these quantities on a case-by-case basis and / or according to the conditions or physiological conditions for which an increase or tendency to the restoration of cell proliferation and functioning is desired.
  • doses may, depending on the route of administration used, the state of the patient and the active substance used, vary over time and be administered in a dosage comprising administration in one or more times per day, per week or per month.
  • a daily dose as mentioned above may itself be replaced by any other chronology and / or dose of administration of the active substance (weekly or monthly administration, in particular) insofar as the galenic of the active principle thus administered provides a pharmacological effect substantially similar to that obtained with daily administration.
  • the active compositions may be administered together with a physiologically acceptable carrier or vector or diluent to thereby form a ready-to-use complete pharmacological composition.
  • This reservoir is formed early in the course of infection, presumably in the initial phase of primary infection, and remains stable during infection.
  • riluzole in AIDS has been demonstrated in the test of the measurement of cell survival, apoptosis, lymphocyte typing and viral production of lymphocytes of AIDS patients cultured in vitro.
  • the drugs defined above are used alone or in combination with other active ingredients for a given treatment.
  • a pathology related to a viral (or retroviral) aggression advantageously will be used an association with one or more compounds with antiviral properties.
  • they may be for example compounds with antiviral properties, such as DDI, DDC, antiproteases, 3TC and AZT, or interferon ⁇ , interferon ⁇ PEG. , ribavirin.
  • the drugs of the invention will advantageously be used alternately with antivirals to allow a pause due to their toxicity, or indeed their presence to eradicate the infection.
  • an antiviral compound such as, for example, acyclovir.
  • an antiviral compound such as, for example, acyclovir.
  • the induction of the expression of interferon ⁇ / ⁇ with immunomodulatory capacity and the ability to inhibit the proliferation of tumor cells will advantageously be exploited.
  • FIGS. 1 to 9 represent, respectively, the effect of riluzole
  • FIGS. 1A to 1C and FIGS. 2A to 2C on the lymphocytes of patients suffering from AIDS;
  • FIGS. 3A to 3C on the lymphocytes of a patient suffering from AIDS
  • FIGS. 4A and 4B on the lymphocytes of a healthy seronegative individual
  • FIGS. 5A to 5C total apoptosis expressed by all the lymphocytes, CD8 lymphocytes and CD4 lymphocytes
  • FIG. 7 on apoptosis induced by the anti-FAS antibody;
  • Figure 8 on the expression of cytokine genes; and
  • Figure 9 on the proliferation of tumor cells.
  • the dosages of the active ingredient are related to the volume in liters of the patient's blood plasma.
  • capsules are prepared at 50 mg of active product having the following composition:
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • lymphocyte cultures are prepared according to the method described by Achour et al., Antimicrob. Agents. Chemother42, 2482-2491 (1998).
  • the PBMCs were isolated from fresh, citrated-treated whole blood from healthy donors infected with HIV-1 by density gradient centrifugation using a device called Ficoll-Hypaque (Eurobio, Les Ullis, France).
  • the harvested cells were resuspended at 10 6 / ml in RPMI 1640 culture medium containing 10% decomplemented human serum AB, non-essential amino acids, 10 U / ml penicillin (Sigma), 100 ⁇ g streptomycin / ml (Sigma), 2mM L-glutamine (Sigma), 1mM sodium pyruvate (Sigma), 10mM HEPES buffer, plus 20 IU / ml interleukin 2 (Boehringer Mannheim, Germany); this medium constitutes the complete culture medium, abbreviated MC.
  • the cells were then seeded at 4x10 6 / well in 6-well culture plates (Nunc, Roskilde, Denmark) and stimulated with 100ng / ml of anti-CD3 monoclonal antibody (Pharmingen, Los Angeles, CA. , USA) plus 100 ng / ml anti-CD28 monoclonal antibody (Pharmingen, Los Angeles, CA, USA) in the absence or presence of different concentrations of riluzole (10 "4/10" 10 M).
  • the cultures were maintained at 37 ° C in humidified air containing CO 2 .
  • the culture media were changed every 4-5 days, the cultures being maintained at a constant density of viable cells of 1x10 6 cells / ml. On each pass, viable cell counts were performed by trypan blue staining, and the supernatants were harvested for storage at -20 ° C.
  • Apoptosis test Apoptotic cells were measured using FITC-labeled propidium iodide and annexin V, which is a phospholipid-binding protein that binds preferentially to phosphatidylserine exposed on the cell surface in the initial phase. apoptosis, using a commercially available kit (Immunotech, Marseille, France). Cells that were negative to iodide Propidium and annexin V-positive were identified as apoptotic cells, while those that were positive for both propidium iodide and annexin V were considered pre-necrotic cells.
  • Apoptosis caused by the anti-FAS monoclonal antibody (CD95 / APO-1) (Immunotech, Marseille, France) was also measured insofar as it is well known that the Fas / Fas ligand apoptosis is amplified in the AIDS disease).
  • T cell counts of CD4 + and CD8 + phenotypes, Ki-67 activation marker, and annexin V were performed by flow cytometric analysis (FACScan, Becton Dickenson, San Jose, CA, USA).
  • FACScan Fluorescence Activated Cell Sorting
  • CD8-PE Becton Dickinson, France
  • Ki-67-FITC Ki-67-FITC
  • Annexine-FITC Immunotech, Marseille, France.
  • Virus production was determined by measuring HIV RNA in cell-free supernatants by an overlap amplification test induced by multiple primers with a detection threshold of 10 copies / ml equivalents (Lu et al., Nat. Med., 1999).
  • the primers used are the following;
  • F1 / R1 (F1, nucleotides sense 1, 359-1, 387 of HIV-1 accession HXB2 sequence
  • SEQ ID NO: 1 5 J--GTGGGGGGACATCAA GCAGCCATGCAAAT-3 'antisense nucleotides 1, 630-1, 659 of HXB2,
  • SEQ ID NO: 2 ⁇ 'CCTTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAG-AATGC-S '
  • RNA was extracted from 100 ⁇ l of the culture supernatants using a commercial solution of RNA isolation (RNAzol; WAK-Chemie Medical, Bad
  • the optical density was measured at 405/450 nm using a microplate reader (Dynatech MRX). The optical density of the samples is directly correlated to the number of specifically amplified HIV-1 sequences in the sample. The viral load is thus calculated using the standard calibration curve following a log-log regression mode.
  • Proviral DNA was determined by a modified Muprovama test.
  • 2x10 5 cells were used for cell DNA purification with a commercial kit (QIAmp® DNA minikit, Quiagen GmbH, Hilden, Germany).
  • QIAmp® DNA minikit Quiagen GmbH, Hilden, Germany.
  • Four standard dilutions (10, 100, 1000 and 10,000 copies) in equivalent of 10 5 HIV negative donor PBMC DNA cells, plasmid HIV-1 DNA (pBH10-R3) were used as an external standard in each experiment.
  • RNA is first retro-transcribed using a kit (Hight capacity cDNA Archive kit PN: 4322171, Applied Bipsystems, Foster City, CA) using random primers. and the MultiScribe RT enzyme (5U / ⁇ l) for 2 hours at 37 ° C.
  • the labeling method with SYBR Green, a fluorescent molecule that is inserted in the small groove of the double helix was used.
