JP2023515387A - Ｃｏｖｉｄ－１９の予防、診断および治療に有用なｔ細胞エピトープクラスターおよび関連組成物 - Google Patents

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Abstract

【要約】本開示は、新規コロナウイルスＣＯＶＩＤ－１９を含む重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患に対する、ワクチンを含む新規エピトープ系組成物に関する。本開示は、免疫原性ポリペプチド（本明細書に開示されるコンカテマーポリペプチド、ハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物、およびキメラまたは融合ポリペプチドを含む）およびその使用、特にワクチン組成物における使用に関する。本開示は、前記ポリペプチドを発現する核酸、ベクター、および細胞、ならびにその用途に関する。本発明のポリペプチドは、より具体的には、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ ＭＨＣ分子のリガンドであると予測されるアグレトープ、ならびにＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子のＴ細胞によって認識されると予測されるエピトープを含んでいる。前記組成物は、特に、ワクチンを製造するのに適しており、特に、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる関連疾患に対するワクチンを製造するのに適している。【選択図】図８Ａ

Description

関連出願
（関連出願との相互参照）
２０２０年２月１４日に出願した米国仮出願６２／９７６，７１５号、２０２０年３月１９日に出願した米国仮出願６２／９９１，７９０号、２０２０年３月３０日に出願した米国仮出願６３／００１，６３２号、２０２０年８月１３日に出願した米国仮出願６３／０６５，１２９号、２０２０年９月１日に出願した米国仮出願６３／０７３，１６１号、２０２０年９月２５日に出願した米国仮出願６３／０８３，３８９号、２０２０年１０月１５日に出願した米国仮出願６３／０９２，２２９号、２０２０年２月２８日に出願した米国仮出願６２／９８３，０１２号号、２０２０年３月１９日に出願した米国仮出願６２／９９１，８１４号、２０２０年８月１３日に出願した米国仮出願６３／０６５，１６１号、２０２０年９月２１日に出願した米国仮出願６３／０８１，０６２号、２０２０年３月３０日に出願した米国仮出願６３／００１，６２４号、２０２０年８月１３日に出願した米国仮出願６３／０６５，１３５号、２０２０年４月３日に出願した米国仮出願６３／００４，７２９号、２０２０年８月１３日に出願した米国仮出願６３／０６５，１５２号、２０２０年４月８日に出願した米国仮出願６３／００６，９６２号、２０２０年８月１３日に出願した米国仮出願６３／０６５，１６３号、２０２０年９月１日に出願した米国仮出願６３／０７３，１５６号、および２０２０年９月２１日に出願した米国仮出願６３／０８１，０５５号の優先権を主張するものであり、各内容は参照によりここに組み込まれる。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されたシーケンスリストを含んでおり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年２月１０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、「EPV0038WO Sequence Listing 1_ST25.txt」と命名され、サイズは１４８ＫＢバイトである。
本開示は、一般に、それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染［または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの、密接な関連を有するウイルス］および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に有効な、ワクチンを含む新規なＴ細胞エピトープ系化合物（T-cell epitope-based compounds）および組成物に関する。そのようなＴ細胞エピトープ化合物および組成物は、免疫原性Ｔ細胞エピトープポリペプチド（immunogenic T-cell epitope polypeptides）（コンカテマーポリペプチド（concatemeric polypeptides）、ハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物（hybrid Ii-key constructs）、およびキメラまたは融合ポリペプチド（chimeric or fusion polypeptides）を含む）、ならびに核酸、プラスミド、ベクター（発現ベクターを含む）、およびポリペプチドを発現する細胞、医薬組成物、およびワクチンを含む。
本開示はまた、一般に、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）又は関連コロナウイルスに対するＴ細胞応答（例えば、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞応答）を含む細胞媒介免疫応答を検出する方法、アッセイ、及びキット、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染又は関連コロナウイルス感染の診断のための方法、アッセイ及びキットに関する。
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、コロナウイルス科に属するポジティブセンスの一本鎖リボ核（ＲＮＡ）ウイルスである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（本明細書では「ＣＯＶＩＤ－１９ウイルス」とも呼ばれる場合がある）は、２０１９年後半に中国の武漢で初めて確認され、高伝染性コロナウイルス疾患２０１９（「ＣＯＶＩＤ－１９」、「２０１９新規コロナウイルス」、「２０１９－ｎＣｏＶ」と称されてきており、本明細書ではそう呼ぶことがある）の原因であるとされている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染は、コロナウイルス病２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）として知られる、軽度または無症状から急速に致命的となる重篤な合併症まで、多くの場合６５歳以上の成人および心血管疾患、２型糖尿病、肥満などの基礎疾患を有する個人で幅広い疾患を引き起こす。ＣＯＶＩＤ－１９の世界的な広がりは、２０２０年３月１１日に世界保健機関（ＷＨＯ）によりパンデミック（世界的流行）と宣言された。２０２０年１２月２５日現在、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２型（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の世界的な広がりにより、中国の武漢で最初の患者が現れてから１０カ月足らずで、ＣＯＶＩＤ－１９の患者数は７９００万人以上、死者は１７０万人となり、世界経済の混乱が生じている。重症化しない自然感染からの回復と、若年者における重症化に対する抵抗性は、防御免疫応答を再現するワクチン戦略によって、ＣＯＶＩＤ－１９の大流行を終わらせるために免疫系を活用できることを示唆している。
ＣＯＶＩＤ－１９の防御の免疫相関はまだ定義されていないが、いくつかの研究では、細胞性獲得免疫機構がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の制御に寄与していることが示されている。液性免疫応答もまた防御に寄与しており、現在のワクチン開発の焦点となっている。ウイルス特異的なＩｇＭおよびＩｇＧ抗体は、ほぼすべての感染症で認められる。セロコンバージョンは、症状発現後７日から１４日目に観察され、ウイルスが消失した後も数週間持続する。抗体量は感染後４～５ヶ月で減少するが、軽症および重症の場合、耐久性のあるメモリーＢ細胞免疫が報告されている。抗体は、表面のスパイク糖タンパク質と内部のヌクレオカプシドタンパク質に対して見いだされる。中和抗体はスパイクの受容体結合ドメインを標的とし、宿主受容体であるアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を介した細胞侵入を阻止する。中和抗体は、セロコンバージョンした人の９０％以上に認められる。医療従事者の前向き研究では、抗ＣＯＶＩＤ－１９ ＩｇＧ抗体価は、その後のＰＣＲ検査陽性からの保護と相関しており、抗体、Ｔ細胞応答（高い抗体価をもたらす）のいずれか、または両方がその後の感染からの保護と相関していることが示唆された。他の研究では、スパイク特異的である濾胞性ヘルパーＣＤ４ Ｔ細胞（Ｔｆｈ）頻度が中和抗体反応と相関していることが示されている。現在、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンは抗体反応の生成に焦点が当てられているが、この後者の発見は、免疫生成におけるＴ細胞の重要な役割を明らかにするものである。
さらに最近、様々なＴ細胞応答と感染防御との相関が明らかになり始めている。大規模な前向き研究（プロスペクティブスタディ）により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的Ｔ細胞の数は、間接的に疾患リスクと相関することが示された。スパイク、膜およびヌクレオカプシドタンパク質に対するＴ細胞応答が低い人はＣＯＶＩＤ－１９を発症し、高い応答者はたとえ血清陰性であっても発症しないのである。Ｔ細胞の幅も保護反応の重要な特徴であり、軽症の患者は重症の患者と比較して、血液および気管支肺胞洗浄液中のＴＣＲクローナリティが高いことが分かっている。
Ｔ細胞の表現型と機能も軽症と重症の予測に役立つ可能性がある。予後不良は、ＰＤ－１やＴＩＭ－３消耗マーカーの発現増強、ＣＴＬＡ－４やＴＩＧＩＴなどの阻害分子レベルの上昇、多機能ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の低頻度、ＧｚｍＢ産生ＣＤ８ Ｔ細胞の低頻度などのＴ細胞障害の複数の兆候と関連している。一方、非重症患者は、抑制分子のレベルが低く、ＧｚｍＡ、ＧｚｍＢ、パーフォリンエフェクターが高い。さらに、ＣＯＶＩＤ－１９で死亡した患者ではリンパ節にＴｆｈ（濾胞性ヘルパーＴ細胞）が見られないのとは対照的に、回復した患者ではウイルスが消失した時点で末梢にＴｆｈが見られ、回復期まで持続していることがわかった。これ（ら）の知見は、ＣＯＶＩＤ－１９免疫の理解を深め、Ｔ細胞免疫を利用した抗体およびＴ細胞指向性ワクチンを開発するために、Ｔ細胞のエピトープ特異性を明らかにすることの重要性を強調するものである。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に含まれるＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞エピトープの同定と、有効な医薬およびワクチンの開発におけるそれらの使用に対する緊急の必要性がある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルスに対するＴ細胞応答（例えば、ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞応答）などの細胞媒介免疫応答を含む免疫応答を検出するための方法、アッセイ、およびキット、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染または関連コロナウイルス感染の診断のための方法、アッセイおよびキットも、緊急に必要である。
したがって、本開示は、新規の、治療用Ｔ細胞エピトープ化合物および組成物、ならびにそれらの、例えば、免疫応答（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を含むコロナウイルス感染およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる関連疾患に対する応答）を刺激、誘導、および／または拡大する方法における、それらの使用、ならびにＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる、対象における関連疾患に対する治療および／または予防方法、に関するものであり、前記Ｔ細胞エピトープ化合物および組成物は、例えば、１または複数の、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列および／またはその断片または変異体を有するポリペプチド、ならびに、任意選択で（optionally）、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に、任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるポリペプチドを含む、本明細書で開示する１または複数の、例えばペプチドまたはポリペプチド；本明細書に開示されるコンカテマーペプチド；本明細書に開示されるようなハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物であって、例えば、配列番号２３２－４５２および４５７－４５９、およびその断片または変異体の１つ以上を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む；本明細書に開示されるキメラまたは融合ポリペプチド組成物（分離、合成または組換えされていてもよい）；本明細書に開示される核酸、発現カセット、プラスミド、発現ベクター、組み換えウイルスまたは細胞；本明細書に開示されるワクチン組成物もしくは製剤、および／または本明細書に開示される医薬組成物を含んでいる。
複数の態様において、本開示のＴ細胞エピトープ化合物または組成物は、本明細書に開示される１または複数のペプチドまたはポリペプチドを含む。複数の態様において、本開示は、１または複数の、配列番号４－２２４および４５４－４５６を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるアミノ酸配列、またはそれらの断片もしくは変異体を有するペプチドもしくはポリペプチドに関する。本明細書において、「本質的に～からなる」という表現は、本開示によるペプチドまたはポリペプチドが、配列番号４－２２４および４５４－４５６のいずれかによる配列又はその断片若しくは変異体に加えて、ペプチドのいずれかの末端及び／又は側鎖に存在し得る追加のアミノ酸又は残基を含んでもよく、これ（ら）のアミノ酸又は残基は、ＭＨＣリガンドとして機能するペプチド又はポリペプチドの一部を必ずしも形成するわけではなく、これ（ら）のアミノ酸又は残基は、Ｔ細胞エピトープとして機能するペプチドの活性を実質的に損ねないものであることを意味する。
本開示のポリペプチドは、分離、合成、および／または組換えであってよく、グリコシル化、付加化学基などの転写後改変を含んでいてもよい。複数の態様において、ペプチドまたはポリペプチドは、中性（非荷電）または塩の形態のいずれかであり得、グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸化などの改変を含まないかまたは含んでいてもよい。複数の態様において、本発明の開示のペプチドまたはポリペプチドは、ｎ－末端アセチル基および／またはｃ－末端アミノ基でキャップされてもよい。複数の態様において、配列番号９、３４、４９、５４、５９、９４、９９、１０４、１０９、１４２、１４７、１８１、１９１、１９６、２１０－２１３、２１５－２１８、２２０、および２２３を有する本開示のペプチドまたはポリペプチドは、ｎ末端アセチル基およびｃ末端アミノ基でキャッピングされる。複数の態様において、配列番号８９、１１４、１８６、２１４、１１９、２２１－２２２、および２２４を有する本発明の開示のペプチドまたはポリペプチドは、ｎ末端アセチル基でキャップされ、ｃ末端ではキャップされない。
複数の態様において、本発明の開示は、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、ならびに、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチドに関する。
複数の態様において、本発明の開示は、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片および変異体）を有する１または複数のペプチドまたはポリペプチドを含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるコアアミノ酸配列、および、任意選択で、前記コアアミノ酸配列のＣ末端および／またはＮ末端に対して１～１２の延長されたアミノ酸を有するペプチドまたはポリペプチドに関し、ここで、これ（ら）の隣接アミノ酸（フランクとしてのアミノ酸）の全体の数は、１～１２、１～３、２～４、３～６、１～１０、１～８、１～６、２～１２、２～１０、２～８、２～６、３～１２、３～１０、３～８、３～６、４～１２、４～１０、４～８、４～６、５～１２、５～１０、５～８、５～６、６～１２、６～１０、６～８、７～１２、７～１０、７～８、８～１２、８～１０、９～１２、９～１０または１０～１２であり、前記隣接アミノ酸は、前記Ｃ末端およびＮ末端に対して任意の比率で分布してもよい（例えば、すべての隣接アミノ酸は、一方の末端に加えられてもよく、または、両方の末端に等しく加えられてもよく、または任意の他の比率で加えられてもよい）。
複数の態様において、本発明の開示は、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片および変異体）、および任意選択で、Ｃ末端および／またはＮ末端の１～１２の延長されたアミノ酸を有する、１または複数のペプチドまたはポリペプチドを含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるコア配列を有するペプチドまたはポリペプチドに関し、これ（ら）の隣接アミノ酸の全体の数は１～１２、１～３、２～４、３～６、１～１０、１～８、１～６、２～１２、２～１０、２～８、２～６、３～１２、３～１０、３～８、３～６、４～１２、４～１０、４～８、４～６、５～１２、５～１０、５～８、５～６、６～１２、６～１０、６～８、７～１２、７～１０、７～８、８～１２、８～１０、９～１２、９～１０、または１０～１２であり、ここで、隣接アミノ酸は前記Ｃ末端および前記Ｎ末端に任意の割合で分布することができ（例えばすべての隣接アミノ酸は一方の末端に付加することもでき、アミノ酸は両方の末端に等しく、または他の任意の割合で付加することもでき）、ただし隣接アミノ酸を有するポリペプチドは、依然として同じＨＬＡ分子に結合できる（すなわち、ＭＨＣ結合性を保持する）。
複数の態様において、前記隣接アミノ酸を有する前記ポリペプチドは、前記隣接アミノ酸を有さない前記ポリペプチドコア配列と同じＨＬＡ分子に結合すること（すなわち、ＭＨＣ結合性を保持すること）および／または同じＴＣＲ特異性を保持することが、依然として可能である。
複数の態様において、前記隣接アミノ酸を有する前記ポリペプチドは、前記隣接アミノ酸を有さない前記ポリペプチドコア配列と同様に、同じＨＬＡ分子に結合する（すなわち、ＭＨＣ結合性を保持する）、及び／又は同じＴＣＲ特異性を保持する、及び／又は抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を含む抗ウイルス活性を保持できることに変わりはない。
複数の態様において、前記隣接アミノ酸配列は、内在性タンパク質において、そこに含まれるペプチドまたはポリペプチドの態様にも存在するものである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドが、配列番号４－８および２１０のアミノ酸配列（および／またはその断片および変異体）、ならびに任意選択で、Ｃ末端および／またはＮ末端の１～１２の延長されたアミノ酸を有する１または複数のペプチドまたはポリペプチドを含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるコア配列を有する場合、１～１２のアミノ酸の延長は、２０１９－ｎＣｏＶのエンベロープのアミノ酸配列（配列番号１）において、配列番号号４－８および２１０のアミノ酸配列に隣接するものとして見出されるものである。
ペプチドまたはポリペプチドが、配列番号９－６３および２１１－２１３のアミノ酸配列（および／またはその断片および変異体）、ならびに任意選択で、Ｃ末端および／またはＮ末端の１～１２の延長されたアミノ酸を有する１または複数のペプチドまたはポリペプチドを含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるコア配列を有する場合、１～１２のアミノ酸の延長は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜のアミノ酸配列（配列番号２）において、配列番９－６３および２１３のアミノ酸配列に隣接するものとして見出されるものである。
ペプチドまたはポリペプチドが、配列番号６４－２０９および２１４－２２４および４５４－４５６アミノ酸配列（および／またはその断片および変異体）、ならびに任意選択で、Ｃ末端および／またはＮ末端の１～１２の延長されたアミノ酸を有する１または複数のペプチドまたはポリペプチドを含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるコア配列を有する場合、１～１２のアミノ酸の延長は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクのアミノ酸配列（配列番号３）において、配列番号６４－２０９と２１４－２２４と４５４－４５６のアミノ酸配列に隣接するものとして見出されるものである。
追加の例は、以下の明細書に記載されている。
複数の態様において、本明細書に記載される前記隣接アミノ酸配列は、ＭＨＣ安定化領域として機能し得る。複数の態様において、より長いペプチドの使用は、患者細胞による内因性プロセシングを可能にし、より効果的な抗原提示およびＴ細胞応答の誘導をもたらす可能性がある。複数の態様において、延長部（複数可）は、ペプチドまたはポリペプチドの生化学的特性（例えば、溶解性または安定性に限定されない）を改善するために、またはペプチドの効率的なプロテアソーム処理の可能性を改善するために役立ち得る。複数の態様において、本開示のポリペプチドは、分離、合成、および／または組換えであってもよく、グリコシル化、付加化学基などの転写後改変を含んでいてもよい。複数の態様において、ペプチドまたはポリペプチドは、中性（非荷電）または塩の形態のいずれかであり得、グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸化などの改変を含まないかまたは含んでいてもよい。特定の態様において、本発明の開示のペプチドまたはポリペプチドは、ｎ末端アセチル基および／またはｃ末端アミノ基でキャップされてもよい。
複数の態様において、本開示は、本発明で開示される１または複数のポリペプチドまたはペプチド（以下に限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、ならびに、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド）が、追加のペプチドまたはポリペプチド（an additional peptide or polypeptide）に連結、融合、または結合（例えば、フレーム内で融合、化学的に結合、または他の方法で結合）して構成されるコンカテマーポリペプチドまたはペプチドに関する。そのような追加のペプチドまたはポリペプチドは、本発明で開示されるポリペプチドまたはペプチドの１つ以上であってもよく、あるいは、着目した追加のペプチドまたはポリペプチドであってもよい。
複数の態様において、コンカテマーペプチドは、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上の本発明で開示されたペプチドまたはポリペプチドから構成されている。他の複数の態様において、コンカテマーペプチド又はポリペプチドは、１０００以上、１０００以下、９００以下、５００以下、１００以下、７５以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、又は１００以下のペプチドエピトープを含む。さらに他の複数の実施形態では、コンカテマーペプチドは、３～１００、５～１００、１０～１００、１５～１００、２０～１００、２５～１００、３０～１００、３５～１００、４０～１００、４５～１００、５０～１００、５５～１００、６０～１００、６５～１００、７０～１００、７５～１００、８０～１００、９０～１００、５～５０、１０～５０、１５～５０，２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０、１００～１５０、１００～２００、１００～３００、１００～４００、１００～５００、５０～５００、５０～８００、５０～１０００、または１００～１０００の本発明で開示されるペプチドまたはポリペプチドが連結、融合または結合しているものである。コンカテマーポリペプチドの各ペプチドまたはポリペプチドは、任意に、切断感受性部位であってもよい１または複数のリンカーを、それらのＮ末端および／またはＣ末端に隣接して有していてもよい。
このようなコンカテマーペプチドにおいて、２つ以上のペプチドエピトープは、それらの間に開裂感受性部位を有していてもよい。あるいは、２つ以上のペプチドエピトープは、互いに直接、または切断感受性部位でないリンカーを介して接続されていてもよい。
複数の態様において、本発明で開示されるコンカテマーポリペプチドまたはペプチド配列は、内在性の（naturally occurring）配列に対応しない。すなわち、本発明で開示される１または複数のポリペプチドまたはペプチド（以下に限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド）の各々が、全体的なコンカテマーポリペプチドが自然発生コロナウイルス配列に対応しないような様式で、追加のペプチドまたはポリペプチド（これは本発明で開示された１または複数のペプチドであってもよい）に、連結、融合または結合（例えば、フレーム内で融合、化学的に結合、または他の方法で結合）連結される。
複数の態様において、本開示のコンカテマーポリペプチドは、分離され、合成され、および／または組換えされてもよく、グリコシル化、付加化学基などの転写後改変を含んでいてもよい。複数の態様において、コンカテマーポリペプチドは、中性（非荷電）または塩の形態のいずれかであり得、グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸化などの改変を含まなくてもよいし、含んでもよい。所定の複数の態様において、本発明の開示のコンカテマーポリペプチドは、ｎ－末端アセチル基および／またはｃ－末端アミノ基でキャップされてもよい。
複数の態様において、本開示の１または複数の、ペプチドもしくはポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチド［例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、ならびに、任意選択で、配列番号２－２２４のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド、または１または複数の配列番号２３２－４５２および４５７－４５９（および／またはその断片もしくは変異体）を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるコンカテマーポリペプチド］は、異種ポリペプチドに、結合し、連結（例えば、フレーム内で融合、化学的に結合、または他の方法で結合）し、および／または挿入される。複数の態様において、本発明で開示の１または複数のペプチドもしくはポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドは、異種ポリペプチドの隣接アミノ酸とともに、アミノ酸配列に接合、連結（例えば、フレーム内融合、化学結合、または他の方法で結合）、および／または挿入されてもよいが、本発明で開示の１または複数のペプチドもしくはポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドは、異種ポリペプチドに全体として、接合、連結（例えば、フレーム内融合、化学結合、または他の方法で結合）、および／または挿入される。
複数の態様において、本開示は、’８１３ハイブリッドと同様の３つの要素で構成されるハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物に関する。３つの要素は、以下の通りである。（１）哺乳類Ｉｉ－ＫｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号２２５）の４－１６残基および抗原提示増強活性を保持する配列番号２２５の改変体（modifications）（複数の態様において改変体は、配列番号２２５のＬＲＭＫ（アミノ酸１－４）残基および０－１２の追加の連続した配列番号２２５の残基、または、抗原提示増強活性を保持する配列番号２２５の改変体；または他の態様ではＬＲＭＫ（配列番号２２６）を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）可能性がある）を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるからなるＮ－末端要素；
（２）ＭＨＣクラスＩＩおよび／またはクラスＩ分子（複数可）の抗原ペプチド結合部位に結合する、ポリペプチドまたはペプチド模倣構造の形態のＭＨＣクラスＩＩおよび／またはＭＨＣクラスＩ提示エピトープ（複数の態様において、これは、本発明で開示する、１または複数のペプチドまたはポリペプチド（これらに限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布する１～１２の追加アミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド）を含む）を含むＣ末端要素；および
（３）前記ハイブリッドのＮ末端およびＣ末端要素に共有結合する任意選択の介在する化学構造であって、複数の態様において、この化学構造は、直鎖状に配置されたとき、２０アミノ酸長まで伸びる柔軟な鎖を形成する共有結合した原子のグループ。
複数の態様において、介在する化学構造は、５－アミノペンタン酸であるデルタ－アミノ吉草酸（および「ａｖａ」と称することがある）を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる。
複数の態様において、介在する化学構造は、ａｖａ、ａｌａ－ａｌａ－ａｌａ、ｇｌｙ－ｇｌｙ、またはａｖａ、ａｌａ－ａｌａ－ａｌａ、およびｇｌｙ－ｇｌｙの他の生物学的に受け入れられた機能的等価物を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなってもよい。
特定のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物は表２に開示されており、配列番号２３２－４５２および４５７－４５９を含む。
特定の態様において、ハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物の、ＭＨＣクラスＩＩおよび／またはクラスＩ分子（複数可）の抗原性ペプチド結合部位に結合する、ポリペプチドまたはペプチド模倣構造の形態のＭＨＣクラスＩＩおよび／またはＭＨＣクラスＩ提示エピトープ（複数の態様において、これは、本発明で開示される１または複数のペプチドまたはポリペプチド（これらに限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド）を含む）を含むＣ末端要素は、Ｎ末端アセチル基および／またはＣ末端アミノ基でキャップされてもよい。
Ｃ末端要素として、配列番号９、３４、４９、５４、５９、９４、９９、１０４、１０９、１４２、１４７、１８１、１９１、１９６、２１０－２１３、２１５－２１８、２２０、および２２３を有する本発明で開示のペプチドまたはポリペプチドを含む本発明で開示のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物の態様では、そのようなペプチドはＮ末端アセチル基およびＣ末端アミノ基でキャップされる。
Ｃ末端要素として、配列番号８９、１１４、１８６、２１４、１１９、２２１－２２２、および２２４を有する本発明で開示のペプチドまたはポリペプチドを含む本発明で開示のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物の態様では、そのようなペプチドはｎ末端アセチル基でキャップされ、ｃ末端でキャップされない。
配列番号２３７、２６２、２７７、２８３、２８７、３２２、３２７、３３２、３３７、３７０、３７５、４０９、４１９、４２４、４３８－４４１、４４３－４４６、４４８、および４５１のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物の態様では、Ｃ末端要素の開示されたペプチド配列は、Ｎ末端アセチル基およびＣ末端のアミノ基でキャップされる。
配列番号３１７、３４２、４１４、４４２、４４７、４４９、４５０、および４５２のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物の態様では、Ｃ末端要素の開示されたペプチド配列は、ｎ末端アセチル基でキャップされ、ｃ末端でキャップされない。
複数の態様において、本開示は、本開示の１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物を含むキメラまたは融合ポリペプチド組成物（複数の態様において、分離、合成、または組換えであり得る）に関する。複数の態様において、本開示のキメラまたは融合ポリペプチド組成物は、本開示の１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、および／またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物（例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号２－２２４のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を有する１または複数のペプチドまたはポリペプチドを含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド）が、異種ポリペプチドに接合、連結（例えば、フレーム内融合、化学結合、またはその他の結合）、および／または挿入されたものを含んでなる
複数の態様において、本開示の１または複数のペプチド、ポリペプチド、および／コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物は、異種ポリペプチドに挿入されてもよく、異種ポリペプチドのＣ末端（当技術分野で知られているように、リンカーを使用してまたは使用せずに）、および／またはＮ末端（当技術分野で知られているように、リンカーを使用してまたは使用せずに）に付加されてもよい。
上記キメラまたは融合ポリペプチド組成物の態様において、１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物は、異種ポリペプチドの隣接アミノ酸とともに、アミノ酸配列に接合、結合（例えばフレーム内融合、化学結合、またはその他の結合）、および／または挿入されたから構成されてもよいが、１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物は、異種ポリペプチドに全体として、接合、連結（例えば、フレーム内融合、化学結合、またはその他の結合）、および／または挿入されてもよい。
複数の態様において、本開示のキメラまたは融合ポリペプチド組成物は、本発明の開示のペプチド、ポリペプチド、および／コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物を含み、前記ペプチド、ポリペプチド、および／コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物は、異種ポリペプチドに自然に含まれない配列および／または異種ポリペプチドのその自然の位置に配置されない配列を有している。
例えば、複数の態様において、本開示の１または複数のペプチド、ポリペプチド、および／コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列が本開示の１または複数のペプチド、ポリペプチド、および／コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物を含まないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列に挿入されてよい（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列が本開示の１または複数のペプチド、ポリペプチド、および／コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物を含まないように変異している）、または本開示の１または複数のペプチド、ポリペプチド、および／コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列において、自然における位置ではない箇所に挿入されてもよい。
複数の態様において、本開示のペプチド、ポリペプチド、および／コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物のうちの１つ以上は、異種ポリペプチドに接合、連結（例えば、フレーム内融合、化学結合、またはその他の結合）、および／または挿入されてもよい。上述のキメラまたは融合ポリペプチド組成物の態様において、キメラまたは融合ポリペプチドは、分離、合成、または組換えであってもよい。
複数の態様において、本発明の開示は、本明細書に記載の１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、および／またはキメラまたは融合ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡを含む、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に関する。例えば、複数の態様において、本発明の開示は、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の割合で分布している１～１２の追加のアミノ酸を有する１または複数のペプチドまたはポリペプチドを含む、これ（ら）からなる、またはこれ（ら）から本質的になるペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸に関する。
さらに、本発明の開示は、表２のＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む、本明細書に開示されるＩｉ－ｋｅｙ構築物をコードする核酸に向けられ、配列番号２３２－４５２および４５７－４５９のものが含まれる。
複数の態様において、本開示は、記載されるような核酸を含む、発現ベクターなどのベクターに関する。複数の態様において、本開示は、本明細書に記載のような核酸を含んでなる発現カセット、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、または細胞に関する。複数の態様において、本開示は、記載されるようなベクターを含んでなる細胞またはワクチンに関する。複数の態様において、本開示は、本開示のベクターを含んでなる細胞に関する。
複数の態様において、本発明の開示は、医薬組成物に関し、医薬組成物は、本発明の開示のＴ細胞エピトープ化合物または組成物（例えば、以下の１つまたは複数：本明細書に開示されるポリペプチド；本明細書に開示されるコンカテマーペプチド；本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物；本明細書に開示されるキメラまたは融合ポリペプチド組成物；そのようなペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、または融合ポリペプチドのキメラ組成物をコードする核酸を含む本明細書に開示される核酸、発現カセット、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、本明細書に開示されるような細胞）、および薬学的に許容される担体、賦形剤、および／またはアジュバントが挙げられる。複数の態様において、前記ペプチドまたはポリペプチドをコードする１または複数の核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｍＲＮＡである。上記の医薬組成物の複数の態様において、本明細書に開示される組成物は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、または少なくとも１０００（その間のあらゆる値または範囲を含む）のペプチド、ポリペプチド、および／コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物である。
複数の態様において、本開示は、本開示のＴ細胞エピトープ化合物または組成物を含むワクチンであり、例えば、１または複数の、本明細書に開示されるポリペプチド；本明細書に開示されるコンカテマーペプチド；本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物；本明細書に開示されるキメラまたは融合ポリペプチド組成物；そのようなペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物またはキメラまたは融合ポリペプチド組成物をコードする核酸を含む、本明細書に開示される核酸；発現カセット、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、本明細書に開示されるような細胞；本明細書に開示されるような医薬組成物；または本明細書に記載のワクチン）および、任意選択で、キャリア、賦形剤、および／またはアジュバントを含む。
本開示はまた、対象において免疫化または免疫応答を誘導する方法に関し、前記方法は、本明細書に記載の１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、キメラまたは融合ポリペプチド、核酸、発現カセット、プラスミド、発現ベクター、組み換えウイルス、細胞医薬組成物、またはワクチンを、前記対象に投与することを含む。複数の態様において、対象はヒトである。複数の態様において、本開示は、対象において免疫化または免疫応答を誘導する方法に関し、前記対象に、本発明の開示のＴ細胞エピトープ化合物または組成物（例えば、１または複数の、本明細書に開示されるポリペプチド；本明細書に開示されるコンカテマーペプチド；本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物；本明細書に開示されるキメラまたは融合ポリペプチド組成物；そのようなペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、または本明細書に開示されるキメラまたは融合ポリペプチド組成物をコードする核酸など、本明細書に開示される核酸；発現カセット、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、本明細書に開示される細胞；本明細書に開示される医薬組成物；または本明細書に記載されるワクチン）を投与する工程を備える。複数の態様において、対象はヒトである。複数の態様において、本開示は、対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる関連疾患に対する免疫応答を刺激、誘導、および／または拡大する方法に関し、前記対象に本発明の開示のＴ細胞エピトープ化合物または組成物を投与する工程を備える。
本開示はまた、ヒトなどの対象における、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる関連疾患を治療および／または予防する方法に関し、前記対象に、本発明で開示のＴ細胞エピトープ化合物または組成物（例えば、１または複数の、本明細書に開示されるポリペプチド；本明細書に開示されるコンカテマーペプチド；本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物；本明細書に開示されるキメラまたは融合ポリペプチド組成物；本明細書に開示される、そのようなペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、またはキメラまたは融合ポリペプチド組成物をコードする核酸など、本明細書に開示される核酸；本明細書に開示される発現カセット、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、細胞；本明細書に開示される医薬組成物；または本明細書に説明されるワクチン）を投与する工程を備える。
理解されるべきこととして、本明細書に記載される本発明の開示のＴ細胞エピトープ化合物または組成物は、免疫応答を誘導するため、および／または対象にワクチン接種するために使用されてもよい。ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる関連疾患に対してワクチン接種することが特に有用である。
複数の態様において、本開示は、免疫応答を検出するための新規な方法、アッセイ、キットを提供し、複数の態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルスに対するＴ細胞応答（例えば、ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞応答）を含む細胞媒介免疫（ＣＭＩ）応答を検出するための新規な方法、アッセイ、キットを提供し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染または関連コロナウイルス感染を診断するための方法、アッセイ、キットを提供し、ならびに、高伝染性コロナウイルス２０１９疾患を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する疾患を診断するための方法、アッセイ、およびキットを提供する。本発明で開示されるアッセイ、方法、およびキットは、本明細書に開示される１または複数のＴ細胞エピトープ化合物および組成物（ペプチドまたはポリペプチドを含み、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、コンカテマーペプチドを含む）を使用するか、または含むものである。
複数の態様において、本開示は、Ｔ細胞または免疫系の他の細胞を含む対象からのサンプルを、本発明の開示の１または複数のペプチドまたはポリペプチドとインキュベートすることによって、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９または関連コロナウイルス感染に対するＣＭＩ応答を測定する方法に関する。複数の態様において、ＩＦＮ－γまたは他のサイトカインもしくは免疫エフェクター分子（複数可）の産生が、次いで検出される。免疫エフェクターの存在またはレベルは、次いで、対象の細胞媒介応答性のレベルを示す。好ましくは、サンプルは、抗原を含む適切な容器に採取された全血である。任意選択で、デキストロースなどの単糖がインキュベーション混合物に添加される。したがって、本開示の一態様は、対象におけるＣＭＩ応答を測定するための方法に関し、前記方法は、前記対象からサンプルを採取する工程であって、前記サンプルが、抗原による刺激後の免疫エフェクター分子を産生することができる免疫系の細胞を含んでいる工程と、前記サンプルを本開示の１または複数のペプチド又はポリペプチドとインキュベートする工程と、次いで、免疫エフェクター分子の存在又はレベルの上昇を測定する工程とを備え、前記免疫エフェクター分子の存在又はレベルが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又は関連コロナウイルス感染に対して細胞媒介免疫応答を行う前記対象の能力を示す、方法である。複数の態様において、免疫エフェクター分子の存在またはレベルの上昇は、前記免疫エフェクター分子の存在またはレベルが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連するコロナウイルス感染に対して細胞媒介免疫応答を行う前記対象の能力を示すものである。
複数の態様において、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルスのペプチド特異的Ｔ細胞をアッセイする方法に関し、この方法は、Ｔ細胞を含む液体を準備する工程、この液体に本発明の開示の１または複数のペプチドまたはポリペプチドを加える工程、サイトカイン放出を引き起こすために液体をインキュベートする工程、および放出したサイトカインを検出する工程を備える。好ましくは、本方法は、サイトカインに対する第一の固定化抗体を有する表面と接触しているＴ細胞を含む液体を準備する工程、前記液体にペプチドまたはポリペプチドを加える工程、サイトカインを分泌するように、ペプチドまたはポリペプチドに対してｉｎ ｖｉｖｏで予め感作されている任意のペプチドまたはポリペプチド特異的Ｔ細胞を生じる条件下で、得られた液体混合物をインキュベートする工程、および第一の固定化抗体に結合した分泌サイトカインを検出する工程、を備える。複数の態様において、細胞は、好ましくは、末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）である。それらは、好適には、ＣＯＶＩＤ－１９感染または関連するコロナウイルス感染に苦しんでいる、または苦しんでいたことが知られている患者から採取することができる。複数の態様において、使用される細胞は新鮮である。複数の態様において、アッセイは、ペプチドまたはポリペプチド特異的Ｔ細胞（例えば特定のペプチドまたはポリペプチドに対してｉｎ ｖｉｖｏで活性化または前感作されたＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞）を同定または定量するために使用される。複数の態様において、これらは、未刺激Ｔ細胞、すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養による分裂／分化をもたらす必要なしに、即時エフェクター機能を発揮することができる細胞である。対象となるペプチドまたはポリペプチドがこのような細胞に提示されると、細胞は種々のサイトカインを分泌し、そのうちの任意の１つがこのアッセイの目的のために選択されてもよい。複数の態様において、選択されるサイトカインは、インターフェロン－γ（ＩＦＮ γ）である。
複数の態様において、本開示は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（または関連コロナウイルス）Ｔ細胞応答（複数の態様においてＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含むことができる）を検出する方法を提供するものであり、この方法は、個体のＴ細胞集団を本発明の開示のペプチドまたはポリペプチド（前記ペプチドまたはポリペプチドの１つ以上は、ペプチドを認識するＴ細胞受容体に結合する類似体によって置換されてもよい）と接触させる工程、およびＴ細胞集団のＴ細胞がペプチドを認識するか否かを決定する工程を備える。
複数の態様において、本開示は、宿主におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルス感染、または宿主のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルスへの曝露を診断する方法を提供し、それには（ｉ）宿主からのＴ細胞集団を、本開示の１または複数のペプチドまたは類似体、および／また前記ペプチドのいずれかを認識するＴ細胞受容体に結合できる類似体に接触させる工程、および（ｉｉ）前記Ｔ細胞集団のＴ細胞が前記ペプチドおよび／または類似体を認識するか否かを決定する工程を備える。
本開示は、以下の図を参照することで、よりよく理解され得る。
図１は、２０１９－ｎＣｏＶのエンベロープ（配列番号１）、メンブレン（配列番号２）、スパイク（配列番号３）のアミノ酸配列を示している。 図２Ａは、ｅｘ ｖｉｖｏ免疫リコール応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ナイーブ個体と経験個体とを区別し、異なるＣＯＶＩＤ－１９免疫型を示す。 図２Ｂは、ｅｘ ｖｉｖｏ免疫リコール応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ナイーブ個体と経験個体とを区別し、異なるＣＯＶＩＤ－１９免疫型を示す。 図３Ａは、本開示のポリペプチドを使用するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２経験者において、強いｅｘ ｖｉｖｏ免疫リコール応答が認められる、または認められ得ることを示す図である。 図３Ｂは、本開示のポリペプチドを使用するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２経験者において、強いｅｘ ｖｉｖｏ免疫リコール応答が認められる、または認められ得ることを示す図である。 図４は、本発明で開示のポリペプチドが、自然のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染におけるｅｘ ｖｉｖｏ免疫リコール反応を刺激することを示す図である。 図５Ａは、本発明の開示のポリペプチドが、培地で増殖後ナイーブおよびＣＯＶＩＤ－１９回復期のドナーにおいて、高いＩＦＮ－γ応答を刺激する、または刺激し得ることを示している。 図５Ｂは、本発明の開示のポリペプチドが、培地で増殖後ナイーブおよびＣＯＶＩＤ－１９回復期のドナーにおいて、高いＩＦＮ－γ応答を刺激する、または刺激し得ることを示している。 図６Ａは、ナイーブおよびＣＯＶＩＤ－１９回復期ドナーにおいて、培地で増殖後、本発明で開示のポリペプチドが低頻度エピトープ特異的Ｔ細胞を刺激するか、または刺激し得ることを示している。 図６Ｂは、ナイーブおよびＣＯＶＩＤ－１９回復期ドナーにおいて、培地で増殖後、本発明で開示のポリペプチドが低頻度エピトープ特異的Ｔ細胞を刺激するか、または刺激し得ることを示している。 図７は、ナイーブおよびＣＯＶＩＤ－１９回復期ドナーにおいて、培地で増殖後、本発明で開示のポリペプチドが低頻度エピトープ特異的Ｔ細胞を刺激することを示している。 図８Ａ～Ｄは、予測されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔ細胞エピトープが、ＣＯＶＩＤ－１９回復期のドナーにおいてｅｘ ｖｉｖｏで抗原性を有するが、健康なドナーでは抗原性を有しないことを示している。（図８Ａ）回復期及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２未感染ドナー（ナイーブ）を、我々の３２の予測エピトープからなる全ペプチドプールで刺激し、ＩＦＮγ産生細胞をフルオロスポットアッセイで測定した。開いている円は、低用量再刺激に対する応答を示す。横線は、ＳＦＣ／１０６脾細胞＝２５における陽性基準を示す。（図８Ｂ）個々のペプチドに対するＩＦＮγ応答も評価し、個々のドナーにおける応答の幅、（図８Ｃ）コホート内の固有のペプチドに対する応答の頻度（縦線は各コホートの２０％を示す）、および（図８Ｄ）ＩＦＮγ産生エピトープ特異的細胞の頻度で示す応答の深さ（縦線はＳＦＣ／１０６脾細胞＝２５での陽性基準を示す）が確認された。＊＝ｐ＜０．０５． 図８Ａと同様である。 図８Ａと同様である。 図８Ａと同様である。 図９Ａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２経験者が、ｅｘ ｖｉｖｏで可変の免疫リコール応答を示すことを示す。（図９Ａ）個々のペプチドに対する有意な応答（ソース抗原ごとに結合）は、共生のドナー内の３つの異なる免疫型コホートを同定する（ドナーの表記；＊＝肺炎、＊＊＝入院、非ＩＣＵ）。（図９Ｂ）性別による累積Ｔ細胞応答と年齢の相関。 図９Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２経験者が、ｅｘ ｖｉｖｏで可変の免疫リコール応答を示すことを示す。（図９Ａ）個々のペプチドに対する有意な応答（ソース抗原ごとに結合）は、共生のドナー内の３つの異なる免疫型コホートを同定する（ドナーの表記；＊＝肺炎、＊＊＝入院、非ＩＣＵ）。（図９Ｂ）性別による累積Ｔ細胞応答と年齢の相関。 図１０Ａ～Ｄは、抗原特異的Ｔ細胞増殖が、ＣＯＶＩＤ－１９回復者における応答を増加させ、健常ドナーにおける既存のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫を発見することを示す。（図１０Ａ）回復者及びナイーブドナーのＰＢＭＣを、８日間の増殖培養後に全ペプチドプールで再刺激し、ＩＦＮγ産生細胞をフルオロスポットアッセイにより測定した。横線は、ＳＦＣ／１０６脾細胞＝２５における陽性基準を示す。（図１０Ｂ）個々のドナーにおける応答の幅を同定し、個々のペプチドに対するＩＦＮγ応答を評価した、（図１０Ｃ）コホート内の固有のペプチドに対する応答の頻度（縦線は各コホートの２０％を示す）、（図１０Ｄ）ＩＦＮγ産生エピトープ特異的細胞の頻度によって示す応答の深さ（縦線は、ＳＦＣ／１０６脾細胞＝２５での陽性基準を示す）を確認した。 図１０Ａと同様である。 図１０Ａと同様である。 図１０Ａと同様である。 図１１Ａ～Ｄは、ＥＰＶ－ＣｏＶ－１９免疫化が、ＨＬＡ－ＤＲ３トランスジェニックマウスにおいて強い１型偏向Ｔ細胞応答を刺激することを示す。ブースト後８日目に、マウスの脾臓細胞を分離し、エピトープ特異的リコール応答についてアッセイした。細胞を、二重ＩＦＮγ／ＩＬ－４フルオロスポットプレートにプレーティングし、そして４８時間、ペプチドプールで再刺激した。（図１１Ａ）代表的な画像およびスポット数を、両方について示す。（図１１Ｂ）ＩＦＮγ ＳＦＣカウントを、１ｘ１０６ 細胞に正規化し、バックグラウンド減算によって調整し、そして（図１１Ｃ）ＩＦＮγ ＳＩ指数を、バックグラウンドに対する個々の再刺激反復の倍数変化を計算することによって、決定した。（図１１Ｃ）ＩＬ－４ ＳＦＣ及び（図１１Ｄ）ＳＩを同様に計算した。横線は、それぞれ、ＳＦＣ＞２５およびＳＩ＞５の陽性基準を示す。（図１１Ｄ）報告されたＩＦＮγおよびＩＬ－４刺激指数から、各再刺激複製物のＩＦＮγ：ＩＬ－４比を計算して、免疫応答の全体的な偏りをモデル化し、すべてのワクチン接種動物において鋭い１型偏向表現型を同定した。横線は、タイプ１／タイプ２応答の４０倍、１００倍、１０００倍の偏向を示す。（ｎ＝１７，＊＝ｐ＜０．０５，＊＊＝ｐ＜０．０１，＊＊＊＝ｐ＜０．００１） 図１１Ａと同様である。 図１１Ａと同様である。 図１１Ａと同様である。 図１１Ａと同様である。 図１１Ａと同様である。 図１２Ａ～Ｅは、ＥＰＶ－ＣｏＶ－１９免疫化が、ＨＬＡ－ＤＲ３トランスジェニックマウスにおいて１型偏向メモリーＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を刺激することを示している。脾臓細胞は、ブレフェルディンＡ及びモネンシンの存在下で、ワクチンとマッチしたペプチドプールで６時間再刺激された。インキュベーション後、細胞を表面マーカーで染色し、固定・透過処理し、細胞内マーカーで染色し、マーカーの発現をフローサイトメトリーで記録した。メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＦＮγ、ＩＬ－４、またはＩＬ－５産生（親Ｔ細胞集団における頻度およびサイトカインの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の両方）について評価された。（図１２Ａ）タイプ１およびタイプ２偏向エピトープ特異的メモリーＴ細胞集団の代表的な画像を示す。（図１２Ｂ）エピトープ特異的応答の倍数増加（ＣＤ２８刺激対照を超える）は、ＩＦＮγのワクチン特異的誘導を同定するが、（図１２Ｃ）ＩＬ－４、または（図１２Ｄ）ＩＬ－５の誘導ではない。（図１２Ｅ）ＩＣＳ生成データから、ペプチド再刺激によるＩＦＮγまたはＩＬ－４および／またはＩＬ－５産生細胞の倍増を計算し、タイプ１対タイプ２応答の比を使用して、ワクチン接種動物におけるＴｈ偏向モデルおよびＴｃ偏向モデルを作成した。（ｎ＝１７，＊＝ｐ＜０．０５，＊＝ｐ＜０．０１，＊＊＊＝ｐ＜０．００１） 図１２Ａと同様である。 図１２Ａと同様である。 図１２Ａと同様である。
