EP2018194A2 - Methode de construction de materiaux vivants fonctionnels, materiaux obtenus et applications - Google Patents

Methode de construction de materiaux vivants fonctionnels, materiaux obtenus et applications

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Publication number
EP2018194A2
EP2018194A2 EP07731472A EP07731472A EP2018194A2 EP 2018194 A2 EP2018194 A2 EP 2018194A2 EP 07731472 A EP07731472 A EP 07731472A EP 07731472 A EP07731472 A EP 07731472A EP 2018194 A2 EP2018194 A2 EP 2018194A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cells
layer
cell
matrix
layers
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07731472A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Gero Decher
Olivier Felix
Benjamin Saulnier
Albert Izquierdo
Jean-Claude Voegel
Pierre Gilbert Schaaf
Nadia Jessel
Vincent Paul Ball
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP2018194A2 publication Critical patent/EP2018194A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3843—Connective tissue
    • A61L27/3852—Cartilage, e.g. meniscus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/34—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
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    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3886—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells comprising two or more cell types
    • A61L27/3891—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells comprising two or more cell types as distinct cell layers

Definitions

  • the subject of the invention is a method for constructing functional biomaterials. It also targets biomaterials as obtained by this method and their applications.
  • biomaterial will be used later to designate a 3D object (biohybrid), consisting at least of macromolecules, living cells and other compounds (molecules, particles, vesicles, ...), such as a tissue or a organ, for example, unless otherwise indicated.
  • a cell layer transfer method on a cellular support has also been proposed (2) and applied to the stacking of a few cell layers.
  • this method does not make it possible to control the 2D and 3D structuring of a biomaterial and the individual environment around each cell.
  • the authors propose to deposit viable cells on a surface using a live cell dispenser (cell print) or, preferably, using a jet printer. ink (3) or by a lazer printing (4).
  • a 3D organization is obtained by successive deposition of a support layer formed of a hydrogel, a cell layer and another support layer.
  • the biomaterial obtained does not meet the characteristics required to have a 3D biohybrid as a tissue and a fortiori a functional organ.
  • the use of a hydrogel as an extracellular matrix does not control the 2D and 3D organization of a biomaterial and the individual environment around each cell.
  • LbL abbreviated to Layer by Layer 5-10
  • the object of the invention is therefore to provide a method of constructing functional living biomaterials that provides a solution to the requirements of the art in this field, and that can be used routinely thanks to its easy implementation and low manufacturing cost.
  • the method of construction according to the invention of a functional living artificial biomaterial is characterized by layer-by-layer (3D) assembly of a matrix and layers (2D) of functional living cells by controlling their interactions and structuring. D depending on the desired organization and final shape for the biomaterial (tissue or organ), where each layer has its own pattern adapted to the neighboring layers and to the functionality of the whole artificial biomaterials.
  • the 2D cell layers are more specifically manufactured either in a homogeneous manner (unstructured layers) by dipping, spraying (11) or by a process giving a thin layer of hydrogel (thickness from nanometer to micrometer) during the period of time. immobilization, either heterogeneously (structured layers in particular patterns) by cell-by-cell spotting using a printer or a robotic device.
  • the method according to the invention is characterized in that one deposits, consecutively, on a support, 2D patterns of functional living cells or. strains, elements necessary for their survival, growth and differentiation and an extracellular matrix, with a 2D and 3D structure according to the desired organization and final shape for the biohybrid object (tissue or organ ), where each layer has its own pattern adapted to neighboring layers and to the functionality of whole artificial biomaterials.
  • the elements necessary for its survival are brought locally to each individual cell, such as nutrients, oxygen transport or binding agents, growth factors, cell differentiation factors, antioxidants, cell adhesion promoters, anti-inflammatory agents, antibacterial agents, agents anti-viral agents, angiogenesis factors or inhibitors, immunosuppressive agents, co-factors, vitamins, DNAs, gene transfection agents, or any factor stimulating or blocking cellular, biological or therapeutic activity.
  • the invention thus provides the means of providing each cell the optimal biochemical environment in relation to its needs and its position in the biomaterial being developed.
  • a single layer of cells is deposited. These are cells of the same type or cells of at least two different cell types.
  • consecutive deposition of several alternating layers of polymers and cells of different types is carried out according to the desired architecture.
  • the cells deposited are, for example, cells that form the final surface of the organ (skin), endothelial cells, smooth muscle cells, connective tissue cells, cells forming the blood vessels, cells constituting tissues or of organs and stem cells whose differentiation into functional cells will be induced by differentiating factors.
  • the cells are deposited according to the required pattern taking into account their function.
  • Biohybrids are built with a 2D / 3D structure where each individual cell has a biochemical environment that is optimal for its needs and position in the artificial organ.
  • encapsulated living cells (12-15) are used by a coating of nanometer thickness.
  • Suitable compounds for developing the coating include functional macromolecules suitable for cell coating.
  • Such encapsulation makes it possible, by modifying their surface, to use cells that are normally non-adherent. It also makes it possible to make the cell “invisible” with respect to any recognition, to control the access / exit of molecules or macromolecules to the cell-environment interface (filtration effect, selective filtration) or to limit fibrosis.
  • the construction method defined above also includes the deposition of elements necessary for the survival, growth and differentiation of the cells.
  • Such elements include, in particular, as indicated above, growth factors, anti-inflammatory agents, anti-bacterial agents, differentiation factors or even vascularization promoters.
  • the extracellular matrix As far as the extracellular matrix is concerned, it is constructed either in the LbL direction, from molecules, macromolecules or colloidal compounds (for example hydrogel in the form of nano-particles, vesicles, ...) interacting through interactions. covalent and / or non-covalent, either by gelation of 2 or more compounds, such as, for example, sodium alginate and calcium. During the construction, it is possible to incorporate molecules either in the multilayer matrix or on either side of the nascent hydrogel matrix surface composed for example of calcium alginate.
  • the matrix has a composition adapted to the cell type using polymers with well controlled chemical functions.
  • biotolerant macromolecules or bioinertes where appropriate biodegradable or bioactive.
  • the immobilization of cells on the multilayer matrix or in the nascent hydrogel matrix at the surface is envisaged according to 4 approaches according to the needs (FIGS. 2A to 2D):
  • the first (2A) lies in the layer-by-layer deposition of bare cells (controlled cell adhesion) on a substrate previously modified by a multilayer treatment. Then, it is possible to cover the cells with another multilayer system; the second (2B) involves the layer-by-layer deposition of individually encapsulated cells (4) by polyelectrolyte multilayers on a substrate previously modified by a multilayer treatment;
  • the third (2C) is based on the incorporation of cells into a nascent hydrogel matrix at the surface whose thickness is a function of the thickness of the multilayer reservoir controlling the concentration of one of the compounds necessary for gelation such as for example, calcium, PLL or oligoamines.
