EP2032991A1 - Protein-biochip zum differentiellen screenen von protein-protein-wechselwirkungen - Google Patents

Protein-biochip zum differentiellen screenen von protein-protein-wechselwirkungen

Info

Publication number
EP2032991A1
EP2032991A1 EP07785530A EP07785530A EP2032991A1 EP 2032991 A1 EP2032991 A1 EP 2032991A1 EP 07785530 A EP07785530 A EP 07785530A EP 07785530 A EP07785530 A EP 07785530A EP 2032991 A1 EP2032991 A1 EP 2032991A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
native form
native
arrangement
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
EP07785530A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Stefan Müllner
Angelika LÜKING
Verena Trappe
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Protagen GmbH
Original Assignee
Protagen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Protagen GmbH filed Critical Protagen GmbH
Publication of EP2032991A1 publication Critical patent/EP2032991A1/de
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in eptitope analysis

Definitions

  • the present invention relates to an array of protein binders containing at least one protein binder presented in at least one native or natural form and at least one non-native and its use or methods for discriminating or screening different suitable protein binders which are the native or non-native form of protein binders detect.
  • Protein biochips are gaining increasing industrial importance in analytics and diagnostics as well as in pharmaceutical development.
  • expression vectors have sequences for so-called affinity epitopes or proteins, which on the one hand allow the specific detection of the recombinant fusion proteins by means of an antibody directed against the affinity epitope, on the other hand, the specific purification via affinity chromatography (IMAC) allows.
  • affinity epitopes or proteins which on the one hand allow the specific detection of the recombinant fusion proteins by means of an antibody directed against the affinity epitope, on the other hand, the specific purification via affinity chromatography (IMAC) allows.
  • the gene products of a cDNA expression library from human fetal brain tissue in the bacterial expression system in Escherichia coli high-density format were placed on a membrane and bodies were successfully screened with different anti '. It could be shown that the proportion of full-length proteins is at least 66%.
  • the recombinant proteins of this library could be expressed and purified at high throughput (Braun P., Hu, Y., Shen, B., Halleck, A., Koundinya, M., Harlow, J. and La Baer, J.
  • protein-antibody-presenting arrangements are described as protein biochips (LaI et al (2002)
  • Antibody arrays An embryonic but growing technology, DDT, 7, 143-149; Kuznetsov et al. (2003), Antibody microarrays: An evaluation of production parameters, Proteomics, 3, 254-264).
  • specificity of binding of various monoclonal antibodies such as anti-HSP90 ⁇ , anti-GAPDH or anti- ⁇ -tubulin could be analyzed on a protein microarray consisting of 96 human recombinantly expressed proteins by means of protein biochips (Lueking (1999)).
  • recombinant proteins for example, therapeutic proteins usually have specific differences to the physiological or native homologs, be it for example in the folding, in the presence of auxiliary sequences so-called.
  • Tags N- or. C-terminal alterations, post-translational modifications, e.g. Glycosylations, phosphorylations, acylations, alkylations, oxidations, etc., or in the presentation of a binding site leading to changes in the protein-protein interaction (protein to bind to a protein binder).
  • the invention addresses the problem of enabling differential screening of protein binders to distinguish the native form from a non-native form, thereby selecting suitable native and non-native forms.
  • the object is achieved in that an arrangement of protein binders containing at least one protein binder presented in at least one native form and at least one non-native form, the particular form having at least one recognition signal for binding one or more proteins, together with means for detecting the binding success.
  • the binding success allows a statement about the suitability or differentiation of the non-native form compared to the native form of a protein binder.
  • non-native proteins which are subject to, for example, any non-natural purification process or production method (such as a recombinant method) and its homogeneity, bioequivalence, batch uniformity, activity and Function should be determined in comparison to the native form of the protein.
  • Such an inventive arrangement is suitable for differential screening or selection and selection of at least one native or non-native form.
  • the recognition signal is preferably an epitope and / or paratope.
  • the native form of a protein binder is one which corresponds to the protein binder of its function (eg immunoglobulins, therapeutic proteins, structural proteins, membrane proteins, etc.).
  • the original function is ensured by the protein structure in its sequence, conformation or configuration (primary, secondary, tertiary, quaternary structure).
  • the protein binder has an epitope (Paratop), which in its native form can be safely recognized by an antibody or a molecule similar in binding affinity and selectivity (antigen).
  • the native form is one that can be obtained from a living organism (in vivo) or is known.
  • the native form may be an accepted standardized form of a protein, for example, for a particular function. Such a function is not ultimately a diagnostic or physiological function of a protein.
  • the non-native form of a protein binder is one in which, compared to the native protein binder, the function can be changed, even impaired or modified.
  • the original function is not guaranteed by the modified or modified protein structure in its sequence, conformation or configuration or modification.
  • the protein binder has an altered epitope (Paratop), which in its non-native form can not be recognized by an antibody or a binding affinity and selectivity-like molecule (antigen) compared to the native form.
  • a non-native form of a protein binder is one wherein the protein binder has been produced synthetically or recombinantly, or the native protein binder has been physically or chemically denatured, and has differences in particular in conformation and configuration to the native form.
  • the folding of the protein binder in its non-native form is decisive in comparison to the native form.
  • the recognition signal e.g., epitope, paratope
  • the recognition signal for a protein to be bound may be disturbed / abolished or misplaced so that the addressing of the protein to be bound is misdirected.
  • the non-native form is the denatured form of a protein.
  • this denatured form of a protein is compared to the non-denatured form (or: native form). It requires the production of denatured forms for example, denaturants (urea, acids, bases, SDS, guanidine hydrochloride, salt, etc.) or physical denaturation, eg high temperatures, ⁇ -rays, UV-rays, lasers etc.
  • denaturants urea, acids, bases, SDS, guanidine hydrochloride, salt, etc.
  • physical denaturation eg high temperatures, ⁇ -rays, UV-rays, lasers etc.
  • the native form is a non-modified form and the non-native form is a modified form.
  • the modified forms have opposite to the unmodified structural changes, e.g. not final removal of phosphates in phosphorylated proteins, removal of carbohydrates in glycolated
  • Proteins, or removal of lip (o) iden in lip (o) idformaten proteins, or removal of post translational structures in the protein may be to chemically alter the native form chemically (e.g., phosphorylation, glycation, lip (o) idization,
  • the modification may be that the native form (unmodified form) is ligated with another protein to a fusion protein (modified form).
  • the native form (unmodified form) is modified such that the native form is cleaved into fragments. Be it e.g. by enzymatic or chemical or physical cleavage.
  • the native form is, for example, a naturally occurring target or marker, in particular a biomarker, which is suitable for the diagnosis or therapy of diseases in humans and animals and comparatively investigated in comparison with a denatured (non-native) form or modified form should be.
  • denatured or modified forms to be compared can be produced, for example, by a purification process or isolation process.
  • the protein binder is an antigen (epitope) or antibody (paratope), in particular monoclonal or polyclonal antibody. Also preferred are protein binders that contain portions of an antibody, such as Fab or Fc fragments. In addition, Affibody® (Affibody, Sweden) is also included.
  • protein binder in the sense of this invention means that a protein to be bound in the presence of a protein binder contacts it or binds to it or at least interacts with it
  • the protein to be bound is addressed to the protein binder or the protein to be bound recognizes the protein binder or the protein binder has the potential to interact with a protein (eg, antigen (epitope) / antibody (paratope) interaction).