本開示は、一般に、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる関連疾患に対する使用のための、ワクチンを含むＴ細胞エピトープに基づく化合物および組成物に関する。本開示は、免疫原性(immunogenic)のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、およびキメラまたは融合ポリペプチド、ならびにそれらの使用、特に医薬組成物およびワクチン組成物における使用に関するものである。本開示はまた、核酸、ベクター（発現ベクターを含む）、およびペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、およびキメラまたは融合ポリペプチドを発現する細胞、ならびにその用途に関する。本開示のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、及びキメラ又は融合ポリペプチドは、より具体的には、ＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩ ＭＨＣ分子のリガンドであると予測されるアグレトープ、並びにＭＨＣクラスＩ及び／又はクラスＩＩ分子についてＴ細胞（ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞を含む）によって認識されると予測されるエピトープから構成されている。本開示は、ヒト用のワクチン、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染及びＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる関連疾患を含むコロナウイルス感染に対するワクチン接種のためのワクチンを製造するのに特に適している。
エピトープ特異的なＴ細胞を利用して、特定の抗原に対する免疫を誘導することが可能である。この発見は、特定の病原体や感染症に対する治療レジメンや抗原特異的な治療法の設計に影響を与えるものである。本開示とデータは、自然感染で認識され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する既存の免疫を刺激する、特定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔ細胞エピトープに関するものである。これらのエピトープは、Ｔ細胞指向性ワクチン開発のための優れた候補である。保存されたエピトープからなるＴ細胞標的ワクチンは、組織常在のメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、および抗体反応をサポートするメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の産生により、感染部位で迅速、有効、長期の免疫を提供することができると考えられる。２００９年のＨ１Ｎ１パンデミックにおけるインフルエンザワクチン接種では、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞が、新規ヘマグルチニンに対するナイーブＢ細胞応答をサポートできることが示された。Ｔ細胞指向型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンは、既存の交差防御抗体の不存在下で、新規ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる急性感染を早期に制御する強固なＣＤ４＋Ｔ細胞メモリーを生成することが可能であろう。
したがって、本開示のＴ細胞エピトープ化合物または組成物［１または複数の、配列番号４－２２４および４５４－４５６および／またはその断片および変異体、ならびに任意選択で配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる配列を有する、１または複数のペプチドまたはポリペプチド（複数の態様において、前記ポリペプチドは、分離、合成、または組み替えられていてもよい）；本明細書に開示されるコンカテマーペプチド；表２（配列番号２３２－４５２および４５７－４５９）に開示されている特定のハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物を含む、本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物；本明細書に開示されるキメラまたは融合ポリペプチド組成物；そのようなペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、またはキメラまたは融合ポリペプチド組成物をコードしている核酸；本明細書に開示されるそのようなペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、またはキメラまたは融合ポリペプチド組成物を発現する、発現カセット、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、または細胞；本明細書に開示されるワクチン組成物または製剤；および／または本明細書に開示される医薬組成物または製剤］を含むＴ細胞エピトープの投与は、任意選択で、薬剤（抗ウイルス剤など）、タンパク質または不活化もしくは弱毒性生ウィルスと併用して、免疫応答（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む病原体、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる関連疾患に対する免疫応答）を誘発しうる。本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物を含むＴ細胞エピトープは、免疫系を免疫に向かって意図的に操作するために使用することができる。
例えば、本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物は、免疫原性Ｔ細胞の選択的な係合（engagement）および活性化において有用である。特定の内在性のＴ細胞（複数の態様において、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む）は、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などの病原体およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫を誘発するために、または免疫応答を誘発するために、係合、活性化、および／または投与できることが、本明細書で実証される。本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物を使用して内在性のＴ細胞を選択的に活性化することにより、本明細書では、かかるＴ細胞エピトープ化合物および組成物を使用して、対象における、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスに対する免疫応答、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる関連疾患に対する免疫応答を刺激、誘導、および／または拡大できることが示され、その結果、対象における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる関連疾患を治療及び／又は予防する方法において使用することができることが示されている。
（定義）
本開示の理解をさらに容易にするために、多数の用語および語句を以下に定義する。特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての用語（技術用語及び科学用語を含む）は、本開示が属する技術分野における通常の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書で定義されるような用語は、関連する技術及び本開示の文脈における意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書で明示的にそのように定義されない限り、理想化されたまたは過度に形式的な意味で解釈されないことがさらに理解されよう。
本明細書で提供される範囲は、その範囲内のすべての値の略記であると理解される。例えば、１～２５の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または小範囲、ならびに、前述の整数間のすべての介在小数値、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９のような前記整数の間のすべての小数値が含まれると理解される。副次的な範囲に関しては、範囲のいずれかの端点から伸びる「囲まれたサブレンジ」が特に企図されている。例えば、１～２５の例示的な範囲の入れ子状の副次的な範囲は、一方向に１～５、１～１０、１～１５、及び１～２０、又は他方向に２５～２０、２５～１５、２５～１０、及び２５～５から構成されてもよい。
本明細書において、「生体サンプル」という用語は、生物の組織、細胞、分泌物などの任意のサンプルを指す。
本明細書において、「医学的状態」という用語は、治療および／または予防が望ましい１つ以上の身体的および／または心理的症状として現れるあらゆる状態または疾患を含むが、これに限定されるものではなく、以前に確認された疾患および新たに確認されたその他の障害も含まれる。
本明細書で使用する場合、「免疫応答」という用語は、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および上記細胞または肝臓で産生される可溶性高分子（抗体、サイトカイン、補体を含む）の協調作用を意味し、これにより、人体から、癌細胞、転移性腫瘍細胞、悪性黒色腫、侵入した病原体（ウイルスを含む）、病原体に感染した細胞または組織、あるいは自己免疫または病的炎症の場合には正常なヒト細胞または組織を選択的に損傷、破壊、または排除させる。複数の態様において、免疫応答は、測定可能な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答（例えば、免疫原性ポリペプチドを発現するウイルスに対する）または抗体の産生などの測定可能なＢ細胞応答、（例えば、免疫原性ポリペプチドに対する）を含む。当業者であれば、ペプチド、ポリペプチド、または関連組成物に対する免疫応答が生じたかどうかを判定するための様々なアッセイを知るであろうが、それには本明細書の実施例に開示するような実験およびアッセイの利用が含まれる。様々なＢリンパ球およびＴリンパ球アッセイは、ＥＬＩＳＡ、ＥｌｉＳｐｏｔアッセイ、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイ、例えばクロム放出アッセイ、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を用いた増殖アッセイ、テトラマーアッセイおよび他のサイトカイン生成アッセイなど、よく知られたものである。参照により本明細書に組み込まれるBenjaminiら(1991)を参照されたい。
本明細書で使用される場合、本開示のＴ細胞エピトープ化合物または組成物（１または複数の、配列番号４－２２４および４５４－４５６および／またはその断片および変異体、ならびに任意選択で配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる配列を有する、１または複数のペプチドまたはポリペプチドを含むペプチドまたはポリペプチド；１または複数の、配列番号２３２－４５２および４５７－４５９および／またはその断片および変異体を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるコンカテマーポリペプチドを含む、本明細書に開示されるコンカテマーペプチド；表２（配列番号２３２－４５２および４５７－４５９）に開示されているハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物を含む本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物；本明細書に開示されるキメラまたは融合ポリペプチド組成物；本明細書に開示される、かかるペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、またはキメラまたは融合ポリペプチド組成物をコードする核酸；本明細書に開示されるようなそのようなペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、またはキメラまたは融合ポリペプチド組成物を発現する発現カセット、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、または細胞；ワクチン組成物または製剤、および／または本明細書に開示されるような医薬組成物または製剤）を含む組成物の「有効量」、「治療有効量」等の用語が、所望の治療および／または予防効果を達成するに十分な量、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる関連疾患などの、治療されている疾患に関連する症状および／または根本原因の予防、または減少をもたらす量、またはウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の複製または感染性を阻害するために測定可能である量、である。対象に投与される本開示の組成物の量は、疾患の種類および重症度、ならびに個体の特性、例えば一般的な健康、年齢、性別、体重および薬物に対する耐性に依存するであろう。また、疾患の程度、重症度、および種類に依存するだろう。当業者は、これらおよび他の要因に応じて、適切な投与量を決定することができるであろう。本発明のＴ細胞エピトープ化合物および組成物はまた、互いに組み合わせて、または１つ以上の追加の治療化合物と組み合わせて投与することができる。
本明細書で使用される「抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性」、「抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチド」、「抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２化合物および組成物」などは、本明細書のＴ細胞エピトープ化合物および組成物（ポリペプチド、コンカテマーポリペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、キメラまたは融合タンパク質、核酸、プラスミド、ベクター、医薬組成物、ワクチン、および本開示の他の組成物）は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を有し、したがって、侵入したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを抑制、制御、および／または殺傷することが可能であることを意味している。例えば、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性とは、本発明で開示される治療用Ｔ細胞エピトープ化合物および組成物が、複数の態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する細胞性（ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答）または液性免疫応答）を刺激、誘導、および／または拡大できること、および／または対象における関連疾患；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＩＦＮγ応答（例えば、ＰＭＢＣなどのリンパ球、またはエフェクターＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞による）を刺激、誘発、拡大できること、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製または感染性を阻害できること、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫誘導できることを意味する。
複数の態様において、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を有する本開示のＴ細胞エピトープ化合物または組成物は、任意の値またはその間の範囲を含む少なくとも約５％～約５０％、少なくとも約１０％～約６０％、少なくとも約３０％～約７０％、少なくとも約４０％～約８０％、または少なくとも約５０％～約９０％、またはそれ以上、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の罹患から生じる疾患症状を低減することになる。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性は、血清の抗体価、例えば、ＥＬＩＳＡ及び／又は血清中和アッセイ分析による、及び／又はワクチン接種チャレンジ評価による方法など、当業者に知られている様々な実験及びアッセイによって決定することができ、本実施例に開示する実験及びアッセイの利用を含む。
本明細書で使用する場合、「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、７－３０アミノ酸の長さで、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子に特異的に結合し、特定のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用できるＭＨＣリガンドまたはタンパク質決定子を意味する。本明細書で使用する場合、Ｔ細胞と係合することが知られているか決定されている（例えば予測されている）Ｔ細胞エピトープでは、用語「係合する(engage)」、「係合(engagement)」などは、ＭＨＣ分子（例えばヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子）と結合したとき、Ｔ細胞エピトープがＴ細胞のＴＣＲと相互作用してＴ細胞を活性化することができることを意味している。一般に、Ｔ細胞エピトープは直線的であり、特定の三次元的特性を発現しない。Ｔ細胞エピトープは、変性溶媒の存在に影響されない。Ｔ細胞エピトープと相互作用する能力は、インシリコ法（De Groot AS et al., (1997), AIDS Res Hum Retroviruses, 13(7):539-41; Schafer JR et al., (1998), Vaccine, 16(19):1880-4; De Groot AS et al., (2001), Vaccine, 19(31):4385-95; De Groot AR et al.,(2003), Vaccine, 21(27-30):4486-504、これらは全て、参照によりその全体をここに組み入れられる）によって予測することができる。
本明細書で使用される場合、用語「Ｔ細胞エピトープクラスター」は、約４－約４０の間のＭＨＣ結合モチーフを含むポリペプチドを指す。特定の実施形態では、Ｔ細胞エピトープクラスターは、約５～約３５の間のＭＨＣ結合モチーフ、約８～約３０の間のＭＨＣ結合モチーフ；及び約１０～約２０の間のＭＨＣ結合モチーフを含む。
本明細書で使用する場合、用語「免疫刺激性Ｔ細胞エピトープポリペプチド」は、免疫応答、例えば、体液性、Ｔ細胞ベース、または自然免疫応答を誘導することができる分子を指す。
本明細書で使用する場合、「制御性Ｔ細胞」、「Ｔｒｅｇ」等の用語は、細胞－細胞接触及び抑制性サイトカイン産生を含む様々な異なるメカニズムを通じて、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）誘導、増殖、及び／又はサイトカイン産生の抑制又はダウンレギュレーションを含む免疫エフェクター機能を抑えるＴ細胞の亜集団のことをいう。複数の態様において、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇは、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３を含むがこれらに限定されない特定の細胞表面マーカーの存在により特徴付けられる。複数の態様において、活性化時に、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞は、ＩＬ－１０及び／又はＴＧＦβを含むがこれらに限定されない、免疫抑制性サイトカイン及びケモカインを分泌する。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇはまた、標的細胞の直接殺傷を通じて免疫抑制効果を発揮することがあり、グランザイムＢおよびパーフォリンを含むがこれらに限定されないエフェクター分子の活性化時の発現によって特徴付けられる。複数の態様において、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇは、ＣＤ８、ＣＤ２５、および活性化時にＦｏｘＰ３を含むがこれらに限定されない、特定の細胞表面マーカーの存在によって特徴付けられる。複数の態様において、活性化すると、制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、および／またはＴＧＦβを含むがこれらに限定されない免疫抑制性サイトカインおよびケモカインを分泌する。複数の態様において、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇはまた、標的細胞の直接殺傷を通じて免疫抑制効果を発揮することができ、活性化時に、グランザイムＢ及び／又はパーフォリンを含むがこれに限定されないエフェクター分子の発現によって特徴付けられる。
本明細書において、「Ｂ細胞エピトープ」という用語は、抗体と特異的に結合することができるタンパク質決定子を意味する。Ｂ細胞エピトープは通常、アミノ酸や糖の側鎖のような化学的に活性な分子の表面グループからなり、通常、特定の三次元構造特性、および特定の電荷特性を有する。コンフォメーション型エピトープとノンコンフォメーション型エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合は失われるが後者への結合は失われないという点で区別される。
本明細書で使用する「対象」という用語は、免疫応答が惹起される任意の生体を意味する。対象という用語は、ヒト、チンパンジーなどの類人猿やサル類などの非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマなどの家畜、イヌ、ネコなどの家畜哺乳類、マウス、ラット、モルモットなどのげっ歯類を含む実験動物などを含むが、それらに限定されるものではない。なお、本用語は、特定の年齢や性別を示すものではない。従って、雌雄を問わず、成人、新生児、胎児も対象とすることを意図している。
本明細書で使用する場合、「主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）」、「ＭＨＣ分子」、「ＭＨＣタンパク質」または「ＨＬＡタンパク質」という用語は、特に、タンパク質抗原のタンパク質分解切断から生じ、潜在的なＴ細胞エピトープを代表するペプチドと結合し、それを細胞表面に運び、そこで特定の細胞、特に細胞障害性Ｔ－リンパ球またはＴ－ヘルパー細胞に提示できるタンパク質であると理解できる。ゲノムの主要組織適合性複合体は、遺伝子領域を含み、その細胞表面で発現する遺伝子産物が内因性抗原および／または外来抗原の結合と提示に重要であり、したがって免疫学的プロセスを制御する。主要組織適合性複合体は、異なるタンパク質、すなわちＭＨＣクラスＩの分子とＭＨＣクラスＩＩの分子をコードする２つの遺伝子群に分類される。この２つのＭＨＣクラスの分子は、異なる抗原源に特化している。ＭＨＣクラスＩの分子は、例えばウイルスタンパク質や腫瘍抗原のような内因性に合成された抗原を提示する。ＭＨＣクラスＩＩの分子は、外来性のタンパク質抗原、例えばバクテリアの生成物などを提示する。２つのＭＨＣクラスの細胞生物学特性と発現様式は、これらの異なる役割に適応している。クラスＩのＭＨＣ分子は重鎖と軽鎖からなり、約８～１１アミノ酸、通常は９～１０アミノ酸のペプチドと結合し、このペプチドが適切な結合モチーフを有する場合、細胞傷害性Ｔリンパ球に提示することができる。クラスＩのＭＨＣ分子が結合するペプチドは、内因性タンパク質抗原に由来する。クラスＩのＭＨＣ分子の重鎖は、好ましくはＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃのモノマーであり、軽鎖はβ－２－ミクログロブリンである。クラスＩＩのＭＨＣ分子は、α鎖とβ鎖からなり、約１２～２５アミノ酸のペプチドと結合して、このペプチドが適切な結合モチーフを有する場合、Ｔ－ヘルパー細胞に提示することができる。クラスＩＩのＭＨＣ分子が結合するペプチドは、通常、細胞外の外来性タンパク質抗原に由来する。α鎖およびβ鎖は、特にＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱおよびＨＬＡ－ＤＰのモノマーである。
本明細書では、「ＭＨＣ複合体」という用語は、ＨＬＡリガンドとして知られるポリペプチドの特定のレパートリーと結合し、当該リガンドを細胞表面に輸送することができるタンパク質複合体を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「ＭＨＣリガンド」は、１または複数の特定のＭＨＣアレルに結合することができるポリペプチドを意味する。用語「ＨＬＡリガンド」は、用語「ＭＨＣリガンド」と交換可能である。ＭＨＣ／リガンド複合体をその表面に発現する細胞は、「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）と称される。同様に、本明細書で使用する場合、用語「ＭＨＣ結合ペプチド」は、ＭＨＣクラスＩ及び／又はＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドに関連する。ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には８～１０アミノ酸長であるが、より長い又は短いペプチドが有効である場合もある。ＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には１０～２５アミノ酸長であり、特に１３～１８アミノ酸長であるが、より長いまたは短いペプチドもまた有効である場合がある。
本明細書で使用する「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」という用語は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）などの細胞表面に提示されるＭＨＣ／リガンド複合体の特定のレパートリーに係合することができるＴ細胞によって発現されるタンパク質複合体を意味する。
本明細書で使用する「ＭＨＣ結合モチーフ」という用語は、特定のＭＨＣアレルへの結合を予測するタンパク質配列中のアミノ酸のパターンを意味する。
本明細書において、「ＡＡＹ切断モチーフ」という用語は、ペプチドまたはタンパク質のプロテアソームによる切断を促進し、抗原処理に関連するトランスポーターのペプチドまたはタンパク質への結合を促進し、および／またはペプチドまたはタンパク質内の特定の部位におけるプロテアソーム分解を増加させることができる「アラニン－アラニン－チロシン」の配列のみからなる短いアミノ酸モチーフのことを意味する。
本明細書において、「免疫シナプス」という用語は、所定のＴ細胞エピトープが細胞表面ＭＨＣ複合体とＴＣＲの両方に同時に結合することによって形成されるタンパク質複合体を意味する。
「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマーを意味し、特定の長さを意味するものではない。したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれる。本明細書において、ポリペプチドは、組換え細胞および非組換え細胞から分離された場合には細胞性物質を実質的に含まないとき、または化学的に合成された場合には化学前駆体または他の化学物質を含まないときに、「分離」または「精製」されていると言われる。但し、本開示のペプチドまたはポリペプチド（例えば、１または複数の、配列番号４－２２４および４５４－４５６またはその断片および変異体を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるポリペプチド、複数の態様において分離、合成または組み換えであってもよい）は、別のポリペプチド（例えば、異種ポリペプチド）に接合、連結、または挿入することができ、細胞内で通常は結合しておらず、依然として「分離」または「精製」される。さらに、本開示の１または複数のＴ細胞エピトープは、別のポリペプチドに結合、連結又は挿入することが可能であり、ここで、本開示の前記１または複数のＴ細胞エピトープが前記ポリペプチドに自然に含まれず、及び／又は本開示の前記１または複数のＴ細胞エピトープが前記ポリペプチドのその自然の位置に位置していない別のポリペプチドに結合、連結又は挿入することが可能である。ポリペプチドが組換え生産される場合、それはまた、培養液（培養培地）を実質的に含まなくてもよく、例えば、培養液は、ポリペプチド調製物の体積の約２０％未満、約１０％未満、または約５％未満を占める。
本明細書で使用する「コンカテマー」ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも２つのペプチドまたはポリペプチドが連結された一連のものを意味する。このような連結は、ストリング・オブ・ビーズ形状であってもよい。
複数の態様において、コンカテマーポリペプチドの各ペプチドまたはポリペプチドは、任意選択で、１または複数のリンカーによって間隔を空けてもよく、さらなる複数の態様において、中性リンカーを用いてもよい。「リンカー」という用語は、エピトープまたはワクチン配列のような２つのペプチドドメインの間に付加されて、前記ペプチドドメインを接続するペプチドを指す。複数の態様において、リンカー配列は、本発明の開示の各１または複数の同定されたペプチド間の立体障害を低減するために使用され、よく翻訳され、本発明の開示の各１または複数の同定されたポリペプチドの処理を支援または可能にする。
複数の態様において、リンカーは、免疫原性配列要素をほとんどまたは全く有さないことが好ましい。複数の態様において、コンカテマーポリペプチドの各ペプチドまたはポリペプチドは、任意に、切断感受性部位であってもよい１または複数のリンカーを、それらのＮ－末端および／またはＣ－末端に隣接して有していてもよい。このようなコンカテマーペプチドにおいて、２つ以上のペプチドは、それらの間に切断感受性部位を有していてもよい。あるいは、２つ以上のペプチドは、互いに直接、または切断感受性部位でないリンカーを介して連結されていてもよい。
本明細書において、「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府または州政府の規制機関によって承認または認可されたもの、あるいはヒトを含む動物への使用について米国薬局方またはその他の一般に認められた薬局方に収載されているものを指すものとする。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤」などは、薬剤とともに対象に投与することができ、その薬理活性を破壊せず、薬剤の治療量を送達するのに十分な用量で投与した場合に無毒な賦形剤、担体、または希釈剤のことを指す。
本書では、「目的別コンピュータプログラム」という用語は、特定の目的（典型的には、特定の生データを分析し、特定の科学的疑問に答えること）を満たすように設計されたコンピュータプログラムを指す。
本明細書で使用する場合、「ｚスコア」という用語は、ある要素が平均から何標準偏差であるかを示す。ｚスコアは、以下の式から算出することができる。ｚ＝（Ｘ－μ）／σ；ここで、ｚはｚスコア、Ｘは要素の値、μは母平均、σは標準偏差である。
本書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、内容が明確に示していない限り、「少なくとも１」を含む複数形を含むことを意図している。「または」とは、「および／または」を意味する。本明細書で使用される場合、用語「及び／又は」及び「１または複数」は、関連する列挙された項目の任意の及び全ての組合せを含む。例えば、「本開示の１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６」に関する用語「１または複数」は、配列番号４－２２４および４５４－４５６のいずれか１つおよびすべての組合せが含まれる。用語「またはその組み合わせ」は、前述の要素のうちの少なくとも１つを含む組み合わせを意味する。
本明細書では、以下の略語および／または頭字語が使用されている。
ＡＡＹ：アラニン－アラニン－チロシン開裂モチーフ
ＭＨＣ：主要組織適合性複合体
２０１９－ｎＣｏＶ：２０１９年新規コロナウィルス
「変異体」ペプチドまたはポリペプチド（変異体Ｔ細胞エピトープを含む）では、１または複数の置換、欠失、挿入、逆位、融合、および切断、またはこれ（ら）のいずれかの組み合わせによってアミノ酸配列が異なっていてもよい。複数の態様において、変異体ペプチドまたはポリペプチド（変異体Ｔ細胞エピトープを含む）は、前記変異体がＭＨＣ結合性および／またはＴＣＲ特異性、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持することを条件に、１または複数の置換、削除、挿入、逆位、融合、切断またはこれ（ら）の任意の組み合わせによりアミノ酸配列が異なり得る。
本開示はまた、本発明のペプチドまたはポリペプチドの断片を含む。本開示はまた、本明細書に記載のＴ細胞エピトープの変異体の断片を包含し、ただし、前記断片および／または変異体は少なくとも部分的にＭＨＣ結合性および／またはＴＣＲ特異性を保持し、および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持することを前提とする。
本開示はまた、本発明で開示の、１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物がその一部であるキメラまたは融合ポリペプチド（複数の態様において、分離、合成、または組換えであってよい）を提供する。複数の態様において、キメラまたは融合ポリペプチド組成物は、異種ポリペプチドに連結された、本発明で開示の１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物を含んでいる。先に述べたように、用語「異種ポリペプチド」は、１または複数のＴ細胞エピトープ（例えば、１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６）が異種ポリペプチドに対して異種であるか、またはこれに自然に含まれないことを意味することが意図される。
複数の態様において、本発明で開示の１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、および／またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物は、異種ポリペプチドに挿入されてもよく（例えば、変異誘発または当該技術分野において他の既知の手段によって）、異種ポリペプチドのＣ末端に（当該技術分野において既知のようにリンカーを使用してもしなくても）付加されても、および／またはＮ末端に（当該技術分野において既知のようにリンカーを使用してもしなくても）付加されてもよい。例えば、変異誘発によるタンパク質工学は、部位特異的変異誘発技術、または当技術分野で公知の他の変異誘発技術を使用して行うことができる（例えば、James A. Brannigan and Anthony J. Wilkinson., 2002,タンパク質engineering 20 years on. Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, 964-970; Turanli-Yildiz B. et al., 2012,タンパク質Engineering Methods and Applications, intechopen.comを参照でき、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
複数の態様において、キメラまたは融合ポリペプチドは、異種ポリペプチドに作動的に連結された本発明で開示の１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、および／またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物を含んでいる。「作動的に連結された」とは、ポリペプチド（例えば、本開示の１または複数のＴ細胞エピトープポリペプチド）および異種タンパク質が、インフレームで融合されているか、化学的に連結されているか、さもなければ結合されていることを示す。複数の態様において、本発明で開示されるキメラまたは融合ポリペプチドは、分離、合成、または組換えであってもよい
「分離」ペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド（例えば、分離Ｔ細胞活性化Ｔ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープポリペプチド）、またはキメラまたは融合ポリペプチドは、それを自然に発現する細胞から精製する、それを発現するように改変した細胞から精製する（組み換え）、または周知のタンパク質合成法により合成されてもよい。一実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物は、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術によって製造される。例えば、ペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、またはキメラまたは融合ポリペプチドをコードする核酸分子を発現ベクターにクローニングし、発現ベクターを宿主細胞に導入し、ペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、またはキメラまたは融合ポリペプチドを宿主細胞で発現させる。その後、標準的なタンパク質精製技術を用いた適切な精製スキームによって、ペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、またはキメラまたは融合ポリペプチドを細胞から分離することができる。
本開示の目的のために、本発明の開示のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、またはキメラまたは融合ポリペプチドは、例えば、Ｄ－立体異性体などの内在性のアミノ酸の改変形態、非内在性のアミノ酸；アミノ酸類似体；および擬態物質を含むことができる。さらに、複数の態様において、本発明で開示のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、またはキメラまたは融合ポリペプチドは、本発明で開示のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物のレトロインベルソペプチドを含むことができる。または本発明の開示のキメラまたは融合ポリペプチドを含み得るが、本発明の開示の前記ペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、またはキメラまたは融合ポリペプチドの少なくとも一部がＭＨＣ結合性および／またはＴＣＲ特異性を保持し、および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持することを条件とする。
本明細書に記載されたものと類似又は同等の任意の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料について説明する。本開示の他の特徴、目的、及び利点は、本明細書及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。本明細書及び添付の特許請求の範囲において、単数形は、文脈上明らかに他に指示されない限り、複数の参照語を含む。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野における通常の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で引用されたすべての文献は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されるのと同じ程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
［ポリペプチド、コンカテマーポリペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、キメラまたは融合ポリペプチド］
複数の態様において、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムからエンコードされたタンパク質）由来のペプチドまたはポリペプチド鎖を含む新規クラスのＴ細胞エピトープ（これは、分離、合成、または組換えであり得る）およびハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物を提供する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質としては、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープ、膜、スパイク、ヌクレオカプシド、ＯＲＦ３ａ、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７ａ、ＯＲＦ８、ＯＲＦ１０、ＯＲＦ１ａｂ非構造タンパク質２（ＮＳＰ２）、ＯＲＦ１ａｂ非構造タンパク質３（ＮＳＰ３）、ＯＲＦ１ａｂ非構造タンパク質４（ＮＳＰ４）、ＯＲＦ１ａｂ３Ｃ様タンパク質分解酵素、ＯＲＦ１ａｂ非構造タンパク質６（ＮＳＰ６）、ＯＲＦ１ａｂ非構造タンパク質７（ＮＳＰ７）、ＯＲＦ１ａｂ非構造タンパク質８（ＮＳＰ８）、ＯＲＦ１ａｂ非構造タンパク質９（ＮＳＰ９）、ＯＲＦ１ａｂ非構造タンパク質１０（ＮＳＰ１０）、ＯＲＦ１ａｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＯＲＦ１ａｂヘリカーゼ、ＯＲＦ１ａｂ ３’－５’エキソヌクレアーゼ、ＯＲＦ１ａｂ ＲＮＡ分解酵素、ＯＲＦ１ａｂ ２’Ｏ－リボースメチルトランスフェラーゼタンパク質が挙げられる。本開示のＴ細胞エピトープは、そのソースタンパク質の既知の変異体間で高度に保存されている（例えば、既知の変異体の１０％超に存在する）。実施例においてより詳細に説明するように、本開示のＴ細胞エピトープは、そのソースタンパク質の既知の変異体、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｔａｘｉｄ：２６９７０４９）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１（ｔａｘｉｄ：６９４００９）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ（ｔａｘｉｄ：１３３５６２６）及びヒトホストから分離されヒトＣｏＶ（ｔａｘｉｄ：１１１３７、４４３２３９、２７７９４４及び３１６３１）の抗原配列の間で、高度に保存されており、国立バイオテクノロジー情報センターでＧｅｎＢａｎｋより取得された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エピトープは、Ｔ細胞エピトープマッピングのために、２０１９年１２月から２０２０年１２月までにゲノムが完全に解読された分離株から得られた配列間で比較された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１ （ＧｅｎＢａｎｋ ｉｄ： ＭＮ９０８９４７）を参照株として選択した。
実施例にさらに記載されているように、本開示のＴ細胞エピトープは、ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（商標）分析によって同定された少なくとも１つの推定Ｔ細胞エピトープを含んでなる。ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（商標）は、ＥｐｉＶａｘ（プロビデンス、プロビデンス、ロードアイランド州）により開発された独自のコンピュータアルゴリズムであり、タンパク質配列を、推定Ｔ細胞エピトープの存在についてスクリーニングするために使用される。このアルゴリズムでは、ＭＨＣ分子に結合する９量体および１０量体のペプチドを予測するためのマトリックスを使用する。各マトリックスは、ポケットプロファイル法に類似するが同一ではない方法によって解明されたアミノ酸結合親和性に関連する位置特異的係数に基づいている（Sturniolo, T. et al.、Nat. Biotechnol. 17:555-561, 1999）。入力配列は、例えば、各フレームがそれぞれ８または９アミノ酸だけ最後に重なる９量体フレームまたは１０量体にパースされる。次に、得られたフレームの各々は、変異ペプチドを形成し、非変異ペプチドは、ＭＨＣクラスＩアレル（例えば、限定するものではないが、ＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂアレル）およびＭＨＣクラスＩＩアレル（例えば、限定するものではないが、ＨＬＡ－ＤＲＢ１アレル）に関して予測結合親和性についてスコア付けされる。生のスコアは、ランダムに生成されたペプチドの大規模なサンプルのスコアに対して正規化される。得られた「Ｚ」スコアは正規分布で、アレル間で直接比較可能である。得られた「Ｚ」スコアが報告される。複数の態様では、理論的には任意のサンプルの上位５％である１．６４以上のアレル特異的ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（商標）Ｚスコアを持つ任意の９量体または１０量体ペプチドは、推定Ｔ細胞エピトープとみなされる。
実施例でさらに説明されているように、推定Ｔ細胞エピトープのクラスターを含むペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイを検証する際に陽性となる可能性がより高くなる。態様では、最初のＥｐｉＭａｔｒｉｘ（商標）分析の結果は、Ｃｌｕｓｔｉｍｅｒ（商標）アルゴリズムとして知られる第２の独自のアルゴリズムを使用して、推定Ｔ細胞エピトープ「クラスター」の存在についてさらにスクリーニングされる。Ｃｌｕｓｔｉｍｅｒ（商標）アルゴリズムは、任意のアミノ酸配列内に含まれ、統計的に異常に多くの推定Ｔ細胞エピトープを含むサブ領域を特定する。典型的なＴ細胞エピトープ「クラスター」は、長さが約９から約３０アミノ酸であり、複数のアレルと複数の９量体フレームにわたる親和性を考慮すると、約４から約４０の推定Ｔ細胞エピトープを含むことができる。
表１は、本開示された配列番号４－８および２１０のＴ細胞エピトープを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥＮＶＥＬＯＰＥ：エンベロープ（配列番号１）からのＭＨＣクラスＩＩクラスターの選択の概要、本開示された配列番号６－９３および２１１－２１３のＴ細胞エピトープを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜（配列番号２）からのＭＨＣクラスＩＩクラスターセレクションの概要、配列番号６４－２０９と２１４－２２４と４５４－４５６のＴ細胞エピトープを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥ：スパイク（配列番号３）からのＭＨＣクラスＩＩクラスターセレクションの概要を開示する。表１は、本開示の配列番号４－２２４および４５４－４５６の各Ｔ細胞エピトープのクラスター配列（太字）、クラスタースコア（フランクなし）、クラスＩ ＭＨＣのＥｐｉＭａｔｒｉｘヒット数（ヒット数は、配列内で見つかったＥｐｉＭａｔｒｉｘ Ｚスコア１．６４以上または上位５％の数である）、およびクラスＩＩ ＭＨＣのＥｐｉＭａｔｒｉｘヒット数（ヒット数は、配列内で見つかったＥｐｉＭａｔｒｉｘ Ｚスコア１．６４以上または上位５％の数である）を開示する。推定Ｔ細胞エピトープのスコアを合計し、候補エピトープクラスターの長さ及び同じ長さのランダムに生成されたクラスターの期待スコアに基づく補正係数を減算することにより、総計（aggregate）ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（商標）スコアを特定した各エピトープクラスターは計算される。１０を超えるＥｐｉＭａｔｒｉｘ（商標）クラスタースコアは有意であると考えられる。複数の態様において、本開示のＴ細胞エピトープは、Ｔ細胞エピトープクラスターとして知られるパターンを形成する複数の推定Ｔ細胞エピトープを含む。
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推定Ｔ細胞エピトープはまた、実施例においてさらに詳細に説明するように、ＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘを使用してヒトプロテオームとの交差保存性についてスクリーニングされた。ＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘシステム（ＥｐｉＶａｘ、プロビデンス、ロードアイランド州）は、宿主プロテオームとの交差保存性についてペプチド配列をスクリーニングするのに有用である。ＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘは、ペプチドクラスターと宿主ゲノムまたはプロテオームとの間の交差反応性の可能性を、それらの推定ＭＨＣリガンドにおけるＴＣＲに面した残基の保存性に基づいて予測するアルゴリズムである。ＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘアルゴリズムは、まず与えられたタンパク質配列に含まれる予測エピトープをすべて考慮し、各予測エピトープを構成するアグレトープとエピトープに分割する。次に、各配列をホストタンパク質のデータベースに対してスクリーニングする。ＭＨＣに面したアグレトープが一致し（すなわち、入力ペプチドとその宿主側のペプチドのアグレトープが同じＭＨＣアレルに結合すると予測される）、全く同じＴＣＲに面したエピトープを持つペプチドが返される。ＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘホモロジースコアは、免疫寛容に偏っていることを示唆している。タンパク質治療薬の場合、自己のヒトエピトープと治療薬のエピトープが交差保存性されることで、その候補がヒトの免疫系に許容される可能性が高くなる可能性がある。ワクチンの場合、ヒトのエピトープと抗原性エピトープとの間の交差保存は、そのような候補が免疫カモフラージュを利用し、それによって免疫応答を回避し、効果のないワクチンとなることを示すかもしれない。宿主が例えばヒトの場合、推定上のＨＬＡリガンドにおけるＴＣＲに面した残基の保存性に基づいて、ペプチドクラスターはヒトゲノムやプロテオームに対してスクリーニングされる。次に、ペプチドはＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘホモロジースコアを用いてスコアリングされる。複数の態様において、２．５未満または３．０未満（および特定の態様においてさえ２．０未満）のＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘホモロジースコアを有するペプチドは、低い耐性原性の可能性を示し、ワクチンに有用である可能性がある。複数の態様において、３．０を超えるＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘホモロジースコアを有するペプチドは、高い寛容性の可能性を示し、ワクチンには有用でない可能性があり、複数の態様において、本開示のＴ細胞エピトープ化合物と組成物、方法、およびアッセイ／キットから除外される場合がある。表Ｉは、本開示される配列番号４－２２４および４５４－４５６のＴ細胞エピトープのＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘ相同スコアを開示し、これらはすべて２．５を十分に下回っている。
複数の態様において、また実施例にさらに詳細に記載されているように、本開示のＴ細胞エピトープは、高病原性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ並びに低病原性コモンコロナウイルス（ＣＣＣ）ＯＣ４３、ＨＫＵ１、ＮＬ６３、及び２２９Ｅを含むヒトに感染する関連コロナウイルス間で高度に保存されている。これらのウイルスに過去にさらされたことで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染時やワクチン接種時にリコールできるＴ細胞記憶が確立されている可能性がある。同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染およびワクチン接種により、これらのウイルスまたはまだ出現していないコロナウイルスに将来感染した際の反応に影響を与えることができるＴ細胞記憶が確立される。
交差反応性の可能性のある配列を同定するために、ＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘアルゴリズム（例えば、表５８Ａ及び表５８Ｂ）を使用して、ヒトに感染するコロナウイルスとの相同性について選択したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エピトープのＴＣＲ面をスクリーニングした。選択された膜およびエンベロープ配列はすべて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶと同一のＴＣＲ面パターンを共有していた。選択されたスパイククラスターの半分はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に独特であり、残りの半分はＳＡＲＳ－ＣｏＶとともに保存されている。また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ以外のウイルスと交差保存性されているクラスターは３つだけであった。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の経験のない人々には既存のＴ細胞免疫があるという報告を考慮し、我々はすべてのＴＣＲ面位置で１００％の同一性を要求することを緩和した。ＴＣＲ相互作用に広く関与している２つの位置（５位と８位）を固定すると、ＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘは、選択されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクおよび膜クラスターの交差保存性状況を拡大予測した。選択されたスパイククラスターのほとんどは、これらの基準によって、ヒトに感染するコロナウイルスのサブセットで保存されていた。交差反応性のある選択された配列の残りは、高病原性ベータコロナウイルス間、または高病原性ベータコロナウイルスと低病原性ベータコロナウイルス間で交差保存されている。
上記の判断基準によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に固有なクラスターは３つだけであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶと単独で保存されているものはなかった。単一膜で選択されたクラスターは、高病原性β－コロナウイルスとヒトのサブセットに感染するコロナウイルスに交差保存性されていた。大多数の人はＳＡＲＳ－ＣｏＶとＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染していないため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＣＣＣのみの間の交差保存性も探索した。選択された３２のペプチドのうち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なものは２つだけである。１８クラスター（５６．６％）がＯＣ４３、ＨＫＵ１、ＮＬ６３、２２９Ｅ間で交差保存性されており、１２クラスター（３７．５％）がこれら４つのＣＣＣの少なくとも１つで交差保存性されている。
複数の態様において、本開示のＴ細胞エピトープは、少なくとも１つ、好ましくは２つ以上の共通のＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩアレルに少なくとも中程度の親和性（例えば、複数の態様において、溶解性のＨＬＡ分子に基づくＨＬＡ結合アッセイにおいて、＜１０００μＭ ＩＣ５０、＜５００μＭ ＩＣ５０、＜４００μＭ ＩＣ５０、＜３００μＭ ＩＣ５０、または＜２００μＭ ＩＣ５０）で結合する。複数の態様において、本開示のＴ細胞エピトープは、ＨＬＡの少なくとも１つ、他の態様では２つ以上のアレルで細胞によって細胞表面に提示されることが可能である。本明細書において、エピトープＨＬＡ複合体は、エピトープＨＬＡ複合体に特異的なＴＣＲを有し、対象中で循環しているＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されてもよい。複数の態様において、エピトープ－ＨＬＡ複合体の認識は、適合するＴ細胞を活性化させ、活性化サイトカイン（例えば、ＩＦＮγなどのエフェクターサイトカイン）およびケモカインを分泌させることができる。
複数の態様において、本開示のＴ細胞エピトープ化合物または組成物は、本明細書に開示される１または複数のペプチドまたはポリペプチドを含む。複数の態様において、本開示は、１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６、またはそれらの断片もしくは変異体を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはポリペプチドに関する。
「本質的に～からなる」という表現は、本開示によるペプチドまたはポリペプチドが、配列番号４－２２４および４５４－４５６、又はその断片若しくは変異体のいずれかによる配列のペプチドまたはポリペプチドに加え、追加のアミノ酸又は残基を含む意味であり、ここで、前記追加のアミノ酸又は残基は、必ずしもＭＨＣリガンドとして機能するペプチド又はポリペプチドの一部を形成しない、ペプチドのいずれかの末端及び／又は側鎖に存在し得、それらがＴ細胞エピトープとして機能するペプチドの活性を大幅に損ねない限り、ペプチドの末端に存在してもよい。
複数の態様において、本発明の開示のペプチドまたはポリペプチドは、中性（非荷電）または塩の形態のいずれかであり得、グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸化などの改変を含まなくてもよいし、含んでもよい。複数の態様において、本発明の開示のペプチドまたはポリペプチドは、ｎ－末端アセチル基および／またはｃ－末端アミノ基でキャップされてもよい。
複数の態様において、配列番号９、３４、４９、５４、５９、９４、９９、１０４、１０９、１４２、１４７、１８１、１９１、１９６、２１０－２１３、２１５－２１８、２２０、および２２３を有する本開示のペプチドまたはポリペプチドは、ｎ末端アセチル基およびｃ末端アミノ基でキャッピングされる。複数の態様において、配列番号８９、１１４、１８６、２１４、１１９、２２１－２２２、および２２４を有する本発明の開示のペプチドまたはポリペプチドは、ｎ末端アセチル基でキャップされ、ｃ末端ではキャップされない。
再び、表１は、本開示の配列番号４－２２４および４５４－４５６の各Ｔ細胞エピトープのクラスタ配列（太字）、クラスタスコア（フランクなし）、クラスＩ ＭＨＣのＥｐｉＭａｔｒｉｘヒット数（ヒット数は、配列内で見つかったＥｐｉＭａｔｒｉｘ Ｚスコア１．６４以上または上位５％の数である）、およびクラスＩＩ ＭＨＣのＥｐｉＭａｔｒｉｘヒット数（ヒット数は、配列内で見つかったＥｐｉＭａｔｒｉｘ Ｚスコア１．６４以上または上位５％の数である）を開示する。
複数の態様において、本発明の開示は、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、ならびに任意に、配列番号４－２４４のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチドに関する。
