WO2009010652A1 - Procede de proliferation de cellules sur des multicouches de polyelectrolytes et son application, notamment a la preparation de biomateriaux cellularises - Google Patents

Procede de proliferation de cellules sur des multicouches de polyelectrolytes et son application, notamment a la preparation de biomateriaux cellularises Download PDF

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WO2009010652A1
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cells
multilayers
pah
polyelectrolyte
initial
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PCT/FR2008/000832
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Patrick Menu
Cédric BOURA
Halima-Assia Kerdjoudj
Vanessa Moby
Nicolas Berthelemy
Jean-Claude Voegel
Pierre Schaaf
Jean-François STOLTZ
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Universite Henri Poincare Nancy 1
Chu De Nancy-Brabois
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Definitions

  • the subject of the invention is a process for the proliferation of cells on polyelectrolyte multilayers and its application, especially to the preparation of cellularized biomaterials.
  • Polyelectrolytes are polymers whose monomers carry an electrolytic group. These polymers are therefore charged.
  • Layer-by-layer deposition of polyelectrolytes is a simple method for designing surfaces with particular properties [a) G. Decher, JB Schlenoff, Multilayer Thin Films: Sequential Assembly of Nanocomposite Materials, Wiley-VCH, Weinheim, 2003. b) G Decher, Science 277, 1232, 1997].
  • a support and multilayer assembly of polyelectrolytes is prepared, in which the anionic and cationic layers are alternated.
  • the growth engine of these multilayers lies in the excess of charges which appears after each new deposition of a polyelectrolyte and which thus allows a new interaction with the polyelectrolyte of opposite sign.
  • This method of treatment is easy to use, applies regardless of the geometry of the support and generally only implements aqueous solutions.
  • the physicochemical, viscoelastic, structural, surface roughness and wettability properties of the carrier and multilayer polyelectrolyte assembly can be adjusted according to the required use [A. Izquierdo, S. Ono, J.C. Voegel, P. Schaaf, G. Decher, Langmuir, 21, 7558, 2005].
  • polyelectrolyte multilayers makes it possible to functionalize surfaces. Improved interaction between cells and surfaces is important in the fields of medicine, biomaterials and biotechnology.
  • the formation of a multilayer of polyelectrolytes on a biomaterial makes it possible to promote the adhesion and the proliferation of cells.
  • the polyelectrolyte multilayers have been used for the proliferation of differentiated cells, for example endothelial cells on a glass slide support [C. Boura, P. Menu, E. Payan, C. Picart, JC Voegel, S. Muller, JF Stoltz, Biomaterials 24, 3521, 2003] and nerve cells on TCPS support (polystyrene said to be "treated for cell culture”) [S. Forry, D. Reyes, M. Gaitan, L. Locascio, Langmuir 22, 5770, 2006].
  • Fibronectin is, to date, the most effective protein for increasing attachment and cell retention. The work published following clinical investigations has shown a strong hydrolysis of fibronectin that is not very compatible with an in vivo use of this protein [A. Tiwari, H. J. Salacinski, G. Punshon, G. Hamilton, A.M. Seifalian, FASEB J. 16, 791, 2002]. Improving the adhesion of cells to supports for the preparation of grafts that will be used in vivo is therefore necessary.
  • the cell proliferation techniques for the preparation of grafts are carried out in two stages with the techniques of those skilled in the art: a first stage of maturation, proliferation, and differentiation of stem cells and / or the expansion of differentiated cells on a first support, then detachment of the cells and seeding on another support which will be grafted.
  • the need to use two supports, and therefore to have to detach and re-seed the cells is expensive in time and increases the risk of contamination.
  • One aspect of the invention is to provide a method of cell proliferation, differentiated or not, which is fast enough for the preparation of grafts.
  • One aspect of the invention is to provide a method for cell proliferation, differentiated or not, in which the proliferation, the maturation and optionally the differentiation of the cells take place on the same support as that which is intended to be grafted. .