  • the calcium alginate matrix is formed by gelling a solution of sodium alginate containing cells in contact with a gelling agent, calcium;
  • the fourth (2D) a variant of the third, also relies on the inclusion of cells in a nascent hydrogel matrix surface composed for example of calcium alginate, but without involvement of a multilayer reservoir.
  • the construction of the calcium alginate matrix is carried out, for example, by simultaneous deposition of a solution of sodium alginate containing the cells and a calcium solution.
  • the emerging nascent hydrogel matrix obtained by spraying, can be deposited between polyelectrolyte multilayers containing active ingredients, such as, for example, growth factors and differentiation factors.
  • active ingredients such as, for example, growth factors and differentiation factors.
  • This cell immobilization approach can also be used in the construction of a biohybrid object involving a patterned structure by deposition of gelling agents using a printer or robotic device.
  • the deposition operation of the various components involved in the construction of the biomaterial is carried out either by dipping or spraying to form an unstructured 2D layer, or by means of a printer (FIG. 3) or a robotic device for constructing a 2D layer structured in particular patterns or unstructured.
  • the spraying technique (9, 10) has the advantage of allowing a fast and homogeneous deposition on the surface and also of constructing matrices completely by modulating the components throughout the construction.
  • Biomaterials as obtained by the method defined above are new products and as such are also covered by the invention.
  • biomaterials are a solution to the acute problem of unmet organ demands for transplants essential for patient survival (total or partial biohybrid). They are also alternatives in cases where organ transplants are unlikely to be successful. Moreover, advantageously, their use makes it possible to suppress high doses immunosuppressants administered to a transplant and that prevent it from recovering a maximum quality of life after transplantation.
  • the structuring of the biomaterials of the invention is similar to that of the actual tissue, they can generally be used for tissue repairs, such as, for example, cartilage reconstruction.
  • tissue repairs such as, for example, cartilage reconstruction.
  • hyaluronic acid key component of the cartilage, is then incorporated into the matrices for osteochondral repair.
  • the matrices used may also include chondrocytes.
  • biomaterials are therefore particularly suitable for biomedical applications and nano biotechnologies, such as interface reactors or thin-film membranes for the bio-fabrication of molecules of interest by living cells, or as an artificial organ, either completely biohybrid, either as a synthetic device coated with a biohybrid layer.
  • FIGS. 1 to 7, illustrate, respectively,
  • FIG. 1 the schematic representation of a 2D / 3D biohybrid completely built layer by layer (IA) and a biohybrid built around an implant or a biomedical device to be implanted (IB);
  • FIG. 2 the schematic representation of the 4 cell immobilization approaches (2A to 2D) used for carrying out the invention
  • FIG. 3 a method of assembling the elements of a biomaterial using an ink jet printer
  • FIG. 4 a schematic representation of a cell layer within a multilayer architecture (4A) and an optical microscope picture of a layer of human erythrocytes incorporated in a multilayer film (4B);
  • FIGS. 5A and 5C a schematic representation of two cellular layers within a multilayer architecture (5A) and two photos in optical microscopy of two layers of human erythrocytes incorporated in a multilayer film (5B and 5C);
  • Fig. 6 a photograph of the HP 690C inkjet printer with an enlargement of the substrate at the printing area;
  • Figure 7 a vertical section of the strategy according to the invention of spray deposition of the various components of the cartilage.
  • Figure 3 illustrates the construction of a biohybrid object using a layer-by-layer 3D deposition using an ink jet printer.
  • the printer head comprises 3 liquid distribution nozzles, for example containing, respectively, living cells, polyanions and polycations.
  • printer heads are used with the number of nozzles required for the different deposits to be made.
  • the liquids containing the desired components are deposited in amounts ranging from picoliters to microliters so as to form successive layers of the constituent elements of the biomaterial and the extracellular matrix.
  • This technique involves, for example, interactions between opposite charges (LbL-electrostatic), other non-covalent interactions (hydrogen bonds for example) and covalent interactions (LbL-covalent) between the materials constituting the layers.
  • the successive deposits are made to control the thickness and the 2D and 3D structure of each layer.
  • hydrogel-type artificial matrix layers of polysaccharides or biodegradable peptides with exponential growth are deposited, which makes it possible to form thick layers of hydrogel character, but of loose structure, while performing only one reduced number of cycles.
  • films with multiple compartments can be made if desired.
  • the erythrocytes were chosen because they are non-functional cells difficult to immobilize. The immobilization of these cells is therefore a real challenge and their ability to cross small vascular structures gives them a perfect adaptation to micro-shear induced by spraying.
  • PDDAC Poly (diallyl dimethyl ammonium chloride) unlike PLL (Poly-L-Lysine) or PAH (Poly (allylamine) hydrochloride) induced the use of this polymer for contact direct with the blood material (layer before and after deposition of unencapsulated erythrocytes in the case of deposition on a surface as well as the encapsulation layer of erythrocytes).
  • the substrates are first cleaned with ethanol and, if appropriate, with acetone and then dried under a stream of nitrogen in order to obtain a clean surface. Then, the slides are activated by consecutive immersion in a HCl / MeOH solution (50/50 v / v) and a concentrated solution of H 2 SO 4 at least for 4 hours for each of them. For these different operations, a Teflon rack made previously at PICS is used which makes it possible to hold 6 lamellae vertically.
  • the polyelectrolyte solutions are prepared at 0.1% (w / v) in Tris buffer (25mM) containing NaCl (0.13 to 0.15M) where the pH was adjusted to 7.3 (+/- 0). 1).
  • the polyelectrolytes that have been used for the construction of the multilayers are: PEI (poly (ethylene imine)), Alginate, PLL, PSS (sodium polystyrene sulfonate), PAH and PDDAC.
  • a sample of human whole blood is centrifuged and rinsed at least once with approximately 12 ml of Tris buffer (see section B).
  • a 30 ⁇ L aliquot of this preparation is taken and diluted qsq in Tris buffer prior to deposition on previously activated surfaces treated with PDDAC-terminated multilayers.
  • the activated lamellae are rinsed with ultrapure water before deposition of the polyelectrolyte layers.
  • the coverslips are immersed for 15 minutes in approximately 15 ml of a polyelectrolyte solution as described in B). They are then rinsed twice in 15 ml of buffer for 2 minutes for each rinsing bath, with manual stirring of the rack for about 1 minute. This process is repeated with an oppositely charged polyelectrolyte solution, the number of times required to achieve the desired construction (see next). * Deposit of a cell layer:
  • the diluted aliquot is removed with the pasteur pipette and deposited on the treated slides (PDDAC-terminated) so that the drop covers the entire surface of the coverslip. After 20 minutes of contact, the coverslip is rinsed in the same manner as for rinsing the polyelectrolyte layers. Alternatively, the deposition of erythrocytes can also be carried out by spraying.