複数の態様において、本発明の開示は、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、コアアミノ酸配列のＣ末端および／またはＮ末端に１～１２の追加のアミノ酸（隣接アミノ酸）を有する１または複数のペプチドまたはポリペプチドを含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる、コアアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドに関し、ここで、これ（ら）の隣接アミノ酸の全体の数は、１～１２、１～３、２～４、３～６、１～１０、１～８、１～６、２～１２、２～１０、２～８、２～６、３～１２、３～１０、３～８、３～６、４～１２．４～１０、４～８、４～６、５～１２、５～１０、５～８、５～６、６～１２、６～１０、６～８、７～１２、７～１０、７～８、８～１２、８～１０、９～１２、９～１０または１０～１２であり、隣接アミノ酸は、Ｃ末端およびＮ末端に対して任意の比率で分配されてもよい（例えば、すべての隣接アミノ酸は、一方の末端に加えられてもよく、またはアミノ酸は、両方の末端に等しくまたは任意の他の比率で加えられてもよい）。
複数の態様において、本発明の開示は、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片および変異体）、および、任意選択で、Ｃ末端および／またはＮ末端に１～１２の延長された追加のアミノ酸を有する１または複数のペプチドまたはポリペプチドを含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるコア配列を有するペプチドまたはポリペプチドに関し、これ（ら）の隣接アミノ酸の全体数は１～１２であり、このとき、これ（ら）のアミノ酸は１～３、２～４、３～６、１～１０、１～８、１～６、２～１２、２～１０、２～８、２～６、３～１２、３～１０、３～８、３～６、４～１２、４～１０、４～８、４～６、５～１２、５～１０、５～８、５～６、６～１２．６～１０、６～８、７～１２、７～１０、７～８、８～１２、８～１０、９～１２、９～１０、または１０～１２であり、ここで、隣接アミノ酸はＣ末端およびＮ末端に任意の割合で分布することができ（例えばすべての隣接アミノ酸は一方の末端に付加してもよく、アミノ酸は両方の末端に等しく、または他の任意の割合で付加してもよく）、但し、隣接アミノ酸を有するポリペプチドが依然として、前記隣接アミノ酸を有しない前記ポリペプチドコア配列と同じＨＬＡ分子に結合できる（すなわち、ＭＨＣ結合性を保持する）。
複数の態様において、前記隣接アミノ酸を有する前記ポリペプチドは、前記隣接アミノ酸を有しない前記ポリペプチドコア配列と、同じＨＬＡ分子に結合する（すなわち、ＭＨＣ結合性を保持する）ことができ、かつ／または同じＴＣＲ特異性を保持し、かつ／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持することが可能である。
複数の態様において、延長部（複数可）は、ペプチドまたはポリペプチドの生化学的特性（限定されないが例えば、溶解性または安定性）を改善するため、またはペプチドの効率的なプロテアソーム処理の可能性を改善するために機能し、設計されてもよい。
複数の態様において、本開示のポリペプチドは、分離、合成、および／または組換えであってもよく、グリコシル化、付加化学基などの転写後改変を含んでいてもよい。
複数の態様において、前記隣接アミノ酸配列は、内在性タンパク質（例えば、参照株として選択したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１ （ＧｅｎＢａｎｋ ｉｄ： ＭＮ９０８９４７）に見られるような）において、そこに含まれるペプチドまたはポリペプチドのフランク（隣接部位）であってもよい。複数の態様において、前記隣接アミノ酸配列は、例えば、後述するように、内在性のタンパク質中のペプチドまたはそれに含まれるポリペプチドへのフランク（隣接部位）であってもよい。
・２０１９－ｎＣｏＶのＥＮＶＥＲＯＰＥ（エンベロープ）のアミノ酸配列（配列番号１）中、ペプチドまたはポリペプチドは、配列番号４－８および２１０のアミノ酸配列を有する１または複数のペプチドまたはポリペプチド（および／またはその断片および変異体）を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるコア配列を有し、任意にＣ末端および／またはＮ末端に１～１２の追加のアミノ酸を有し、１～１２のアミノ酸の延長は配列番号４－８および２１０のアミノ酸配列に隣接するものである。
・２０１９－ｎＣｏＶのＭＥＭＢＲＡＮＥ（膜）のアミノ酸配列（配列番号２）中、ペプチドまたはポリペプチドは、配列番号９－６３および２１１－２１３のアミノ酸配列を有する１または複数のペプチドまたはポリペプチド（および／またはその断片および変異体）を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるコア配列を有し、任意にＣ末端および／またはＮ末端に１～１２の追加のアミノ酸を有し、１～１２のアミノ酸の延長は配列番号９－６３および２１１－２１３のアミノ酸配列に隣接するものである。
・２０１９－ｎＣｏＶのＳＰＩＫＥ（スパイク）のアミノ酸配列（配列番号３）中、ペプチドまたはポリペプチドは、配列番号６４－２０９および２１４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列を有する１または複数のペプチドまたはポリペプチド（および／またはその断片および変異体）を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるコア配列を有し、任意にＣ末端および／またはＮ末端に１～１２の追加のアミノ酸を有し、１～１２のアミノ酸の延長は配列番号６４－２０９および２１４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列に隣接するものである。
複数の態様において、本明細書に記載される前記隣接アミノ酸配列は、ＭＨＣ安定化領域として機能し得る。より長いペプチドの使用は、患者細胞による内因性プロセシングを可能にし、より効果的な抗原提示およびＴ細胞応答の誘導につながる可能性がある。複数の態様において、本発明の開示のペプチドまたはポリペプチドは、分離され、組換えられ、および／または合成されてもよい。複数の態様において、ペプチドまたはポリペプチドは、中性（非荷電）または塩の形態のいずれかであり得、グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸化などの改変を含まなくてもよいし、含んでもよい。複数の態様において、本発明の開示のペプチドまたはポリペプチドは、ｎ－末端アセチル基および／またはｃ－末端アミノ基でキャップされてもよい。
複数の態様において、本発明の開示は、表１の１または複数のクラスＩＩポリペプチド（「クラスター」）、（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、表１のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸に関する。
複数の態様において、本発明の開示は、配列番号２１０、９、２１１、３４、２１２、２１３、４９、５４、５９、２１４、２１５、８９、９４、９９、２１６、１０４、１０９、１１４、２１７、２１８、１４２、１４７、２１９、２２０、２２１、２２２、１８１、１８６、１９１、１９６、２２３および２２４のアミノ酸配列（および／またはその断片および変異体）、ならびに任意選択で、配列番号２１０、９、２１１、３４、２１２、２１３、４９、５４、５９、２１４、２１５、８９、９４、９９、２１６、１０９、１１４、２１７、２１８、１４２、１４７、２１９、２２０、２２１、２２２、１８１、１８６、１９１、１９６、２２３および２２４のＣ末端および／またはＮ末端に、任意の割合で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる、１または複数のクラスＩＩポリペプチド（「クラスター」）に関する。
複数の態様において、本発明の開示は、配列番号２１８、１９、２１６、２１２、８９、９４、３４、１４２、２２１、５４、１８６、５９、２１４、２２３、２１９、１９１、２２４、２２２、２１０、４９、１０４、２１７、２１３、２１５、１０９、２２０、１４７、１８１、１９６、９、１１４および９９のアミノ酸配列（および／またはその断片および変異体）、ならびに任意選択で、配列番号２１８、１９、２１６、２１２、８９、９４、３４、１４２、２２１、５４、１８６、５９、２１４、２２３、２１９、１９１、２２４、２２２、２１０、４９、１０４、２１７、２１３、２１５、１０９、２２０、１４７、１８１、１９６、９、１１４および９９のＣ末端および／またはＮ末端に、任意の割合で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる、１または複数のクラスＩＩポリペプチド（「クラスター」）に関する。
複数の態様において、本発明の開示は、配列番号２１０、９、１９、３４、２１２、４４、４９、５４、５９、２１４、８９、９４、９９、２１６、１０４、１０９、１１０、１１４、２１８、１４２、１４７、２２０、２２１、１７６、１８１、１８６、１９１、１９６、２２３、２２４、４５４、４５５および４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片および変異体）、ならびに任意選択で、配列番号２１０、９、１９、３４、２１２、４４、４９、５４、５９、２１４、８９、９４、９９、２１６、１０４、１０９、１１０、１１４、２１８、１４２、１４７、２２０、２２１、１７６、１８１、１８６、１９１、１９６、２２３、２２４、４５４、４５５および４５６のＣ末端および／またはＮ末端に、任意の割合で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる、１または複数のクラスＩＩポリペプチド（「クラスター」）に関する。
複数の態様において、本発明の開示は、配列番号４－２２４および４５４－４５６（および／またはその断片）のいずれか１つと、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドに関し、当該ポリペプチドは依然として同一のＨＬＡ分子に結合できる（すなわち、ＭＨＣ結合性を保持する）、および／または同じＴＣＲ特異性を保持する、および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持する。
複数の態様において、本開示は、本発明で開示される１または複数のポリペプチドまたはペプチド（限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド）、およびこれに連結、融合、または結合（例えば、フレーム内で融合、化学的に結合、または他の方法で結合）している追加のペプチドまたはポリペプチドを含む、コンカテマーポリペプチドまたはペプチドに関する。
そのような追加のペプチドまたはポリペプチドは、本発明で開示される１または複数のポリペプチドまたはペプチドであってもよく、あるいは、関心のある追加のペプチドまたはポリペプチドであってもよい。複数の態様において、コンカテマーペプチドは、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上の本発明で開示されたペプチドまたはポリペプチドで構成されている。
他の複数の態様において、コンカテマーペプチド又はポリペプチドは、１０００以上、１０００以下、９００以下、５００以下、１００以下、７５以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、又は１００以下のペプチドエピトープを含む。さらに他の複数の実施形態では、コンカテマーペプチドは、３～１００、５～１００、１０～１００、１５～１００、２０～１００、２５～１００、３０～１００、３５～１００、４０～１００、４５～１００、５０～１００、５５～１００、６０～１００、６５～１００、７０～１００、７５～１００、８０～１００、９０～１００、５～５０、１０～５０、１５～５０，２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０、１００～１５０、１００～２００、１００～３００、１００～４００、１００～５００、５０～５００、５０～８００、５０～１０００、または１００～１０００の本発明で開示されるペプチドまたはポリペプチドが連結、融合または結合しているものである。コンカテマーポリペプチドの各ペプチドまたはポリペプチドは、任意に、切断感受性部位であってもよい１または複数のリンカーを、それらのＮ末端および／またはＣ末端に隣接して有していてもよい。
Ｃ末端要素のＮ末端上に含まれ得る、ＡＡＹ切断モチーフまたはポリＧＳリンカーを含む、そのような適切なリンカーおよび切断感受性部位は、当技術分野において既知である。
このようなコンカテマーペプチドにおいて、２つ以上のペプチドエピトープは、それらの間に、切断感受性部位として作用し得るリンカーを有していてもよい。あるいは、２つ以上のペプチドエピトープは、互いに直接、または切断感受性部位でないリンカーを介して接続されてもよい。
追加の適切なリンカーは、ハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物において後述するが、本発明で開示されるコンカテマーペプチドで使用されてもよい。複数の態様において、コンカテマーペプチドまたはポリペプチドは、中性（非荷電）または塩の形態のいずれかであってもよく、グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸化などの改変を含んでいても、含んでいなくてもよい。複数の態様において、本発明で開示のコンカテマーペプチドまたはポリペプチドは、ｎ末端アセチル基および／またはｃ末端アミノ基でキャップされてもよい。複数の態様において、そのようなリンカーは抗原的に中性であり、リンカーは、好ましくは、９のアミノ酸が線形に配列されたペプチジルバックボーンの長さ、またはそれ未満である。複数の態様において、リンカーの長さは、２個から８のアミノ酸が直線的に配列されたペプチドの骨格（ペプチジルバックボーン）の長さである。複数の態様において、スペーサーは、増強ハイブリッドペプチドの他の異なる要素に対して、任意の空間的に異なる様式で水素結合することができない。
複数の態様において、そして抗原的に中性なリンカー要素に関して、アミノ酸の代わりに様々な化学基をリンカーとして組み込んでもよく、そのような例は、米国特許第５，９１０，３００号明細書に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。複数の態様において、リンカーは、ヘテロ原子によって最適に中断された脂肪族鎖、例えばＣ２－Ｃ６ アルキレン、または＝Ｎ－（ＣＨ２）２－６－Ｎ＝で構成されてもよい。あるいは、スペーサーは、例えば疎水性、親油性、脂肪族およびアリール－脂肪族配列の交互単位で構成されていてもよく、任意にＯ、Ｎ、Ｓなどのヘテロ原子で中断されている。スペーサーのこのような成分は、好ましくは次のクラスの化合物から選ばれる：ステロール、アルキルアルコール、アルキル機能が変化したポリグリセリド、アルキルフェノール、アルキルアミン、アミド、疎水性のポリオキシアルキレン等である。その他、疎水性のポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシ酸、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコールポリヒドロキシ酪酸などが挙げられる。また、リンカーは、ポリプロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ペンタメチレンなどの短い脂肪族鎖を酸素原子で分離して繰り返し含んでいてもよい。
可能なリンカーとして使用することができる追加のペプチジル配列は、米国特許第５，８５６，４５６号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態では、リンカーは、開裂を受ける化学基を内部に組み込んでいる。限定されないが、このような化学基は、プロテアーゼによって、化学基によって、または触媒モノクローナル抗体によって触媒される開裂のために設計されてもよい。
プロテアーゼ感受性化学基の場合、トリプシン標的（カチオン性側鎖を有する２つのアミノ酸）、キモトリプシン標的（疎水性側鎖を有する）、およびカテプシン感受性（Ｂ、ＤまたはＳ）が好適に使用される。本明細書において、「トリプシン標的」という用語は、トリプシン及びトリプシン様酵素によって認識されるアミノ酸の配列を表すために使用される。キモトリプシン標的」という用語は、本明細書では、キモトリプシンおよびキモトリプシン様酵素によって認識されるアミノ酸の配列を記述するために使用される。さらに、触媒モノクローナル抗体の化学的標的、および他の化学的に切断された基は、ペプチド合成、酵素触媒、および有機化学全般の技術に精通する者によく知られており、日常的な実験方法を使用して、ハイブリッド構造に設計し、合成することができる。
複数の態様において、本発明の開示のコンカテマーポリペプチドは、ＥｐｉＡｓｓｅｍｂｌｅｒシステム（ＥｐｉＶａｘ）を使用して製造される。ＥｐｉＡｓｓｅｍｂｌｅｒシステムは、重複するエピトープを免疫原性コンセンサス配列（ＩＣＳ）に組み立てるのに有用である。ＥｐｉＡｓｓｅｍｂｌｅｒは、病原体と集団のカバレッジのバランスを最適化するアルゴリズムである。ＥｐｉＡｓｓｅｍｂｌｅｒは、ＣｏｎｓｅｒｖａｔｒｉｘおよびＥｐｉＭａｔｒｉｘによって生成された配列からの情報を使用して、高度に免疫原性のコンセンサス配列を形成する。複数の態様において、本開示は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を有するコンカテマーポリペプチドを提供する。
先に記載したように、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性とは、本発明で開示された治療用Ｔ細胞エピトープ化合物および組成物が、複数の態様において：対象において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２および／または関連疾患に対する免疫応答（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する細胞性（ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答）または液性免疫応答）を刺激、誘発、拡大することができる；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＩＦＮγ応答（例えば、ＰＭＢＣなどのリンパ球、またはエフェクターＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞による）を刺激、誘発、拡大することができる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製または感染性を阻害することができる、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫誘導ができる、ことを意味する。
複数の態様において、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を有する本開示のＴ細胞エピトープ化合物または組成物は、任意の値またはその間の範囲、少なくとも約５％～約５０％、少なくとも約１０％～約６０％、少なくとも約３０％～約７０％、少なくとも約４０％～約８０％、または少なくとも約５０％～約９０％またはそれ以上でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジから生じる疾患症状を低減することができるだろう。
ここでも、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性は、血清の抗体価、例えば、ＥＬＩＳＡ及び／又は血清中和アッセイ分析による、及び／又はワクチン接種チャレンジ評価による方法など、当業者に知られているように、種々の実験及びアッセイによって決定することができ、本実施例に開示する実験及びアッセイの利用が含まれる。
複数の態様において、本発明の開示のコンカテマーポリペプチドは、分離され、組換えられ、および／または合成されてもよい。複数の態様において、コンカテマーペプチドまたはポリペプチドは、中性（非荷電）または塩の形態のいずれかであり得、グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸化などの改変を含まなくてもよいし、含んでもよい。複数の態様において、本発明の開示のコンカテマーペプチドまたはポリペプチドは、ｎ－末端アセチル基および／またはｃ－末端アミノ基でキャップされてもよい。
複数の態様において、本開示の１または複数のペプチドまたはポリペプチド（限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片および変異体）、ならびに任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のＣ末端および／またはＮ末端に、任意の割合で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる、ペプチドまたはポリペプチド；ならびに本明細書に開示するコンカテマーポリペプチドおよびハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物）は、異種ポリペプチドに接合、連結（例えば、フレーム内で融合、化学的に結合、または他の方法で結合）、および／または挿入されてもよい。
先に記載したように、本発明の開示の１または複数のＴ細胞エピトープに関して、用語「異種ポリペプチド」は、本発明の開示の１または複数のＴ細胞エピトープが異種ポリペプチドに異種であるか、または自然に含まれないことを意味することが意図される。
複数の態様において、異種ポリペプチドは、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、モノ特異的抗体、二重特異的抗体、グリコシル化抗体、Ｆｃ改変抗体、または抗体－薬物複合体；異なるクラスまたはサブクラスの抗体（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ分子）またはその抗原特異的抗体断片（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、閉立体構造多特異抗体、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、ダイアボディ）が含まれるが、それだけに限らない）であってもよい。
複数の態様において、本発明で開示される１または複数のポリペプチドは、異種ポリペプチドに挿入されてもよく（例えば、組換え技術、突然変異誘発、または当該技術分野において他の既知の手段によって）、異種ポリペプチドのＣ末端に（当該技術分野において既知のように、リンカーの使用とともにまたは使用せずに）付加されてもよく、および／またはＮ末端（当該技術分野において既知のように、リンカーの使用とともにまたは使用せずに）に付加されてもよい。
複数の態様において、本発明で開示される１または複数のポリペプチドは、米国特許第７，４４２，７７８号、米国特許第７，６４５，８６１号、米国特許第７，６５５，７６４号、米国特許第７，６５５，７６５号、および／または米国特許第７，７５０，１２８号（その各々は、参照によりその全体がここに組み込まれる）に開示されるようにＦｃドメイン中のアミノ酸に挿入または置換されてもよい。
例えば、変異誘発によるタンパク質工学は、部位特異的変異誘発技術、または当該技術分野で公知の他の変異誘発技術を使用して行うことができる（例えば、James A. Brannigan and Anthony J. Wilkinson., 2002,タンパク質engineering 20 years on.Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, 964-970; Turanli-Yildiz B. et al., 2012,タンパク質Engineering Methods and Applications, intechopen.com,これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
複数の態様において、キメラまたは融合ポリペプチドは、異種ポリペプチドに作動的に（operatively linked）連結された、１つまたは複数の本開示のポリペプチドを含んでなる。「作動的に連結された」とは、本発明で開示される１または複数のポリペプチドと異種タンパク質とが、インフレームで融合されているか、化学的に連結されているか、または他の方法で結合されていることを示す。例えば、複数の態様において、本発明で開示される１または複数のポリペプチドが、米国特許第８，００８，４５３号、米国特許第９，１１４，１７５号、および／または米国特許第１０，１８８，７４０号（これらの各々は、参照によりその全体がここに組み込まれる）に開示されるように、Ｆｃドメイン内の１または複数の内部共役部位に共有結合されてもよい。
複数の態様において、本開示の１または複数のペプチドまたはポリペプチド（限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、ならびに任意に配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド）は、異種ポリペプチドの隣接アミノ酸とともに、アミノ酸配列に接合、連結（例えば、フレーム内融合、化学結合、または他の方法で結合）、および／または挿入されてもよいが、本発明で開示の１または複数のペプチドまたはポリペプチドは、異種ポリペプチドに全体として、接合、連結（例えば、フレーム内融合、化学結合、または他の方法で結合）、および／または挿入されてもよい。
複数の態様において、本開示は、１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６含む配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含むポリペプチド（複数の態様においては、分離、合成または組み換えであってよい）に関し、ここで、前記１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６は、ポリペプチド中に自然に含まれない、および／またはポリペプチド中のその自然の位置に配置されない。
例えば、複数の態様において、本開示の１または複数のペプチド、ポリペプチド、および／コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列に挿入されてもよく、ここで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は、本開示の１または複数のペプチド、ポリペプチド、および／コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物を含まない（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は、本開示の１または複数のペプチド、ポリペプチド、および／コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物を含まないか、含まないように変異している）、または本開示の１または複数のペプチド、ポリペプチド、および／コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列に挿入されるが、それらは自然の位置には存在しない。
複数の態様において、本発明の開示の１または複数のペプチドまたはポリペプチドは、小分子（例えば、アルブミンまたは他の既知の担体およびタンパク質）、薬剤、または薬剤断片、（例えば、限定はしないが、定義されたＨＬＡに高い親和性で結合する薬剤または薬剤断片）に接合または連結（例えば、フレーム内融合、化学結合、または他の結合）できる。
複数の態様において、本開示は、ハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物（ＵＳ６，４３２，４０９に当初開示され、その全体が参照によりここに組み込まれる）に関する。そのようなハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物は、１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６（および／またはその断片および変異体、ならびに任意選択で配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸）を含むハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を包含する。
このようなハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物については、適切な介在化学構造によって哺乳類Ｉｉ－ｋｅｙペプチドに共有結合してハイブリッド構築物（および複数の態様ではハイブリッドポリペプチド）を形成するＭＨＣクラスＩＩ制限抗原性エピトープが、前駆抗原性エピトープよりも著しく高い効力をもって、抗原提示細胞によってＴリンパ球に提示されるという最初の発見に基づいている。
複数の態様において、本発明で開示されるハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物は、哺乳類Ｉｉ－ｋｅｙペプチドまたはその改変体で構成されるＮ末端を有し、前記改変体は、共有結合的に、しかし間接的に、Ｉｉ－ｋｅｙペプチドに連結されて抗原提示増強活性を保持しており、提示される特定の抗原性エピトープ（これは複数の態様において、本発明で開示される１または複数のペプチドまたはポリペプチド（これらに限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド）を含む）である。介在する化学構造は、「スペーサー」または「リンカー」と呼ばれることがあり、以下により詳細に説明されるであろう。
複数の態様において、本開示のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物は、’８１３ハイブリッドと同様に、３つの要素で構成されている。３つの要素は以下の通りである。
（１）哺乳類Ｉｉ－ＫｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号２２５）の４－１６残基および抗原提示増強活性を保持する配列番号２２５の改変体（複数の態様において改変体は、配列番号２２５のＬＲＭＫ（アミノ酸１－４）残基および０－１２の追加の連続した配列番号２２５の残基、または、抗原提示増強活性を保持する配列番号２２５の改変体；または他の態様ではＬＲＭＫ（配列番号２２６）を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）可能性がある）を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるからなるＮ－末端要素；
（２）ＭＨＣクラスＩＩおよび／またはクラスＩ分子（複数可）の抗原ペプチド結合部位に結合する、ポリペプチドまたはペプチド模倣構造の形態のＭＨＣクラスＩＩおよび／またはＭＨＣクラスＩ提示エピトープ（複数の態様において、これは、本発明で開示する、１または複数のペプチドまたはポリペプチド（これらに限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布する１～１２の追加アミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド）を含む）を含むＣ末端要素；および
（３）前記ハイブリッドのＮ末端およびＣ末端要素に共有結合する任意の介在する化学構造であって、複数の態様において、この化学構造は、直鎖状に配置されたとき、２０アミノ酸長まで伸びる柔軟な鎖を形成する共有結合した原子のグループ。
複数の態様において、介在する化学構造は、５－アミノペンタン酸であるデルタ－アミノ吉草酸（および「ａｖａ」と称することがある）を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる。
複数の態様において、介在する化学構造は、ａｖａ、ａｌａ－ａｌａ－ａｌａ、ｇｌｙ－ｇｌｙ、またはａｖａ、ａｌａ－ａｌａ－ａｌａ、およびｇｌｙ－ｇｌｙの他の生物学的に受け入れられた機能的等価物を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなってもよい。
特定のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物は表２に開示されており、配列番号２３２－４５２および４５７－４５９を含む。
表２のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物におけるＬＲＭＫ（配列番号２２６）のジャンクションＥｐｉＭａｔｒｉｘヒット（クラスＩＩ）およびジャンクションなヒトヒット（junctional human hits）を決定するために、Ｇｌｙ－Ｇｌｙをａｖａの代わりとして使用した。
特定の態様において、本開示のハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物のＭＨＣクラスＩＩおよび／またはクラスＩ分子（複数可）の抗原性ペプチド結合部位に結合する、ポリペプチドまたはペプチド模倣構造の形態のＭＨＣクラスＩＩおよび／またはＭＨＣクラスＩ提示エピトープ（これは複数の態様において、本発明で開示の１または複数のペプチドまたはポリペプチド（これらに限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド）が含まれる。）を含むＣ末端要素は、Ｎ末端アセチル基および／またはＣ末端アミノ基でキャップされてもよい。
Ｃ末端要素として、配列番号９、３４、４９、５４、５９、９４、９９、１０４、１０９、１４２、１４７、１８１、１９１、１９６、２１０－２１３、２１５－２１８、２２０、および２２３を有する本発明で開示のペプチドまたはポリペプチドを含む、本発明で開示のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物の態様では、かかるペプチドはＮ末端アセチル基およびＣ末端アミノ基でキャップされる。
Ｃ末端要素として、配列番号８９、１１４、１８６、２１４、１１９、２２１－２２２、および２２４を有する本発明で開示のペプチドまたはポリペプチドを含む、本発明で開示のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物の複数の態様において、かかるペプチドはｎ末端アセチルでキャップされ、ｃ末端でキャップされない。
配列番号２３７、２６２、２７７、２８３、２８７、３２２、３２７、３３２、３３７、３７０、３７５、４０９、４１９、４２４、４３８－４４１、４４３－４４６、４４８、および４５１のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物の複数の態様において、開示されたペプチド配列のＣ末端要素は、Ｎ末端アセチルおよびＣ末端のアミノ基でキャップされる。
配列番号３１７、３４２、４１４、４４２、４４７、４４９、４５０、および４５２のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物の複数の態様において、開示されたペプチド配列のＣ末端要素は、ｎ末端アセチル基でキャップされ、ｃ末端でキャップされない。
Figure 2023515387000017
Figure 2023515387000018
Figure 2023515387000019
Figure 2023515387000020
Figure 2023515387000021
Figure 2023515387000022
Figure 2023515387000023
Figure 2023515387000024
Figure 2023515387000025
Figure 2023515387000026
Figure 2023515387000027
Figure 2023515387000028
Figure 2023515387000029
Figure 2023515387000030
Figure 2023515387000031
複数の態様において、本発明で開示されたハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物の、様々な要素間の接合部（jungctions）にまたがるエピトープは、本開示の範囲内に包含される。したがって、例えば、請求項において、エピトープの一部が、本発明で開示されたハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物ペプチド要素またはドメイン（例えば、リンカー領域）の１つに含まれると規定する場合、これは、必然的に、残りの部位が、フランク部位またはドメインの連続した部位に見られることを意味する。
Ｉ－ｋｅｙを用いた過去の研究では、哺乳類のＩ－ｋｅｙペプチドであるＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号２２５）、および哺乳類の改変Ｉ－ｋｅｙペプチドであるＹＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号２２７）には、特定のＭＨＣクラスＩＩ制限抗原ペプチドを、これを認識するＴリンパ球ハイブリドーマへ提示するのを変更する能力があることが実証された。（米国特許第５，５５９，０２８号、米国特許第５，９１９，６４５号、米国特許第５，９１９，６４５号、第５，９１９，６３９号、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）。文献に記載されているように、Ｉｉ－ｋｅｙペプチドの改変体を用いた以前の実験では、このポリペプチドに対して、活性を損なわずに多種多様な改変（改変）を行うことができることが示されている。実際、改変はしばしばこのポリペプチドの抗原提示活性を増強した。
例えば、米国特許第６，４３２，４０９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）には、抗原提示増強活性を保持するすべての改変Ｉｉ－ｋｅｙペプチドが、適切に組み込まれた場合に、本発明の増強ハイブリッドにおいて機能することが示されている。Ｉｉ－ｋｅｙペプチドの改変には、Ｃ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失、Ｎ末端の保護、アミノ酸置換、および環状ペプチドの導入が含まれる。元の配列の少なくとも４つの連続したアミノ酸を保持する欠失型Ｉｉ－ｋｅｙペプチド、またはその置換型Ｉｉ－ｋｅｙペプチドは、機能活性を示す。様々な天然または非天然のアミノ酸がそれぞれの残基の位置で置換されていてもよい。置換される分子の例としては、ペプチド模倣構造、Ｄ－異性体アミノ酸、Ｎ－メチルアミノ酸、Ｌ－異性体アミノ酸、改変Ｌ－異性体アミノ酸、環化誘導体などが挙げられる。
さらに、ハイブリッドのＮ末端セグメントの追加的な改変を行うために、日常的な実験方法を用いて当業者によって薬化学の手順が適用され得る。そのような手順の例は、合理的薬物設計の方法、Ｘ線回折データ、核磁気共鳴データ、および他の計算方法からの構造情報に基づく分子モデリング、ならびにコンビナトリアル化学合成の生成物のスクリーニング、および天然物の分離が挙げられる。高い活性を維持することが知られており、発明で開示されるハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物に含まれる可能性のあるＩｉ－ｋｅｙペプチドの改変体の例としては、ＬＲＭＫ（配列番号２２６）、ＬＲＭＫＬＰＫ（配列番号２２８）、ＬＲＭＫＬＰＫＳ（配列番号２２９）、ＬＲＭＫＬＰＫＳＡＫＰ（配列番号２３０）、およびＬＲＭＫＬＰＫＳＡＫＰＶＳＫ（配列番号２３１）が挙げられる。
Ｉｉ－ｋｅｙペプチドの他の改変体および改変バージョンは、米国特許第５，９１９，６３９号、および米国特許第５，５５９，０２８号に記載されており、これらは、参照によりその全体が組み込まれる。
活性を保持することが知られているＩｉ－ｋｅｙペプチドの改変バージョン（ＹＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ、配列番号２２７）は、本明細書において「Ｉｉ－ｋｅｙ相同体」と称される。
したがって、本発明で開示されるハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物のＮ末端要素は、哺乳類Ｉｉ－ＫｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号２２５）の４～１６残基および抗原提示増強活性を保持する配列番号２１０の改変体（複数の態様において改変体は、配列番号２２５のＬＲＭＫ（アミノ酸１－４）残基および配列番号２２５の０－１２の追加の連続した残基、および、抗原提示増強活性を保持する配列番号２２５の改変体；または他の態様ではＬＲＭＫ（配列番号２２６）を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる可能性がある）を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる可能性がある。
本発明で開示されるハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物の複数の態様において、ＭＨＣクラスＩＩおよび／またはクラスＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合する、ポリペプチドまたはペプチド模倣構造の形態のＭＨＣクラスＩＩおよび／またはクラスＩ提示エピトープを含むＣ－末端エレメントは、本発明で開示する１または複数のペプチドまたはポリペプチドから構成されている。
このように、複数の態様において、Ｃ末端要素は、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる。
さらなる態様において、Ｃ末端要素は、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布している１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる、ペプチドまたはポリペプチドを含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる。
複数の態様において、Ｃ末端要素は、配列番号４－２２４および４５４－４５６のいずれか１つ（および／またはその断片）に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなり、ここで当該ポリペプチドは、依然として同じＨＬＡ分子に結合でき（すなわち、ＭＨＣ結合性を保持する）、および／または同じＴＣＲ特異性を保持し、および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持する。
複数の態様において、ポリＧＳリンカーは、Ｃ末端要素のＮ末端上に含まれてもよい。先に述べたように、エピトープはＣ－末端要素とリンカー要素に重なることがある。ある状況では、追加のエピトープまたは決定子がリンカーエレメントとＮ末端Ｉｉ－ｋｅｙ部位の間で重なり合うことが可能であろう。
特定の態様では、本発明で開示のハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物のＭＨＣクラスＩＩおよび／またはＭＨＣクラスＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合する、ポリペプチドまたはペプチド模倣構造の形態のＭＨＣクラスＩＩおよび／またはＭＨＣクラスＩ提示エピトープ（これは、複数の態様では、本発明で開示される１または複数のペプチドまたはポリペプチド（これらに限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド）を含む）を含むＣ末端要素は、Ｎ末端アセチル基および／またはＣ末端アミノ基でキャップされてもよい。
複数の態様において、介在する化学構造またはスペーサーが、１または複数のエピトープ／決定子を含んでいてもよく、定義された範囲（limits）内でのその全体の長さは、その特性およびエピトープ／決定子によって大きく左右される。
複数の態様において、介在する化学構造は抗原的に中性であり、スペーサーは、好ましくは、９アミノ酸が直線状に配置されたペプチドバックボーンの長さ未満である。複数の態様において、スペーサーの長さは、４アミノ酸から６アミノ酸が直線状に配列されたペプチジルバックボーンの長さである。
複数の態様において、スペーサーは、増強ハイブリッドペプチドの他の異なる要素に対して、任意の空間的に異なる様式で水素結合することができない。
複数の態様において、介在する化学構造は、５－アミノペンタン酸であるデルタ－アミノ吉草酸（「ａｖａ」と呼ぶことがある）を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる。複数の態様において、介在する化学構造は、ａｖａ、ａｌａ－ａｌａ－ａｌａ、ｇｌｙ－ｇｌｙ、または他の生物学的許容されたａｖａ、ａｌａ－ａｌａ－ａｌａ、ｇｌｙ－ｇｌｙの機能的等価物を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる可能性がある。
複数の態様において、また、抗原的に中性なスペーサー要素に関して、アミノ酸の代わりに様々な化学基をスペーサーセグメントに組み込んでもよい。例えば、そのような例は、米国特許第５，９１０，３００号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。好ましい実施形態では、スペーサーは、ヘテロ原子によって最適に中断されている脂肪族鎖、例えばＣ２－Ｃ６ アルキレン、または＝Ｎ－（ＣＨ２）２－６－Ｎ＝から構成される。あるいは、スペーサーは、例えば、任意にＯ、Ｎ、Ｓなどのヘテロ原子で中断されていてもよい、疎水性、親油性、脂肪族およびアリール－脂肪族配列の交互単位で構成されてもよい。スペーサーのこのような成分は、好ましくは以下の分類の化合物：ステロール、アルキルアルコール、アルキル機能が変化したポリグリセリド、アルキルフェノール、アルキルアミン、アミド、疎水性のポリオキシアルキレン等から選ばれる。その他に、疎水性ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシ酸、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコールポリヒドロキシ酪酸等が挙げられる。また、スペーサーは、ポリプロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ペンタメチレンなどの短い脂肪族鎖を酸素原子で分離して繰り返し含んでいてもよい。
スペーサーに使用することができる追加のペプチジル配列は、米国特許第５，８５６，４５６号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態では、スペーサーは、切断の対象となる化学基を内部に組み込んでいる。限定されないが、そのような化学基は、プロテアーゼによって、化学基によって、または触媒モノクローナル抗体によって触媒される切断のために設計されてもよい。プロテアーゼ感受性の化学基の場合、トリプシン標的（カチオン性側鎖を有する２アミノ酸）、キモトリプシン標的（疎水性側鎖を有する）、およびカテプシン感受性（Ｂ、ＤまたはＳ）が好適に使用される。「トリプシン標的」という用語は、本明細書では、トリプシン及びトリプシン様酵素によって認識されるアミノ酸の配列を記述するために使用される。「キモトリプシン標的」という用語は、本明細書では、キモトリプシンおよびキモトリプシン様酵素によって認識されるアミノ酸の配列を記述するために使用される。さらに、触媒モノクローナル抗体の化学的標的、および他の化学的に切断される基は、ペプチド合成、酵素触媒、および有機化学全般の技術に精通する者によく知られており、日常的な実験方法を使用して、ハイブリッド構造に設計し、合成することができる。
複数の態様において、介在する化学構造またはスペーサーは、以下からなる群から選択される。１）ＭＨＣクラスＩエピトープまたはその一部；および２）抗体認識決定子またはその一部からなる群から選択される。
複数の態様において、本開示のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物は、性質が完全にペプチドであるものから、性質が実質的に非ペプチドであるものまで変動する。いくつかの相同体が実質的に縮小されたペプチド、または非ペプチドの性質を有するという観点から、それらは、当技術分野で知られているように、例えば、細胞膜を通る浸透性、溶解性、タンパク質分解に対する耐性、抱合による不活化に対する耐性、経口バイオアベイラビリティ、およびｉｎ ｖｉｖｏにおけるより長い半減期などの好ましい性質を有することがより可能であるといえる。
複数の態様において、本開示は、表２の、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物、（および／またはその断片もしくは変異体）に関する。複数の態様において、本開示は、表２のＩｉ－ｋｅｙ構築物（配列番号２３２－４５２および４５７－４５９を含む）に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の相同性を有するハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を提供する。複数の態様において、本開示は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を有するハイブリッドＩ－ｋｅｙ構築物を提供し、前記ハイブリッドＩ－ｋｅｙ構築物は、表２のＩ－ｋｅｙ構築物（配列番号２３２－４５２、４５７－４５９を含む）に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の相同性を有する。
複数の態様において、本開示は、配列番号４３８、２３７、４３９、２６２、４４０、４４１、２７７、２８２、２８７、４４２、４４３、３１７、３２２、３２７、４４４、３３２、３３７、３４２、４４５、４４６、３７０、３７５、４４７、４４８、４４９、４５０、４０９、４１４、４１９、４２４、４５１および４５２のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および任意選択で、配列番号４３８、２３７、４３９、２６２、４４０、４４１、２７７、２８２、２８７、４４２、４４３、３１７、３２２、３２７、４４４、３３２、３３７、３４２、４４５、４４６、３７０、３７５、４４７、４４８、４４９、４５０、４０９、４１４、４１９、４２４、４５１、および４５２のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端（および複数の態様においては、このようなハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物のＣ末端要素のＮ末端および／またはＣ末端）に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物に関する。
複数の態様において、本開示は、配列番号４４６、２４６、４４４、４４０、３１７、３３２、２６２、３７０、４４９、２８２、４１４、２８７、４４２、４５１、４４７、４１９、４５２、４５０、４３８、２７７、３３２、４４５、４４１、４４３、３３７、４４８、３７５、４０９、４２４、２３７、３４２および３２７のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および任意選択で配列番号４４６、２４６、４４４、４４０、３１７、３３２、２６２、３７０、４４９、２８２、４１４、２８７、４４２、４５１、４４７、４１９、４５２、４５０、４３８、２７７、３３２、４４５、４４１、４４３、３３７、４４８、３７５、４０９、４２４、２３７、３４２および３２７のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端（および複数の態様においては、このようなハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物のＣ末端要素のＮ末端および／またはＣ末端）に任意の比率で分布している１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる１つ以上のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物に関する。
複数の態様において、本開示は、配列番号４３８、２３７、２４６、２６２、４４０、４４１、２７２、２７７、２８２、２８７、４４２、３１７、３２２、３２７、４４４、３３２、３３７、３３８、３４２、４４６、３７０、３７５、４４８、４４９、４０４、４０９、４１４、４１９、４２４、４５１、４５２、４５７、４５８、および４５９のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および任意選択で、配列番号４３８、２３７、２４６、２６２、４４０、４４１、２７２、２７７、２８２、２８７、４４２、３１７、３２２、３２７、４４４、３３２、３３７、３３８、３４２、４４６、３７０、３７５、４４８、４４９、４０４、４０９、４１４、４１９、４２４、４５１、４５２、４５７、４５８、および４５９のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端（および複数の態様においては、このようなハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物のＣ末端要素のＮ末端および／またはＣ末端）に任意の比率で分布している１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる１つ以上のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物に関する。
本明細書で使用する場合、２種のポリペプチド（またはポリペプチドの領域）は、アミノ酸配列が少なくとも約４５～５５％、典型的には少なくとも約７０～７５％、より典型的には少なくとも約８０～８５％、より典型的には約９０％以上、およびより典型的には９５％以上相同または同一である場合に実質的に相同または同一であると意味する。
２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列の相同性または同一性のパーセントを決定するために、配列は最適な比較目的のために整列される（例えば、他のポリペプチドまたは核酸分子との最適な整列のために、一方のポリペプチドまたは核酸分子の配列に隙間を導入することが可能である）。そして、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。
一方の配列の位置が、他方の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合、分子はその位置において相同である。当技術分野で知られているように、２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一位置の数の関数である。ポリペプチドの配列相同性は、通常、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。
本明細書で使用する場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と等価である。複数の態様において、２つの配列間の相同性パーセントは、配列によって共有される同一位置の数の関数である（例えば、相同性パーセントは、同一位置の数／位置の総数×１００に等しい）。
複数の態様において、本開示ではまた、相同性の程度は相対的に低いが、本発明の開示のポリペプチドによって行われる１つ以上の同じ機能を行うように十分な類似性を有するポリペプチド（例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、１または複数の、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる配列を有するポリペプチド；本発明で開示されるコンカテマーペプチド；配列番号２３２－４５２および４５７－４５９のハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物を含む本明細書に開示するハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物）が含まれる。
類似性は、保存されたアミノ酸置換によって決定される。そのような置換は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を、同様の特性を有する別のアミノ酸で置換するものである。保存的な置換(substitution)は、表現型的に沈黙している可能性が高い。典型的な保存的置換としては、脂肪族アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅの一つずつの置換、水酸基残基ＳｅｒとＴｈｒとの間の置換、酸性残基ＡｓｐとＧｌｕとの間の置換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎとの間の置換、塩基残基Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇとの間の置換、芳香族残基Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒとの間の置換が見られる。どのアミノ酸の変化が表現型的に沈黙している可能性が高いかに関するガイダンスを参照できる（Bowie JUら , (1990), Science, 247(4948):130610,これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
複数の態様において、変異体ポリペプチドは、１または複数の置換、欠失、挿入、逆位、融合、および切断、またはこれ（ら）のいずれかの組み合わせによってアミノ酸配列が異なり得る。変異体ポリペプチドは、完全に機能的（例えば、ＭＨＣ結合性及び／又はＴＣＲ特異性を保持し、及び／又は抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持）であるか、又は一つ以上の活性において機能を欠くことができる。完全に機能的な変異体は、典型的には、保存的変異または非重要残基または非重要領域における変異のみを含む；この場合、典型的には、ＭＨＣ結合を提供するＭＨＣ接触残基が保持される。
機能的変異体はまた、機能において変化しない、または重要でない変化（例えば、ＭＨＣ結合性および／またはＴＣＲ特異性を保持し、および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持する）をもたらす類似アミノ酸の置換を含むことができる。あるいは、そのような置換は、ある程度機能に正または負に影響し得る。非機能的な変異体は、典型的には、１または複数の非保存的なアミノ酸置換、欠失、挿入、逆位、もしくは切断、または重要な残基もしくは重要な領域（この場合、典型的にはＴＣＲ接触残基）における置換、挿入、逆位、もしくは欠失を含む。
複数の態様において、変異体および／または相同ポリペプチドは、本開示の所望の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持する（例えば：対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２および／または関連疾患に対する免疫応答（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する細胞性（ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答）または液性免疫応答）を刺激、誘導、および／または拡大でき；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＩＦＮγ応答（例えば、ＰＭＢＣなどのリンパ球、またはエフェクターＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞による）を刺激、誘発、拡大することができ；および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製もしくは感染性を阻害でき；および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫誘導能を有する）。
あるいは、そのような置換は、機能にある程度正または負に影響し得る。非機能的変異体は、典型的には、重要残基もしくは重要領域（典型的にはＴＣＲ接触残基）における、１または複数の非保存的なアミノ酸置換、欠失、挿入、逆位、もしくは切断、または置換、挿入、逆位、もしくは欠失を含む。
複数の態様において、本明細書に開示される、１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる配列（またはコア配列）を有するポリペプチドの機能的変異体は、１または複数の保存的置換を含んでいてもよく、複数の態様では、本開示のポリペプチドの、機能にとって必須ではないと考えられるアミノ酸残基（機能にとって必須と考えられるアミノ酸残基は、例えば、ＭＨＣ結合性向および／またはＴＣＲ特異性を保持し、および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持する）において、１または複数の非保存的置換を含んでいてもよい。