  • Protein binders may be proteins, peptides, modified proteins / peptides, recombinant proteins / peptides, antibodies or a molecule or antigen similar in binding affinity and selectivity, or other proteins which may be represented on a protein biochip according to the invention.
  • Suitable proteins to bind to a protein binder in the context of this invention may not be conclusive: proteins, peptides, modified proteins / peptides, recombinant proteins / peptides, antibodies or antigens, or other proteins, proteids.
  • the proteins to be bound may be in purified form as well as mixed or even in a heterogeneous protein mixture such as a lysate or digest (e.g., microorganism or plant lysates, tissue lysate, mammalian cell lysate). This reflects the quality of the binder in complex mixtures such as those found in immunohistochemistry.
  • a lysate or digest e.g., microorganism or plant lysates, tissue lysate, mammalian cell lysate.
  • the invention relates to such an arrangement of one or more protein binders, wherein a first region has at least one native form of a protein binder and a second region has at least one non-native form of a protein binder Protein Binder and these areas form a unit, which unit is at least one protein to be bound, preferably at the same time under standardized conditions, accessible.
  • the protein binder in the respective form, native or non-native may be represented in different amounts in the first and / or second region.
  • the first and second regions may each comprise a total of protein binders, i. a sufficient number of different protein binders. These may also be in a non-native or native form. At least 96 to 25,000 (numerically) or more of different protein binders are preferred. Preferably, however, more than 2,500, more preferably 10,000 or more protein binders resulting, for example, from an expression library.
  • the invention relates to such an arrangement of protein binders also a diagnostic device or a protein biochip or protein microarray.
  • arrangement synonymously means “array” and insofar as this "array” is used to identify proteins to be bound to protein binders, this is to be understood as an “assay”.
  • the arrangement is designed such that the protein binders represented on the arrangement are in the form of a grid. Further, such arrangements are preferred which allow a high density array of protein binders. Such high density arrangements are disclosed, for example, in WO 99/57311 and WO 99/57312.
  • the protein binders may be fixed in the assembly on a solid support, spotted or immobilized.
  • the protein binders are present as clones.
  • Such clones can be obtained, for example, by means of a cDNA expression library according to the invention (Büssow et al., 1998 (supra)).
  • expression libraries containing clones are obtained by means of expression vectors from an expressing cDNA library. These expression vectors preferably contain inducible
  • Induction of expression may be e.g. by means of an inductor, such as e.g. IPTG.
  • an inductor such as e.g. IPTG.
  • Suitable expression vectors are described in Terpe et al. (Terpe T Appl Microbiol Biotechnol 2003 Jan; 60 (5): 523-33).
  • Expression libraries are known to the person skilled in the art, and these can be prepared according to standard works, such as Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Handbook, 2nd edition (1989), CSH press, CoId Spring Harbor, New York Further preferred are expression libraries which are tissue-specific.
  • expression libraries which can be obtained by exon trapping are also included in the invention, and instead of an expression library it is possible to speak synonymously of an expression library.
  • Uniclone® library protein biochips or corresponding expression libraries which have no redundancy
  • Uniclone® library protein biochips or corresponding expression libraries which have no redundancy
  • WO 99/57311 and WO 99/57312 protein biochips or corresponding expression libraries which have no redundancy
  • These preferred Uniclone libraries have a high content of non-defective, fully expressed proteins of a cDNA expression library.
  • the clones may not be such as transformed bacteria, recombinant phage or transformed cells of mammals, insects, fungi, yeasts or plants.
  • the protein binders in the particular form may be in the form of a fusion protein containing, for example, at least one affinity epitope or "tag".
  • the tag may be one such as c-myc, His-tag, Arg-tag, FLAG, alkaline phosphatase, V5 tag, T7 tag or Strep tag, HAT tag, NusA, S-tag, SBP tag , Thioredoxin, DsbA, a fusion protein, preferably a cellulosic binding domain, green fluorescent protein, maltose binding protein, calmodulin binding protein, glutathione S-transferase or lacZ.
  • solid support includes embodiments such as a filter, a membrane, a magnetic bead, a silicon wafer, glass, metal, a chip, a mass spectrometric target, or a matrix.
  • PVDF polyvinyl styrene
  • nitrocellulose polymethyl methacrylate
  • nylon polymethyl methacrylate
  • this corresponds to a grid having the size of a microtiter plate (96 wells, 384 wells or more), a silicon wafer, a chip, a mass spectrometric target or a matrix.
  • the evaluation is carried out, for example, using commercially available image analysis software (GenePix Pro (Axon Laboratories), Aida (Raytest), ScanArray (Packard Bioscience).
  • Fluorescent labeling, biotinization or radio-isotope labeling in a conventional manner is carried out for example by means of a microarray laser scanner.
  • the invention relates to a method for the differential screening of suitable protein binders in non-native form, wherein the detection of a binding success of a protein to a protein binder in non-native form is sufficient. Corresponding protein binders in non-native form are selected.
  • the invention therefore relates to a method for the differential screening or discrimination of protein binders which have at least one native form and at least one non-native form, the respective form having at least one recognition signal for binding one or more proteins
  • the method according to the invention particularly advantageously allows a discrimination of such protein binders with an epitope, Paratop, whereby a comparative examination of the native form with the non-native form takes place. It is essential here whether the respective sequence of an epitope, paratope is relevant for the protein to be bound or whether non-epitope, non-paratope sequences of the non-native form are relevant.
  • the invention relates to a method for identifying and characterizing protein binders which present at least one native form and at least one non-native form, the respective form having at least one recognition signal for binding one or more proteins, bringing the native form into contact and non-native native form with at least one binding protein and evidence of binding success.
  • a binding success is present with positive detection of the binding protein to a recognition signal of the protein binder.
  • both the native form and the non-native form of the protein binder from the protein to be bound has a binding success.
  • the inventive method is carried out on the basis of the above-described embodiments, in particular arrangements, in particular the native form is a non-modified or non-denatured form and the non-native form to be compared is a denatured or modified form.
  • the methods of the invention allow such non-native forms, which have a binding success to select safely.
  • the methods of the invention are used to screen suitable epitopes / paratopes.
  • the invention also relates to the use of an arrangement according to the invention for the differential screening of suitable protein binders for distinguishing the non-native form from the native form.
  • differential screening allows the selection or discrimination of such protein binders in non-native form, which therefore have no or no homologous function with respect to protein-protein interactions.
  • FIG. 1 shows the differential screening of the protein binder galectin 10 in native form (non-denatured) and non-native form (denatured (denaturing agent: urea)), presented with various antibodies to be bound. Based on the binding curves (signal intensities vs.
  • Diaclone 503.18Hl recognizes the native form of galectin 10 worse than the other antibodies, and the denatured form of galectin 10 better.
  • the antibody MOR Aby491.3 recognizes the native form of galectin 10 best, but the denatured form of galectin 10 is significantly worse than the other antibodies.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Anordnung von Proteinbinder enthaltend mindestens einen Proteinbinder präsentiert in mindestens einer nativen Form und mindestens einer nicht-nativen Form und dessen Verwendung samt Verfahren zur Diskriminierung bzw. differentielles Screenen von geeigneten Proteinbindern in nativer und nicht-nativer Form.

