WO2002022130A2 - Moyens pour la regulation des defenses immunitaires - Google Patents
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Definitions
- the subject of the invention is the use for this purpose of at least one substance chosen from the group consisting of organic compounds having an aromatic condensed structure, comprising at least three aromatic and / or heteroaromatic rings , preferably two of the said rings being aromatic rings, optionally substituted, in particular by at least one NH2 and / or CF3 group, and one of the said rings being a heteroaromatic ring comprising a nitrogen atom substituted by a lower alkyl group in C1-C4, optionally substituted, preferably a propyl group, so as to provide a tendency to reestablish or increase the proliferation of lymphocytes, in particular T lymphocytes, by action on monocytes / macrophages and / or on cells dendritic,
- R5 (NR6R 7 ) ⁇ represents a substituent group of ring nitrogen, in which
- the APR (at 1 nM) revealed a significant increase in the proliferation (binding of [ ⁇ H] -thymidine) of the T cells of HIV patients (cultured with M / M) in response to a stimulation by anti-CD3 / anti-CD28 antibodies and by booster antigens such as PPD or by the P18 antigen specific for HIV env V3 (FIG. 2A).
- the proliferation of T cells of patients in the presence of CD sensitized by the gag protein (p24) of HIV was also increased by APR
- Such a rapid decrease in most of the cytokines detectable under the effect of the APR according to the invention reflects the recovery of T cells after they have completed their proliferation cycle, as shown by the parallel decline in the expression of Ki-67 (which is a marker of T cells competent for proliferation) and the decrease in the percentage of apoptotic cells after 14 days of culture in the presence of APR (table 1). Since none of the above-mentioned cytokines appeared to be involved in the proliferation of T cells positively regulated by APR, other experiments were then carried out in which recombinant human IL-2 was excluded from the culture medium. standard lymphocytes.
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Abstract
L'invention concerne la reconstitution des défenses immunitaires et plus particulièrement dans le traitement des cancers, de la tuberculose, et l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine. Elle concerne plus particulièrement l'utilisation d'au moins un composé apte à agir sur le monocytes/macrophages et/ou sur les cellules dendritiques de façon à leur procurer un signal induisant une prolifération des lymphocytes, en particulier des lymphocytes T, procurant ainsi une régulation positive des défenses immunitaires dans l'organisme traité. La substance active est avantageusement choisie parmi des dérivés de phénazine, de phénoxazine et de phénothiazine notamment l'aminopérazine [ou 2-amino-10-[3'-(1-méthyl-4-pipérazinyl)-propyl]phénothiazine].
Description
MOYENS POUR LA RÉGULATION DES DÉFENSES IMMUNITAIRES
La présente invention concerne la régulation des défenses immunitaires dans les organismes vivants. Elle concerne plus particulièrement, chez l'homme et les animaux, la régulation positive des défenses immunitaires par action spécifique sur les monocytes/macrophages et/ou sur les cellules dendritiques, de façon à induire une prolifération des lymphocytes, en particulier des lymphocytes T, in vivo dans ledit organisme ou ex vivo, ou encore in vitro. L'invention concerne plus spécialement des moyens pour le rétablissement des défenses immunitaires d'un organisme, comportant au moins une substance active choisie dans le groupe consistant en des dérivés de phénothiazine, de phénoxazine et de phénazine.
L'invention s'applique avantageusement au traitement, à la prévention et/ou à la vaccination des cancers, infections à germes intracellulaires comme par exemple la tuberculose, infections virales telles que par exemple l'infection par les virus de l' im unodéficience humaine, et de manière générale aux affections résultant ou à l'origine de dérèglements des défenses immunitaires ou associées à de tels dérèglements, ainsi qu'à toutes situations pathologiques, provoquées par des médicaments ou des radiations, ou physiologiques telles que le grand âge, et à toutes situations dans lesquelles les défenses immunitaires sont altérées ou nécessitent d'être stimulées .
ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION
Dans la réponse immunitaire naturel le , la prolifération (c ' est-à-dire la division mitotique) des cellules T activées a pour effet l ' expansion de clones de lymphocytes T ef fecteurs , qui conservent la même spécificité antigénique, et ainsi augmentent la réponse
immunitaire vis-à-vis d'un antigène particulier. Les monocytes/macrophages (M/M) et les cellules dendritiques (CD) sont sollicités non seulement pour la présentation d'antigènes aux cellules T (cette présentation étant parfois désignée sous le nom de "premier signal"), mais également pour l'augmentation par prolifération des cellules T effectrices spécifiques d'un antigène (parfois désignée sous le nom de "second signal"). L'interaction entre les M/M et/ou les CD d'une part et les cellules T d'autre part déclenche une série d'événements encore mal connus à ce jour, qui accroît l'activité mitotique des cellules T et le développement de leurs fonctions effectrices; ce processus s'achève par la disparition d'une partie des cellules T spécifiques de l'antigène sous la forme d'une mort cellulaire programmée, également appelée "apoptose", et par la génération d'une population de cellules quiescentes spécifiques de l'antigène (que l'on dénomme ordinairement lymphocytes-mémoires) .
Il est bien connu de nos jours que le système immunitaire peut accroître la réponse des lymphocytes T cytotoxiques (LTC) contre les antigènes exprimés par des cellules cancéreuses autologues . Une réponse immunitaire insuffisante ou même absente à l'égard d'antigènes tumoraux chez un patient souffrant d'un cancer (ce qu'on a dénommé "anergie antitumorale") a été attribuée à un trouble du "premier signal" (dysfonctionnement de la présentation antigénique des cellules présentatrices telles que les CD aux lymphocytes T) et/ou du "second signal" (dysfonctionnement de la prolifération des lymphocytes T conduisant à un état d' anergie) au niveau des sites tumoraux (Matzinger, P. (1998), An innate sensé of danger, Se in. Im unol . 10 , 399-415). De ce fait, l'essentiel des recherches en immunothérapie antitumorale s'est focalisé sur une immunisation spécifique par un(des) antigène(s) associé(s) à la tumeur (AAT) . Les résultats d'essais cliniques ont montré que l'immunisation avec des
AAT ou des CD chargées d'un AAT peut induire une réponse des LCT spécifiques de l 'AAT, mais ne donne pas nécessairement lieu aux réponses cliniques prédites sur la base de la réponse des LCT. Ainsi, certaines métastases peuvent diminuer de taille ou disparaître, tandis que d'autres peuvent rester non affectées par la thérapie. Bien souvent, on observe jusqu'à présent l'absence de réponse clinique. Cette absence de réponse peut refléter l'absence ou le dysfonctionnement de l'activité du "second signal" au niveau des sites tumoraux des patients traités avec un vaccin comportant un AAT.
Dans ce cadre, il est apparu concevable qu'une stratégie fondée sur la normalisation ou la majoration du second signal à l'origine d'une prolifération adéquate des lymphocytes T en combinaison avec un vaccin auquel participent des CD chargées avec un ou des AAT puisse optimiser le potentiel d'une immunothérapie antitumorale.