例えば、複数の態様において、本明細書に開示される１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６またはその断片を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる配列（またはコア配列）を有する変異型ポリペプチド、または本明細書に開示されるコンカテマーペプチドまたはその断片、本明細書に開示される１または複数の配列番号２３２－４５２および４５７－４５９を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を有する、変異型ポリペプチドは、ＨＬＡ結合が維持される限り、１または複数のＨＬＡ接触残基に１または複数の保存的置換（および複数の態様において非保存的置換）を含んでもよい。
複数の態様において、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物のＣ末端要素は、ＨＬＡ結合が保存されるならば、１または複数のＨＬＡ接触残基においてそのような１または複数の保存的置換（および複数の態様において、非保存的置換）を含んでもよいことが、理解されるべきである。
ＭＨＣ結合アッセイは、当技術分野でよく知られている。複数の態様において、そのようなアッセイは、当技術分野で知られているような結合アッセイで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおけるＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩアレルに関する結合親和性の試験を含み得る。例えば、米国７，８８４，１８４号またはＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２００８９に開示されているような可溶性結合アッセイがあり、これ（ら）の両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
さらに、複数の態様において、本明細書に開示される、１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６を含む、それを含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなる配列（またはコア配列）を有する完全に機能する変異体ポリペプチドは、ＴＣＲ接触残基などの、一つまたは複数の重要な残基または領域で変異が存在することはない。
複数の態様において、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する、９量体の同定されたエピトープ（本発明で開示する１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６の９量体断片、コンカテマーペプチドの９量体断片、または１または複数の配列番号２３２－４５２および４５７－４５９のまたはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物の９量体断片、複数の態様においてＩｉ－ｋｅｙ構築物のＣ末端要素であってもよい）のＴＣＲ結合エピトープ（ＴＣＲ結合残基、ＴＣＲ対面（TCR facing）エピトープ、ＴＣＲ対面残基、またはＴＣＲ接触と呼ぶことができる）は、同定されたエピトープのアミノ末端から数えて２、３、５、７および８位に存在する。一方、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する、９量体の同定されたエピトープ（１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６の９量体断片、配列番号２３２－４５２および４５７－４５９のＩｉ－ｋｅｙ構築物の９量体断片であってよい、複数の態様においてＩｉ－ｋｅｙ構築物のＣ末端要素であってもよい）に対するＭＨＣ結合アグレトープ（agretope）（ＭＨＣ接触、ＭＨＣ対面残基、ＭＨＣ結合残基またはＭＨＣ結合面と呼ぶことがある）は、アミノ末端から数えて１、４、６、９位に存在する。
複数の態様において、ＭＨＣクラスＩ分子に結合する、９量体の同定されたエピトープ（これは、本明細書に開示された、１または複数の本発明で開示する１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６の９量体断片、または１または複数の配列番号２３２－４５２および４５７－４５９のハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物の９量体断片であってもよい。複数の態様においてＩｉ－ｋｅｙ構築物のＣ末端要素であってもよい。）のＴＣＲ結合エピトープは、同定されたエピトープのアミノ末端から数えて４、５、６、７および８位に存在する。一方、ＭＨＣクラスＩ分子に結合する、９量体の同定されたエピトープ（１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６の９量体断片、または配列番号２３２－４５２および４５７－４５９のハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物の９量体断片であってよい。複数の態様においてＩｉ－ｋｅｙ構築物のＣ末端要素であってもよい。）のＭＨＣ結合アグレトープは、アミノ末端から数えて１、２、３、９位に存在する。
複数の態様において、ＭＨＣクラスＩ分子に結合する、１０量体の同定されたエピトープ（本発明で開示する１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６の１０量体断片、または配列番号２３２－４５２および４５７－４５９のハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物の１０量体断片、または配列番号２３２－４５２および４５７－４５９のハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物の１０量体断片であってよい。複数の態様においてＩｉ－ｋｅｙ構築物のＣ末端要素であってもよい。）のＴＣＲ結合エピトープは、同定されたエピトープのアミノ末端から数えて４、５、６、７、８、および９位に存在してもよい。一方、ＭＨＣクラスＩ分子に結合する、１０量体の同定されたエピトープのＭＨＣ結合アグレトープ（本開示されているように、１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６の１０量体断片、または配列番号２３２－４５２および４５７－４５９のハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物の１０量体断片であってもよい。複数の態様においてＩｉ－ｋｅｙ構築物のＣ末端要素であってもよい。）はアミノ末端から数えて１、２、３、９および１０位に存在する。
複数の態様において、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する、９量体の同定されたエピトープ（本発明で開示する１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６の９量体断片、または配列番号２３２－４５２および４５７－４５９のハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物の９量体断片であってよい。複数の態様においてＩｉ－ｋｅｙ構築物のＣ末端要素であってもよい。）のＴＣＲ結合エピトープは、は、同定されたエピトープのアミノ末端から数えて２、３、５、７、および８位の残基の任意の組み合わせ（例えば、３、５、７および８位；２、５、７および８位；２、３、５および７位など、ただし、これらに限定されない。）に存在してもよい。一方、９量体の同定されたエピトープ（本明細書で開示する、１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６の９量体断片、または配列番号２３２－４５２および４５７－４５９のハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物の９量体であってもよい。複数の態様においてＩｉ－ｋｅｙ構築物のＣ末端要素であってもよい。）に対するＭＨＣ結合アグレトープは、アミノ末端から数えてＴＣＲ対面残基に対する相補面（complementary face）に存在する。
複数の態様において、ＭＨＣクラスＩ分子に結合する、９量体の同定されたエピトープ（本発明で開示する１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６の９量体断片、または配列番号２３２－４５２および４５７－４５９のハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物の９量体断片であってよい。複数の態様においてＩｉ－ｋｅｙ構築物のＣ末端要素であってもよい。）のＴＣＲ結合エピトープは、同定されたエピトープのアミノ末端から数えて４、５、６、７、および８位、１、４、５、６、７、および８位、または１、３、４、５、６、７、および８位に存在してもよい。一方、９量体の同定されたエピトープ（本発明で開示する１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６の９量体断片、または配列番号２３２－４５２および４５７－４５９のハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物の９量体断片であってもよい。複数の態様においてＩｉ－ｋｅｙ構築物のＣ末端要素であってもよい。）に対するＭＨＣ結合アグレトープは、アミノ末端から数えたＴＣＲ対面残基に対する相補面に存在する。
複数の態様において、ＭＨＣクラスＩ分子に結合する、１０量体の同定されたエピトープ（本発明で開示する１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６の１０量体断片、または配列番号２３２－４５２および４５７－４５９のハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物の１０量体断片であってよい。複数の態様においてＩｉ－ｋｅｙ構築物のＣ末端要素であってもよい。）のＴＣＲ結合エピトープは、同定されたエピトープのアミノ末端から数えて１、３、４、５、６、７、８、９位の任意の組み合わせに存在する。一方、１０量体の同定されたエピトープ（本明細書で開示する、１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６の１０量体断片、または配列番号２３２－４５２および４５７－４５９のハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物の１０量体断片であってよい。複数の態様においてＩｉ－ｋｅｙ構築物のＣ末端要素であってもよい。）に対するＭＨＣ結合アグレトープは、アミノ末端から数えたＴＣＲ対面残基に対する相補面に存在する。
上記に基づき、１または複数の９量体及び／又は１０量体エピトープがより長いポリペプチド内に含まれ、１または複数のクラスＩ又はクラスＩＩ ＭＨＣ分子と結合すると予測され、内在する（Naturally occurring）配列において互いに近接して存在する（例えば、ここで、結合９量体および／または１０量体の各対の１位は、例えば、互いの３アミノ酸以内に入る）態様において、そのようなエピトープは、エピトープクラスターを形成するために組み合わされてもよい。所定のクラスターにおいて、任意のアミノ酸は、所定の９量体エピトープまたは１０量体エピトープに関しては、ＭＨＣに面し、別の９量体エピトープに関しては、ＴＣＲに面している可能性がある。
複数の態様において、本開示はまた、本発明で開示されるポリペプチド、コンカテマーポリペプチド、およびハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物の断片を含む。複数の態様において、本開示は、本明細書に記載される開示されるポリペプチド、コンカテマーポリペプチド、およびハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物の変異体の断片も包含する。複数の態様において、本明細書で使用されるように、断片は、少なくとも約９の連続したアミノ酸を含んでなる。複数の態様において、本開示はまた、本明細書に記載されるＴ細胞エピトープの変異体の断片を包含する。
有用な断片（および本明細書に記載のポリペプチド、コンカテマーポリペプチド、およびハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物の変異体の断片）には、１又は複数の生物学的活性（特にＭＨＣ結合性向および／またはＴＣＲ特異性、および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性）を保持するものが含まれる。生物学的活性を有する断片は、例えば、約９、１０、１１、１２、１、１４、１５、１６、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上のアミノ酸長で、その間のいかなる値または範囲も含む。断片は個別（他のアミノ酸またはポリペプチドと融合していない）であってもよいし、より大きなポリペプチド内に存在してもよい。いくつかの断片は、単一の大きなポリペプチド内に構成することができる。複数の態様において、宿主における発現のために設計された断片は、ポリペプチド断片のアミノ末端に融合した異種のプレおよびプロポリペプチド領域と、断片のカルボキシル末端に融合した追加の領域とを有し得る。
複数の態様において、本発明で開示されるポリペプチド、コンカテマーポリペプチド、およびハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物は、そのアレルもしくは配列変異体（「突然変異体（mutants）」）または類似体を含むことができ、または化学改変（例えば、ペギル化、グリコシル化）を含むことができる。複数の態様において、突然変異体は、同じ機能、特にＭＨＣ結合性および／またはＴＣＲ特異性、および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持する。複数の態様において、突然変異体は、ＭＨＣ分子への結合の強化を提供することができる。複数の態様において、突然変異体は、ＴＣＲへの結合の強化をもたらすことができる。別の例では、突然変異体は、ＭＨＣ分子および／またはＴＣＲへの結合の減少をもたらすことができる。また、結合するが、ＴＣＲを介したシグナル伝達を許さない突然変異体も意図されている。
本開示のポリペプチドの製造方法は、分子を構成する様々な要素の性質に応じて、大きく異なるであろう。例えば、分離されたポリペプチドは、それを自然に発現する細胞から精製するか、それを発現するように改変された細胞から精製するか（組換え）、または既知のタンパク質合成方法を使用して合成することができる。合成手順は、単純であり、高い収率を提供し、高度に精製された安定な生成物を可能にするように選択されてもよい。
例えば、本開示のポリペプチドは、本明細書に開示される核酸から、または組換え技術、突然変異誘発、もしくは当該技術分野において他の既知の手段などの標準分子生物学技術の使用のいずれかによって製造することができる。分離されたポリペプチドは、それを自然に発現する細胞から精製されるか、それを発現するように改変された細胞から精製されるか（組換え）、または既知のタンパク質合成技術を使用して合成されてもよい。
複数の態様において、本開示のポリペプチドは、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術によって製造される。複数の態様において、本開示のポリペプチドは、適切な宿主細胞における本開示の組換え核酸の発現によって産生されてもよい。例えば、ポリペプチドをコードする核酸分子を発現カセットまたは発現ベクターにクローニングし、発現カセットまたは発現ベクターを宿主細胞に導入し、ポリペプチドを宿主細胞で発現させる。その後、標準的なタンパク質精製技術を用いた適切な精製スキームにより、ポリペプチドを細胞から分離することができる。あるいは、ポリペプチドは、プロテアーゼ消化および精製などのｅｘ ｖｉｖｏ手順の組み合わせによって製造することができる。
さらに、本開示のポリペプチドは、部位特異的変異誘発技術、または当該技術分野で公知の他の変異誘発技術を使用して製造することができる（例えば、James A. Brannigan and Anthony J. Wilkinson.、2002、Protein engineering 20 years on. Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, 964-970; Turanli-Yildiz B. et al., 2012,タンパク質Engineering Methods and Applications, intechopen.com,これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれている）。
複数の態様において、本開示はまた、キメラまたは融合ポリペプチド組成物を提供する。複数の態様において、本開示は、本開示の１つまたは複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物（これに限定されないが、例えば、１つまたは複数のペプチドまたはポリペプチドは、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号２２４のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなり、同様に、表１の（配列番号２３２－４５２および４５７－４５９）（および／またはその断片もしくは変異体）を含む、本明細書に記載されるコンカテマーペプチドまたはポリペプチド、および本明細書に記載されるＩｉ－ｋｅｙ構築物の配列を有していてもよい。）を含む、キメラまたは融合ポリペプチド組成物（複数の態様において、分離、合成、または組換えであり得る）に関する。
複数の態様において、本開示のキメラまたは融合ポリペプチド組成物は、無関係なタンパク質などの異種ポリペプチドに接合、連結（例えば、フレーム内融合、化学結合、またはその他の結合）、および／または挿入された本開示の１つまたは複数のペプチド、ポリペプチド、および／コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物から構成される。
先に記載したように、１または複数のＴ細胞エピトープ（例えば、本開示のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物）に関して、用語「異種ポリペプチド」は、本開示の１または複数のＴ細胞エピトープは、異種ポリペプチドに異種であるか、自然に含まれないことを意味することが意図される。
複数の態様において、異種ポリペプチドは、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、モノ特異的抗体、二重特異的抗体、グリコシル化抗体、Ｆｃ改変抗体、または抗体－薬物コンジュゲート；異なるクラスまたはサブクラスの抗体（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ分子）またはその抗原特異的抗体断片（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、閉立体構造多特異抗体、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、ダイアボディ）が含まれるが、それだけに限らない）であってもよい。
複数の態様において、本発明で開示される１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーポリペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物は、異種ポリペプチドに挿入されてもよい（例えば、組換え技術、突然変異誘発、または当該技術分野において他の既知の手段によって）、異種ポリペプチドのＣ末端に（当該技術分野において既知のように、リンカーを使用してまたは使用せずに）付加されてもよく、および／または異種ポリペプチドのＮ末端に（当該技術分野において既知のように、リンカーを使用してまたは使用せずに）付加されてもよい。
複数の態様において、本発明で開示される１または複数のポリペプチドは、米国特許第７，４４２，７７８号、米国特許第７，６４５，８６１号、米国特許第７，６５５，７６４号、米国特許第７，６５５，７６５号、および／または米国特許第７，７５０，１２８号（その各々は、参照によりその全体がここに組み込まれる）に開示されるようにＦｃドメイン中のアミノ酸に挿入または置換されてもよい。
例えば、変異誘発によるタンパク質工学は、部位特異的変異誘発技術、または当技術分野で公知の他の変異誘発技術を使用して行うことができる（例えば、James A. Brannigan and Anthony J. Wilkinson., 2002, タンパク質engineering 20 years on. Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, 964-970; Turanli-Yildiz B. et al., 2012,タンパク質Engineering Methods and Applications, intechopen.com, これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
複数の態様において、キメラまたは融合ポリペプチドは、異種ポリペプチドに作動的に連結された即座に開示された１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーポリペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物を含んでなる。「作動的に連結された」とは、本発明で開示される１または複数のペプチド、ポリペプチド、またはコンカテマーペプチドと異種ポリペプチドとが、インフレームで融合されているか、化学的に連結されているか、または他の方法で結合されていることを示す。
例えば、複数の態様において、１または複数の本開示ポリペプチドは、米国特許第８，００８，４５３号、米国特許第９，１１４，１７５号、および／または米国特許第１０，１８８，７４０号（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるようにＦｃドメイン内の１または複数の内部共役部位に共有結合されてもよい。
複数の態様において、本開示の１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーポリペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物は、異種ポリペプチドの隣接アミノ酸とともに、アミノ酸配列に接合、連結（例えば、フレーム内融合、化学結合、または他の方法で結合）、および／または挿入されてもよいが、本発明で開示の１または複数のペプチドまたはポリペプチド、コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物は、異種ポリペプチドに全体として、接合、連結（例えば、フレーム内融合、化学結合、または他の方法で結合）、および／または挿入されてもよい。
複数の態様において、キメラまたは融合ポリペプチド組成物は、本発明で開示のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含み、ここで、前記１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチドのが、１．またはハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物は、異種ポリペプチドに天然に含まれず、および／またはペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物の前記１つ以上が、異種ポリペプチドのその天然位置に配置されない。
例えば、複数の態様において、本開示の１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、および／またはＩｉ－ｋｅｙ構築物は、本開示の１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、および／またはＩｉ－ｋｅｙ構築物を含んでいないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列が、本開示の１つまたは複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、および／またはＩｉ－ｋｅｙ構築物を含まない、または含まないように変異している）に挿入されていてもよく、または、本開示の１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、および／またはＩｉ－ｋｅｙ構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列に挿入されているものの、自然な位置では挿入されていない。
複数の態様において、１または複数の本開示のペプチドまたはポリペプチドは、異種ポリペプチドに接合、連結（例えば、フレーム内融合、化学結合、またはその他の結合）、および／または挿入されてもよい。複数の態様において、キメラまたは融合ポリペプチド組成物は、Ｔ細胞エピトープと実質的に相同ではないアミノ酸配列を有する異種ポリペプチドに作動的に連結された本開示の１または複数のＴ細胞エピトープ（例えば、本開示のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物）を含んでいる。
複数の態様において、キメラまたは融合ポリペプチドは、それ自体、Ｔ細胞エピトープの機能に影響を与えない。例えば、融合ポリペプチドは、Ｔ細胞エピトープ配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されたＧＳＴ－融合ポリペプチドであり得る。他のタイプの融合ポリペプチドには、酵素融合ポリペプチド、例えばβ－ガラクトシダーゼ融合、酵母ツーハイブリッドＧＡＬ融合、ポリ－Ｈｉｓ融合及びＩｇ融合が含まれるが、これらに限定されるものではない。このような融合ポリペプチド、特にポリ－Ｈｉｓ融合またはアフィニティタグ融合は、組換えポリペプチドの精製を容易にすることができる。特定の宿主細胞（例えば、哺乳類宿主細胞）において、ポリペプチドの発現および／または分泌は、異種シグナル配列を使用することによって増加させることができる。したがって、複数の態様において、キメラまたは融合ポリペプチドは、そのＮ－末端に異種シグナル配列を含む。上記キメラまたは融合ポリペプチド組成物の複数の態様において、異種ポリペプチドまたはポリペプチドは、生物学的に活性な分子を含んでいる。
複数の態様において、生物学的に活性な分子は、免疫原性分子、Ｔ細胞エピトープ、ウイルスタンパク質、および細菌タンパク質からなる群から選択される。複数の態様において、本開示の１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物は、低分子、薬剤、または薬剤断片に接合または連結（例えば、フレーム内で融合、化学的に連結、または他の方法で結合）されてもよい。例えば、本開示の１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物は、無関係のペプチドまたはタンパク質、小分子（例えば、アルブミンまたは他の既知の担体およびタンパク質）、薬剤、またはドラッグ断片、例えば限定されないが、定められたＨＬＡに高い親和性で結合する薬剤またはドラッグ断片に結合または連結する（例えば、インフレーム融合、化学的結合、または他の結合）ことが可能である。上記のキメラまたは融合ポリペプチド組成物の態様において、キメラまたは融合ポリペプチド組成物は、組換え、分離、および／または合成であり得る。
キメラまたは融合ポリペプチド組成物は、当技術分野で知られているような標準的な組換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術によって製造することができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ断片は、従来の技術に従ってインフレームで一緒にライゲーションされてもよい。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成されてもよい。あるいは、核酸断片のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅は、キメラ核酸配列を生成するために続いてアニールされ再増幅されてもよい２つの連続する核酸断片の間の相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して実施することができる（Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, (2ND , 1992), FM Asubel et al. (eds), Green Publication Associates, New York, NY (Publ), ISBN: 9780471566355,これ（ら）の参照は、本開示に組み込むことができる）。
さらに、本開示の１つまたは複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーポリペプチド、またはＩｉ－ｋｅｙ構築物（限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、ならびに任意に配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末および／またはＣ末に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドもしくはポリペプチド）は、組換え技術、合成重合技術、突然変異誘発、または当該技術分野で知られている他の標準的技術によって、異種ポリペプチドに挿入するか、またはポリペプチドの非自然発生位置へ挿入することが可能である。
例えば、変異誘発によるタンパク質工学は、部位特異的変異誘発技術、または当技術分野で公知の他の変異誘発技術を用いて行うことができる（例えば、James A. Brannigan and Anthony J. Wilkinson.、2002、Protein engineering 20 years on. Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, 964-970; Turanli-Yildiz B. et al., 2012,タンパク質Engineering Methods and Applications, intechopen.com, これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれている）。
複数の態様において、ポリペプチド、コンカテマーポリペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、およびキメラまたは融合ポリペプチドは、均質になるまで精製することができ、又は部分的に精製することができる。しかしながら、Ｔ細胞エピトープ化合物および組成物が均質になるまで精製されない調製物が有用であることが理解される。重要な特徴は、調製物が、相当量の他の成分の存在下でも、組成物の所望の機能を可能にすることである。したがって、本開示は、様々な程度の純度を包含する。一実施形態では、「細胞性物質を実質的に含まない」という文言は、約３０％未満（乾燥重量で）の他のタンパク質（例えば、汚染タンパク質）、約２０％未満の他のタンパク質、約１０％未満の他のタンパク質、約５％未満の他のタンパク質、約４％未満の他のタンパク質、約３％未満の他のタンパク質、約２％未満の他のタンパク質、約１％未満の他のタンパク質、またはその間の任意の値または範囲を有するポリペプチド、コンカテマーポリペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、およびキメラまたは融合ポリペプチドの調製物を含む。
複数の態様において、本開示のポリペプチド、コンカテマーポリペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、およびキメラまたは融合ポリペプチドが組換えにより得られる場合、組成物は、培養液（培養培地）を実質的に含まないこともでき、例えば、培養液は、ポリペプチド、コンカテマーポリペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、およびキメラまたは融合ポリペプチド調製物中の約２０体積％未満、約１０体積％未満、または約５体積％未満を占める。
「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という表現は、Ｔ細胞エピトープの合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離された、本ポリペプチド、コンカテマーポリペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、およびキメラまたは融合型ポリペプチドの調製物を含む。「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という文言は、例えば、約３０％未満（乾燥重量で）の化学前駆体または他の化学物質、約２０％未満の化学前駆体または他の化学物質、約１０％未満の化学前駆体または他の化学物質、約５％未満の化学前駆体または他の化学物質、約４％未満の化学前駆体または他の化学物質、約３％未満の化学前駆体または他の化学物質、約２％未満の化学前駆体または他の化学物質、または約１％未満の化学前駆体または他の化学物質を有する、本ポリペプチド、コンカテマーポリペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、およびキメラまたは融合ポリペプチドの調整物を含み得る。
複数の態様において、本開示はまた、Ｔ細胞エピトープ化合物および組成物（例えば、本明細書に開示されるペプチドまたはポリペプチド；本明細書に開示されるコンカテマーペプチド；本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物；本明細書に開示されるキメラまたは融合ポリペプチド組成物（これらは複数の態様において、分離、合成、および／または組み換えであってもよい）の１またはそれ以上を含む）の薬学的に許容される塩を含む。「薬学的に許容される塩」とは、薬学的に許容され、親ペプチドまたはポリペプチド（例えば、本明細書に開示されるペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、および／またはキメラまたは融合ポリペプチド）の所望の薬理活性を有する塩を意味する。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、本発明で開示されるポリペプチド、コンカテマーポリペプチド、および／またはキメラまたは融合ポリペプチドの誘導体を指し、ここで、その化合物は、その酸または塩基塩を作ることにより改変される。薬学的に許容される塩の例には、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機酸塩などが含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩としては、例えば、無毒な無機又は有機酸から形成される従来の無毒性塩又は親化合物の第４級アンモニウム塩が挙げられる。例えば、そのような従来の非毒性塩は、２－アセトキシ安息香酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、酢酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、重炭酸、炭酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、１，２－エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリコリアルサニル酸、ヘキシルレゾルシン酸、ヒドラバム酸、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフトエ酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリルスルホン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ナプシル酸、硝酸、シュウ酸、パモイ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、リン酸、ポリガラクツロン酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、亜酢酸、コハク酸、スルファミン酸、スルファニル酸、硫酸、タンニン酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、および一般的なアミン酸、例えば、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、アルギニンから選択される無機および有機酸から得られるものを含むが、これらに限定されるものではない。
（核酸）
複数の態様において、本開示は、本明細書に記載される本開示の１つまたは複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、および／またはキメラまたは融合ポリペプチドの全体または一部をコードする核酸（限定されないが、例えば、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡなど））、ベクター、ウイルス、またはそのハイブリッド（これらはすべて分離、合成または組み換えであってもよい）をも提供する。
複数の態様において、核酸は、発現カセット、プラスミド、および発現ベクター、または組換えウイルスをさらに含むか、またはその中に含まれており、ここで、任意選択で、核酸、または発現カセット、プラスミド、発現ベクター、または組換えウイルスは、細胞（任意選択でヒト細胞または非ヒト細胞）内に含まれ、任意に、前記細胞は、核酸、または発現カセット、プラスミド、発現ベクター、または組換えウイルスで形質導入される。複数の態様において、細胞は、本明細書に開示される、分離、合成、または組換えされた核酸、発現カセット、プラスミド、発現ベクター、または組換えウイルス；および／または本明細書に開示される、分離、合成、または組換えキメラまたは融合ポリペプチド組成物を、例えば、１または複数の、本開示のポリペプチド（本開示のコンカテマーポリペプチドおよびハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物を含む）の中に含むように形質転換、トランスフェクト、または他の方法で工学的に構築される。
複数の態様において、細胞は、哺乳類細胞、細菌細胞、昆虫細胞、または酵母細胞であり得る。複数の態様において、本開示の核酸分子は、ベクターに挿入され、例えば、発現ベクターまたは遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号）または定位注射（Chen SHら、(1994)、Proc Natl Acad Sci USA、91(8):3054-7、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれている）により対象に送達されうる。
同様に、本開示の核酸分子は、プラスミドに挿入することができる。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容される希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むことができ、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれている徐放性マトリックスから構成されることができる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターからそのまま生産され得る場合、医薬製剤は、遺伝子送達システムを生産する１または複数の細胞を含むことができる。
このような医薬組成物は、投与のための指示書とともに、容器、パック、またはディスペンサーに含まれ得る。本明細書に記載の少なくとも１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、および／またはキメラまたは融合ポリペプチドを全体または部分的にコードする上記核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ベクター、ウイルス、またはそのハイブリッド）の複数の態様において、上記核酸は、本開示の１または複数のペプチドまたはポリペプチド（例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド、表２に開示されるような、配列番号２３２－４５２および４５７－４５９を含むハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物）をコードする。
複数の態様において、本開示は、本開示の１または複数のポリペプチド（本開示のコンカテマーポリペプチドおよびハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物を含む）または本開示のキメラまたは融合ポリペプチド組成物をコードする本開示の核酸を含むベクターに関する。複数の態様において、本開示は、本開示のベクターを含んでなる細胞に関する。複数の態様において、細胞は、哺乳類細胞、細菌細胞、昆虫細胞、または酵母細胞であり得る。
本開示の核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含むがこれに限定されない）またはＲＮＡ（ｍＲＮＡを含むがこれに限定されない）であり、一本鎖または二本鎖であってよい。核酸は、典型的には、ＤＮＡまたはＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）である。核酸は、当技術分野で周知の技術、例えば、免疫原性ポリペプチドをコードする配列の合成、またはクローニング、または増幅；細胞膜アドレス配列をコードする配列の合成、またはクローニング、または増幅；適切なベクターおよび細胞における配列のライゲーションおよびそれらのクローニング／増幅によって製造することができる。
本明細書に記載される１つまたは複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、および／またはキメラまたは融合ポリペプチドの全部または一部をコードする本明細書に提供される核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ベクター、ウイルスまたはそれらのハイブリッドであっても）は、種々の供給源から分離し、遺伝子工学的に増幅し、合成的に生成し、および／または組換え発現／生成させることができる。これ（ら）の核酸から生成された組換えポリペプチドは、個々に分離またはクローン化され、所望の活性について試験することができる。任意の組換え発現系を使用することができ、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、細菌、真菌、哺乳類、酵母、昆虫または植物細胞発現系が挙げられる。
複数の態様において本明細書で提供される核酸は、周知の化学合成技術によってｉｎ ｖｉｔｒｏで合成される（例えば、Adams(1983)J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic.Biol.Med.19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33: 7886-7896; Narang (1979) Meth.Enzymol.68: 90; Brown (1979) Meth. Enzymol. Enzymol.68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22: 1859; 米国特許第４，４５８，０６６号、これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、本明細書で提供される核酸の操作のための技術、例えば、サブクローニング、標識プローブ（例えば、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを用いたランダムプライマー標識、ニック翻訳、増幅）、配列決定、ハイブリッド化などは、科学文献および特許文献によく記載されている（例えば、Sambrook編、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed., John Wiley & Sons, Inc.John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed., New York(1997)；ラボラトリーテクニック イン バイオケミストリー＆分子生物学：核酸プロブレムのハイブリッド化、第１部理論および核酸調製、Tijssen編、Elsevier, N.Y. (1993)、これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
本発明のさらなる目的は、本明細書に記載の１つまたは複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、および／またはキメラまたは融合ポリペプチドをコードする核酸分子に関するものである。核酸は、本明細書に記載の１または複数のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、及び／又はキメラ若しくは融合ポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏで産生するために、又はポリペプチドをその表面に発現する細胞を産生するために、又は活性成分が核酸若しくは核酸を含むベクターであるワクチンを製造するために使用されてもよい。核酸は、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖および／または二本鎖のいずれか、または当該技術分野で知られているようなポリヌクレオチドの自然または安定化形態であってもよい。
前述したように、本開示による核酸分子は、原核生物由来または真核生物由来のいずれかを問わず、核酸分子それ自体；プラスミド、ベクター；ウイルスまたは宿主細胞などの形態で提供されてもよい。ベクターには、本発明の核酸分子を含有する発現ベクターが含まれる。ポリペプチドを発現させることができる発現ベクターを調製することができる。異なる細胞種のための発現ベクターは、当該技術分野において周知であり、過度の実験をすることなく選択することができる。一般に、（例えば、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡを含むＲＮＡ）は、発現のために適切な方向および正しいリーディングフレームで、プラスミドなどの発現ベクターに挿入される。必要に応じて、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡを含むＲＮＡ）は、所望の宿主（例えば、細菌）によって認識される適切な転写および翻訳制御ヌクレオチド配列に連結されてもよいが、このような制御は、一般に発現ベクター中で利用可能である。次いで、このベクターは、標準的な技術を使用してクローニングするために宿主細菌に導入される。
本発明のベクターは、例えば、転写プロモーター、および／または転写ターミネーターを含んでいてもよく、ここで、プロモーターは核酸分子と作動可能に連結されており、そして核酸分子は転写ターミネーターと作動可能に連結されている。本開示の１つまたは複数のペプチドまたはポリペプチドは、１つの発現ベクターによってコードされてもよい。そのような核酸分子は、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡワクチンの形態で、ペプチド／ポリペプチドをそれを必要とする対象にｉｎ ｖｉｖｏで送達するためのビヒクルとして機能し得る。
複数の態様において、ベクターは、上記で定義されたような核酸を含むウイルスベクターであってよい。ウイルスベクターは、異なるタイプのウイルス、例えば、豚痘、鶏痘、仮性狂犬病、Ａｕｊｅｚｋｙのウイルス、サルモネラ、ワクシニアウイルス、ＢＨＶ（牛ヘルペスウィルス）、ＨＶＴ（トルコヘルペスウィルス）、アデノウイルス、ＴＧＥＶ（伝染性胃腸炎コロナウイルス）、エリスロウイルス、およびＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）から由来してもよい。また、酵母細胞内で複製および／または堆積するプラスミドなど、他の発現系やベクターも使用することができる。
本開示はまた、本開示のペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、及び／又はキメラ若しくは融合ポリペプチドを調製する方法に関し、この方法は、核酸の発現、及びペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物、および／またはキメラもしくは融合ポリペプチドの回収に適した条件下で上記に定義したような核酸又はベクターを含む宿主細胞を培養することを含んでいる。上記に示されるように、タンパク質およびペプチドは、当該技術分野においてそれ自体既知の技術に従って精製されてもよい。
［医薬組成物及び製剤］
複数の態様において、本開示のＴ細胞エピトープ組成物（例えば、１つまたは複数の、本明細書に開示されるようなポリペプチド；本明細書に開示されるようなコンカテマーペプチド；本明細書に開示されるようなハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物；本明細書に開示されるようなキメラまたは融合ポリペプチド組成物；本明細書に開示されるようなペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物、またはキメラまたは融合ポリペプチド組成物をコードする核酸など、本明細書に開示される核酸；本明細書に開示されるような発現カセット、プラスミド、発現ベクター、組み換えウイルスまたは細胞、並びに本明細書に開示されるようなワクチン；以下、「本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物」）が、医薬組成物または製剤中に含まれていてもよい。
複数の態様において、本発明で開示される医薬組成物または製剤は、一般に、本開示のＴ細胞エピトープ組成物と、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含んでなる。複数の態様において、医薬組成物または製剤は、アジュバントを含んでいる。複数の態様において、前記薬学的組成物は、投与に適している。薬学的に許容される担体および／または賦形剤は、部分的には、投与される特定の組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明で開示されるＴ細胞エピトープ組成物を投与するための医薬組成物の適切な処方は、多種多様である（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, (18TH Ed, 1990), Mack Publishing Co., Easton, PA Publを参照）。
複数の態様において、医薬組成物は、一般に、無菌、実質的に等張、および米国食品医薬品局のすべての適正製造基準（ＧＭＰ）規制を完全に遵守するように製剤化される。本明細書に開示される医薬組成物は、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる関連疾患に対する免疫応答を刺激、誘導、および／または拡大するために好ましく使用でき、ヒトなどの対象におけるＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる関連疾患の治療および／または予防方法において使用することが可能である。
組成物、担体、賦形剤、および試薬を指す「薬学的に許容できる」、「生理学的に許容できる」、およびそれらの文法的変形は、互換的に用いられ、材料が、組成物の投与を禁止する程度の望ましくない生理作用の生成なしに、対象へのまたは対象に投与できることを表わす。例えば、「薬学的に許容される賦形剤」とは、例えば、一般に安全で、無毒で、望ましい医薬組成物の調製に有用な賦形剤を意味し、ヒトの医薬用途と同様に獣医用途にも許容される賦形剤が含まれる。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアゾール組成物の場合には気体であり得る。当業者であれば、本開示の特定のＴ細胞エピトープ組成物について、適切な投与のタイミング、順序および用量を決定することができるであろう。
複数の態様において、そのような担体または希釈剤の好ましい例には、水、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、および５％ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されるものではない。リポソームおよび固定油などの非水性ビヒクルもまた使用することができる。薬学的活性物質に対するこのような媒体および化合物の使用は、当技術分野でよく知られている。任意の従来の媒体または化合物が本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物と不適合である限り、および先に上述したように、組成物におけるそれらの使用が企図される。補足的な活性化合物もまた、組成物に組み込むことができる。
複数の態様において、本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化される。本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物は、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮内、経皮、直腸、頭蓋内、髄腔内、腹膜内、経鼻；膣内；筋肉内経路によって、または吸入剤として投与することが可能である。複数の態様において、本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物は、堆積物（deposite）が蓄積した特定の組織に直接注入することができ、例えば、頭蓋内注入である。他の態様では、筋肉内注射または静脈内注入が、本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物の投与に使用されてもよい。
いくつかの方法において、本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物は、Ｍｅｄｉｐａｄ（商標）デバイスなどの徐放性組成物またはデバイスとして投与されるが、これらに限定されるものではない。複数の態様において、本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物は、例えば、パルスニードルフリー技術（Ｐｕｌｓｅ ５０（商標） マイクロ投与注射システム、パルスニードルフリーシステム； Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ，アメリカ合衆国）などの市販のニードルフリー高圧装置を用いて皮内投与される。複数の態様において、前記市販のニードルフリー高圧装置（例えば、パルスニードルフリー技術）は、以下の利点の１つ以上を与える：非侵襲的、組織外傷を減らす、痛みを減らす、対象に組成物を堆積させるために真皮層に小さな開口を必要とする（例えば、マイクロ皮膚開口を必要とするだけ）、組成物の即時分散、組成物のより良い吸収、組成物の真皮露出が大きい、及び／又は鋭い損傷のリスクが減少する。
複数の態様において、本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物は、本明細書に記載されるような様々な医学的状態の治療に少なくとも部分的に有効な他の薬剤と組み合わせて任意に投与されてもよい。
複数の態様において、非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分：注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌化合物；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化合物；アセテート、クエン酸またはリン酸などの緩衝剤および塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの緊張度調節用化合物を含むことができるが、これらに限定されるものではない。ｐＨは、塩酸や水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。賦形剤の例としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、水、エタノール、ＤＭＳＯ、グリコール、プロピレン、乾燥スキムミルクなどを挙げることができる。また、本組成物は、ｐＨ緩衝試薬、及び湿潤剤又は乳化剤を含有することができる。
複数の態様において、注射可能な使用に適した医薬組成物または製剤は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射可能溶液または分散液の即席の調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与のために、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。いずれの場合も、組成物は無菌であり、容易なシリンジ性が存在する程度に流動的であるべきである。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であり、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保存される。本開示のＴ細胞エピトープ化合物または組成物を含む態様では、凝集体、断片、分解物および翻訳後改変を含むことができるが、これらの不純物がＨＬＡと結合し、同族Ｔ細胞に同じＴＣＲ面を呈する程度に、それらは純Ｔ細胞エピトープと同様の様式で機能すると期待される。
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体とすることができる。
適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合には必要な粒子径の維持、界面活性剤の使用などによって維持することができる。
微生物の作用の防止は、種々の抗菌・抗カビ化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成することができる。
多くの場合、組成物中に等張化合物、例えば、糖類、マニトール、ソルビトールのような多価アルコール、塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の長時間の吸収は、組成物中に吸収を遅延させる化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによってもたらされてもよい。
複数の態様において、無菌注射液（例えば、注射および／または皮内ニードルフリー高圧装置に適した無菌溶液）は、本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物を、必要に応じて上に列挙した成分の１つまたは組み合わせて適切な溶媒中に必要量で入れて、その後、ろ過滅菌することによって調製することが可能である。一般に、分散液は、結合剤を、基本的な分散媒体および上記に列挙した成分の中から必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、あらかじめ無菌濾過したその溶液から活性成分＋任意の追加所望成分の粉末をもたらす真空乾燥および凍結乾燥である。さらに、本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物は、活性成分の持続的または脈動的な放出を可能にするような方法で調合することができるデポ注射剤またはインプラント製剤の形態で投与することが可能である。
複数の態様において、経口組成物は一般に不活性希釈剤または食用担体を含み、ゼラチンカプセルに封入されるか、または錠剤に圧縮されることができる。複数の態様において、経口治療投与の目的のために、結合剤は賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用することができる。経口組成物はまた、洗口剤として使用するための液体担体を用いて調製することができ、液体担体中の化合物は、経口的に適用され、スイッシュして去痰するかまたは飲み込まれる。薬学的に適合する結合化合物、および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。複数の態様において、錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の成分：微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたは乳糖などの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Sterotes）などの潤滑剤；コロイド性二酸化ケイ素などの滑剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味化合物；またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料などの香味剤化合物などのいずれか、または類似の性質の化合物を含むことができる。
吸入による投与のために、本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物は、適切な推進剤、例えば二酸化炭素のようなガス、またはネブライザーを含む加圧容器またはディスペンサーからのエアゾールスプレーの形態で送達することができる。
複数の態様において、本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物の全身投与はまた、経粘膜または経皮的手段によることができる。経粘膜または経皮投与の場合、浸透させるべきバリアに適切な浸透剤が製剤中に使用される。このような浸透剤は、一般に当該技術分野において知られており、例えば、経粘膜投与の場合、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは坐薬の使用により達成することができる。経皮投与の場合、Ｔ細胞エピトープ化合物および組成物は、クリーム状軟膏(ointment)、軟膏(salve)、ゲル、またはクリームに配合し、当該技術分野で一般に知られているように、局所的にまたは経皮パッチ技術を通じて適用することができる。
複数の態様において、本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いて）または保持浣腸の形態で調製することが可能である。
複数の態様において、本発明のＴ細胞エピトープ化合物および組成物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のような、体からの急速な排除に対してＴ細胞エピトープ化合物および組成物を保護する担体とともに調製される。生分解性、生体適合性ポリマーは、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などを使用することができる。このような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。
材料はまた、商業的に、例えば、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．から入手することができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞に標的化されたリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、当業者に公知の方法に従って調製することができる（米国特許第４，５２２，８１１号、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
複数の態様において、本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物は、所望の部位へのＴ細胞エピトープ化合物および組成物の徐放を可能にするバイオポリマー固体支持体内に移植されてもよいか、またはそれに連結されてもよい。
複数の態様において、投与の容易さおよび投与量の均一性のために、経口または非経口組成物を投与単位形態で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される用量単位形態は、治療される対象に対する単位用量として適した物理的に離散した単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の結合剤を含有する。本開示の投与単位形態の仕様は、結合剤の固有の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに対象の治療のためにそのようなＴ細胞エピトープ化合物および組成物を配合する技術に固有の制限によって規定され、かつそれに直接依存する。
本明細書に記載の医薬組成物の態様において、組成物は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４，少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の本発明で開示されるペプチドもしくはポリペプチド（コンカテマーポリペプチド、ハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）またはそのようなペプチドもしくはポリペプチド（コンカテマーポリペプチド、ハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）をコードする核酸を提供することができる。
例えば、複数の態様において、医薬組成物は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０のペプチドまたはポリペプチド（４０までの任意の値または範囲を含むペプチドまたはポリペプチドを含む）であって、１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の割合で分布している１～１２の追加のアミノ酸を有する１または複数のペプチドまたはポリペプチド、本明細書に開示されるようなコンカテマーペプチド；
配列番号２３２－４５２および４５７－４５９のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む本明細書に開示されるようなハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物；および本明細書に記載の、そのようなペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、および／またはその断片および変異体をコードする核酸；を含むことができる。
［ワクチン組成物］
本明細書で使用される「ワクチン」という用語は、病原体に対する動物（例えば、ヒト）の免疫系を引き起こす、刺激する、または増幅するために使用されてもよい薬剤を含む。本発明のワクチンは、ＣＯＶＩＤ－１９を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）または中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる関連疾患に対する免疫を引き起こすかまたは刺激もしくは増幅させることが可能である。
用語「免疫化」は、対象に免疫原を送達する工程を含む。免疫化は、例えば、動物が以前に曝露された病原体または抗原に対して向けられた、ヒトなどの免疫された動物においてＴリンパ球が病原体を殺傷または抑制することができる、高レベルの抗体および／または細胞応答の継続を可能にし得る。
本開示のワクチンは、上記のような本開示のＴ細胞エピトープ化合物または組成物の免疫学的有効量を含み、複数の態様では、薬学的に許容されるビヒクル中に、任意に追加の賦形剤および／またはアジュバントと一緒に含まれる。本開示の組成物によるワクチン接種の結果、動物、および複数の態様においてヒトは、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる関連疾患に対して少なくとも部分的または完全に免疫となり、あるいはＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる中程度または重度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および／または関連疾患を発症することに対して抵抗性となる。本発明で開示されるワクチンは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞応答を含む体液性応答および／または細胞性応答を誘発するために使用されてもよい。
複数の態様において、ヒトなどの動物対象は、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる関連疾患の有害な生理学的症状または効果のすべてが有意に減少、改善または完全に防止される程度まで保護される。
実際には、免疫学的に有効な用量に必要な正確な量は、対象の年齢および一般状態、製剤の性質および投与様式などの要因によって、対象によって異なる場合がある。適切な「有効量」は、当業者であれば、日常的な実験のみを用いて決定することができる。例えば、ヒト対象を含む動物対象の体重、ワクチンの濃度および他の典型的な因子に基づいて最小有効量を見出すために、ワクチンの適切な投与量を決定または量を定める（titrate）方法が当技術分野で知られている。本開示のワクチンの投与量は、ワクチン接種される動物（例えば、家畜豚／豚）の種、品種、年齢、サイズ、ワクチン接種歴、および健康状態、ならびに投与経路、例えば、皮下、皮内、経口筋肉内または静脈内投与に依存することになる。本開示のワクチンは、単回投与または反復投与で投与することができる。本開示のワクチンは、単独で投与することができ、または他のブタ免疫原性またはワクチン組成物などの１または複数のさらなる組成物と同時または逐次投与することができる。組成物が異なる時間に投与される場合、投与は互いに別々であっても、時間的に重なっていてもよい。複数の態様において、ワクチンは、本開示のポリペプチドおよび／または核酸の、その間の任意の値または範囲を含む０．１～３０００μｇの単回投与からなる。
好適な免疫応答を誘発するワクチンの投与量、その中の成分の濃度および投与のタイミングは、血清の抗体価、例えばＥＬＩＳＡおよび／または血清中和アッセイ分析による方法および／またはワクチン接種チャレンジ評価などの方法により決定することが可能である。
複数の態様において、ワクチンは、精製された形態の新規の、治療用Ｔ細胞エピトープ化合物または本明細書に開示される組成物；本明細書に開示される医薬組成物または製剤）を、任意に、任意の適切な賦形剤、キャリア、アジュバント、および／または追加のタンパク質抗原と組み合わせて含んでいる。
別の態様では、ワクチンは、任意選択で、任意の適切な賦形剤、担体、アジュバント、および／または追加のタンパク質抗原と組み合わせて、上記で定義された核酸を含んでなる。複数の態様において、ワクチンは、上記で定義されたような核酸を含むウイルスベクターを含んでなる。複数の態様において、ワクチンは、１つまたは複数のプラスミドベクターを含んでなる。
本開示のＴ細胞エピトープ化合物又は組成物を含むワクチン構築物を対象に投与すると、強いＴ細胞媒介免疫応答が開始されてもよいが、液性免疫応答は誘導されない可能性がある。したがって、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる関連疾患に対するワクチンの態様は、推定Ｔ細胞エピトープの組み合わせを、弱毒生ウイルス（ＬＡＶ、例えば弱毒生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）または不活化ウイルス（例えば不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のいずれかの組み合わせとともに含んでいる。このワクチン組成物（推定Ｔ細胞エピトープとＬＡＶまたは不活化ウイルスの両方を含む）を対象に投与すると、細胞性免疫応答と液性免疫応答の両方が誘導され、それによってヒトを含む動物において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する包括的な免疫性が付与されてもよい。
ワクチンは、当業者にそれ自体知られている他の成分、例えば、投与経路に応じて、薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、アジュバント、凍結乾燥安定剤、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または粘性増強添加物、および防腐剤を含んでいてもよい。
薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤の例としては、脱塩水または蒸留水；生理食塩水；ピーナッツ油、アラキス油、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油またはココナッツ油などの植物ベースの油；メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン、メチルフェニルポリソルポキサンなどのポリシロキサンを含むシリコーン油；揮発性シリコーン；軽質流動パラフィン油、重質流動パラフィン油などの鉱油；スクワレン；メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体；エタノールまたはイソプロパノールなどの低級アルカノール類；低級アラルカノール類；低級ポリアルキレングリコールまたは低級アルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコールまたはグリセリン；脂肪酸エステル、例えばパルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピルまたはオレイン酸エチル；ポリビニルピロリドン；寒天；カラギーナン；トラガカントゴムまたはアカシアゴム；およびワセリンなどが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。典型的には、担体（単数または複数）は、ワクチン組成物の１０重量％～９９．９重量％を形成し、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、リン酸二水素カリウム、それらの混合物などの当技術分野で公知の試薬を用いた従来の方法によって緩衝されてもよい。
アジュバントの例としては、水中油型エマルジョン、水酸化アルミニウム（ミョウバン）、免疫刺激複合体、非イオン性ブロックポリマーまたはコポリマー、サイトカイン（ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γなど）、サポニン、モノリン脂質Ａ（ＭＬＡ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、ＭＣＡなどがあるが、それだけにとどまらない。他の適切なアジュバントとしては、例えば、硫酸アルミニウムカリウム、大腸菌から分離された熱安定性又は熱安定性エンテロトキシン（複数可）、コレラ毒素又はそのＢサブユニット、ジフテリア毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、フロイントの不完全又は完全アジュバント等が挙げられる。ジフテリア毒素、破傷風毒素、百日咳毒素などの毒素系アジュバントは、使用前に、例えばホルムアルデヒドで処理することにより不活化されてもよい。
凍結乾燥安定剤の例としては、例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、デキストラン又はグルコース等の炭水化物、アルブミン又はカゼイン等のタンパク質及びこれ（ら）の誘導体等を挙げることができる。
ワクチンは、さらに、少なくとも１つの追加の病原体、例えば、アクチノバチルス・プレウロプネウノミアのようなブタ病原体；アデノウイルス；東部馬脳脊髄炎ウイルスなどのアルファウイルス；バランチウム・コリ；ボルデテラ・ブロンチセプティカ；ブラキスピラ属、好ましくは、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア、ブラキスピラ・ピロシコリ、ブラキスピラ・イノセンス、ブタ流産菌、好ましくは次亜種１、２および３；古典豚熱ウイルス、クラミジアおよびクラミドフィラ属、好ましくはクラミジア・ぺコルムおよびクラミジア・アボルタス；クロストリジウム属、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・ペルフリンゲンス・タイプＡ、ＢおよびＣ、クロストリジウム・ノービイ、クロストリジウム・セプチクム、クロストリジウム・テタニ；消化器および呼吸器コロナウイルス；クリプトスポリジウム・パルバム；アイメリア属菌（アイメリア亜種；エペリトロズーニス・スイス（現マイコプラズマ・ヘモスイス；エリジペロスフィックス・ルジオパシエ；大腸菌；ヘモフィルス・パラスイス（好ましくは亜型１、７および１４）；ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス；イソスポラ・スイス；日本脳炎ウィルス；ローソニア・イントラセルラリスレプトスピラ亜種、好ましくは、レプトスピラ・アウストラリス、レプトスピラ・カニコラ、レプトスピラ・グリッポティフォサ、レプトスピラ・イクテロヘモラギカエ、レプトスピラ・インターロガンス、レプトスピラ・ポモナおよびレプトスピラ・タラソビ；マンハイミア・ヘモリチカ；マイコバクテリウム属菌、好ましくはマイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーおよびマイコバクテリウム・ボービス、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ；パルボウイルス；パスツレラ・ムルトシダ；豚のサーコウイルス；豚のサイトメガロウイルス；豚のパルボウイルス、ブタ生殖および呼吸症候群ウィルス：仮性狂犬病ウイルス；ロタウイルス；サギヤマウイルス；サルモネラ属菌、好ましくはサルモネラ・チフィリウムおよび豚コレラ菌；ブドウ球菌属菌、好ましくはスタファロウカカス・ヒイカス；ストレプトコックス属菌，好ましくはトレプトコックス・スイス；豚サイトメガロウイルス；豚ヘルペスウイルス；豚インフルエンザウイルス；豚ポックスウイルス；トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）；豚の水疱性口内炎ウイルスおよび発疹ウイルス；または豚サーコウイルスの他の分離物および亜型などを含んでいてもよい。
本開示のワクチン組成物は、水溶液、油中水型または水中油型エマルジョン、シロップ、エリキシル、チンキなどの液体製剤であってもよく、または滅菌懸濁液もしくはエマルジョンなどの非経口、皮下、皮内、筋肉内または静脈内投与（例えば、注射投与）用製剤であってもよい。このような製剤は当技術分野で知られており、典型的には、抗原および他の典型的な添加物を適切な担体または溶媒系に溶解させることによって調製される。液体製剤はまた、懸濁剤または乳化剤を含む懸濁液およびエマルジョンを含むことができる。
投与経路は、経皮、粘膜投与経由、または非経口経路（皮内、筋肉内、皮下、静脈内、または腹腔内）経由とすることができる。本開示によるワクチン組成物は、単独で投与されてもよく、または他の治療または療法と共投与もしくは順次投与することができる。本開示のワクチンは、好都合には、経鼻投与、経皮投与（すなわち、全身吸収のために皮膚表面上または皮膚に適用）、非経口投与、眼球投与等されてもよい。非経口的な投与経路としては、筋肉内、静脈内、皮内、および腹腔内などの経路が挙げられるが、これらに限定されない。態様において、本開示のワクチンは、皮内投与され、例えば、当技術分野で知られているようにマイクロ針パッチを使用することによって、またはパルスニードルフリー技術（Ｐｕｌｓｅ ５０（商標）Ｍｉｃｒｏ Ｄｏｓｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ， パルスニードルフリー Ｓｙｓｔｅｍｓ； Ｌｅｎｅｘａ， ＫＳ， ＵＳＡ）などの商用ニードルフリー高圧デバイスを使用することによって、投与される。
本開示はまた、上述するペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、キメラまたは融合ポリペプチド、核酸、細胞、ベクター、医薬、またはワクチンを前記動物に投与する工程を含む、動物（例えば、ヒト）において免疫化または免疫応答を誘導する方法に関するものである。
本開示はまた、上述するペプチド、ポリペプチド、コンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物、キメラまたは融合ポリペプチド、核酸、細胞、ベクター、医薬、またはワクチンを前記動物に投与する工程を含む、動物（例えばヒト）におけるＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による関連疾患を治療および／または予防する方法に関するものである。
本開示のワクチンは、好都合には、経鼻投与、経皮投与（すなわち、全身吸収のために皮膚表面上または皮膚に適用）、非経口投与、眼球投与等することができる。非経口的な投与経路としては、筋肉内、静脈内、及び腹腔内等の経路が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示のワクチンの投与量は、ワクチン接種される動物（例えば、ヒト）の種、品種、年齢、サイズ、ワクチン接種歴、および健康状態、ならびに投与経路、例えば、皮下、皮内、経口筋肉内、または静脈内投与に依存することになるだろう。本開示のワクチンは、単回投与または反復投与で投与されてもよい。本開示のワクチンは、単独で投与することができ、または他のブタ免疫原性またはワクチン組成物などの１または複数のさらなる組成物と同時または逐次投与することができる。組成物が異なる時間に投与される場合、投与は互いに別々であっても、時間的に重なっていてもよい。
複数の態様において、本開示は、本発明で開示されるワクチン組成物の複数のラウンドの投与を含む。例えば、ワクチンは、１週間、２週間、３週間、および／または４週間の間隔でブーストすることができる。このようなことは、病原体に対する保護を改善するために免疫系を改善またはブーストするために、当技術分野で知られている。さらに、本開示は、本発明で開示されるワクチン組成物のさらなる投与が保証されるかどうかを決定するために、対象の免疫系を評価することも含み得る。いくつかの態様において、複数回の投与は、本発明で開示されたワクチン（例えば、本明細書に開示されるポリペプチドベースまたは核酸ベース）を使用したワクチン接種のプライムブースト戦略の開発（development）を含んでもよい。そのようなことは、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる関連疾患に対する逐次免疫原性応答を生成する機会を提供し得る。
いくつかの態様において、ワクチンは、１、２、３、４、５、または６週間の間隔でブーストされてもよい。いくつかの態様において、ワクチンは、２週間間隔でブーストされる。いくつかの態様では、ワクチンは３週間間隔でブーストされる。いくつかの態様において、ペプチドベースのワクチンおよび核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）ワクチン接種は、対象の免疫系に異なる様式で提示される同じ免疫原による免疫のレジメンを提供するために代替様式で達成されてもよい。
一態様において、本開示のワクチン組成物は、２０１９－ｎＣｏＶ感染に感受性があるか、またはその他のリスクがある対象に投与され、対象自身の免疫応答能力を向上させる。ワクチンが投与される対象は、１つの態様において、ヒトである。動物は、２０１９－ｎＣｏＶまたは近縁のウイルスによる感染に対して感受性であってよい。
一態様において、本開示のワクチン組成物は、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による関連疾患に感受性があるか又はその他のリスクがある対象に投与され、対象自身の免疫応答能力を増強させる。ワクチンが投与される対象は、１つの態様において、ヒトである。動物は、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症（または近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による関連疾患に感染しやすいものであってよい。
本明細書に記載のワクチンの態様において、ワクチンは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の本発明で開示されるペプチドもしくはポリペプチド（コンカテマーポリペプチド、および／またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物を含む）、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチド（コンカテマーポリペプチド、および／またはハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物を含む）をコードする核酸を含むことができる。
例えば、複数の態様において、ワクチンは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０のペプチドまたはポリペプチド（４０までのその間の任意の値または範囲を含むペプチドまたはポリペプチドを含む）であって、１または複数の配列番号４－２２４および４５４－４５６、ならびにそれらの断片および変異体、ならびに任意に配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の割合で分布している１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるアミノ酸配列を有する１または複数のペプチドまたはポリペプチドを含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド；本明細書に開示されるようなコンカテマーペプチド；配列番号２３２－４５２および４５７－４５９のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含むハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物；本明細書に記載されるようなペプチド、ポリペプチド、またはコンカテマーペプチド、ハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物、および／またはそれらの断片および変異体をコードする核酸を含むことができる。
本開示はまた、上記のようなポリペプチド（コンカテマーポリペプチド、ハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物、およびキメラまたは融合ポリペプチドを含む）、核酸またはワクチンの免疫学的に有効な量を含む容器を提供する。本開示はまた、免疫学的に有効な量のワクチンを含む任意に無菌の容器、動物にワクチンを投与するための手段、及び任意選択でＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（又は近縁ウイルス）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患を治療及び／又は予防するための組成物の免疫学的有効量の投与についての情報を含む取扱説明書を含む、ワクチン接種キットを提供する。
［治療法］
本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物によるＴ細胞の刺激は、対応する内在性免疫応答を刺激、誘導、および／または拡大することができ、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む対応する内在性の免疫応答を刺激、誘発、および／または拡大し、複数の態様ではサイトカインおよびケモカインの分泌が増加する。
複数の態様において、本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物によって活性化されたＴ細胞は、対象において、ＣＯＶＩＤ－１９などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する細胞媒介性免疫能を刺激する。
複数の態様において、本開示のＴ細胞エピトープ化合物および組成物によって活性化されたＴ細胞は、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または密接な関連ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する細胞媒介性免疫を刺激する。
複数の態様において、本開示は、それを必要としている対象に治療効果量のＴ細胞エピトープ組成物（本発明に係る化合物または組成物）を投与することにより、免疫応答（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対して）を刺激、誘導、および／または拡大する方法、に関する。
複数の態様において、本開示は、ＣＯＶＩＤ－１９などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）による疾患を、それを必要としている対象に、治療的効果量の本開示のＴ細胞エピトープ化合物または組成物を投与して予防、処置または改善する方法に関する。
［本開示のアッセイ、方法、およびキット］
複数の態様において、本開示は、Ｔ細胞または免疫系の他の細胞を含む対象からのサンプルを、本開示の１つまたは複数のペプチドまたはポリペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）とインキュベートすることによって、対象におけるＣＭＩ応答を含む免疫応答を測定する方法に関する。複数の態様において、ＩＦＮ－γまたは他のサイトカインもしくは免疫エフェクター分子（複数可）の産生が、次いで検出される。免疫エフェクターの存在またはレベルは、対象の細胞媒介応答性のレベルを示す。好ましくは、サンプルは、抗原を含む適切な容器に採取された全血である。任意選択で、デキストロースなどの単糖がインキュベーション混合物に添加される。
したがって、本開示の一態様は、対象、好ましくはヒト対象、より好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルス（重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）または中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）等）に潜在感染したヒト対象におけるＣＭＩ応答を測定する方法に関するものであり、前記方法は、前記対象からサンプルを収集する工程であって、前記サンプルが、抗原による刺激後免疫エフェクター分子を産生する免疫系の細胞を含む、工程と、前記サンプルを本開示の１または複数のペプチドとインキュベートする工程と、次に免疫エフェクター分子の存在またはレベルの上昇を測定する工程であって、前記免疫エフェクター分子の存在またはレベルが前記対象の細胞仲介免疫応答を実行する能力を示す工程である工程、を含む。複数の態様において、前記免疫エフェクター分子の存在またはレベルの上昇は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルス感染に対して細胞媒介免疫応答を行う前記対象の能力を示すものである。
「対象」との用語は、霊長類、家畜動物（例えば、羊、牛、豚、馬、ロバ、山羊）、実験用試験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター）、伴侶動物（例えば、犬、猫）、鳥類（例えば、家禽鳥、鳥類）、爬虫類、両生類などの人間又は非人類種を含む。したがって、本開示は、ヒトの医学において適用性を有するだけでなく、家畜および獣医学および野生生物の用途を有する。しかしながら、最も好ましくは、対象はヒトであり、ＣＭＩ応答アッセイは、ＣＯＶＩＤ－１９または関連コロナウイルス感染に対する応答性のスクリーニングにおいて適用性を有する。
「免疫細胞」との用語は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含むリンパ球、Ｔ細胞、（ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋細胞）、Ｂ細胞、マクロファージ及び単球、樹状細胞又は直接若しくは間接の抗原刺激に応答してエフェクター分子を生成できる他の任意の細胞のような細胞を含んでいる。好ましくは、免疫細胞はリンパ球であり、より詳細にはＴリンパ球である。
免疫エフェクター分子は、細胞の活性化または抗原による刺激に応答して産生される一連の分子のいずれであってもよい。ＩＦＮ－γのようなインターフェロン（ＩＦＮ）は特に有用な免疫エフェクター分子であるが、その他に、インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０またはＩＬ－１２、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、顆粒球（Ｇ）－ＣＳＦまたは顆粒球マクロファージ（ＧＭ）－ＣＳＦなどのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、その他多くのサイトカイン、補体または補体系に属する成分なども含まれる。
したがって、複数の態様において、本開示は、対象におけるＣＭＩ応答を測定するための方法を提供し、前記方法は、前記対象からサンプルを収集する工程であって、前記サンプルが、本開示の１つまたは複数のペプチド（例えば、ハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）による刺激後にＩＦＮ－γ分子を産生できる免疫系の細胞から構成されている、工程と、前記サンプルを本開示の１または複数のペプチドとインキュベートする工程と、ＩＦＮ－γ分子の存在またはレベルの上昇を測定し、前記ＩＦＮ－γ分子の存在またはレベルが、細胞媒介免疫応答を行う前記対象の能力を示す工程と、を含む。
対象から採取されたサンプルは、一般に採血管に入れられる。採血管には、血液吸引チューブ（blood drawing tube）または他の容器などが含まれる。便利なことに、サンプルが全血である場合、採血管はヘパリン化されている。あるいは、血液を採取した後にヘパリンを添加する。全血が好ましく最も便利なサンプルであるにもかかわらず、本発明は、リンパ液、脳液、組織液、鼻水や肺液などの呼吸液など、免疫細胞を含む他のサンプルにも適用される。採血管の使用は、標準的な自動化された実験室システムと互換性があり、これらは大規模かつランダムアクセスサンプリングでの分析に適合している。また、採血管は取り扱いコストを最小限に抑え、検査室での全血や血漿への曝露を減らすことができるため、検査室職員が病原体に感染するリスクを低減することができる。
インキュベーション工程と捕集管の組み合わせは特に効果的で、デキストロースなどのサンプル糖の存在下で細胞をインキュベートするオプション機能とともに、アッセイの感度を向上させる。
インキュベーション工程は、５～７２時間、より好ましくは５～４０時間、さらに好ましくは８～２４時間、またはその間の任意の値もしくは範囲であってよい。複数の態様において、インキュベーション工程は、デキストロースなどの単糖の存在下で実施される。
免疫エフェクター分子の検出は、タンパク質レベルまたは核酸レベルで行うことができる。その結果、「前記免疫エフェクター分子の存在又はレベル」との用語は、直接データ及び間接データを含む。例えば、ＩＦＮ－γ ｍＲＮＡのレベルが高いことは、ＩＦＮ－γのレベルの上昇を示す間接的なデータである。
免疫エフェクターに対するリガンドは、これらの分子の検出および／または定量に特に有用である。免疫エフェクターに対する抗体は、特に有用である。本明細書で企図されるアッセイのための技術は、当技術分野で知られており、例えば、サンドイッチアッセイ、ＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＳｐｏｔが含まれる。
「抗体」との用語は、抗体の一部、哺乳類化（例えばヒト化）抗体、組換えまたは合成抗体、ならびにハイブリッドおよび単鎖抗体を含む。当技術分野で知られているような広範囲のイムノアッセイ技術が、ＵＳ７，６０８，３９２（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているものなど、本開示に適合することが理解されるべきである。
複数の態様において、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルス（重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）または中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）など）ペプチド特異的Ｔ細胞をアッセイする方法に関し、この方法は、Ｔ細胞を含む液体を用意する工程と、その液体に本開示の１または複数のペプチドまたはポリペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）を加える工程と、サイトカイン放出を引き起こすために液体をインキュベーションする工程と、放出したサイトカインを検出する工程を含む。好ましくは、本方法は、サイトカインに対する固定化第一抗体を有する表面と接触しているＴ細胞を含む液体を準備する工程と、液体にペプチドを加える工程と、得られた液体混合物を、ペプチドに対して生体内で予め感作されている任意のペプチド特異的Ｔ細胞にサイトカインを分泌させる条件下にインキュベートする工程と、固定化第一抗体に結合した分泌サイトカインを検出する工程を含む。
複数の態様において、細胞は、好ましくは、末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）である。それらは好適には、ＣＯＶＩＤ－１９感染または関連するコロナウイルス感染に苦しんでいる、または苦しんでいたことが知られている患者から採取することができる。複数の態様において、使用される細胞は新鮮である。
複数の態様において、アッセイは、特定のペプチドに対してｉｎ ｖｉｖｏで活性化または前感作されたペプチド特異的Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋またはＣＤ４＋細胞を同定または定量するために使用される。
複数の態様において、これらは、非再刺激Ｔ細胞（unrestimulated T-cells）、すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養による分裂／分化をもたらす必要なしに、即時エフェクター機能を発揮することができる細胞である。対象となるペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）がこのような細胞に提示されると、細胞は様々なサイトカインを分泌するが、そのうちの任意の１つがこのアッセイの目的のために選択されてもよい。複数の態様において、選択されたサイトカインはインターフェロンγ（ＩＦＮ γ）である。しかしながら、ＩＦＮ－γのようなインターフェロン（ＩＦＮ）は特に有用な免疫エフェクター分子であるが、その他に、インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０またはＩＬ－１２、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、顆粒球（Ｇ）－ＣＳＦまたは顆粒球マクロファージ（ＧＭ）－ＣＳＦなどのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）など多くのサイトカインが挙げられる。
分泌されたサイトカインは、文献で知られている様々な方法のいずれかによって検出することができる。好ましくは、アッセイ方法は、ＩＦＮ－γまたは他のサイトカインに対する固定化された第１抗体を担持する表面を提供することを含む。ＰＢＭＣまたは他の新鮮な細胞を含む液体は、その固定化された抗体と接触するように置かれる。ＰＢＭＣの約３０％はＣＤ８＋細胞である。
複数の態様において、本方法は、本開示のペプチド又はポリペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）を液体に添加する工程を含む。活性化されたまたは予め感作されたペプチド特異的Ｔ細胞（ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）が試験液体中に存在する場合、それらはＩＦＮ－γなどの適切なエフェクターサイトカインを分泌することによって応答し、その後、固定化抗体に結合されるようになる。複数の態様において、本開示の１または複数のペプチドまたはポリペプチドは、未結合の形態で新鮮な細胞に添加されてもよい。このようなペプチドまたはポリペプチドでパルス処理された培養細胞を添加することは可能であるが、定義されたペプチド／ポリペプチドエピトープを使用する場合、これは必要ではない。ペプチド／ポリペプチドは、観察可能なシグナルを生成するのに十分な量を添加する必要があり、一態様では、液中の好ましい濃度範囲は０．０１から１００μＭ特に０．５～５．０μＭである。
インキュベーションは、選択された特定のペプチド／ポリペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）にｉｎ ｖｉｖｏで予め感作されたＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋細胞がＩＦＮ－γまたは他のサイトカインを分泌するのに十分な時間継続されるべきである。複数の態様において、静止しているＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋細胞が分化してペプチドによって活性化され、サイトカインを分泌し始める時間を持つほど、インキュベーションは長く続かないはずである。これは、４～２４時間、より詳細には６～１６時間のインキュベーション時間を示唆する。試験のインキュベーション部分が、１日または一晩で、かつｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞培養に必要な無菌条件を使用せずに実施できることは、本発明の利点である。
複数の態様において、インキュベーションの間、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋細胞によって分泌される任意のＩＦＮ－γ又は他のサイトカインは、表面に固定化された第一抗体に結合するようになる。インキュベーションの後、表面は、結合していない物質を除去するために洗浄されてもよい。検出のために、複数の態様において、サイトカインに対する標識された第２抗体が使用される場合がある。これを表面に塗布すると、存在するあらゆるサイトカインと結合する。複数の態様において、第２抗体は、第１抗体とは異なるエピトープを認識することが望ましい。複数の態様において、第１および第２抗体の一方または両方は、モノクローナルであってもよい。標識は、放射性同位体、発色または化学発光を生成する酵素、蛍光基または質量分析または屈折率（例えば表面プラズモン共鳴による）による検出のための基を含む、当該分野で従来使用されている任意のものであってよい。標識された抗体を用いるのが便利であるが、必ずしもそうする必要はない。サイトカインに特異的に結合する任意の試薬が標識されて使用されうる。標識の検出およびおそらく定量は、当該分野でよく知られ、使用される標識の性質に適した手段によって行われ、米国特許７，６０８，３９２（その全体が参照によりここに組み込まれる）に開示されるようなものであってよい。
複数の態様において、アッセイは、マルチウェルプレートで簡便に実施されてもよい。プレートの各ウェルは、結合した第１抗体を担持する表面を有する。各ウェルには、適切な数、例えば１０３－１０６の細胞を含む液体が加えられる。異なるペプチドおよび／またはコントロールがプレートの個々のウェルに添加される。インキュベーション中にサイトカインを分泌した細胞は、スポット（spot forming cellまたはＳＦＣ）として現れ、各ウェル中のこれらの数または密度を容易に決定することができる。
複数の態様において、本開示は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（または関連コロナウイルス、例えば重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）または中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ））Ｔ細胞応答（複数の態様においては、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む）を検出する方法であって、個体のＴ細胞の集団に、本開示のペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）を接触させる工程（前記接触工程では、前記１または複数のペプチドは、ペプチドを認識するＴ細胞受容体に結合する類似体によって置換されていてもよい）、およびＴ細胞集団のＴ細胞がペプチド（複数可）を認識するかどうかを決定する工程を含む、検出方法である。
さらに、複数の態様において、本開示は、宿主における、または宿主をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２もしくは関連コロナウイルスに曝露して、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルス感染（重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）または中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）など）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患を診断する方法であって、この方法は、（ｉ）宿主からのＴ細胞の集団を、１または複数の、本発明で開示されるようなペプチドまたは類似体、および前記ペプチドのいずれかを認識するＴ細胞受容体に結合できる類似体に接触させる工程と、（ｉｉ）前記Ｔ細胞集団のＴ細胞が前記ペプチドおよび／または類似体を認識するか否かを決定する工程を含む、方法を提供する。
複数の態様において、宿主は一般にヒトであるが、動物であってもよく、典型的にはマイコバクテリアに自然または人為的に感染し得るものである。宿主は、霊長類、牛、羊、豚、アナグマまたはげっ歯類、例えばマウスまたはラットなどの哺乳類であってもよい。宿主は、典型的には、活動中または潜伏中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染または関連コロナウイルス感染であるか、または最近そのような感染に罹患したことがある。宿主は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染または関連コロナウイルス感染に曝露された健康な接触者であってもよい。したがって、本方法は、そのようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染または関連コロナウイルス感染を有する個人の健康な接触者を追跡するために使用されてもよい。また、本方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者または関連コロナウイルス感染者、あるいは健康な接触者の母数を測定するための集団調査に用いることができる。
複数の態様において、本方法においてペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）を認識するＴ細胞は、一般に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルスからの抗原に対してｉｎ ｖｉｖｏで予め感作されたＴ細胞である。これらの抗原経験Ｔ細胞は、一般に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染又は関連コロナウイルス感染に曝された宿主の末梢血に存在する。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。
用語「ペプチド」または「ポリペプチド」は、文脈上他に必要とされない限り、そのペプチドの類似体（この用語の通常の使用によって定義されるペプチドでない場合もある）も含むと理解される。
複数の態様において、Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）と接触させることができ、Ｔ細胞がペプチドを認識するか否かの決定は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。複数の態様において、Ｔ細胞が本開示のペプチドまたはポリペプチドを認識するかどうかの決定は、一般に、ペプチドまたはポリペプチドの存在下でのＴ細胞の状態の変化を検出すること、またはＴ細胞がペプチドまたはポリペプチドに結合するかどうかを決定することによって行われる。状態の変化は、一般に、Ｔ細胞レセプターがペプチドまたはポリペプチドを結合した後のＴ細胞の抗原特異的な機能活性によって引き起こされる。一般に、Ｔ細胞受容体と結合すると、ペプチドは、通常、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に存在するＭＨＣクラスＩＩ分子またはＭＨＣクラスＩ分子と結合する。
複数の態様において、Ｔ細胞の状態の変化は、サイトカイン、特にＩＦＮ－γ、ＩＬ－２またはＴＮＦ－αなどのＴ細胞からの物質の分泌の開始または増加であってよい。複数の態様において、選択されるサイトカインは、インターフェロン－γ（ＩＦＮ γ）である。しかしながら、ＩＦＮ－γのようなインターフェロン（ＩＦＮ）は特に有用な免疫エフェクター分子であるが、他には、インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０またはＩＬ－１２、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、顆粒球（Ｇ）－ＣＳＦまたは顆粒球マクロファージ（ＧＭ）－ＣＳＦなどのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）といった範囲のサイトカインがある。物質は、通常、特異的結合剤に結合させ、特異的結合剤／物質複合体の存在を測定することにより検出することができる。特異的結合剤は、典型的には、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体などの抗体である。サイトカインに対する抗体は市販されており、また標準的な技術で作製することも可能である。
複数の態様において、特異的結合剤は固体支持体上に固定化される。物質が結合した後、固体支持体は任意に洗浄され、薬剤に特異的に結合していない物質を除去することができる。複数の態様において、薬剤／物質の複合体は、複合体を結合する第２の結合剤を用いることによって検出されてもよい。典型的には、第２結合剤は、第１結合剤と結合する部位とは異なる部位で物質と結合する。複数の態様において、第２結合剤は好ましくは抗体であり、検出可能な標識によって直接的または間接的に標識されている。
したがって、第２結合剤は、通常、検出可能な標識によって直接的または間接的に標識された第３の剤によって検出される可能性がある。例えば、第２結合剤はビオチン部位を含み、ストレプトアビジン部位を含む第３の剤と通常検出可能なラベルとしてのアルカリホスファターゼによる検出を可能にしてもよい。
複数の態様において、使用される検出系は、当該技術分野において公知であるようなｅｘ ｖｉｖｏのＥＬＩＳＰＯＴアッセイである。このようなアッセイでは、Ｔ細胞から分泌されたＩＦＮ－γは、固体支持体上に固定化されている第１のＩＦＮ－γ特異的抗体によって結合される。結合したＩＦＮ－γは、次に、検出可能な標識で標識された第２のＩＦＮ－γ特異的抗体を用いて検出される。
複数の態様において、測定可能なＴ細胞の状態の変化は、チミジンの取り込みのような、Ｔ細胞による物質の取り込みの増加であってもよい。状態の変化は、Ｔ細胞のサイズの増加、またはＴ細胞の増殖、またはＴ細胞の細胞表面マーカーの変化であってもよい。
複数の態様において、アッセイ／方法において接触されるＴ細胞は、宿主から血液サンプル中において採取されるが、Ｔ細胞を含む他のタイプのサンプルを使用することができる。サンプルはアッセイに直接加えてもよいし、最初に処理してもよい。典型的な処理は、例えば水または緩衝液によるサンプルの希釈を含む。典型的には、サンプルは１．５～１００倍、例えば２～５０倍または５～１０倍に希釈される。
複数の態様において、処理は、サンプルの成分の分離を含んでいてもよい。典型的には、単核細胞（ＭＣ）がサンプルから分離される。ＭＣは、Ｔ細胞及びＡＰＣを含むだろう。したがって、本方法において、分離されたＭＣに存在するＡＰＣは、Ｔ細胞にペプチドを提示することができる。複数の態様において、Ｔ細胞のみ、例えば、ＣＤ４＋のみ及び／又はＣＤ８＋のみのＴ細胞が、サンプルから精製されてもよい。ＰＢＭＣ、ＭＣおよびＴ細胞は、当技術分野で既知の技術を用いてサンプルから分離することができる。
複数の態様において、アッセイ／方法で使用されるＴ細胞は、未処理または希釈されたサンプルの形態であるか、または直接ｅｘ ｖｉｖｏ（すなわち、方法で使用される前に培養されることはない）で使用される新鮮分離されたＴ細胞（例えば、新鮮分離されたＭＣまたはＰＢＭＣの形態）である。しかし、Ｔ細胞は、例えば、１または複数のペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）、および一般的には外来成長促進サイトカインの存在下で、使用前に培養することができる。培養中、ペプチドは通常、本方法で使用するＡＰＣのようなＡＰＣの表面に存在する。Ｔ細胞の前培養は、本方法の感度の上昇につながる可能性がある。したがって、Ｔ細胞は、短期細胞株のような細胞株に変換することができる。
複数の態様において、アッセイ／方法において典型的に存在するＡＰＣは、Ｔ細胞と同じ宿主のものであってもよいし、異なる宿主のものであってもよい。複数の態様において、ＡＰＣは、内在するＡＰＣであっても、人工のＡＰＣであってもよい。複数の態様において、ＡＰＣは、Ｔ細胞にペプチドを提示することができる細胞である。典型的には、Ｂ細胞、樹状細胞、またはマクロファージである。ＡＰＣは、通常、Ｔ細胞と同じサンプルから分離され、通常、Ｔ細胞と共精製される。したがって、ＡＰＣは、ＭＣまたはＰＢＭＣに存在してもよい。複数の態様において、ＡＰＣは、典型的には、新鮮分離されたｅｘ ｖｉｖｏ細胞または培養細胞である。短期細胞株または不死化細胞株などの細胞株の形態であってもよい。ＡＰＣは、その表面に空のＭＨＣクラスＩＩ分子またはＭＨＣクラスＩ分子を発現していてもよい。
アッセイ／方法の態様において、サンプルに由来するＴ細胞は、試験しようとする全てのペプチド（すなわち、ペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）のプール）（関連パネル）を有するアッセイに入れることができ、またはＴ細胞は、それぞれが１または複数のペプチドを含む別々のアッセイに分割して入れることができる。複数の態様において、方法／アッセイのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの形態において、本明細書に記載されるような本発明で開示されるペプチド／ポリペプチドまたはその類似体の少なくとも１つまたは複数が使用される。
複数の態様において、本明細書に開示される１または複数のペプチドまたはポリペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）は、Ｔ細胞およびＡＰＣを含むアッセイに直接添加される。上述したように、このようなアッセイにおけるＴ細胞およびＡＰＣは、ＭＣの形態であり得る。ＡＰＣによる提示を必要とせずにＴ細胞によって認識されてもよいペプチドが使用される場合、ＡＰＣは必要ない。ＭＨＣ分子に結合した元のペプチドを模倣する類似体は、そのようなペプチドの一例である。複数の態様において、ペプチドまたはポリペプチドは、Ｔ細胞の非存在下でＡＰＣに提供される。次に、ＡＰＣは、典型的にはその表面にペプチドを提示させられた後、Ｔ細胞に提供される。ペプチドは、ＡＰＣの内部に取り込まれて提示されてもよいし、ＡＰＣの内部に入ることなく単に表面に取り込まれてもよい。
複数の態様において、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）をＴ細胞と接触させる期間は、ペプチドの認識を決定するために使用される方法に応じて変化する。通常、１０５～１０７、好ましくは５×１０５～１０６のＰＢＭＣが各アッセイに添加される。ペプチドがアッセイに直接加えられる場合、その濃度は１０－１～１０３μｇ／ｍＬ、好ましくは０．５～５０ｇ／ｍＬまたは１～１０μｇ／ｍＬである。複数の態様において、Ｔ細胞がペプチドまたはポリペプチドとともにインキュベートされる時間の長さは、４時間～２４時間、好ましくは６時間～１６時間である。
複数の態様において、Ｔ細胞による本開示のペプチドまたはポリペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）の認識の決定は、ペプチドのＴ細胞への結合を測定することによって行われ得る。典型的には、ペプチドと結合するＴ細胞は、例えばＦＡＣＳ機を用いて、この結合に基づいてソートすることができる。ペプチドを認識しているＴ細胞の存在は、ペプチドを用いてソートされた細胞の頻度が「コントロール」値以上であれば、発生したと判断される。抗原経験Ｔ細胞の頻度は、一般に１０６中１から１０３中１であるため、ソーティングされた細胞が抗原経験Ｔ細胞であるか否かを判定することができる。
複数の態様において、Ｔ細胞によるペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）の認識の判定は、ｉｎ ｖｉｖｏで測定されてもよい。複数の態様において、本開示のペプチドまたはポリペプチドが宿主に投与され、次いで、ペプチドまたはポリペプチドの認識を示す応答が測定されてもよい。複数の態様において、ペプチドは、典型的にはＭａｎｔｏｕｘテストと同様の方法で皮内投与される。複数の態様において、ペプチドは表皮に投与されてもよい。複数の態様において、ペプチドは、注射などの針によって投与されるが、例えば核酸を送達するために使用されてきたバリスティック技術などの他の方法によって投与することができる。ＥＰ－Ａ－０６９３１１９は、ペプチドを投与するために典型的に使用することができる技術を記述している。複数の態様において、０．００１～１０００μｇ、例えば０．０１～１００μｇまたは０．１～１０μｇのペプチドが投与される。
あるいは、ｉｎ ｖｉｖｏでペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）を提供することができる薬剤を投与することができる。したがって、ペプチドを発現することができるポリヌクレオチドを、典型的にはペプチドの投与について上述した方法のいずれかで投与することができる。複数の態様において、ポリヌクレオチドは、後述する本発明により提供されるポリヌクレオチドの特性のいずれかを有する。複数の態様において、ペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでポリヌクレオチドから発現され、ｉｎ ｖｉｖｏでのペプチドの認識が測定される。複数の態様において、０．００１～１０００μｇ、例えば０．０１～１００μｇまたは０．１～１０μｇのポリヌクレオチドが投与される。ｉｎ ｖｉｖｏでのペプチドの認識は、典型的には、応答の発生によって示される。
アッセイ／方法に使用できる類似体は、本開示の等価の（equivalent）ペプチドまたはポリペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）を認識するＴ細胞受容体に結合することができる。したがって、一般に、類似体が、相当する前記ペプチドまたはポリペプチドの存在下で、典型的にはＡＰＣの存在下でＴ細胞に加えられると、類似体は、相当するペプチドまたはポリペプチドの認識を阻害する。複数の態様において、前記Ｔ細胞受容体への前記類似体の結合は、標準的な技術によって試験することができる。例えばＴ細胞受容体は、ペプチドまたはポリペプチドを認識することが示されているＴ細胞から（例えば、本開示のアッセイ／方法を用いて）分離されてもよい。複数の態様において、類似体のＴ細胞受容体への結合の実証は、次に、Ｔ細胞受容体が、類似体に結合する物質、例えば、類似体に対する抗体への類似体の結合を阻害するかどうかを決定することによって示すことができる。複数の態様において、類似体は、そのような結合の阻害アッセイにおいてＭＨＣ分子に結合される。