Description

Titel : Protein-Biochip zum differentiellen Screenen von Protein-Protein-Wechselwirkungen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Anordnung von Proteinbindern enthaltend mindestens einen Proteinbinder präsentiert in mindestens einer nativen oder natürlichen Form und mindestens einer nicht-nativen und dessen Verwendung oder Verfahren zur Diskriminierung bzw. differentiellen Screenen von geeigneten Proteinbindern, welche die native oder nicht native Form von Proteinbindern erkennen. Protein-Biochips gewinnen eine zunehmende industrielle Bedeutung in der Analytik und Diagnostik sowie in der Pharmaentwicklung.
Insbesondere konnten mit Hilfe von Protein-Biochips bei der Analyse des Genoms und der Genexpression ein großer Informationsgewinn erzeugt werden. Hierbei wird die schnelle und hochparallele Detektion einer Vielzahl spezifisch bindender Analysemoleküle in einem einzigen Experiment ermöglicht. Zur Herstellung von Protein-Biochips ist es erforderlich, die benötigten Proteine zur Verfügung zu haben. Hierzu haben sich Protein-Expressionsbibliotheken etabliert. Die Hochdurchsatz-Klonierung von definierten offenen Leserahmen ist eine Möglichkeit (Heyman, J.A. , Cornthwaite,
J., Foncerrada, L., Gilmore, J. R., Gontang, E., Hartman, K.J., Hernandez, CL. , Hood, R., HuIl, H.M., Lee, W. Y., Marcil, R., Marsh, E. J., Mudd, K.M., Patino, M. J., Purcell, T. J., Rowland, J. J., Sindici, M. L. and Hoeffler, J. P. (1999) Genome-scale cloning and expression of individual open reading frames using topoisomerase I-mediated ligation. Genome Res, 9, 383-392; Kersten, B., Feilner, T., Krämer, A., Wehrmeyer, S., Possling, A., Witt, I.,1 Zanor, M.I., Stracke, R., Lueking, A., Kreutzberger, J., Lehrach, H. and Cahill, D. J. (2003) Generation of Arabidopsis protein chip for antibody and serum Screening. Plant Molecular Biology, 52, 999-1010; Reboul, J., Vaglio, P., Rual, J. F., Lamesch, P., Martinez, M., Armstrong, CM. , Li, S., Jacotot, L., Bertin, N., Janky, R., Moore, T., Hudson, J. R., Jr., Hartley, J. L., Brasch, M.A., Vandenhaute, J., Boulton, S., Endress, G.A., Jenna, S., Chevet, E.,
Papasotiropoulos, V., Tolias, P.P., Ptacek, J., Snyder, M., Huang, R-, Chance, M.R., Lee, H., Doucette-Stamm, L., Hill, D.E. and Vidal, M. (2003) C. elegans ORFeome Version 1.1: experimental verification of the genome annotation and resource for proteome-scale protein expression. Nat Genet, 34, 35-41.; Walhout, A. J., Temple, G. F., Brasch, M.A., Hartley, J. L., Lorson, M.A. , van den Heuvel, S. and Vidal, M. (2000) GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methode Enzymol, 328, 575-592) . Allerdings hängt ein solcher Ansatz stark mit dem Fortschritt der Genom-Sequenzierungsprojekte und der Annotierung dieser Gensequenzen zusammen. Darüber hinaus ist die Bestimmung der exprimierten Sequenz aufgrund differenzieller Spleißvorgänge nicht immer eindeutig. Dieses Problem kann durch die Anwendung von cDNA-
Expressionsbibliotheken umgangen werden (Büssow, K., Cahill, D., Nietfeld, W., Bancroft, D., Scherzinger, E., Lehrach, H. and Walter, G. (1998) A method for global protein expression and antibody Screening on high-density filters of an arrayed cDNA library. Nucleic Äcids Research, 26, 5007-5008; Büssow, K., Nordhoff, E., Lübbert, C, Lehrach, H. and Walter, G. (2000) A human cDNA library for high-throughput protein expression Screening. Genomics, 65, 1-8; Holz, C, Lueking, A., Bovekamp, L., Gutjahr, C, Bolotina, N., Lehrach, H. and Cahill, D. J. (2001) A human cDNA expression library in yeast enriched for open reading frames. Genome Res, 11, 1730-1735; Lueking, A., Holz, C, Gotthold, C, Lehrach, H. and Cahill, D. (2000) A system for dual protein expression in Pichia pastoris and Escherichia coli, Protein Expr. Purif. , 20, 372- 378) . Hierbei wird die cDNA eines bestimmten Gewebes in einen bakteriellen oder einen Hefe-Expressionsvektor einkloniert. Die für die Expression verwendeten Vektoren zeichnen sich im Allgemeinen dadurch aus, dass sie induzierbare Promotoren tragen, mit denen sich der Zeitpunkt der Proteinexpression steuern lässt. Darüber hinaus weisen Expressionsvektoren Sequenzen für sogenannte Affinitätsepitope oder -proteine auf, die zum einen den spezifischen Nachweis der rekombinanten Fusions-Proteine mittels eines gegen das Affinitätsepitop gerichteten Antikörpers erlauben, zum anderen wird die spezifische Aufreinigung über Affinitätschromatographie (IMAC) ermöglicht.
Beispielsweise wurden die Genprodukte einer cDNA- Expressionsbibliothek aus humanem fötalem Hirngewebe in dem bakteriellen Expressionssystem Escherichia coli im Hochdichte- Format auf einer Membran angeordnet und konnten erfolgreich mit unterschiedlichen Anti'körpern gescreent werden. Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil an Volllänge-Proteinen bei mindestens 66% liegt. Die rekombinanten Proteine dieser Bibliothek konnten darüber hinaus im Hochdurchsatz exprimiert und aufgereinigt werden (Braun P., Hu, Y., Shen, B., Halleck, A., Koundinya, M., Harlow, Ξ. and LaBaer, J. (2002) Proteome- scale purification of human proteins from bacteria. Proc Natl Äcad Sei U S A, 99, 2654-2659; Büssow (2000) supra; Lueking, A., Hörn, M., Eickhoff, H., Büssow, K., Lehrach, H. and Walter, G. (1999) Protein microarrays for gene expression and antibody Screening. Änalytical Biochemistry, 270, 103-111) . Solche Protein-Biochips auf der Basis von cDNA- Expressionsbibliotheken sind insbesondere Gegenstand der WO 99/57311 und WO 99/57312.
Ferner sind als Proteinbiochips Antigen-Antikörper präsentierende Anordnungen beschrieben (LaI et al (2002)
Antibody arrays : An embryonic but rapidly growing technology, DDT, 7, 143-149; Kusnezow et al . (2003), Antibody microarrays: An evaluaution of produetion parameters, Proteomics, 3, 254- 264) . Beispielsweise konnte mittels Proteinbiochips in Einzelmessung die Bindungsspezifität verschiedener monoklonaler Antikörper wie anti-HSP90ß, anti-GAPDH oder anti-α-Tubulin auf einem Protein-Microarray, bestehend aus 96 humanen rekombinant exprimierten Proteinen analysiert werden (Lueking (1999) ) . Zudem konnte die Kreuzreaktivität zweier monoklonaler Antikörper gegen ungefähr 2500 unterschiedliche Proteine untersucht werden (Lueking, A., Possling, A., Huber, 0., Beveridge, A., Hörn, M., Eickhoff, H., Schuchardt, J., Lehrach, H. and Cahill, D. J. (2003) A Nonredundant Human
Protein Chip for Antibody Screening and Serum Profiling. Mol Cell Proteomics, 2, 1342-1349) .
Allerdings besteht ein großes Bedürfnis, zwischen nicht- nativen Formen und nativen Formen von Proteinbindern zu unterscheiden und diese Unterschiede zu identifizieren, die z.B. aufgrund synthetischer / rekombinanter Herstellung oder Isolation / Aufreinigung geänderte Proteinstrukturen erzeugt werden.
Zum Beispiel weisen rekombinante Proteine (beispielsweise therapeutische Proteine) zumeist spezifische Unterschiede zu den physiologischen bzw. nativen Homologen auf, sei es beispielsweise in der Faltung, im Vorhandensein von Hilfssequenzen sog. Tags, N-bzw. C-Terminale Veränderungen, posttranslationaler Modifikationen wie z.B. Glykosylierungen, Phosphorylierungen, Acylierungen, Alkylierungen, Oxidationen etc. oder in der Präsentation einer Bindungsstelle, die zur Veränderungen in der Protein-Protein-Wechselwirkung (zu bindendes Protein an einen Proteinbinder) führen.
Daher betrifft die Erfindung die Aufgabe ein differentielles Screenen von Proteinbindern zur Unterscheidung der nativen Form von einer nicht-nativen Form zu ermöglichen, und dabei geeignete native und nicht-native Formen zu selektionieren.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass eine Anordnung von Proteinbindern enthaltend mindestens einen Proteinbinder präsentiert in mindestens einer nativen Form und mindestens einer nicht-nativen Form bereitgestellt wird, wobei die jeweilige Form mindestens ein Erkennungssignal zur Bindung einer oder mehrerer Proteine aufweist, samt Mittel zum Nachweis des Bindungserfolges.
Der Bindungserfolg erlaubt eine Aussage über die Eignung oder Differenzierung der nicht-nativen Form im Vergleich zur nativen Form eines Proteinbinders.
Besonders vorteilhaft ist die Erfindung zur Qualitätskontrolle und -Überwachung von (nicht-nativen) Proteinen einzusetzen, die beispielsweise einem beliebigen nicht natürlichen (Auf) Reinigungsprozess oder Herstellungsmethode (wie einem rekombinanten Verfahren) unterliegen und dessen Homogenität, Bioäquivalenz, Chargen-Gleichheit, Aktivität und Funktion im Vergleich zur nativen Form des Proteins bestimmt werden soll.
Daher ist eine solche erfindungsgemäße Anordnung zum differentiellen Screenen oder Auswahl und Selektion mindestens einer nativen bzw. nicht-nativen Form geeignet.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Erkennungssignal ein Epitop und / oder Paratop.
Im Rahmen dieser Erfindung ist die native Form eines Proteinbinders eine solche, die dem Proteinbinder seiner Funktion entspricht (z.B. Immunglobuline, therapeutische Proteine, Strukturproteine, Membranproteine, u.v.a.). Hierbei ist die ursprüngliche Funktion durch die Proteinstruktur in ihrer Sequenz, Konformation oder Konfiguration (Primär-, Sekundär-, Tertiär-, Quartärstruktur) gewährleistet. Der Proteinbinder verfügt beispielsweise über ein Epitop (Paratop) , welches in seiner nativen Form sicher von einem Antikörper oder einem in Bindungsaffinität und Selektivität ähnlichem Molekül (Antigen) erkannt werden kann. Insbesondere ist die native Form eine solche, wie sie aus einem lebenden Organismus (in vivo) erhalten werden kann oder bekannt ist. Darüber hinaus kann die native Form eine angenommene standardisierte Form eines Proteins sein, beispielsweise für eine bestimmte Funktion. Eine solche Funktion ist nicht abschließend eine diagnostische oder physiologische Funktion eines Proteins.
Im Rahmen dieser Erfindung ist die nicht-native Form eines Proteinbinders eine solche, wobei im Vergleich zum nativen Proteinbinders die Funktion geändert, gar beeinträchtigt oder modifiziert sein kann. Hierbei ist die ursprüngliche Funktion durch die geänderte oder modifizierte Proteinstruktur in ihrer Sequenz, Konformation oder Konfiguration oder Modifikation nicht gewährleistet. Beispielsweise verfügt der Proteinbinder über ein verändertes Epitop (Paratop) , welches in seiner nicht-nativen Form nicht von einem Antikörper oder einem in Bindungsaffinität und Selektivität ähnlichem Molekül (Antigen) im Vergleich zur nativen Form erkannt werden kann.
Eine nicht-native Form eines Proteinbinders ist insbesondere eine solche, wobei der Proteinbinder synthetisch oder rekombinant hergestellt worden ist oder der native Proteinbinder physykalisch oder chemisch denaturiert wurde, und Unterschiede insbesondere in der Konformation und Konfiguration gegenüber der nativen Form aufweist. Insbesondere ist die Faltung des Proteinbinders in seiner nicht-nativen Form im Vergleich zur nativen Form maßgebend.
Insbesondere bei Änderung der Konformation und Konfiguration eines Proteinbinders, nämlich in nicht-nativer Form, kann das Erkennungssignal (z.B. Epitop, Paratop) für ein zu bindendes Protein gestört/verändert oder ganz aufgehoben sein, so dass die Adressierung des zu bindenden Proteins fehlgeleitet ist.
Daher ist in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung die nicht-native Form die denaturierte Form eines Proteins. Erfindungsgemäß wird diese denaturierte Form eines Proteins im Vergleich zu der nicht-denaturierten Form (oder: native Form) gesetzt. Zur Herstellung denaturierter Formen bedarf es beispielsweise Denaturierungsmittel (Harnstoff, Säuren, Basen, SDS, Guanidin Hydrochlorid, Salz u.v.a.) oder physikalische Denaturierung, z.B. hohe Temperaturen, γ-Strahlen, UV-Strahlen, Laser etc.
In einer weiteren Ausführungsform ist die native Form eine nicht-modifizierte Form und die nicht-native Form eine modifizierte Form. Die modifizierten Formen weisen gegenüber der nicht-modifizierten Strukturänderungen auf, z.B. nicht abschließend Entfernung von Phosphaten bei phosphorylierten Proteinen, Entfernung von Kohlenhydraten bei glykolisierten
Proteinen, oder Entfernung von Lip(o)iden bei lip (o) idisierten Proteine, oder Entfernung der posttranslationellen Strukturen im Protein. Ferner können, die Modifikationen darin bestehen, dass die native Form beliebig chemisch verändert wird (z.B. Phosphorylierung, Glykolisierung, Lip (o) idisierung,
Derivatisierungen) . Ferner kann die Modifikation darin bestehen, dass die native Form (nicht-modifizierte Form) mit einem weiteren Protein zu einem Fusionsprotein (modifizierte Form) ligiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform ist die native Form (nicht- modifizierte Form) , dahingehend modifiziert, dass die native Form in Fragmente gespalten ist. Sei es z.B. durch enzymatische oder chemische oder physikalische Spaltung.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die native Form beispielsweise ein natürlich vorkommendes Target oder Marker, insbesondere ein Biomarker, die zur Diagnose oder Therapie von Krankheiten bei Mensch und Tier geeignet sind und im Vergleich zu einer denaturierten (nicht nativen) Form oder modifizierten Form vergleichend untersucht werden sollen. Solche zu vergleichende denaturierte oder modifizierte Formen können beispielsweise durch ein Aufreinigungsverfahren, Isolationsverfahren entstehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Proteinbinder ein Antigen (Epitop) oder Antikörper (Paratop) , insbesondere monoklonaler oder polyklonaler Antikörper. Ferner sind solche Proteinbinder bevorzugt, die Teile eines Antikörpers enthalten, wie Fab- oder Fc- Fragmente. Darüber hinaus, sind ebenfalls Affibody ® (Affibody, Schweden) umfasst.
Der Begriff „Proteinbinder" im Sinne dieser Erfindung bedeutet, dass ein zu bindendes Protein in Gegenwart eines Proteinbinders diesen kontaktiert oder an diesen bindet oder zumindest in Wechselwirkung tritt. Im weitesten Sinne ist das zu bindende Protein an den Proteinbinder adressiert bzw. das zu bindende Protein erkennt den Proteinbinder bzw. der Protein-Binder hat das Potential mit einem Protein in Wechselwirkung zu treten (z.B. Antigen (Epitop) / Antikörper (Paratop) Wechselwirkung) .
Proteinbinder können Proteine, Peptide, modifizierte Proteine / Peptide, rekombinante Proteine / Peptide, Antikörper oder einem in Bindungsaffinität und Selektivität ähnlichem Molekül oder Antigene sein, oder sonstige Proteine die auf einem erfindungsgemäßen Proteinbiochip repräsentiert werden können.
Geeignete zu bindende Proteine an einen Proteinbinder im Sinne dieser Erfindung können nicht abschließend sein: Proteine, Peptide, modifizierte Proteine / Peptide, rekombinante Proteine / Peptide, Antikörper oder Antigene sein, oder sonstige Proteine, Proteide.
Die zu bindende Proteine können in (auf) gereinigter Form sowie gemischt oder gar in einer heterogenen Proteinmischung, wie ein Lysat oder Aufschluss (z.B. Lysate von Mikroorganismen oder Pflanzen, Gewebelysat, Säugerzellysat) vorliegen. Dies spiegelt die Qualität des Binders in komplexen Gemischen, wie sie beispielsweise in der Immunohistochemie auftreten, wieder.
Insbesondere betrifft die Erfindung eine solche Anordnung von einem oder mehreren Proteinbindern, wobei ein erster Bereich mindestens eine native Form eines Proteinbinders aufweist und ein zweiter Bereich mindestens eine nicht-native Form eines Proteinbinders aufweist und diese Bereiche eine Einheit bilden, wobei diese Einheit mindestens einem zu bindenden Protein, vorzugsweise zeitgleich unter standardisierten Bedingungen, zugänglich ist.
In einer weiteren Ausführungsform kann der Proteinbinder in der jeweiligen Form, nativ oder nicht-nativ, in unterschiedlichen Mengen im ersten und / oder zweiten Bereich repräsentiert sein. Dies erlaubt eine Variation der Sensitivität . Der erste und zweite Bereich kann jeweils eine Gesamtheit von Proteinbindern aufweisen, d.h. eine genügende Zahl an verschiedenen Proteinbindern. Diese können ebenfalls in einer nicht-nativen oder nativen Form vorliegen. Bevorzugt sind mindestens 96 bis 25.000 (numerisch) oder mehr aus verschiedenen Proteinbindern. Bevorzugt jedoch mehr als 2.500, besonders bevorzugt 10.000 oder mehr Proteinbinder, die beispielsweise aus einer Expressionsbibliothek resultieren.
Daher betrifft die Erfindung eine solche Anordnung von Proteinbindern ebenfalls ein diagnostische Vorrichtung oder einen Protein-Biochip bzw. Protein-Microarray. Im Rahmen dieser Erfindung bedeutet „Anordnung" synonym „Array" und sofern dieser „Array" zur Identifizierung von zu bindenden Proteinen an Proteinbindern verwendet wird, ist hierunter ein „Assay" zu verstehen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Anordnung derart gestaltet, dass die auf der Anordnung repräsentierten Protein-Binder in Form eines Gitters vorliegen. Ferner sind solche Anordnungen bevorzugt, die eine hochdichte (high-density) Anordnung von Proteinbindern erlauben. Solche hochdichte Anordnungen sind beispielsweise in der WO 99/57311 und WO 99/57312 offenbart.
Die Proteinbinder können in der Anordnung auf einen festen Träger fixiert, gespottet oder immobilisiert sein.
In einer weiteren Ausführungsform liegen die Proteinbinder als Clone vor. Solche Clone können beispielsweise mittels einer erfindungsgemäßen cDNA-Expressionsbibliothek erhalten werden (Büssow et al . 1998 (supra) ) . In einer bevorzugten Ausführungsform werden solche Expressionsbibliotheken enthaltend Clone mittels Expressionsvektoren aus einer exprimierenden cDNA Bibliothek erhalten. Diese Expressionsvektoren enthalten vorzugsweise induzierbare
Promotoren. Die Induktion der Expression kann z.B. mittels eines Induktors, solche wie z.B. IPTG, erfolgen. Geeignete Expressionsvektoren sind beschrieben in Terpe et al. (Terpe T Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Jan; 60 (5) : 523-33) .
Expressionsbibliotheken sind dem Fachmann bekannt, diese können nach Standardwerken, wie Sambrook et al, "Molecular Cloning, A laboratory handbook, 2nd edition (1989) , CSH press, CoId Spring Harbor, New York hergestellt werden. Weiterhin bevorzugt sind solche Expressionsbibliotheken, die gewebespezifisch sind (z.B. humanes Gewebe, insbesondere humane Organe) . Ferner sind erfindungsgemäß ebenfalls solche Expressionsbibliotheken mit eingeschlossen, die mittels exon- trapping erhalten werden können. Statt Expressionsbibliothek kann synonym von einer Expressionsbank gesprochen werden.
Weiterhin bevorzugt sind Protein-Biochips oder entsprechende Expressionsbibliotheken, die keine Redundanz aufweisen (sogenannte: Uniclone®-Bibliothek) und nach den Lehren der WO 99/57311 und WO 99/57312 beispielsweise hergestellt werden können. Diese bevorzugten Uniclone- Bibliotheken weisen eine hohen Anteil an nicht-fehlerhaften vollständig exprimierten Proteinen einer cDNA-Expressionsbibliothek auf.
Im Rahmen dieser Erfindung können die Clone ebenfalls nicht abschließend solche sein, wie transformierte Bakterien, rekombinante Phagen oder transformierte Zellen von Säugern, Insekten, Pilzen, Hefen oder Pflanzen.
Die Clone werden auf einen festen Träger fixiert, gespottet oder immobilisiert. Zusätzlich können die Proteinbinder in der jeweiligen Form in Form eines Fusionsproteins vorliegen, welches beispielsweise mindestens ein Affinitätsepiptop oder "Tag" enthält. Der Tag kann ein solcher sein wie wie c-myc, His-Tag, Arg-tag, FLAG, alkalische Phosphatase, V5-Tag, T7-Tag oder Strep-Tag, HAT- tag, NusA, S-tag, SBP-tag, Thioredoxin, DsbA, ein Fusionsprotein, vorzugsweise eine Cellulose-bindende Domäne, grünfluoreszierendes Protein, Maltose bindendes Protein, calmodulin-bindendes Protein, Glutathione S-transferase oder lacZ enthalten.
In sämtlichen Ausführungsformen umfasst der Begriff "fester Träger" Ausführungen wie einen Filter, eine Membran, ein magnetisches Kügelchen, ein Silizium-Wafer, Glas, Metall, ein Chip, ein massenspektrometrisches Target oder eine Matrix.
Als Filter ist PVDF, Nitrocellulose oder Nylon bevorzugt (z.B. Hybond N+ Amersham) .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anordnung entspricht diese einem Gitter, dass die Größenordnung einer Mikrotiterplatte (96 Wells, 384 Wells oder mehr) , eines Silizium-Wafers, eines Chips, eines massenspektrometrischen Targets oder einer Matrix besitzt.
Nachdem das zu bindende Protein einen Proteinbinder kontaktiert, erfolgt die Auswertung, die beispielsweise unter Verwendung mit handelsüblicher Image-Analyse Software (GenePix Pro (Axon Laboratories), Aida (Raytest), ScanArray (Packard Bioscience) erfolgt.
Die Visualisierung erfindungsgemäßer Protein-Protein- Wechselwirkungen (z.B. Protein an Proteinbinder, wie Antigen/Antikörper) oder „Mittel zum Nachweis des Bindungserfolges" kann beispielsweise mittels
Fluoresenzmarkierung, Biotiniylierung oder Radio-Isotopen- Markierung in üblicher Weise erfolgen. Eine Auslesung erfolgt z.B. mittels eines Microarray-Laserscanners . Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum differentiellen Screenen von geeigneten Proteinbindern in nicht-nativer Form, wobei der Nachweis eines Bindungserfolges eines Proteins an einen Proteinbinder in nicht-nativer Form hinreichend ist. Entsprechende Proteinbinder in nicht-nativer Form werden selektioniert .
Daher betrifft die Erfindung ein Verfahren zum differentiellen Screenen oder Diskriminierung von Proteinbindern, die mindestens eine native Form und mindestens eine nicht-nativen Form aufweisen bzw. erkennen, wobei die jeweilige Form mindestens ein Erkennungssignal zur Bindung einer oder mehrerer Proteine aufweist, mit
Inkontaktbringen der nativen Form und nicht-nativen Form mit mindestens einem bindenden Protein und Nachweis des Bindungserfolges. Ein Bindungserfolg liegt vor mit positivem Nachweis des bindenden Proteins an ein Erkennungssignal des Proteinbinders. Insbesondere dann, falls sowohl die native Form und die nicht-native Form des Proteinbinders von dem zu bindenden Protein einen Bindungserfolg aufweist. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren besonders vorteilhaft eine Diskriminierung von solchen Proteinbindern mit einem Epitop, Paratop, wobei eine vergleichende Untersuchung der nativen Form mit der nicht nativen Form erfolgt. Hierbei ist es wesentlich, ob die jeweilige Sequenz von einem Epitop, Paratop für das zu bindende Protein relevant ist oder ob Nicht-Epitop, Nicht-Paratop Sequenzen der nicht-nativen Form relevant sind.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren und Charakterisieren von Proteinbindern, die mindestens eine native Form und mindestens eine nicht-native Form präsentieren, wobei die jeweilige Form mindestens ein Erkennungssignal zur Bindung einer oder mehrerer Proteine aufweist, mit Inkontaktbringen der nativen Form und nicht- nativen Form mit mindestens einem bindenden Protein und Nachweis des Bindungserfolges. Ein Bindungserfolg liegt vor mit positivem Nachweis des bindenden Proteins an ein Erkennungssignal des Proteinbinders. Insbesondere dann, falls sowohl die native Form und die nicht-native Form des Proteinbinders von dem zu bindenden Protein einen Bindungserfolg aufweist.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der oben beschriebenen Ausführungsformen, insbesondere Anordnungen, durchgeführt, insbesondere ist die native Form eine nicht- modifizierte oder nicht-denaturierte Form und die zu vergleichende nicht-native Form eine denaturierte oder modifizierte Form.
Die erfindungsgemäßen Verfahren erlauben solche nicht-native Formen, die einen Bindungserfolg aufweisen, sicher zu selektionieren.
Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Verfahren zum Screenen geeigneter Epitope/Paratope eingesetzt.
Daher betrifft die Erfindung ebenfalls die Verwendung einer erfindungsgemäßen Anordnung zum differentiellen Screenen geeigneter Proteinbinder zur Unterscheidung der nicht-nativen Form von der nativen Form.
Das differentielle Screenen erlaubt insbesondere die Selektion oder Diskriminierung solcher Proteinbinder in nicht-nativer Form, die daher eine oder keine homologe Funktion hinsichtlich Protein-Protein-Wechselwirkungen aufweisen . Beispiel und Figuren:
Dieses Beispiel dient ausschließlich zur Erläuterung der Erfindung, ohne die Erfindung auf dieses Beispiel zu begrenzen.
In Figur 1 ist das differentielle Screenen des Proteinbinders Galectin 10 in nativer Form (nicht-denaturiert) und nicht- nativer Form (denaturiert (Denaturierungsmittel: Harnstoff)), mit verschiedenen zu bindenden Antikörper dargestellt. Anhand der Bindungskurven (Signalintensitäten vs .
Konzentrationen/Spot) , kann der Bindungserfolg vergleichend festgestellt werden.
Beispielsweise erkennt Diaclone 503.18Hl die native Form des Galectin 10 im Vergleich zu den anderen Antikörpern schlechter, und die denaturierte Form des Galectin 10 besser.
Der Antikörper MOR Aby491.3 erkennt die native Form des Galectin 10 am besten, jedoch dafür die denaturierte Form des Galectin 10 deutlich schlechter als die anderen Antikörper.

Claims

Patentansprüche
1. Anordnung von Proteinbindern enthaltend mindestens einen Proteinbinder präsentiert in mindestens einer nativen Form und mindestens einer nicht-nativen Form, wobei die jeweilige Form mindestens ein Erkennungssignal zur Bindung einer oder mehrerer Proteine aufweist, samt Mittel zum Nachweis des Bindungserfolges.
2. Anordnung von Proteinbindern nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die native Form eine nicht- modifizierte oder nicht-denaturierte Form ist und die nicht-native Form eine denaturierte oder modifizierte Form ist.
3. Anordnung von Proteinbindern nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die nicht-native Form rekombinant oder synthetisch hergestellt ist.
4. Anordnung von Proteinbindern nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die modifizierte
Form Strukturänderungen gegenüber der nicht- modifizierten Form aufweist oder die modifizierte Form gegenüber der nicht-modifizierten Form chemisch verändert ist.
5. Anordnung von Proteinbindern nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die native Form ein Target oder Marker ist.
6. Anordnung von Proteinbindern nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteinbinder Proteine, Peptide, modifizierte Proteine / Peptide, rekombinante Proteine / Peptide, vorzugsweise Antigen und / oder Antikörper oder ein in Bindungsaffinität und Selektivität ähnlichem Molekül sind.
7. Anordnung von Proteinbindern nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Erkennungssignal ein Epitop oder Paratop ist.
8. Anordnung von Proteinbindern nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Anordnung einen ersten Bereich eines Proteinbinders in nativer Form aufweist und einen zweiten Bereich eines Proteinbinders in nicht-nativer Form aufweist und diese Bereiche eine Einheit bilden, wobei diese Einheit mindestens einem zu bindenden Protein zugänglich ist.
9. Anordnung von Proteinbindern nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der erste und / oder zweite Bereich eine Gesamtheit von mindestens 96 bis 25.000 oder mehr Protein-Binder enthält und in Form eines Gitters angeordnet sind, insbesondere die
Größenordnung einer Mikrotiterplatte, eines Silizium- Wafers, eines Chips, eines massenspektrometrischen Targets oder einer Matrix besitzt.
10. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteinbinder Clone einer cDNA-Expressionsbibliothek sind, insbesondere transformierte Bakterien, rekombinante Phagen oder transformierte Zellen von Säugern, Insekten, Pilzen, Hefen oder Pflanzen.
11. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteinbinder als Fusionsproteine vorliegen, insbesondere ein Affinitätsepitop oder ein Tag solche wie wie c-myc, His-Tag, Arg-tag, FLAG, alkalische Phosphatase, V5-Tag, T7-Tag oder Strep-Tag, HAT-tag, NusA, S-tag, SBP-tag, Thioredoxin, DsbA, ein Fusionsprotein, vorzugsweise eine Cellulose-bindende Domäne, grünfluoreszierendes Protein, Maltose bindendes Protein, calmodulin- bindendes Protein, Glutathione S-transferase oder lacZ enthalten.
12. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die zu bindende Proteine in (auf) gereinigter Form sowie gemischt oder in einer heterogenen Proteinmischung, wie ein Lysat oder Aufschluss vorliegen.
13. Protein-Biochip oder Protein-Microarray bestehend aus einer Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 12.
14. Verwendung einer Anordnung nach einem der Ansprüche 1- 13 zum differentiellen Screenen oder Diskriminierung von Proteinbindern zur Unterscheidung der nativen Form von der nicht-nativen Form.
15. Verfahren zum differentiellen Screenen oder Diskriminierung von Proteinbindern, die mindestens eine native Form und mindestens eine nicht-native Form aufweisen, wobei die jeweilige Form mindestens ein Erkennungssignal zur Bindung einer oder mehrerer Proteine aufweist,
Inkontaktbringen der nativen Form und nicht-nativen Form mit mindestens einem bindenden Protein und Nachweis des Bindungserfolges.
16. Verfahren zum Identifizieren und Charakterisieren von Proteinbindern, die mindestens eine nativen Form und mindestens eine nicht-native Form präsentieren, wobei die jeweilige Form mindestens ein Erkennungssignal zur Bindung einer oder mehrerer Proteine aufweist, Inkontaktbringen der nativen Form und nicht-nativen Form mit mindestens einem bindenden Protein und Nachweis des Bindungserfolges.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei die native Form eine nicht-modifizierte oder nichtdenaturierte Form ist und die nicht-native Form eine denaturierte oder modifizierte Form ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren auf einer Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 durchgeführt wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass nicht-native Formen mit einem Bindungserfolg selektioniert werden.
EP07785530A 2006-06-09 2007-06-11 Protein-biochip zum differentiellen screenen von protein-protein-wechselwirkungen Ceased EP2032991A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102006027259A DE102006027259A1 (de) 2006-06-09 2006-06-09 Protein-Biochip zum differentiellen Screenen von Protein-Protein-Wechselwirkungen
PCT/DE2007/001029 WO2007140768A1 (de) 2006-06-09 2007-06-11 Protein-biochip zum differentiellen screenen von protein-protein-wechselwirkungen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2032991A1 true EP2032991A1 (de) 2009-03-11

Family

ID=38562836

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP07785530A Ceased EP2032991A1 (de) 2006-06-09 2007-06-11 Protein-biochip zum differentiellen screenen von protein-protein-wechselwirkungen

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20100331201A1 (de)
EP (1) EP2032991A1 (de)
DE (1) DE102006027259A1 (de)
WO (1) WO2007140768A1 (de)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2437060A1 (de) * 2010-10-01 2012-04-04 Protagen AG Markersequenzen für Multiple Sklerose und deren Verwendung
SG188698A1 (en) * 2011-09-09 2013-04-30 Albena Samokovlisky Ph D Improved glycosylation assay, glycoanalysis array and an assay system

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR231590A1 (es) * 1981-04-29 1984-12-28 Ciba Geigy Ag Dispositivo de analisis inmunologico y procedimiento para obtenerlo
CA2184195C (en) * 1995-10-25 2002-04-16 Andrew Pakula Screening method for identifying ligands for target proteins
DE10152677A1 (de) * 2001-10-19 2003-05-08 Aventis Behring Gmbh Antikörper zum spezifischen Nachweis von pathogenen Prionen humanen Ursprungs und damit durchgeführten Nachweisverfahren
DE102004056794B4 (de) * 2004-11-24 2010-08-26 Protagen Ag Verwendung einer Anordnung und Verfahren zur Validierung von Bindern

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2007140768A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2007140768A1 (de) 2007-12-13
US20100331201A1 (en) 2010-12-30
DE102006027259A1 (de) 2007-12-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60211651T2 (de) Proteom-analyseverfahren
EP2483690A1 (de) Markersequenzen für pankreaskrebserkrankungen, pankreaskarzinom und deren verwendung
WO2006056438A2 (de) Protein-biochip zur validierung von bindern
WO1997044491A1 (en) Methods of detection utilizing modified bacteriophage
DE102006015001A1 (de) Verfahren zum Nachweis und/oder zur Anreicherung von Analytproteinen und/oder Analytpeptiden aus einer komplexen Proteinmischung
EP1330655B1 (de) Verfahren zur analyse von proteinen
EP2255195A2 (de) Markersequenzen für rheumatoide arthritis und deren verwendung
WO2007140768A1 (de) Protein-biochip zum differentiellen screenen von protein-protein-wechselwirkungen
WO2010000874A2 (de) Markersequenzen für prostataentzündungserkrankungen, prostatakarzinom und deren verwendung
DE69927668T2 (de) Massenfingerabdrucken und seiner verwendung zur identifizierung von protein-affinitätsliganden
EP1147419B1 (de) Nachweis von zellen mittels spezifischer zellwand-bindender domänen (cbd) von zellwand-bindenden proteinen
EP2745115B1 (de) Neues verfahren zur diagnostik von hochaffinen bindern und markersequenzen
DE102008007422A1 (de) Stratifizierung und Therapiesteuerung eines Patienten mittels Proteinbiochips
EP1133697B1 (de) Verfahren zur modifikation und identifikation funktioneller stellen in proteinen
KR20230116497A (ko) 상호작용체 분석용 키트 및 이를 이용한 상호작용체 분석법
DE102007041657A1 (de) Markersequenzen für Multiple Sklerose und deren Verwendung
DE102007028050A1 (de) Hautchip
DE60211714T2 (de) Isolierung membrangebundener ligandenspezifischer komplexe
EP1504267B1 (de) Festphasenassisitierte spektroskopische und spektrometrische analyse komplexer biopolymergemische
DE102010042359A1 (de) Markersequenzen für Multiple Sklerose und deren Verwendung
WO2004019967A1 (en) Method for isolating subpopulations of proteins that engage in protein-protein interactions
US20060275821A1 (en) Method for isolating subpopulations of proteins that engage in protein-protein interactions
DE102005011579B4 (de) Affinitätsmarker zur Proteinreinigung, seine Herstellung und Verwendung sowie Verfahren zur Aufreinigung eines Proteins
DE10220804A1 (de) Festphasenassistierte spektroskopische und spektrometrische Analyse komplexer Biopolymergermische
DE102007041654A1 (de) Markersequenzen für juvenile idiopathische Arthritis und deren Verwendung

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20090109

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL PL PT RO SE SI SK TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL BA HR MK RS

17Q First examination report despatched

Effective date: 20090825

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
REG Reference to a national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: R003

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION HAS BEEN REFUSED

18R Application refused

Effective date: 20121023