Il est connu depuis plus de dix ans que les réponses prolifératives des lymphocytes T des stimulations mitogènes ou antigeniques diminuent progressivement au cours de l'évolution de l'infection par VIH (Clerici et al., (1989), J. Clin. Invest . 84, 1892-99; Miedema et al., (1988), J. Clin. Invest. 82, 1908-14; van Noesel et al., (1990), J. Clin. Invest. 86, 293-299). Cette réponse proliferative altérée des cellules T activées (due à un dysfonctionnement du "second signal") est une caractéristique permanente de l'infection à VIH limitant l'expansion des cellules T et rendant les cellules T activées (aussi bien les CD4 que les CD8) plus sensibles à une mort cellulaire programmée, ou apoptose (Finkel et al., (1995), Nat. Med. I, 129-134; Lu et Andrieu, (1995), Nat . Med. J, 386-387), conduisant ainsi à une diminution progressive de la concentration et de l'activité des cellules CD4+ et des cellules CD8+ du sang périphérique aussi bien que des organes lymphoïdes (Embretson et al., (1993), Nature 362 , 359-362; Fauci, (1995), Am. J. Med.
99 , 59S-60S; Lu et Andrieu, (1995), ibid. ; Pantaleo et al., (1993), Nature 362 , 355-358; Salerno-Goncalves et al., (2000), J. Virol. 74 , 6648-6651). Il a été suggéré que de nombreuses cytokines seraient impliquées dans un tel état d'anergie des cellules T activées dans l'infection à VIH (Kaneko et al., (1997), Clin. Exp . Immunol. 109, 41-46; Liegler et Stites, (1994), J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 7, 340-348; Schols et De Clercq, (1996), J. Virol. 70 , 4953-4960; Tam a et al., (1997), Clin. Immunol. Immunopathol . 85, 195-201; Zagury et al-, (1994) , Biomed. Pharmacother . 48, 11-16) . Cet état de "pause" des cellules T activées, en particulier caractérisé par un profil anormal d'expression des cytokines (Mil an et D'Souza, 1994), peut à son tour provoquer ou être associé à un dysfonctionnement des CD
(c'est-à-dire un manque de "premier signal") (Frankel et al., (1997), A . J; Pathol . 151 , 89-96; Spinillo et al.,
(1993), Gynecol. Oncol. 48, 210-213; Wenig et al., (1996),
Am. J.Surg. Pathol. 20, 572-587), favorisant plus encore la tolérance au virus et la dissémination virale chez les patients infectés.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION
On a maintenant trouvé de façon inattendue que l'on peut provoquer une prolifération des lymphocytes en agissant, au moyen d'une substance sans action propre sur les lymphocytes T eux-mêmes, sur les monocytes/macrophages (en abrégé M/M) et/ou sur les cellules dendritiques (en abrégé CD) et que l'on peut induire ainsi une tendance au rétablissement ou un accroissement de la prolifération des lymphocytes.
La présente invention a ainsi pour premier objet l'utilisation, pour l'obtention d'un médicament apte à procurer une prolifération des lymphocytes, d'au moins une substance apte à agir sur les monocytes/macrophages et/ou sur les cellules dendritiques ou leurs précurseurs, en
particulier issus du sang périphérique et des organes dans lesquels ils se situent habituellement, tels que ganglions, rate, tube digestif, etc., de façon à leur procurer un signal induisant une prolifération des lymphocytes, en particulier des lymphocytes T, procurant ainsi une régulation positive des défenses immunitaires dans l'organisme traité.
Dans une forme de réalisation préférée, l'invention a pour objet l'utilisation à cette fin d'au moins une substance choisie dans le groupe constitué par les composés organiques ayant une structure condensée aromatique, comportant au moins trois cycles aromatiques et/ou hétéroaromatiques, de préférence deux des dits cycles étant des cycles aromatiques, éventuellement substitués, notamment par au moins un groupe NH2 et/ou CF3, et l'un des dits cycles étant un cycle hétéroaromatique comprenant un atome d'azote substitué par un groupe alkyle inférieur en C1-C4, éventuellement substitué, de préférence un groupe propyle, de façon à procurer une tendance au rétablissement ou un accroissement de la prolifération des lymphocytes, en particulier des lymphocytes T, par action sur les monocytes/macrophages et/ou sur les cellules dendritiques,
Plus particulièrement l'invention a pour objet l'utilisation, telle que susdite, d'au moins un dérivé hétéroaromatique de type phénazine, phénoxazine ou phénothiazine substitué par un groupe alkyle inférieur en CI-C4, de préférence un groupe propyle, lui-même éventuellement substitué, et tout particulièrement l'utilisation d'au moins un composé de formule I ci-après, ou d'un dérivé ou d'un sel d'addition avec un acide pharmaceutiquement acceptable de ce composé:
où Ri , R^ , R3 et R^, qui peuvent être identiques ou différents, sont choisis indépendamment l'un de l'autre dans le groupe constitué par H, un groupe alkyle en C1-C4, de préférence -CH3 , un groupe NH2 et un groupe CF3 ,
X désigne 0, N ou S,
R5(NR6R7)Π représente un groupement substituant de l'azote du cycle, dans lequel
R5 est un groupe alkyle en C1.-C4, n vaut 1 ou 2, et
R^ et R7, qui peuvent être identiques ou différents l'un de l'autre, désignent chacun un groupe alkyle inférieur en C1-C4, de préférence -CH3 , et R^ et R7 peuvent former conjointement avec l'atome d'azote auquel ils sont liés un cycle hétéroatomique, de préférence un cycle pipérazinyle, • avantageusement substitué sur l'atome d'azote non lié à R^ par un groupe alkyle en C1-C4, de préférence par un groupe -CH3.
Dans le cas où le composé de formule est une phénazine (X = N) l'atome N correspondant, a ses trois valences dans le cycle et les insaturations de type aromatique sont délocalisées entre les trois cycles du composé.
De préférence, N5(NR6R7)Π dans la formule I ci-dessus désigne l'un quelconque des groupements -CH2CH2CH2-NR6R7 et -CH2CH(NRβR7)CH2-NRβR7, et plus particulièrement l'un quelconque des groupements CH2CH[N (CH3 ) 2 ]CH2N(CH3 ) 2
CH2CH(CH3)CH2N(CH3)2, CH2CH2CH2N (CH3 ) 2 ou CH2CH2CH2- pipérazinyl-CH3.
Parmi les composés de formule I, on préfère l'amino- pérazine [ou 2-amino-10- [3 ' - (l-méthyl-4-pipérazinyl) - propyl] -lOH-phénothiazine, C20H26 4S; masse moléculaire: 354,51] (abrégée ci-après en APR) , et son homologue trifluoré, la trifluopérazine (en abrégé TFP) , ou 10- [3- (4-méthyl-l-pipérazinyl) -propyl] -2- (trifluorométhyl) -10H- phénothiazine . Ces composés peuvent être préparés par l'homme du métier, au moyen de procédés connus et à partir de composés précurseurs connus, ou sont disponibles commercialement .
L'invention a ainsi également pour objet des compositions pharmaceutiques comportant au moins un tel composé de formule I, en particulier au moins un composé de formule I choisi parmi les phénazines, phénoxazines ou phénothiazines substituées, notamment 1 ' aminopérazine et/ou la trifluopérazine. Sous un autre aspect, l'invention a également pour objet des moyens pour l'obtention d'un médicament pour le renforcement des réponses immunitaires et/ou la restauration de l'immunité chez un patient ou une personne apparemment saine, comprenant une quantité efficace d'au moins un agent apte à provoquer la régulation positive des défenses immunitaires du dit patient, par action sur les monocytes/macrophages et/ou les cellules dendritiques.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION L'invention repose sur la constatation de ce que des substances aptes à agir sur les M/M et/ou les CD se sont avérées être particulièrement efficaces pour induire une tendance au rétablissement ou un accroissement de la prolifération des lymphocytes, en particulier des lymphocytes T, chez des patients traités in vivo avec des quantités appropriées de telles substances .