  • the reaction is carried out by means of a thermocycler (ABI prism 7900 HT, Applied Boisystems, Foster City, CA).
  • Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase has been used as an endogenous control gene.
  • sequences of the primers used are the following (Proligo LLC, Boulder, CO, USA) (forward-reverse): SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 15: GAPDH (5'-AACAGCCTCAAGATCAGCAA-3 ') - (5' -CAGTCTGGGTGGCAGTGAT-3 ') SEQ ID No. 4 and SEQ ID No. 16:
  • TLR-2 (5'-CTCTCGGTGTCGGAATGTC-3 ') - (5'-AGGGGGGATTGAAGTTCTC-3') SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 17:
  • TLR-3 (5'-ACGAGACCCATACCAACATCC-3 ') - (5'-TTCCCAGACCCAATCCTTATC-3') SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 18: TLR-7 (5'-GACCTCAGCCACAACCAAC-3 1 ) - (5 "-TAACCCACCAGACAAACCAC-3 ')
  • TLR-9 (5'-CTACAACCGCATCGTCAAAC-3 ') - (5'-CATTCAGCCAGGAGAGAGAAC-3')
  • SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 20 IFN- ⁇ (5'-ACT ⁇ GGAT ⁇ CCCCAGGA-3 ') - (5'-CAGGCACAAGGGCTGTATT-3')
  • IFN- ⁇ (5'-ATCTAGCACTGGCTGGAATGAG-3 ') - (5 1 -TTCGGAGGTAACCTGTAAGTCTG-3 1 )
  • IFN- ⁇ (5'-GGGTTCTCTTGGCTGTTACTG-3 ') - (5'-GCATCTGACTCCTTTTTCGC-3') SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 23:
  • IL-10 (5'-GCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCT-3 ') - (5'CTTGATGTCTGGGTCTTGGTTCT-3')
  • IL-12p40 (5 l -TGGAGTGCCAGGAGGACAGT-3 ') - (5'-TCTTGGGTGGGTCAGGTTTG-3')
  • IL-18 (5'-GACGCATGCCCTCAATCC-3 ') - (5'-CTAGAGCGCAATGGTGCAATC-3')
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • IL-15 in the supernatant of the cells conditioned by riluzole is estimated by the enzyme immunoassay ELISA (R & D, Quantikine, U. K).
  • the line TG 180 (Crocker sarcoma tumor) is cultured in the presence of different concentrations of Rliluzole. After 5 days the proliferation of cells is estimated by the incorporation of tritiated thymidine ( 3 H).
  • Other tumor lines were used, namely the H9 line (IvmphomeT), the line NB4 (line derived from leukemia acute promvelocyte) and the Jurkat line (Ivmphoblastial T cell line from IvmphomeT).
  • the percentage of cell survival at the day of passage of cultures is estimated as follows:
  • the PE patient had no therapy and had the following parameters (T4: 467 / mm 3 , T8: 1662 / mm 3 , viral load: 60824 copies / ml of plasma).
  • T4 467 / mm 3
  • T8 1662 / mm 3
  • viral load 60824 copies / ml of plasma.
  • the survival of the cells at day 13 of the culture was increased by 216% relative to the control cells at the dose of 10 -6 M, and by 378% at the dose of 10 -7 M (FIG. 1A).
  • the patient PR followed a triple therapy and had the following parameters (T4: 880 / mm 3 , T8: 1280 / mm 3 , viral load: 250 copies / ml of plasma).
  • Cell survival at day 13 of culture was increased by 169% over control cells at the dose of 10 -6 M, and 202% at the dose of 10 -7 M ( Figure 2A).
  • the dose effect of riluzole was then studied on the lymphocytes of a patient
  • AIDS AR following no therapy and having the following parameters CD4: 291 / mm 3 (17%), CD8: 872 / mm 3 (51%), Virus: 43576 copies / ml of plasma).
  • the survival of the cells at day 13 of the culture was increased by 670% compared with the control cells at the dose of 10 -8 M, 407% at the dose of 10 -7 M and 230% at the dose. 10 "6 M ( Figure 3A).
  • the effect dose of riluzole was also examined on lymphocytes from an HIV-negative healthy individual.
  • the cell survival at day 13 of culture was increased by 271 % relative to the control cells at the dose of 10 -8 M, 228 at the dose of 10 -7 M and 157 at the dose of 10 -6 M ( Figure 4A).
  • riluzole in the culture medium thus protects mononuclear cells from HIV-1-induced cell death and allows proliferation of lymphocytes.
  • Negative regulation of apoptosis and Ki-67 expression of lymphocytes by riluzole T cell apoptosis and expression of ki-67 were also regulated after 13 days in the presence of riluzole. Indeed, in the window of concentration of the drug (10 '7 -10 "8 M) riluzole inhibits 66% of total apoptosis expressed by all lymphocytes, 70% of CD8 lymphocyte apoptosis and 80% CD4 lymphocytes ( Figure 5A, 5B, 5C), whereas apoptosis that is weakly expressed by lymphocytes from a healthy donor is not changed by riluzole treatment ( Figure 4C).
  • Ki-67 antigen expression which is a proliferation-competent T cell marker
  • Ki-67 antigen expression shows that it is downregulated. This effect is characterized by an inhibition of the order of 33% by all lymphocytes, 37% by CD8 lymphocytes and 50% by CD4 lymphocytes ( Figure 6A, 6B, 6C). These results reflect the recovery of T cells after completion of their cell proliferation cycle.
  • HIV-1 RNA concentrations in supernatants collected from patient T cell cultures were different in the presence or absence of the compound.
  • the RNA of HIV-1 in the supernatant of cultures from non EP patient treated and having a high viral load, packed with riluzole (10 "7 M) was increased on day 13 of culture by 100%.
  • the load virus is strong from the start, and the peak of virus release for control is on day 6.
  • TT (-) Patient without triple therapy
  • TT (+) Patient under triple therapy * Number of copies per ml of blood. Proviral HIV DNA log (copies [cp] / 10 6 cells).
  • Effect of riluzole on the expression of cytokine genes To associate the described effects of riluzole with the expression of cytokines, the inventors measured by real-time PCR the expression of cytokine genes. The results obtained showed that riluzole is capable of inducing the expression of the genes of NL-15, interferon ⁇ and interferon ⁇ , and ToII receptor 3 (FIG. 8). Effect of riluzole on the production of interferon and IL-15: The activation of the interferon and IL-15 genes is associated with the production of these two cytokines in the supernatant of the cells treated with riluzole.
  • the cells When the cells are conditioned by riluzole at a concentration of 10 -8 M, they become capable of producing interferon ⁇ / ⁇ capable of inhibiting the cytolytic capacity of VSV.
  • the quantity thus produced is estimated at 32,000 International Units (Table 2). ).
  • the AZT 10 ⁇ g / ml which exerts an anti-viral effect, also has a suppressor effect (anti-proliferative) on the control cells.
  • riluzole and AZT make it possible to maintain proliferation and highlights the restorative effect of riluzole compared to the activity of a drug known for its anti-proliferative effect at a dose of 10 ⁇ g / ml. .
  • AZT is used at 1 ⁇ g / ml, the antiviral effect is partial or even equivalent on the control cells.