  • the construction of a multilayer always starts with PEI.
  • the next layer contains either directly (PSSZPDDAC) n or after the prior adsorption of (PSS / PAH) n with PAH coupled to FITC (fluorophore) for visualization of fluorescence by confocal microscopy.
  • the layers directly covering the erythrocytes are composed of either (PDDAC / PSS) n or (PDDAC / PSS) n then covered with PAH / PSS with fluorescent PAH for visualization of confocal microscopy recovery or fluorescence.
  • encapsulated erythrocytes (14,15) with PDDAC their incorporation into the multilayer is carried out between two layers of polyanions.
  • the erythrocytes can either be directly deposited on the multilayer (few polyelectrolyte layers are sufficient) or a multilayer hydrogel (exponential growth) can also be built between the two cell layers to ensure a good spatial separation (here, (PLL / Alg) n with n from 8 to 20).
  • Figure 4 shows an optical microscope image of human erythrocytes embedded in a multilayer film (magnification 400).
  • Figures 5B and 5C show two optical microscopy images where 2 layers of human erythrocytes were incorporated within a multilayer. These 2 images differ only in the focus that has been made at the level of each cell layer.
  • each cell is functionalized on its surface by coating LbL with biofunctional macromolecules.
  • active agents such as RGD (tripeptide which facilitates cell adhesion) or ⁇ -MSH (anti-inflammatory agent) are attached to polyelectrolytes such as poly-L-lysine (16-19), which leads to to polymers that can be easily characterized in solution and deposited on different surfaces using the layer-by-layer deposition protocol.
  • Figure 6 shows the HP 690C printer used to print "ICS France" with a polyelectrolyte multilayer on a silicon substrate.
  • PSS and PAH were used at a concentration of 1 mg / mL in Milli-Q aqueous solution. We work without salt.
  • the black ink cartridge the only one that is used, by drilling a hole in the membrane on the upper face of the cartridge. Once emptied, the cartridge is cleaned with tap water until no more ink is poured, no ink inside. Finally, the cartridge is thoroughly rinsed with a Milli-Q water solution and then dried with nitrogen. The polyelectrolyte solutions are introduced with a syringe by the upper face.
  • the printer used an HP 690C model where the black cartridge is disassociated from the color cartridge, allows printing from a single ink cartridge, the black in the case of experimentation.
  • the substrate is glued to the laminated black beam of the printer where the printing will take place.
  • the calibration of the printing area was done from the Canvas software by first printing on a real blank page, then on a tape stuck on the plastic bar.
  • the same drawing (ICS France) is alternately printed with respectively a cartridge containing PSS and a cartridge containing PAH. Since the cartridge does not contain salt, it can be printed without rinsing.
  • the sodium alginate is solubilized at 0.6% (w / v) in Krebs-Ringer-Hepes buffer, composed of 25 mM Hepes, 90 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH 2 PO 4 and 1.2 mM MgSO 4 . 7H2O, whose pH was adjusted to 7.3 with 1M NaOH solution. Then the cells are dispersed in the alginate solution. The suspension thus obtained is sprayed at a pressure of approximately 1.3 atmospheres on a Petri dish previously treated with a multilayer (PLL / Alg) 2 / Ca. Finally, the material containing the cells is rinsed by consecutive immersion in two Hepes buffer baths. Additional deposition of polyelectrolyte layers on the alginate gel can be achieved.
  • the individual encapsulation of the cells is performed by sequentially dispersing the cells in a 0.3% (w / v) solution of alginate in Hepes buffer and in a 0.1% (w / v) solution of PLL in Hepes buffer for 15 minutes. minutes. Between each layer, the suspension is centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes, rinsed with Hepes buffer and centrifuged again.
  • the components of the cartilage matrix are deposited by spraying simultaneously and / or alternately, according to three cell-matrix subunits of different structure and nature, namely:
  • Alginate gels and functionalized films act as a guardian in the process of cellular differentiation and cartilage regeneration, whereas the mixture of collagen and hydroxyapatite facilitates the anchoring of the material. biomaterial in the subchondral bone.
  • FIG. 7 shows, in vertical section, the strategy followed for the sputtering deposition of the various constituents of the cartilage used:
  • a mutilayer film for example the HA / poly-L-lysine system (PLL) as compartment functionalized by growth factors of interest such as BMP-2 and TGF- ⁇ ,
  • an alginate layer containing stem cells at. differentiate into chondrocytes, expressing cartilage-specific HB collagen
  • an alginate layer containing stem cells to be differentiated into chondrocytes, expressing type I and II collagen.
  • the two reagents for forming the calcium alginate gel are CaCl 2 and sodium alginate, which is a natural constiuted polymer of two monosaccharide units, D-mannuronic acid (M) and L-guluronic acid. (BOY WUT).
  • M D-mannuronic acid
  • BOY WUT L-guluronic acid
  • the sodium alginate used comes from the alga Macrocystis pyrifera (Sigma-Aldrich). This sodium alginate has a greater proportion of M blocks and the quotient M / G is about 1.6.
  • the gel is obtained by simultaneous sputtering of a solution of Ca 2+ ions at a concentration of 0.125M and a solution of sodium alginate with a Ca / alginate molar ratio of 1/1. For sputtering cells, the cells are suspended in the sodium alginate solution.
  • the viability of the cells sputtered in the calcium alginate gels was verified by the MTT method and confirmed that the sputtering of the cells in the gels did not result in significant cell death.
  • Decher G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites, Science, 1997, 277, 1232-1237.
  • Multilayer Thin Films Sequential Assembly of Nanocomposite Materials; Decher, G. and Schlenoff, J.B., eds., Wiley-VCH: Weinheim, 2003; 524 pages.
  • Diaspro A. Silvano D., Krol S, Cavalleri O., Gliozzi A., Single living cell encapsulation in nano-organized polyelectrolyte shells, Langmuir, 2002, 18, 5047-5050.
  • Frank Caruso Hollow Capsule Processing Through Colloidal Templating and SeIf-Assembly, Chem. Ew. J, 2000, 6 (3), 413-419.

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Abstract

L'invention a pour objet une méthode de construction d'un biomatériau artificiel vivant fonctionnel, caractérisée par l'assemblage couche par couche (3D) d'une matrice et de couches 2D de cellules vivantes fonctionnelles en contrôlant leurs interactions et la structuration 3D en fonction de l'organisation et de la forme finale souhaitées pour le biomatériau, où chaque couche a son propre motif adapté aux couches voisines et ô la fonctionnalité des biomatériaux artificiels entiers. Application dans le domaine biomédical et en nanobiotechnologie.

Description

« Méthode de construction de matériaux vivants fonctionnels, matériaux obtenus et applications »
L'invention a pour objet une méthode de construction de biomatériaux fonctionnels. Elle vise également les biomatériaux tels qu'obtenus par cette méthode et leurs applications. Le terme « biomatériau » sera utilisé par la suite pour désigner un objet 3D (biohybride), constitué au minimum de macromolécules, de cellules vivantes et d'autres composés (molécules, particules, vésicules, ...), comme un tissu ou un organe par exemple, à moins d'indications contraires.
On sait qu'il existe une forte demande en biomatériaux fonctionnels, pour réparer des tissus détériorés ou détruits suite à des maladies, et en particulier un besoin crucial en organes pour des transplantations.
Diverses approches ont été proposées pour répondre à ces besoins, mais sont loin de permettre une production en routine, même de simples tissus.
L'approche classique utilisée en ingénierie tissulaire consiste à coloniser une matrice poreuse inorganique ou hybride par des cellules (1). Cette technique ne permet pas toutefois de créer des biomatériaux complexes qui dépendent de l'organisation à la fois de nombreuses cellules et de cellules différentes, aucun contrôle ne pouvant être exercé sur la structuration du tissu généré et l'environnement individuel autour de chaque type cellulaire.
Une méthode de transfert de couche cellulaire sur un support cellulaire a également été proposée (2) et appliquée à l'empilement de quelques couches cellulaires. Mais ce procédé ne permet pas de contrôler la structuration 2D et 3D d'un biomatériau et l'environnement individuel autour de chaque cellule.
Dans deux approches plus récentes, les auteurs proposent d'effectuer un dépôt de cellules viables sur une surface à l'aide d'un distributeur de cellules vivantes (cell print) ou de manière préférée à l'aide d'une imprimante à jet d'encre (3) ou par une impression lazer (4). Une organisation 3D est obtenue par dépôt successive d'une couche support formée d'un hydrogel, d'une couche de cellules et d'une autre couche support. Le biomatériau obtenu ne répond toutefois pas aux caractéristiques requises pour disposer d'un biohybride 3D comme un tissu et a fortiori un organe fonctionnel. L'utilisation d'un hydrogel en tant que matrice extracellulaire ne permet pas de contrôler l'organisation 2D et 3D d'un biomatériau et l'environnement individuel autour de chaque cellule.
Les recherches des inventeurs dans ce domaine les ont amené à développer des moyens, en exploitant une technique de dépôt dite couche par couche (LbL en abrégé, pour Layer by Layer) (5-10), afin d'organiser tous les éléments nécessaires pour obtenir un biomatériau fonctionnel vivant, en particulier permettant de construire un tissu ou un organe (biohybride complet), ainsi qu'une structure biohybride, fonctionnels autour d'un implant ou d'un dispositif biomédical à implanter (biohybride partiel) (Figurel).
L'invention a donc pour but de fournir une méthode de construction de biomatériaux vivants fonctionnels apportant une solution aux exigences de la technique dans ce domaine, et exploitable en routine grâce à sa mise en œuvre aisée et à un faible coût de fabrication.
Elle vise également les biomatériaux ainsi obtenus, en tant que produits nouveaux et leurs applications, en particulier biomédicales et en nano-biotechnologies.
La méthode de construction selon l'invention d'un biomatériau artificiel vivant fonctionnel, est caractérisée par l'assemblage couche par couche (3D) d'une matrice et de couches (2D) de cellules vivantes fonctionnelles en contrôlant leurs interactions et la structuration 3 D en fonction de l'organisation et de la forme finale souhaitées pour le biomatériau (tissu ou organe), où chaque couche a son propre motif adapté aux couches voisines et à la fonctionnalité des biomatériaux artificiels entiers..
Les couches de cellules 2D sont plus spécialement fabriquées soit d'une façon homogène (couches non structurées) par trempage, pulvérisation (11) ou par un procédé donnant une couche mince d'hydrogel (épaisseur du nanomètre au micromètre) pendant la période d'immobilisation, soit de façon hétérogène (couches structurées en motifs particuliers) par dépôt cellule par cellule "spotting" à l'aide d'une imprimante ou d'un dispositif robotique.
Plus particulièrement, la méthode selon l'invention est caractérisée en ce qu'on dépose, consécutivement, sur un support, des motifs 2D de cellules vivantes fonctionnelles ou. souches, d'éléments nécessaires à leur survie, à leur croissance et à leur différenciation et d'une matrice extra-cellulaire, avec une structuration 2D et 3D selon l'organisation et la forme finale souhaitées pour l'objet biohybride (tissu ou organe), où chaque couche a son propre motif adapté aux couches voisines et à la fonctionnalité des biomatériaux artificiels entiers.
Ces dispositions permettent de réaliser et de contrôler avec une précision de l'ordre du micromètre (2D) et du nanomètre (3D), une structuration tridimensionnelle fine des différents types de cellules vivantes et de macromolécules, au sein d'un même biomatériau, et de contrôler la composition de la matrice extracellulaire indispensable à la survie des cellules et à leur communication. Lors du dépôt 2D cellule par cellule dans chaque couche et du dépôt 3D consécutif de plusieurs couches monocellulaires et de couches de matrice selon le processus couche par couche, on apporte en effet localement, à chaque cellule individuelle, les éléments nécessaires à sa survie, comme les substances nutritives, les agents de transport ou de fixation de l'oxygène, les facteurs de croissance, les facteurs de différenciation cellulaire, les agents antioxydants, les promoteurs d'adhésion cellulaire, les agents anti-inflammatoires, les agents antibactériens, les agents anti-viraux,les facteurs ou inhibiteurs d'angiogénèse, les agents immunosuppresseurs, les co-facteurs, les vitamines, des ADN, des agents de transfection de gènes, ou tout facteur stimulant ou bloquant l'activité cellulaire, biologique ou thérapeutique.
L'invention fournit ainsi les moyens de procurer à chaque cellule l'environnement biochimique optimal par rapport à ses besoins et à sa position dans le biomatériau en cours d'élaboration.
Selon un mode de mise en œuvre de l'invention, pour la construction plus spécialement d'un biomatériau simple, on procède au dépôt d'une seule couche de cellules. Il s'agit de cellules d'un même type ou de cellules d'au moins deux types cellulaires différents.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, pour la construction d'un biomatériau complexe, on procède au dépôt consécutif de plusieurs couches alternées de polymères et de cellules de types différents selon l'architecture souhaitée.
Les cellules déposées sont par exemple des cellules qui forment la surface finale de l'organe (peau), des cellules endothéliales, des cellules de muscle lisse, des cellules de tissus connectifs, des cellules formant les vaisseaux sanguins, des cellules constitutives de tissus ou d'organes et des cellules souches dont la différenciation en cellules fonctionnelles sera induite par des facteurs de différenciation.
Les cellules sont déposées selon le motif requis compte tenu de leur fonction.
Pour contrôler l'interaction cellule-matrice, on utilise des cellules nues ou individuellement enrobées par des multicouches de polyélectrolytes (12-15) ou des cellules immobilisées lors de la gélification en surface d'une couche mince d'hydrogel (épaisseur du nanomètre au micromètre) composé par exemple d'alginate de calcium. Ces différentes approches d'immobilisation permettent d'assurer la fixation des cellules, soit de façon hétérogène selon des motifs qui sont imposés par le procédé de dépôt et la distance entre les cellules (cellules nues, cellules encapsulées et couche mince d'hydrogel) soit de façon homogène (cellules nues, cellules encapsulées et couche mince d'hydrogel), ainsi que la survie et la fonctionnalité maximales des cellules dans les objets biohybrides. ). Les biohybrides sont construits avec une structure 2D/3D où chaque cellule individuelle possède un environnement biochimique optimal par rapport à ses besoins et sa position dans l'organe artificiel.
Dans une variante de réalisation de l'invention, on utilise des cellules vivantes encapsulées (12-15) par un revêtement d'une épaisseur de l'ordre du nanomètre. Des composés appropriés pour l'élaboration du revêtement comprennent des macromolécules fonctionnelles adaptées à l'enrobage cellulaire. Une telle encapsulation permet, en modifiant leur surface, d'utiliser des cellules qui sont normalement non-adhérentes. Elle permet en outre de rendre la cellule « invisible » par rapport à une reconnaissance quelconque, de contrôler l'accès/sortie des molécules ou macromolécules à l'interface cellule-environnement (effet de filtration, filtration sélective) ou de limiter la fibrose.
La méthode de construction définie ci-dessus comprend également le dépôt d'éléments nécessaires à la survie, à la croissance et à la différenciation des cellules.
De tels éléments comprennent, notamment, comme indiqué ci-dessus des facteurs de croissance, des agents anti-inflammatoires, des agents anti-bactériens, des facteurs de différenciation ou encore des promoteurs de vascularisation.
En ce qui concerne la matrice extra-cellulaire, elle est construite soit dans le sens LbL, à partir de molécules, macromolécules ou de composés colloïdaux (par exemple hydrogel en forme de nano-particules, vésicules, ...) interagissant par des interactions covalentes et/ou non covalentes, soit par gélification de 2 composés ou plus, tels que par exemple l'alginate de sodium et le calcium. Lors de la construction, il est possible d'incorporer des molécules soit dans la matrice multicouche, soit de part et d'autre de la matrice d'hydrogel naissante en surface composée par exemple d'alginate de calcium. La matrice présente une composition adaptée selon le type cellulaire en utilisant des polymères avec des fonctions chimiques bien contrôlées.
De manière avantageuse, elle est principalement composée de macromolécules biotolérantes ou bioinertes, le cas échéant biodégradables ou bioactives.
Lors de la réalisation de l'invention, l'immobilisation de cellules sur la matrice multicouche ou dans la matrice d'hydrogel naissante en surface est envisagée selon 4 approches en fonction des besoins (Figures 2A à 2D) :
- la première (2A) réside dans le dépôt couche par couche de cellules nues (adhésion cellulaire contrôlée) sur un substrat préalablement modifié par un traitement multicouche. Ensuite, il est possible de recouvrir les cellules par un autre système multicouche ; - la seconde (2B) implique le dépôt couche par couche de cellules encapsulées individuellement (4) par des multicouches de polyélectrolytes sur un substrat préalablement modifié par un traitement multicouche ;
- la troisième (2C) est basée sur l'incorporation de cellules dans une matrice d'hydrogel naissante en surface dont l'épaisseur est fonction de l'épaisseur du réservoir multicouche contrôlant la concentration d'un des composés nécessaire à la gélification tel que, par exemple, le calcium, PLL ou des oligoamines. Par exemple, la matrice d'alginate de calcium est formée par gélification d'une solution d'alginate de sodium contenant des cellules au contact d'un gélifiant, le calcium ;
- la quatrième (2D), une variante de la troisième, repose aussi sur l'inclusion de cellules dans une matrice d'hydrogel naissante en surface composée par exemple d'alginate de calcium, mais sans implication d'un réservoir multicouche. La construction de la matrice d'alginate de calcium est réalisée, par exemple, par dépôt simultané d'une solution d'alginate de sodium contenant les cellules et d'une solution de calcium.
La matrice d'hydrogel naissante en surface, obtenue par pulvérisation, peut être déposée entre des multicouches de polyélectrolytes contenant des principes actifs, tels que par exemple des facteurs de croissance et des facteurs de différenciation. Cette approche d'immobilisation des cellules peut également être utilisée dans la construction d'un objet biohybride impliquant une structure en motifs par dépôt d'agents de gélification à l'aide d'une imprimante ou d'un dispositif robotique.
L'opération de dépôt des différents composants impliqués dans la construction du biomatériau est réalisée soit par trempage ou pulvérisation pour former une couche 2D non structurée, soit à l'aide d'une imprimante (Figure 3) ou d'un dispositif robotique pour construire une couche 2D structurée en motifs particuliers ou non structurée. La technique par pulvérisation (9,10) présente l'avantage de permettre un dépôt rapide et homogène sur la surface et également de construire des matrices totalement à façon, en modulant les composants tout au long de la construction.
Les biomatériaux tels qu'obtenus par la méthode définie ci-dessus sont des produits nouveaux et à ce titre sont également visés par l'invention.
Ces biomatériaux constituent une solution au problème aigu de la demande non satisfaite en organes en vue de transplantations essentielles à la survie de patients (biohybride total ou partiel). Ils constituent aussi des solutions de remplacement dans les cas où les transplantations de certains organes ont peu de chances de pouvoir être réalisées avec succès. De plus, de manière avantageuse, leur emploi permet de supprimer les fortes doses d'immunosuppresseurs administrées à un transplanté et qui l'empêchent de récupérer un maximum de qualité de vie après la transplantation.
La structuration des biomatériaux de l'invention se rapprochant de celle du tissu réel, ils sont utilisables, de manière générale, pour les réparations tissulaires, comme par exemple la reconstruction du cartilage. Dans ce cas, l'acide hyaluronique, constituant clé du cartilage, est alors incorporé dans les matrices destinées à la réparation ostéochondrale. A l'image de l'hétérogénéité du tissu hyalin natif, les matrices utilisées peuvent également inclure des chondrocytes.
Ces biomatériaux s'avèrent donc particulièrement appropriés pour des applications biomédicales et en nano biotechnologies, comme réacteurs à l'interface ou membranaires en couche mince pour la bio-fabrication de molécules d'intérêt par des cellules vivantes, ou comme organe artificiel, soit complètement biohybride, soit en tant que dispositif synthétique enrobé par une couche biohybride.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés ci-après dans la description de modes de réalisation, ce qui ne doit nullement être interprété comme une limitation de l'invention à ces caractéristiques.
Dans la description qui suit, il sera fait référence aux figures 1 à 7, qui illustrent, respectivement,
- la figure 1 : la représentation schématique d'un biohybride 2D/3D complètement construit couche par couche (IA) et d'un biohybride construit autour d'un implant ou d'un dispositif biomédical à implanter (IB) ;
- la figure 2 : la représentation schématique des 4 approches (2A à 2D) d'immobilisation de cellules utilisées pour la réalisation de l'invention ;
- la figure 3 : une méthode d'assemblage des éléments d'un biomatériau à l'aide d'une imprimante à jet d'encre ; la figure 4 : une représentation schématique d'une couche cellulaire au sein d'une architecture multicouche (4A) et une photo en microscopie optique d'une couche d'érythrocytes humains incorporés dans un film multicouche (4B);
- les figures 5 A et 5 C : une représentation schématique de deux couches cellulaires au sein d'une architecture multicouche (5A) et deux photos en microscopie optique de 2 couches d'érythrocytes humains incorporés dans un film multicouche (5B et 5C) ; la figure 6 : une photo de l'imprimante jet d'encre HP 690C avec un agrandissement du substrat au niveau de la zone d'impression ; - la figure 7 : une section verticale de la stratégie selon l'invention de dépôt par pulvérisation des différents constituants du cartilage.
Exemple : fabrication d'objets biohvb rides fonctionnels
La figure 3 illustre la construction d'un objet biohybride à l'aide d'un dépôt couche par couche 3D mettant en œuvre une imprimante à jet d'encre. Sur cette représentation schématique, la tête de l'imprimante comprend 3 buses de distribution de liquides, par exemple contenant, respectivement, des cellules vivantes, des polyanions et des polycations. Pour la préparation de biomatériaux complexes, on utilise des têtes d'imprimantes comportant le nombre de buses requis pour les différents dépôts à effectuer. On procède au dépôt des liquides contenant les composants souhaités selon de quantités allant de picolitres à des microlitres de manière à former des couches successives des éléments constitutifs du biomatériau et de la matrice extracellulaire. Cette technique met en jeu par exemple des interactions entre charges opposées (LbL-électrostatique), d'autres interactions non- covalentes (liaisons hydrogènes par exemple) et des interactions covalentes (LbL-covalent) entre les matériaux constituant les couches. Les dépôts successifs sont réalisés de manière à contrôler l'épaisseur et la structuration 2D et 3D de chaque couche.
Pour constituer la matrice artificielle de type hydrogel, on procède au dépôt de couches de polysaccharides ou de peptides biodégradables à croissance exponentielle, ce qui permet de former des couches épaisses de caractère hydrogel, mais de structure lâche, tout en n'effectuant qu'un nombre réduit de cycles.
En combinant des couches à croissance linéaire avec des couches à croissance exponentielle, on peut fabriquer, si on le souhaite, des films comportant plusieurs compartiments.
Protocole de préparation de multicouches contenant des érythrocytes sur du verre :
Les érythrocytes ont été choisis du fait qu'ils s'agissent de cellules non fonctionnelles difficiles à immobiliser. L'immobilisation de ces cellules constitue donc un véritable défi et leur capacité à traverser des structures vasculaires de petite taille leur confère une parfaite adaptation au micro-cisaillement induit par la pulvérisation.
L'absence d'éclatement des érythrocytes en présence de PDDAC (Poly(diallyl diméthyl ammonium chlorure) contrairement à PLL (Poly-L-Lysine) ou PAH (Poly(allylamine) hydrochlorure) a induit l'utilisation de ce polymère pour le contact direct avec le matériel sanguin (couche avant et après dépôt des érythrocytes non encapsulés dans le cas d'un dépôt sur une surface ainsi que la couche d'encapsulation des érythrocytes).
A) Activation de la surface
Les substrats (lamelles de verres circulaires) sont préalablement nettoyés à l'éthanol et le cas échéant à l'acétone puis séchées sous flux d'azote dans le but d'obtenir une surface propre. Ensuite, les lamelles sont activées par immersion consécutive dans une solution HCl/MeOH (50/50 v/v) et une solution concentrée de H2SO4 au moins pendant 4 heures pour chacune d'entre elles. Pour ces différentes opérations, on utilise un portoir en Téflon réalisé précédemment à PICS qui permet de maintenir 6 lamelles verticalement.
B) Préparation des solutions de polyélectrolytes
Les solutions de polyélectrolytes sont préparées à 0,1% (w/v) dans un tampon Tris (25mM) contenant du NaCl (0,13 à 0,15M) où le pH a été ajusté à 7,3 (+/-0,1). Les polyélectrolytes qui ont été utilisés pour la construction des multicouche sont : PEI (poly(éthylène imine)), Alginate, PLL, PSS (poly(styrène sulfonate) de sodium), PAH et PDDAC.
C) Préparation des aliquotes sanguins
Un prélèvement de sang total humain est centrifugé et rincé au moins une fois avec environ 12mL de tampon Tris (voir section B). Un aliquote de 30μL de cette préparation est prélevé et dilué qsp ImL dans du tampon Tris avant dépôt sur les surfaces préalablement activées et traités par des multicouches terminé par PDDAC.
D) Construction du multicouche mixte
Les lamelles activées sont rincées à l'eau ultrapure avant dépôt des couches polyélectrolytes.
*Dépôt d'une couche polyélectrolyte :
Les lamelles sont immergées durant 15min dans environ 15mL d'une solution de polyélectrolyte telle que décrite en B). Elles sont ensuite rincées deux fois dans 15mL de tampon pendant 2min pour chaque bain de rinçage, avec agitation manuelle du portoir pendant environ 1min. Ce procédé est répété avec une solution de polyélectrolyte de charge opposée, ceci le nombre de fois nécessaire pour réaliser la construction désirée (voir suivant). *Dépôt d'une couche cellulaire :
L'aliquote dilué est prélevé à la pipette pasteur et déposé sur les lamelles traitées (terminées PDDAC) de telle sorte que la goutte recouvre toute la surface de la lamelle. Après 20 minutes de contact, la lamelle est rincée de la même manière que pour le rinçage des couches polyélectrolytes. Alternativement, le dépôt d'érythrocytes peut également être réalisé par pulvérisation.
La construction d'une multicouche débute toujours avec PEI. La couche suivante contient soit directement (PSSZPDDAC)n, soit après l'adsorption préalable de (PSS/PAH)n avec PAH couplé à FITC (fluorophore) pour visualisation de la fluorescence par microscopie confocale. Les couches recouvrant directement les érythrocytes sont composées soit de (PDDAC/PSS)n ou (PDDAC/PSS)n ensuite recouverts de PAH/PSS avec PAH fluorescent pour visualisation du recouvrement par microscopie confocale ou de fluorescence. Dans le cas d'érythrocytes encapsulés (14,15) avec le PDDAC, leur incorporation dans la multicouche est réalisée entre 2 couches de polyanions.
Dans le cas où plusieurs couches d'érythrocytes sont déposées. Les érythrocytes peuvent être soit directement déposés sur la multicouche (peu de couches polyélectrolytes suffisent) soit une multicouche à caractère hydrogel (croissance exponentielle) peut également être construite entre les deux couches cellulaires pour assurer une bonne séparation spatiale (ici, (PLL/Alg)n avec n de 8 à 20).
La figure 4 montre une image de microscopie optique d'érythrocytes humains incorporés dans un film multicouche (grossissement de 400).
Les figures 5B et 5 C montrent deux images de microscopie optique où 2 couches d'érythrocytes humains ont été incorporés au sein d'une multicouche. Ces 2 images ne diffèrent que par la mise au point qui a été faite au niveau de chaque couche cellulaire.
Contrôle de l'environnement local:
Pour contrôler l'environnement local de chaque cellule, on fonctionnalise chaque cellule à sa surface par enrobage LbL avec des macromolécules biofonctionnelles.
En variante, on fixe des agents actifs tels que RGD (tripeptide qui facilite l'adhésion cellulaire) ou α-MSH (agent anti-inflammatoire) à des polyélectrolytes tels que la poly-L- lysine (16-19), ce qui conduit à des polymères qui peuvent être aisément caractérisés en solution et déposés sur différentes surfaces en utilisant le protocole de dépôt couche par couche. La figure 6 montre l'imprimante HP 690C utilisée pour imprimer "ICS Strasbourg" avec une multicouche de polyélectrolytes sur un substrat de silicium.
Protocole d'impression d'un film polyéleetrolyte à l'aide d'une imprimante HP 690C :
A*) Préparation des solutions :
PSS et PAH ont été utilisés à la concentration de lmg/mL en solution aqueuse de Milli-Q. On travaille sans sel.
B) Préparation d'une cartouche d'imprimante :
Pour commencer, il faut vider la cartouche d'encre noire, la seule que l'on utilise, en perçant un trou au niveau de la membrane sur la face supérieure de la cartouche. Une fois vidée, la cartouche est nettoyée avec de l'eau du robinet jusqu'à ne plus voir d'encre coulée, ni d'encre à l'intérieur. Enfin, la cartouche est abondamment rincée avec une solution d'eau Milli-Q puis séchée à l'azote. Les solutions de polyélectrolytes sont introduites avec une seringue par la face supérieure.
C) Préparation de l'imprimante :
L'imprimante utilisée, un modèle HP 690C où la cartouche noire est dissociée de la cartouche de couleur, permet d'imprimer à partir d'une seule cartouche d'encre, la noire dans le cas de l'expérimentation.
Le substrat est collé sur la poutre noire plastifiée de l'imprimante où se fera l'impression. . La calibration de la zone d'impression a été réalisée à partir du logiciel Canevas en imprimant d'abord sur une vraie page blanche, puis sur un ruban collé sur la barre plastifiée.
D) Imprimer un film multicouche.
Pour imprimer un film multicouche sur un substrat de silicium, on imprime donc alternativement le même dessin (ICS Strasbourg) avec respectivement une cartouche contenant du PSS et une cartouche contenant du PAH. Comme la cartouche ne contient pas de sel, on peut imprimer sans rinçage.
Remarque : Si l'on désire imprimer à partir de solutions contenant du sel, il faut impérativement rincer la surface après le dépôt de chaque couche car des cristaux de sel sont très rapidement obtenus en surface. Pour cette étape, il faut décoller et recoller le substrat au même endroit. Protocole d'immobilisation de cellules par gélification d'alginate pulvérisé sur une surface riche en calcium.
L'alginate de sodium est solubilisé à 0.6 % (w/v) dans un tampon Krebs-Ringer- Hepes, composé de 25 mM Hepes, 90 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4 and 1.2 mM MgSO4.7H2O, dont le pH a été ajusté à 7.3 avec une solution de NaOH IM. Ensuite, les cellules sont dispersées dans la solution d'alginate. La suspension ainsi obtenue est pulvérisée à une pression approximative de 1.3 atmosphère sur une boîte de Pétri préalablement traitée par une multicouche (PLL/Alg)2/Ca. Finalement, le matériau contenant les cellules est rincé par immersion consécutive dans deux bains de tampon Hepes. Le dépôt additionnel de couches de polyélectrolytes sur le gel d'alginate peut être réalisé.
Protocole d'encapsulation de cellules avec des polyélectrolytes
L'encapsulation individuelle des cellules est réalisée par dispersion successive des cellules dans une solution à 0.3% (w/v) d'alginate dans du tampon Hepes et dans une solution 0.1% (w/v) de PLL dans du tampon Hepes pendant 15 minutes. Entre chaque couche, la suspension est centrifugée à 2000 tpm pendant 5 minutes, rincée avec du tampon Hepes et centrifugée à nouveau.
Reconstruction tridimensionnelle du cartilage par pulvérisation séquentielle de cellules et des constituants matriciels
Les composants de la matrice du cartilage sont déposés par pulvérisation simultanément et/ou de manière alternée, selon trois sous- unités cellules-matrice de structure et de nature différentes à savoir :
(i) un film de (acide hyaluronique (HA)/PLL) comme compartiment actif,
(ii) un gel d'alginate de calcium contenant les cellules,
(iii) un mélange de collagène et d'hydroxyapatite .
Les gels d'alginate et les films fonctionnalisés, par exemple par des facteurs de croissance, ont un rôle de tuteur dans le processus de différenciation cellulaire et de régénération du cartilage, alors que le mélange de collagène et d'hydroxyapatite facilite l'ancrage du biomatériau dans l'os sous-chondral. Cette construction est représentée sur la figure 7 qui montre, en section verticale, la stratégie suivie pour le dépôt par pulvérisation des différents constituants du cartilage utilisés :
(1) une couche de collagène et d'apatite comme matrice ostéo-chondrale,
(2) un film muticouche (par exemple le système HA/poly-L-lysine (PLL)) comme compartiment fonctionnalisé par des facteurs de croissance d'intérêt comme BMP-2 et TGF- β,
(3) une couche d'alginate contenant des cellules souches, à différencier en chondrocytes, exprimant le collagène de type X,
(4) un film multicouche (HA/PLL) comme compartiment actif,
(5) une couche d'alginate contenant des cellules souches, à . différencier en chondrocytes, exprimant le collagène de type HB spécifique du cartilage,
(6) un film multicouches (HA/PLL) comme compartiment actif,
(7) une couche d'alginate contenant des cellules souches, à différencier en chondrocytes, exprimant le collagène de type I et II.
Les deux réactifs pour former le gel d'alginate de calcium sont le CaCl2 et l'alginate de sodium, qui est un polymère naturel constiuté de deux unités monosaccharidiques, l'acide D-mannuronique (M) et l'acide L-guluronique (G). La proportion en M et G varie d'une espèce à l'autre.
Dans les expériences rapportées dans ces exemples, l'alginate de sodium utilisé provient de l'algue Macrocystis pyrifera (Sigma-Aldrich). Cet alginate de sodium présente une plus grande proportion de blocs M et le quotient M/G est d'environ 1,6. Le gel est obtenu par pulvérisation simultanée d'une solution d'ions Ca2+ à une concentration de 0,125M et d'une solution d'alginate de sodium avec un rapport Ca/alginate en mole de 1/1. Pour la pulvérisation de cellules, les cellules sont mises en suspension dans la solution d'alginate de sodium.
La viabilité des cellules pulvérisées dans les gels d'alginate de calcium a été vérifiée par la méthode de MTT et a permis de confirmer que la pulvérisation des cellules dans les gels n'entraînait pas de mort cellulaire significative.
L'observation en microscopie confocale de gels renfermant des fibroblastes a montré que les cellules restent bien entre deux couches de gels et conservent leur phénotype. Références bibliographiques
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Claims

Revendications
1/ Méthode de construction d'un biomatériau artificiel vivant fonctionnel, caractérisée par l'assemblage couche par couche (3D) d'une matrice et de couches 2D de cellules vivantes fonctionnelles en contrôlant leurs interactions et la structuration 3D en fonction de l'organisation et de la forme finale souhaitées pour le biomatériau, où chaque couche a son propre motif adapté aux couches voisines et à la fonctionnalité des biomatériaux artificiels entiers.
2/ Méthode selon la revendication 1, caractérisée par des couches de cellules 2D fabriquées soit d'une façon homogène (couches non structurées) par trempage, pulvérisation ou par un procédé donnant une couche mince d'hydrogel (épaisseur du nanomètre au micromètre) pendant la période d'immobilisation, soit de façon hétérogène (couches structurées en motifs particuliers) par dépôt cellule par cellule à l'aide d'une imprimante ou d'un dispositif robotique.
3/ Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée par l'apport localement à chaque cellule individuelle des éléments nécessaires à sa survie comme les substances nutritives, les agents de transport ou de fixation de l'oxygène, les facteurs de croissance, les facteurs de différenciation cellulaire, les agents anti-oxydants, les promoteurs d'adhésion cellulaire, les agents anti-inflammatoires, les agents anti-bactériens, les agents anti-viraux,les facteurs ou inhibiteurs d'angiogénèse, les agents immunosuppresseurs, les co-facteurs, les vitamines, des ADN, des agents de transfection de gènes, ou tout facteur stimulant ou bloquant l'activité cellulaire, biologique ou thérapeutique.
4/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour la construction d'un biomatériau simple, caractérisée en ce qu'on procède au dépôt d'une seule couche de cellules,ces cellules, immobilisées selon la revendication 2 par la méthode couche par couche selon la revendication 1, étant d'un même type ou d'au moins deux types cellulaires différents.
5/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour la construction d'un biomatériau complexe, caractérisée en ce qu'on procède au dépôt consécutif de plusieurs couches alternées de polymères et de cellules de types différents selon l'architecture souhaitée.
6/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les cellules déposées sont des cellules qui forment la surface finale de l'organe (peau), des cellules endothéliales, des cellules de muscle lisse, des cellules de tissus connectifs, des cellules formant les vaisseaux sanguins, des cellules constitutives de tissus ou d'organes et des cellules souches dont la différenciation en cellules fonctionnelles sera induite par des facteurs de différenciation, à l'exclusion des cellules souches embryonnaires d'origine humaine.
Il Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que, pour contrôler l'interaction cellule-matrice dans l'espace, on utilise des cellules nues ou individuellement enrobées par des multicouches de polyélectrolytes ou des cellules immobilisées dans une couche mince d'hydrogel naissante (épaisseur du nanomètre au micromètre).
8/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'on utilise des cellules vivantes encapsulées par un revêtement d'une épaisseur de l'ordre du nanomètre, ce revêtement comprenant des macromolécules fonctionnelles adaptées à l'enrobage cellulaire.
9/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la matrice extra-cellulaire, composée de macromolécules biotolérantes ou bioinertes, le cas échéant biodégradables ou bioactives, est construite couche par couche dans le sens LbL à partir de molécules, macromolécules ou de composés colloïdaux, par exemple hydrogel en forme de nano-particules ou vésicules, interagissant par des interactions covalentes et/ou non covalentes, soit par gélification de 2 composés ou plus tels que, par exemple, Palginate de sodium et le calcium.
10/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que, lors de la construction, les molécules sont incorporées soit dans la matrice multicouche, soit de part et d'autre de la matrice.
11/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que l'immobilisation de cellules sur la matrice est réalisée :
- par dépôt de cellules nues ou encapsulées individuellement par des multicouches de polyélectrolytes sur un substrat préalablement modifié par un traitement multicouche dont la surface est de charge opposée ;
- par incorporation de cellules dans une matrice d'hydrogel naissante en surface, composée par exemple d'alginate de calcium, dont l'épaisseur est fonction de l'épaisseur du réservoir multicouche contrôlant la concentration d'un des composés nécessaire à la gélification ;
- par inclusion de cellules dans une matrice d'hydrogel naissante en surface, composée par exemple d'alginate de calcium, mais sans implication d'un réservoir multicouche 12/ En tant que produits nouveaux, les biomatériaux tels qu'obtenus par la méthode définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 11.
13/ Application des biomatériaux selon la revendication 12, dans le domaine biomédical et en nano biotechnologie.
14/ Application selon la revendication 13 , comme réacteurs à l'interface ou membranaires en couche mince pour la bio-fabrication de molécules d'intérêt par des cellules vivantes.
15/ Application selon la revendication 13, comme organe artificiel soit complètement biohybride, soit en tant que dispositif synthétique enrobée par une couche biohybride.
16/ Application selon la revendication 13, pour la réparation tissulaire, en particulier pour la réparation du cartilage.
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