  • One of the other aspects of the invention is to provide viable cell-covered materials, such as artificial skin or substitutes for vessels or arteries.
  • the invention relates to the use of an assembly comprising a support and polyelectrolyte multilayers deposited on said support,
  • the above recovery is obtained after a period not exceeding one month, including 14 days, including 11 days, especially 7 days, after contacting the aforesaid initial cells with the above set.
  • the method further comprises a differentiation step which also takes place on the above-mentioned set.
  • One aspect of the invention relates to the use of polyelectrolyte multilayers deposited on a support, said multilayers:
  • the aforesaid recovery being obtained after a period not exceeding one month, in particular 14 days, in particular 11 days, in particular 7 days, after bringing the aforementioned initial cells into contact,
  • the invention is based on the demonstration that the obtaining of a viable, confluent and adherent cell layer is faster than with the techniques of a person skilled in the art.
  • the invention is based on the demonstration of the saving of time and means provided by the use of polyelectrolyte multilayers for the maturation, proliferation, and differentiation of stem cells and / or for the proliferation of differentiated cells.
  • maturation, proliferation, and differentiation of stem cells and / or proliferation of differentiated cells can be carried out directly on the support that will be used for the graft, unlike the techniques of those skilled in the art which are done in two steps:
  • support any material on which the layer-by-layer deposition of polyelectrolytes can be carried out.
  • polyelectrolytes polymers whose monomers carry an electrolytic group.
  • polyelectrolyte multilayers are meant all the layers obtained by the layer-by-layer deposition of polyelectrolytes [G. Decher, J. B. Schlenoff, Multilayer Thin Films: Sequential Assembly of Nanocomposite Materials, Wiley-VCH, Weinheim, 2003].
  • top layer of polyelectrolytes is meant the last layer of polyelectrolytes deposited by the layer-by-layer deposition technique.
  • Polyelectrolyte inner layers means the polyelectrolyte layers between the support and the polyelectrolyte top layer.
  • polycation is meant a polymer that is generally positively charged, “generally positively charged” meaning that the total charge is positive, but this does not exclude the presence of negatively charged monomers in the polymer.
  • polyanion is meant a polymer that is generally negatively charged, “overall negatively charged” meaning that the total charge is negative, but this does not exclude the presence of positively charged monomers in the polymer.
  • Bio molecules means molecules that participate in the metabolic process and maintenance of a living organism, for example proteins, DNA, RNA, cytokines, growth factors, by examples are those necessary for the recruitment and differentiation of the desired cell type (especially VEGF in the case of vascular cells).
  • biologically active molecules are meant molecules which have curative or preventive properties, for example which accelerate or reduce cell differentiation and / or proliferation, or for example drugs (especially VEGF in the case of ischemia, or taxol in the case of cancers).
  • multilayers coated with a set of molecules means that a set of molecules is deposited on the surface of the multilayers.
  • the molecules can be adsorbed on the surface. Interactions exist between the molecules and the upper layer of polyelectrolytes but the molecules can also be buried between the layers of the more internal polyelectrolytes of the multilayer.
  • the molecule is a globally positively charged protein coating a polyelectrolyte multilayer whose polyelectrolyte top layer is a polyanion
  • the main electrostatic interactions will be those between the positive charges of the protein and the negative charges of the layer.
  • a globally positively charged protein may contain negatively charged amino acids, which do not interact with the top layer of the polyelectrolyte, but rather with the positively charged polyelectrolytes of the polyelectrolyte inner layer.
  • the term “completely coated” means that the molecules coat the entire surface of the polyelectrolyte multilayer.
  • the expression “partially coated” means that the molecules are only present at certain places on the polyelectrolyte multilayer. This partial coating can be obtained by spraying techniques, such as those used in the publications [Porcel et al., Langmuir 22, 4376-83, 2006 and Porcel et al., Langmuir 21, 800-02, 2005]. Images using a laser fluorescence microscope or an atomic force microscope can determine whether the coating is partial or complete.