  • Cell survival is estimated by the rate (number of day 18 cells - number of day 12 cells) X 100 / day 12 cell count.

Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation du riluzole ou de sels pharmaceutiquement acceptables du riluzole, pour Ia fabrication de médicaments pour rétablir et amplifier la fonction immunitaire pour le traitement de maladies infectieuses et de cancers.

Description

Utilisation du riluzole et de ses dérivés pour fabriquer de nouveaux médicaments
La présente invention a pour objet l'utilisation du riluzole et de ses dérivés, pour fabriquer de nouveaux médicaments permettant de rétablir et réguler des fonctions immunes perturbées chez des patients atteints de pathologies associées à de tels dysfonctionnements, comme les pathologies infectieuses ou les cancers. Le riluzole ou 6-(Trifluorométhoxy)-2-aminobenzothiazole) répond à la formule (A)
Des activités thérapeutiques ont déjà été rapportées pour le riluzole et des sels de ce composé, par exemple des activités comme anticonvulsivants, anxyolytiques et hypnotiques (brevet EP 050551). La demande WO 94/20103 décrit également leur utilisation pour le traitement du neurosida, des troubles démentiels, des troubles cognitifs, des neuropathies, de la myopathie, des troubles oculaires et de tous les symptômes neurologiques liés au virus HIV-1.
Les travaux des inventeurs sur ces composés ont permis de mettre en évidence que, de manière surprenante, le riluzole, ainsi que des dérivés de ce produit, étaient capables de rétablir la fonction immunitaire chez des patients souffrant de pathologies associées à des dérégulations de cette fonction. Comme le montrent les exemples donnés dans la demande, ces composés (ce terme, tel qu'utilisé dans la description et les revendications englobe le riluzole et ses dérivés) sont capables d'induire la prolifération de lymphocytes et/ ou d'assurer leur survie chez les patients atteints de telles pathologies et d'inhiber l'apoptose cellulaire induite par des infections. Le riluzole est aussi capable d'induire l'expression de l'interféron α/β et de l'interleukine 15, pour traiter un dysfonctionnement lié à une pathologie d'origine exogène ou endogène. II s'agit plus particulièrement d'une pathologie associée à une agression d'origine iatrogène, induite par l'action d'immunosuppresseurs tel que la cyclosporine ou par l'action des corticoïdes.
L'invention a donc pour but de fournir une nouvelle utilisation du riluzole ou de ses sels pharmaceutiquement acceptables pour la fabrication de médicaments pour rétablir la fonction immunitaire pour le traitement de maladies infectieuses ou de cancers.
Comme sels pharmaceutiquement acceptables, on citera les sels avec les acides minéraux tels que chlorhydrate, sulfate, nitrate, phosphate ou organiques tels que acétate, propionate, succinate, citrate, oxalate, benzoate, fumarate, maléate, méthanesulfonate, iséthionate, théophilline-acétate, salicylate, phénolphtalinate, méthylène-bis-β-oxynaphtoate ou des dérivés de substitution de ces acides.
Les médicaments fabriqués conformément à l'invention peuvent être utilisés in vivo, ou ex vivo, ou encore, dans le cadre d'essais, in vitro.
Ils se présentent le plus généralement sous des formes pour l'administration par voie orale, parentérale, par exemple intraveineuse, ou topique, ou encore rectale, notamment sous forme de suppositoires.
Comme compositions solides pour une administration par voie orale, ces médicaments peuvent être utilisés sous forme de comprimés, pilules, poudres (capsules de gélatine, cachets) ou granulés. Dans ces compositions, le principe actif selon l'invention est mélangé à un ou plusieurs diluants inertes tels que amidon, cellulose, saccharose, lactose ou silice, sous courant d'argon. Ces compositions peuvent également comprendre des substances autres que les diluants, par exemple un ou plusieurs lubrifiants tels que le stéarate de magnésium ou le talc, un colorant, un enrobage (dragées) ou un vernis. Des compositions sous forme liquide comprennent des solutions, des suspensions, des émulsions, des sirops et des élixirs pharmaceutiquement acceptables contenant des diluants inertes tels que l'eau, l'éthanol, le glycérol, les huiles végétales ou l'huile de paraffine. Ces compositions peuvent comprendre des substances autres que les diluants, par exemple des produits mouillants, édulcorants, épaississants, aromatisants ou stabilisants.
Ces compositions utilisées sous forme de gouttes ou de nébulisats.
Les compositions stériles pour administration parentérale, peuvent être de préférence des solutions aqueuses ou non aqueuses, des suspensions ou des émulsions. Comme solvant ou véhicule, on citera l'eau, le propyléneglycol, un polyéthyllèneglycol , des huiles végétales, en particulier l'huile d'olive, des esters organiques injectables, par exemple l'oléate d'éthyle ou d'autres solvants organiques convenables. Ces compositions peuvent également contenir des adjuvants, en particulier des agents mouillants, isotonisants, émulsifiants, dispersants et stabilisants. La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple par filtration aseptisante, en incorporant à la composition des agents stérilisants, par irradiation ou par chauffage. Elles peuvent également être préparées sous forme de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes au moment de l'emploi dans de l'eau stérile ou tout autre milieu stérile injectable.
Pour l'administration par voie topique, les médicaments seront avantageusement sous forme de pommades, crèmes, gels ou de patchs.
Les médicaments ci-dessus renferment avantageusement, en tant que principe actif, de 25 à 100 mg de riluzole ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de ce dérivé, ces composés étant utilisés seuls ou en association, dans un traitement donné avec d'autres médicaments.
L'utilisation du riluzole ou de ses sels, comme défini plus haut, permet de disposer de médicaments de grande valeur pour le traitement des affections résultant ou à l'origine des dysfonctionnements entraînant la mort cellulaire ou associées à de tels dérèglements, ainsi que pour toute situation pathologique provoquée par des médicaments, des cancers ou des radiations, ou physiologiques, tel que le grand âge et, de manière générale, toutes les situations dans lesquelles la survie et le fonctionnement des cellules immunitaires sont altérées ou nécessitent d'être rétablis. On citera notamment le traitement
- de pathologie liées à une agression virale, notamment le traitement des infections virales ou rétrovirales et de leurs symptômes virologiques et immunitaires, induits, par exemple, par le VIH de type 1 ou 2, y compris les infections opportunistes et concernant le fonctionnement des lymphocytes et la régulation du système immunitaire, ou encore par les virus des hépatites A, B, C, ou par les herpès, ou HTLV I ou II,
- d'agression parasitaire, telle que la leishmaniose, la malaria ou la bilhariose,
- de l'ischémie/reperfusion et de la production de radicaux libres, - d'agression d'origine iatrogène, par exemple induite par l'action d'immunodépresseurs tels que la cyclosporine ou par l'action des corticoïdes.
- d'agression d'origine tumorale, telle que qu'une tumeur hématologique comme le myélome, ou tissulaire.
- des pathologies liées à une agression qui est une maladie auto-immune, comme le diabète ou les thyroïdites.
Les médicaments de l'invention présentent aussi un grand intérêt dans le cas des greffes allogéniques de foie.