Rien de ce qui était connu antérieurement ne divulgait, ni même ne suggérait la possibilité de mise en oeuvre de tels moyens pour la lutte préventive ou curative contre des affections tumorales et/ou des infections accompagnées, résultant ou à l'origine d'une altération des défenses immunitaires des organismes vivants ou de conditions physiologiques ou pathologiques dans lesquelles il est souhaitable de renforcer positivement les défenses immunitaires, selon lesquels on agit sélectivement sur les monocytes/macrophages et/ou sur les cellules dendritiques en administrant dans l'organisme à traiter une quantité efficace d'au moins une substance agissant sur les M/M et/ou les CD de façon à procurer à l'organisme traité une tendance au rétablissement ou un accroissement de la prolifération des lymphocytes dans ledit organisme.
L'invention est ainsi fondée sur un nouveau concept inventif général, à savoir l'utilisation thérapeutique de substances aptes à agir in vivo sur les M/M et/ou les CD, ou encore in vitro sur des cultures appropriées de M/M et/ou de CD, dans ces derniers cas en présence dans tous les cas de lymphocytes ou de lysats de lymphocytes activés, en induisant une tendance au rétablissement ou un accroissement de la prolifération des lymphocytes, par action sur lesdits M/M et/ou CD. On a en effet établi selon l'invention que la prolifération des cellules T de patients normaux ou infectés par le VIH, induite par des M/M ou des CD, peut être l'objet d'une forte régulation positive par un composé de formule I, conformément à l'invention, par une nouvelle voie n'impliquant apparemment aucune des cytokines actuellement identifiées.
Les tableaux ci-dessous et les figures annexées regroupent et illustrent des résultats obtenus par les moyens selon l'invention, décrits plus en détail ci-après Les compositions pharmaceutiques selon l'invention présentées et/ou conditionnées pour l'accroissement des
réponses immunitaires et/ou la restauration de l'immunité chez un patient, comprennent comme principe actif au moins un composé tel que défini plus haut, et/ou un sel ou autre dérivé pharmacologique ent acceptable de celui-ci. Ladite composition est avantageusement sous forme de comprimés, tablettes ou pastilles, éventuellement effervescents, ou encore de solutions ou suspensions pour injections intradermiques, sous-cutanées, intramusculaires" ou intraveineuses, ou pour injection dans les cavités séreuses de l'organisme à traiter, comme par exemple le péritoine et la plèvre. Par ailleurs, au stade de la prévention du développement des affections tumorales ou des infections de l'organisme concerné, on peut également préconiser l'emploi d'une forme topique locale du dit composé ou de ladite composition.
Les formes galéniques de cette composition comprennent en pratique par dose unitaire ou multiple de doses unitaires une quantité de substance active ou de mélange de substances actives correspondant à une concentration en substance active ou mélange de substances actives d'environ 0,1 à 1000 nM pour un test in vitro.
L'homme du métier est apte à ajuster ces quantités au cas par cas et/ou selon les affections ou états physiologiques pour lesquels on désire une augmentation ou une tendance à la restoration des défenses immunitaires.
La composition comporte avantageusement une proportion de substance active apte à procurer une concentration plasmatique chez le sujet traité d'environ
0,1 à 1000 nM par litre de plasma du patient traité, pour un traitement in vivo ou ex vivo.
Ces doses peuvent, selon la voie d'administration employée, l'état du patient et la substance active utilisée, varier dans le temps et être administrées suivant une posologie comprenant une administration en une seule ou en plusieurs fois par jour, par semaine ou par mois. Ainsi une dose quotidienne telle que mentionnée ci-
dessus peut être elle-même remplacée par une quelconque autre chronologie et/ou dose d'administration de la substance active (administration hebdomadaire ou mensuelle, notamment) dans la mesure où la galénique du principe actif ainsi administré procure un effet pharmacologique sensiblement similaire à celui obtenu avec une administration quotidienne.
Selon l'invention, les substances actives peuvent être administrées par voie orale, parentérale, par exemple intraveineuse, la préférence allant à la voie orale.
Les substances actives peuvent être administrées conjointement avec un support ou vecteur ou un diluant physiologiquement acceptable pour former ainsi une composition pharmaceutiques complète, prête à l'emploi. De telles compositions contiennent avantageusement plus de 0,1% en poids d'au moins une substance active et peuvent être préparées par des techniques classiques permettant l'obtention de formes galéniques classiques, par exemple des comprimés, des capsules, des gélules, des dragées, des poudres dispersables, des sirops, des élixirs, des suspensions ou des solutions, des gouttes, des nébulisations, des suppositoires, des pommades, des lotions. Des diluants ou des supports ou vecteurs pharmaceutiques appropriés comprennent par exemple l'eau, des alcools, des huiles ou cires naturelles ou durcies, des carbonates de calcium ou de sodium, du phosphate de calcium, du kaolin, du talc et du lactose, ainsi que, si on le souhaite, des agents conservateurs appropriés, tels que par exemple de 1 'hydroxybenzoate de méthyle, des agents de mise en suspension, comme la methylcellulose, la gomme adragante et l'alginate de sodium, des agents mouillants, tels que la lécithine, le polyoxyéthylène stéarate et le monooléate de polyoxyéthylène-sorbitan, des agents de ganulation et/ou de désintégration tels que l'amidon et l'acide alginique, des agents de cohésion, tels que l'amidon, la gélatine et la gomme arabique, et
des agents lubrifiants comme le stéarate de magnésium, l'acide stéarique et le talc. Les compositions selon 1 ' invention qui sont sous forme de comprimés peuvent être revêtues par des techniques connues, afin que puissent être différées la désintégration du comprimé et l'absorption du principe actif dans le tractus gastrointestinal et que soit ainsi procurée une action prolongée sur une longue période. Les formes d'administration intramusculaires peuvent être élaborées par les techniques habituelles, connues de l'homme du métier, de façon à libérer le principe actif sur un temps prolongé. Une forme préférée est représentée par les formes pour administration per os que sont les gouttes et les comprimés . L'invention est décrite plus en détail dans la partie expérimentale ci-après, qui ne la limite aucunement et dans laquelle, sauf mention contraire, les posologies- du principe actif sont rapportées au volume en litres du plasma sanguin du patient.
METHODES
Purification et culture de monocytes/macrophages (M/M)
Les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC, ou Peripheral Blood Mononuclear Cells en anglais) ont été isolées à partir de sang complet frais, traité au citrate, de donneurs respectivement sains et infectés par le VIH-1, par centrifufgation à gradient de densité au moyen d'un dispositif dénommé Ficoll-Hypaque (Eurobio, Les Ullis, France) . Les PBMC ont été appauvries en cellules
CD3+ et CD19+ au moyen de billes magnétiques (Dyanl, Great
Neck, New York, USA) et ensemencées à raison de
5x10^ /puits dans des plaques de 24 puits ou alvéoles
(Nunc, Roskilde, Danemark). Après 4 heures d'incubation à 37°C dans 5% de C02/ les cellules non-adhérantes ont été éliminées par deux rinçages successifs avec une solution
saline équilibrée de Hank (tampon de Hank) . Les celllules adhérantes ont ensuite été utilisées pour la culture avec 2x10^ de cellules T autologues activées en présence ou en l'absence d'un filtre (voir plus loin) ou cultivées pendant 7 jours avec un lysat de cellules T autologues activées (produit par un choc osmotique et sonication, c'est-à-dire traitement aux ultrasons), en présence ou en l'absence d'une substance active selon l'invention (en l'occurence de l'APR ou de la TFP) aux concentrations indiquées .
Purification et culture de cellules dendritiques (CD)
Pour produire des cellules dendritiques (CD) on a purifié des monocytes périphériques provenant de PBMC de 10 patients (non traités) contaminés par le VIH, (voir plus haut) par sélection négative utilisant des billes magnétiques (Dynal) . Les cellules purifiées (5xl0^/ml) ont été mises en suspension dans du milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum AB humain inactivé par la chaleur (SAB) , 100 U/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine, 2 mM de
L-glutamine, 100 mM de pyruvate de sodium et 5x10~8 cle mercaptoéthanol complété avec 0,25 ng/ml de GM-CSF (R&D
System, Inc., Mineapolis, MN, USA) et 0,1 ng/ml d'IL-4
(R&D System) et cultivées pendant 5 jours dans des sachets en Teflon de 30 ml (Vuclife, APC, Columbia, USA) .
Purification et culture de cellules T
Des cellules de phénotype CD3+, CD3+/CD4+ ou CD3+/CD8+ ont été purifiées à partir de PBMC fraîchement isolées, provenant du sang total de donneurs sains ou de patients non traités, infectés par le VIH-1, au moyen de billes magnétiques anti-CD3 /billes DETACH (Dynal, Great Neck, New York, USA) . Les cellules purifiées ont été remises en suspension à raison de 10^/ml dans un milieu de culture RPMI 1640 contenant 20% de SAB, des acides aminés non-essentiels, 100 U/ml de pénicilline, 100 μg/ml de
streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 10 mM de tampon HEPES; ce milieu est appelé dans la suite "milieu de culture des lymphocytes", soit en abrégé MCL. Les cellules ont ensuite été ensemencées à raison de 2xl0^/puits dans des plaques de 24 puits (Nunc, Roskilde, Danemark) et ont été stimulées avec 4 μg/ml de phytohémagglutinine (PHA) (Sigma, St Louis, Missouri, USA) ou 0,5 μg/ml d'anticorps monoclonaux anti-CD3 (Beckton Dickinson France, Le Pont-de-Claix, France) , plus 100 ng/ml d'anticorps monoclonaux anti-CD28 (PharMingen, Los
Angeles, CA, USA) ou stimulées par culture avec des CD autologues sensibilisées par la protéine gag (p24) du VIH
(voir plus loin) repectivement en l'absence ou en présence respectivement de phénothiazine (PT, Sigma), de chromopromazine (CPZ, Sigma) , d'APR (Aremas) aux doses de substance médicamenteuse indiquées. Après une nuit de stimulation avec de la PHA ou des anticorps anti-CD3/CD28, les cellules ont été lavées et remises en suspension à la concentration de lO^/ml dans du MCL contenant les mêmes concentrations des substances médicamenteuses plus 20 Ul/ml d' interleukine 2 (Boehringer Mannheim, Allemagne) pendant une période de 20 jours de cuture en présence ou en 1 ' absence de M/M, aussi bien avec que sans filtre (voir plus haut) . Les cultures ont été maintenues à 37°C dans de l'air humidifié à 5% de Cθ2 • Les milieux de culture ont été changés tous les 2-3 jours, tandis qu'on maintenait les cultures à une densité de cellules viables < 2xlθ6/puits dans un volume constant de 2 ml/puits. Tous les 2/3 jours, des comptages de cellules viables ont été effectués par exclusion au bleu trypan, et les surnageants ont été récoltés pour conservation à -20°C.
Test de prolifération
Des PBMC ont été fraîchement isolées à partir de 10 patients infectés par le VIH et non-traités qui possédaient 200-400 lymphocytes périphériques CD4/ml et
plus de 10^ de copies d'éq. d'ARN de VIH par ml de plasma. Les cellules ont été remises en suspension à une concentration cellulaire de 5x10^ /ml dans du MCL et ensemencées en quadruple dans des plaques de microtitrage à fond rond, comportant 96 puits (Nunc) contenant 10^ PBMC par puits. Les cellules ont été stimulées avec 3000 U/ml de dérivé protéinique purifié (PPD) de tuberculine (Pasteur Mérieux, Lyon, France) ou 1 μg/ml de peptite P18 d'env V3 de VIH (P18) (Genosys, Londres, UK) respectivement en l'absence ou en présence d'APR aux concentrations indiquées . Les plaques de microtitrage ont été placées dans un incubateur de cellules sous une atmosphère humidifiée contenant 5% de Cθ2 pendant 96 heures. Pendant les 16 dernières heures d'incubation les cellules ont été puisées avec 1 μCi/puits de [3f_] thymidine (Amershan, Aylesbury, UK) . Les cellules ont ensuite été récoltées sur des filtres en fibres de verre au moyen d'un appareil de récolte, multi-échantillons automatisé; les filtres ont ensuite été placés dans des tubes avec du liquide de scintillation et soumis à un comptage avec un compteur à scintillation bêta.
Pour l'évaluation de la prolifération des cellules T en réponse à des CD sensibilisées à de l'antigène viral, des CD purifiées ont été ensemencées en quadruple à des doses progressives (30.000, 10.000, 3.000 et 1.000) dans des plaques de microtitrage pour culture de tissus à fond plat et à 96 puits (Nunc.) et incubées avec 1 μg/ml de la protéine gag (p24) recombinante du VIH-1 (Transgène, Strasbourg, France) pendant 2 heures. L'excès d'antigène a été éliminé par lavage et 10^ cellules T autologues ont été ajoutées dans chaque puits et cultivées pendant 5 jours. La prolifération des cellules T a ensuite été déterminée: les cellules ont été puisées par 1 μCi/puits de [^H] thymidine (Amershan) pendant les 16 dernières heures d'incubation et la radioactivité a été déterminée
par comptage dans un compteur à scintillation bêta comme décrit plus haut .
Test d'apoptose Les cellules apoptotiques ont été mesurées au moyen d'iodure de propidium et d'annexine V marquée au FITC, qui est une protéine de liaison aux phospholipides qui se fixe préférentiellement à la phosphatidylsérine exposée à la surface des cellules dans la phase initiale de l' apoptose, au moyen d'un kit disponible dans le commerce (Immunotech, Marseille, France) . Les cellules qui étaient négatives à 1 ' iodure de propidium et positives à 1 ' annexine V ont été identifiées comme étant des cellules apoptotiques, tandis que celles qui étaient positives aussi bien à 1 ' iodure de propidium qu'à l' annexine V ont été considérées comme étant des cellules pré-nécrotiques .
Cytome rie de flux
Des comptages de cellules T de phénotypes CD4+ et de CD8+, ainsi que leurs sous-populations naïves (CD45RO+ ou CD45RA+/CD62L-) , mémoire (CD45RA+/CD62L+) ou Ki-67 ont été effectués par analyse par cytométrie de flux (FACScan, Beckton Dickinson, San José, CA, USA) . On a utilisé une série d'anticorps monoclonaux dirigés contre les marqueurs de surface suivants des cellules T: CD3-PerCP, CD4-FITC, CD8-PE, CD45RO-PE, CD45RA-PE, CD62L-FITC, CD4-PerCP, CD8- PerCP et Ki-67-PE (Beckton Dickinson, France) .
Détection de cytokines Les surnageants exempts de cellules recueillis au jour 7 et au jour 14 de culture ont été testés pour observer la présence et mesurer la concentration des cytokines ci-après: TNF- , TGF-βl, IL-lβ, IL-lra, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18 et IFN-γ, avec l'aide de kits ELISA du commerce (Quantikine®, R&D System) . La sensibilité du test pour chaque cytokine était de 4,4
pg/ l pour TNF-α, 7 pg/ l pour TGF-βl, 1 pg/ml pour IL-lβ, 22 pg/ml pour IL-lra, 10 pg/ml pour IL-4, 0,7 pg/ml pour IL-6, 3,9 pg/ml pour IL-10, 5 pg/ml pour IL-12, 1 pg/ml pour IL-15, 15 pg/ml pour IL-18 et 7 pg/ml pour IFN-γ respectivement.
Test de quantification virale
La production virale a été déterminée par mesure de l'ARN de VIH dans les surnageants exempts de cellules par un test d'amplification avec chevauchement induit par des amorces multiples, nouvellement mis au point (en abrégé
MUPROVAMA) , décrit dans le document WO 97/17465, avec un seuil de détection de 10 éq. copies/ml (Lu et al., 1999).
L'ADN proviral a été déterminé par un test MUPROVAMA modifié. Pour cela, on a utilisé 2x10^ cellules pour purification d'ADN cellulaire avec un kit du commerce
(QIAamp® DNA Mini kit, QIAGEN GmbH, Hilden, Allemagne) .
Quatre dilutions standard (10, 100, 1000 et 10.000 copies dans un équivalent de 105 cellules d'ADN de PBMC de donneur négatif vis-à-vis du VIH) d'ADN de VIHl de plasmide (pBHlO-R3) ont été utilisées comme standard externe dans chaque expérience (Lu et al., 1994) . Un équivalent de 10^ cellules d'ADN échantillon purifié et 4 ADN standard ont été utilisés pour une amplification spécifique de VIH par le test MUPROVAMA tel que décrit dans Lu et al., 1999, tandis qu'un équivalent de 10^ cellules de chaque ADN échantillon purifié ou d'ADN standard avaient été purifié en parallèle pour le calibrage de l'apport d'ADN génomique avec une paire d'amorces (5 ' -GCGGGAAATCGTGCGTGACATT-3 ' , sens, nucléotide
[nt] 2.280-2.301 de la séquence génomique de β-actine
HUMACCYBB, numéro d'accès à la base de gènes GeneBank
M10277; 5 ' -GATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG-3 ' , antisens, [nt]
2.606-2.583 de HUMACCYBB. Après amplification, 10 μl de produit de réaction de VIH ou de β-actine de chaque échantillon ont été répartis dans les 96 puits d'une
plaque de microtitrage revêtus de streptavidine (Roche Molecular Bioche icals, Meylan, France) pré-incubés avec une sonde marquée à la biotine, spécifique pour le VIH-1 (Lu et al., 1999) ou pour la β-actine (5'- TTCCAGCCTTCCTTTCTGGGCATGGAATCCTGT-5 ' , nt 2544-2576 de HUMACCYBB) . Un test ELISA couplé avec une hybridation a été réalisé comme décrit (Lu et al., 1999). Le signal optique de chaque puits d'hybride de VIH a été corrigé automatiquement de la différence entre le signal du puits d'hybride de β-actine correspondant et la moyenne des signaux de β-actine de l'ADN standard contenant 10^ puits d'ADN génomique de PBMC avec un logiciel (Révélation 4.02, Dynex, Chantilly, VA, USA). La charge d'ADN proviral de VIH cellulaire a été calculée au moyen de la courbe de calibrage standard (qui suit un modèle de régression log- log dans l'intervalle de 1 à 10^ copies d'ADN de VIH-1 pour 10^ cellules) générée à partir des signaux de quatre dilutions du standard externe d'ADN de VIH-1.
Pour l'évaluation de l'activité antivirale de cellules T de phenotype CD8+ développée en présence de CD sensibilisés par un antigène viral, on a ensemencé 5x10^ de CD en double dans des plaques à 24 puits (Nunc) et on a incubé avec 1 μg/ml de protéine gag (p24) de VIH-1 (Transgène) pendant 2 heures. L'excès d'antigène a été éliminé par lavage et 10^ cellules T CD4+ autologues seules ou associées à 10^ cellules T CD8+ autologues ont été ajoutées dans chaque puits et mises en culture pendant 20 jours. L'ADN proviral cellulaire et l'ADN viral du surnageant de culture ont été évalués au oyeen de la méthode de quantification virale susdite.
RESULTATS
Survie accrue des cellules T sous l'effet d'APR La survie des cellules a été augmentée de 1 à 5 fois et de 10 à 25 fois au jour 14 de culture par 0,1-10 nM
(pic à 1 nM) d'APR dans des cellules T (cultivées avec M/M) , normales et infectées par le VIH de façon exogène (in vitro) respectivement, tandis que PT ou CPZ présentaient peu d'effet (augmentation <1 fois du nombre des celllules T normales et <5 fois d'augmentation des cellules T infectées) ou même pas d'effets sur la survie des cellules (Fig. 1A & 1B) . En outre, l'APR (à 1 nM) présentait des augmentations de 1-5 fois de la survie des cellules T de 6 patients atteints de VIH cultivées avec des M/M après stimulation avec de la PHA (Fig. 2A) ou des
'anticorps anti-CD3/anti-CD28 (Fig. 2B) . L'analyse cytometrique.de flux a démontré que les sous-ensembles naïf (CD45RO+ ou CD45RA+ / CD 62 L ~ ) et mémoire
(CD45RA+/CD62L+) des lymhocytes T CD4 aussi bien que CD8 étaient également multipliés par l'APR (données non représentées) .
Prolifération accrue des cellules T sous l'effet de l'APR
L'APR (à 1 nM) a révélé une augmentation significa- tive de la prolifération (fixation de [^H] -thymidine) des cellules T de patients atteints par le VIH (mises en culture avec M/M) en réponse à une stimulation par des anticorps anti-CD3/anti-CD28 et par des antigènes de rappel tels que le PPD ou par l'antigène P18 spécifique de l'env V3 du VIH (Fig. 2A) . La prolifération des cellules T des patients en présence de CD sensibilisées par la protéine gag (p24) du VIH a également été accrue par l'APR
(à 1 nM) (Fig. 2B) .
Augmentation de la survie des cellules T sous l'effet d'APR par l'intermédiaire de M/M ou de CD
Le composé dénommé APR (à 1 nM) a augmenté la survie des celllules T normales ou infectées par le VIH, cultivées avec des M/M autologues. La survie des cellules T était seulement légèrement augmentée lorsque les
• cellules T ont été séparées des M/M par un filtre; par
ailleurs, on n'a observé aucune augmentation de la survie des cellules T lorsqu'elles étaient cultivées en l'absence de M/M (Fig. 2A) . De plus, les surnageants dérivés de M/M cultivés avec du lysat de cellules T autologues activées (mais pas les surnageants de M/M seuls) en présence d'APR
(à 1 nM) présentaient une augmentation semblable de la survie des cellules T normales ou infectées par le VIH
(Fig. 2B) . Des résultats semblables ont également été observés avec des surnageants dérivés de CD cultivées avec du lysat de cellules T autologues activées (mais pas de CD seule) en présence d'APR (à 1 nM) (données non représentées) .
Régulation négative de l'apoptose de l'expression de Ki-67 des lymphocytes T et de la production de cytokine dans les surnageants de culture par l'APR
La concentration de IL-lβ, IL-lra, IL-6, IL-10, IL-12 et IFN-γ dans les surnageants des cellules T de 10 patients atteints par le VIH et non traités, cultivées avec des M/M autologues déclinait (de 2 fois) à partir du jour 7 et diminuait de façon très forte (de > 10 fois) au jour 14 de culture en présence d'APR (à 1 nM) . L' apoptose des cellules T et l'expression de Ki-67 (qui est un marqueur de prolifération des cellules T ont également été régulées négativement après 14 jours de culture en présence d'APR, tandis que le TNF- et l'IL-4 n'étaient pas détectables dans les surnageants recueillis aux jours 7 et 14 de chacune des cultures (tableau 1) .
Une telle diminution rapide de la plupart des cytokines détectables sous l'effet de l'APR selon l'invention reflète la récupération des cellules T après qu'elles ont achevé leur cycle de prolifération, comme le montre le déclin parallèle dans l'expression de Ki-67 (qui est un marqueur des cellules T compétent vis-à-vis de la prolifération) et la diminution du pourcentage de cellules apoptotiques après 14 jours de culture en présence d'APR
(tableau 1) . Etant donné qu'aucune des cytokines susdites n'est apparue être impliquée dans la prolifération des cellules T régulée positivement par l'APR, on a ensuite effectué d'autres expériences dans lesquelles l'IL-2 humaine recombinée était exclue du milieu de culture de lymphocytes standard. On a obtenu au total 50% de réduction dans la survie des cellules T dans la culture d'où était éliminée l'IL-2, par comparaison avec le milieu standard contenant de l'IL-2 exogène. Il était intéressant de noter que l'ampleur de l'augmentation de la survie des cellules T sous l'effet de l'APR était semblable (5 fois après 14 jours de culture) en présence et en l'absence d'IL-2 exogène (données non représentées). L'IL-2 produite de façon endogène restait inchangée en présence d'APR. II est plausible que l'APR accomplisse son effet régulateur sur la survie des cellules T par l'intermédiaire de l'induction d'un ou plusieurs facteurs solubles, non identifiés à ce jour, dérivés de M/M ou de CD en présence de cellules T activées, qui sont capables d ' accroître/restaurer l'activité proliferative des cellules T normales/cellules T de patients infectés par le VIH.
Activité antivirale des cellules T CD8+ accrue par des CD autologues sensibilisées par la protéine gag (p24) de VIH en présence d'APR
Ayant ainsi observé le rétablissement de l'activité proliferative des cellules T de patients infectés par le VIH, on a examiné une restauration potentielle de l'immunité anti-VIH qui se développe peu après l'infection, mais diminue progressivement au cours de l'évolution de l'infection. Après expansion sous stimulation par anti-CD3/anti-CD28 en présence de CD, le nombre de copies d'ADN proviral intracellulaire de cellules T de patients atteints de VIH (copies/10^ cellules) restait inchangé en présence d'APR, par
comparaison avec les mêmes cellules cultivées en l'absence d'un tel composé. Les concentrations d'ARN de VIH dans les surnageants recueillis à partir des cultures de cellules T des patients étaient semblables en présence ou en l'absence du composé susdit (tableau 2) . Au contraire, l'ADN proviral de cellules T de patients atteints de VIH cultivées avec des CD autologues sensibilisées par la protéine gag (p24) de VIH était abaissé de 2 logio Pa-r des cellules T cultivées en présence d'APR, tandis que l'ARN de VIH dans le surnageant des mêmes cultures était diminué de 3 logio en présence d'APR (tableau 3). Soit l'absence de cellules T de phenotype CD8+ (tableau 3), soit la présence d'anticorps anti-CD8 (données non représentées) supprimait ces activités antivirales, ce qui indiquait que les cellules T de phenotype CD8+ effectrices anti-VIH peuvent être aisément amplifiées en présence de CD sensibilisées par la p24 et d'une substance de formule I selon l'invention, telle que par exemple l'APR.
A cet égard, on peut envisager des traitements améliorés fondés sur une reconstitution immunitaire, combinant des vaccins à base de cellules dendritiques (CD) destinées à procurer un "pemier signal" adéquat et des substances médicamenteuses régulatrices de l'immunité, telles que par exemple l'APR ou la TFP, ayant pour fonction de restaurer le "second signal".
Tableau 1. Effets de l 'aminopérazine (APR) (1 nM) sur l' apoptose et l'expression de Ki-67 membranaire de cellules T de 10 patients VIH+ non traités, stimulées avec des anticorps anti-CD3/CD28 et cultivées avec des M/M, ainsi que sur leur production de cytokine dans le surnageant de culture.
Jour 7 de culture Jour 14 de culture
Moyenne APR Moyenne APR
% d ' poptose 12,3±4, 1* 12,6±5,7 20,6±8,4 10,1*7,31
% de cellules de Ki-67 47,8+14,5 48, 1+14,9 21,7+5,1 8,4+3, lf
TNF-α (pg/ml) UND§ UND UND UND
TGF-B1 (pg/ml) 0,41 ±0,27 0,42±0,28 UND UND
IL-lβ (pg/ml) 185*155 64+48t 77,6+65,2 UND
IL-lra (pg/ml) 4136*2395 2077+ 142 If 1736+934 27+16f
IL-4 (pg/ml) UND UND UND UND
IL-6 (pg/ml) 4306+1032 2458±726f 1669+489 64+45f
IL- 10 (pg/ml) 166±124 84+8 lf 73+68 UND
IL- 12 (pg/ml) 389+357 164+137f 149+106 UND
IL- 15 (pg/ml) 6,2+ 1.7 6,1 + 1,8 UND UND
IL- 18 (pg/ml) 54,6+17,8 55,3+18,9 UND UND
IFN-γ (ng/ml) 10,4+8,6 5,5+4, lf 5,7+3,2 l,3+l,lt
Données exprimées sous la forme de la moyenne ± E.T. (écart- type) des mesures.
Valeur P (Wilcoxon) <0,01 par comparaison avec le milieu de culture seul.
UND, non-détectable (c'est-à-dire en dessous du seuil de détection des kits ELISA du commerce) .
Tableau 2. Effets de 1 'aminopérazine (APR) (1 nM) sur l'ADN proviral et 1 ' ARN de virion du surnageant de cellules T de 10 patients VIH+ non traités, stimulées avec des anticorps anti-CD3/CD28 et cultivées avec des CD.
Jour 7 de culture Jour 14 de culture Moyenne APR Moyenne APR
Log d'ADN de VIH proviral (copies [cp]/106 cellules) 4,5+1,2* 4,5±l,l 4,7+1,3 4,8+1,4
Log d'ARN de VIH dans le surnageant
( éq . de cp/ml ) 4,6+0 8 4,8±0,9 5,7±1,4 5,9+1,8
* Données exprimées sous la forme de la moyenne ± E.T. (écart- type) des mesures.
Tableau 3 . Effets de l ' aminopérazine (APR) ( 1 nM) sur l ' ADN proviral et l ' ARN de virion du surnageant de cellules T de phenotype CD4+ de 10 patients VIH+ non- traités, cultivées avec des CD sensibilisées par du gag de VIH, en l ' absence et en présence de cellules T de phenotype CD8+ .
Jour 7 de culture Jour 14 de culture Moyenne APR Moyenne APR
Culture de cellules T de phenotype CD4+ Log d'ADN de VIH proviral (copies
[cp]/106 cellules) 4,7+1,3* 4,7+1,4 4,8±1,4 4,8+1,7
Log d'ARN de VIH dans le surnageant (éq. de cp/ml) 5,0+1,7 5,1+1,5 5,5+1,6 5,3+1,7
Coculturβ de cellules T de phenotype CD4+/CD8+
Log d'ADN de VIH proviral (copies
[cp]/106 cellules) 3,8+1,1 2,0+0,5f 3,7+1,7 2,2±0,4,
Log d'ARN de VIH dans le surnageant (éq. de cp/ml) 3,1±0,7 l,5±0,2f 3,8+1,3 1,8+0,31
* Données exprimées sous la forme de la moyenne ± E.T. (écart- type) des mesures . t Valeur P (Wilcoxon) <0,01 par comparaison avec le milieu de culture seul.
Des aspects particuliers de 1 ' invention sont en outre illustrés dans les figures annexées, qui illustrent certains des résultats obtenus selon l'invention, et dans lesquelles : Fig. 1 représente, sous forme d'un diagramme en blocs: Survie (jour 14) de cellules T (A) normales et (B) infectées par du VIH de façon exogène (in vitro), stimulées avec de la PHA et cultivées avec des M/M en présence de 0,1-1000 nM de phénotiazine (PT) (L-1) , de chlorpromazine (CPZ) (Q) ou d' aminopérazine (APR) (ϋ) . Effets de l'APR (1 nM) sur la survie (jour 11) de cellules T de patients non traités, infectés par le VIH, stimulées (C) par la PHA ou (D) par des anticorps anti-CD3/anti-CD28 et cultivées avec des M/M (1—1, le patient No.l avait 800 cellules CD4/μl; 03, le patient No.2 avait 664 cellules CD4/μl; Ξ. le patient No.3 avait 504 cellules CD4/μl; Ω, le patient No.4 avait 484 cellules CD4/μl; E__, le patient No.5 avait 267 cellules CD4/μl; lu, le patient No.6 avait 214 cellules CD4/μl) . Effets de l'APR (1 nM) sur la survie ( our 14) de cellules T non infectées (VIH-, n=5) ou de cellules T de patients infectés par le VIH (VIH+, n=10) , stimulées avec de la PHA; cellules T seules (Q), cultivées avec des M/M autologues eri l'absence (^) ou en la présence (Q) d'un filtre (E) , ou avec des surnageants dérivés de culture de M/M autologue (Éϋ) ou de M/M cultivés avec du lysat de cellules T autologues activées (lu) (F) . Les données ont été exprimées sous la forme de la moyenne ± l'écart-type (ET) d'expériences faites en triple dans les figures 1A à 1D, et ont été exprimées sous la forme de la moyenne ± ET pour les mesures obtenues avec des échantillons de 5 donneurs normaux ou de 10 patients infectés dans les figures 1E et IF.
Fig. 2 représente: Effet de l'APR (à 1 nM) sur les réponses prolifératives des cellules T de 10 patients non- traités, infectés par le VIH, stimulées par anti-CD3/anti- CD28 (H) , par de la PPD (0) ou par du V3-P18 (E3) en
présence (A) de M/M autologues ou (B) de CD autologues, sensibilisées par la protéine gag (p24) du VIH (" "; CD seule; "O", CD plus APR) (B) . Les données ont été exprimées sous la forme de la moyenne ± ET des mesures obtenues avec des échantillons de 10 patients.
Fig. 3 représente: Effets de l'APR (1 nM) sur la survie (jour 14) des cellules de 5 patients souffrant de cancers métastatiques (CM) non-traités, stimulées avec de la PHA) ; cellules T seules (1—I) , cultivées avec des M/M autologues en l'absence (1H) ou en la présence (E_l) d'un filtre, ou avec des surnageants dérivés d'une culture de M/M autologues (Ξ) ou de M/M cultivés avec du lysat de cellules T autologues, activées (HOÏ) . Les données ont été exprimées sous la forme de la moyenne ± ET des mesures obtenues avec des échantillons de 5 patients.
Ainsi, les moyens selon l'invention, et tout particulièrement le produit dénommé APR, se sont avérés, dans des quantités appropriées, variables en fonction des conditions d'expérience et/ou des données relatives aux patients traités, être des stimulateurs puissants de la prolifération des cellules T, dont le pilotage est assuré par les M/M et/ou les CD. L'APR (de préférence à raison d'environ 0,1-100 nM) s'est avérée être capable d'augmenter la réponse par prolifération/survie de cellules T normales ou infectées, par exemple par le VIH, (de façon exogène ou endogène) (y compris de sous- populations de lymphocytes naïfs et mémoire aussi bien de phenotype CD4+ que CD8+) vis-à-vis de la lectine, de la PHA, des anticorps anti-CD3 ou anti-CD28 ou des antigènes de rappel, en présence, mais pas en l'absence, de M/M ou de CD, avantageusement autologues. Au contraire, la phénothiazine elle-même et la chlorpromazine (qui est. un dérivé de phénothiazine bien connu) ne manifestaient pas ou seulement très peu d'effet sur la prolifération des cellules T. Ces réponses proliferatives des cellules T ont été accrues de façon similaire par des surnageants obtenus
à partir de M/M ou de CD cultivés avec un lysat de cellules T autologues activées, en présence d'APR, mais pas à partir des surnageants de M/M ou de CD seuls. Une telle prolifération renforcée des cellules T allait de pair avec une diminution des IL-lβ, IL-lra, IL-6, IL-10, IL-12 et IFN-γ à partir du 7ème jour de culture, ainsi qu'avec une diminution du pourcentage des cellules T apoptotiques aussi bien qu'avec celles portant le marqueur de Ki-67+ au 14ème jour de culture. L'infection virale' et la replication dans les cellules T de patients contaminés par le VIH cultivées avec des M/M ou des CD n'étaient pas affectées par les produits de formule I selon l'invention, en particulier par celui dénommé APR. Au contraire, l'ADN proviral cellulaire et de l'ARN viral du surnageant étaient très fortement abaissés par les lymphocytes T de CD8+ cultivés en présence des CD autologues sensibilisées par de la protéine gag de VIH et d'APR. Ainsi, les produits de formule I selon 1 ' invention, et parmi eux plus particulièrement le produit dénommé APR, peuvent être utiles pour renforcer la réponse immunitaire chez des individus vaccinés ou à vacciner et/ou restaurer l'immunité chez des patients pour lesquels celle-ci était compromise, insuffisante ou faisait défaut. Ils sont applicables dans le traitement, mais également dans la prévention, des maladies tumorales et des infections, aussi bien que dans d'autres situations physiologiques (comme le grand âge) ou pathologiques (par exemple, système immunitaire lésé par des médicaments, des radiations, des toxines) . Les mêmes effets que ceux des moyens selon l'invention relatés ci-dessus peuvent être mis à profit dans des expériences in vitro, ainsi que dans des travaux de recherche sur les affections tumorales et les infections des organismes vivants, ainsi que dans les différentes situations évoquées plus haut.
Selon une autre forme de réalisation de la présente invention, on peut également faire proliférer les lymphocytes, en particulier des lymphocytes T, par incubation d'au moins une substance selon l'invention dans des cultures cellulaires appropriées qui sont ensuite injectées aux patients à traiter.
On obtient des résultats comparables en mettant en oeuvre conformément à l'invention les composés de formule I suivants, seuls ou en mélanges, éventuellement sous la forme d'un sel d'addition avec un acide pharmaceutiquement acceptable et/ou d'un dérivé pharmaceutiquement acceptable de ceux-ci:
- la 2-amino-10- (3-diméthylaminopropyl) -lOH-phénothiazine,
- la 2-amino-10- [3- (l-méthyl-4-pipérazinyl)propyl] -10H- phénoxazine,
- la 2-amino-10- (3-diméthylaminopropyl) -lOH-phénoxazine,
- la 3-amino-10- [3- (l-méthyl-4-pipérazinyl) ropyl] -10H- phénothiazine,
- la 3-amino-10- (3-diméthylaminopropyl) -lOH-phénothiazine, - la 3-amino-10- [3- (l-méthyl-4-pipérazinyl) propyl] -10H- phénoxazine,
- la 3-amino-10- (3-diméthylaminopropyl) -lOH-phénoxazine,
- la 2-fluoro-10- [3- (l-méthyl-4-pipérazinyl) propyl] -10H- phénothiazine, - la 2-fluoro-10- (3-diméthylaminopropyl) -lOH-phéno- thiazine,
- la 2-fluoro-10- [3- (l-méthyl-4-pipérazinyl) propyl] -10H- phénoxazine, et
- la 2-fluoro-10- (3-diméthylaminopropyl) -lOH-phénoxazine. Bien que l'on ne souhaite pas être lié par une quelconque théorie, on pense que les moyens selon l'invention agissent sur les M/M et/ou les CD en formant avec ceux-ci des facteurs ou des structures autrement activées, qui peuvent à leur tour agir sur les lymphocytes, en particulier sur les lymphocytes T, de façon à développer ceux-ci et à leur permettre de procurer
une régulation positive des défenses immunitaires dans l'organisme traité ou dans des celllules traitées ex vivo, ou encore dans des cultures de cellules in vivo.
Aux doses préconisées in vivo ou aux concentrations utilisées in vitro ou ex vivo pour les substances selon la présente invention, lesdites substances ne présentent pas d'effets latéraux qui puissent les rendre incompatibles avec leur prescription.
Claims
REVENDICATIONS
Utilisation d'au moins une substance pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour la régulation positive des défenses immunitaires d'un organisme vivant par action sur les monocytes/macrophages et/ou les cellules dendritiques, caractérisée en ce que ladite substance est une substance apte à procurer un signal induisant une prolifération des lymphocytes.
Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite substance est un composé organique ayant une structure condensée aromatique, comportant au moins trois cycles aromatiques et/ou hétéroaromatiques, éventuellement substitués, notamment par au moins un groupe NH2 et/ou CF3, et l'un des dits cycles étant un cycle hétéroaromatique comprenant un atome d'azote substitué par un groupe alkyle en Cl .4.
Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite substance est un composé de formule I
X désigne O, N ou S,
R5(NR6R7)Π représente un groupement substituant de l'azote du cycle, dans lequel
R5 est un groupe alkyle en C1-C4, n vaut 1 ou 2, et
R6 et R7, qui peuvent être identiques ou différents l'un de l'autre, désignent chacun un groupe alkyle inférieur en C1-C4, de préférence -CH3, et R^ et R7 peuvent former conjointement avec l'atome d'azote auquel ils sont liés un cycle hétéroatomique, de préférence un cycle pipérazinyle, avantageusement
substitué sur l'atome d'azote non lié à R^ par un groupe alkyle en C1-C4,. de préférence par un groupe -CH3. ou un dérivé ou un sel d'addition avec un acide pharmaceutiquement acceptable du dit composé.
4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite substance est la 2-amino-10-[3'-(l-méthyl-4-pipérazinyl)propyl]-10H-phénothiazine ou aminopérazine.
5. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite substance est la 10-[3-(4-méthyl-l-pipérazinyl)-propyl]-2-(trifluorométhyl)-10H-phéno- thiazine.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ladite substance est combinée avec une préparation vaccinale.
7. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit organisme vivant est choisi parmi les animaux, y compris l'homme.
8. Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la préparation d'un médicament pour le traitement des affections tumorales et/ou des infections.
9. Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la préparation d'un médicament pour le traitement d'états physiologiques ou pathologiques accompagnés d'une déficience immunitaire.
10. Composition pharmaceutique pour la régulation positive des défenses immunitaires d'un organisme vivant, caractérisée en ce qu'elle comprend, en tant que substance active, au moins un composé organique ayant une structure condensée aromatique, comportant au moins trois cycles aromatiques et/ou hétéroaromatiques, éventuellement substitués, et l'un des dits cycles étant un cycle hétéroaromatique comprenant un atome d'azote substitué par un groupe alkyle en C1-.4.
11. Composition selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle est combinée avec une préparation vaccinale.
12. Composition selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend, en tant que substance active, au moins un composé organique ayant une structure condensée aromatique, comportant au moins trois cycles aromatiques et/ou hétéroaromatiques, éventuellement substitués, et l'un des dits cycles étant un cycle hétéroaromatique comprenant un atome d'azote substitué par un "groupe alkyle en Cl .4.
13. Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend, en tant que substance active, au moins un composé répondant à la formule I
X désigne O, N ou S,
R5(NR6R7)Π représente un groupement substituant de l'azote du cycle, dans lequel
R5 est un groupe alkyle en C1-C4, n vaut 1 ou 2, et
R6 et R7, qui peuvent être identiques ou différents l'un de l'autre, désignent chacun un groupe alkyle inférieur en C1-C4, de préférence -CH3, et R" et R' peuvent former conjointement avec l'atome d'azote auquel ils sont liés un cycle hétéroatomique, de préférence un cycle pipérazinyle, avantageusement substitué sur l'atome d'azote non lié à R^ par un groupe alkyle en C1-C4, de préférence par un groupe -CH3, ou un dérivé ou un sel d'addition avec un acide pharmaceutiquement acceptable du composé de formule I.
14. Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce que la substance active est la 2-amino-10-[3'-(l-méthyl-4-pipérazinyl)propyl]-10H-phéno- thiazine ou aminopérazine.
15. Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce que la substance active est la 10-[3-(4-méthyl-l-pipéra__inyl)-propyl]-2-(trifluorométhyl)-10H- phénothiazine.
16. Composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, caractérisée en ce qu'elle comporte une proportion de substance active apte à procurer des concentrations de ladite substance active correspondant à une concentration en substance active d'environ 0,1 à 1000 nM pour un test in vitro.
17. Composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, caractérisée en ce qu'elle comporte une proportion de substance active apte à procurer une concentration plasmatique chez le sujet traité d'environ 0,1 nM à 1000 nM par litre de plasma du patient traité, pour un traitement in vivo ou ex vivo.
18. Composition selon l'une quelconque des revendications 10-15 et 17, caractérisée en ce qu'elle est sous forme de comprimés, tablettes ou pastilles, éventuellement effervescents, ou sous forme de solutions ou suspensions pour injections intradermiques, sous-cutanées, intramusculaires ou intraveineuses.
19. Composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 18, caractérisée en ce qu'elle comporte ladite substance active à raison de plus de 0,1% en poids, en mélange avec un support, vecteur et/ou diluant pharmaceutiquement acceptable.
20. Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 13 à 15 pour la production in vitro de monocytes/macrophages dotés d'un second signal les rendant aptes à induire une prolifération des lymphocytes.
21. Utilisation selon la revendication 20 pour la préparation d'un médicament apte à induire une prolifération des lymphocytes, notamment des lymphocytes T, d'un organisme vivant.
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