  • the expression “comprising biological or biologically active molecules” means that molecules are present in the polyelectrolyte multilayer.
  • adjacent layers two layers of polyelectrolytes which have been deposited one after the other during the formation of the polyelectrolyte multilayer.
  • polyelectrolyte multilayer By “properties of the polyelectrolyte multilayer” is meant the physicochemical properties, including viscoelasticity, surface roughness and wettability of the polyelectrolyte multilayer.
  • biological properties of said molecules is meant the curative or preventive properties of the biologically active molecules.
  • cell proliferation is meant the division and maturation of cells.
  • initial cells are meant cells that are initially contacted with the polyelectrolyte multilayer.
  • covering multilayers by cells means obtaining a layer, preferably a monolayer, of cells deposited on the polyelectrolyte multilayer.
  • the cells may be adsorbed on the polyelectrolyte top layer of the multilayer, but there may also be interactions with polyelectrolyte inner layers of the polyelectrolyte multilayer. These interactions may for example be ionic bonds, hydrogen, van der Waals ...
  • viable cells are meant cells that are able to survive. The cell viability can for example be determined by the ABRA test (Alamar Blue ® redox assay).
  • confluent cells are meant cells whose cell membranes establish junctions. This occurs when the initial cells cultured have proliferated to occupy all available space in a monolayer. The confluence can be demonstrated by images obtained by phase contrast microscopy or laser scanning.
  • cells resulting from the proliferation of initial cells is meant cells derived from division, maturation, and possibly differentiation (when the initial cells are stem cells), initial cells.
  • Another aspect of the invention relates to the use of polyelectrolyte multilayers deposited on a support, said multilayers:
  • the aforesaid recovery being obtained after a period not exceeding one month, in particular 14 days, in particular 11 days, in particular 7 days, after bringing the aforementioned initial cells into contact,
  • chemical bond not being of a covalent nature means that the bonds between the molecules and the polyelectrolyte layers are, for example, ionic, hydrogen, van der Waals bonds, which do not modify the properties of the molecules and polyelectrolyte multilayer.
  • the polyelectrolyte top layer of the multilayers is a polycation and the multilayers are not coated with a set of biological or biologically active molecules, and do not contain any biologically or biologically active molecules integrated between them. at least two adjacent layers of said polyelectrolyte multilayers.
  • the multilayer polyelectrolyte top layer is a polyanion and the multilayers are not coated with a set of biological or biologically active molecules, and do not contain biologically or biologically active molecules integrated between at least two adjacent layers of said polyelectrolyte multilayers.
  • the cells When the upper layer of polyelectrolytes is negatively charged, the cells, whose membrane is negatively charged, generally do not adhere to the polyelectrolyte multilayer (repulsive electrostatic interactions).
  • the multilayer polyelectrolyte top layer is a polycation and wherein the multilayers are coated with a set of biological or biologically active molecules and optionally contain biologically or biologically active molecules integrated between at least two adjacent layers of the aforesaid polyelectrolyte multilayers.
  • the multilayer polyelectrolyte top layer is a polyanion and wherein the multilayers are coated with a set of biological or biologically active molecules and optionally contain biologically or biologically active molecules integrated between at least two adjacent layers of the aforesaid polyelectrolyte multilayers.
  • the multilayers are coated with a set of biological or biologically active molecules, and in this case the cells adhere to this set of molecules, or,
  • the multilayers contain biological or biologically active molecules integrated between at least two adjacent layers, and in this case the cells adhere to the polyelectrolyte multilayers, or,
  • the multilayers are coated with a set of biological or biologically active molecules and they contain biological or biologically active molecules integrated between at least two adjacent layers and in this case the cells adhere to this set of molecules.
  • the coating of the multilayer of polyelectrolytes by biological molecules is particularly advantageous because it can make it possible to reverse the polarity of the support and therefore to promote cell adhesion.