De manière avantageuse, les médicaments fabriqués conformément à l'invention sont capables d'induire la production des interférons α/β et de l'IL-15. Les doses utilisées dans ces traitements dépendent de l'effet recherché, de la durée du traitement et de la voie d'administration utilisée. Elles seront généralement comprises entre 50 et 200 mg par jour par voie orale pour un adulte avec des doses unitaires allant de 25 à 100 mg de substance active.
D'une façon générale, la posologie sera déterminée en fonction de l'âge, du poids et de tous les autres facteurs propres au sujet à traiter.
Les formes galéniques de cette composition comprennent en pratique par dose unitaire ou multiple de doses unitaires une quantité de substance active ou de mélange de substances actives correspondant à une concentration en substance active ou mélange de substances actives d'environ 1 à 100 nM pour un test in vitro. L'homme du métier ajustera ces quantités au cas par cas et/ou selon les affections ou états physiologiques pour lesquels on désire une augmentation ou tendance à la restauration de la prolifération et du fonctionnement cellulaires.
Ces doses peuvent, selon la voie d'administration employée, l'état du patient et la substance active utilisée, varier dans le temps et être administrées suivant une posologie comprenant une administration en une seule ou plusieurs fois par jour, par semaine ou par mois. Ainsi une dose quotidienne telle que mentionnée ci-dessus peut être elle même remplacée par une quelconque autre chronologie et/ou dose d'administration de la substance active (administration hebdomadaire ou mensuelle, notamment) dans la mesure ou la galéηique du principe actif ainsi administré procure un effet pharmacologique sensiblement similaire à celui obtenu avec une administration quotidienne.
Les compositions actives peuvent être administrées conjointement avec un support ou vecteur ou un diluant physiologiquement acceptable pour former ainsi une composition pharmacologique complète prête à l'emploi.
Dans le cas de l'infection par VIH, des travaux ont rapporté que des lymphocytes T CD4+ infectés sont capables de remettre en marche une machinerie virale qui n'était qu'en sommeil. La présence du provirus dans les lymphocytes mémoires CD4+ a ainsi été décelée. Ces cellules, après avoir répliqué activement le virus, sont retrouvées à l'état de latence. La même observation a été faite chez des patients traités par la trithérapie et sans virus plasmatique décelable depuis deux à trente mois. Quelle que soit la durée de leur traitement, tous présentent des virus ré- activables dans leurs lymphocytes quiescents. Ces virus sont en effet restés quiescents, témoins de l'existence de réservoirs de virus par persistance de provirus dans des populations de lymphocytes infectés, mais sans aucune activité réplicative.
Ce réservoir se constitue très tôt au cours de l'infection, vraisemblablement à la phase initiale de la primo-infection, et sa taille reste stable au cours de l'infection.
On sait, maintenant que le traitement précoce de la primo-infection ne prévient pas la constitution du réservoir, mais réduit peut être sa taille. La taille du réservoir restant globalement stable, il se trouve vraisemblablement réalimenté en permanence par un faible taux de réplication virale. Il a été montré qu'une réplication virale active se poursuit dans les cellules réservoirs dans le temps. L'activation chronique ainsi que la mort cellulaire des lymphocytes sont donc deux composantes essentielles du SIDA. En effet, l'activation des cellules T est un facteur aggravant dans la progression de la maladie favorisant ainsi la réplication virale. Ainsi, l'action combinée d'une mortalité excessive des cellules T hyperstimulées, mais non infectées et d'une régénération déficiente en lymphocytes CD4 semble pouvoir expliquer le déficit quantitatif en lymphocytes T CD4+.
On mesurera alors l'intérêt des médicaments fabriqués conformément à l'invention, qui constituent une nouvelle voie de traitement.
L'activité du riluzole dans le SIDA a été mis en évidence dans le test de la mesure de la survie cellulaire, de l'apoptose, du typage des lymphocytes et de la production virale des lymphocytes de patients SIDA cultivés in vitro. Comme indiqué plus haut, les médicaments définis ci-dessus sont utilisés seuls ou en association avec d'autres principes actifs pour un traitement donné.
Pour le traitement d'une pathologie liée à une agression virale (ou rétrovirale) on utilisera avantageusement une association avec un ou plusieurs composés à propriétés anti-virales. Dans le cas du traitement du SIDA, II peut s'agir par exemple de composés à propriétés antivirales, comme le DDI, le DDC, les antiprotéases, le 3TC et l'AZT, ou encore l'interféron α, l'interféron α PEG, la ribavirine.
Les médicaments de l'invention seront avantageusement utilisés en alternance avec les antiviraux afin de permettre une pause due à leur toxicité, ou en bien leur présence afin d'éradiquer l'infection.
Pour le traitement d'une pathologie liée à une agression virale caractéristique de l'Herpès, on associera avec avantage, au traitement par les médicaments de l'invention, un composé antiviral comme par exemple l'acyclovir. Pour le traitement des cancers, on mettra avantageusement à profit l'induction de l'expression de l'interféron α/β à capacité immunomodulatrice et la capacité à inhiber la prolifération des cellules tumorales.
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples qui suivent, donnés à titre illustratif, sans en limiter sa portée. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 9, qui représentent, respectivement, l'effet du riluzole
- Les figures 1A à 1C et les figures 2A à 2C, sur les lymphocytes de patients atteint du SIDA ;
- Les figures 3A à 3C, sur les lymphocytes d'un patient atteint du SIDA ;
- Les figures 4A et 4B, sur les lymphocytes d'un individu sain séronégatif ; - Les figures 5A à 5C, sur l'apoptose totale exprimée par l'ensemble des lymphocytes, des lymphocytes CD8 et des lymphocytes CD4 ;
- La figure 6, sur l'expression de l'antigène Ki-67 ;
- La figure 7, sur l'apoptose induite par l'anticorps anti-FAS ; La figure 8, sur l'expression des gènes de cytokines ; et La figure 9, sur la prolifération des cellules tumorales.
Sauf mention contraire, les posologies du principe actif sont rapportées au volume en litres du plasma sanguin du patient. Exemple A
On prépare, selon la technique habituelle, des comprimés dosés à 50 mg de produit actif ayant la composition suivante :
- Riluzole 50 mg - Mannitol 64 mg
- Cellulose microcristalline 50 mg
- Polyvidone, excipient 12 mg
- Carboxyméthylamidon sodique 16 mg
- Talc 4 mg - Stéarate de magnésium 2 mg
- Silice colloïdale anhydre 2 mg
- Mélange de méthylhydroxypropylcellulose,
- Polyéthylèneglycol 6000, dioxyde de titane (72-3,5-24,5)
- q.s.p. 1 comprimé pellicule terminé à 245 mg Exemple B
On prépare, selon la technique habituelle, des gélules dosées à 50 mg de produit actif ayant la composition suivante :
- Riluzole 50 mg
- Cellulose 18 mg - Lactose 55 mg
- Silice colloïdale 1 mg
- Carboxyméthylamidon sodique 10 mg
- Talc 10 mg
- Stéarate de magnésium 1 mg Exemple C
On prépare une solution injectable contenant 10 mg de produit actif ayant la composition suivante :
- Riluzole 10 mg
- Acide benzoïque 80 mg - Alcool benzylique 0.06 cm3
- Benzoate de sodium 80 mg
- Ethanol à 95% 0.4 cm3
- Hydroxyde de sodium 24 mg
" Propylène glycol 1.6 cm3 - Eau q.s.p. 4 cm3
METHODES
Purification et culture des cellules mononucléaires du sang périphérique (désignées ci-après par PBMC pour Peripheral Blood Mononuclear CeIIs)
Les cultures de lymphocytes sont préparées selon la méthode décrite par Achour et al., Antimicrob. Agents. Chemother42, 2482-2491 (1998).
Les PBMC ont été isolées à partir de sang complet frais, traité au citrate, de donneurs respectivement sains et infectés par le VIH-1 , par centrifugation à gradient de densité au moyen d'un dispositif dénommé Ficoll-Hypaque (Eurobio, Les Ullis, France). Les cellules récoltées ont été remises en suspension à raison de 106/ml dans un milieu de culture RPMI 1640 contenant 10% de sérum humain AB décomplémenté, des acides aminés non-essentiels, 10 U/ml de pénicilline (Sigma), 100 μg/ml de streptomycine (Sigma), 2mM de L-glutamine (Sigma), 1mM de pyruvate de sodium (Sigma), 1OmM de tampon HEPES, plus 20 Ul/ml d'interleukine 2 (Boehringer Mannheim, Allemagne); ce milieu constitue le milieu de culture complet, soit en abrégé MC. Les cellules ont ensuite été ensemencées à raison de 4x106/puits dans des plaques de culture de 6 puits (Nunc, Roskilde, Danemark) et ont été stimulées avec 100ng/ml d'anticorps monoclonal anti-CD3 (Pharmingen, Los Angeles, CA, USA), plus 100 ng/ml d'anticorps monoclonal anti-CD28 (Pharmingen, Los Angeles, CA, USA) en l'absence ou en présence de différentes concentrations de riluzole (10"4/10"10M). Les cultures ont été maintenues à 37°C dans de l'air humidifié renfermant du CO2. Les milieux de culture ont été changés tous les 4-5 jours, les cultures étant maintenues à une densité constante de cellules viables de 1x106 cellules/ml. A chaque passage, des comptages de cellules viables ont été effectués par coloration au bleu trypan, et les surnageants ont été récoltés pour conservation à -20°C.
Test d'apoptose Les cellules apoptotiques ont été mesurées au moyen d'iodure de propidium et d'annexine V marquée au FITC, qui est une protéine de liaison aux phospholipides se fixant préférentiellement à la phosphatidylsérine exposée à la surface des cellules dans la phase initiale de l'apoptose, au moyen d'un kit disponible dans le commerce (Immunotech, Marseille, France). Les cellules qui étaient négatives à l'iodure de propidium et positives à l'annexine V ont été identifiées comme étant des cellules apoptotiques, tandis que celles qui étaient positives aussi bien à l'iodure de propidium qu'à l'annexine V ont été considérées comme étant des cellules pré- nécrotiques. On a mesuré aussi l'apoptose provoquée par l'anticorps monoclonal anti-FAS (CD95/APO-1) (Immunotech, Marseille, France) dans la mesure où il est bien connu que l'apoptose Fas/Fas ligand est amplifiée dans la maladie du SIDA).
Cvtométrie de flux
Des comptages de cellules T de phénotypes CD4+ et de CD8+, du marqueur d'activation Ki-67 ainsi que de l'annexine V ont été effectués par analyse par cytométrie de flux (FACScan, Becton Dickenson, San José, CA, USA). On a utilisé une série d'anticorps monoclonaux dirigés contre les marqueurs de surface suivants de cellules T : CD4-PerCP, CD8-PE (Becton Dickinson, France), Ki-67-FITC (Pharmingen, Los Angeles, CA, USA), Annexine-FITC (Immunotech, Marseille, France).
Test de quantification virale
La production virale a été déterminée par mesure de l'ARN du VIH dans les surnageants exempts de cellules par un test d'amplification avec chevauchement induit par des amorces multiples avec un seuil de détection de 10 équivalents copies/ml (Lu et al. Nat. Med., 1999). Les amorces utilisées sont les suivantes ;
F1/R1 (F1 , nucleotides sens 1 ,359-1 ,387 de VIH-1 séquence de HXB2 accession
GenBank N°K03455,
SEQ ID N°1 : 5J-GTGGGGGGACATCAA-GCAGCCATGCAAAT-3' nucleotides antisens 1 ,630-1 ,659 de HXB2,
SEQ ID N°2 : δ'CCTTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAG-AATGC-S')
L'ARN a été extrait à partir de 100μl des surnageants de culture en employant une solution commerciale d'isolement d'ARN (RNAzol ; WAK-Chemie Médical, Bad
Hambourg, Allemagne), puis amplifié par RT-PCR à l'aide d'amorces du gag du VIH- 1 (Lu et al. Nat. Med., 1999). Les produits amplifiés ont ensuite été détectés en employant une technique en phase solide.
En bref, 10μl des produits amplifiés ont été détectés, dénaturés pendant 15 minutes (EDTA 0.4 M/NaOH, 2 mM), puis capturés sur une microplaque revêtue de streptavidine contenant une sonde spécifique biotynylée et le tampon d'hybridation. L'hybridation à 37°C pendant 30 minutes a été suivie du lavage avec le tampon de lavage (PBS/0.3% Tween 20). L'hybride ADN-ADN formé a été détecté par addition d'un anticorps monoclonal de souris anti-ADN double brin, puis d'un second anticorps dirigé contre le premier, obtenu chez la chèvre et marqué à la phosphatase alcaline. Après ajout du substrat (p-Nitrophényl phosphate, pNPP), la densité optique a été mesurée à 405/450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (Dynatech MRX). La densité optique des échantillons est directement corrélée au nombre de séquences VIH-1 spécifiquement amplifiés dans l'échantillon. La charge virale est ainsi calculée au moyen de la courbe de calibrage standard qui suit un mode de régression log-log.
L'ADN proviral a été déterminé par un test Muprovama modifié. A cet effet, 2x105 cellules ont été utilisées pour purification d'ADN cellulaire avec un kit de commerce (QIAmp® DNA minikit, Quiagen Gmbh, Hilden, Allemagne). Quatre dilutions standard (10, 100, 1000 et 10.000 copies) dans un équivalent de 105 cellules d'ADN de PBMC de donneur négatif vis-à-vis du VIH, d'ADN de VIH-1 du plasmide (pBH10-R3) ont été utilisés comme standard externe dans chaque expérience. Un équivalent de 105 cellules d'ADN échantillon purifié et 4 ADN standards ont été utilisés pour une amplification spécifique du VlH par le test Muprovama, tandis qu'un équivalent de 102 cellules de chaque ADN échantillon purifié ou d'ADN standard avaient été purifié en parallèle pour le calibrage de I1ADN génomique avec une paire d'amorces de la séquence génomique de la β-actine, (numéro d'accès à la base de gènes Genebank M10277 : 2.280-2.301 , sens et 2.606-2.538, antisens). Après amplification, 10μl de produit de réaction de VIH ou de β-actine de chaque échantillon ont été répartis dans les 96 puits d'une plaque de microtitrage revêtue de streptavidine pré-incubée avec une sonde marquée à la biotine spécifique pour le VIH-1 ou pour la β-actine. Un test Elisa couplé à une hybridation a été réalisé. Le signal optique de chaque puits d'hybride de VIH a été corrigé automatiquement de la différence entre le signal du puits d'hybride de la β- actine correspondant et la moyenne des signaux de β-actine de l'ADN standard avec un logiciel (Dynex, Chantilly, USA). La charge d'ADN proviral a été calculée au moyen de la courbe de calibrage standard (modèle de régression log-log dans l'intervalle de 1 à 105 copies d'ADN de VIH-1 pour 106 cellules) générée à partir de signaux de quatre dilutions du standard externe d'ADN de VIH-1. Détection des cytokiπes par PCR en temps réel
Par PCR en temps réel, 2 μg d'ARN totaux sont d'abord rétro-transcrits à l'aide d'un kit (Hight capacity cDNA Archive kit PN : 4322171, Applied Bipsystems, Foster City, CA) utilisant les amorces au hasard et la MultiScribe RT enzyme (5U/μl_) pendant 2 heures à 37°C. La méthode de marquage avec SYBR Green, une molécule fluorescente qui s'intercale dans le petit sillon de la double hélice a été utilisée. La réaction est réalisée grâce à un thermocycler (ABI prism 7900 HT, Applied Boisystems, Foster City, CA). Chaque point étudié était composé de 5 μL de SYBR Green PCR Master Mix (PW : 4344463 ; Applied Biosystems, Foster City, CA), 0,3 μL d'amorce sens et anti-sens à la concentration de 10 μM (Proligo), 3,4 μL d'eau dépourvue de Rnase et 1 μL d'ADNc. Après une étape de dénaturation à 95°C pendant 15 min, l'amplification est effectuée après 40 cycles à 95°C pendant 15 s, 6O0C pendant 30 s et 72°C pendant 30 s. En fin de PCR, une étape de dissociation correspondant au pic d'amplification, ayant lieu en un cycle de 95°C pendant 15 s, 600C pendant 15 s, et 95°C pendant 15 s, vérifie la validité des amorces. Les amorces de tous les gènes étudiés ont été choisies suivant les conditions d'amplification du logiciel Oligo Explorer 1.1. Les échantillons ont été étudiés en double réplique en présence d'un témoin négatif composé de Master Mix et les amorces, mais sans l'ADNc. La glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase (GAPDH) a été utilisée comme gène contrôle endogène.
L'effet des traitements sur les taux d'ARNm d'intérêt est étudié en utilisant la méthode de comparaison des CT (Peinnequin et al., 2004) ou nombre de cycles nécessaires pour atteindre une valeur seuil de fluorescence (logiciel SDS 2.1, AB prism).
Les séquences des amorces utilisées sont les suivantes (Proligo LLC, Boulder, CO, USA) (forward-reverse): SEQ ID N°3 et SEQ ID N°15 : GAPDH (5^-AACAGCCTCAAGATCAGCAA-3')-(5'-CAGTCTGGGTGGCAGTGAT-3') SEQ ID N°4 et SEQ ID N°16 :
TLR-2 (5'-CTCTCGGTGTCGGAATGTC-3')-(5'-AGGGGGGATTGAAGTTCTC-3') SEQ ID N°5 et SEQ ID N°17:
TLR-3 (5'-ACGAGACCCATACCAACATCC-3')-(5'-TTCCCAGACCCAATCCTTATC-3') SEQ ID N°6 et SEQ lD N°18 : TLR-7 (5'-GACCTCAGCCACAACCAAC-31)-(5"-TAACCCACCAGACAAACCAC-3')
SEQ ID N°7 et SEQ ID N019 :
TLR-9 (5'-CTACAACCGCATCGTCAAAC-3')-(5'-CATTCAGCCAGGAGAGAGAAC-3')
SEQ ID N°8 et SEQ ID N°20: IFN-α (5'-ACTπGGATπCCCCAGGA-3')-(5'-CAGGCACAAGGGCTGTATT-3')
SEQ ID N°9 et SEQ ID N°21 :
IFN-β(5'-ATCTAGCACTGGCTGGAATGAG-3')-(51-TTCGGAGGTAACCTGTAAGTCTG-31)
SEQ ID N°10 et SEQ ID N°22 :
IFN-γ (5'-GGGTTCTCTTGGCTGTTACTG-3')-(5'-GCATCTGACTCCTTTTTCGC-3') SEQ ID N°11 et SEQ ID N°23 :
IL-10(5'-GCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCT-3')-(5'CTTGATGTCTGGGTCTTGGTTCT-3')
SEQ ID N°12 et SEQ ID N°24 :
IL-12P40 (5l-TGGAGTGCCAGGAGGACAGT-3')-(5'-TCTTGGGTGGGTCAGGTTTG-3')
SEQ ID N°13 et SEQ ID N°25 : IL-15(5'-CCATCCAGTGCTACTTGTGTTTAC-3')-(5>CCAGTTGGCTTCTGTTTTAGGAA-3^)
SEQ ID N°14 et SEQ ID N°26 :
IL-18 (5'-GACGCATGCCCTCAATCC-3')-(5'-CTAGAGCGCAATGGTGCAATC-3')
Mesure de l'activité fonctionnelle de l'interféron Le test fonctionnel est évalué par sa capaité à inhiber le pouvoir cytolytique du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) vis à vis des cellules MDBK.
Mesure de la production de l'lnterleukine-15 .
La production de l'IL-15 dans le surnageant des cellules conditionnées par le riluzole est estimée par le test immuno-enzymatique ELISA (R&D, Quantikine, U. K).
Mesure de l'inhibition de la prolifération des cellules tumorales. La lignée TG 180 (Tumeur du sarcome de Crocker) est cultivée en présence de différentes concentrations de Rliluzole. Au bout de 5 jours la prolifération des cellules est estimée par l'incorporation de thymidine tritiée (3H).D'autres lignées tumorales ont été utilisées à savoir la lignée H9 (IvmphomeT), la lignée NB4 (lignée dérivée d'une leucémie aiguë promvélocvtaire) et la lignée Jurkat (lignée de cellules T Ivmphoblastiαues issues de IvmphomeT). RESULTATS
Survie accrue des cellules T sous l'effet du riluzole :
Le pourcentage de la survie cellulaire au jour du passage des cultures est estimé de la façon suivante :
Nombre de cellules viables du jour - Nombre de cellules du jour Q X 100% Nombre de cellules du jour 0
L'effet du riluzole a d'abord été étudié sur les lymphocytes de 2 patients atteints du SIDA.
Le patient PE n'avait suivi aucune thérapie et possédait les paramètres suivants (T4:467/mm3, T8:1662/mm3, charge virale:60824 copies/ml de plasma). La survie des cellules, au jour 13 de la culture, a été augmentée de 216% par rapport aux cellules contrôles à la dose de 10"6M, et de 378% à la dose de 10"7M (Figure 1A).
Le patient PR suivait une trithérapie et possédait les paramètres suivants (T4:880/mm3, T8:1280/mm3, charge virale:250 copies/ml de plasma). La survie des cellules, au jour 13 de la culture, a été augmentée de 169% par rapport aux cellules contrôles à la dose de 10"6M, et de 202% à la dose de 10"7M (Figure 2A). L'effet dose du riluzole a ensuite été étudiée sur les lymphocytes d'un patient
SIDA AR ne suivant aucune thérapie et possédant les paramètres suivants (CD4 :291/mm3 (17%), CD8 : 872/mm3 (51%), Virus:43576 copies/ml de plasma). La survie des cellules, au jour 13 de la culture, a été augmentée de 670% par rapport aux cellules contrôles à la dose de 10"8M, de 407% à la dose de 10"7M et de 230% à la dose de 10"6M (Figure 3A). Comme contrôle, l'effet dose du riluzole a aussi été étudié sur les lymphocytes d'un individu sain séronégatif. La survie des cellules, au jour 13 de la culture, a été augmentée de 271 % par rapport aux cellules témoins à la dose de 10"8M, de 228% à la dose de 10"7M et de 157% à la dose de 10"6M (Figure 4A).
Effet du riluzole sur la mort cellulaire des lymphocytes en culture :
Par ailleurs on peut constater dans les figures 1 B, 2B, 3B, ci-après, que par exemple dans le cas des cellules traitées par le riluzole, le pourcentage des cellules mortes dans la culture se maintient aux alentours de 2 à 10%, alors qu'il varie de 10 à 25%, dès le 3eme jour de la culture. Comme témoins, les lymphocytes d'un individu sain cultivés en présence ou en l'absence de riluzole ne manifestent pas un effet spécifique sur la mortalité (Figure 4B).
La présence du riluzole dans le milieu de culture protège donc les cellules mononucléaires de la mort cellulaire induite par le VIH-1 et permet une prolifération des lymphocytes.
Régulation négative de l'apoptose et de l'expression de Ki-67 des lymphocytes par le riluzole L'apoptose des cellules T et l'expression de ki-67 (qui est un marqueur de la prolifération des cellules T) ont été également régulées après 13 jours en présence de riluzole. En effet, dans la fenêtre de concentration de la drogue (10'7-10"8 M) le riluzole inhibe de 66% de l'apoptose totale exprimée par l'ensemble des lymphocytes, de 70% de l'apoptose des lymphocytes CD8 et de 80% des lymphocytes CD4 (Figure 5A, 5B, 5C), alors que l'apoptose qui est exprimée faiblement par les lymphocytes d'un donneur sain n'est pas changée par le traitement au riluzole (Figure 4C).
L'étude de l'expression de l'antigène Ki-67 (qui est un marqueur des cellules T compétent vis-à-vis de la prolifération) montre qu'il est régulé négativement. Cet effet se caractérise par une inhibition de l'ordre de 33% par l'ensemble des lymphocytes, de 37% par les lymphocytes CD8 et de 50% par les lymphocytes CD4 (Figure 6A, 6B, 6C). Ces résultats reflètent la récupération des cellules T après l'achèvement de leur cycle de prolifération cellulaire.
Régulation négative de l'apoptose FAS/FAS ligand par le riluzole :
Comme indiqué ci-dessus, il est bien établi que les lymphocytes de patients infectés par le VIH-1 sont sensibles à l'apoptose induite par l'expression de FAS (CD95/APO-1) et de son agoniste l'anticorps anti-FAS. Aussi, on a entrepris de faire agir cet anticorps sur les lymphocytes du patient AR en l'absence ou en présence de riluzole et de mesurer l'apoptose par l'expression de l'annexine V. Les résultats de la Figure 7 indiquent que l'apoptose des cellules témoins couplées à l'anticorps atteint le seuil de 50% d'expression, alors que les cellules conditionnées par le riluzole à la dose de 10"8M ne l'expriment qu'à 15% (62% d'inhibition). Ce pourcentage d'inhibition est comparable pour les cellules cultivées sans anticorps anti-FAS.
Effet du riluzole sur la réplication du VIH-1 : Ayant ainsi observé le rétablissement de l'activité proliférative des cellules T de patients infectés traités ou non par les antiviraux (trithérapie; antipolymérase plus antiprotéase) et l'inhibition de l'apoptose et de la mort cellulaire, l'expression du virus dans les cultures a été examinée.
Les concentrations d'ARN de VIH-1 dans les surnageants recueillis à partir des cultures de cellules T de patients étaient différentes en présence ou en l'absence du composé. L'ARN du VIH-1 dans les surnageant des cultures, provenant du patient PE non traité et possédant une forte charge virale, conditionnées par le riluzole (10"7M) était augmenté au jour 13 de la culture de 100%. La charge virale étant forte dès le départ, et le pic de la sortie du virus pour le contrôle a lieu au jour 6. Aux jours 3 et 6 de la culture, la mesure du virus est pratiquement la même, cependant aux jours 10 et 13, alors que la courbe des témoins amorce une décroissance , celle des cultures conditionnées (10'7M) reste 2 fois plus élevée (Figure 1C). Par contre, pour les cellules provenant du patient PR soumis à la trithérapie et ayant une charge virale à la limite du détectable, dés le 3eme jour de culture, une très forte sortie de virus est observée sur les cellules conditionnées par le riluzole (10'7M) par rapport au contrôle (1.1 logio de plus) (Figure 2C). Le pic de sortie du virus a lieu au jour 10 de la culture du contrôle due à l'historique des lymphocytes. Au jour 13 de la culture, alors que l'expression virale des cellules contrôle stagne, celle des cellules traitées culmine à un seuil élevé (0.7 logio de plus). L'effet dose du riluzole a ensuite été étudié sur l'expression du RNA viral des lymphocytes du patient SIDA AR ne suivant aucune thérapie et possédant une charge virale plasmatique de 43576 copies/ml. Le pic de la sortie du virus a lieu au jour 10 de la culture. Comparativement, les cellules conditionnées par le riluzole dès le 6eme jour de la culture exprimaient 0.8 log-io de plus de RNA viral que le contrôle aux doses de 10"6M, 10"7M et 10"8M . Cette production continuait d'augmenter au jour 13 (jusqu'à 0.7 log-io de plus) (Figure 3C). Effet du riluzole sur le virus intégré (ADN proviral):
Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 1 suivant :
Tableau 1
Effet du riluzole (0.1 μM) sur l'ADN proviral de lymphocytes de patients VIH-1 non traités et traités cultivées en l'absence ou en présence du riluzole.
Jour 3 de culture Jour 6 de culture
(-) (+) (-) (+)
#TT(-), V: 68.000* 6,8+0, 1 3,7 ± 0 O** 5.7+0 ,3 0,7+0,
#TT(+) , v :250* 4,5 +0 ,3 3 ± 0, 2** 3,8+0, 2 0,2+0, rf ** I I
#TT(+) , v :44.000* 5,3+0, 2 2 ± 0, 3** 4,8+0 ,3 0,3±0 «I **
TT(-): Patient sans Trithérapie, TT(+) : Patient sous Trithérapie * Nombre de copies par ml de sang. Log d'ADN de VIH proviral (copies [cp] /106 cellules).
Données exprimées sous la forme de moyenne + E.T (écart type) des T (écart type) des mesures. ** Valeur P (Wilcoxon) <0,01 par comparaison avec le milieu de culture seul.
Les données du tableau 1 démontrent que le riluzole est capable de diminuer de façon spécifique l'expression du virus intégré (p<0.01) des cellules provenant de patients SIDA.
Ces résultats montrent que le riluzole, tout en inhibant l'apoptose viro-induite favorisant ainsi la prolifération des lymphocytes, est en même temps capable d'agir sur les cellules « réservoir » et de les pousser à sortir le virus faiblement réplicatif.
Effet du riluzole sur l'expression des gènes de cvtokines : Pour associer les effets décrits du riluzole à l'expression des cytokines, les inventeurs ont mesuré par PCR en temps réel l'expression des gènes de cytokines. Les résultats obtenus ont montré que le riluzole est capable d'induire l'expression des gènes de NL-15, de l'interféron α et de l'interféron β, et du ToII récepteur 3 (Figure 8). Effet du riluzole sur la production de l'iπterféron et de l'IL-15: L'activation des gènes de l'interféron et de l'lL-15 est associée à la production de ces deux cytokines dans le surnageant des cellules traitées par le riluzole. L'activité fonctionnelle de l'interféron est déterminée par sa capacité à inhiber le pouvoir cytolystique du V.S.V. La production de l'IL-15 est quant à elle estimée par un test commercial Elisa. Ainsi des cellules traitées par 10'8 M de riluzole sont capables de 6 pg/ml d'IL-15. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 2 suivant : Tableau 2
Effet du riluzole (10"8 M) sur la production de l'IL-15 et de l'interféron α/β
Interleukine 15 lnterféron α/β
(-) Riluzole (+) Riluzole (-) Riluzole (+) Riluzole
1* 15* 20** 32.000**
* La mesure de la production de l'IL-15 est estimée par la technique Elisa (Kit R&D, U. K) les valeurs correspondent à des programmes par (pg/ml) par ml de culture.
** Les valeurs de l'interféron correspondent au nombre d'unités internationales par ml de culture.
Lorsque les cellules sont conditionnées par le riluzole à la concentration de 10"8 M elles deviennent capables de produire de l'interféron α/β capable d'inhiber le pouvoir cytolytique du V.S.V. La quantité ainsi produite est estimée à 32.000 Unités Internationales (Tableau 2).
Effet du riluzole sur la prolifération des cellules tumorales :
Lorsque les cellules tumorales de la lignée ATG 180 (Sarcome de Brocker) sont mises en culture avec différentes concentrations de riluzole (10'4-10"8 M) une inhibition de la prolifération des cellules est observée comparativement aux contrôles. A I O-4 M une inhibition de 86% de la prolifération est observée, elle est de
40% à 10'5 M et de 30% à 10"6 M (Figure 9a). Lorsqu'on utilise d'autres cellules tumorales comme la lignée Jurkat (Figure 9b), la lignée NB4 (Figure 9c) et la lignée H9 (Figure 9d) une inhibition de la prolifération de ces cellules tumorales est aussi observée.
Inhibition de l'ARN viral par addition de riluzole à un composé antiviral comme I1AZT. Les cellules provenant des patients PE, PR et AR (voir Figures 1-3) sont cultivées à partir du jour 12 en présence du riluzole et en présence d'AZT.
Après 6 jours de culture, on mesure la présence de virus par la mesure de l'ARN viral, le virus intégré dans la cellule sous forme d'ADN proviral, le taux de survie cellulaire et la viabilité cellulaire. Les résultats sont donnés dans le tableau 3 ci-dessous (dans ce tableau
Ril≈riluzole).
On observe une inhibition de l'ARN viral par l'AZT aux doses de 10 μg/ml et de 1 mg/ml cumulées aux concentrations de riluzole allant de 10"5 à 10'8 M.
Comme le montrent les résultats du tableau, l'AZT à 10 μg/ml, qui exerce un effet anti-viral, présente également un effet suppresseur (anti-prolifératif) sur les cellules témoins.
L'utilisation conjointe de riluzole et d'AZT permet de maintenir la prolifération et met en évidence l'effet restaurateur du riluzole par rapport à l'activité d'une drogue connue pour son effet anti-prolifératif à la dose de 10 μg/ml. Lorsque l'AZT est utilisée à 1 μg/ml l'effet antiviral est partiel, voire équivalent sur les cellules témoins.
En revanche, l'addition concomitante du riluzole aux concentrations indiquées permet de maintenir à la fois une inhibition de l'ARN viral et le maintien de la proliférationcellulaire. Il est en plus à remarquer que le riiuzole (10'6A9M) permet de diminuer de manière sigificative le taux de virus intégré (ADN proviral) et du virus libéré (ARN) viral à un taux où l'AZT (1 μg/ml) ne présente pas d'ihibition virale tout en conservant ses propriétés de restauration de la survie cellulaire. Tableau 3
(1) Nombre de copies d'ARN viral par ml de milieu de culture par test de quantification virale RT PCR.
(2) Log d'ADN de VIH proviral (copies [cp] /106 cellules).
(3) La survie cellulaire est estimée par le taux (nombre de cellules jour 18 - nombre des cellules jour 12) X 100 / nombre de cellules jour 12.
(4> La viabilité cellulaire est estimée par numérotation avec le bleu trypan.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Utilisation du riluzole ou de sels pharmaceutiquement acceptables du riluzole, pour la fabrication de médicaments pour amplifier et rétablir la fonction immunitaire pour le traitement de maladies, infectieuses et de cancers.
2- Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que les dits médicaments se présentent sous des formes pour l'administration par voie orale, parentérale, par exemple intraveineuse, ou topique, ou encore rectale, notamment sous forme de suppositoires.
3- Utilisation selon la revendication 1 ou 2, pour l'induction de l'interféron α/β et de l'interleukine 15 pour traiter un dysfonctionnement lié à une pathologie d'origine exogène ou endogène.
4- Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que la pathologie est associée à une agression d'origine iatrogène, induite par l'action d'immunosuppresseurs tel que la cyclosporine ou par l'action des corticoïdes.
5- Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour le traitement d'une pathologie liée à une agression virale.
6- Utilisation selon la revendication 5, pour le traitement des infections liées à une agression d'origine rétrovirale due aux VIH te type 1 ou II et aux HTLV I et II, ou par les herpès.
7- Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que la pathologie est liée à une agression d'origine virale due aux virus des Hépatites.
8- Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée par l'association avec un ou plusieurs composés à propriétés anti-virales. 9- Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que le composé antiviral est choisi parmi le DDI, le DDC, les antiprotéases, le 3TC et l'AZT.
10- Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour le traitement d'une pathologie liée à une agression parasitaire telle que la leishmaniose, la malaria ou bilharziose.
11- Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour le traitement d'une pathologie associée à une agression d'origine tumorale, telle qu'une tumeur immunologique comme le myélome et les leucémies, ou tissulaire.
12 - Utilisation selon la revendication 2, pour le traitement d'une pathologie associée à une agression auto-immune.
13 - Utilisation selon l'une quelconque des revendications 11 à 12, caractérisée en ce que lesdits médicaments sont administrés à raison de 50 à 200 mg/jour d'au moins un composé de formule (I), en tant que principe actif, à des doses unitaires de 25 à 100 mg.
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