複数の態様において、類似体は、ペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）のＴ細胞受容体への結合を阻害する。この場合、類似体の存在下でＴ細胞受容体に結合できるペプチドの量は減少する。これは、類似体がＴ細胞受容体に結合することができ、Ｔ細胞受容体への結合についてペプチドと競合するためである。
上記結合実験に使用するためのＴ細胞は、例えば、本開示の方法の助けを借りて、ＣＯＶＩＤ－１９または関連コロナウイルス感染患者から分離することができる。
類似体の他の結合特性も、本開示の対応するペプチドまたはポリペプチドと同じであり、したがって、典型的には、類似体は、本開示のペプチドまたはポリペプチドが結合する同じＭＨＣクラスＩＩ分子またはＭＨＣクラスＩ分子に結合する。
類似体は、典型的には、ペプチドまたはポリペプチドである。それは、本開示の等価の元のペプチドまたはポリペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）と相同性を有していてもよい。別のペプチドまたはポリペプチドと相同であるペプチドまたはポリペプチドは、典型的には、例えば少なくとも１５、好ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも４０、６０または１００以上の連続するアミノ酸の領域にわたって、そのペプチドと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７または９９％相同性である。タンパク質の相同性を測定する方法は当技術分野でよく知られており、当業者には、現在の文脈では、相同性はアミノ酸の同一性に基づいて計算されることが理解されよう（「ハード相同性」と呼ばれることもある）。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するために使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えば、そのデフォルト設定で使用）（Devereuxら(1984)Nucleic Acids Research 12, p 387-395）。
相同ペプチドまたはポリペプチドは、置換、挿入または欠失によって、例えば、ＮまたはＣ末端で、または配列中の他の位置であり得る１、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上の置換、欠失または挿入によって異なっていてもよい。置換は好ましくは保存的である。保存的置換として典型的に見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、およびＩｌｅ間の１つおきの置換、水酸基残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎ間の置換、塩基残基Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇの交換ならびに芳香族残基Ｔｒｐ、ＰｈｅおよびＴｙｒ間の交換などである。
類似体は、典型的には８～８０アミノ酸の長さであり、例えば１０～６０または１２～５０、好ましくは１５～３０または２０～２５の長さである。複数の態様において、ＭＨＣ分子との結合に寄与する、またはＴ細胞受容体による認識を担う元のペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸と同等の位置にある類似体のアミノ酸は、同じであるか、または保存されている。
複数の態様において、類似体ペプチドは、自然の翻訳後改変または人工的な改変であり得る、１または複数の改変を含んでいる。改変は、アミノ、アセチル、ヒドロキシまたはハロゲン（例えばフッ素）基または炭水化物基などの化学部位（典型的には、水素、例えばＣ－Ｈ結合の置換による）を提供してもよい。複数の態様において、改変は、ＮまたはＣ末端に存在する。複数の態様において、類似体は、１または複数の非天然アミノ酸、例えば、天然アミノ酸とは異なる側鎖を有するアミノ酸を含んでいてもよい。一般に、非天然アミノ酸は、Ｎ末端および／またはＣ末端を有するであろう。非天然アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸であってもよい。複数の態様において、類似体は、元のペプチドまたはポリペプチドに実質的に類似する形状、サイズ、柔軟性または電子配置を有する。それは、典型的には、元のペプチドまたはポリペプチドの誘導体である。
複数の態様において、類似体は、ＭＨＣクラスＩＩ分子またはＭＨＣクラスＩ分子に結合した元のペプチドであるか、またはそれを模倣する。複数の態様において、類似体は、互いに会合または結合した２、３、４またはそれ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子またはＭＨＣクラスＩ分子に結合した元のペプチドであってもよいし、それを模倣してもよい。複数の態様において、これ（ら）のＭＨＣ分子は、ビオチン／ストレプトアビジン系システムを用いて結合されてもよく、典型的には、２、３または４のビオチン標識ＭＨＣ分子がストレプトアビジン部位に結合している。この類似体は、典型的には、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）の結合を阻害する。複数の態様において、クラスＩＩまたはクラスＩ複合体と、その複合体に特異的なＴ細胞レセプターまたは抗体とが結合する。複数の態様において、この類似体は、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２断片などの抗体または抗体の断片である。
複数の態様において、類似体は、固体支持体に固定化されてもよく、特に、ＭＨＣ分子に結合したペプチドを模倣する類似体であってもよい。
類似体は、計算機によって設計され、その後、当技術分野で既知の方法を用いて合成される。あるいは、類似体は、化合物のライブラリーから選択することができる。ライブラリーは、コンビナトリアルライブラリーまたはファージディスプレイライブラリーのようなディスプレイライブラリーであってもよい。化合物のライブラリーは、元のペプチドが結合するＭＨＣ分子のようなＭＨＣクラスＩＩ分子またはＭＨＣクラスＩ分子に結合される形でディスプレイライブラリーで発現させることができる。類似体は、一般に、元のペプチドの結合特性を模倣する能力に基づいて、ライブラリーから選択される。従って、元のペプチドを認識するＴ細胞受容体や抗体と結合する能力に基づいて選択されることもある。
本開示はまた、本明細書に開示されるような１または複数のペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）または類似体、および、任意選択で、Ｔ細胞などの免疫系の細胞によるペプチドの認識を検出する手段を含む、上記方法およびアッセイを実施するためのキットを提供する。複数の態様において、認識を検出する手段は、上で議論された技術に基づく検出を可能にするかまたは補助するが、しかし、米国特許７，６０８，３９２（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されたものなど、当技術分野の他の検出手段を使用してもよい。したがって、この手段は、認識後にＴ細胞によって分泌される物質を検出することを可能にしてもよい。従って、キットは、抗体のような、物質に対する特異的結合剤を追加的に含んでもよい。複数の態様において、薬剤はＩＦＮ－γに特異的であるが、しかし、上記のような他のサイトカインについて記載された薬剤が使用されてもよい。複数の態様において、薬剤は固体支持体上に固定化される。これは、薬剤を結合した後、物質がそれを分泌したＴ細胞の近傍に留まることを意味する。したがって、物質と薬剤の複合体の「スポット」が支持体上に形成され、各スポットは物質を分泌しているＴ細胞を表している。スポットを定量化し、通常コントロールと比較することで、ペプチドを認識しているかどうかを判断することができる。
複数の態様において、キットはまた、物質／薬剤複合体を検出する手段を含んでいてもよい。物質を結合させた後、薬剤自体に色の変化など、検出可能な変化が起こってもよい。あるいは、検出のために直接または間接的に標識された第２剤を物質／剤複合体に結合させ、スポットの決定を可能にすることもできる。上述したように、第２剤は物質に特異的であってもよいが、第１剤とは物質上の異なる部位に結合する。複数の態様において、認識を検出する手段は、上で議論された技術に基づく検出を可能にするか、または補助するが、しかし、当技術分野における他の検出手段、例えば、米国特許７，６０８，３９２（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示のものを使用してもよい。複数の態様において、固定化支持体は、マイクロタイタープレートのようなウェルを有するプレートであってもよい。したがって、各アッセイは、プレート内の別々のウェルで実施されてもよい。
複数の態様において、キットは、さらに、Ｔ細胞などの免疫系の細胞のための培地、検出剤、および／または検出工程で使用される洗浄バッファーを含んでもよい。複数の態様において、キットは、サンプルからのＰＢＭＣまたはＴ細胞の分離のような、サンプルからの分離に適した試薬をさらに含んでもよい。複数の態様において、キットは、サンプルの成分の分離を必要とせずに、サンプル中のＴ細胞を直接検出できるように設計されてもよい。
複数の態様において、キットは、皮内または表皮投与のような、ペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）の投与を可能にする器具を含んでいてもよい。典型的には、このような器具は１本以上の針から構成される。器具は、ペプチドのバリスティック投与を可能にしてもよい。キット中のペプチドまたはポリペプチドは、医薬組成物の形態であってもよい。
複数の態様において、キットはまた、ポジティブコントロールまたはネガティブコントロールなどの対照を含んでいてもよい。複数の態様において、ポジティブコントロールは、検出系を試験することを可能にし得る。したがって、ポジティブコントロールは、典型的には、上記のアッセイまたは方法のいずれかにおけるペプチドまたはポリペプチド（例えば、１または複数のハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）の認識を模倣する。ｉｎ ｖｉｔｒｏで認識を決定するように設計されたキットの態様では、ポジティブコントロールはサイトカインである。ペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの認識を検出するように設計されたキットの態様では、ポジティブコントロールは、ほとんどの個人が応答するはずの抗原であってよい。
複数の態様において、本キットは、宿主／対象からＴ細胞などの免疫細胞を含むサンプルを採取する手段、例えば血液サンプルを含んでいてもよい。複数の態様において、キットは、宿主からのサンプルから単核細胞またはＴ細胞を分離する手段を含んでもよい。複数の態様において、キットは、全血のような対象からのサンプルを受け取るように適合された１または複数の区画を有する区画形態であることが好都合である。その区画または別の区画は、サンプルがブドウ糖のような単糖を含むまたは含まない全血である場合、ヘパリンを含むように適合されてもよい。単糖はまた、別の容器に保持されてもよい。
複数の態様において、キットは、説明書一式とともに販売用にパッケージングされる形態である。説明書は、一般に、本明細書に開示されるようなアッセイ及び／又は方法を実施するためのフォームで存在するだろう。
本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意のアッセイ、方法、及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料が記載される。本開示の他の特徴、目的、及び利点は、本明細書及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。本明細書及び添付の特許請求の範囲において、単数形は、文脈上明らかに他に指示されない限り、複数の参照語を含む。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における通常の技術者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で引用されたすべての文献は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
［態様］
第１の態様は、配列番号４－２２４および４５４－４５６、および／またはその断片および変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布している１～１２の追加のアミノ酸、のみからなるポリペプチドに関する。
第２の態様は、配列番号４－２２４および４５４－４５６、および／またはその断片および変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布している１～１２の追加のアミノ酸、から本質的になるポリペプチドに関する。
第３の態様は、配列番号４－２２４および４５４－４５６、および／またはその断片および変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布している１～１２の追加のアミノ酸、を含むポリペプチドに関するものである。
第４の態様は、配列番号４－２２４および４５４－４５６からなる群から選択されるアミノ酸配列の前記変異体または断片が、ＭＨＣ結合性およびＴＣＲ特異性を保持し、および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持する、態様１～３のいずれか一態様に記載のポリペプチドに関するものである。
第５の態様は、配列番号４－２２４および４５４－４５６、およびその断片のいずれか１つに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の相同性を有するアミノ酸配列、のみからなるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドはＭＨＣ結合性および同じＴＣＲ特異性を保持し、および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持する。
第６の態様は、配列番号４－２２４および４５４－４５６、およびその断片のいずれか１つに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の相同性を有するアミノ酸配列、から本質的になるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドはＭＨＣ結合性および同じＴＣＲ特異性を維持し、および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を維持する。
第７の態様は、配列番号４－２２４および４５４－４５６、およびその断片のいずれか１つに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の相同性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチドに関し、当該ポリペプチドは、ＭＨＣ結合性および同じＴＣＲ特異性を維持し、および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を維持する。
第８の態様は、配列番号２３２－４５２および４５７－４５９、ならびにその断片または変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
第９の態様は、態様８によるポリペプチドに関し、配列番号２３２－４５２および４５７－４５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの前記断片または変異体が抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持する。
第１０の態様は、配列番号４－２２４および４５４－４５６、および／またはその断片および変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の割合で分布する１～１２の追加のアミノ酸、のみからなるポリペプチドをコードする核酸に関する。
第１１の態様は、配列番号４－２２４および４５４－４５６、および／またはその断片および変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列、および、任意選択で、配列番号４４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸、から本質的になるポリペプチドをコードする核酸に関するものである。
第１２の態様は、配列番号４－２２４および４５４－４５６、および／またはその断片および変異からなる群から選択されるアミノ酸配列体、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸、を含むポリペプチドをコードする核酸に関するものである。
第１３の態様は、配列番号２３２－４５２および４５７－４５９、および／またはその断片および変異体からなる群から選択されるアミノ酸、を含むポリペプチドをコードする核酸に関するものである。
第１４の態様は、配列番号２３２－４５２および４５７－４５９、およびその断片または変異体からなる群から選択される配列のみからなる核酸に関する。
第１５の態様は、配列番号２３２－４５２および４５７－４５９、およびその断片または変異体からなる群から選択される配列から本質的になる核酸に関する。
第１６の態様は、配列番号２３２－４５２および４５７－４５９、およびその断片または変異体からなる群から選択される配列、を含む核酸に関する。
第１７の態様は、態様１０～１２のいずれか１態様の核酸に関し、配列番号４－２２４および４５４－４５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸の前記断片または変異体は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持するポリペプチドをコードする、核酸に関する。
第１８の態様は、態様１３の核酸であって、配列番号２３２－４５２および４５７－４５９からなる群から選択されるアミノ酸を含むポリペプチドをコードする核酸の前記断片または変異体が、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持するポリペプチドをコードする核酸に関する。
第１９の態様は、態様１～７、１０～１２、または１７のいずれか一態様のポリペプチドまたは核酸に関し、ここで、前記ポリペプチドは、表１の１つまたは複数のクラスＩＩポリペプチド（「クラスター」）、（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、表１のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の割合で分布している１～１２の追加のアミノ酸を含む。
第２０の態様は、態様１～７、１０～１２、または１７のいずれか一態様のポリペプチドまたは核酸に関し、前記ポリペプチドは、配列番号２１０、９、２１１、３４、２１２、２１３、４９、５４、５９、２１４、２１５、８９、９４、９９、２１６、１０４、１０９、１１４、２１７、２１８、１４２、１４７、２１９、２２０、２２１、２２２、１８１、１８６、１９１、１９６、２２３、および２２４のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号２１０、９、２１１、３４、２１２、２１３、４９、５４、５９、２１４、２１５、８９、９４、９９、２１６、１０４、１０９、１１４、２１７、２１８、１４２、１４７、２１９、２２０、２２１、２２２、１８１、１８６、１９１、１９６、２２３、および２２４のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布している１～１２の追加のアミノ酸、を含み、またはのみからなり、または本質的になる、１または複数のクラスＩＩポリペプチド（「クラスター」）である。
第２１の態様は、態様１～７、１０～１２、または１７のいずれか一態様のポリペプチドまたは核酸に関し、前記ポリペプチドは、配列番号２１８、１９、２１６、２１２、８９、９４、３４、１４２、２２１、５４、１８６、５９、２１４、２２３、２１９、１９１、２２４、２２２、２１０、４９、１０４、２１７、２１３、２１５、１０９、２２０、１４７、１８１、１９６、９、１１４、および９９の配列（および／またはその断片もしくは変異体）、ならびに任意選択で、配列番号２１８、１９、２１６、２１２、８９、９４、３４、１４２、２２１、５４、１８６、５９、２１４、２２３、２１９、１９１、２２４、２２２、２１０、４９、１０４、２１７、２１３、２１５、１０９、２２０、１４７、１８１、１９６、９、１１４、および９９のアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸、を含み、またはのみからなり、または本質的になる、１または複数のクラスＩＩポリペプチド（「クラスター」）である。
第２２の態様は、態様１～７、１０～１２、または１７のいずれか一態様のポリペプチドまたは核酸に関し、前記ポリペプチドは、配列番号２１０、９、１９、３４、２１２、４４、４９、５４、５９、２１４、８９、９４、９９、２１６、１０４、１０９、１１０、１１４、２１８、１４２、１４７、２２０、２２１、１７６、１８１、１８６、１９１、１９６、２２３、２２４、４５４、４５５、および４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、ならびに任意に、配列番号２１０、９、１９、３４、２１２、４４、４９、５４、５９、２１４、８９、９４、９９、２１６、１０４、１０９、１１０、１１４、２１８、１４２、１４７、２２０、２２１、１７６、１８１、１８６、１９１、１９６、２２３、２２４、４５４、４５５、および４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布している、１～１２の追加のアミノ酸、を含み、またはのみからなり、または本質的になる１または複数のクラスＩＩポリペプチド（「クラスター」）である。
第２３の態様は、態様８～９、または１３～１６または１８のいずれか一態様のポリペプチドまたは核酸に関し、前記ポリペプチドは、１または複数の配列番号４３８、２３７、２４６、２６２、４４０、４４１、２７２、２７７、２８２、２８７、４４２、３１７、３２２、３２７、４４４、３３２、３３７、３３８、３４２、４４６、３７０、３７５、４４８、４４９、４０４、４０９、４１４、４１９、４２４、４５１、４５２、４５７、４５８、および４５９のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、を含み、またはのみからなり、または本質的になる１または複数のポリペプチドである。
第２４の態様は、態様８～９、または１３～１６または１８のいずれか一態様のポリペプチドまたは核酸に関し、前記ポリペプチドは、配列番号４３８、２３７、２４６、２６２、４４０、４４１、２７２、２７７、２８２、２８７、４４２、３１７、３２２、３２７、４４４、３３２、３３７、３３８、３４２、４４６、３７０、３７５、４４８、４４９、４０４、４０９、４１４、４１９、４２４、４５１，および４５２のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、を含み、またはのみからなり、または本質的になる１または複数のポリペプチドであるか、または、、前記ポリペプチドは、配列番号４４６、２４６、４４４、４４０、３１７、３３２、２６２、３７０、４４９、２８２、４１４、２８７、４４２、４５１、４４７、４１９、４５２、４５０、４３８、２７７、３３２、４４５、４４１、４４３、３３７、４４８、３７５、４０９、４２４、２３７、３４２、および３２７のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、を含み、またはのみからなり、または本質的になる１または複数のポリペプチドである
第２５の態様は、態様１０～２４のいずれか１つに記載の核酸を含むプラスミドに関する。
第２６の態様は、態様１０～２４のいずれか１つに記載の核酸を含むベクターに関する。
第２７の態様は、態様１～９または１９～２４のいずれか１つに記載のポリペプチドと、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む薬学的組成物に関する。
第２８の態様は、態様１０～２４のいずれか１つに記載の核酸と、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む薬学的組成物に関する。
第２９の態様は、態様２５によるプラスミドと、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
第３０の態様は、態様２６によるベクターと、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
第３１の態様は、態様１～９または１９～２４のいずれか一態様に記載のポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、および／またはアジュバントとを含むワクチンに関する。
第３２の態様は、態様１０～２４のいずれか一態様に記載の核酸と、薬学的に許容される賦形剤、担体、および／またはアジュバントとを含むワクチンに関する。
第３３の態様は、態様２５によるプラスミドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、および／またはアジュバントとを含むワクチンに関する。
第３４の態様は、態様２６によるベクターと、薬学的に許容される賦形剤、担体、および／またはアジュバントとを含むワクチンに関する。
第３５の態様は、それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫を誘導する方法に関し、その方法は、態様１～９または１９～２４のいずれか一態様に従うポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含んでいる。
第３６の態様は、それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫を誘導する方法に関し、その方法は、態様１０～２４のいずれか一態様に従う治療有効量の核酸を対象へ投与する工程を含んでいる。
第３７の態様は、それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫を誘導する方法に関し、この方法は、態様２５に従うプラスミドを治療有効量、対象に投与する工程を含んでいる。
第３８の態様は、それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含む免疫ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫を誘導する方法に関し、この方法は、態様２６に従うベクターの治療有効量を対象へ投与する工程を含む。
第３９の態様は、それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾病に対する免疫を誘導する方法に関し、この方法は、態様２７－３０のいずれか一態様に従う医薬組成物の治療有効量を対象に投与する工程を含んでいる。
第４０の態様は、それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫を誘導する方法に関し、この方法は、態様３１－３４のいずれか一態様に従うワクチン組成物の治療有効量を対象に投与する工程を含んでいる。
第４１の態様は、投与工程がさらにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの投与を含み、このウイルスが弱毒生ウイルスまたは不活化ウイルスである、態様３５－４０のいずれか一態様に従う方法に関する。
第４２の態様は、それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫応答を誘導する方法に関し、この方法は、１－９または１０－２４のいずれかの態様に従う１または複数のポリペプチドの治療有効量を対象へ投与する工程を含む。
第４３の態様は、それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対して免疫応答を誘導する方法に関し、この方法は、態様１０～２４のいずれか一態様に従う治療有効量の核酸を対象に投与する工程を含んでいる。
第４４の態様は、それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対して免疫応答を誘導する方法に関し、この方法は、態様２５による治療有効量のプラスミドを対象に投与する工程を含んでいる。
第４５の態様は、それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対して免疫応答を誘導する方法に関し、この方法は、態様２６による治療有効量のベクターを対象に投与する工程を含んでいる。
第４６の態様は、それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫応答を誘導する方法に関し、この方法は、態様２７～３０のいずれか一態様に従う治療有効量の医薬組成物を対象へ投与する工程を含んでいる。
第４７の態様は、それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対して免疫応答を誘導する方法に関し、この方法は、態様３１～３４のいずれか一態様に従うワクチン組成物の治療有効量を対象に投与する工程を含んでいる。
第４８の態様は、投与の工程が、さらにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを投与し、このウイルスが弱毒生ウイルスまたは不活化ウイルスである、態様４２－４７のいずれか一態様に記載の方法に関する。
第４９の態様は、態様１～９または１０～２４のいずれか一態様に記載のポリペプチドを含むキメラまたは融合ポリペプチドに関し、前記ポリペプチドが異種ポリペプチドに接合、連結、または挿入されている。
第５０の態様は、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又は関連コロナウイルスに対するＣＭＩ応答を測定するための方法に関し、前記方法は、前記対象から全血サンプルを採取する工程であって、前記全血サンプルが、抗原による刺激後に免疫エフェクター分子を産生できる免疫系の細胞を含んでいる工程と、前記全血サンプル、態様１～９または１０～２４のいずれか一態様に従う少なくとも１種のポリペプチド、および、任意選択で、抗原による刺激を増強するのに有効な量の分離単糖、および任意選択でヘパリンを含む混合物をインキュベートする工程と、免疫エフェクター分子の存在又はレベルの上昇を測定する工程であって、前記免疫エフェクター分子の存在又はレベルが、細胞媒介免疫応答を行う前記対象の能力を示す工程とを含む。
第５１の態様は、対象がヒトである、態様５０の方法に関する。
第５２の態様は、全血が少なくとも１種のポリペプチドを含むチューブで収集される、態様５０の方法に関する。
第５３の態様は、全血がヘパリンを含むチューブで採取される、態様５０の方法に関する。
第５４の態様は、チューブがヘパリンを含む、態様５２の方法に関する。
第５５の態様は、全血サンプルが少なくとも１種のポリペプチドと共に約５時間から約５０時間インキュベートされる、態様５０の方法に関する。
第５６の態様は、免疫エフェクター分子がサイトカインである、態様５０の方法に関する。
第５７の態様は、サイトカインがＩＦＮ－γである、態様５６の方法に関する。
第５８の態様は、サイトカインがＧＭ－ＣＳＦである、態様５６の方法に関する。
第５９の態様は、サイトカインがインターロイキンである、態様５６の方法に関する。
第６０の態様は、サイトカインがＴＮＦ－αである、態様５６の方法に関する。
第６１の態様は、対象がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルスに感染している、態様５０または５１のいずれかの方法に関する。
第６２の態様は、免疫細胞がＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージまたは単球から選択される、態様５０の方法に関する。
第６３の態様は、免疫細胞がＴ細胞である、態様５２の方法に関する。
第６４の態様は、単糖がデキストロースである、態様５０の方法に関する。
第６５の態様は、免疫エフェクターが、それに特異的な抗体を用いて検出される、態様５０の方法に関する。
第６６の態様は、免疫エフェクターがＥＬＩＳＡを用いて検出される、態様６５の方法に関する。
第６７の態様は、免疫エフェクターがＥＬＩＳｐｏｔを用いて検出される、態様６５の方法に関する。
第６８の態様は、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルス特異的即時エフェクターＴ細胞を同定するためのアッセイに関し、（ａ）Ｔ細胞を含む前記対象からのサンプルを準備し；（ｂ）前記Ｔ細胞を、態様１～９または１０～２４のいずれか一態様に記載の少なくとも１種のポリペプチドの免疫原性量に曝露し；および（ｃ）前記サンプルにおける新しい即時エフェクターＴ細胞の発生の前に、前記Ｔ細胞からのサイトカインの分泌を測定し、前記Ｔ細胞が前記ポリペプチドによって活性化されているかどうかを決定するアッセイであって、前記Ｔ細胞の活性化により、前記対象において、元のサンプル中に存在したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルス－特異的即時エフェクターＴ細胞の存在を同定する。
第６９の態様は、前記Ｔ細胞が末梢血単核細胞である、態様６８のアッセイに関する。
第７０の態様は、前記Ｔ細胞の活性化が、前記Ｔ細胞からのインターフェロン－γの分泌を測定することによって決定される、態様６８のアッセイに関する。
第７１の態様は、前記対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルスに感染している、または感染していた工程が知られている、態様６６の方法に関する。
第７２の態様は、前記感染が監視される、態様７１の方法に関する。
第７３の態様は、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルス特異的即時エフェクターＴ細胞を同定するためのアッセイに関し、以下の工程：（ａ）Ｔ細胞を含む前記対象からのサンプルを準備し；（ｂ）前記Ｔ細胞を、態様１～９または１０～２４のいずれか一態様に記載の少なくとも１種のポリペプチドの免疫原性量に曝露し；（ｃ）前記Ｔ細胞を、静止Ｔ細胞の即時エフェクターＴ細胞への分化をもたらすのに十分ではない時間インキュベートし；および（ｄ）前記Ｔ細胞からのサイトカインの分泌を測定することによって、前記Ｔ細胞が前記ポリペプチドによって活性化されるかどうかを決定することを備え、前記Ｔ細胞の活性化により、前記対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルス特異的即時エフェクターＴ細胞の存在を識別するアッセイに関する。
第７４の態様は、前記Ｔ細胞が約３７℃で前記ポリペプチドに曝露される、態様７２または７３のいずれかの方法またはアッセイに関する。
第７５の態様は、前記インキュベーション時間が４時間から２４時間である、態様７３のアッセイに関する。
第７６の態様は、前記インキュベーション時間が６時間から１６時間である、態様７３のアッセイに関する。
第７７の態様は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又は関連コロナウイルスＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞応答を検出する方法に関し、ヒト個体のＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞の集団に、態様１～９または１０～２４のいずれか一態様に従う１または複数のポリペプチドを接触させる工程を含み、ここで、１または複数のポリペプチドは、ペプチドを認識するＴ細胞受容体に結合する類似体によって置換されていてもよく、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞集団のＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞がペプチド（複数可）を認識するかどうかを決定する工程を含む。
第７８の態様は、ペプチドパネルが採用される、態様７７による方法に関し、ここで、前記パネルは、前記１または複数のポリペプチド又はその前記類似体を含む。
第７９の態様は、態様７７による方法に関し、ここで、使用される任意の類似体が、（ｉ）前記ポリペプチド全体に対して少なくとも７０％相同、好ましくは少なくとも８０％相同、より好ましくは少なくとも９０％相同であり、および／または（ｉｉ）前記ポリペプチドと比較してＮ末端および／またはＣ末端に１または複数の欠失があり、および／または（ｉｉｉ）前記ポリペプチドと比較して１または複数の保存的置換を有する。
第８０の態様は、態様７７による方法に関し、ここで、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞によるポリペプチド（複数可）の認識が、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞からのサイトカインの分泌を測定する工程によって決定される態様７７による方法に関する。
第８１の態様は、態様８０による方法に関し、ここで、Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ分泌が測定される。
第８２の態様は、態様８１による方法に関し、ここで、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ分泌を決定する工程が、分泌されたＩＦＮ－γを、サイトカインに特異的な固定化抗体を結合させ、抗体／サイトカイン複合体の存在を決定することにより行われる。
第８３の態様は、態様８２による方法に関し、ここで、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞が末梢血から新鮮分離されたｅｘ ｖｉｖｏ細胞である。
第８４の態様は、態様７７による方法に関し、ここで、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞がペプチド（複数可）とともにｉｎ ｖｉｔｒｏで前培養される。
第８５の態様は、態様７７による方法に関し、ここで、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞の集団が、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又は関連コロナウイルスワクチンが投与された個体のものである。
第８６の態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される態様７７による方法に関する。
第８７の態様は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルスによるヒト宿主の感染、またはヒト宿主の曝露を診断する方法に関し、この方法は、（ｉ）宿主からのＴ細胞集団を、態様１～９または１０～２４のいずれか一態様の１つまたは複数のポリペプチドと接触させる工程；および（ｉｉ）前記Ｔ細胞集団のＴ細胞が前記ポリペプチドに対して認識応答を示すかどうかをｉｎ ｖｉｔｒｏで決定する工程とを備える。
第８８の態様は、Ｔ細胞が新鮮分離される、態様８７の方法に関する。
第８９の態様は、Ｔ細胞が血液から分離される、態様８７の方法に関する。
第９０の態様は、Ｔ細胞集団がＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、態様８７の方法に関する。
第９１の態様は、宿主が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルスに曝露された健康なヒト宿主である、態様８７の方法に関する。
第９２の態様は、態様１～９または１０～２４のいずれか一態様に記載の１または複数のポリペプチドと、任意でＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞によるポリペプチド（複数）の認識を検出する手段を含むキットに関し、前記１または複数のポリペプチドは、ポリペプチドを認識するＴ細胞受容体と結合する類似体によって置換されていてもよい。
第９３の態様は、ＩＦＮ－γに対する抗体を含む、態様９２によるキットに関する。
第９４の態様は、前記抗体が固体支持体上に固定化されており、任意に任意の抗体／ＩＦＮ－γ複合体を検出する手段も含む、態様９２によるキットに関する。
第９５の態様は、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞によるペプチド（複数可）の認識を検出する手段を含む、態様９２によるキットに関する。
第９６の態様は、任意の抗体／ＩＦＮ－γ複合体を検出する手段を含む、態様９４によるキットに関する。
第９７の態様は、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染による疾患を、それを必要とする対象において、予防、治療、または改善する方法に関し、その方法は、態様１～９または１０～２４のいずれか一態様に従うポリペプチドの１つまたは複数の治療有効量を対象に投与する工程を含んでいる。
第９８の態様は、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染による疾患を、それを必要とする対象において、予防、治療、または改善する方法に関し、その方法は、態様１０～２４のいずれか一態様に記載の核酸の治療有効量を対象に投与する工程を含む。
第９９の態様は、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染による疾患を、それを必要とする対象において、予防、治療、または改善する方法に関し、その方法は、対象に対して、態様２５による治療有効量のプラスミドを投与する工程を含んでいる。
第１００の態様は、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染による疾患を、それを必要とする対象において、予防、治療、または改善する方法に関し、その方法は、態様２６によってベクターの治療有効量を対象に投与する工程を含んでいる。
第１０１の態様は、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染による疾患を、それを必要とする対象において、予防、治療、または改善する方法に関し、その方法は、態様２７－３０のいずれか一態様による医薬組成物の治療有効量を対象に投与する工程を含んでいる。
第１０２の態様は、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染による疾患を、それを必要とする対象において、予防、治療、または改善する方法に関し、その方法は、態様３１－３４のいずれか一態様に従うワクチン組成物の治療有効量を対象に投与する工程を含んでいる。
第１０３の態様は、投与の工程が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの投与を追加で含み、ウイルスが弱毒生ウイルスまたは不活化ウイルスである、態様４２－４７のいずれか一態様に記載の方法に関する。
第１０４の態様は、前記ポリペプチドが、ポリペプチドと比較して１または複数の保存的置換を有する、態様１～９または１０～２４のいずれか一態様に記載のポリペプチドに関する。
第１０５の態様は、前記ポリペプチドがＭＨＣ結合性及びＴＣＲ特異性を保持し、及び／又は抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持する、態様１０４に従うポリペプチドに関する。
本開示のさらなる態様および利点は、例示的なものとしてのみ考慮されるべき、以下のセクションで提供される。
以下に示す実施例は、いかなる方法によっても本発明の範囲を限定するものと解釈されるものではない。本開示に照らして、特許請求の範囲の範囲内の多数の実施形態は、当業者には明らかであろう。
（実施例１：ＨＬＡの潜在的なエピトープのインシリコによる同定）
Ｔ細胞は、細胞から提示されたエピトープを、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）クラスＩおよびＩＩ分子と関連で特異的に認識する。これらのＴ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ結合溝に適合する７－３０の連続したアミノ酸からなる線形配列として表現することができる。様々な起源のタンパク質分子内のクラスＩおよびＩＩエピトープを検出するために、多くのコンピュータアルゴリズムが開発され、使用されてきた（De Groot AS et al,(1997), AIDS Res Hum Retroviruses,13(7):539-41; Schafer JRら, (1998), Vaccine,16(19):1880-4; De Groot ASら, (2001), Vaccine, 19(31):4385-95; De Groot ASら、 (2003), Vaccine, 21(27-30):4486-504）。
Ｔ細胞エピトープのこれらの「インシリコ」予測は、ワクチンの設計および治療タンパク質、すなわち抗体ベースの薬剤、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、人工タンパク質スキャフォールド、酵素、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキンおよび血栓溶解剤の脱免疫にうまく適用されている（Dimitrov DS, (2012), Methods Mol Biol, 899:1-26）。
Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｒｉｘシステム（ＥｐｉＶａｘ、プロビデンス、ロードアイランド州）は、より大きなデータセットから９量体ポリペプチド配列を同定するのに有用なアルゴリズムである。Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｒｉｘシステムは、入力配列を、入力された複数の全配列（同じ病原体の複数の株（strain）など）の間で保存されている９量体配列へ解析し、このシステムは、最も変異しやすい潜在的なワクチン標的でさえ、対象とする。これらの９量体配列は、データセット間で同一にマッチする９量体配列を検索することができる。
ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（商標）システム（ＥｐｉＶａｘ，プロビデンス、ロードアイランド州）は、クラスＩおよびクラスＩＩ ＨＬＡリガンドとＴ細胞エピトープの予測に有用なコンピュータープログラムにコード化された一連の予測アルゴリズムである。ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（商標）システムは、特定のアミノ酸とＨＬＡ分子内の結合位置との間の相互作用をモデル化するために、マトリックスを使用する。任意の入力タンパク質内に存在する推定エピトープを特定するため、ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（商標）システムではまず、入力タンパク質を解析して、重複するｎ量体フレーム（ｎ＝スクリーニングするエピトープペプチドのアミノ酸長、例えばｎ＝９またはｎ＝１０）のセットを作成し、各フレームは最後のｎ－１アミノ酸だけ重複している状態にする。次に、各フレームは、ＨＬＡ分子の１または複数の共通アレルに対する予測される親和性についてスコアリングされる。
簡単に説明すると、任意のｎ量体ペプチドについて、特定のアミノ酸コード（２０の天然に存在するアミノ酸のそれぞれについて１つ）と相対的結合位置（１～ｎ）を用いて、予測マトリックスから係数を選択する。個々の係数は、Sturniolo（Sturniolo Tら、1999、Nat Biotechnol、17(6):555-61）により最初に開発されたポケットプロファイル法と類似するが同一ではない独自の方法を使用して導き出される。
次に、個々の係数が合計され、生のスコアが生成される。ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（商標）の生のスコアは、次に、ランダムに生成された非常に大規模なペプチド配列のセットから得られたスコア分布に関して正規化される。結果として得られる「Ｚ」スコアは正規分布であり、アレル間で直接比較することができる。
ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（商標）の「Ｚ」スケールで１．６４以上のスコア（任意のペプチドセットの上位５％程度）を持つペプチドは、それが予測されたＭＨＣ分子に結合する可能性がかなり高いと判断される。スケールで２．３２以上のスコア（上位１％）のペプチドは、結合する可能性が極めて高い。
推定Ｔ細胞エピトープのクラスターを含むペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのアッセイの検証で陽性となる可能性が高くなる。複数の態様では、最初のＥｐｉＭａｔｒｉｘ（商標）分析の結果は、Ｃｌｕｓｔｉｍｅｒ（商標）アルゴリズムとして知られる第２の独自アルゴリズムを使用して、推定Ｔ細胞エピトープ「クラスター」の存在についてさらにスクリーニングされる。Ｃｌｕｓｔｉｍｅｒ（商標）アルゴリズムは、任意のアミノ酸配列内に含まれ、統計的に異常に多くの推定Ｔ細胞エピトープを含むサブ領域を特定する。典型的なＴ細胞エピトープ「クラスター」の長さは約９から約３０アミノ酸であり、複数のアレルへの親和性と複数の９量体フレームを考慮すると、約４から約４０の推定Ｔ細胞エピトープを含むことができる。
表１は、本発明で開示された配列番号４－８のＴ細胞エピトープを含む、２０１９－ｎＣｏＶのＥＮＶＥＬＯＰＥ：エンベロープ（配列番号１）からのＭＨＣクラスＩＩクラスター選択の概要；本発明で開示される配列番号９－６３のＴ細胞エピトープを含む、２０１９－ｎＣｏＶのＭＥＭＢＬＡＮＥ：膜（配列番号２）からのＭＨＣクラスＩＩクラスター選択の概要；本発明で開示される配列番号６４－２２４および４５４－４５６のＴ細胞エピトープを含む、２０１９－ｎＣｏＶのＳＰＩＫＥ：スパイク（配列番号３）からのＭＨＣクラスＩＩクラスター選択の概要を開示する。
表１は、本発明で開示された配列番号４－２２４及び４５４－４５６の各Ｔ細胞エピトープのクラスター配列（太字）、クラスタースコア（フランクを含まない）、クラスＩ ＭＨＣのＥｐｉＭａｔｒｉｘヒット数（ヒット数は、ＥｐｉＭａｔｒｉｘ Ｚスコア１．６４以上の数または配列内で見つかった上位５％の数である）を開示している。
各エピトープクラスターは、推定Ｔ細胞エピトープのスコアを合計し、候補エピトープクラスターの長さと同じ長さのランダムに生成されたクラスターの期待スコアに基づく補正係数を減算して、総計（aggregate）ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（商標）スコアを算出する。+１０を超えるＥｐｉＭａｔｒｉｘ（商標）クラスタースコアは有意であると考えられる。複数の態様において、本開示のＴ細胞エピトープは、Ｔ細胞エピトープクラスターとして知られるパターンを形成するいくつかの推定Ｔ細胞エピトープを含む。
ＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘシステム（ＥｐｉＶａｘ、プロビデンス、ロードアイランド州）は、宿主プロテオームとの交差保存性についてペプチド配列をスクリーニングするのに有用である。ＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘは、ペプチドクラスターと宿主ゲノムまたはプロテオームとの間の交差反応性の可能性を、それらの推定ＭＨＣリガンドにおけるＴＣＲに面した残基の保存に基づいて予測するアルゴリズムである。ＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘアルゴリズムは、まず、与えられたタンパク質配列に含まれる予測エピトープをすべて考慮し、各予測エピトープを構成するアグレトープとエピトープに分割する。次に、各配列をホストタンパク質のデータベースに対してスクリーニングする。ＭＨＣに面したアグレトープが一致し（すなわち、入力ペプチドとその宿主側のペプチドのアグレトープが同じＭＨＣアレルに結合すると予測される）、全く同じＴＣＲに面したエピトープを持つペプチドが返される。
ＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘホモロジースコアは、免疫寛容に偏っていることを示唆している。治療用タンパク質の場合、自己由来のヒトエピトープと治療用エピトープの交差保存性は、そのような候補がヒトの免疫系に許容される可能性を高める可能性がある。ワクチンの場合、ヒトエピトープと抗原性エピトープとの間の交差保存は、そのような候補が免疫カモフラージュを利用していることを示し、それによって免疫応答を回避し、効果のないワクチンとなる可能性がある。宿主が例えばヒトの場合、ペプチドクラスターは、推定上のＨＬＡリガンドにおけるＴＣＲに面した残基の保存性に基づいて、ヒトゲノムやプロテオームに対してスクリーニングされる。次に、ペプチドはＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘホモロジースコアを用いてスコアリングされる。複数の態様において、２．５未満または３．０未満のＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘ相同性スコアを有するペプチドは、低い寛容性の可能性を示し、ワクチンに有用である可能性がある。複数の態様において、３．０を超えるＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘホモロジースコアを有するペプチドは、高い寛容性の可能性を示し、ワクチンには有用でない場合があり、複数の態様において、本開示のＴ細胞エピトープ組成物から除外される場合がある。
表１は、本発明で開示される配列番号４－２２４および４５４－４５６のＴ細胞エピトープのＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘ相同スコアを開示し、これらはすべて２．５を十分に下回っている。
複数の態様において、ＶａｃｃｉｎｅＣＡＤシステムは、ワクチン候補配列の接合時に新規エピトープの生成を回避するために、潜在的なエピトープワクチン候補をストリング状に配置するのに有用である。具体的には、ＶａｃｃｉｎｅＣＡＤは、接合プロセスで現れる可能性のある有害な接合エピトープを最小限に抑えながら、潜在的なワクチン候補をビーズのストリング状（string-of-beads）ワクチンに設計する。ＶａｃｃｉｎｅＣＡＤは、ＥｐｉＭａｔｒｉｘを使用してジャンクションエピトープを予測することができる。
［実施例２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの投与］
ワクチン構築物の設計は、本明細書で示されるような態様において開発される。全体を通して記載されるように、そのようなワクチンは、ＣＯＶＩＤ－１９などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫応答を刺激、誘導、および／または拡大するために使用されてもよい。このようなワクチンは、強力なＴ細胞媒介免疫応答を開始させ、液性免疫応答を誘導する可能性を有する。
したがって、任意選択で、弱毒生ウイルス（ＬＡＶ）または不活化ウイルスとの組み合わせを含む、明細書に開示されるワクチンを、適切な動物モデル、例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスターなど、あるいは当技術分野で知られているようにヒトにおいて免疫化試験で投与する。この混合ワクチンの投与によるデータは、ワクチンの安全性と有効性について肯定的な結果をもたらす。このワクチン接種方法は、細胞性免疫応答と液性免疫応答の両方を誘導し、それによって、ヒトにおけるＣＯＶＩＤ－１９などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）や中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫応答を刺激、誘導、および／または拡大すると予測される。
［実施例３．ＭＨＣへのポリペプチドの結合］
（可溶性ＭＨＣに結合する本開示のポリペプチドの評価方法）
（ペプチドの合成）
本開示のポリペプチド（以下に限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含む、またはこれ（ら）のみからなる、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド、表２に開示されているようなＩｉ－Ｋｅｙ構築物）は、直接化学合成または組み換え法によって製造することができる（J Sambrookら, J Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2ED, 1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Springs Harbor, NY (Publ)）。
すべてのペプチドは、純度、質量、および正しい配列を決定するために、放出前に厳格な品質管理の特性評価を受ける。ペプチドは逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）により純度が評価される。ペプチドの純度は９０％以上で、各製剤はアミノ酸分析を行い、異なるロットのペプチド間の一貫性と再現性のために同等のモル量がアッセイで使用されることを保証し、またペプチドの効能間の信頼できる比較研究を可能にする。ペプチドは、タンデム質量分析およびＭＳＣｈｅｃｋＴ分析を用いて、質量および正しい配列について評価される。特定の態様において、本明細書に開示されるようなポリペプチドは、ｎ－末端アセチル基および／またはｃ－末端アミノ基でキャップされる。選択されたポリペプチドのＨＰＬＣ、質量分析およびＵＶスキャン（それぞれ純度、質量およびスペクトルを確保する）分析は、８０％超の純度を示すであろう。
（ＨＬＡ結合アッセイ）
結合活性は、ＥｐｉＶａｘ（プロビデンス、ロードアイランド州）において分析され、本開示の任意のポリペプチド（例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含む、またはこれ（ら）のみからなる、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない）について、行われる。
使用される結合アッセイ（Steere ACら、(2006)、J Exp Med、2003(4):961-71）は、ペプチド－ＭＨＣ親和性の間接的な尺度をもたらす。可溶性ＨＬＡ分子は、非標識実験ポリペプチド及び標識対照ペプチドと共に９６ウェルプレートにロードされる。結合混合物が定常平衡に達すると（２４時間後），ＨＬＡ－ポリペプチド複合体を抗ヒトＤＲ抗体でコートしたＥＬＩＳＡプレート上で捕捉し、標識のためにユーロピウムがリンクしたプローブ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で検出する。
結合した標識対照ペプチドの時間分解蛍光は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５ユニット（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）で評価する。実験ポリペプチドの結合は、標識対照ペプチドの阻害率（実験蛍光／対照蛍光を１００倍した値）として表される。各実験用ポリペプチドの阻害パーセント値（モル濃度範囲にわたって）を用いて、標識対照ポリペプチドの特異的結合の５０％を阻害する濃度、すなわち、ポリペプチドのＩＣ５０を算出する。
選択した実験用ポリペプチドは、ＤＭＳＯに溶解される。希釈されたポリペプチドは、水性緩衝液中の結合試薬と混合され、１００，０００ｎＭから１００ｎＭまでの最終濃度を得ることができる。選択されたポリペプチドは、８つの一般的なクラスＩＩＨＬＡアレル：ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊１３０１、およびＤＲＢ１＊１５０１のパネルに対してアッセイされる。各濃度における標識対照ペプチドの阻害率から、線形回帰分析を用いて各ポリペプチド／アレル組合せのＩＣ５０値を導き出す。
このアッセイでは、実験用ポリペプチドは、１００ｎＭ以下の濃度で対照ペプチド結合の５０％を阻害する場合、非常に高い親和性で結合すると考えられ、１００ｎＭと１，０００ｎＭの間の濃度で対照ペプチド結合の５０％を阻害する場合は高い親和性と考えられ、１，０００ｎＭと１０，０００ｎＭとの間の濃度で対照ペプチド結合の５０％を阻害する場合は中程度の親和性と考えられている。低親和性ペプチドは、１０，０００ｎＭから１００，０００ｎＭの間の濃度で対照ペプチド結合の５０％を阻害する。１００，０００ｎＭ以下のいかなる濃度でも対照ペプチド結合の５０％以上を阻害できず、用量反応を示さないペプチドを非結合体（ＮＢ）とする。
（ＨＬＡクラスＩＩ分子との結合によるペプチドの特性評価）
可溶性ＭＨＣ結合アッセイは、本発明で開示されるポリペプチドのいずれか（例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含む、またはこれ（ら）のみからなる、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド、表２に開示されているような、ハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物が挙げられるが、これに限定されない）について行われる。
可溶性ＭＨＣ結合アッセイは、先に記載した方法に従って、本明細書に開示したような選択されたポリペプチドに対して行われる。ＩＣ５０値（ｎＭ）は、６点阻害曲線から導出される。ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（商標）予測、計算されたＩＣ５０値、および結果の分類は、各ポリペプチドおよびＨＬＡアレルについて報告される。ＨＬＡ ＤＲＢ１＊０８０１アッセイや ＨＬＡ ＤＲＢ１＊１５０１アッセイなど、選択したクラスＩＩ ＨＬＡアレルに対する特定のポリペプチドの結合曲線が生成される。
［実施例４．ペプチド露出型ＡＰＣ］
（ペプチドに曝露されたＡＰＣの表現型を評価するための方法）
プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるクラスＩＩ ＨＬＡ（ＨＬＡ－ＤＲ）およびＣＤ８６の表面発現は、ＡＰＣがＴ細胞応答を調節する一つの方法である。このアッセイでは、候補ポリペプチドは、プロフェッショナルＡＰＣ、特に樹状細胞の表面上のクラスＩＩ ＨＬＡおよび共刺激分子ＣＤ８６の発現に影響を与える（例えば、上方制御する）能力についてテストされる。
複数の態様において、アンカー残基への変異を有する、本明細書に開示されるようなポリペプチドは、クラスＩＩ ＨＬＡ表面マーカーおよび共刺激分子ＣＤ８６の発現の増加をもたらすことが予測される。
本開示のポリペプチド（例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含む、またはこれ（ら）のみからなる、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド、ならびに表２のものを含む本開示のＩｉ－ｋｅｙ構築物が挙げられるが、これに限定されない）を、ＥｐｉＶａｘ（ＥｐｉＶａｘ、プロビデンス、ロードアイランド州）において以前に開発した独自のＡＰＣ表現型アッセイを用いてエフェクター潜在性について個別にテストする。
前もって採取され凍結されたＰＢＭＣは、従来の方法で解凍され、ｃｈＲＰＭＩに懸濁される。ＨＬＡの分類は、ハートフォード病院（コネチカット州ハートフォード）により、ＥｐｉＶａｘへ提供された、細胞材料の少量の抽出サンプルで実施される。
アッセイ０日目に、０．５×１０６の細胞を抽出し、表面マーカーＣＤ１１ｃ（樹状細胞に特有のマーカー）の存在についてスクリーニングし、表面マーカーＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤ８６の存在についてフローサイトメトリーにより分析される。残りの細胞を、プレーティング（ｃｈＲＰＭＩ＋８００μｌ培地中４．０ｘ１０６細胞／ｍＬ）し、選択したペプチドのうちの１つ、または緩衝液のみ（ネガティブコントロール）、Ｔレジトープ１６７（エフェクター活性のネガティブコントロール）（21st Century Biochemicals、Marlboro、MA）、Ｆｌｕ－ＨＡ３０６－３１８（ポジティブコントロール）（21stCentury Biochemicals、Marlboro、MA）およびＯｖａ３２３－３３９（ネガティブコントロール）（21st Century Biochemicals、Marlboro、MA）を含むポジティブおよびネガティブコントロールの１つで刺激（５０μｇ／ｍＬ）する。プレーティングした細胞は、３７℃で７日間インキュベートされるだろう。アッセイ７日目に、インキュベートされた細胞は、表面マーカーＣＤ１１ｃの存在についてフローサイトメトリーによりスクリーニングされる。ＣＤ１１ｃ陽性細胞は、次に表面マーカーＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ８６の存在について分析される。実験ペプチドは、５人の異なるヒトドナーから採取したサンプルでテストされている。
白血球除去フィルターは、健康なドナーから得られた全血から白血球をろ過するために、ロードアイランド血液センター（プロビデンス、ＲＩ）から入手する。全血をフィルターに通した後、フィルターを逆方向に流し、回収した白血球をフィルターから押し出す。白血球は、通常のＦｉｃｏｌｌ（商標）分離勾配（ＧＥヘルスケア社製）を用いて分離される。回収された白血球は、その後、将来の使用のために冷凍保存される。アッセイに使用するために必要な場合、凍結した白血球は通常の方法で解凍される。後述するＧｖＨＤ研究のために、ＰＢＭＣを（例えば、ＨｅｍａＣａｒｅ， Ｖａｎ Ｎｕｙｓ， ＣＡから）入手する。
樹状細胞の表現型に関する本明細書に本発明で開示されるポリペプチドへの曝露は、複数の手段によって測定される。まず、各実験条件について、ＣＤ１１ｃおよびＨＬＡ－ＤＲの表面発現を対比させたドットプロットを作成する。すべての対照ペプチドと実験ペプチドに暴露した細胞のドットプロットを、培養培地のみに暴露したコントロール細胞のドットプロットに重ね合わせる。この重ね合わせは、ポリペプチドで刺激したＣＤ１１ｃ高発現細胞と刺激していないＣＤ１１ｃ高発現細胞との間のＨＬＡ－ＤＲ分布のシフトを視覚的に観察する効果的な方法となる（データは示していない）。ＨＬＡ－ＤＲの分布における観察されたシフトを、定性的な指標として報告する。次に、各ドットプロットのＣＤ１１ｃ－高セグメントについて、ＨＬＡ－ＤＲ発現強度の変化を計算する。ＨＬＡ－ＤＲ発現強度の変化率は、ペプチド曝露細胞のＨＬＡ－ＤＲ発現の平均蛍光指数（ＭＦＩ）から培地暴露細胞のＨＬＡ－ＤＲ発現のＭＦＩを引いたものを、培地暴露細胞のＨＬＡ－ＤＲ発現のＭＦＩで割って１００倍した値：
（ＨＬＡ－ＤＲＭＦＩペプチド－ＨＬＡ－ＤＲＭＦＩ培地／ＨＬＡ－ＤＲＭＦＩ培地×１００培地）に等しくなる。
次に、ＣＤ１１ｃ高発現集団の中に存在するＨＬＡ－ＤＲ低細胞の割合の、培地コントロールに対する変化率を、各ペプチドについて算出する。ＨＬＡ－ＤＲ－低細胞の割合の変化率は、ペプチド曝露細胞のＨＬＡ－ＤＲ－ｌｏｗの割合から培地曝露細胞のＨＬＡ－ＤＲ－ｌｏｗの割合を引いたものを、培地曝露細胞のＨＬＡ－ＤＲ－ｌｏｗの割合で割って１００倍した値：
（ＨＬＡ－ＤＲ－低％ペプチド－ＨＬＡ－ＤＲ－低％培地／ＨＬＡ－ＤＲ－低％培地×１００培地培地）に等しくなる。このアッセイでは、観察されたＨＬＡ－ＤＲＭＦＩの負の変化、およびＣＤ１１ｃ－高発現集団に存在するＨＬＡ－ＤＲ－低細胞の割合の正の変化は、ＨＬＡの発現が減少し、制御性ＡＰＣ表現型へシフトしたことを意味する。
このアッセイにおいて、観察されたＨＬＡ－ＤＲ ＭＦＩの正の変化、およびＣＤ１１ｃ－高発現集団に存在するＨＬＡ－ＤＲ－低細胞の割合の負の変化は、ＨＬＡの発現の増加およびエフェクターＡＰＣ表現型へのシフトを示唆する。
同様の方法で、Ｔ細胞の活性化を促進することが知られているコスティミュレーション分子であるＣＤ８６の表面発現に対する本開示のポリペプチドの暴露の影響を評価する。まず、各実験条件について、ＣＤ１１ｃとＣＤ８６の表面発現を対比させたドットプロットを作成する。すべてのコントロールおよび実験用Ｔレジトープに暴露した細胞のドットプロットは、培養培地のみに暴露したコントロール細胞のドットプロットに重ね合わせる。この重ね合わせにより、ポリペプチドで刺激したＣＤ１１ｃ高発現細胞と刺激していないＣＤ１１ｃ高発現細胞との間でＣＤ８６の分布のシフトを視覚的に観察する効果的な方法が得られる。ＣＤ８６の分布における観察されたシフトは、定性的な指標として報告される。
次に、各ドットプロットのＣＤ１１ｃ－高セグメントについて、ＣＤ８６－高発現の強度の変化を計算する。ＣＤ８６－高発現の強度の変化率は、ペプチド曝露細胞に対するＣＤ８６発現の平均蛍光指数（ＭＦＩ）から培地暴露細胞に対するＣＤ８６－高発現のＭＦＩを引いたものを、培地暴露細胞に対するＣＤ８６発現のＭＦＩで除して１００倍したもの：
（ＣＤ８６－高ＭＦＩペプチド－ＣＤ８６－高ＭＦＩ培地／ＣＤ８６－高ＭＦＩ培地×１００）に等しくなる。
次に、ＣＤ１１ｃ高発現集団のうち、ＣＤ８６低細胞が存在する割合の変化率を算出する。ＣＤ８６－ｈｉｇｈ細胞の割合の変化パーセントは、ペプチド曝露細胞に対するＣＤ８６－ｈｉｇｈの割合から、培地暴露細胞に対するＣＤ８６－ｈｉｇｈの割合を引いたものを、培地暴露細胞に対するＣＤ８６－ｈｉｇｈの割合で割ったものに１００をかけたもの：
（ＣＤ８６－低％Ｉペプチド－ＣＤ８６－低％培地／ＣＤ８６－低％培地×１００）に等しい。このアッセイでは、観察されたＣＤ８６ＭＦＩの負の変化、およびＣＤ１１ｃ－高発現集団に存在するＣＤ８６－低細胞の割合の正の変化は、ＣＤ８６の発現低下および制御性ＡＰＣ表現型へのシフトを示す。このアッセイにおいて、観察されたＣＤ８６ＭＦＩの正の変化、およびＣＤ１１ｃ－高発現集団に存在するＣＤ８６－低細胞の割合の負の変化は、ＣＤ８６の発現の増加およびエフェクターＡＰＣ表現型へのシフトを示唆する。
（ペプチドに暴露されたＡＰＣの特性評価）
樹状細胞表現型アッセイは、先に記載した方法に従って、本開示のポリペプチドで実施される。
ＣＤ１１対ＨＬＡ－ＤＲの表面発現を表すドットプロットは、様々なペプチド刺激剤の存在下で、５人のドナーについてアッセイ７日目に分析される。複数の態様において、獲得エフェクター表現型を示す媒体対照と比較して、ＣＤ１１ｃ＋／ＨＬＡ－ＤＲ＋集団の上方移動が、本開示のエフェクターポリペプチド（例えば、本開示のポリペプチドから選ばれたもの（以下に限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含む、またはこれ（ら）のみからなる、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド、および表２に開示されているようなハイブリッドＩｉ－Ｋｅｙ構築物））で処理した試料において明らかになることが予想される。
ＣＤ１１ｃ対ＣＤ８６の表面発現を表すドットプロットは、様々なペプチド刺激剤の存在下で、５人のドナーにわたってアッセイ７日目に分析される。獲得エフェクター表現型へのシフトを示す媒体対照と比較して、本開示のエフェクターポリペプチドで処理した試料に存在するＣＤ８６－高細胞の増加が予想される。
複数の態様において、本明細書に開示されるようなポリペプチド（例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含む、またはこれ（ら）のみからなる、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド、および表２のものを含む本開示のＩｉ－ｋｅｙ構築物が含まれるが、これに限定されない）により、対照媒体と比較して、ＨＬＡ－ＤＲの発現を増加することが予想される。
［実施例６．ＣＯＶＩＤ－１９回復者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するメモリーＴ細胞応答］
＜材料と方法＞
（ペプチドの合成）
合成ペプチドは、21st Century Biochemicals （マールボロ、MA）による９－フルオロニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化合物を用いて製造された。ペプチドの純度は、分析的逆相ＨＰＬＣによって確認され、９０％以上であった。ペプチドの質量は、タンデム質量分析によって確認された。
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２回復期ドナー）
回復期の患者は、参加者の特定、同意、登録を行った臨床サービスグループであるＳａｎｇｕｉｎｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社によって募集された。対象者は、（ｉ）書面でのインフォームドコンセントと写真付き身分証明書を提供する意思と能力があり、（ｉｉ）１８－６０歳の男女で、（ｉｉｉ）ＣＯＶＩＤ－１９診断確定（回復）で診断日が血液採取から３０日以上であり、（ｉｖ） ＣＯＶＩＤ－１９ ＰＣＲ系キットの陽性が、タイムスタンプ付きのカルテや診断テストレポート、使用テストキットが明記されていたことである。除外基準には、（ｉ）妊娠中または授乳中、（ｉｉ）ＨＩＶ、肝炎またはその他の感染症の既往歴がある、（ｉｉｉ）自己免疫疾患がある、（ｉｖ）脆弱な患者集団（囚人、精神障害者）、（ｖ）献血能力に影響を及ぼす病状（すなわち、貧血、急性疾患）がある対象が含まれる（ｉｖ）過去６ヶ月以内に免疫抑制療法またはステロイドの投与を受けた者、（ｖｉｉ）過去３０日以内に治験薬の投与を受けた者、（ｖｉｉｉ）過去１ヶ月間に２５０ｍＬまたは過去２ヶ月間に５００ｍＬの献血を含む過剰出血があった者、（ｉｘ）ＣＯＶＩＤ－１９ ＰＣＲ検査が陽性であるが無症状であった者が挙げられる。サンプルはＮＩＨの規則に従い、ＩＲＢの承認を得て収集された。
（健康な未罹患ドナー）
サンプルは、２０１９年１２月のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２発生前の非関連研究のためにロードアイランド血液センターから白血球除去フィルターから入手した。サンプルは、ＮＩＨの規則に従い、ＩＲＢの承認を得て収集された。
（ＰＢＭＣの培養）
解凍した全ＰＢＭＣ（正常な健康なドナー）を一晩休ませ、抗原刺激（本発明で開示の脱寛容化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドを含む）によって、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で９日間にわたって増殖させる。４８ウェルプレートにおいて、ヒトＡＢ血清を補充した１５０μＬのＲＰＭＩ培地中の５×１０６細胞は、１日目に１０μｇ／ｍＬのペプチドのプールで刺激されることになる。３日後、ＩＬ－２を１０ｎｇ／ｍＬ添加し、培地量を３００μＬに上昇させる。７日目に、細胞に１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を培地半量交換で補充する。２日後、免疫リコール反応を測定する準備として、ＰＢＭＣを回収し、洗浄することになる。
（フルオロスポットアッセイ）
インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）フルオロスポットアッセイは、ｅｘ ｖｉｖｏでＭａｂｔｅｃｈから購入したキットを用いた培養後に行い、製造業者の仕様書に従って実施する。ペプチドを、１０％ヒトＡＢ血清を補充したＲＰＭＩ培地中の２５万のＰＢＭＣ（ｅｘ ｖｉｖｏ）または１０万のＰＢＭＣ（培養）を含む３反復でウェルに、１０μｇ／ｍＬで個別に添加し、プールする（８のペプチド、１．２５μｇ／ｍＬ）。ポジティブコントロールとしてＣｏｎＡ（１０μｇ／ｍＬ）を含む３反復でウェルをプレーティングし、抗原刺激を含まない６つのウェルをバックグラウンド決定のために使用する。細胞は５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で４０－４８時間インキュベートする。ＦＩＴＣ標識抗ＩＦＮ－γ検出抗体を用いて、製造元の指示に従いプレートを現像する。
フルオロスポットリーダーシステム（ｉＳｐｏｔ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、ＡＩＤ、Ｓｔｒａｓｓｂｅｒｇ、ドイツ）、ソフトウェアバージョン７．０，ｂｕｉｌｄ１４７９０を用いて、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５の別々のフィルターを用いてフルオロスポットがカウントし、ＺｅｌｌＮｅｔ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ，Ｉｎｃ．により生のスポット数が記録される。カメラの露出とゲインの設定は、各フィルターに適合させ、露出過多または露出不足を防ぎ、高品質のスポット画像を得るようにした。スポットサイズ、スポット強度、スポット勾配（スポットの中心から周辺にかけて染色強度が弱まる）を用いて蛍光体固有のスポットパラメータを定義し、スポット分離アルゴリズムを適用して最適なスポット検出を行う。
結果は、ペプチドウェルのスポット数の平均値として算出し、１００万細胞あたりのスポット数に調整する。以下の基準を満たす反応は、スポット数が（ｉ）バックグラウンドの少なくとも２倍、（ｉｉ）バックグラウンドより１ウェルあたり５０個以上のスポット形成細胞（２万のＰＢＭＣあたり１の反応）、（ｉｉｉ）スチューデントのｔ検定により培地のみのコントロールと統計的に異なる（ｐ＜０．０５）場合に陽性とする。
本開示のポリペプチド（これらに限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布する１～１２の追加アミノ酸、を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド、ならびに、表２のものを含む本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物）は、自然感染で生じたＴ細胞によって認識され、Ｔｈ１サイトカイン産生を刺激し、感冒コロナウイルスに対する既存の免疫を刺激する可能性があり、臨床試験において記憶免疫を増強することができるであろう。
図２Ａ－図７について、ペプチド１（またはランク１）は配列番号２１８であり；ペプチド２（またはランク２）は配列番号１９であり；ペプチド３（またはランク３）は配列番号２１６であり；ペプチド４（またはランク４）は配列番号２１２であり；ペプチド５（またはランク５）は配列番号８９であり；ペプチド６（またはランク６）は配列番号９４であり；ペプチド７（またはランク７）は配列番号３４であり；ペプチド８（またはランク８）は配列番号１４２であり；ペプチド９（またはランク９）は配列番号２２１であり；ペプチド１０（またはランク１０）は配列番号５４であり；ペプチド１１（またはランク１１）は配列番号１８６であり；ペプチド１２（またはランク１２）は配列番号５９であり；ペプチド１３（またはランク１３）は配列番号２１４であり；ペプチド１４（またはランク１４）は配列番号２２３であり；ペプチド１５（またはランク１５）は配列番号２１９であり；ペプチド１６（またはランク１６）は配列番号１９１であり；ペプチド１７（またはランク１７）は配列番号２２４であり；ペプチド１８（またはランク１８）は配列番号２２２であり；ペプチド１９（またはランク１９）は配列番号２１０であり；ペプチド２０（またはランク２０）は配列番号４９であり；ペプチド２１（またはランク２１）は配列番号１０４であり；ペプチド２２（またはランク２２）は配列番号２１７であり；ペプチド２３（またはランク２３）は配列番号２１３であり；ペプチド２４（またはランク２４）は配列番号２１５であり；ペプチド２５（またはランク２５）は配列番号１０９であり；ペプチド２６（またはランク２６）は配列番号２２０であり；ペプチド２７（またはランク２７）は配列番号１４７であり；ペプチド２８（またはランク２８）は配列番号１８１であり；ペプチド２９（またはランク２９）は配列番号１９６であり；ペプチド３０（またはランク３０）は配列番号９であり；ペプチド３１（またはランク３１）は配列番号１１４であり；およびペプチド３２（またはランク３２）は配列番号９９である。
さらに、プールＡは配列番号２１８；配列番号１９；配列番号２１６；配列番号２１２；配列番号８９；配列番号９４；配列番号３４；配列番号１４２を含む。プールＢは配列番号２２１；配列番号５４；配列番号１８６；配列番号５９；配列番号２１４；配列番号２２３；配列番号２１９；配列番号２２０を含む。プールＣは配列番号１８１；配列番号２２２；配列番号２１０；配列番号４９；配列番号１０４；配列番号２１７；配列番号２１３；配列番号２１５を含む。プールＤは配列番号１０９；配列番号２２０；配列番号１４７；配列番号１８１；配列番号１９６；配列番号９；配列番号１１４；配列番号９９を含む。
図２Ａおよび図２Ｂに示すように、ｅｘ ｖｉｖｏ免疫リコール応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ナイーブ個体および経験個体を区別し、異なるＣＯＶＩＤ－１９免疫型を示す。回復期のドナーにおける頑健な免疫応答および失敗した免疫応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２経験者のディープ免疫プロファイリング研究において特徴付けられた異なる免疫型を表す可能性がある（Giles et al. Deep immune profiling of COVID-19 patients reveals distinct immunotypes with therapeutic implications.Science.2020 Jul 15:eabc8511. doi: 10.1126/science.abc8511.PMID:32669297、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
態様において、本開示のポリペプチド（例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、ならびに任意に配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド、および表２のもの（配列番号２３２－４５２および４５７－４５９）などの本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）は、強いエフェクター免疫リコール応答（エフェクターサイトカイン、例えば、ＩＦＮ－γの生成など）を誘発すると予測される。
図３Ａおよび図３Ｂに示すように、強いｅｘ ｖｉｖｏ免疫リコール応答が、本発明で開示のポリペプチドを用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２経験者において見出される。
複数の態様において、本発明で開示のポリペプチド（例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、ならびに任意に配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド、および表２のもの（配列番号２３２－４５２および４５７－４５９）などの本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）は、強いｅｘ ｖｉｖｏ免疫リコール応答を誘発することが予測される。
図４に示すように、本発明で開示のポリペプチドは、自然のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染におけるｅｘ ｖｉｖｏ免疫リコール応答を刺激する。この例示的な研究において、３２の試験されたペプチドのうち、１５のテストされたペプチドが、少なくとも１人のドナーにおいて、緑色で示されるような陽性応答を示した。外部データとし、PengらbioRxiv [Preprint]2020 Jun 8 PMID: 32577665; PMCID: PMC7302222のプレプリントから示す。
複数の態様において、本開示のポリペプチド（例えば、配列番号２－２２４のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、ならびに任意に配列番号２－２２４のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド、および表２のもの（配列番号２３２－４５２および４５７－４５９）などの本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）は、強いエフェクター免疫リコール応答（エフェクターサイトカイン、例えば、ＩＦＮ－γの生成など）を誘発すると予測される。
図５Ａおよび図５Ｂに示すように、本発明で開示のポリペプチドは、培地での増殖後、ナイーブおよびＣＯＶＩＤ－１９回復期のドナーにおいて、高いＩＦＮ－γ応答を刺激する。ナイーブドナーにおける応答は、本開示のポリペプチドが、低頻度の感冒コロナウイルス交差反応性Ｔ細胞を拡大することを示唆する。
さらに、ｅｘ ｖｉｖｏおよび培地アッセイにおけるプールによる応答の違いは、エピトープ特異的Ｔ細胞が培養に付されたときの可変の表現型および／または増殖能力を反映している可能性がある。
複数の態様において、本開示のポリペプチド（例えば、配列番号２－２２４のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、ならびに任意に配列番号２－２２４のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド、および表２のもの（配列番号２３２－４５２および４５７－４５９）などの本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）は、強いエフェクター免疫リコール応答（エフェクターサイトカイン、例えば、ＩＦＮ－γの生成など）を誘発すると予測される。
図６Ａ及び図６Ｂに示すように、本発明で開示のポリペプチドは、培地での増殖後、ナイーブおよびＣＯＶＩＤ－１９回復期のドナーにおいて、低頻度エピトープ特異的Ｔ細胞を刺激する。ナイーブドナーにおける応答は、本開示のポリペプチドが、低頻度の感冒コロナウイルス交差反応性Ｔ細胞を拡大することを示唆する。
ｅｘ ｖｉｖｏおよび培地アッセイにおけるスパイクペプチドおよび膜ペプチドに対する応答の違いは、エピトープ特異的Ｔ細胞が培養に付されたときの可変の表現型および／または増殖能力を反映している可能性がある。
複数の態様において、本開示のポリペプチド（例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、ならびに任意に配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド、および表２のもの（配列番号２３２－４５２および４５７－４５９）などの本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）は、強いエフェクター免疫リコール応答（エフェクターサイトカイン、例えば、ＩＦＮ－γの生成など）を誘発すると予測される。
図７に示すように、本開示のポリペプチドは、ナイーブ及びＣＯＶＩＤ－１９回復期ドナーにおける培養の増殖後に低頻度エピトープ特定性Ｔ細胞を刺激する。３２のテストされたペプチドのうち、２７のテストペプチドは、少なくとも１人のドナーにおいて、緑色で示すように、陽性応答を示した。さらに、予想されるスパイクエピトープと感冒コロナウイルスとの交差保存性がナイーブドナーで確認された。外部データはNeldeら, Research Square [preprint]: 2020 Jun 17 doi: 10.21203/rs.3.rs-35331/v1.のプレプリントより示す。
このように、図２Ａ－図７のデータは、本開示のポリペプチドが、自然感染で生じたＴ細胞によって認識され、Ｔｈ１サイトカイン産生を刺激し、感冒コロナウイルスに対する既存の免疫を刺激し、記憶は臨床試験において免疫を高める可能性があることを実証するものである。
また、複数の態様において、本開示のポリペプチド（例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、ならびに任意に配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド、および表２のもの（配列番号２３２－４５２および４５７－４５９）などの本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物を含む）は、強いエフェクター免疫リコール応答（エフェクターサイトカイン（例えばＩＦＮ－γ）の産生など）を誘発すると予想される。
［実施例７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２罹患経験のあるヒトと未罹患のヒトにおけるＴ細胞エピトープマッピング］
（合理的なＣＯＶＩＤ－１９ワクチン設計のためのエピトープ候補の同定）
＜材料および方法＞
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の塩基配列）
ヒト宿主から分離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｔａｘｉｄ：２６９７０４９）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１（ｔａｘｉｄ：６９４００９）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ（ｔａｘｉｄ：１３３５６２６）、ヒトＣｏＶ（ｔａｘｉｄ：１１１３７、４４３２３９、２７７９４４、３１６３１）の抗原配列はアメリカ国立生物工学情報センターのＧｅｎＢａｎｋから取得した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エピトープは、２０１９年１２月から２０２０年１２月に分離されたゲノムが完全に配列決定された分離株から得られた配列間で比較した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１（GenBank id: MN908947）を参照株として選択した。
（Ｔ細胞エピトープマッピング）
各抗原配列は、可能性のある全ての線形９量体配列について解析された。各９量体は、Ｔ細胞エピトープをマッピングするためのマトリックスベースのアルゴリズムであるＥｐｉＭａｔｒｉｘバージョン１．３を用いて、クラスＩおよびクラスＩＩ ＨＬＡアレルのパネルへの結合の可能性がスコア化された。
クラスＩＩエピトープは、９つのスーパータイプアレルについて同定された。ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊０９０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊１３０１、ＤＲＢ１＊１５０１の９つのスーパータイプアレルについてクラスＩＩエピトープが同定された。
クラスＩエピトープ９量体（および１０量体）は、Ａ＊０１０１、Ａ＊０２０１、Ａ＊０３０１、Ａ＊２４０２、Ｂ＊０７０２、Ｂ＊４４０１の６つのスーパータイプアレルに結合する可能性があることが確認された。それぞれのアレルは、ヒト集団の９５％以上をカバーしている（Southwood S, Sidney J, Kondo A, et al.）。いくつかの共通のＨＬＡ－ＤＲタイプは、ペプチド結合レパートリーがほぼ重なり合っている（J Immunol. 1998; 160 (7): 3363-337; and Sette A, Sidney J. Nine major HLAクラスI supertypes account for the vast preponderance of HLA-A and -B polymorphism. The Immunogenetics. Immunogenetics. 1999; 50(3-4):201-212 これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
Ｔ細胞免疫原性ポテンシャルの高密度のタンパク質の領域を表すプロミスキャス・クラスＩＩ ＨＬＡエピトープを、ＣｌｕｓｔｉＭｅｒアルゴリズムを使用して同定した。同じ長さのランダムな配列に対するスコアの平均予想合計を差し引いた後、全体のＥｐｉＭａｔｒｉｘスコア≧１０をスコアするクラスターは、有意な免疫原性の可能性を有する（例えば、Ｍｏｉｓｅら、ｉＶＡＸ：抗原の選択と最適化及びエピトープ駆動型ワクチンの設計のための統合ツールキット。Human Vaccines & Immunotherapeutics 11:9, 2312-2321 (2015)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
（Ｔ細胞エピトープの相同性解析）
ＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘアルゴリズム（Moise L, Gutierrez AH, Bailey-Kellogg C, et al. The two-faced T cell epitope:ＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘによる宿主と微生物のインターフェースの検証。Hum Vaccines Immunother.2013;9(7):1577-1586. doi:10.4161/hv.24615，その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を用いて、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）－面保存（２、３、５、７、８位）と同じアレルによって制限されているがヒトプロテオームで見られるエピトープおよび他の（α－およびβ－）コロナウイルスエピトープを共有しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エピトープを同定した。
同じＭＨＣアレルに結合することが予測される、同一のＴＣＲ面残基を持つエピトープは、交差反応性Ｔ細胞を誘導する可能性がより高い。ヒト（自己）タンパク質との交差保存性について、２（配列の長さを平均した交差保存ＨＬＡアレル特異的エピトープ）のＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘスコア閾値を適用し、寛容または積極的に制御される可能性が高くなったエピトープを同定することとした。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エピトープと、関連する高病原性コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）および低病原性感冒性コロナウイルス（ＣＣＣ；ＯＣ４３、ＨＫＵ１、ＮＬ６２、２２９Ｅ）の保存性を調べるため、ＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘは５つの位置、２位と８位のＴＣＲ面における同一の残基のみを必要とするように設定した。
ｉＶＡＸが予測したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔ細胞エピトープとＩｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅに登録されているコロナウイルスエピトープとの個別相同性分析をＢＬＡＳＴを用いて行い、８０％の類似度をカットオフとした。
（ペプチド合成）
合成ペプチドは、２１ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（マールボロ、ＭＡ）による９－フルオロニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化合物を用いて製造された。ペプチドの純度は、分析的逆相ＨＰＬＣによって確認されたように、９０％以上であった。ペプチドの質量は、タンデム質量分析によって確認された。
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２回復期患者ドナー）
回復期の患者は、参加者の特定、同意、登録を行った臨床サービスグループであるSanguine Biosciences社によって募集された。対象者は、（ｉ）書面でのインフォームドコンセントを提供する意思と能力があり、（ｉｉ）１８－８０歳の男女で、（ｉｉｉ）ＰＣＲによりＣＯＶＩＤ－１９の診断が確定し（回復）、診断日が血液採取から３０日以上経過している者であることを条件とした。
除外基準は、（ｉ）妊娠中または授乳中、（ｉｉ）ＨＩＶ、肝炎またはその他の感染症の既往歴がある、（ｉｉｉ）自己免疫疾患がある、（ｉｖ）患者脆弱集団（囚人、精神障害者）の一員である、（ｖ）献血能力に影響を及ぼす病状（すなわち、貧血、急性疾患）がある対象、（ｖｉ）過去６ヶ月以内に免疫抑制療法またはステロイドの投与を受けた者、（ｖｉｉ）過去３０日以内に治験薬の投与を受けた者、（ｖｉｉｉ）過去１ヶ月間に２５０ｍＬまたは過去２ヶ月間に５００ｍＬの献血を含む過剰出血を経験した者、（ｉｘ）ＣＯＶＩＤ－１９ ＰＣＲテスト陽性であるが無症状であった者である。サンプルは、ＮＩＨの規則に従い、独立した外部の機関審査委員会の承認を得て収集された。
（健康な未罹患ドナー）
２０１９年１２月のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２発生前に、無関係な研究のためにロードアイランド血液センターから白血球減少フィルターから非同定サンプルを入手した（サンプル入手日：２０１６年２月－２０１９年１１月）。サンプルは、ＮＩＨの規制に従い、独立した外部の機関審査委員会（Ethical & Independent Review Services, Independence, MO）の承認を受けて入手した。
（ＰＢＭＣの培養）
ＣＯＶＩＤ－１９回復者のＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ分離後、直接培地に入れた。正常な健康なドナーからの細胞は、培地に入れる前に解凍し、一晩休ませた。サンプルはｅｘ ｖｉｖｏアッセイと抗原特異的細胞増殖に割り当てられ、その後、培地アッセイを行った。抗原刺激細胞は、５％ＣＯ２の雰囲気下、３７oＣで８日間培養された。４８ウェルプレートで、ヒトＡＢ血清を添加した１５０μＬＲＰＭＩ培地中の５ｘ１０６細胞を、１日目に１０μｇ／ｍＬのペプチドのプールで刺激した。３日後、ＩＬ－２を１０ｎｇ／ｍＬで添加し、培地量を３００μＬに上昇させた。７日目に、細胞に１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を培地半量交換で補充した。２日後、免疫リコール応答の測定準備のため、ＰＢＭＣを回収し、洗浄した。
（Ｅｘ ｖｉｖｏおよび培養ヒトフルオロスポットアッセイ）
インターフェロンγ（ＩＦＮγ）フルオロスポットアッセイは、Ｍａｂｔｅｃｈから購入したアッセイキットを用いてｅｘ ｖｉｖｏおよび培養ＰＢＭＣを用いて行い、メーカーの仕様書に従って実行した。ｅｘ ｖｉｖｏアッセイでは、特に断りのない限り、１０％ヒトＡＢ血清添加ＲＰＭＩ培地中の２５万のＰＢＭＣを含むウェルに、３反復でペプチドを個別に２０μｇ／ｍＬで添加するか、ペプチドごとに１０μｇ／ｍＬでプールした。培地アッセイでは、ペプチドを個々に１０μｇ／ｍＬで添加し、総ペプチド濃度１０μｇ／ｍＬでプールし（３２ペプチド、０．３１３μｇ／ｍＬ）、１０万のＰＢＭＣを含むウェルに３反復で添加した。ポジティブコントロールとしてＣｏｎＡ（５μｇ／ｍＬ）を加えたウェルを３反復でプレーティングし、抗原刺激なし（０．２－０．４％ＤＭＳＯ）を含む６つのウェルをバックグラウンドの決定に使用した。細胞は５％ＣＯ２の雰囲気下、３７oＣで４０～４８時間インキュベートした。プレートは、ＦＩＴＣ標識抗ＩＦＮ－γ検出抗体を用いて、製造元の指示に従って現像した。
フルオロスポットリーダーシステム（ｉＳｐｏｔ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、ＡＩＤ、Ｓｔｒａｓｓｂｅｒｇ、ドイツ）、ソフトウェアバージョン７．０，ｂｕｉｌｄ１４７９０を用いて、ＦＩＴＣおよびＣｙ３フィルターを使用してフルオロスポットをカウントし、Ｚｅｌｌ Ｎｅｔ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ，Ｉｎｃ．により生のスポット数が記録され、カメラの露出とゲインの設定は、各フィルターに適合させ、露出過多または露出不足を防ぎ、高品質のスポット画像を得ることができた。スポットサイズ、スポット強度、スポット勾配（スポットの中心から周辺にかけて染色強度が弱まる）を用いて蛍光体固有のスポットパラメータを定義し、スポット分離アルゴリズムを適用して最適なスポット検出を行った。
結果は、ペプチドウェルのスポット数の平均値として算出し、１００万細胞あたりのスポット数に調整した。以下の基準を満たす反応は、スポット数が（ｉ）バックグラウンドの少なくとも５倍、（ｉｉ）バックグラウンドより１ウェルあたり２５スポット形成細胞以上（４０，０００ ＰＢＭＣｓあたり１反応）、（ｉｉｉ）Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により培地のみのコントロールと統計的に異なる（ｐ＜０．０５）場合に陽性とみなされた。
（ＨＬＡタイピング）
ドナーのＨＬＡクラスＩＩ型は、ハートフォード病院移植免疫学研究所のＯｎｅ Ｌａｍｂｄａ Ｍｉｃｒｏ ＳＳＰ（商標）Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＨＬＡクラスＩＩ ｋｉｔを用いて決定された。
（マウス）
ＨＬＡ－ＤＲ３トランスジェニックマウスは、Ｄｒ． Ｃｈｅｌｌａ Ｄａｖｉｄ（Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ）から商業ライセンスで入手した。このマウスは、Ｂ．１０－Ａｂ０マウスクラスＩＩネガティブバックグラウンドでＨＬＡ－ＤＲＡとＤＲＢ１?０３０１遺伝子を発現している。マウス研究のための動物研究プロトコルは、Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．の審査と承認を受けた。動物実験委員会の審査を受け、承認された。
（ペプチドワクチンの調製）
１回当たり、１．２５または５．０μｇ／ペプチドの２０のペプチドのプールを５０μＬのポリ－ＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（商標）；Ｏｎｃｏｖｉｒ）と混和した。
（ワクチン接種）
ワクチン接種および偽処置をしたＨＬＡ－ＤＲ３マウス（Ｎ＝５／群）は、免疫開始時に雌で６－８週齢であった。マウスはプライミングされ、２週間後にペプチド／ポリＩＣＬＣワクチンの皮内免疫によってブーストされた。対照群には、滅菌水（Ｎ＝３）またはポリ－ＩＣＬＣ単独（Ｎ＝５）を投与した。マウスは、ブースト免疫の９日後に犠牲にされた。開始時と終了時の血液と脾臓は、免疫モニタリングのために採取された。５μｇ／ペプチドを投与したグループの１匹のマウスは、ワクチン接種とは無関係と考えられる理由で、不十分な回復と生存率の低さのために脾臓細胞分離後に除外された。
（マウス脾臓細胞におけるＥｘ ｖｉｖｏ フルオロスポットアッセイ）
ワクチン特異的脾臓細胞の頻度は、製造者のプロトコルに従って、プレコートプレートを有するＭａｂｔｅｃｈマウスＩＦＮγ／ＩＬ－４ フルオロスポットキットを用いたデュアルサイトカインＩＦＮγ／ＩＬ－４ フルオロスポットアッセイによって決定された。１０％子牛胎児血清（ＦＣＳ、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中の洗浄した脾臓細胞を、ウェル当たり２５０，０００細胞で添加した。抗原刺激には、全２０種のワクチンペプチドのプール、ならびにスパイク（ＳＰＩＫＥ）由来のワクチンペプチド、および膜（ＭＥＭＢＲＡＮＥ）由来のワクチンペプチドが含まれた。ペプチドプールは、１ペプチドあたり０．５μｇ／ｍＬで添加された。ポジティブコントロールとして２ μｇ／ｍＬ コンカナバリンＡ （ＣｏｎＡ； Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で３反復でウェルを刺激し、０．２％ ＤＭＳＯを含む培地で６反復でウェルをバックグラウンド決定のために使用した。ＺｅｌｌＮｅｔ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ， Ｉｎｃ．によって生のスポット数が記録され、結果はヒトフルオロスポットアッセイについて上述したように算出された。
（マウス脾臓細胞におけるフローサイトメトリー）
脾臓細胞は、ウェルあたり３００，０００細胞でプレーティングされ、１ペプチドあたり０．５μｇ／ｍＬの全２０ワクチンペプチドのプールと４μｇ／ｍＬの共刺激抗ＣＤ２８抗体で６時間にわたり３反復で刺激された。３反復のウェルは、ポジティブコントロールとしてＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍＬ）＋イオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）で刺激した。バックグラウンドの測定には、０．２％ＤＭＳＯのみを含む培地、および０．２％ＤＭＳＯと４μｇ／ｍＬの共刺激性抗ＣＤ２８抗体を含む培地で３反復のウェルを処理した。細胞内サイトカインの検出を可能にするため、ブレフェルディンＡ（５ｎｇ／μＬ）および２μＭモネンシンを刺激とともに添加した。
刺激後、死細胞と生細胞を識別するために、固定化生存率染色剤４５０でインキュベートし、以下の表面マーカー抗体パネル：ＣＤ３ｅ－ＡＦ７００（ｃｌｏｎｅ５００Ａ２），ＣＤ４－ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ７５０（ｃｌｏｎｅＧＫ１．５），ＣＤ８ａ－ＦＩＴＣ（ｃｌｏｎｅ５３－６．７），ＣＤ６２Ｌ－ＡＰＣ（ｃｌｏｎｅＭＥＬ－１４）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ），ＣＤ４４－ｅＦＬｕｏｒ５０６（ｃｌｏｎｅＩＭ７）（Ｔｈｅｒｍｏ）で染色した。
細胞内サイトカイン発現を検出するために、細胞を固定し、透過処理し、ＩＦＮ－ＢＶ６０５(ｃｌｏｎｅＸＭＧ１．２），ＩＬ－４－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ｃｌｏｎｅ１１Ｂ１１）およびＩＬ－５－ＰＥ（ｃｌｏｎｅＴＲＦＫ５）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）抗体を用いて免疫染色をした。
フローサイトメトリー測定はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＡｔｔｕｎｅサイトメーターで行い、収集したデータはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０．６．２）を用いて解析した。細胞は、リンパ球／シングレット／ライブイベントでゲーティングされた。回収されたＴｈ１およびＴｈ２細胞は、それぞれ、ＩＦＮγ産生ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞およびＩＬ－４－および／またはＩＬ－５産生ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞として定義された。Ｔｃ１およびＴｃ２細胞は、それぞれＩＦＮγ産生ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞およびＩＬ－４－および／またはＩＬ－５産生ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞として定義された。
＜結果＞
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＴ細胞標的のインシリコ予測）
自然感染時に防御反応を誘導するＴ細胞に認識されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列を同定するため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面抗原であるスパイク（ＳＰＩＫＥ）、膜（ＭＥＭＢＲＡＮＥ）、エンベロープ（ＥＮＶＥＬＯＰＥ）のＴ細胞免疫原性の可能性をイムノインフォマティックツールで解析した。グループとしてこれらの抗原は構造タンパク質であり、抗体の標的となる可能性があり、感染細胞において他の抗原よりも高濃度に産生されると推定された。まず、ＥｐｉＭａｔｒｉｘＴ細胞エピトープマッピングアルゴリズムとＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１株を参照配列としてＣＤ４＋Ｔ細胞の免疫原性ポテンシャルを予測した。
予測は、ヒト集団の９５％以上を占める９つのＨＬＡクラスＩＩと６つのＨＬＡクラスＩのスーパータイプアレルを用いて行われた。各抗原について、複数のスーパータイプアレルにまたがるクラスＩＩ ＨＬＡエピトープ密度の高い領域（クラスターと呼ばれる）を同定した。各々６から６０の結合モチーフを含む合計５２のエピトープクラスターが同定された（表５７）。これらのエピトープクラスターは９つのスーパータイプアレルそれぞれについて１００以上の個々の結合モチーフを含み、ＤＲＢ１＊０３０１の１０９からＤＲＢ１＊０９０１の１８０までであった。
これらのクラスターのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫原性の可能性を評価したところ、複数の推定クラスＩ ＨＬＡエピトープがクラスＩＩ ＨＬＡエピトープ密度の高い領域で重なっていることが示された（表５７）。したがって、これらのエピトープクラスターは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２既往のある個人においてＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の反応を呼び起こすと予想され、Ｔ細胞指向型ワクチンにおいてＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の免疫を刺激すると思われる。また、他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株におけるこれらのクラスターの保存性を調査し、２０２０年１月から９月の間に分離された株の９８．３８％以上に見られるクラスターと同一であることを明らかにした（表５７）。これらのような高度に保存されたペプチドは、ワクチンや、自然感染や免疫のサンプルを使ってＴ細胞応答を調べるアッセイの試薬として有用である。
ＨＬＡクラスＩＩリガンドは、エフェクターあるいは制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激し、多様な免疫学的結果をもたらす可能性がある。ＨＬＡ結合予測は、これらの可能性を区別していない。ＨＬＡ結合予測は、ペプチドとＨＬＡ結合溝との相互作用を考慮し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）との相互作用の可能性を見落としているのである。
Ｔ細胞のレパートリーはヒトＴ細胞エピトープのトレーニングによって形成されるので、我々はＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘアルゴリズムを用いてエピトープのＴＣＲ面を自己抗原との相同性でスクリーニングすることによって、制御性Ｔ細胞誘導の可能性を定期的に評価している。各クラスターについて、ヒトの配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列と同じＨＬＡアレルに結合することを条件として、ＴＣＲ面の位置をすべて固定し、ＨＬＡ面の位置を変化させた場合の、ヒトプロテオームの平均カバー深度を計算した。
ＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘ解析の結果、各ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２タンパク質は、有意なヒト相同性スコア（＞２）を持つクラスターを含んでいることがわかった。これは、選択された５２のクラスターの一部にも当てはまった。１７のクラスター（３２．７％）は、ヒトプロテオームとの高いＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘ相同性に基づき、制御性Ｔ細胞誘導の可能性が高く、対照的に３５のクラスター（６７．３％）はエフェクターＴ細胞応答を誘導する可能性が高いと考えられた。この結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の経過とｉｎ ｖｉｔｒｏでのリコール応答の測定において、異なるＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットがこれらのエピトープによって活性化される可能性を示唆するものであった。
エフェクターエピトープを中心に、ヒトと相同性の高いエピトープを削除するように手作業でクラスターを編集し、合成用ペプチドを３２種類設計した。これらの３２のペプチドを用いて、推定されるエフェクターＴ細胞エピトープのＴ細胞認識を調査した。ペプチドは、１つのエンベロープ配列、８つの膜由来配列、および２３のスパイク由来配列を含んでいる（表３Ａ、表３Ｂ）。スパイクペプチドは、５つのＲＢＤ配列を含むＳ１ドメインに１４配列、そしてＳ２ドメインに９配列を含む。
Figure 2023515387000032
Figure 2023515387000033
［ＴＣＲ面におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と関連コロナウイルスとのエピトープ保存性］
また、選択されたペプチドと、高病原性ＳＡＲＳ－ＣｏＶやＭＥＲＳ－ＣｏＶ、低病原性の感冒性コロナウイルス（ＣＣＣ）ＯＣ４３、ＨＫＵ１、ＮＬ６３、２２９Ｅを含むヒトに感染する関連コロナウイルスとの保存性が検討された。これらのウイルスに過去にさらされたことで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染時やワクチン接種時に呼び出すことのできるＴ細胞記憶が確立されている可能性がある。同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染およびワクチン接種により、これらのウイルスまたはまだ出現していないコロナウイルスに将来感染した際の応答に影響を与えることができるＴ細胞記憶が確立される。交差反応性の可能性のある配列を同定するために、ＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘアルゴリズムを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エピトープのＴＣＲ面を、ヒトに感染するコロナウイルスとの相同性でスクリーニングした（表３Ａおよび表３Ｂ）。膜とエンベロープの配列はすべて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶと同一のＴＣＲ－面パターンを共有していた。スパイククラスターの半分はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に固有であり、残りの半分はＳＡＲＳ－ＣｏＶと保存されている。ＳＡＲＳウイルス以外では３つのクラスターだけが交差保存性されていた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の経験がない人々の既存のＴ細胞免疫に関する報告を考慮し、我々はすべてのＴＣＲ面位置における１００％の同一性の必要条件を緩和した。ＴＣＲ相互作用に広く関与している２つの位置（５位と８位）を固定すると、ＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクおよび膜クラスターの交差保存性状況を拡大することを予測した。ほとんどのスパイククラスターは、これらの基準によって、ヒトに感染するコロナウイルスのサブセットで保存されていた。交差反応性の可能性を持つ残りの配列は、高病原性ベータコロナウイルス間、または高病原性ベータコロナウイルスと低病原性ベータコロナウイルス間で交差保存されている。上記の基準によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に固有のクラスターは３つだけであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ単独で保存されているものはなかった。単一膜クラスターは、ヒトに感染する高病原性β－コロナウイルスとコロナウイルスのサブセットで交差保存性されていた。
大多数の人はＳＡＲＳ－ＣｏＶやＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染していないため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＣＣＣのみの交差保存性性も探った。３２のペプチドのうち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なものは２つだけである。１８クラスター（５６．６％）がＯＣ４３、ＨＫＵ１、ＮＬ６３、２２９Ｅ間で交差保存性されており、１２クラスター（３７．５％）がこれら４つのＣＣＣの少なくとも１つで交差保存性されている。
（クリニカルコホート）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染歴のある人とない人を選び、予測されるＴ細胞エピトープの検証のためにＰＢＭＣサンプルを提供することとした。２０２０年３月から６月にかけてＰＣＲでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が確認されたＣＯＶＩＤ－１９回復者（Ｎ＝１５）を、直近の陽性応答から３０日から１８０日の間に、症状が消失してから最低１４日後に募集した（表５９、表６０）。ドナーは幅広いＣＯＶＩＤ－１９の症状を示し、ＷＨＯの基準に従って軽症または中等症のいずれかを経験した。回復者の採血は、診断から約１カ月から６カ月の間であった。健常者（Ｎ＝１０）は２０１６年２月から２０１９年１１月まで細胞サンプルを提供し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への曝露の機会はなかった。両コホートとも、女性と男性がバランスよく含まれ、平均年齢と年齢幅もほぼ同じである。回復期ドナーの６０％は、人種的・民族的マイノリティの出身である。健常者コホートについては、民族情報は得られていない。
Figure 2023515387000034
Figure 2023515387000035
Figure 2023515387000036
Figure 2023515387000037
［予測されたエピトープがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の自然感染で認識される］
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染で増殖したＴ細胞によって予測されたエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープクラスターが認識されるかを明らかにするために、回復期のドナーから得た全ＰＢＭＣ調製物を用いてｅｘ ｖｉｖｏ ＩＦＮγフルオロスポットアッセイが実施された。個々のペプチドまたはプールされたペプチドを用いて、フルオロスポットアッセイにおける免疫リコールが刺激された。バックグラウンドに対して２５以上のスポット形成細胞がある場合とバックグラウンドの５倍以上である場合の双方の応答を陽性とみなした。
予備的研究では、少数のドナーのコホートを低濃度のペプチドで刺激した（プールされたペプチドあたり０．３１３μｇ／ｍＬ、個々のペプチドによる刺激では１０μｇ／ｍＬ）。この濃度は、アッセイ感度を上げるために高められたが、エピトープ特異的クローンの頻度やドナーあたりのペプチド検出数にアッセイ条件間の有意差がないことがわかったので、ここでは両方のデータセットを統合している。
全体として、ＣＯＶＩＤ－１９回復期ドナーの大部分（９／１５；６０％）が、３２のペプチドのプールに反応したことが分かった（図８Ａ）。対照的に、１０人中１人の健康な対照ドナーのみが、このプールに対して、閾値をわずかに上回る免疫リコールを示した。個々のペプチド刺激は、ＣＯＶＩＤ－１９回復期ドナーが、Ｓ１およびＳ２ドメインおよびＲＢＤにおける応答を含むエンベロープ、膜、およびスパイクペプチドに対して陽性応答を有することを示した（図８Ｄ）。
２１／３２（６６％）のペプチドについて、少なくとも１人の回復期ドナーでリコール応答が観察され、（１／１のエンベロープ由来エピトープ、７／８（８７．５％）の膜由来エピトープ、１３／２３（５６．５％）のスパイク由来エピトープに対応）；１４／３２（４４％）のペプチドは回復期ドナーの少なくとも２０％で確認できた（図８Ｃ）。
ドナーあたり確認されたペプチドの数は、０から１８の範囲であり、回復期のドナーあたり平均４－５のペプチドが反応した（図８Ｂ）。健康なドナーのうち、２人だけがペプチドのいずれかをｅｘ ｖｉｖｏで認識した：全ペプチドプールに応答した前述のドナーは、唯一のエンベロープエピトープ（ペプチド１）及びＳ２由来の配列（ペプチド２５）をリコールし、一方別のドナーはＳ２ドメイン配列（ペプチド２６）に対して応答した。これらの知見は、まれではあるが、感冒コロナウイルス感染歴と交差反応する記憶反応が存在する可能性を示唆している。
エピトープ特異的応答の可変パターンを考慮して、我々はまた、個々のペプチドに対する応答をバッチングすることによって、特定の抗原に対する累積応答を評価した（図９Ａ）。個々のドナーのペプチド分析から予想されるように、膜由来エピトープに特異的なＴ細胞は、１１／１５人のドナーが有意な抗膜応答を示し、膜エピトープ特異的Ｔ細胞は１０／１１人のドナーの総リコール応答の４０％以上を占めて、最も頻繁にリコールされた。また、個々のＳ１由来エピトープに対する反応のばらつきが大きいにもかかわらず、これらのペプチドに対する反応の大きさは、個々のドナーの膜特異的Ｔ細胞応答の大きさと同様であることが分かった。
興味深いことに、各ドナーの累積応答の質によって、コホート内の３つの異なる免疫表現型を識別することができた。これらのコホートは、個人が（１）ロバストなＴ細胞応答を獲得、（２）弱いＴ細胞応答を獲得、または（３）Ｔ細胞応答を獲得しなかったによって定義された。さらに、男性および女性について、応答の点で異なる傾向を同定することができた（図９Ｂ）。
本研究で評価した若年者では、性別に関係なく同様のＴ細胞応答レベルが観察されたが、年齢とともに分岐し、男性のみエフェクターＴ細胞応答が高くなった（Ｒ＝０．７５７、ｐ＝０．０１１、ｎ＝７）。逆に、高齢女性（５０歳以上）は主にＴ細胞活性が低下することが示された。女性の全コホートにおける相関分析では、２つの外れ値（いずれも中等症、酸素補給や入院を必要としない肺炎）のため、またおそらく研究規模が小さいため、有意差は認められなかった（Ｒ＜０．０００１、ｐ＝０．９９３、ｎ＝８）。しかし、これらの外れ値がない場合、軽症の女性コホートでは、エフェクターＴ細胞応答と年齢の間に有意な相関が見られた（Ｒ＝０．７０４、ｐ＝０．０３７、ｎ＝６）。
集約すると、これらの知見は、ＣＯＶＩＤ－１９のほとんどの症例で膜標的Ｔ細胞応答が高い頻度で見られることを明らかにし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン接種において、感染時にこの抗原に対するＴ細胞応答を早め、集中させるためにスパイクを標的とすることの重要性を示している。
［健康なドナーの既存ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫は、抗原特異的細胞増殖後に予測されるエピトープによって刺激される］
回復期のドナーは、集団としては予測されたエピトープの大部分をｅｘ ｖｉｖｏで認識したが、個人としては、より少ないサブセットのエピトープしか認識しなかった。我々は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって誘導されたＴ細胞クローンは、疾患の経過とともに様々な増殖・縮小を繰り返し、結果としてメモリーＴ細胞集団となり、ｅｘ ｖｉｖｏで検出可能または検出不可能なＴ細胞応答の頻度が生じたと仮定した。
低頻度のエピトープ特異的Ｔ細胞を明らかにするために、ＰＢＭＣをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドで刺激し、短期培養で増殖させ、ＩＦＮγ フルオロスポットアッセイで、個々のまたはペプチドプールで再刺激を行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖過程における細胞表現型の変化は、感染に対する自然免疫応答を表すものではないが、ｅｘ ｖｉｖｏで存在するエピトープ特異的Ｔ細胞の増殖および培養フルオロスポットアッセイによるその検出は、免疫原性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔ細胞エピトープのレパートリーを増強し、ｅｘ ｖｉｖｏでのリコールだけから考えられるよりも大きなＴ細胞記憶が生成されていることが示唆されるかもしれない。
上記と同様にＩＦＮγ応答を定義する同じ基準を使用して、１１／１５（７３．３％）の回復期のドナーが３２のペプチドのプールに対して応答を獲得したことが見出された（図１０Ａ）。ｅｘ ｖｉｖｏアッセイと同様に、個々のペプチド刺激は、エンベロープおよび膜ペプチド、ならびにＳ１およびＳ２ドメインおよびＲＢＤをカバーするスパイクペプチドに対して陽性応答を示した（図１０Ｄ）。単一のＳ２由来のエピトープのみがリコールされなかった。回復期のドナーは、０－２７のペプチドを認識し、ドナーあたり平均９－１０のペプチド応答を示した。（図１０Ｂ）。少なくとも１人の回復期ドナーが３１／３２（９６．９％）のペプチドを認識し、ペプチドの大部分（２６／３２；０／１エンベロープエピトープ、６／８膜エピトープ、２０／２３スパイクエピトープを含む）が、我々のコホートの２０％以上において確認された。（図１０Ｃ）。
ｅｘ ｖｉｖｏと培地アッセイ測定間のＩＦＮγ応答の変化は、ソース抗原に関連するペプチド認識のより広いパターンを明らかにする（データは示さず）。例えば、回復期のドナーにおいてエンベロープおよび膜由来抗原に対して同定された応答は、ｅｘ ｖｉｖｏで陽性応答を示したドナーの培養後に再現されることはほとんどなかった。一方、スパイク由来のペプチドに対する応答は、主に培養後に確認されたが、ｅｘ ｖｉｖｏで反応を示したものは、培養後にも陽性応答を維持する可能性が非常に高かった。これらの違いは、自然感染後のエピトープ特異的Ｔ細胞集団の様々な記憶表現型（エフェクター対セントラル）、増殖能、活性化／消耗プロファイルを反映しているのかもしれない。
健康なドナーは、ｅｘ ｖｉｖｏ応答とは対照的に、増殖培養後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔ細胞エピトープに対する強いリコール応答を行った。３２のペプチドのプールに対して、８／１０（８０％）の健康なドナーは、検出可能なＩＦＮγ応答を誘発した（図１０Ａ）。個々のペプチドの再刺激に対して、交差反応性Ｔ細胞応答が、エンベロープ、膜、およびスパイクＳ１、Ｓ２、およびＲＢＤ由来のペプチドに見出された（図１０Ｄ）。平均して、個々のコントロールドナーは、１５のペプチドに応答し、ドナーあたり０－２７の認識されたペプチドの範囲であった（図１０Ｂ）。培養後、３１／３２（９６．９％）のペプチドが、少なくとも１人のコントロールドナーにおいて応答を刺激した。これらのうち、単一のペプチドのみが、健常者コホートの≧２０％において確認されなかった（図１０Ｃ）。３０のペプチドは、１／１エンベロープペプチド、６／８膜ペプチド、および２３／２３スパイクペプチドに対応する。全体として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２既往のないドナーにおける交差反応性Ｔ細胞応答の大きさと有病率は、感冒コロナウイルス感染に対するＴ細胞記憶がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する免疫応答に寄与する可能性を示唆するものである。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドワクチンによる１型免疫の活性化］
これらの予測されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドは、感染で増殖したＴ細胞に認識されることが確認され、ワクチン接種によってｄｅ ｎｏｖｏ免疫応答を引き起こす可能性が示唆された。ペプチドワクチンによってＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞がプライミングされ，感染時にリコールされる（呼び出される）免疫記憶が形成され，体液性および細胞性免疫の防御機構がサポートされる可能性が示唆された．３２種類のペプチドのうち、ＥｐｉＭａｔｒｉｘのスコアが最も高い（２０以上）ペプチドをワクチン接種用に選択した。（１つのペプチドはプールへの溶解性が低いため削除され、第２１ランクのペプチドに置き換えられた）。２０のペプチドは、ペプチドワクチンの臨床試験で使用されている範囲である。ペプチドは、カルボキシメチルセルロース、ポリイノシン酸、ポリ－Ｌ－リジン二本鎖ＲＮＡからなるアジュバント、ポリ－ＩＣＬＣ（ヒルトノール）で製剤化され、ＴＬＲ－３とＭＤＡ－５の自然免疫経路とＴｈ１－偏向ＣＤ４Ｔ細胞応答を刺激した。
ＨＬＡ－ＤＲ３トランスジェニックマウスをプライミングしてペプチドワクチン（ＥＰＶ－ＣｏＶ－１９）でブーストし、野生型マウスでは実現不可能なヒトＭＨＣ制限の中でのｉｎ ｖｉｖｏワクチン免疫原性を評価した。ＭＨＣ－ＩＩノックアウト／ＨＬＡ－ＤＲ３ノックイントランスジェニックマウスにおけるＭＨＣクラスＩＩ介在細胞性免疫は、そのマウスオルトログではなくヒトＭＨＣによって完全に制限され、ヒトＴ細胞によっても認識されるペプチドを提示する。このように、ＨＬＡ－ＤＲ３マウスモデルにおけるワクチン免疫原性は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドのヒトへの応用を支持するものである。マウスは皮内経路で免疫された。ポリＩＣＬＣアジュバントと皮内投与によるペプチドワクチンの臨床試験では、注射部位反応は最小限に抑えられ、免疫に伴う毒性もないと報告されている。
ワクチン接種によって刺激されたタイプ１／タイプ２Ｔ細胞のバランスをサイトカイン産生を測定することによって評価した。ＩＦＮγ産生をタイプ１応答のマーカーとして測定し、ＩＬ－４およびＩＬ－５をタイプ２応答のマーカーとして測定した。ＩＦＮγ／ＩＬ－４デュアルサイトカインフルオロスポットアッセイ（図１１Ａ）において、個々のマウスからの脾細胞を、全てのワクチンペプチドのプール、ならびにワクチン中の膜由来ペプチドまたはスパイク由来ペプチドで刺激した。
すべての低用量および高用量ワクチン接種マウスは、ＳＦＣ（図１１Ｂ）およびＳＩ（図１１Ｃ）基準によって定義されるように、各プールに対してＩＦＮγ応答を行った。各プールに対する応答の大きさは、低用量群と高用量群との間で統計的に差がなかったが、スパイク特異的：膜特異的ＩＦＮγ応答の比率は、高用量ワクチンを受けた動物において有意により高かった。ポリＩＣＬＣのみ、または生理食塩水を投与したコントロールマウスは反応しなかった。両方の陽性基準を満たすＩＬ－４分泌は、免疫化マウスまたは模擬免疫化マウスのいずれにおいても検出されなかった（図１１Ｄ－Ｅ）。ＩＦＮγおよびＩＬ－４応答の比率を、タイプ１／タイプ２Ｔ細胞バランスの指標として使用した。低用量ワクチン群および高用量ワクチン群の両方について、ＩＦＮγ／ＩＬ－４比は、タイプ１に強く偏る（図１１Ｆ）。
Ｔ細胞亜集団におけるサイトカイン産生を評価するために、細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリーを用いて、ＥＰＶ－ＣｏＶ－１９ペプチドに応答する脾臓ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度、平均蛍光強度、および分化状況を測定した。ゲーティングを伴う代表的なフローサイトメトリーデータを、図１２Ａに示す。低用量および高用量の両方での本発明で開示のワクチン接種は、ワクチンペプチドによって特異的にリコールされたＩＦＮγ産生メモリーＴ細胞の数の統計的に有意な増加、ならびに対照マウスと比較して細胞あたり産生されるＩＦＮγの平均量の増加を刺激した（図１２Ｂおよびデータ示さず）。一方、メモリーＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＬ－４およびＩＬ－５産生は、対照よりも、ｉｎ ｖｉｔｒｏでワクチンペプチドによって再刺激され得なかった（図１２Ｃ－Ｄ）。ワクチン接種された動物からのＩＬ－５産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度における最小限の増加を認めるが（データは示さず）、細胞あたりのＩＬ－５産生の同時増加はなく、この応答の大きさはＴｈ１サブセットの誘導と同等であり、したがってこの観察の機能的意義を最小にする。
全体として、低用量および高用量ワクチン群の両方は、Ｔｈ１／Ｔｃ１へ急激に偏るＩＦＮγ／（ＩＬ－４＋ＩＬ－５）比率を示す（図１２Ｅ）。全体として、これらの結果は、ＥＰＶ－ＣｏＶ－１９が、用量非依存的に１型偏向応答を誘発するようにリコールすることができる強いＴ細胞応答を刺激する一方で、呼吸器疾患の増強と関連する著しい２型誘導を決定的に回避することも示している。
実施例７に概説したこれらの同じ実験を利用することにより、本発明で開示のポリペプチド（これらに限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布する１～１２の追加アミノ酸、を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド、ならびに、表２のものを含む本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物）は、用量非依存的に、強力な１型偏向応答を誘発するようにリコールされることが可能な強いＴ細胞応答を刺激する一方で、強い呼吸器疾患と関連する著しい２型誘導を決定的に回避することができるであろうことが、予測される。
［実施例８］
＜全体設計＞
本試験には、適格基準を満たした健康な対象２８名が登録される。参加者は７人ずつ４つのコホートに分けられ、５人が活性ワクチンを、２人が生理食塩水プラセボを受けるようにコホート内の治療が無作為化される。最初の３つのコホートは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）抗体に対する血清反応が陰性で、プラセボまたは１０μｇ／ペプチド（これらに限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布する１～１２の追加アミノ酸、を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド、ならびに、表２のものを含む本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物）（第１コホート）、５０μｇ／ペプチド（第２コホート）、１５０μｇ／ペプチド（第３コホート）のいずれかのワクチンを投与される。第４コホートは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体に対する血清反応が陽性の参加者で構成され、生理食塩水プラセボまたは１０μｇ／ペプチドを含むワクチンの投与を受けることになる。
用量漸増は、１ペプチドあたり１０μｇ、５０μｇ、１５０μｇを皮内投与するよう予定される。本発明で開示のワクチンの開始用量は、１ペプチド（これらに限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布する１～１２の追加アミノ酸、を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド、ならびに、表２のものを含む本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物）あたり１０μｇである（最大２０ペプチドまで）。
最大用量であるペプチドあたり１５０μｇは、Ｏｔｔらが新抗原ペプチドワクチン臨床試験で報告したフェーズ２／３試験で用いられた皮下または筋肉内投与量（ペプチドあたり３００μｇ）より低い用量である。ＦＩＨ試験で提案されたペプチドの総投与量は、合成ペプチドを使用した過去の臨床試験で安全に投与された量を大きく下回ることになる。
各コホートで時差投与が行われる予定である。
１日目、参加者１名に本発明で開示のポリペプチドを含むワクチン、参加者１名に生理食塩水プラセボを投与する。
１日目の投与で十分な安全性と寛容性が確認されれば、残りの対象には少なくとも４８時間後に投与される。
本試験の用量範囲（コホート１からコホート３）のすべての参加者は、最大１４日間（Ｄａｙ－１４からＤａｙ－１）のスクリーニング期間を経て、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の血清抗体が陽性の参加者（コホート４）は最大３０日間（Ｄａｙ－３０からＤａｙ－１）のスクリーニング期間を持つ。試験介入（生理食塩水プラセボおよび本発明で開示のワクチンを含む）は、１日目と１５日目に試験会場ですべての参加者に投与される予定である。
参加者は、臨床安全性データのレビューから特定された安全性の懸念がなければ、各ワクチン接種後６０分の評価終了後、治験責任医師の判断で解放される。すべての参加者は、安全性、寛容性、免疫原性のフォローアップのため、３日目（１回目の接種の２日後）、８日目（１回目の接種の１週間後）、２２日目（２回目の接種の１週間後）、４３日目（２回目の接種の２８日後）および２回目の接種の２、６、１２カ月後に試験施設に戻る。参加者は、２回目接種後３カ月から試験終了時（ＥＯＳ）まで、安全性・有効性フォローアップのために毎月１回、電話連絡を受けるが、訪問が必要な月（Ｍ６およびＭ１２）を除く。治験責任医師の判断により、安全性およびコロナウイルス症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）の症状フォローアップのために予定外の訪問が必要となる場合がある。
各コホートの安全性、寛容性、免疫原性データは、次のコホートへの用量増加の前、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体陽性の参加者を巻き込む前に、安全性モニタリング委員会（ＳＭＣ）によってレビューされる予定である。用量拡大は、前のコホートの最後の参加者の２回目のワクチン接種の１週間の安全性フォローアップが完了し、ＳＭＣによる前のコホートのすべての安全性、寛容性、免疫原性データのレビュー後に本明細書に開示するワクチンが十分に許容される場合にのみ実施される。同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体陽性の参加者のコホートは、用量範囲グループからの最後の参加者の２回目のワクチン接種のための１週間の安全性フォローアップが完了し、ＳＭＣによる前回のコホートのすべての安全性、寛容性および免疫原性データのレビュー後に本明細書に開示するワクチンが十分に許容される場合にのみ治験製品を受けることになる。生物学的分析による免疫原性解析のロジスティックスにより、直近に登録されたコホートの免疫原性データは、そのコホートの安全性レビューには含まれないが、その後のレビューで利用可能であれば含まれる。残りの対象の登録を容易にするため、用量増加の間にもスクリーニングの手順を継続することがある。
［簡単な概要］
本試験の目的は、健康な対象を対象に、本発明で開示される１または複数のポリペプチド（これらに限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布する１～１２の追加アミノ酸、を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド、ならびに、表２のものを含む本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物）を含むＴ細胞エピトープ駆動型ワクチンの安全性、寛容性および免疫原性を生理食塩水プラセボと比較検討することである。試験の詳細は以下の通りである。
試験期間は最長でコホート１－３は１３ヶ月間、コホート４は１３．５ヶ月間であり得る。
治療期間は最大で１５日間であり得る。
訪問頻度は１日目、３日目、８日目から２２日目まで毎週、４３日目、２回目接種後２ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月目であり得る。そして、２回目接種後３ヶ月からＥＯＳまで、現地訪問が必要な月（Ｍ６、Ｍ１２）を除き、毎月電話によるフォローアップを実施する。
［参加者数］
最大２８人の健康な参加者が、試験介入に無作為に割り当てられる。
注：「登録済み」とは、インフォームド・コンセントの手続きとスクリーニングの完了後、参加者またはその法的に認められた代理人が臨床研究に参加することに同意することを意味する。研究への参加資格を決定する目的でスクリーニングを受けたが、研究に参加しない潜在的参加者は、プロトコルで別途規定されていない限り、登録されたとはみなされない。参加者は、スクリーニング後、研究活動に参加する前にインフォームド・コンセントが撤回されない場合、登録されたものとみなされる。
［介入グループと期間］
本試験の用量範囲（コホート１－コホート３）の参加者の試験参加期間は、合計で最大13ヶ月であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２血清抗体が陽性の参加者（コホート４）の参加期間は、最長１３カ月半となる予定である。最長１４日間のスクリーニング期間、７５日間（初回接種から２回目接種後６０日間）の治療・フォローアップ期間、２回目接種後１２カ月間の長期フォローアップ期間となる。
参加者は、研究介入（生理食塩水プラセボ及び本発明で開示のワクチン［ペプチドあたり１０μｇ、５０μｇ及び１５０μｇ、最大２０ペプチドであって、ペプチドは、これらに限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布する１～１２の追加アミノ酸、を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド、ならびに、表２のものを含む本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物］を含むものである）を、１日目及び１５日目に研究者／認定研究員によって研究施設で投与される。
各投与日に、試験介入は、マントゥー法により四肢にそれぞれ４回別々に皮内注射（１回あたり０．５ｍＬ）される。ワクチンは４つのペプチドプール（１プール５ペプチド（これらに限定されないが、例えば、配列番号４－２２４および４５４－４５６のアミノ酸配列（および／またはその断片もしくは変異体）、および、任意選択で、配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端上に任意の比率で分布する１～１２の追加アミノ酸、を含み、またはこれ（ら）のみからなり、または本質的にこれ（ら）からなるペプチドまたはポリペプチド、ならびに、表２のものを含む本明細書に開示されるハイブリッドＩｉ－ｋｅｙ構築物））から構成されているため、各プールは１つの注射部位に注射される。各時の注射部位は、症例報告書（ＣＲＦ）に概略的に記録される。参加者は、臨床安全性データのレビューから安全性の懸念が確認されなければ、各ワクチン接種後６０分の評価終了後、治験責任医師の判断で解放される。
［中止／停止ルール］
各参加者について、ブースター（２回目投与）は、２週間以上持続するグレード２の有害事象（ＡＥ）、グレード３の有害事象、あらゆるグレードの過敏性反応、妊娠検査陽性のいずれかが発生した場合に中止される。
各投与コホートにおいて、２週間以上持続するグレード２の有害事象が２例、グレード３の有害事象が２例、２週間以上持続するグレード２の有害事象が１例とグレード３の有害事象の組み合わせ、またはグレード４の有害事象が１例のいずれかが発生した場合、試験介入を中止する。投与コホートに対する試験介入が停止された場合、同時に試験／研究登録を停止する。
有害事象は、産業へのＦＤＡガイダンスを用いて等級付けされる。予防的ワクチン臨床試験に参加する健康な青年期のボランティアに対する毒性等級スケール（２００７年９月）を参考にしている。
［安全性監視委員会］
本試験では、ＳＭＣが任命されている。ＳＭＣは、治験責任医師（ＰＩ）、メディカルモニター、治験依頼者の医療担当者から構成され、ヒト研究介入の安全性と科学的完全性を監視し、有効性、有害性、無益性による試験の中止について治験依頼者に勧告するために任命される。委員会の構成は、試験のモニタリングに必要な科学的スキルや知識によって決まる。
［研究対象者］
（参加基準）
参加者は、以下の基準のすべてに当てはまる場合のみ、本試験に参加することができる。
１．研究手順の開始に先立ち、書面によるインフォームド・コンセントを提供する能力。
２．計画された試験手順を理解し、遵守することに同意し、すべての試験訪問に応じることができること。
３．プロトコルに従った静脈血の採取に同意する。
４．登録時の年齢が１８歳から５５歳の男性または非妊娠の女性。
５．スクリーニング時のボディマス指数１８～３５ｋｇ／ｍ２（両端の値を含む）。
６．妊娠可能な女性は、各ワクチン接種前２４時間以内に尿または血清の妊娠検査が陰性でなければならない。
７．口腔内の温度が華氏１００．４度（摂氏３８．０度）以下であること。
８．脈拍が１分間に１００回以下であること。
９．収縮期血圧は８５～１５０ｍｍＨｇ。
１０．臨床スクリーニング検査値（白血球［ＷＢＣ］、ヘモグロビン［Ｈｇｂ］、血小板［ＰＬＴ］、アラニントランスアミナーゼ［ＡＬＴ］、アスパラギン酸トランスアミナーゼ［ＡＳＴ］、クレアチニン［Ｃｒ］、アルカリホスファターゼ［ＡＬＰ］、総ビリルビン［ＴＢＬ］、リパーゼ、プロトロンビン時間［ＰＴ］および部分トロンボプラスチン時間［ＰＴＴ］）は使用する検査で許容範囲内にあり、標準的な基準範囲にある。
１１．二次研究のためのサンプル保管に同意している。
１２．参加者は、試験中（本試験以外）に血液または血漿の提供を控えることに同意する必要がある。
１３．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）診断テストが陰性であること。
１４．男女の避妊は、臨床試験に参加する者の避妊方法に関する現地の規制と一致する必要がある。
注：男性および／または女性の登録資格のための性的禁欲の信頼性は、臨床試験の期間および参加者の好ましい通常のライフスタイルとの関連で評価される必要がある。周期的禁欲（例：カレンダー法、排卵法、対症療法、排卵後法）および中絶は許容される避妊法ではない。
ａ．男性参加者
男性参加者は、試験介入期間中および試験介入最終投与後さらに９０日間（造精周期）、このプロトコルの付録４に詳述されているように、効果の高い避妊を行うことに同意し、この間精子の提供を控える必要がある。
ｂ．女性参加者
女性参加者は、妊娠しておらず（付録４参照）、授乳中でなく、以下の条件の少なくとも１つに該当する場合に参加することが可能である。
付録４で定義された妊娠可能な女性（ＷＯＣＢＰ）でないこと、またはＷＯＣＢＰである場合は、試験介入期間中および試験介入最終投与後さらに９０日間、付録４の避妊ガイダンスに従うことに同意すること。
・コホート１～３にのみ適用される追加基準
１５．１日目のリアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）およびＢｉｎａｘＮｏｗ（商標）ＣＯＶＩＤ－１９テストによる鼻咽頭スワブ／喀痰スワブのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査は陰性。
１６．抗体測定法によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する血清ＩｇＧ抗体（力価＜１：８０）陰性（マウントサイナイ医科大学の中央研究所で標準化された測定法による。）
・コホート４のみに適用される追加基準
１７．ＲＴ－ＰＣＲおよびＢｉｎａｘＮｏｗ（商標）ＣＯＶＩＤ－１９テストによる鼻咽頭スワブ／喀痰スワブでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検査は、－３０日目から－１日目まで陰性である。
１８．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する血清ＩｇＧ抗体が陽性であること（力価≧１：８０）。
１９．ＣＯＶＩＤ－１９の既往症に関して、以下の基準のいずれかを満たすこと。
ａ．ＣＯＶＩＤ－１９の症状が出たことはない、または
ｂ．ＣＯＶＩＤ－１９の軽度から中等度の症状を経験し、ワクチン接種の３０日以上前に治癒し、入院を必要としたことがない。
（除外基準）
参加者は、以下の基準のいずれかに該当する場合、本試験から除外される。
１．スクリーニング時または各ワクチン投与直前の妊娠検査で陽性であること。
２．初回接種時から最終接種後６０日までの間に授乳中または授乳予定の女性参加者。
３．治験責任医師または治験分担医師の判断により、治験に参加できない医学的な疾患または状態であること。
注：参加者を許容できない傷害のリスクにさらす、参加者をプロトコールの要件を満たせなくする、または反応の評価や参加者がこの研究を正常に完了することを妨げる可能性のある急性、亜急性、断続的または慢性の医学的疾患または状況を含む。
４．自己申告または医学的に証明された重大な医学的または精神医学的状態があること。
注：重大な医学的または精神医学的状態とは、以下を含むがこれに限定されない。
（１）現在、毎日の投薬を必要とする呼吸器疾患（例：慢性閉塞性肺疾患［ＣＯＰＤ］、喘息）、または過去５年間における呼吸器疾患の増悪（例：喘息増悪）の治療を受けたことがある方。喘息治療薬：吸入、経口、または静脈内コルチコステロイド、ロイコトリエン調節薬、長時間および短時間作用型β作動薬、テオフィリン、イプラトロピウム、生物製剤。
（２）重大な心血管系疾患（例：うっ血性心不全、心筋症、虚血性心疾患）または成人として心筋炎または心膜炎の既往歴があること。
（３）神経学的または神経発達学的疾患（例：過去５年間の片頭痛の既往、てんかん、脳卒中、過去３年間の発作、脳症、局所神経障害、ギランバレー症候群、脳脊髄炎、横紋筋炎など）。
（４）進行中の悪性腫瘍、または最近５年間の悪性腫瘍の診断（皮膚の基底細胞癌と扁平上皮癌を除く）が認められている。
（５）非自己免疫性の原因、限局性、乾癬の既往のない甲状腺機能低下症を含む、自己免疫性疾患。
（６）何らかの原因で免疫不全に陥った場合。
５．各ワクチン接種の前７２時間以内に、発熱（口腔内温度３８．０度以上［華氏１００．４度］）を伴う場合がある、施設のＰＩまたは適切な副研究員が判断した急性疾患がある。
注：急性疾患がほぼ治癒し、軽度の残存症状のみが残っている場合、治験施設ＰＩまたは適切な治験分担医師の意見により、残存症状がプロトコルで要求される安全性パラメータの評価能力を阻害しない場合は、許容される。
６．スクリーニング検査で、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗体、ＨＩＶ１型または２型抗体のいずれかが陽性である。
７．最初のワクチン投与前６０日以内、または５半減期のいずれか長い方の期間内に、何らかの治験薬（治験薬、生物学的製剤、または装置を含む）を含む別の治験研究に参加したことがあること。
８．現在、治験報告期間中（または初回接種から１３ヶ月後）に受ける予定の治験薬（認可または未認可のワクチン、医薬品、生物製剤、デバイス、血液製剤、薬剤を含む）を用いた別の臨床試験に登録中、または参加予定であること。
９．過去に認可または非認可のワクチンに対して過敏症または重度のアレルギー反応（例：アナフィラキシー、全身性蕁麻疹、血管浮腫、その他の重大な反応）を起こしたことがある者。
１０．免疫応答性の低下と関連する可能性のある薬剤を慢性的に使用（連続１４日以上）していること。これには、最初のワクチン投与前の６ヶ月間に、プレドニゾン換算で１０ｍｇ／日を超える全身性コルチコステロイド、アレルギー注射、免疫グロブリン、インターフェロン、免疫調節薬、細胞毒性薬、その他類似または毒性のある薬物が含まれるが、これに限定されるものではない。低用量の外用、眼科用、吸入および経鼻ステロイド製剤の使用は許可される。
１１．最初のワクチン投与前４ヶ月以内、または試験期間中のいずれかの時点で、免疫グロブリンおよび／または血液または血液製剤を投与されたこと。
１２．血液の異常、または重大な凝固障害がある。
１３．初回ワクチン投与前６ヶ月以内に、アルコール乱用またはその他の娯楽用薬物（大麻を除く）の使用歴がある。
１４．注射部位（三角筋／大腿部）の局所反応の観察に支障をきたすような異常や永久的なボディーアート（例：刺青）がある場合。
１５．各ワクチン接種の前後４週間以内に認可された生ワクチンを接種した、または接種する予定がある。
１６．各ワクチン接種の前後２週間以内に認可された不活化ワクチンを接種した、または接種する予定がある。
１７．試験前または試験中に、他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または他の実験的コロナウイルスワクチンの接種を受けたこと。
１８．ＣＯＶＩＤ－１９の予防のための治験薬による治療を現在行っていること。
１９．治験責任医師が承認していない限り、ワクチン接種前７日以内に処方薬または市販薬を現在使用していること。
２０．参加から２回目の接種後２８日までの間に、米国（米国本土、ハワイ、アラスカ）外に旅行する予定があること。
２１．治験用ワクチンの成分に対してアレルギーがある参加者、またはより重篤なアレルギー反応、過去にアレルギーの既往歴がある参加者。
２２．登録後３０日以内にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が陽性となった人と直接接触した場合。
・コホート１～３にのみ適用される追加基準
２３．実験室で確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の既往歴がある人。
２４．初回接種前２週間以内に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に合致する臨床症状（鼻づまりや鼻水、喉の痛み、息切れ、咳、気力や疲労感の低下、筋肉や体の痛み、頭痛、悪寒や戦慄、暑さや発熱、吐き気、吐物、下痢、嗅覚や味覚の低下など、ＦＤＡガイダンスで指定されたもの）があった参加者。
・コーホート４のみに適用される追加基準
参加者は、初回接種前３０日以内に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に合致する臨床症状（鼻づまりや鼻水、喉の痛み、息切れ、咳、気力の低下や疲れ、筋肉や体の痛み、頭痛、悪寒や震え、暑さや発熱、吐き気、吐瀉、嗅覚や味覚の低下などＦＤＡガイダンスに明記されている）を有しており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査の結果が陽性だった。

Claims (97)

  1. 配列番号４－２２４および４５４－４５６、および／またはその断片と変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列、および任意選択で配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末および／またはＣ末に任意の割合で分布する１～１２の追加のアミノ酸、のみからなる、ポリペプチド。
  2. 配列番号４－２２４および４５４－４５６、および／またはその断片と変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列、および任意選択で配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末および／またはＣ末に任意の割合で分布する１～１２の追加のアミノ酸、から本質的になる、ポリペプチド。
  3. 配列番号４－２２４および４５４－４５６、および／またはその断片と変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列、および任意選択で配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末および／またはＣ末に任意の割合で分布する１～１２の追加のアミノ酸、を含む、ポリペプチド。
  4. 請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチドであって、配列番号４－２２４および４５４－４５６からなる群から選択されるアミノ酸配列の前記変異体または断片が、ＭＨＣ結合性およびＴＣＲ特異性を保持し、および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持する、ポリペプチド。
  5. 配列番号４－２２４および４５４－４５６、およびその断片のいずれか１つと、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の相同性を有するアミノ酸配列のみからなるポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＭＨＣ結合性および同じＴＣＲ特異性を保持し、および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持する、ポリペプチド。
  6. 配列番号４－２２４および４５４－４５６、およびその断片のいずれか１つと、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の相同性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＭＨＣ結合性および同じＴＣＲ特異性を保持し、および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持する、ポリペプチド。
  7. 配列番号４－２２４および４５４－４５６、およびその断片のいずれか１つと、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＭＨＣ結合性および同じＴＣＲ特異性を保持し、および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持する、ポリペプチド。
  8. 配列番号２３２－４５２および４５７－４５９、およびその断片または変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  9. 請求項８に記載のポリペプチドであって、配列番号２３２－４５２および４５７－４５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片または変異体が、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持する、ポリペプチド。
  10. 配列番号４－２２４および４５４－４５６、および／またはその断片および変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列、および任意選択で配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末および／またはＣ末に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸、のみからなるポリペプチドをコードする核酸。
  11. 配列番号４－２２４および４５４－４５６、および／またはその断片および変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列、および任意選択で配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末および／またはＣ末に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸、から本質的になるポリペプチドをコードする核酸。
  12. 配列番号４－２２４および４５４－４５６、および／またはその断片および変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列、および任意選択で配列番号４－２２４および４５４－４５６のポリペプチドのＮ末および／またはＣ末に任意の比率で分布する１～１２の追加のアミノ酸、を含むポリペプチドをコードする核酸。
  13. 配列番号２３２－４５２および４５７－４５９、および／またはその断片および変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸。
  14. 配列番号２３２－４５２および４５７－４５９、ならびにその断片または変異体からなる群から選択される配列のみからなる核酸。
  15. 配列番号２３２－４５２および４５７－４５９、ならびにその断片または変異体からなる群から選択される配列から本質的になる核酸。
  16. 配列番号２３２－４５２および４５７－４５９、ならびにその断片または変異体からなる群から選択される配列を含む核酸。
  17. 請求項１０～１２のいずれか一項に記載の核酸であって、配列番号４－２２４および４５４－４５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸の前記断片又は変異体が、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持するポリペプチドをコードする、核酸。
  18. 請求項１３に記載の核酸であって、配列番号２３２－４５２及び４５７－４５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸の前記断片又は変異体が、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持するポリペプチドをコードする、核酸。
  19. 請求項１０～１８のいずれか一項に記載の核酸を含むプラスミド。
  20. 請求項１０～１８のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
  21. 請求項１～９のいずれか一項に記載のポリペプチドと、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
  22. 請求項１０～１８のいずれか一項に記載の核酸と、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
  23. 請求項１９に記載のプラスミドと、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
  24. 請求項２０に記載のベクターと、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
  25. 請求項１～９のいずれか一項に記載のポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、及び／又はアジュバントとを含むワクチン。
  26. 請求項１０～１８のいずれか一項に記載の核酸と、薬学的に許容される賦形剤、担体、及び／又はアジュバントとを含む、ワクチン。
  27. 請求項１９に記載のプラスミドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、および／またはアジュバントとを含む、ワクチン。
  28. 請求項２０に記載のベクターと、薬学的に許容される賦形剤、担体、及び／又はアジュバントとを含む、ワクチン。
  29. それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫を誘導する方法であり、対象に対して治療有効量の請求項１～９のいずれか一項に係るポリペプチドを投与する工程を含む、方法。
  30. それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫を誘導する方法であり、対象に対して治療有効量の請求項１０～１８のいずれか一項に従う核酸を投与する工程を含む、方法。
  31. それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫を誘導する方法であり、対象に、治療有効量の請求項１９に記載のプラスミドを投与する工程を含む、方法。
  32. それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫を誘導する方法であり、対象に、治療有効量の請求項２０に記載のプラスミドベクターを投与する工程を含む、方法。
  33. それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫を誘導する方法であり、対象に、治療有効量の請求項２１～２４のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
  34. それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫を誘導する方法であり、対象に、治療有効量の請求項２５～２８のいずれか一項に記載のワクチン組成物を投与する工程を含む、方法。
  35. 請求項２９～３４のいずれか一項に記載の方法であって、投与工程が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの投与を追加で含み、ここで、ウイルスが弱毒生ウイルスまたは不活化ウイルスである、方法。
  36. それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫応答を誘導する方法であり、対象に、治療有効量の請求項１～９のいずれか一項に記載の１または複数のポリペプチドを投与する工程を含む、方法。
  37. それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に、治療有効量の請求項１０～１８のいずれか一項に従う核酸を投与する工程を含む、方法。
  38. それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫応答を誘導する方法において、対象に、治療有効量の請求項１９に記載のプラスミドを投与する工程を含む、方法。
  39. それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫応答を誘導する方法において、対象に、治療有効量の請求項２０に記載のベクターを投与する工程を含む、方法。
  40. それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫応答を誘導する方法において、対象に、治療有効量の請求項２１～２４のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
  41. それを必要とする対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの近縁ウイルス）および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する関連疾患に対する免疫応答を誘導する方法において、対象に、治療有効量の請求項２５～２８のいずれか一項に記載のワクチン組成物を投与する工程を含む、方法。
  42. 請求項３６～４１のいずれか一項に記載の方法であって、投与工程が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの投与をさらに含み、ここで、該ウイルスが弱毒生ウイルスまたは不活化ウイルスである、方法。
  43. 請求項１～９のいずれか一項に記載のポリペプチドを含み、このポリペプチドが異種ポリペプチドに接合、連結、または挿入されている、キメラまたは融合ポリペプチド。
  44. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又は関連コロナウイルスに対する、対象のＣＭＩ応答を測定するための方法であって、この方法は、前記対象から全血サンプルを採取する工程であって、この全血サンプルは抗原に刺激後免疫エフェクター分子を産生することができる免疫系の細胞を含んでいる採取工程と、前記全血サンプル、および請求項１～９のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリペプチド、および、任意選択で、抗原による刺激を増強するのに有効な量の分離単糖、および、任意選択で、ヘパリンを含む混合物をインキュベートする工程と、免疫エフェクター分子の存在又はレベルの上昇を測定する工程、とを備えており、前記免疫エフェクター分子の存在又はレベルが、前記対象が細胞媒介免疫応答を行う能力を示している、方法。
  45. 請求項４４に記載の方法であって、対象がヒトである、方法。
  46. 請求項４４に記載の方法であって、全血が、請求項１～９のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリペプチドを含むチューブで採取される、方法。
  47. 請求項４４に記載の方法であって、全血がヘパリンを含むチューブで採取される、方法。
  48. 請求項４６に記載の方法であって、チューブがヘパリンを含む、方法。
  49. 請求項４４に記載の方法であって、全血サンプルが、請求項１～９のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリペプチドと共に約５～約５０時間インキュベートされる、方法。
  50. 請求項４４に記載の方法であって、免疫エフェクター分子がサイトカインである、方法。
  51. 請求項５０に記載の方法であって、サイトカインがＩＦＮ－γである、方法。
  52. 請求項５０に記載の方法であって、サイトカインがＧＭ－ＣＳＦである、方法。
  53. 請求項５０に記載の方法であって、サイトカインがインターロイキンである、方法。
  54. 請求項５０に記載の方法であって、サイトカインがＴＮＦ－αである、方法。
  55. 請求項４４または４５に記載の方法であって、対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルスに感染している、方法。
  56. 請求項４４に記載の方法であって、免疫細胞が、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージまたは単球から選択される、方法。
  57. 請求項５６に記載の方法であって、免疫細胞がＴ細胞である、方法。
  58. 請求項４４に記載の方法であって、単糖がデキストロースである、方法。
  59. 請求項４４に記載の方法であって、免疫エフェクターが、それに特異的な抗体で検出される、方法。
  60. 請求項５９に記載の方法であって、免疫エフェクターが、ＥＬＩＳＡを用いて検出される、方法。
  61. 請求項５９に記載の方法であって、免疫エフェクターがＥＬＩＳｐｏｔを用いて検出される、方法。
  62. 対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルス特異的即時エフェクターＴ細胞を同定するためのアッセイであって、（ａ）前記対象からＴ細胞を含むサンプルを用意する工程；（ｂ）請求項１～９のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリペプチドの免疫原性量に前記Ｔ細胞を曝露する工程；および（ｃ）前記サンプル中の新しい即時エフェクターＴ細胞の生成の前に、前記Ｔ細胞からのサイトカインの分泌を測定して、前記ポリペプチドによって前記Ｔ細胞が活性化されているかどうかを決定する工程を備え、前記Ｔ細胞の活性化により、前記対象において、元のサンプル中に存在したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルス－特異的即時エフェクターＴ細胞の存在を同定する、アッセイ。
  63. 請求項６２に記載のアッセイ方法であって、前記Ｔ細胞が末梢血単核細胞である、方法。
  64. 請求項６２に記載のアッセイ方法であって、前記Ｔ細胞の活性化が、前記Ｔ細胞からのインターフェロン－γの分泌を測定することによって決定される、方法。
  65. 請求項６０に記載の方法であって、前記対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルスに感染していること、または感染していたことが知られている、方法。
  66. 請求項６５に記載のアッセイ方法であって、前記感染がモニターされる、方法。
  67. 対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルス特異的即時エフェクターＴ細胞を同定するためのアッセイであって、（ａ）前記対象からＴ細胞を含むサンプルを用意する工程；（ｂ）請求項１～９のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリペプチドの免疫原性量に前記Ｔ細胞を曝露する工程；（ｃ）静止Ｔ細胞の即時エフェクターＴ細胞への分化をもたらすのに十分ではない時間、前記Ｔ細胞をインキュベートする工程；および（ｄ）前記Ｔ細胞からのサイトカインの分泌を測定することによって、前記Ｔ細胞が前記ポリペプチドによって活性化されているかどうかを決定する工程を備え、前記Ｔ細胞の活性化により、前記対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルス特異的即時エフェクターＴ細胞の存在を同定する、アッセイ。
  68. 前記Ｔ細胞が、約３７℃で前記ポリペプチドに曝露される、請求項６２または６７に記載の方法。
  69. 前記インキュベーション時間が４時間から２４時間である、請求項６７に記載の方法。
  70. 前記インキュベーション時間が６時間から１６時間である、請求項６７に記載の方法。
  71. 抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又は関連コロナウイルスＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞の応答を検知するための方法であって、ヒト個体のＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞の集団に、請求項１～９のいずれか一項に記載の１つ又は複数のポリペプチドを接触させる工程であって、１または複数のポリペプチドは、このペプチドを認識するＴ細胞受容体に結合する類似体によって置換されていてもよい接触工程と、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞集団のＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞が前記ペプチド（複数）を認識するかどうかを判定する工程とを含む、方法。
  72. 請求項７１に記載の方法であって、ペプチドパネルが採用され、前記パネルが請求項１～９のいずれか一項に記載の１または複数のポリペプチドを含み、１または複数のペプチドが前記類似体によって置換されてもよい、方法。
  73. 請求項７１に記載の方法であって、使用される任意の類似体が、（ｉ）ポリペプチド全体に対して少なくとも７０％相同、好ましくは少なくとも８０％相同、より好ましくは少なくとも９０％相同であり、および／または（ｉｉ）前記ポリペプチドと比較してＮ末端および／またはＣ末端に１または複数の欠失を有し、および／または（ｉｉｉ）前記ポリペプチドと比較して１または複数の保存的置換を有する、方法。
  74. 請求項７１に記載の方法であって、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞によるポリペプチド（複数可）の認識が、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞からのサイトカインの分泌を測定することによって決定される、方法。
  75. 請求項７４に記載の方法であって、Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ分泌が測定される、方法。
  76. 請求項７５に記載の方法であって、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ分泌が、分泌されたＩＦＮ－γにサイトカインに特異的な固定化抗体を結合させ、次いで抗体／サイトカイン複合体の存在を決定することによって決定される、方法。
  77. 請求項７１に記載の方法であって、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞が、末梢血から新鮮に分離されたｅｘ ｖｉｖｏ細胞である、方法。
  78. 請求項７１に記載の方法であって、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞が、ペプチド（複数可）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで前培養される、方法。
  79. 請求項７１に記載の方法であって、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞の集団が、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又は関連コロナウイルスワクチンが投与された個体からのものである、方法。
  80. 請求項７１に記載の方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される、方法。
  81. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルスによるヒト宿主の感染、またはヒト宿主の曝露を診断する方法であって、（ｉ）宿主からのＴ細胞集団を、請求項１～９のいずれか一項に記載の１または複数のポリペプチドと接触させる工程；及び（ｉｉ）前記Ｔ細胞集団のＴ細胞が前記ポリペプチドに対して認識応答を示すかどうかをｉｎ ｖｉｔｒｏで判定する工程を含む、方法。
  82. 請求項８１に記載の方法であって、Ｔ細胞が新鮮分離されたものである、方法。
  83. 請求項８１に記載の方法であって、Ｔ細胞が血液から分離される、方法。
  84. 請求項８１に記載の方法であって、Ｔ細胞集団が、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、方法。
  85. 請求項８１に記載の方法であって、宿主が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または関連コロナウイルスに曝露された健康なヒトの宿主である、方法。
  86. 請求項１～９のいずれか一項に記載の１または複数のポリペプチドを含むキットであって、１または複数の前記ポリペプチドは、このポリペプチドを認識するＴ細胞受容体と結合する類似体によって置換されていてもよく、任意選択で、ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞による該ポリペプチドの認識を検出する手段も含まれる、キット。
  87. 請求項８６に記載のキットであって、ＩＦＮ－γに対する抗体を含む、キット。
  88. 請求項８６に記載のキットであって、前記抗体が固体支持体上に固定化されており、任意選択で、任意の抗体／ＩＦＮ－γ複合体を検出する手段も含む、キット。
  89. 請求項８６に記載のキットであって、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞によるペプチド（複数可）の認識を検出する手段を含む、キット。
  90. 請求項８８に記載のキットであって、任意の抗体／ＩＦＮ－γ複合体を検出する手段を含む、キット。
  91. ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染による疾患を、それを必要とする対象において、予防、治療、または改善する方法であって、治療有効量の、請求項１～９のいずれか一項に記載の１または複数のポリペプチドを対象に投与する工程を含む、方法。
  92. ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染による疾患を、それを必要とする対象において、予防、治療、または改善する方法であって、治療有効量の、請求項１０～１８のいずれか一項に記載の核酸を対象に投与する工程を含む、方法。
  93. ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染による疾患を、それを必要とする対象において、予防、治療、または改善する方法であって、請求項１９に記載の治療有効量のプラスミドを対象に投与することを含む、方法。
  94. ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染による疾患を、それを必要とする対象において、予防、治療、または改善する方法であって、治療有効量の請求項２０に記載のベクターを対象に投与することを含む、方法。
  95. ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染による疾患を、それを必要とする対象において、予防、治療、または改善する方法であって、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
  96. ＣＯＶＩＤ－１９を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染による疾患を、それを必要とする対象において、予防、治療、または改善する方法であって、請求項２５～２８のいずれか一項に記載のワクチン組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、方法。
  97. 請求項３６～４１のいずれか一項に記載の方法であって、投与の工程が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの投与をさらに含み、ここで、該ウイルスは弱毒生ウイルスまたは不活化ウイルスである、方法。
JP2022548850A 2020-02-14 2021-02-12 Ｃｏｖｉｄ－１９の予防、診断および治療に有用なｔ細胞エピトープクラスターおよび関連組成物 Pending JP2023515387A (ja)

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