  • the upper layer of a multilayer (PAH-PSS) 3 is negatively charged and the cells generally do not adhere. If globally positively charged proteins coat the multilayer, the polarity of the surface is reversed and cell adhesion is favored.
  • the initial cells are differentiated cells, chosen in particular from keratinocytes, chondrocytes, nerve cells, dendritic cells, endothelial cells, fibroblasts, epiblasts, myoblasts, cardio-myoblasts, myocytes, cells epithelial cells, osteocytes, osteoblasts, hepatocytes and islet cells of Langerhans.
  • the initial cells are stem cells, in particular chosen from totipotent, pluripotent and multipotent cells.
  • totipotent cells cells that can be differentiated into any cellular type of the organism. They allow the development of a complete individual.
  • pluripototent cells cells that can be differentiated into cells from any of the three embryonic layers. They can not produce a whole organism.
  • multipotent cells are meant cells that can be differentiated into several differentiated cell types but only for particular cell types.
  • hematopoietic multipotent cells can differentiate into red blood cells, platelets, lymphocytes or macrophages but they can not differentiate into muscle cells.
  • stem cells include embryonic stem cells, hematopoietic cells, mesenchymal cells, precursors such as EPCs (endothelial progenitor cells).
  • the polyelectrolyte multilayers consist of alternating layers of polycations and polyanions
  • polystyrene resin in particular chosen from polyallylamine (PAH), polyethyleneimine (PEI), polyvinylamine, polyaminoamide (PAMAM), polyacrylamide (PAAm), polydiallyldimethylammonium chloride (PDAC), positively charged polypeptides such as polylysine and positively charged polysaccharides such as chitosan,
  • PAH polyallylamine
  • PEI polyethyleneimine
  • PAMAM polyvinylamine
  • PAMAM polyaminoamide
  • PAAm polyacrylamide
  • PDAC polydiallyldimethylammonium chloride
  • positively charged polypeptides such as polylysine and positively charged polysaccharides such as chitosan
  • polyacrylic acid PAA
  • PMA polymethacrylic acid
  • PSS polystyrene sulphonic acid
  • negatively charged polypeptides such as polyglutamic acid and acid.
  • polyaspartic and negatively charged polysaccharides such as hyaluronan and palginate.
  • the number of layers of the polyelectrolyte multilayers is 3 to 100, in particular 3 to 50, in particular 5 to 10 and in particular 7.
  • the film is still permeable to small molecules, for example Hoechst 33258 (molecular weight 623 Da).
  • the polyelectrolyte multilayers are chosen from (PAH-PSS) 3 , (PAH-PSS) 3 -PAH and PEI- (PSS-PAH) 3 .
  • the support is a synthetic support advantageously chosen from glass, TCPS (polystyrene called “cell culture treated”), polysiloxane, perfluoroalkyl polyethers, biocompatible polymers in particular Dacron ® , polyurethane, polydimethylsiloxane, polyvinyl chloride, Silastic ® , polytetrafluoroethylene (PTFEe), and any material used for prostheses and / or implanted systems.
  • TCPS polystyrene called "cell culture treated”
  • polysiloxane polysiloxane
  • perfluoroalkyl polyethers biocompatible polymers in particular Dacron ® , polyurethane, polydimethylsiloxane, polyvinyl chloride, Silastic ® , polytetrafluoroethylene (PTFEe), and any material used for prostheses and / or implanted systems.
  • the support is a natural support advantageously chosen from blood vessels, veins, arteries, in particular the decellularized umbilical arteries, notably deendothelialized ones, the said vessels, veins and arteries originating from organs of donors or animals
  • the support is a natural support advantageously chosen from the dermis of the placenta, the bladder or any other support (organ) of human or animal origin.
  • the polyelectrolyte multilayers deposited on a support are rigid enough to allow adhesion of cells and sufficiently flexible to deform under the effect of arterial pulsations and withstand physiological pressures of 10 to 300 mmHg, especially 50 to 250 mmHg and advantageously 80 to 230 mmHg.
  • Physiological pressures refers to blood pressures in arteries, veins and vessels in a healthy subject
  • the coating of the polyelectrolyte multilayers deposited on the support by the adherent cells is such that it resists shearing of blood flow, especially in vivo.
  • blood flow shear is meant the frictional tangential force induced by the blood flow that is exerted on the polyelectrolyte multilayer when the assembly: support, multilayer of polyelectrolytes, and cells covering it, is under physiological conditions.
  • the invention makes it possible to prepare stents, angioplasty balloons, arteries or artificial vessels for grafts, vascular drifts, heart valves, artificial components for the heart, pacemakers, ventricular assist devices, catheters, contact lenses, intraocular lenses, matrices for tissue engineering, biomedical membranes, dialysis membranes, cell encapsulation membranes, prostheses for cosmetic surgery, orthopedic prostheses, dental prostheses, dressings, sutures, diagnostic biosensors.
  • the invention also relates to a method for recovering initial, stem or differentiated cells, comprising: contacting initial cells with multilayers of polyelectrolytes deposited on a support, said multilayers optionally being coated with a set of biological or biologically active molecules and / or possibly containing biological or biologically active molecules, integrated between at least two adjacent layers of said polyelectrolyte multilayers, the integration being such that neither the properties of the polyelectrolyte multilayer, nor the possible biological properties of said molecules are modified, and preferably such as the possible chemical bonds between the aforementioned molecules and the polyelectrolyte layers are not of a covalent nature, in media allowing the proliferation of said initial cells,
  • the cells may or may not be detached from the polyelectrolyte multilayer.
  • the cells will be detached from the multilayer.
  • the endothelial cells are not detached, provided that the support is biocompatible because the biocompatible / multilayer polyelectrolyte / endothelial cell assembly is grafted.
  • biocompatible carrier is meant a support well tolerated by a living organism, which does not cause rejection reaction, toxic reactions, lesions or harmful effect on the biological functions of the latter.
  • the method is an initial stem cell recovery method comprising:
  • the initial cells are stem cells. It has been found that, unexpectedly, the stem cells can proliferate and differentiate to confluence in a shorter time than the prior art methods.
  • the duration involved in the invention being 14 days, especially 11 days, in particular 7 days.
  • PAH-PSS polyelectrolyte multilayer
  • the confluence is reached in 14 days whereas it takes 60 days using fibronectin (which is the protein giving the proliferation times and differentiation among the fastest techniques known to those skilled in the art).
  • the method is an initial differentiated cell recovery method comprising:
  • the initial cells are differentiated cells. It has been found that, unexpectedly, the initial cells can proliferate to confluence in a shorter time than the processes of the prior art.
  • the duration involved in the invention being 7 days, especially 5 days, in particular 3 days.
  • the confluence is reached in 7 days or less, whereas without polyelectrolyte multilayer deposition, no cell adheres.
  • the multilayers are coated with a set of biological or biologically active molecules, and / or containing biological or biologically active molecules, integrated between at least two adjacent layers of the aforementioned polyelectrolyte multilayers. , the integration being such that neither the properties of the polyelectrolyte multilayer, nor the possible biological properties of said molecules are modified.
  • the method comprises:
  • multilayers of polyelectrolytes deposited on a support said multilayers optionally being coated with a set of biological or biologically active molecules, and / or optionally containing biological or biologically active molecules, integrated between at least two adjacent layers of said polyelectrolyte multilayers, the integration being such that neither the properties of the polyelectrolyte multilayer nor the possible biological properties of said molecules are modified, and preferably such as the possible chemical bonds between the aforesaid molecules and the polyelectrolyte layers are not of a covalent nature, in media allowing the proliferation of said initial cells,
  • the adherent, viable and confluent cells are detached from the polyelectrolyte multilayer.
  • the method comprises:
  • multilayers of polyelectrolytes deposited on a support said multilayers optionally being coated with a set of biological or biologically active molecules, and / or optionally containing biological or biologically active molecules, integrated between at least two adjacent layers of said polyelectrolyte multilayers, the integration being such that neither the properties of the polyelectrolyte multilayer nor the possible biological properties of said molecules are modified, and preferably such as the possible chemical bonds between the aforesaid molecules and the polyelectrolyte layers are not of a covalent nature, in media allowing the proliferation of said initial cells,
  • the adherent, viable and confluent cells are not detached from the polyelectrolyte multilayer.
  • the method is an initial endothelial cell recovery method which comprises:
  • polyelectrolyte multilayers chosen from (PAH-PSS) 3 , (PAH-PSS) 3 -PAH and PEI- (PSS-PAH) 3 , deposited on a support, in particular a natural support; such as a blood vessel or a decellularized artery, in particular deendothelialized, or a biocompatible synthetic support having a vessel or artery shape, said multilayers possibly being coated with a set of biological or biologically active molecules, and / or containing optionally, biological or biologically active molecules integrated between at least two adjacent layers of said polyelectrolyte multilayers, the integration being such that neither the properties of the polyelectrolyte multilayer nor the possible biological properties of said molecules are modified, and preference such as the possible chemical bonds between the above molecules and the layers of lyelectrolytes are not of a covalent nature, in media allowing the proliferation of the aforementioned endothelial cells,
  • This case corresponds to a method of proliferation of endothelial cells on a polyelectrolyte multilayer for the preparation of vascular or arterial substitutes which will be used as grafts.
  • the use of polyelectrolyte multilayers has many advantages. Indeed, the artery or vessel / multilayer polyelectrolyte support assembly is rigid enough to allow adhesion of the cells and elastic enough to accept the deformation imposed by the blood flow. In addition, the cell monolayer obtained must allow the passage of oxygen and nutrients, which must allow essential exchanges between blood and surrounding tissues.
  • the method is an initial stem cell recovery method comprising:
  • polyelectrolyte multilayers selected from (PAH-PSS) 3 , (PAH-PSS) 3 -PAH and PEI- (PSS-PAH) 3 , deposited on a support, said multilayers being optionally coated with a set of biological or biologically active molecules, and / or optionally containing biological or biologically active molecules, integrated between at least two adjacent layers of said polyelectrolyte multilayers, the integration being such that neither the properties of the multilayer of polyelectrolytes, nor the possible biological properties of said molecules are modified, and preferably such that the possible chemical bonds between the above-said molecules and the polyelectrolyte layers are not of a covalent nature, in media allowing the proliferation of the aforesaid stem cells initials
  • This case corresponds to a process of proliferation of stem cells, then differentiation into endothelial cells, on a multilayer of polyelectrolytes for the preparation of vascular or arterial substitutes that will be used as grafts.
  • the initial stem cells are in particular chosen from totipotent, pluripotent and multipotent cells.
  • the initial differentiated cells are chosen in particular from keratinocytes, chondrocytes, nerve cells, dendritic cells, endothelial cells, fibroblasts, epiblasts, myoblasts, cardio-myoblasts, myocytes, epithelial cells, osteocytes, osteoblasts and hepatocytes. and cells of islets of Langerhans.
  • the polyelectrolyte multilayers consist of preferably alternating layers of polycations and polyanions,
  • polystyrene resin being chosen in particular from polyallylamine (PAH), polyethyleneimine (PEI), polyvinylamine, polyaminoamide (PAMAM), polyacrylamide (PAAm), polydiallyldimethylammonium chloride (PDAC), positively charged polypeptides such as polylysine and positively charged polysaccharides such as chitosan,
  • PAH polyallylamine
  • PEI polyethyleneimine
  • PAMAM polyvinylamine
  • PAMAM polyaminoamide
  • PAAm polyacrylamide
  • PDAC polydiallyldimethylammonium chloride
  • positively charged polypeptides such as polylysine and positively charged polysaccharides such as chitosan
  • polyacrylic acid PAA
  • PMA polymethacrylic acid
  • PSS polystyrene sulfonic acid
  • negatively charged polypeptides such as polyglutamic acid and polyaspartic acid and negatively charged polysaccharides such as hyaluronan and alginate.
  • the number of layers of said polyelectrolyte multilayers is 3 to 100, in particular 3 to 50, in particular 5 to 10 and in particular 7.
  • the polyelectrolyte multilayers are chosen from (PAH-PSS) 3 , (PAH-PSS) 3 -PAH and PEI- (PSS-PAH) 3 .
  • the support is chosen from synthetic supports such as glass, TCPS (polystyrene called “cell culture treated"), polysiloxane, polyethers of perfluoroalkyl, biocompatible polymers, in particular Dacron ®, polyurethane, polydimethylsiloxane, polyvinyl chloride, Silastic ®, polytetrafluoroethylene (ePTFE), and any material used for prostheses and / or implanted systems,
  • synthetic supports such as glass, TCPS (polystyrene called "cell culture treated"), polysiloxane, polyethers of perfluoroalkyl, biocompatible polymers, in particular Dacron ®, polyurethane, polydimethylsiloxane, polyvinyl chloride, Silastic ®, polytetrafluoroethylene (ePTFE), and any material used for prostheses and / or implanted systems,
  • the support is chosen from natural supports such as blood vessels, veins, arteries, in particular the decellularized umbilical arteries, in particular deendothelialized, the so-called vessels, veins and arteries from organs of donors or animals.
  • the support is a natural support advantageously chosen from the dermis of the placenta, the bladder or any other support (organ) of human or animal origin.
  • the subject of the present invention is a composition
  • a composition comprising: a support, multilayers of polyelectrolytes deposited on said support, said multilayers optionally being coated with a set of biological or biologically active molecules and / or possibly containing biological or biologically active molecules, integrated between at least two adjacent layers of said multilayered layers; polyelectrolytes, the integration being such that neither the properties of the polyelectrolyte multilayer, nor the possible biological properties of said molecules are modified, and preferably such that the possible chemical bonds between the aforementioned molecules and the polyelectrolyte layers are not of covalent nature, and,
  • the composition of the invention comprises a support, multilayers of polyelectrolytes deposited on said support, said multilayers are coated with a set of biological or biologically active molecules and / or contain biological molecules or biologically active, integrated between at least two adjacent layers of said polyelectrolyte multilayers.
  • the composition of the invention comprises a support, polyelectrolyte multilayers deposited on said support, and a layer of stem cells covering said polyelectrolyte multilayers.
  • the initial stem cells are in particular chosen from totipotent, pluripotent and multipotent cells.
  • composition of the invention comprises:
  • multilayers of polyelectrolytes deposited on said support said multilayers optionally being coated with a set of biological or biologically active molecules and / or possibly containing biological or biologically active molecules, integrated between at least two adjacent layers of said multilayered layers; polyelectrolytes, the integration being such that neither the properties of the polyelectrolyte multilayer, nor the possible biological properties of said molecules are modified, and preferably such that the possible chemical bonds between the aforementioned molecules and the polyelectrolyte layers are not of covalent nature, and,
  • composition of the invention comprises:
  • multilayers of polyelectrolytes deposited on said support said multilayers being coated with a set of biological or biologically active molecules and / or containing biological or biologically active molecules integrated between at least two adjacent layers of said polyelectrolyte multilayers, the integration being such that neither the properties of the polyelectrolyte multilayer nor the possible biological properties of said molecules are modified, and preferably such that the possible chemical bonds between the above-mentioned molecules and the polyelectrolyte layers are not of a similar nature, and
  • composition of the invention comprises:
  • composition of the invention comprises:
  • multilayers of polyelectrolytes deposited on said support said multilayers being coated with a set of biological or biologically active molecules, and / or containing biological or biologically active molecules, integrated between at least two adjacent layers of said polyelectrolyte multilayers; the integration being such that neither the properties of the polyelectrolyte multilayer nor the possible biological properties of said molecules are modified, and preferably such that the possible chemical bonds between the aforementioned molecules and the polyelectrolyte layers are not covalent nature, and,
  • the support is a synthetic or natural support, and in particular a synthetic support.
  • the initial differentiated cells are chosen in particular from keratinocytes, chondrocytes, nerve cells, dendritic cells, endothelial cells, fibroblasts, epiblasts, myoblasts, cardio-myoblasts, myocytes, epithelial cells, osteocytes, osteoblasts and hepatocytes. and cells of Langerhans islets.
  • the polyelectrolyte multilayers consist of preferably alternating layers of polycations and polyanions, the polycations being chosen in particular from polyallylamine (PAH), polyethyleneimine (PEI), polyvinylamine, polyaminoamide (PAMAM), polyacrylamide (PAAm), polydiallyldimethylammonium chloride (PDAC), positively charged polypeptides such as polylysine and positively charged polysaccharides such as chitosan,
  • PAH polyallylamine
  • PEI polyethyleneimine
  • PAMAM polyaminoamide
  • PAAm polyacrylamide
  • PDAC polydiallyldimethylammonium chloride
  • positively charged polypeptides such as polylysine and positively charged polysaccharides such as chitosan
  • polyacrylic acid PAA
  • PMA polymethacrylic acid
  • PSS polystyrene sulfonic acid
  • negatively charged polypeptides such as polyglutamic acid and polyaspartic acid and negatively charged polysaccharides such as hyaluronan and alginate.
  • the number of layers of said polyelectrolyte multilayers is 3 to 100, in particular 3 to 50, in particular 5 to 10 and in particular 7.
  • the polyelectrolyte multilayers are chosen from (PAH-PSS) 3 , (PAH-PSS) 3 -PAH and PEI- (PSS-PAH) 3 .
  • the support is selected from natural supports, such as blood vessels, veins, arteries, including decellularized umbilical arteries, including deendothelialized, said vessels, veins and arteries from organs of the body. donors or animals, and the placenta dermis, (ditto)
  • the support is advantageously chosen from the dermis of the placenta, the bladder or any other support (organ) of human or animal origin.
  • the carrier is selected from the synthetic substrates including glass, TCPS (polystyrene called “tissue culture treated”), polysiloxane, perfluoroalkyl polyethers, biocompatible polymers, in particular Dacron ®, the polyurethane, polydimethylsiloxane, polyvinyl chloride, Silastic ® , polytetrafluoroethylene (PTFEe) and any material used for prostheses and / or implanted systems.
  • TCPS polystyrene called "tissue culture treated”
  • polysiloxane polysiloxane
  • perfluoroalkyl polyethers perfluoroalkyl polyethers
  • biocompatible polymers in particular Dacron ®
  • the polyurethane polydimethylsiloxane
  • polyvinyl chloride polyvinyl chloride
  • Silastic ® polytetrafluoroethylene
  • PTFEe polytetrafluoroethylene
  • FIG. 1 represents an objective confocal microscope image 40 of a PTFEe support on which the polyelectrolyte multilayer [PEI- (PSS-PAH) 2 -PSS-PAH *] has been deposited, PAH * being hydrochloride of poly (allylamine) coupled to rhodamine.
  • the small arrow corresponds to a microfibril or the distance between two nodes, and the large arrow corresponds to the nodes.
  • the asterisk corresponds to a pore.
  • This image shows the topology of the inner surface of the artery.
  • This image is a cross section and shows that the polyelectrolyte multilayer coating has taken place over the entire inner surface of the artery.
  • