EP0599845A1 - Medicament contenant un agent inhibant in vivo l'apoptose pathologique et applications - Google Patents

Medicament contenant un agent inhibant in vivo l'apoptose pathologique et applications

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EP0599845A1
EP0599845A1 EP92908880A EP92908880A EP0599845A1 EP 0599845 A1 EP0599845 A1 EP 0599845A1 EP 92908880 A EP92908880 A EP 92908880A EP 92908880 A EP92908880 A EP 92908880A EP 0599845 A1 EP0599845 A1 EP 0599845A1
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EP
European Patent Office
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agent
cells
cell
lymphocytes
antibody
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP92908880A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Claude Ameisen
Hervé GROUX
André Capron
Fabienne Ameisen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Pasteur de Lille
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Institut Pasteur de Lille
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Institut Pasteur de Lille
Publication of EP0599845A1 publication Critical patent/EP0599845A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2006—IL-1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex

Definitions

  • the present invention relates to the treatment of apoptosis of human cells characterized by the dysfunction or deficiency of certain cell populations.
  • It also relates to a method of selecting agents for the treatment of apoptosis in its pathological manifestations.
  • It also relates to methods for determining the capacity of cells of individuals affected by an HIV virus to respond to aggression by an infectious agent.
  • apoptosis is synonymous with the expressions "programmed cell death” or "activation-induced death”.
  • Apoptosis is a suicide mechanism of cells which has the particularity of being physiologically active. It is involved in the regeneration of tissues thus found in the involution during embryogenesis and adult life and the maturation of the embryonic immune system.
  • apoptosis differs from necrosis which is a response to attacks by the cell.
  • Apoptosis has pathological consequences that are all the greater since it can occur in cell populations that the organism is unable to regenerate in their adult form. differentiated, in particular memory lymphocyte cells and neurons.
  • the capacity for cellular regeneration of the organism can also be exceeded from a quantitative point of view.
  • pathological also relates to phenomena such as cell degeneration or aging involving an involution.
  • Apoptosis only concerns cells in the process of disappearing, and does not cause effects on the tissue and cellular environment: it is therefore not an apparent phenomenon, unless we really try to bring it into evidence.
  • TCR T cell receptor
  • lentiviruses causing pathological disorders resulting in an abnormal appearance of cellular suicides.
  • viruses SIV in monkeys By way of example of such lentiviruses, mention may be made of viruses SIV in monkeys, FIV in felines, BIV in cattle, VISNA in sheep, CAEV in goats and HIV in humans.
  • CD4 helper T cells CD4 helper T cells.
  • MHC-II major class II histo-compatibility complex
  • PWM mitogen pockeweed
  • anti-CD28 antibody increases the proliferation of T cells in patients infected with the HIV j virus, and thus allows a proliferative response of immature thymocytes to anti-CD3, and to two antibodies. anti-CD2.
  • HIV viruses vis-à-vis certain diseases or vis-à-vis certain antigens.
  • the applicants therefore set out to find an effective therapeutic agent, in particular with regard to diseases linked to the HIV virus.
  • the present invention therefore relates to a medicament containing an agent which in vivo inhibits pathological apoptosis.
  • an agent can be selected by a process comprising at least the steps:
  • a cell activating agent such as pokeweed mitogen (PWM)
  • PWM pokeweed mitogen
  • the retrovirus is an HIV.
  • HIV HIV
  • the virus in the presence of an agent according to the invention cannot teach cells apoptosis. This method, unlike the previous one, directly concerns the virus.
  • An agent according to the invention will be chosen from those capable of:
  • PHA phytohemagglutinin
  • Allogeneic irradiated cells are cells from an individual genetically different in terms of their HLA system.
  • Such a medicament is in particular intended for the treatment of diseases linked to retroviruses and in particular linked to lentiviruses, such as viruses.
  • Another subject of the present invention is the use of an agent as defined above for obtaining a medicament intended for the treatment of the previously mentioned diseases.
  • composition containing a pharmaceutically effective amount of an agent as defined previously in combination with one or more pharmaceutically acceptable diluents or adjuvants.
  • a pharmaceutical composition is intended for the treatment of diseases linked to retroviruses and in particular linked to lentiviruses.
  • the treatment of patients affected by these diseases will be done in a manner known per se and preferably by parenteral or intravenous route.
  • the present invention also relates to a method for determining the qualitative deficiency of the immunological repertoire of individuals vis-à-vis an infectious agent comprising at least the steps of:
  • the object of the present invention is also a method for determining the capacity of an individual's lymphocytes to respond to aggression by an infectious agent comprising at least the steps of:
  • the present invention further relates to a method of in vitro stimulation of lymphocytes from patients suffering from a disease linked to retrovirus by treatment of the lymphocytes isolated with an anti-CD28 antibody.
  • the present invention relates to a method for selecting an agent which in vivo inhibits pathological apoptosis comprising at least one step of bringing cells infected with a lentivirus such as an HIV virus into contact with an antigen, respectively in the presence and in the absence of said agent and consequently of stimulation by said antigen.
  • a difference in response between the cells cultured in the presence and in the absence of said agent would constitute an index of the inhibitory activity of this agent.
  • the anti-CD28 antibody preferably used for the implementation of the present invention is the mouse monoclonal antibody derived from the clone CLB-402 (catalog number JANSSEN 1989
  • FIG. 1a is a diagram illustrating the proliferation of cells of patients infected with the HIV 1 virus and of healthy individuals in the presence of phytohemagglutinin (PHA), of PWM, of staphylococcal enterotoxin B super-antigens (SEB) or of tetanus toxin (TT).
  • PHA phytohemagglutinin
  • SEB staphylococcal enterotoxin B super-antigens
  • TT tetanus toxin
  • FIG. 1b is a diagram showing the effect of the anti-CD28 antibody on the proliferation of cells of patients infected with the HIV 1 virus, in the presence of PWM, SEB or TT.
  • FIG. 2a illustrates the mortality of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of patients infected with the HIV ⁇ virus (columns 1) and healthy individuals (columns 2), in the presence of cycloheximide, cyclosporin A (CSA), anti-CD28 antibodies, PWM, or SEB.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • FIG. 2b illustrates the cell mortality of PBMC cells of patients affected by the HIV 1 virus (columns 1) and of healthy individuals (columns 2) from which CD4 + T cells or CD8 + T cells have been eliminated, in the presence or in the absence anti-CD28, PWM or SEB antibodies.
  • FIG. 3 illustrates the results obtained after incorporation of tritiated thymidine in cells of patients affected by an HIV virus in the presence of PWM, or of PHA.
  • FIG. 4 is an autoradiogram representing the hybridization of total RNA of PBMC cells of patients affected by the HIV virus, cultured in the presence of PWM or of PHA, with a DNA probe complementary to the interleukin-2 receptor.
  • FIG. 5 is a snapshot of a DNA electrophoresis gel of PBMC cells from patients infected with the HIV 1 virus, cultured in the presence of PMW or SEB and of healthy individuals.
  • FIGS. 6a and 6b respectively represent photographs by electron microscopy of PBMC cells of healthy individuals and of patients affected by the HIV 1 virus.
  • Figures 7a and 7b are histograms corresponding respectively to the proliferation and cell death of cells cultured in a simple medium (column 1), in a medium supplemented with IL-2 (10 units / ml - column 2) and activated with bound CD5 antibody as a control (column 3) or by bound CD3 antibody (column 4 to 8) in the presence of recombinant IL-1 (50 units / ml) column 5, recombinant IL-2 (10 units / ml column 6), anti-IFNgamma antibody (serum dilution 1/800 - column 7) or cycloheximide (50 ⁇ / ml - column 8).
  • FIG. 7c is an electrophoresis gel of DNA extracted from medullary thymocytes cultured in a simple medium (column 1) or stimulated by CD3 (columns 4, 5 and 7) in the presence of recombinant Interleukin (column 5) or d anti-IFNgamma antibody (column 7).
  • FIG. 7d represents a dot blot analysis of RNA of medullary thymocytes stimulated by simple medium (column 1) with recombinant IL-1
  • FIG. 8 represents a gel for electrophoresis of DNA from T cells of chimpanzees infected with the HIV virus (columns 1 to 4) or of control chimpanzees
  • FIG. 9 represents a gel for electrophoresis in agarose of DNA of control macaque T cells stimulated with SEB (columns 1 and 2) of T cells of macaques infected with the SIV virus incubated in a simple medium (columns 3, 5 and 7) and T cells of macaques infected with the SIV virus, incubated with SEB (columns 4, 6 and 8).
  • FIG. 10 represents a gel for electrophoresis of DNA of T cells of macaques infected with the SIV virus incubated in simple medium (columns 1 and 3) or of medium + SEB columns 2 and 4), of T cells of green monkeys infected with SIV and incubated with SEB (columns 5 to 7) and green monkey T cells incubated with SEB (columns 8 and 9).
  • T lymphocytes from 38 patients infected with the HIV-1 virus and from 20 healthy individuals were tested in response to the polyclonal activators phytohemagglutinin, concanavalin A, mitogenic pockweed (PWM), anti-CD3 monoclonal antibody, and in response to the antigen stimulation of the tetanus toxin TT.
  • PWM mitogenic pockweed
  • TT-specific memory T cells are rare, and may have been eliminated in patients infected with the HIV virus, the response to the mobilization of T cell receptors by the use of enterotoxin B superantigens Staphylococcus (SEB) was also tested.
  • SEB enterotoxin B superantigens Staphylococcus
  • SEBs bind to MHC-II molecules and act with V ⁇ molecules of T cell receptors (TCR) expressed by up to 30% of normal T cells, and induce the proliferation of mature normal T cells (Marrack and Kappler, J Science 248, 705-711, 1990) and apoptosis in immature thymocytes (Genkinson et al. J. Immun. 19, 2175-20177, 1989).
  • TCR T cell receptors
  • HIV infection was attributed to 15 of the patients to homosexual relationships, to 14 of the patients to heterosexual relationships, to 7 of the patients to intravenous drug use and to 2 of the patients to blood transfusion.
  • the peripheral blood mononuclear cells were obtained on Ficoll-Hypaque and were cultured as described by Reed et al. (Proc. National Acad. Sci. USA 83, 3982-3986 (1986)).
  • the PBMCs are incubated at a cell density of 2.5 ⁇ 10 5 / ml for 3 days with culture medium without adjuvant, medium containing phytohemagglutinin (PHA) at 10 ⁇ g / ml, pokeweed mitogen (PWM) at 10 ⁇ / ml , staphylococcal enterotoxin B superantigen (SEB) at 1 ⁇ g / ml, or for 6 days with the antigen (TT) at 10 ⁇ g / ml.
  • PHA phytohemagglutinin
  • PWM pokeweed mitogen
  • SEB staphylococcal enterotoxin B superantigen
  • each circle represents the average of cultures carried out in triplica, the horizontal bars representing the average of the results for each treatment.
  • Trials have also been carried out by incorporating tritiated thymidine into T cells of 19 of the HIV infected patients (FIG. 1 b) in response to proliferation by PWM, SEB or TT, in the absence or in the presence of anti CD28 antibody.
  • the anti-CD-28 antibody is provided by the company JANSSEN (mouse monoclonal antibody derived from the clone CLB-402).
  • Cells were prepared and used as described for FIG. La and the anti-CD28 antibody was added at a concentration of 10 ⁇ g / ml.
  • FIG. 1 b shows that the anti-CD28 antibody increases the proliferation of control T cells in the presence of PWM or SEB.
  • the antibodies CD5 (A50, gamma 1, CD43 (B1B6, gamma 1), CD44 (P245, gamma 2a), and CD45R (ALB11, gamma 1, Immunotech) at concentrations of 10 ⁇ g / ml do not stimulate proliferation T cells from HIV + patients (results not shown in the figure).
  • FIG. 2 a illustrates the cell death of PBMC of patients infected with the HIV virus as well as controls, after in vitro culture in the presence of PWM and SEB.
  • results mentioned in FIG. 2a represent the average plus or minus the standard deviation of experiments carried out on 20 different patients infected with the HIV virus (columns 1) and 20 uninfected individuals (column 2). Cell mortality is demonstrated by the permeability to trypan blue.
  • PBMCs are cultured with an initial cell density of 2.5 10 5 / ml in
  • CsA cyclosporine A
  • FIG. 1 Figure 2b concerns similar experiments.
  • PBMC cells from an infected patient with the HIV virus (columns 1) and an uninfected individual (columns 2) were purified by elimination of CD4 + T cells (CD 8 cells) or CD8 + T cells (CD 4 cells) by incubation with respectively IOT4 or IOT8 antibody followed by incubation with magnetic particles coated with goat anti-mouse IgG antibody.
  • the quality of the elimination is measured by cytofluorometry (Epix Coulter Clone) and shows that the cell contamination is less than 1%.
  • the cells are cultured as described for FIG. 1 a).
  • the results represent the average of three measurements of cell mortality after 48 hours.
  • the proliferation is measured by incorporation of the tritiated thymidine after 3 days.
  • CD4 cells of uninfected individuals proliferate in response to PWM (5250 + 651 CPM) and SEB (21.642 + 2.317 CPM), while CD8 control cells and CD4 and CD8 cells from patients infected with HIV do not proliferate after 5 days.
  • anti-CD28 antibodies to the CD4 cells of patients infected with the HIV virus restores the capacity of these cells to proliferate during stimulation with PWM and SEB, but has no effect on the cells of patients. infected with unstimulated HIV or on control CD8 cells.
  • FIG. 3 illustrates the proliferation of PBMC cells of patients infected with the HIV virus and of healthy individuals after addition of PWM or of PHA, after incorporation of tritiated thymidine in the T cells of 3 patients infected with the HIV virus (ABC) and B ') and a healthy individual (D) in response to stimulation by PMW at 10 ⁇ g / ml (columns A, B and C, and column D) or by PHA at 10 ⁇ m / ml (column B ').
  • FIG. 4 illustrates the expression of the messenger RNAs coding for the interleukin 2 receptor (IL-2R) of PBMC of patients infected with the HIV virus and of healthy individuals after addition of PWM or of PHA.
  • the same patients (A, B, C, B 'and D) as in Figure 3 were repeated. This expression is measured on the same cells after 2 hours, 6 hours and 16 hours. These messenger RNAs were not detected before stimulation.
  • IL-2R interleukin 2 receptor
  • RNAzol Cina-Biotex, Friendwood, USA
  • the experiments were carried out by extraction of the total cellular RNAs from 10 7 PBMCs with RNAzol (Cinna-Biotex, Friendwood, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • the total RNA samples (approximately 10 ⁇ g / ml) are fractionated according to their size in 1% agarose gels containing formaldehyde and are transferred to HYBOND-N filters (Amersham).
  • the filters are then hybridized with cDNA probes labeled with phosphate 32 (human IL-2R) and washed with a 0.1 SSC, 0.1% SDS solution at 55oC.
  • the relative sizes of the IL-2R mRNAs which hybridize with the probe are in agreement with the values of 3.5 kb previously published.
  • EXAMPLE 4 Degradation of cellular DNA.
  • FIG. 5 represents the ectrophoresis on DNA agarose gel extracted from PBMC of patients infected with the HIV virus or of healthy individuals after culture overnight in a culture medium with or without adjuvants.
  • EDTA 0.5% Triton X100
  • DNA from the supernatants is concentrated by precipitation at
  • Well 1 in Figure 5 corresponds to the molecular weight marker.
  • Well 2 corresponds to the DNA of PBMC cells from healthy individuals incubated with PWM.
  • Wells 3 to 11 correspond to the DNA of PBMC cells of 7 patients infected with the HIV virus incubated respectively with medium without adjuvant (well 3), medium comprising PMW (wells 4 to 6, 8 and 9), and medium comprising SEB (wells 10 and 11).
  • Wells 3 and 4 correspond to the same patient.
  • the figure shows that the DNAs from wells 4 to 6 and 8 to 11 have a degradation profile characteristic of apoptosis, the degraded DNA bands being multiples of 200 base pairs.
  • FIG. 6a represents a photograph by electron microscopy of PBMC of a patient infected with the HIV virus after an incubation of 24 hours in a medium without adjuvant.
  • FIG. 6b represents the same cells incubated in a medium containing 5 ⁇ g / ml of PWM.
  • influenza antigen is a commonly encountered antigen, it is possible that the three patients whose lymphocytes do not proliferate in the presence of anti-CD28 antibodies have already encountered it, and that the memory cells directed against this antigen have been eliminated thereby .
  • Lymphocytes were stimulated (OJ) after purification, by tetanus toxin (TT) by phytohemagglutin (PHA) and by the mitogen pockeweed (PWM).
  • OJ tetanus toxin
  • PHA phytohemagglutin
  • PWM mitogen pockeweed
  • the proliferation is measured by the incorporation of tritiated thymidine after 6 days (day 6).
  • the cells are cultured in the presence of tetanus toxin or the superantigen of staphylococcal B enteroxin (SEB) with or without anti-CD28 antibody.
  • SEB staphylococcal B enteroxin
  • the cells precultivated in the presence of the anti-CD28 antibody proliferate in the presence of the TT or SEB antigens.
  • Lymphocytes from patients infected with the HIV virus are stimulated either directly (JO) with phytohememaglutinin (PHA), the mitogen pockeweed
  • PWM staphylococcal enterotoxin B
  • SEB staphylococcal enterotoxin B
  • the cells are restimulated after 10 days under the same conditions as in the OJ.
  • lymphocytes The restoration of the capacity of lymphocytes to proliferate after a first stimulation with allogenic cells and in response to PWM and SEB was tested.
  • the monoclonal antibody CD3 does not induce the proliferation of thymocytes and leads after 48 hours to the death of approximately 50% of the thymocytes, as indicated in Table V below.
  • the cells were stained with a mixture of CD4-FITC antibody (LFL1 green fluorescence) and CD8-RD antibody (LFL2 red fluorescence) to perform a flow cytofluorometry analysis (Coulter Epies Profile II).
  • Cell proliferation after mobilization of TCRs with CD3 antibodies bound on a dish, in the presence or absence of IL-2 (10 units per ml) was determined by incorporation of tritiated thymidine ( 3 H-TdR). Thymidine was added in the last twelve hours of the third day.
  • the results represent the average of triplicate culture or a representative experiment among the three.
  • Cell death was determined 48 hours after stimulation by exclusion of trypan blue. The results and the percentages of cell death are chosen from three experiments.
  • Thymus were obtained from children less than two months after cardiac surgery.
  • the thymocytes were purified on a nylon sieve and were frozen until used.
  • the medullary thymocytes were isolated from a population of total thymocytes by negative selection with magnetic beads covered with a CD1 antibody (D47, IgG1 at l ⁇ .ml), according to the manufacturer's instructions (Biosys, France).
  • the CD4 + CD8- or CD8 + CD4- thymocytes were purified from medullary thymocytes by additional negative selection using respectively the CD8 monoclonal antibody (L533 IgG1 at 1 ⁇ / ml) or the CD4 antibody (0516, IgG1, at 1 ⁇ / ml).
  • Proliferation tests with fixed monoclonal antibodies (OKT3, IgG2a) or CD5 (A50, IgG2a) as controls were carried out. To determine cell death, the cells were harvested after 48 hours by pipetting and diluted in half with 0.1% trypan blue in PBS buffers. Living cells and dead cells were counted in a hemocytometer. The results are expressed as the percentage of dead cells.
  • the medullary thymocytes having been isolated by a negative selection, using the antibody CDla in all cases, and the antibodies CD46 and CD8 in the additional purifications, the three cell populations were contaminated by approximately 20% of immature thymocytes CD4- CD8- CD3-.
  • the cell mortality due to CD3 of total medullary thymocytes is associated with a DNA fragmentation characteristic of apoptosis as shown in Figure 7 C.
  • This figure is an agarose electrophoresis gel of DNA extracted from medullary thymocytes after different treatments.
  • the spinal cord thymocytes were cultured in a simple medium (column 1) or were stimulated by the bound CD3 antibody (columns 4, 5 and 7) in the presence of recombinant IL-1 (rIL-1) (TO U / ml, column 5), or in the presence of anti-IFN gamma (serum dilution 1/800, column 7).
  • This cell death is an active process which can be prevented by cycloheximine as shown in Figure 7b and cyclosporine A as shown in Table VI. l
  • apoptosis due to CD3 of medullary thymocytes is associated with the expression of the messenger RNA IFNgamma, with the secretion of IFNgamma, with the expression of the messenger RNA of the P55 chain of the IL-2 receptor, the absence of expression of the IL-2 gene and the absence of secretion of IL-2.
  • FIG. 7d represents the dot blot analysis of RNA of medullary thymocytes stimulated with a simple medium (column 1), a medium containing rILl ⁇ (50 units / ml, column 2), of the bound CD3 antibody (column 3) and CD3 antibody linked with rILl ⁇ (column 4).
  • the IL-2 autoradiogram was performed after 6 hours.
  • IFNgamma, IL-2 receptor and S-actin autoradiograms were performed after 6 p.m.
  • the probes were tested on a Northern Blot of RNA of thymocytes and each gives a specific signal without cross hybridization. The relative sizes of the messenger RNAs which hybridize to the probes are in agreement with the previously published values.
  • IL-2 prevents thymocyte death ( Figure 7b) and allows proliferation thymocytic in response to the CD3 antibody ( Figure 7a).
  • T-lymphocyte the addition of IL-1 to medullary thymocytes stimulated with CD3 allows the expression of messenger RNAs of IL-2 (Figure 7d) and the secretion of IL-2 (Table VI).
  • IL-1 does not affect the expression of IFNgamma messenger RNAs ( Figure 7d) or the secretion of IFNgamma (Table VI) in response to stimulation by CD3.
  • IFNgamma and IL-2 are added to thymocytes activated by CD3 and treated with CsA. Under these conditions, IFNgamma induces thymocyte death, while IL-2 induces thymocyte proliferation. When IFNgamma and IL-2 are added together, no cell death is observed and the thymocytes proliferate.
  • Table VII shows, for its part, that such a cell death program is not restricted to the stages of development of T cells, but is also present in the case of peripheral T cells, activated and mature humans.
  • a mature CD4 + T cell line specific for the tetanus toxin antigen behaves like human medullary thymocytes when stimulated by the CD3 antibody in the absence of other cells.
  • IFNgamma and / or IL-2 to peripheral mononuclear cells activated by CD3 and treated with CsA leads to the same results with the antigen-dependent T cell lines and the medullary thymocytes.
  • Table VIII below shows that neither the addition of IL-2 nor the addition of anti- Interferon gamma are not capable, unlike the antibody CD28, of preventing apoptosis of these lymphocytes, nor of restoring their proliferation in response to stimuli. IL-1 is also devoid of effect.
  • An antigen (tetanus, influenza) is presented to a T-CD4 + lymphocyte line by monocytes which have been preincubated with an HIV virus. The presentation of the antigen takes place in the presence of AZT to avoid infection of T-CD4 + lymphocytes. A normal lymphocyte proliferative response ensues.
  • the antigen when represented a second time to T-CD4 + lymphocytes by monocytes, even those not infected with the HIV virus, the lymphocytes die of apoptosis instead of proliferating.
  • FIG. 8 represents a gel for electrophoresis of DNA from T cells of chimpanzees infected with the HIV virus and incubated with SEB (columns 1 to 4) and of control chimpanzees, that is to say chimpanzees not infected with the HIV virus but whose T cells have been incubated with SEB (columns 5 and 6).
  • FIG. 9 corresponding to gels made with the DNA of T cells of control macaques stimulated with SEB (columns 1 and 2), of macaques infected with the SIV virus and whose cells were incubated in simple media (columns 3 , 5 and 7) and of macaques infected with the SIV virus and whose cells were incubated with SEB (columns 4, 6 and 8) shows that there is degradation of DNA and therefore apoptosis in the cells of macaques infected with the SIV virus when incubated with SEB.
  • Figure 10 shows that the African green monkey infected with the SIV virus does not develop apoptosis.
  • columns 1 to 4 correspond to the DNA of T cells of macaques infected with the SIV virus incubated with simple medium (columns 1 and 3) or with SEB (columns 2 and 4) while columns 5 to 7 correspond to T cells of African Green monkeys infected with SIV virus, incubated with SEB and columns 8 and 9 correspond to control African green monkey T cells, not infected with SIV, incubated with SEB.
  • This animal is therefore an interesting model for selecting therapeutic agents capable of preventing apoptosis and the onset of the disease.
  • This animal is all the more interesting since, unlike humans, where AIDS is declared in ten years, the macaque infected with the SIV virus has the particularity of developing AIDS in six months to a year and a half.
  • a protein synthesis inhibitor (cycloheximide) or cyclosporin A prevents apoptosis of T cells from patients infected with the HIV virus stimulated by PMW or SEB (FIG. 2a and FIG. 3).
  • the CD3 antibody induces cell proliferation and among the various co-signals (Interleukin 1, Interleukin 2, Interferon gamma, CD5 antibody, CD28, CD 43, CD44 and CD 45R or phorbol ester) which have been added to the T cells of patients infected with the HIV virus, only the CD28 antibody prevents death induced by PWM and SEB and restores proliferation to PMW, SEB and TT (FIG. 1b and Figure 2a).
  • the set of results seems to indicate that the CD4 T H cells of patients infected with the HIV virus are programmed in vivo for a suicide process by apoptosis after activation by defined stimulation, including the mobilization of T cell receptors (TCR) by the molecules presented by the major class II hiscompatibility complex.
  • TCR T cell receptors
  • tetanus-specific T cells appear to be present in patients infected with the HIV virus. Although such cells are too rare to allow their death to be demonstrated, the induction of apoptosis seems to be the most likely mechanism to explain their lack of response in vitro.

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Abstract

Ce médicament peut contenir: soit un agent capable de bloquer la réception ou la transduction de signaux conduisant au suicide des cellules, soit un agent apportant ou générant un cosignal permettant à la cellule de se différencier et de se multiplier normalement, soit un agent qui à lui seul entraîne la prolifération et la différenciation cellulaires et génère des cellules qui ont perdu la capacité à se suicider dans des conditions pathologiques, soit un agent capable d'inhiber les signaux qui rendent une cellule susceptible de répondre à une activation, par une apoptose pathologique. De tels médicaments peuvent être utilisés dans le traitement des maladies liées au rétrovirus, et en particulier liées aux lentivirus tels que le virus HIV chez l'homme.

Description

"Médicament contenant un agent inhibant in vivo l'apoptose pathologique et applications".
La présente invention concerne le traitement de l'apoptose de cellules humaines caractérisée par le dysfonctionnement ou la déficience de certaines populations cellulaires .
Elle a également pour objet une méthode de sélection d'agents de traitement de l'apoptose dans ses manifestations pathologigues .
Elle est d'autre part relative à des méthodes de détermination de la capacité de cellules d'individus atteints par un virus HIV à répondre à l'agression par un agent infectieux .
Le terme apoptose est synonyme des expressions "mort cellulaire programmée" ou " mort induite par l'activation".
Dans la présente description il sera essentiellement question d'apoptose .
L'apoptose est un mécanisme de suicide des cellules gui a pour particularité d'être physiologiquement actif . Il est impliqué dans la régénération des tissus ainsi gue dans l'involution durant l'embryogenèse et la vie adulte et la maturation du système immunitaire embryonnaire .
De ce fait , l'apoptose se différencie de la nécrose gui est une réponse à des agressions de la cellule .
On sait également que l'apoptose est toujours liée à la réception ou à la non réception par la cellule d'un signal physiologique donné .
L'apoptose a des conséquences pathologiques d'autant plus grandes qu'elle peut survenir dans des populations cellulaires que l'organisme n'est pas capable de régénérer sous leur forme adulte différenciée , notamment les cellules lymphocytaires à mémoire et les neurones .
En cas d'apoptose , la capacité de régénération cellulaire de l'organisme peut être aussi dépassée d'un point de vue quantitatif..
Dans la présente description le mot "pathologique" concerne également des phénomènes tels que la dégénérescence cellulaire ou le vieillissement impliquant une involution .
L'apoptose ne concerne que les cellules en cours de disparition, et n'entraîne pas d'effets sur l'environnement tissulaire et cellulaire : elle n'est donc pas un phénomène apparent , sauf si l'on cherche réellement à la mettre en évidence .
On a déjà montré que , dans le cas des thymocytes non matures ,la mobilisation du récepteur des cellules T (TCR) conduit à l'apoptose . Ce phénomène joue un rôle essentiel dans la sélection du répertoire des cellules T. (Blackman et al.. Science , 248 ; 1335-1341 ; 1990 ).
On sait par ailleurs que certains retrovirus sont responsables du dysfonctionnement et de l'effondrement du système immunitaire ainsi que du dysfonctionnement et l'involution de certains tissus .
II s'agit notamment de lentivirus provoquant des désordres pathologigues se traduisant par une apparition anormale de suicides cellulaires .
A titre d'exemple de tels lentivirus , on peut citer les virus SIV chez le singe , FIV chez les félins , BIV chez les bovins , VISNA chez les ovins , CAEV chez les caprins et HIV chez l'homme .
Il a aussi été montré que les individus infectés par un virus HIV présentent de manière précoce des lacunes dans la réponse d'une famille de lymphocytes T : les lymphocytes T CD4 helper (TH) . Ces lacunes d'ordre qualitatif précèdent des réductions quantitatives de cette population cellulaire et sont caractérisées par une perte sélective de la prolifération en réponse à des antigènes du complexe majeur d'histo-compatibilité de classe II ( MHC-II ) et à un mitogène extrait de Phytolacca americana, dénommé mitogène pockeweed ou PWM dans la suite du texte , voir notamment Lane et al.( N. Engl. J. Med. 313, 79-84, 1985 ) et Van Noesel et al.( J. Clin. Invest, 86, 293-299, 1990 ).
Ces derniers auteurs ont en outre montré que l'anticorps anti-CD28 augmente la prolifération de cellules T chez des patients infectés par le virus HIVj, et permet ainsi une réponse proliférative de thymocytes immatures à l'anti-CD3, et à deux anticorps anti-CD2.
De plus , il a été montré récemment que les cellules T adultes humaines et murines normales peuvent aussi subir l'apoptose dans des conditions particulières (Newell, et al. Nature 347 , 286-289 (1990); Janssen O. et al. J. Immunol., 146, 35-39 , 1991 ) . Dans ce cas , l'apoptose induite par stimulation diffère de celle observée dans les thymocytes immatures .
Dans des cellules T humaines adultes portant le récepteur TCR gamma-delta et stimulées par l'anticorps anti-CD3, l'addition d'Interleukine-2 induit l'apoptose au lieu de la prévenir ( Janssen et al. J. Immunol.,146, 35-39 , (1991).
Les résultats faisant partie de l'état de la technigue ne concernent que des cultures cellulaires in vitro et ne mentionnent aucune application thérapeutique. De plus , les publications connues des
Demandeurs ne mentionnent pas l'existence et encore moins le rôle du phénomène d'apoptose dans la perte de la prolifération des cellules T issues de patients infectés par un virus HIV , et ne donnent aucune explication quant à la perte sélective de réponse de patients infectés par les virus HIV vis-à-vis de certaines maladies ou vis-à-vis de certains antigènes.
Les demandeurs se sont donc attachés à trouver un agent thérapeutigue efficace notamment vis-à-vis des maladies liées au virus HIV .
Dans le cadre de leurs travaux , ils ont également apporté une explication au phénomène de perte de réponse à l'égard de certains antigènes ou de certaines maladies rencontrées en particulier dans le cas d'infections par les virus HIV , en vue d'applications thérapeutiques et préventives vis-à-vis de ces maladies . Ils ont ainsi montré que de manière surprenante le mécanisme responsable de cette perte de réponse , est du type apoptose .
Ils ont aussi montré de manière tout aussi surprenante que les mécanismes impliqués dans l'apoptose pathologique des cellules issues de patients atteints par un virus HIV se différencient des mécanismes de l'apoptose non liée aux virus HIV , telle que l'apoptose induite par une stimulation du récepteur T de thymocytes humains normaux ou de lignées lymphocytaires T matures humaines normales.
Selon l'invention , il a été trouvé que l'on pouvait inhiber in vivo l'apoptose pathologigue .
La présente invention a donc pour objet un médicament contenant un agent inhibant in vivo l'apoptose pathologique . Un tel agent peut être sélectionné par un procédé comprenant au moins les étapes :
- mise en contact d'au moins deux préparations cellulaires d'un patient infecté par un retrovirus avec un agent d' activation cellulaire , tel que du mitogène pokeweed (PWM), respectivement en présence et en absence dudit agent , et
- comparaison de la prolifération et/ou de la mortalité dans les deux préparations cellulaires .
II peut aussi être sélectionné par un procédé comprenant au moins :
- une première présentation d'un antigène par des monocytes préincubés avec un retrovirus, à une lignée cellulaire de lymphocytes T CD4+,
- une seconde présentation de l'antigène par des monocytes , éventuellement préincubés avec un retrovirus , à la lignée cellulaire de lymphocytes T CD4+,et
- une étape d'estimation de la mort et/ou de la prolifération des lymphocytes .
Préférentiellement , le retrovirus est un HIV. Une telle méthode permet de sélectionner un agent gui empêche directement l'induction de l'apoptose.
Le virus en présence d'un agent selon l'invention ne peut enseigner aux cellules l'apoptose.Cette méthode contrairement à la précédente concerne directement le virus.
Un agent selon l'invention sera choisi parmi ceux capables:
soit de bloquer la réception ou la transduction de signaux conduisant au suicide des cellules , et en particulier capables d'inhiber l'activation d'une endonuclease nucléaire entraînant la fragmentation du génome de la cellule , tel que la cyclosporine , ou un inhibiteur de la synthèse protéique tel que la cycloheximide ;
- soit d'apporter ou de générer un co-signal permettant à la cellule de se différencier et de se multiplier normalement tel qu'un anticorps anti-CD28 ou une association d'un agent entraînant la stimulation de la phosphokinase C tel qu'un ester du phorbol , avec l'interleukine 1 ;
- soit d'entraîner à eux seuls la prolifération et la différenciation cellulaires et de générer des cellules qui ont perdu la capacité à se suicider dans des conditions pathologiques , par exemple , la phytohémagglutinine ( PHA ), des cellules allogénigues irradiées , un anticorps anti-CD2, ou un anticorps anti-CD3.
- soit d'inhiber les signaux qui rendent une cellule susceptible de répondre à une activation par une apoptose pathologigue .
Les cellules allogéniques irradiées sont des cellules provenant d'un individu génétiquement différent quant à son système HLA.
Un tel médicament est notamment destiné au traitement des maladies liées au retrovirus et en particulier liées au lentivirus , tels que les virus
HIV chez l'homme et SIV , FIV , BIV , VISNA et CAEV chez l 'animal .
La présente invention a d'autre part pour objet l'utilisation d'un agent tel que précédemment défini pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement des maladies précédemment citées .
Elle concerne d'autre part une composition pharmaceutique contenant une quantité pharmaceutiquement efficace d'un agent tel que défini précédemment en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants pharmaceutiquement acceptables . Une telle composition est destinée au traitement de maladies liées au retrovirus et en particulier liées au lentivirus .
Le traitement des patients atteints par ces maladies se fera d'une manière connue en soi et préférentiellement par voie parentérale ou intraveineuse .
La présente invention concerne d'autre part une méthode de détermination de la déficience qualitative du répertoire immunologique d'individus vis-à-vis d'un agent infectieux comprenant au moins les étapes de :
- stimulation in vitro des lymphocytes dans un milieu contenant au moins un anticorps anti-CD28 en présence d'un ou plusieurs antigènes spécifiques de l'agent infectieux, et
- mesure de la cinétique de prolifération des lymphocytes .
L'objet de la présente invention est d'autre part une méthode de détermination de la capacité des lymphocytes d'un individu à répondre à l'agression par un agent infectieux comprenant au moins les étapes de:
- stimulation in vitro des lymphocytes dans un milieu contenant au moins un anticorps anti-CD28 en présence d'un ou plusieurs antigènes spécifiques de l'agent infectieux,et
- mesure de la cinétique de prolifération des lymphocytes .
La présente invention est de plus relative à une méthode de stimulation in vitro de lymphocytes issus de patients atteints d'une maladie liée aux retrovirus par traitement des lymphocytes isolés par un anticorps anti-CD28.
Enfin, la présente invention concerne une méthode de sélection d'un agent inhibant in vivo l'apoptose pathologique comprenant au moins une étape de mise en contact de cellules infectées par un lentivirus tel qu'un virus HIV , avec un antigène , respectivement en présence et en absence dudit agent et consécutivement de stimulation par ledit antigène .
Une différence de réponse entre les cellules cultivées en présence et en absence dudit agent constituerait un indice de l'activité inhibitrice de cet agent .
L'anticorps anti-CD28 préférentiellement utilisé pour la mise en oeuvre de la présente invention est l'anticorps monoclonal de souris issu du clone CLB-402 ( nº de catalogue JANSSEN 1989
26.683.08) commercialisé par la Société JANSSEN .
La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples d'application suivants, dans lesquels :
La figure la est un diagrame illustrant la prolifération de cellules de patients infectés par le virus HIV1 et d'individus sains en présence de phytohemagglutinine (PHA) , de PWM, de super-antigènes d'entérotoxine B de staphylocoque ( SEB ) ou de toxine tétanique ( TT ).
La figure lb est un diagramme montrant l'effet de l'anticorps anti-CD28 sur la prolifération de cellules de patients infectés par le virus HIV1 , en présence de PWM , de SEB ou de TT .
La figure 2a illustre la mortalité de cellules mononucléaires du sang périphérique ( PBMC ) de patients infectés par le virus HIV^ (colonnes 1 ) et d'individus sains ( colonnes 2 ) , en présence de cycloheximide , de cyclosporine A ( CSA ) , d'anticorps anti-CD28, de PWM , ou de SEB .
La figure 2b illustre la mortalité cellulaire de cellules PBMC de patients atteints par le virus HIV1 (colonnes 1 ) et d'individus sains ( colonnes 2) desquelles on a éliminé les cellules T CD4+ ou les cellules T CD8+ , en présence ou en absence d'anticorps anti-CD28 , de PWM ou de SEB.
La figure 3 illustre les résultats obtenus après incorporation de thymidine tritiée dans des cellules de patients atteints par un virus HIV en présence de PWM , ou de PHA.
La figure 4 est un autoradiogramme représentant l'hybridation de RNA total de cellules PBMC de patients atteints par le virus HIV , cultivées en présence de PWM ou de PHA , avec une sonde d'ADN complémentaire du récepteur de l'interleukine-2.
La figure 5 est un cliché d'un gel d'électrophorèse de DNA de cellules PBMC de patients infectés par le virus HIV1, cultivées en présence de PMW ou de SEB et d'individus sains .
Les figures 6a et 6b représentent respectivement des photographies en microscopie électronique de cellules PBMC d'individus sains et de patients atteints par le virus HIV1 .
Les figures 7a et 7b sont des histogrammes correspondant respectivement à la prolifération et à la mort cellulaire de cellules cultivées dans un milieu simple ( colonne 1 ) , dans un milieu complémenté avec de l'IL-2 ( 10 unités/ml - colonne 2 ) et activées avec de l'anticorps CD5 lié comme témoin (colonne 3 ) ou par de l'anticorps CD3 lié ( colonne 4 à 8 ) en présence d'IL-1 recombinante ( 50 unités/ml) colonne 5 , d'IL-2 recombinante ( 10 unités/ml colonne 6 ) , d'anticorps anti-IFNgamma ( dilution sérique 1/800 - colonne 7 ) ou de cycloheximide ( 50 μ/ml - colonne 8 ) .
La figure 7c est un gel d'electrophorese d'ADN extrait de thymocytes médullaires cultivés dans un milieu simple ( colonne 1 ) ou stimulés par du CD3 ( colonnes 4, 5 et 7 ) en présence d'Interleukine recombinante ( colonne 5 ) ou d'anticorps anti- IFNgamma ( colonne 7 ).
La figure 7d représente une analyse par dot blot d'ARN de thymocytes médullaires stimulés par du milieu simple ( colonne 1 ) par de l'IL-1 recombinante
(colonne 2) par du CD3 lié ( colonne 3 ) ou par du CD3 et de l'IL-1 recombinante ( colonne 4 ) .
La figure 8 représente un gel d'electrophorese d'ADN de cellules T de chimpanzés infectés par le virus HIV ( colonnes 1 à 4 ) ou de chimpanzés témoins
( colonnes 5 et 6 ) après stimulation in vitro avec le super antigène SEB .
La figure 9 représente un gel d'electrophorese en agarose d'ADN de cellules T de macaques témoins stimulées avec le SEB ( colonnes 1 et 2 ) de cellules T de macaques infectées avec le virus SIV incubées dans un milieu simple ( colonnes 3, 5 et 7)et de cellules T de macaques infectées avec le virus SIV , incubées avec le SEB (colonnes 4, 6 et 8 ).
La figure 10 représente un gel d'electrophorese d'ADN de cellules T de macaques infectées par le virus SIV incubées dans du milieu simple ( colonnes 1 et 3 ) ou du milieu + SEB colonnes 2 et 4 ) , de cellules T de singes verts infectées par le SIV et incubées avec du SEB( colonnes 5 à 7 ) et de cellules T de singes verts incubées avec du SEB ( colonnes 8 et 9).
EXEMPLE 1 :
Prolifération in vivo des lymphocytes T de patients asymptomatiσues infectés par le virus HIV1 .
a) Stimulation par des activateurs polyclonaux.
La prolifération des lymphocytes T de 38 patients infectés par le virus HIV-1 et de 20 individus sains a été testée en réponse aux activateurs polyclonaux phytohé- hémagglutinine , concanavaline A , mitogène pockweed (PWM) , anticorps monoclonal anti-CD3 , et en réponse à la stimulation par l'antigène de la toxine tétanique TT .
Les cellules T mémoires spécifiques de l'a'tigène TT étant rares , et pouvant avoir été éliminées chez des patients infectés par le virus HIV , la réponse à la mobilisation des récepteurs de cellules T par l'utilisation des superantigènes de l'entérotoxine B du staphylocoque ( SEB) a aussi été testée.
Les SEB se lient aux molécules MHC-II et agissent avec des molécules Vβ des récepteurs de cellules T (TCR) exprimés par jusqu'à 30% des cellules T normales , et induisent la prolifération des cellules T normales matures (Marrack et Kappler , J. Science 248 , 705-711 , 1990) et l'apoptose chez les thymocytes immatures (Genkinson et al. J. Immun. 19, 2175-20177 , 1989 ).
Pour évaluer l'intensité de la réponse , on a effectué les mesures après l'incorporation de la thymidine tritiée dans les cellules . (figure 1a ). Les patients infectés par le HIV comprenaient 26 hommes et 12 femmes , 25 patients étant au stade de CDC II A (pas d'anormalité biologique , cellules CD4 > 500 /mm3 ,et en moyenne de 856 /mm3 ) et 13 d'entre eux étaient au stade CDC IIB ( anormalité biologique , cellules CD4 < 500/mm3 et en moyenne de 345/mm3).
L'infection par le HIV était attribuée pour 15 des patients à des relations homosexuelles , pour 14 des patients à des relations hétérosexuelles , pour 7 des patients à l'utilisation d'une drogue intraveineuse et pour 2 des patients à la transfusion sanguine .
Les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) ont été obtenues sur Ficoll- Hypaque et ont été cultivées comme décrit par Reed et al.( Proc. National Acad. Sci. USA 83, 3982-3986 (1986)) . Les PBMC sont incubées à une densité cellulaire de 2,5.105/ml durant 3 jours avec du milieu de culture sans adjuvant , du milieu contenant de la phytohémagglutinine (PHA) à 10μg/ml , du mitogène pokeweed (PWM) à 10μ/ml , du superantigène d*entérotoxine B de staphylocoque ( SEB) à 1 μg/ml , ou durant 6 jours avec l'antigène ( TT ) à 10 μg/ml .
La prolifération des cellules T des patients HIV+ à la Concanavaline A (10μg/ml), à l'anticorps monoclonal CD3 (Groux et al . Nature , 339, 152-154, 1989 ) est seulement légèrement réduite ( résultat non indiqué sur la figure ) de même que la prolifération en présence de PHA.
Sur la figure la chaque cercle représente la moyenne de cultures effectuées en triplica , les barres horizontales représentant la moyenne des résultats pour chaque traitement.
Ces résultats montrent que, tandis que des cellules T des individus témoins prolifèrent en réponse à tous les stimulis , des cellules T des patients infectés par le virus HIV répondent de manière moindre à la stimulation par le PWM , le SEB ou l'antigène TT (figure la).
b) Stimulation en présence d'un anticorps anti-CD28.
On a également fait des essais en incorporant de la thymidine tritiée dans des cellules T de 19 des patients infectés par le HIV (figure 1 b ) en réponse à la prolifération par les PWM, SEB ou TT , en l'absence ou en présence d'anticorps anti- CD28.
Dans cet exemple ainsi que dans ceux qui suivent l'anticorps anti-CD-28 est fourni par la Société JANSSEN (anticorps monoclonal de souris issu du clone CLB-402) .
Des cellules ont été préparées et utilisées comme décrit pour la figure la et l'anticorps anti-CD28 a été ajouté à une concentration de 10μg/ml .
La figure lb montre que l'anticorps anti-CD28 augmente la prolifération des cellules T témoins en présence de PWM ou de SEB .
Par contre les anticorps CD5 ( A50,gamma 1, CD43 (B1B6,gamma 1) ,CD44 (P245,gamma 2a) , et CD45R (ALB11, gamma 1, Immunotech) à des concentrations de 10 μg/ml ne stimulent pas la prolifération des cellules T des patients HIV+ ( résultats non indiqués sur la figure ).
EXEMPLE 2:
Mortalité des cellules T et des cellules mononucléaires du sang périphérique de patients infectés par le virus HIV après culture in vitro en présence de PWM et de SEB.
1) La figure 2 a) illustre la mort cellulaire de PBMC de patients infectés par le virus HIV ainsi que de témoins , après culture in vitro en présence de PWM et de SEB.
Les résultats mentionnés sur la figure 2a) représentent la moyenne plus ou moins l'écart type d'expérimentations effectuées sur 20 patients différents infectés par le virus HIV ( colonnes 1 ) et de 20 individus non infectés ( colonne 2). La mortalité cellulaire est mise en évidence par la perméabilité au bleu trypan . Les PBMC sont cultivées avec une densité cellulaire initiale de 2,5 105/ml en
48 heures dans du milieu de culture sans adjuvant , du milieu contenant du PWM ( 10 mg/ml ) ou des SEB
(Iμg/ml) en l'absence ou en présence de cycloheximide
( 50 μg/ml ) de cyclosporine A ( CsA ) à 200 ng/ml ou d'anticorps monoclonal anti-CD28 ( 10μg/ml) .
L'addition de PWM ou de SEB aux cellules PBMC de patients atteints par le virus HIV ( colonnes 1 ) est suivie après 48 heures de culture par respectivement jusqu'à 60 et 30% de morts cellulaires, tandis qu'aucune mortalité cellulaire n'est observée à 48 heures pour les PBMC non stimulées de patients infectés par le virus HIV (colonnes 2 ), ainsi que pour les PBMC témoins stimulées ( colonnes 2 ) qui montrent jusqu'à 95% de viabilité (figure 2 a).
La culture des cellules en présence d'anticorps monoclonal CD3 n'entraîne pas de mortalité des cellules T (résultats non indiqués sur les figures).
Après 48 heures de culture en milieu sans adjuvant , la mortalité cellulaire de base des cellules PBMC de 40 patients infectés par le virus HIV ne dépasse jamais 10% (en moyenne 5,3 %).
2) La figure 2b concerne des expérimentations similaires . Les cellules PBMC d'un patient infecté par le virus HIV ( colonnes 1 ) et d'un individu non infecté (colonnes 2) ont été purifiées par élimination des cellules T CD4 + ( cellules CD 8 ) ou des cellules T CD8 + ( cellules CD 4) par incubation avec respectivement des anticorps IOT4 ou IOT8 suivie par incubation avec des particules magnétiques couvertes d'anticorps IgG de chèvre anti-souris .
La qualité de l'élimination est mesurée par cytofluorométrie ( Epix Coulter Clone ) et montre que la contamination cellulaire est inférieure à 1% . Les cellules sont cultivées comme décrit pour la figure la). Les résultats représentent la moyenne de trois mesures de la mortalité cellulaire après 48 heures . La prolifération est mesurée par incorporation de la thymidine tritiée après 3 jours .
Les cellules CD4 des individus non infectés prolifèrent en réponse au PWM ( 5250 + 651 CPM ) et au SEB ( 21.642 + 2.317 CPM ) , tandis que les cellules témoins CD8 et les cellules CD4 et CD8 des patients infectés par le virus HIV ne prolifèrent pas après 5 jours.
L'addition d'anticorps anti-CD28 aux cellules CD4 des patients infectés par le virus HIV restaure la capacité de ces cellules à proliférer lors de stimulation par le PWM et le SEB , mais n'a pas d'effet sur les cellules de patients infectés par le HIV non stimulées ou sur des cellules CD8 témoins .
3) La figure 3 illustre la prolifération des cellules PBMC de patients infectés par le virus HIV et d'individus sains après addition de PWM ou de PHA, après incorporation de thymidine tritiée dans les cellules T de 3 patients infectés par le virus HIV (ABC et B') et d'un individu sain ( D ) en réponse à la stimulation par le PMW à lOμg/ml ( colonnes A,B et C, et colonne D) ou par le PHA à lOμm/ml (colonne B').
Les colonnes B et B* représentent les résultats obtenus avec des PBMC du même patient infecté par le virus HIV. Tous les résultats sont la moyenne (+/- l'écart type) de cultures effectuées en triplicate.
EXEMPLE 3 :
Synthèse des ARN messagers codant pour le récepteur à l'Interleukine-2.
La figure 4 illustre l'expression des RNA messagers codant pour le récepteur à l'interleukine 2 ( IL-2R) de PBMC de patients infectés par le virus HIV et d'individus sains après addition de PWM ou de PHA . Les mêmes patients (A, B, C, B' et D ) que dans la figure 3 ont été repris . Cette expression est mesurée sur les mêmes cellules après 2 heures , 6 heures et 16 heures . Ces RNA messagers n'étaient pas détectés avant la stimulation .
Les expérimentations ont été effectuées par extraction des ARN totaux cellulaires de 107 PBMC par le RNAzol (Cinna-Biotex, Friendwood, USA ) selon les instructions du fabricant. Les échantillons de RNA totaux ( environ 10μg/ml) sont fractionnés en fonction de leur taille dans des gels d'agarose à 1% contenant du formaldéhyde et sont transférés sur des filtres HYBOND-N (Amersham). Les filtres sont ensuite hybrides avec des sondes de cDNA marquées au phosphate 32 ( IL-2R humain) et lavés avec une solution 0,1 SSC , 0,1 % SDS à 55ºC. Les tailles relatives des mRNA IL-2R qui hybrident avec la sonde sont en accord avec les valeurs de 3,5 kb précédemment publiées .
EXEMPLE 4: Dégradation de l'ADN cellulaire .
La figure 5 représente l'é'ectrophorèse sur gel d'agarose de DNA extrait de PBMC de patients infectés par le virus HIV ou d'individus sains après culture durant une nuit dans un milieu de culture avec ou sans adjuvants.
Ces gels ont été obtenus par lyse dans 4 ml d'un tampon de lyse hypotonique (5 mM Tris pH 7,4, 5mM
EDTA , 0,5 % Triton X100) de 15.106 cellules centrifugées à 200 g durant 10 mn. Les lysats sont ensuite centrifugés à 13.000 g durant 15 minutes . Le
DNA des surnageants est concentré par précipitation à
-20ºC dans 50% d'isopropanol , 130mM NaCl. Après centrifugation à 13.000 g, les précipités sont séchés à l'air et resuspendus dans 10mM Tris pH 8, ImM EDTA.
Tous les échantillons sont déprotéinisés par une extraction au phénol/chloroforme et une double extraction par un mélange chloroforme/alcool isoamylique (24:1). Après électrophorèse sur des gels fins d'agarose à 2% durant 12 heures à 30 V, le DNA est visualisé par coloration au bromure d'éthidium.
Le puits 1 de la figure 5 correspond au marqueur de poids moléculaire . Le puits 2 correspond au DNA de cellules PBMC d'individus sains incubés avec du PWM.
Les puits 3 à 11 correspondent au DNA de cellules PBMC de 7 patients infectés par le virus HIV incubés respectivement avec du milieu sans adjuvant (puits 3) , du milieu comprenant du PMW (puits 4 à 6, 8 et 9 ) , et du milieu comprenant du SEB (puits 10 et11).
Les puits 3 et 4 correspondent au même patient. La figure montre que les DNA des puits 4 à 6 et 8 à 11 ont un profil de dégradation caractéristique de l'apoptose, les bandes d'ADN dégradé étant des multiples de 200 paires de bases .
La dégradation de ces DNA est supprimée par addition de CsA au milieu contenant le PWM ( colonne 7 correspondant au même patient que la colonne 6 ).
EXEMPLE 5-
Etat cellulaire des PBMC de patients infectés par le HIV .
La figure 6a représente une photographie en microscopie électronique de PBMC d'un patient infecté par le virus HIV après une incubation de 24 heures dans un milieu sans adjuvant.
La figure 6b représente les mêmes cellules incubées dans un milieu contenant 5 μg/ml de PWM.
Les cellules ayant différents degrés de concentration chromatique peuvent être observées sur cette figure et sont caractéristiques de l'apoptose. Les flèches sur cette figure les désignent .
EXEMPLE 6:
Effet de l'anticorps anti-CD28 sur la restauration de la capacité des lymphocytes à proliférer .
1º) Récupération de la prolifération par co-stimulation par l'antigène tétanique et l'antigène grippal , en présence d'anti-CD28.
Des cellules de patients sont stimulées soit par la toxine tétanique ( TT ) soit par un antigène grippal (GP ) en présence ou en l'absence de l'anticorps anti-CD28 . Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau I ci-après .
Ces résultats montrent que dans le cas de la toxine tétanique , la présence de l'anticorps anti- CD28 permet dans les cultures des lymphocytes desdits patients de restaurer la capacité à proliférer .
On retrouve ces résultats dans le cas de sept patients sur dix en présence d'antigène grippal (GP) .
L'antigène grippal étant un antigène couramment rencontré , il est possible que les trois patients dont les lymphocytes ne prolifèrent pas en présence d'anticorps anti-CD28 , l'aient déjà rencontré , et que les cellules mémoires dirigées contre cet antigène aient été éliminées de ce fait .
2º) Mise en évidence de la nécessité de la présence de l'anticorps anti-CD28 lors de la première stimulation pour la rééducation des cellules .
Des lymphocytes ont été stimulés ( JO ) après purification , par la toxine tétanique (TT) par la phytohemagglutine ( PHA ) et par le mitogène pockeweed (PWM).
La prolifération est mesurée par l'incorporation de thymidine tritiée au bout de 6 jours ( j 6).
Parallèlement les cellules sont cultivées en présence de toxine tetanigue ou du superantigène de l'entéroxine staphylococcigue B (SEB) avec ou sans anticorps anti-CD28.
Après 10 jours de culture , alors que les cellules sont revenues au repos , elles sont restimulées par les mêmes stimulis qu'à J 0 .
On observe quand la première stimulation de lymphocytes de patients infectés par le virus HIV a été effectuée en présence de TT ou de SEB sans CD28 , qu'il n'est pas possible de réobtenir une prolifération , même si ces lymphocytes sont restimulés par l'anticorps anti-CD28.
Par contre , les cellules précultivées en présence de l'anticorps anti-CD28 prolifèrent en présence des antigènes TT ou SEB.
Les résultats sont résumés dans le tableau II.
3" ) Restauration de la capacité des lymphocytes à proliférer en réponse au PWM et au SEB après une première stimulation par la PHA.
Des lymphocytes de patients infectés par le virus HIV sont stimulés soit directement ( JO ) avec la phytohémmaglutinine (PHA) , le mitogène pockeweed
(PWM ) ou l'entérotoxine staphylococcique B (SEB) , ou préstimulées par le PHA pendant 10 jours .
Les cellules sont restimulées après 10 jours dans les mêmes conditions qu'à JO.
Les résultats sont rassemblés dans le tableau III.
On observe que la stimulation des cellules par un adjuvant tel que le PHA, PWM ou le SEB permet la restimulation au bout de 10 jours en présence de PHA. EXEMPLE 7 :
Restauration de la capacité des lymphocytes à proliférer par stimulation par des cellules allogenigues .
La restauration de la capacité des lymphocytes à proliférer après une première stimulation par des cellules allogéniques et en réponse au PWM et au SEB a été testée .
Parallèlement , on a testé la capacité à proliférer après une première stimulation par la PHA.
Les patients ayant subi une première stimulation par le PHA ou par les cellules allogéniques (RLM ou réaction lymphocytaire mixte ) sont restimulées après dix jours de culture ( J10).
Le tableau IV ci-après illustre les résultats obtenus.
Ce tableau montre donc que par rapport au témoin, les cellules ayant subi une première stimulation par des cellules allogéniques présentent une prolifération équivalente à celles qui ont été stimulées par la PHA.
EXEMPLE 8 :
Comparaison des mécanismes d'aptotose dans des cellules normales et dans des cellules d'individus infectés par un virus HIV.
1) Etude de l'apoptose de cellules d'individus non infectés par le virus HIV.
On a testé la réponse de thymocytes médullaires totaux humains fixés par l'anticorps monoclonal CD3 et de sous-populations de thymocytes médullaires matures CD4+ CD8~ ou CD8+ CD4- .
Dans les trois populations , l'anticorps monoclonal CD3 n'induit pas la prolifération de thymocytes et conduit après 48 heures à la mort d'environ 50% des thymocytes , comme indiqué dans le tableau V ci-après.
Dans le tableau V, les réponses à la mobilisation des TCR de thymocytes totaux humains (A) , de thymocytes CD4+ CD8~ ( B ) , de thymocytes CD8+ CD4- (C) et de thymocytes immatures CD4- CD8- CD3- (D) ont été testées .
Les cellules ont été colorées avec un mélange d'anticorps CD4-FITC ( LFL1 fluorescence verte) et d'anticorps CD8-RD ( LFL2 fluorescence rouge ) pour effectuer une analyse en cytofluorometrie de flux (Coulter Epies Profile II) . La prolifération cellulaire après la mobilisation des TCR avec des anticorps CD3 liés sur une boîte, en présence ou en absence d'IL-2 (10 unités par ml), a été déterminée par incorporation de thymidine tritiée (3H-TdR ). La thymidine a été ajoutée dans les dernières douze heures du troisième jour. Les résultats représentent la moyenne de culture en triplicate ou d'une expérimentation représentative parmi les trois . La mort cellulaire a été déterminée 48 heures après la stimulation par l'exclusion du bleu trypan . Les résultats et les pourcentages de mort cellulaire sont choisis parmi trois expériences .
La méthode utilisée a été la suivante . Des thymus ont été obtenus à partir d'enfants de moins de deux mois après une opération chirurgicale cardiaque . Les thymocytes ont été purifiés sur un tamis de Nylon et ont été congelés jusqu'à utilisation . Les thymocytes médullaires ont été isolés à partir d'une population de thymocytes totaux par sélection négative avec des billes magnétiques recouvertes d'un anticorps CD1 (D47, IgG1 à lμ.ml ), selon les instructions du fabricant ( Biosys, France).
Les thymocytes CD4+ CD8- ou CD8+ CD4- ont été purifiés à partir de thymocytes médullaires par une sélection négative supplémentaire en utilisant respectivement l'anticorps monoclonal CD8 ( L533 IgG1 à 1μ/ml) ou l'anticorps CD4 ( 0516, IgG1, à 1 μ/ml) . Les essais de prolifération avec des anticorps monoclonaux fixés ( OKT3, IgG2a) ou CD5 ( A50, IgG2a) comme témoins ont été effectués . Pour déterminer la mort cellulaire , les cellules ont été récoltées après 48 heures par pipetage et diluées de moitié avec 0,1 % de bleu de trypan dans des tampons PBS. Les cellules vivantes et les cellules mortes ont été comptées dans un hémocytomètre . Les résultats sont exprimés comme le pourcentage de cellules mortes.
Comme précédemment décrit ( Nieto et al. J. Immunol. 145, 1364-1368,1990) , l'addition d'IL-2 empêche la mort cellulaire et permet une prolifération des thymocytes en présence d'anticorps CD3.
Les thymocytes médullaires ayant été isolés par une sélection négative , utilisant l'anticorps CDla dans tous les cas , et les anticorps CD46 et CD8 dans les purifications supplémentaires , les trois populations cellulaires ont été contaminées par environ 20% de thymocytes immatures CD4- CD8- CD3-.
Comme l'indique le tableau V, ces thymocytes immatures quand ils sont purifiés ne meurent ni ne prolifèrent en réponse à l'anticorps CD3, en l'absence ou en présence d'IL-2.
La mortalité cellulaire due au CD3 des thymocytes médullaires totaux est associée à une fragmentation de l'ADN caractéristique de l'apoptose comme le montre la figure 7 C.
Cette figure est un gel d'electrophorese en agarose d'ADN extrait de thymocytes médullaires après différents traitements . Les thymocytes médullaires ont été cultivés dans un milieu simple ( colonne 1 ) ou ont été stimulés par l'anticorps CD3 lié ( colonnes 4, 5 et 7) en présence de d'IL-1 recombinante (rIL-1) ( TO U/ml, colonne 5 ), ou en présence d'anti-IFN gamma ( dilution sérique 1/800, colonne 7).
Cette mort cellulaire est un procédé actif qui peut être empêché par la cycloheximine comme le montre la figure 7b et la cyclosporine A comme indiqué dans le tableau VI. l Comme montré dans le tableau VI et dans la figure 7d, l'apoptose due au CD3 de thymocytes médullaires est associée à l'expression des ARN messagers IFNgamma , à la sécrétion de l'IFNgamma , à l'expression de l'ARN messager de la chaîne P55 du récepteur de l'IL-2 , à l'absence d'expression du gène de l 'IL-2 et à de l'absence de sécrétion de l'IL-2.
La figure 7d représente l'analyse en dot blot d'ARN de thymocytes médullaires stimulés avec un milieu simple ( colonne 1) , un milieu contenant de la rILlσ ( 50 unités/ml, colonne 2), de l'anticorps CD3 lié (colonne 3 ) et de l'anticorps CD3 lié avec de la rILlα (colonne 4). L'autoradiogramme de l'IL-2 a été effectué après 6 heures . Les autoradiogrammes de l' IFNgamma, du récepteur àl'IL-2 et de la S - actine ont été effectués après 18 heures . Les sondes ont été testées sur un Northern Blot de RNA de thymocytes et chacune donne un signal spécifique sans hybridation croisée . Les tailles relatives des ARN messagers qui hybrident aux sondes sont en accord avec les valeurs préalablement publiées .
La sécrétion de l'IFNgamma à des niveaux élevés en l'absence de sécrétion d'IL-2 en réponse à l'anticorps CD3 a été aussi observée dans des thymocytes médullaires CD4+ CD8- et CD8+ CD4- comme le montre le tableau VI.
L'addition d'anticorps anti-IFNgamma empêche la mort des thymocytes due au CD3 ( figure 7b) et la fragmentation de l'ADN ( figure 7c) , mais ne rétablit pas la prolifération thymocytaire à l'anticorps CD3
(figure 7a).
Par contre, l'IL-2 empêche la mort thymocytaire ( figure 7b ) et permet une prolifération thymocytaire en réponse à l'anticorps CD3 ( figure 7a).
Comme précédemment observé avec les cellules
T-lymphocytaires , l'addition d'IL-1 aux thymocytes médullaires stimulés avec le CD3 permet l'expression d'ARN messagers de l'IL-2 (figure 7d) et la sécrétion d'IL-2 (tableau VI).
Ceci est associé à l'empêchement de la mort cellulaire ( figure 7b) ou la fragmentation du DNA (figure 7c) et à la prolifération thymocytaire (figure 7a).
De manière curieuse l'IL-1 n'affecte pas l'expression des ARN messagers de l'IFNgamma ( figure 7d ) ni la sécrétion d' IFNgamma (tableau VI) en réponse à la stimulation par le CD3.
Ni l'IL-1 ni l'IL-2 n'induisent la prolifération cellulaire en l'absence de CD3 ( figure 7a). L' IFNgamma n'induit pas de mort cellulaire en l'absence de CD3.
L'addition d'anticorps anti-IFNgamma à l'IL-2 et aux thymocytes médullaires CD4+ CD8- et CD8+ CD4- stimulée par le CD3 ont le même effet que dans le cas des thymocytes médullaires totaux ( tableau VI). Dans le cas des thymocytes CD8+ CD4- purifiés ,l'IL-1 n'induit pas la sécrétion d'IL-2 et n'empêche pas la mort cellulaire en réponse au CD3 . Ceci suggère que l'effet préventif de l'IL-1 dans les thymocytes médullaires totaux est lié à la sécrétion d'IL-2 par les thymocytes CD4+ CD8- .
Les rôles respectifs de l' IFNgamma et de l'IL- 2 dans la prolifération et la mort des thymocytes due au CD3 ont été de plus testés dans des expériences utilisant la ciclosporine A CsA , qui empêche l'apoptose des thymocytes et inhibe la sécrétion de l'IL-2 et 1 *IFNgamma ( tableau VI ) . Comme montré sur le tableau VI, l' IFNgamma et/ou l'IL-2 sont ajoutés à des thymocytes activés par le CD3 et traités par la CsA. Dans ces conditions , l' IFNgamma induit la mort des thymocytes , tandis que l'IL-2 induit la prolifération des thymocytes . Quand l' IFNgamma et l'IL-2 sont ajoutés ensemble , aucune mort cellulaire n'est observée et les thymocytes prolifèrent.
Ces résultats indiquent que la mobilisation par le CD3 entraîne dans le cas des thymocytes médullaires humains , une mort cellulaire qui est dépendante de l'IFNgamma, mais qui est inhibée par l'IL-2 même en présence d' IFNgamma.
Le tableau VII montre quant à lui, qu'un tel programme de mort cellulaire n'est pas restreint aux étapes de développement des cellules T, mais est aussi présent dans le cas de cellules T périphériques, activées et matures humaines . Une lignée cellulaire T CD4+ mature spécifique de l'antigène de la toxine tétanique se comporte comme des thymocytes médullaires humains quand elle est stimulée par l'anticorps CD3 en l'absence d'autres cellules . Comme montré aussi sur le tableau VII, l'addition d' IFNgamma et/ou d'IL-2 à des cellules mononucléaires périphériques activées par le CD3 et traitées par la CsA conduit aux mêmes résultats avec les lignées cellulaires T antigène-dépendantes et les thymocytes médullaires.
2) Apoptose dans des cellules d'individus infectés par un virus HIV.
Des expériences comparables ont été effectuées avec des lymphocytes T CD4 d'un sujet infecté par le virus HIV.
Le tableau VIII ci-après montre que ni l'addition d'IL-2 ni l'addition d'anticorps anti- Interféron gamma ne sont capables, contrairement à l'anticorps CD28, de prévenir l'apoptose de ces lymphocytes , ni de restaurer leur prolifération en réponse aux stimuli . L'IL-1 est aussi dépourvue d'effet .
La comparaison de ces résultats montre donc, que le mécanisme mis en jeu dans l'apoptose des sujets infectés par le virus HIV , se distingue de l'apoptose de cellules de patients non infectés par le virus HIV.
EXEMPLE 9
Induction in vitro dans des lignées lvmphocytaires normales spécifique d'antigènes d'une apoptose équivalente à l'apoptose des cellules de patients infectés par un virus HIV.
On fait présenter un antigène ( tétanos, grippe) à une lignée lymphocytaire T-CD4+ par des monocytes qui ont été préincubés avec un virus HIV. La présentation de l'antigène se déroule en présence d'AZT pour éviter l'infection des lymphocytes T-CD4+ . Une réponse proliferative lymphocytaire normale s 'ensuit.
Par contre, lorsgue l'antigène est représenté une deuxième fois aux lymphocytes T-CD4+ par des monocytes , même non infectés par le virus HIV , leslymphocytes meurent d'apoptose au lieu de proliférer.
Ces résultats sont présentés dans les tableaux IX et X ci-après .
Comme l'apoptose des lymphocytes de sujets infectés par le virus HIV , l' apoptose observée lors de la deuxième stimulation est empêchée par l'anticorps CD28 , mais ni par l'IL-2 ni par les anticorps anti-Interféron gamma. Ces résultats montrent donc qu'un contact entre des lymphocytes T-CD4+ normaux et des monocytes infectés par un virus HIV amorce dans les lymphocytes T-CD4+ , en l'absence d'infection par un virus HIV , un programme d'apoptose en réponse à une stimulation ultérieure .
Ce modèle cellulaire permet :
a) d'étudier dans un nombre très important de lymphocytes T-CD4+ normaux les mécanismes d'induction d'un phénomène d'apoptose comparable à l'apoptose observée chez les sujets infectés par un virus HIV.
b) d'étudier les agents thérapeutiques permettant de corriger ce phénomène d'apoptose;
c) d'identifier la ou les protéines virales en cause dans l'amorçage du programme d'apoptose ;
d) de trouver des agents thérapeutiques permettant non plus seulement d'empêcher les cellules déjà anormales de mourir mais d'empêcher aux lymphocytes d'apprendre à mourir en réponse à une stimulation ultérieure .
EXEMPLE 10:
Comparaison de l'apoptose des cellules humaines induites par le virus HIV et de l'apoptose de cellules simiesoues induites par le virus SIV.
Afin de comparer l'apoptose induite par le virus HIV chez les lymphocytes T, à d'autres infections virales, différents modèles , virus-hôte ont été étudiés chez les singes .
Ces modèles sont les suivants :
- chimpanzés , expérimentalement infectés par le virus HIV ; ces animaux ne développent pas de maladies ; - macaques rhésus , expérimentalement infectés par le virus HIV ( Simian Immuno Deficiency virus) ; ces animaux développent un SIDA ;
singes verts d'Afrique naturellement infectées par le virus SIV ; ces animaux ne développent pas de maladie .
La figure 8 représente un gel d'electrophorese d'ADN de cellules T de chimpanzés infectés par le virus HIV et incubés avec du SEB ( colonnes 1 à 4 ) et de chimpanzés témoins c'est-à-dire de chimpanzés non infectés par le virus HIV mais dont les cellules T ont été incubées avec le SEB ( colonnes 5 et 6 ).
Cette figure montre gue, l'apoptose qui est caractérisée par une dégradation de l'ADN , n'a été détectée dans aucun des chimpanzés étudiés .
La figure 9 correspondant à des gels effectués avec l'ADN de cellules T de macaques témoins stimulées avec le SEB ( colonnes 1 et 2 ) , de macaques infectés par le virus SIV et dont les cellules ont été incubées dans des milieux simples (colonnes 3, 5 et 7) et de macaques infectés par le virus SIV et dont les cellules ont été incubées avec du SEB ( colonnes 4, 6 et 8 ) montre qu'il y a dégradation de l'ADN et donc apoptose chez les cellules des macaques infectés par le virus SIV lorsqu'elles sont incubées avec du SEB.
La figure 10 montre que le singe vert d'Afrique infecté par le virus SIV ne développe pas d' apoptose . Sur cette figure , les colonnes 1 à 4 correspondent à l'ADN de cellules T de macaques infectés par le virus SIV incubées avec du milieu simple ( colonnes 1 et 3 ) ou avec du SEB ( colonnes 2 et 4 ) tandis que les colonnes 5 à 7 correspondent à des cellules T de singes Verts d'Afrique infectés avec du virus SIV, incubées avec du SEB et les colonnes 8 et 9 correspondent à des cellules T de singes verts d'Afrique témoins , non infectés par du SIV , incubées avec le SEB.
Seuls les macaques infectés par le virus SIV reproduisent un phénomène comparable à celui observé chez l'homme avec le virus HIV .
Cet animal est donc un modèle intéressant pour sélectionner des agents thérapeutiques capables de prévenir l'apoptose et la survenue de la maladie . Cet animal est d'autant plus intéressant, que contrairement à l'homme ou le SIDA se déclare en dix ans , le macaque infecté par le virus SIV présente la particularité de développer un SIDA en six mois à un an et demie .
CONCLUSION:
Une caractéristique essentielle de l'apoptose est que la mort cellulaire dépend d'une activation de la cellule , de la transcription des gènes et de la synthèse des protéines dans les cellules mourantes . L'activation des cellules T de patients infectés par le virus HIV après addition de PWM est montrée par l'expression des mRNA p55 correspondant aux récepteurs à l' interleukine-2 à des niveaux équivalents et avec des cinétiques équivalentes à celle observée dans des cellules T d'individus sains ( figure 4 ) .
De plus , l'addition d'un inhibiteur de synthèse protéique ( la cycloheximide ) ou de cyclosporine A empêche l'apoptose des cellules T des patients infectés par le virus HIV stimulées par le PMW ou le SEB ( figure 2a et figure 3 ).
Il est à noter que parmi les stimulis qui induisent l'apoptose dans des thymocytes immatures normaux , et parmi les co-signaux qui empêchent ce processus , seul un nombre limité a le même effet vis- à-vis de cellules T de patients infectés par le HIV.
Dans les thymocytes immatures , la plupart des stimulis induisant la prolifération de cellules T adultes normales , incluant l'anticorps CD3 , conduisent à l'apoptose, et l'addition de co-signaux tels que l'interleukine-1, l'interleukine-2 ou des esters de phorbol évite non seulement l'apoptose mais permet aussi une prolifération en réponse au stimuli .
Dans les cellules T de patients infectés par le virus HIV, l'anticorps CD3 induit la prolifération cellulaire et parmi les divers co-signaux ( Interleukine 1, Interleukine 2, Interféron gamma , anticorps CD5, CD28, CD 43, CD44 et CD 45R ou ester de phorbol ) qui ont été ajoutés aux cellules T de patients infectés par le virus HIV, seul l'anticorps CD28 évite la mort induite par le PWM et le SEB et restaure la prolifération au PMW , au SEB et au TT (figure lb et figure 2a) .
Sans gue cette interprétation puisse être considérée comme une restriction à la présente invention , l'ensemble des résultats semble indiquer que les cellules CD4 TH des patients infectés par le virus HIV sont programmées in vivo pour un procédé de suicide par apoptose après une activation par une stimulation définie , incluant la mobilisation des récepteurs des cellules T (TCR) par les molécules présentées par le complexe majeur d'hiscompatibilite de classe II.
Etant donné que les anticorps anti-CD28 rétablissent la possibilité de proliférer après stimulation par l'antigène TT, les cellules T spécifiques du tétanos semblent présentes chez les patients infectés par le virus HIV. Quoique de telles cellules sont trop rares pour permettre une mise en évidence de leur mort , l'induction de l'apoptose semble être le mécanisme le plus probable pour expliquer leur absence de réponse in vitro .
Chez les patients infectés par le HIV, moins de 0,1% des cellules T CD4 du sang périphérique sont infectées par le HIV , ce qui exclut la possibilité que l'apoptose soit due directement à l'infection des cellules .

Claims

REVENDICATIONS
1. Médicament contenant un agent inhibant in vivo l'apoptose pathologique , ledit agent pouvant être sélectionné par un procédé comprenant au moins les étapes de:
- mise en contact d'au moins deux préparations cellulaires d'un patient infecté par un retrovirus avec un agent d'activation cellulaire , tel que du mitogène pokeweed, respectivement en présence et en absence dudit agent , et
- comparaison de la prolifération et/ou de la mortalité des deux préparations cellulaires .
2. Médicament selon la revendication l,caractérisé en ce que l'agent est capable de bloquer la réception ou la transduction de signaux conduisant au suicide des cellules .
3. Médicament selon la revendication 2,caractérisé en ce gue l'agent est capable d'inhiber l'activation d'une endonuclease nucléaire entraînant la fragmentation du génome de la cellule .
4. Médicament selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'agent apporte ou génère un cosignai permettant à la cellule de se différencier et de se multiplier normalement.
5. Médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent à lui seul entraîne la prolifération et la différenciation cellulaires et génère des cellules gui ont perdu la capacité à se suicider dans des conditions pathologiques .
6. Médicament selon la revendication 1 , caractérisé en ce gue l'agent est capable d'inhiber les signaux qui rendent une cellule susceptible de répondre par une apoptose pathologique à une activation .
7. Médicament selon la revendication 2 , contenant de la cyclosporine , ou un inhibiteur de synthèse protéique tel que la cycloheximide .
8. Médicament selon la revendication 4 contenant un anticorps anti-CD28 ou une association d'un agent entraînant la stimulation de la phosphokinase C , tel qu'un ester du phorbol , avec l'interleukine I.
9. Médicament selon la revendication 5 contenant un agent mitogène tel que la phytohémagglutinine (PHA) , des cellules allogéniques irradiées , un anticorps anti-CD2 ou un anticorps anti-CD3.
10. Médicament selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il est destiné au traitement et à la prévention des maladies liées aux retrovirus et en particulier liées aux lentivirus , tels que les virus HIV chez l'homme et SIV, FIV, BIV , VISNA et CAEV chez l'animal .
11. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient une quantité pharmaceutiquement efficace d'un agent tel que défini dans l'une des revendications 1 à 9 en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants pharmaceutiquement acceptables .
12. Composition pharmaceutique selon la revendication 11 , caractérisée en ce qu'elle est destinée au traitement et à la prévention des maladies liées aux retrovirus et en particulier liées aux lentivirus , tels que les virus HIV chez l'homme et SIV, FIV , BIV, VISNA et CAEV , chez l'animal .
13. Utilisation d'un agent tel que défini dans l'une des revendications 1 à 9 pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement et à la prévention des maladies liées aux retrovirus et en particulier liées aux lentivirus , tels que les virus HIV chez l'homme et SIV, FIV, BIV, VISNA et CAEV chez l'animal.
14. Méthode de détermination de la déficience qualitative du répertoire immunologique d'un individu vis-à-vis d'un agent infectieux comprenant au moins les étapes de :
- stimulation in vitro des lymphocytes dans un milieu contenant au moins un anticorps anti-CD28 en présence d'un ou plusieurs antigènes spécifiques de l'agent infectieux, et
- mesure de la cinétique de prolifération des lymphocytes .
15. Méthode de détermination de la capacité des lymphocytes d'un individu à répondre à l'agression par un agent infectieux comprenant au moins les étapes de :
- stimulation in vitro des lymphocytes dans un milieu contenant au moins un anticorps anti-CD28 en présence d'un ou plusieurs antigènes spécifiques de l'agent infectieux, et
- mesure de la cinétique de prolifération des lymphocytes .
16. Méthode de stimulation in vitro de lymphocytes issus de patients atteints d'une maladie liée aux retrovirus par traitement des lymphocytes isolés par un anticorps anti-CD28.
17. Méthode de sélection d'un agent inhibant in vivo l'apoptose pathologigue comprenant au moins une étape de mise en contact de cellules infectées par un lentivirus , tel gu'un virus HIV avec un antigène respectivement en présence et en absence dudit agent et, consécutivement de stimulation par ledit antigène.
18. Méthode de sélection d'un agent inhibant in vivo l'apoptose pathologique comprenant au moins :
- une première présentation d'un antigène par des monocytes préincubés avec un retrovirus, à une lignée cellulaire de lymphocytes T CD4+,
- une seconde présentation de l'antigène par des monocytes , éventuellement préincubés avec un retrovirus, à la lignée cellulaire de lymphocytes T CD4+,
- estimation de la mort et/ou de la prolifération des lymphocytes .
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