CN117915935A - 用于刺激t细胞的微生物交叉反应抗原 - Google Patents
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Abstract
本文尤其提供了微生物交叉反应抗原(mCRAG)和包含该微生物交叉反应抗原的组合物，用于刺激T细胞以治疗或预防与冠状病毒感染相关的疾病。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年9月3日提交的美国临时专利申请号63/240,602的优先权，该申请的披露内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及用于刺激T细胞以预防或治疗与冠状病毒相关的疾病和/或症状的新用途和包含多肽的组合物。特别地，冠状病毒是SARS-CoV-2。
背景技术
冠状病毒(冠状病毒科(Coronaviridae))长期以来一直被认为是人类普通感冒和呼吸道感染以及动物多种呼吸道疾病的致病物之一。然而，直到21世纪，冠状病毒变体才作为大流行病原体出现。2002年，SARS-CoV病毒出现，并在短时间内展现出现代毒株的高传染性特征。MERS冠状病毒在阿拉伯半岛的出现遵循类似的轨迹。
自从SARS(严重急性呼吸综合征)冠状病毒2(SARS-CoV-2)爆发并引起冠状病毒病(COVID-19)以来，这种高传染性病毒在世界范围内迅速传播，导致全球大流行。虽然大约15％-20％的检测病例是无症状的，但大多数受影响的患者有轻度症状，包括发热(83％-98％的有症状病例)、咳嗽(59％-82％的有症状病例)、呼吸短促(19％-55％的有症状病例)和肌肉疼痛(11％-44％的有症状病例)。然而，在一些患者中，该疾病将发展到更严重的状态，这将在感染发生后8天左右发生。主要症状从呼吸困难到呼吸窘迫，3％-29％的患者需要入住重症监护室(ICU)。然后病程可能导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)(17％-29％的患者住院)、严重脓毒症伴休克，并且在一些情况下导致在一周内出现多器官功能障碍。最后，据估计，被感染患者的全球死亡率为大约5％-7％。
这种病毒带来的挑战是多方面的：其高接触传染性加上相当一部分无症状携带者使得感染在人群中迅速传播而不被发现。这导致所有被感染国家/地区的病例迅速增加，给现有医疗基础设施带来巨大压力，导致死亡人数增高。
此外，与其他冠状病毒不同，该变体保留了其毒力，尽管作为RNA病毒，但预计它会以相对高的频率发生突变。另外，缺乏该疾病的动物模型阻碍了疫苗开发者证明疗效的能力，并且快速传播要求在没有大量动物数据的情况下采用捷径来进行人体试验。
因此，除少数国家/地区外，所有被感染国家/地区都进入了广泛的封锁状态，限制社会集会，限制旅行，并迫使大多数企业将活动限制到最低限度(在大多数情况下关闭)。这样的措施引发了“停工经济学”，造成全球经济衰退，给全球人口带来了破坏性后果。
在过去的几个月里，政府、非政府组织(NGO)和私营公司重新集中精力寻找针对COVID-19的治疗方法。最常见的方法可以分为三大类：i)被动免疫/中和抗体、ii)疫苗和iii)药物重新定位(drug repurposing)。
关于上述方法，一种产品(小分子药物瑞德西韦(Remdesivir))已被批准用于治疗COVID-19的重症病例。然而，最近公布的临床数据并没有显示出与安慰剂相比有很大的益处。2020年5月12日，在clinicaltrials.gov中注册了1368项针对COVID-19的临床试验。
发明内容
为了克服目前SARS-CoV-2和其他冠状病毒引起/相关的呼吸道疾病或病症的爆发所带来的挑战，本发明人认为，预防或治疗人群的一般冠状病毒相关严重呼吸综合征疾病、特别是COVID-19要取得成功的关键将是提供一种产品，该产品将：(i)使免疫系统能够(a)分泌抗SARS-CoV-2的抗体，(b)刺激预先存在的SARS-CoV-2交叉反应T细胞，并且(3)使用具有微生物交叉反应抗原(mCRAG)的细菌菌株产生新的SARS-CoV-2交叉反应T细胞，并且/或者(ii)激活免疫系统以在感染SARS-CoV-2之前刺激抗病毒免疫。本发明诸位发明人认为，这种方法(即使用mCRAG刺激T细胞)可以单独使用和/或与其他研究组目前正在考虑的其他方法(如疫苗)一起使用。
因此，本发明的目的是提供用于通过刺激T细胞预防或治疗与冠状病毒相关的疾病和/或症状的方法和包含mCRAG的组合物。特别地，本发明的目的是提供用于预防或治疗有需要的受试者的与SARS-CoV-2病毒相关的疾病和/或症状的mCRAG。
因此，在一些方面，本文提供了一种用于刺激T细胞的方法，该方法包括使T细胞与一种或多种包含SEQ ID NO.1-71的多肽接触，其中刺激T细胞导致以下中的一种或多种：i)T细胞增殖增加；ii)细胞因子分泌；以及iii)一种或多种表面表达的活化标记物上调。在一些实施例中，细胞因子是选自由IFNγ、TNFα、IL2、IL17、IL22、IL4和IL5组成的组的一种或多种细胞因子。在本文所披露的任何实施例中的一些实施例中，表面表达的活化标记物是选自由CD69、CD134、CD137、CD154和CD25组成的组的一种或多种标记物。在本文所披露的任何实施例中的一些实施例中，T细胞是细胞毒性T细胞、辅助性T细胞和/或γδT细胞。
附图说明
图1是一系列描绘通过流式细胞术测量的CD4 T细胞对合成肽池的细胞内IFN-γ反应的图。将来自5个个体供体的PBMC分成2部分，并在2周的离体扩增步骤中用CRAG或对照肽池进行处理，然后用CRAG、对照或SARS-CoV-2肽池进行再刺激。图表示表达细胞内IFN-γ的总CD4细胞的个体供体百分比，其中减去了背景DMSO媒介物对照测量值。各图表按最终肽池再刺激处理进行排列，并按初始刺激部分分组。使用比率配对T检验进行统计分析。
具体实施方式
以下陈述了本发明的详细方面。在单独的部分中部分地讨论了一些详细方面。这是为了便于参考，并且绝对不是限制性的。下面描述的所有实施例同样适用于本发明的所有方面，除非上下文另有特别规定。
黏膜IgA对微生物群具有广泛的交叉反应性，有助于维持微生物群与宿主的稳态。不受理论的约束，通过用与冠状病毒(包括SARS-CoV-2，表面多肽(主要是S蛋白))具有同源表位的mCRAG刺激T细胞，有可能诱导交叉反应IgA抗体，该抗体可以通过在黏膜表面与SARS-CoV-2或其他冠状病毒病毒粒子发生交叉反应而降低感染风险。黏膜IgA抗体还经由在上皮细胞中表达的聚合Ig受体将病毒颗粒从上皮细胞的宿主侧转运到微生物群侧。
为了产生抗原特异性反应和新抗体产生，mCRAG应在例如肠道/黏膜中诱导T细胞依赖性反应。如果以粉末形式食用，这些抗体也可能在呼吸道的黏膜中产生。
抗原特异性T细胞依赖性反应在次级淋巴组织(淋巴结/派伊尔斑)中由以下细胞驱动：(i)摄入外源抗原并在其表面上的MHC-II/MHC-I分子上展示交叉反应肽的抗原呈递细胞，(ii)识别肽:MHC-II复合物的CD4 T细胞，(iii)由CD4 T细胞活化的抗原特异性CD8 T细胞，以及(iv)由结合病原体并在MHC-II中展示肽的B细胞受体活化的B细胞，以及(v)由来自同一外源抗原的肽通过抗原呈递细胞活化的CD4 T细胞。
T细胞依赖性IgA的产生由TGF-β(IgA类别转换)驱动，并且B细胞的扩增/分化由CD4 T细胞分泌的IL-5、IL-6、IL-10和IL-21驱动。这基本上是一种致耐受性Treg/屏障，保护由分泌IL-6、IL-10、IL-23、TGF-β的树突细胞诱导的Th17对微生物群的反应。
mCRAG对T细胞的刺激诱导肠道中的IgA反应。已经表明，一些浆B细胞(Ab产生细胞)会移动到其他黏膜部位(约10％)，例如呼吸道(约1-2％)，以添加到现有的浆细胞/IgA池中。
CD8记忆细胞在根除病毒感染细胞和驱动抗病毒免疫方面很重要。已经表明，健康人具有针对共生微生物的记忆CD8 T细胞。进一步表明，含有肿瘤新抗原的交叉反应肽的细菌菌株短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)能够影响肿瘤反应CD8 T细胞(Bessell CA,Isser A,Havel JJ,Lee S,Bell DR,Hickey JW等人Commensal bacteria stimulateantitumor responses via T cell cross-reactivity[共生细菌经由T细胞交叉反应性刺激抗肿瘤反应]；JCI Insight[临床研究杂志子刊机理解析]；2020；5(8))，这表明微生物群也可以影响针对病原体的抗原特异性记忆CD8 T细胞池。CD8反应通常由IL-12/IFN-γ和Th1型树突细胞/CD4 T细胞启动。因此，衍生自益生菌的mCRAG可以影响预先存在的冠状病毒交叉反应记忆CD8 T细胞，但也可以影响记忆CD4 T细胞。
mCRAG刺激T细胞也可以影响现有的浆细胞活化和IgA池。如果存在针对SARS-CoV-2的交叉反应IgA，则mCRAG可以通过不依赖T细胞的机制来支持总IgA产生。共生微生物群/益生菌在肠中诱导总IgA产生(不依赖抗原)，并且也可能对肠外IgA产生具有影响。例如，短链脂肪酸和来自上皮细胞的TGF-β(IgA类别转换)、IL-6、视黄酸、BAFF和APRIL的诱导会驱动IgA产生。不受理论的约束，据信衍生自这样的微生物群/益生菌的mCRAG也会诱导类似的总IgA和肠外IgA产生。
例如，20多年来，已经在临床研究中研究了针对感冒和流感的益生菌补充剂。临床研究的几项荟萃分析表明，益生菌通常可能对降低呼吸道感染的风险和持续时间有效。然而，益生菌对免疫刺激和对呼吸道感染的有益效果之间存在菌株特异性差异。对乳酸双歧杆菌(B.lactis)Bl-04、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCFM和乳酸双歧杆菌Bi-07的研究以及文献中的其他研究表明，益生菌通过“训练”先天免疫反应发挥作用，即通过在病毒感染之前启动免疫系统发挥作用。研究表明，在将病毒载量或感染风险降低大约20％之前，干扰素和先天免疫细胞因子的表达增加。
尽管所有病毒都具有不同的发病机理和生命周期，但它们仍然会诱导相似的抗病毒免疫反应—以NK细胞、ILC1、细胞毒性T淋巴细胞、Th1反应和IgG抗体产生以及干扰素α、β、γ和λ的产生、炎性体和Th1相关细胞因子诸如IL-12和IP-10的活化为特征。因此，针对SARS-CoV-2的先天免疫系统刺激也可能对其他冠状病毒有效。
病毒通过例如产生抑制干扰素产生和细胞免疫的分子来逃避这些免疫反应。据报道，在SARS-CoV-2感染中，干扰素反应被延迟。
已经表明益生菌如嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM可以诱导与抗病毒免疫如干扰素β相关的特定途径并且增加检测病毒RNA的受体(TLR3)的表达。此外，NCFM降低了3-5岁儿童的感冒症状的发生率。它还在体外驱动IL-12产生。不受理论的约束，据信通过选择衍生自驱动/刺激抗病毒反应的一种或多种细菌菌株或一种或多种优化益生菌的聚生体的mCRAG，可以降低SARS-CoV-2感染和严重COVID-19疾病的风险，并且缩短疾病的持续时间和病程，同时可能减少总症状负荷。
冠状病毒可以在哺乳动物和鸟类中引起各种疾病或病症。在人类中，这些病毒可以引起从轻度到致命的呼吸道感染。轻度疾病包括一些普通感冒病例，而就COVID-19(SARS-CoV-2)而言，更致命的病毒可以引起严重的急性呼吸综合征(SARS)(SARS-CoV)、中东呼吸综合征(MERS)(MERS-CoV)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。在许多患者中，呼吸窘迫之后会出现严重脓毒症伴休克，并且在一些情况下导致在一周内出现多器官功能障碍，从而导致被感染患者的死亡率为大约5％-7％。
在一个实施例中，由冠状病毒引起的疾病是呼吸道疾病。更具体地，呼吸道疾病是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
在另一个实施例中，呼吸道疾病是肺炎。
根据世界卫生组织(WHO)报道，COVID-19最常见的症状是发热、干咳和疲倦。不太常见的症状包括疼痛、咽痛、腹泻、结膜炎、头痛、味觉或嗅觉丧失、皮肤出疹或者手指或脚趾变色。严重症状包括难以呼吸或呼吸短促、胸痛或胸闷以及语言能力或行动能力丧失。
在一个实施例中，冠状病毒引起的症状是咳嗽、发热、呼吸短促或难以呼吸(呼吸困难)、疲劳、肌肉或身体疼痛、恶心或呕吐、腹泻、嗅觉丧失或改变(嗅觉缺失症)和味觉丧失或改变(味觉缺失症)中的一种或多种。
在另一个实施例中，与冠状病毒相关的疾病和/或症状的预防和/或治疗通过当与本发明的一种或多种细菌菌株接触时刺激受试者的免疫系统来实现。
冠状病毒是一组相关的RNA病毒，并且这些病毒包括229E(α冠状病毒)、NL63(α冠状病毒)、OC43(β冠状病毒)、HKU1(β冠状病毒)、MERS-CoV(中东呼吸综合征冠状病毒)、SARS-CoV和SARS-CoV-2病毒。
在一个实施例中，本发明涉及属于冠状病毒科的任何冠状病毒。冠状病毒是具有正链单链RNA基因组和螺旋对称核衣壳的包膜病毒。冠状病毒的基因组大小在大约26至32千碱基的范围内，是RNA病毒中最大的一种。它们具有从表面突出的特有的棒状刺突。
在一个实施例中，根据本发明的冠状病毒选自由229E(α冠状病毒)、NL63(α冠状病毒)、OC43(β冠状病毒)、HKU1(β冠状病毒)、MERS-CoV(中东呼吸综合征冠状病毒)、SARS-CoV和SARS-CoV-2病毒组成的组。
在本发明的特定的实施例中，冠状病毒是SARS-CoV-2病毒。
一些人处于感染冠状病毒的高风险中(在临床上极其脆弱)。这些人包括接受过器官移植的人；正在接受癌症化疗或抗体治疗(包括免疫治疗)的人；正在接受肺癌高强度放疗(根治性放疗)的人；正在接受可能影响免疫系统的靶向癌症治疗(诸如蛋白激酶抑制剂或PARP抑制剂)的人；患有血液或骨髓癌(诸如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)的人；最近接受过骨髓或干细胞移植或者仍在服用免疫抑制药物的人；患有严重肺病(诸如囊性纤维化、严重哮喘或严重COPD)的人；患有意味着他们感染风险非常高的医学病症(诸如SCID或镰状细胞)的人；正在服用使他们更有可能感染的药物(诸如高剂量的类固醇或免疫抑制药物)的人；以及患有严重心脏病和怀孕的人。
一些人处于感染冠状病毒的中风险中(在临床上脆弱)。这些人包括70岁或以上的人；患有不严重的肺病(诸如哮喘、COPD、肺气肿或支气管炎)的人；患有心脏病(诸如心力衰竭)的人；患有糖尿病(I型或II型糖尿病)的人；患有慢性肾病的人；患有肝病(诸如肝炎)的人；患有影响脑或神经的病症(诸如帕金森病、运动神经元病、多发性硬化或脑瘫)的人；患有意味着他们感染风险高的病症的人；正在服用可能影响免疫系统的药物(诸如低剂量的类固醇)的人；非常肥胖的人(BMI为40或以上)；怀孕的人。
还有其他因素可能影响您的风险，诸如是男性、住在护理院(诸如疗养院或长期护理机构)或者是监狱或看守所的居住者。
在一个实施例中，本发明涉及患有一种或多种先前存在的病症的受试者，这些病症选自由肥胖症、II型糖尿病、慢性肺病或中度至重度哮喘、心脏病、免疫受损、慢性肾脏病和肝病组成的组。
在另外的实施例中，本发明涉及65岁或以上和/或居住在疗养院或长期护理机构或看守所或监狱中的受试者。
方法
本文提供了用于刺激T细胞的方法，这些方法包括使T细胞与一种或多种包含SEQID NO.1-71的多肽接触，其中刺激T细胞导致以下中的一种或多种：i)T细胞增殖增加；ii)细胞因子分泌；以及iii)一种或多种表面表达的活化标记物上调。
在一些实施例中，使T细胞与一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多种)包含SEQ ID NO.1-71(例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:70和/或SEQ ID NO:71)的多肽接触，导致T细胞增殖增加。与未与一种或多种包含SEQID NO.1-71的多肽接触的T细胞中观察到的增殖量相比，T细胞增殖可增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％或150％或更多中的任何值(包括介于这些值之间的所有百分比)。测量T细胞增殖的方法是本领域所熟知的。在一些实施例中，T细胞是细胞毒性T细胞、辅助性T细胞和/或γδT细胞。
在一些实施例中，使T细胞与一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多种)包含SEQ ID NO.1-71(例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:70和/或SEQ ID NO:71)的多肽接触，导致一种或多种细胞因子(例如但不限于IFNγ、TNFα、IL2、IL17、IL22、IL4和/或IL5)分泌。与未与一种或多种包含SEQ ID NO.1-71的多肽接触的T细胞中观察到的细胞因子分泌量相比，T细胞的细胞因子分泌可增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％或150％或更多中的任何值(包括介于这些值之间的所有百分比)。测量细胞因子分泌的方法是本领域所熟知的。在一些实施例中，T细胞是细胞毒性T细胞、辅助性T细胞和/或γδT细胞。
在一些实施例中，使T细胞与一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多种)包含SEQ ID NO.1-71(例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:70和/或SEQ ID NO:71)的多肽接触，导致一种或多种表面表达的活化标记物(例如但不限于CD69、CD134、CD137、CD154和/或CD25)上调。与未与一种或多种包含SEQ ID NO.1-71的多肽接触的T细胞中观察到的表面表达的活化标记物的量相比，表面表达的活化标记物可上调约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％或150％或更多中的任何值(包括介于这些值之间的所有百分比)。测量表面表达的活化标记物的方法是本领域所熟知的。在一些实施例中，T细胞是细胞毒性T细胞、辅助性T细胞和/或γδT细胞。
药物组合物
本发明的mCRAG可用作药物组合物或配制品或者用于制备药物组合物或配制品。此处，术语“药物”以广义使用并且涵盖用于人类的药物以及用于动物的药物(即，兽医应用)。
在优选实施例中，药学上可接受的组合物是药物。
药物组合物可以用于治疗目的，其本质上可以是治愈性的或姑息性的或预防性的。药物组合物甚至可用于诊断目的。
在本发明的优选实施例中，药物用于口服施用。
药学上可接受的组合物或支持物可以是例如压缩片剂、片剂、胶囊、软膏、栓剂或可饮用溶液的乳膏、泡沫、凝胶、洗剂和软膏形式的配制品或支持物。
当用作药物或用于制备药物时，本发明的组合物可与以下中的一种或多种结合使用：药学上可接受的载剂、药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂、药学上可接受的辅剂、药物活性成分。
一般来说，酵母已被证明是口服施用的辅剂。特别地，耶氏酵母(Yarrowia)已被证明可以驱动正确的IL-12/Th1/干扰素伽马路径，以及诱导IL-27引起CD8细胞毒T淋巴细胞合成/活化。它还似乎通过Th17细胞亚群诱导IL-17产生，该细胞亚群通常参与肠上皮细胞的先天免疫，包括壁完整性。
因此，在特定的实施例中，辅剂是酵母，并且更特别地是耶氏酵母。
药物可呈溶液的形式或作为固体，这取决于用途和/或应用方式和/或施用方式。
本发明的mCRAG可以用作药物成分。此处，组合物可以是唯一的活性组分，或者它可以是许多种(即，2种或更多种)活性组分中的至少一种。
药物成分可呈溶液的形式或作为固体，这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。
根据本发明，可以以任何合适的形式使用mCRAG-无论是单独时还是与其他组分或成分组合存在时。同样地，包含本发明的细菌和其他组分和/或成分(即，诸如食物成分、功能性食物成分或药物成分的成分)的组合可以任何合适的形式使用。
根据本发明，mCRAG可以以固体或液体制剂的形式或其替代物的形式使用。固体配制品的实例包括但不限于可以是可湿润的、喷雾干燥的或冷冻干燥的片剂、胶囊、尘剂、颗粒和粉末。液体制剂的实例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液、悬浮液和乳液。
针对立即释放、延迟释放、调节释放、持续释放、脉冲释放或受控释放应用，形式的合适实例包括以下中的一种或多种：可含有调味剂或着色剂的片剂、丸剂、胶囊、珠剂、溶液或悬浮液。
举例来说，如果本发明的mCRAG以片剂形式使用(如用作功能性成分)，则片剂还可含有以下中的一种或多种：赋形剂，如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂，如淀粉(优选地玉米、土豆或木薯淀粉)、乙醇酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐；制粒粘合剂，如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石。
用于在制备这些形式中使用的营养上可接受的载剂的实例包括例如水、盐溶液、醇、硅酮、蜡、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、表面活性剂、硅酸、黏性石蜡、芳香油、脂肪酸30甘油单酯和甘油二酯、石油醚(petroethrai)脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于这些形式的优选赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milksugar)或高分子量聚乙二醇。
对于水性悬浮液和/或酏剂，本发明的mCRAG可与各种甜味剂或调味剂、着色物质或染料组合，与乳化剂和/或悬浮剂组合，并且与稀释剂(如水、丙二醇和甘油及其组合)组合。
这些形式还可包括明胶胶囊；纤维胶囊、纤维片剂等；或者甚至纤维饮料。
在一方面，根据本发明的mCRAG能以气溶胶的形式施用，例如通过鼻腔喷雾的方式，例如用于施用于呼吸道。
实例
实例1：富集和评价共生微生物与致病性抗原之间具有交叉反应的T细胞库
在本实例中，实验测定与已知病毒病原体具有高氨基酸序列同源性的微生物肽的交叉反应潜力。设计了体外T细胞回忆方案以识别这样的相互作用。
这些方法分为两个阶段。第一阶段涉及使用热灭活全细胞制剂形式的微生物抗原或基于微生物蛋白质的氨基酸片段的合成肽抗原对从健康人供体获取的外周血单个核细胞(PBMC)进行体外刺激。当个体供体先前与应用于体外培养系统的微生物物种有过免疫接触时，在供体PBMC样品中可能发生记忆T细胞反应。在实验的第一阶段，从大量无反应的T细胞中分离出因对微生物抗原产生反应而获得活化表型的T细胞，这些反应与记忆T细胞活化中发生的已知反应一致。用于区分记忆细胞活化的反应也用于分离活化的T细胞。这些反应包括：特定表面标记物的上调；通过抗体的检测和通过磁分离技术的分离；或通过降低细胞示踪染色剂的荧光强度检测诱导的增殖，然后通过FACS分离。
一旦获得对微生物抗原有反应的T细胞亚群，将进行体外扩增阶段，通过细胞因子补充支持此阶段。这些细胞因子可包括(IL-2、IL-7、IL-15、IL-4)。通过抗体缀合的聚苯乙烯微球进行的T细胞受体(TCR)复合物和共刺激受体(例如CD28和CD137)进一步拮抗用于模拟由抗原呈递细胞提供的刺激信号。T细胞培养方法用于维持T细胞的体外增殖，并持续14天或直至获得足够的细胞以在实验的第二阶段中作为测定的种子，此时去除刺激性微球和细胞因子以使富集的T细胞系恢复至静息状态。
将静息T细胞系与初始微生物抗原刺激中使用的来自相同供体样品的自体PBMC细胞以1:10的比例重新组合，以提供再刺激测定中T细胞活化所需的抗原呈递功能。保留的自体PBMC还用于测量对在再刺激测定中应用的肽抗原的基线初始反应。
表1和表2中列出的以下肽用于测试如第1阶段描述的方法中建立的T细胞系中的交叉反应性，并包括以下内容。
SARS-CoV-2肽：对应于IEDB数据库中整理的已知免疫原性T细胞表位的合成肽，依靠经验证明其可在先前感染病原体(在此情况下是SARS-CoV-2)的人类中诱导T细胞反应。
CRAg(mCRAG)肽：微生物衍生的与SARS-CoV-2具有同源性的氨基酸序列，其保持与SARS-CoV-2肽(与其同源)相当的HLA结合。
CRAg对照肽：与SARS-CoV-2非同源但衍生自与CRAg肽相同的微生物蛋白质的肽，具有与SARS-CoV-2肽和匹配的CRAg肽相似的HLA等位基因的理想HLA结合特性。
表1：CD89mer肽
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表2：CD415mer肽
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确定交叉反应性的测定使用基于流式细胞术的测定进行，这些测定可测量活化信号，包括细胞因子的细胞内蓄积、活化诱导的T细胞活化标记物的表面水平或对肽刺激作出反应的增殖。
实例2：对益生菌衍生的CRAG肽有反应的T细胞扩增增加健康人供体PBMC中SARS-
CoV-2反应性TCR克隆型的百分比
为了证明CRAG肽能够交叉活化对SARS-Cov-2肽抗原有反应的T细胞受体(TCR)，使用来自健康供体的冻存PBMC制剂进行了2步离体测定。在含有合并肽的培养基中培养PBMC，其中肽的氨基酸序列源自益生菌生物体所表达的蛋白质。在一个肽池中，益生菌序列与SARS-CoV-2抗原具有高度的氨基酸序列同源性，已知这些抗原会在从康复期Covid-19患者中采集的T细胞中引发回忆反应。第二个池由一组来自相同益生菌蛋白质但与SARS-CoV-2没有同源序列同一性的匹配肽组成。此外，还对每个配对的CRAG和对照肽进行了序列基序的筛选，将预测这些序列基序能够以与亲本SARS-CoV-2抗原相似的亲和力与相同的HLA等位基因结合。这是为了最大程度增加每个肽池中相同组的肽可被个体供体抗原呈递细胞识别的概率，尽管供体群体中的HLA等位基因遗传学具有高变异性。因此，将来自各供体的CRAG和匹配的对照肽池在单独的孔中孵育，孵育期2周，以支持各池中TCR特异性克隆型的增殖。在方案的最后48小时内，去除支持抗原诱导的活化和增殖的细胞因子和抗原补充剂，以使T细胞恢复至静息状态。
在方案的第二阶段，用多种肽池和对照处理对CRAG和对照肽刺激供体部分中的T细胞比例进行再刺激，持续16小时，并通过流式细胞术分析CD4+T细胞的细胞内IFN-γ产生。用CRAG、对照和SARS-CoV-2肽池对各离体扩增部分进行再刺激。将来自相同供体的CRAG和对照部分作为成对样品处理，以比较再刺激时IFN-γ阳性CD4细胞％的差异。
如所预期的，CRAG部分比来自相同供体的对照部分含有更多的CRAG反应性CD4 T细胞，相反，对照部分比CRAG部分含有更多的对照肽反应性CD4 T细胞。如图1所示，对SARS-CoV-2肽再刺激作出反应时，在CRAG部分中的IFN-γ百分比较高，这表明CRAG反应性克隆型可能有助于对SARS-CoV-2肽作出反应而产生的信号。此结果表明，在分子水平上，可在益生菌蛋白质中包含的氨基酸片段中发现的序列同源性程度足以诱导已知参与SARS-CoV-2免疫反应的T细胞的活化。
Claims (5)
1.一种用于刺激T细胞的方法，所述方法包括使所述T细胞与一种或多种包含SEQ IDNO.1-71的多肽接触，其中刺激所述T细胞导致以下中的一种或多种：i)T细胞增殖增加；ii)细胞因子分泌；以及iii)一种或多种表面表达的活化标记物上调。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞因子是选自由IFNγ、TNFα、IL2、IL17、IL22、IL4和IL5组成的组的一种或多种细胞因子。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述表面表达的活化标记物是选自由CD69、CD134、CD137、CD154和CD25组成的组的一种或多种标记物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述T细胞是细胞毒性T细胞、辅助性T细胞和/或γδT细胞。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种多肽在细胞中表达。
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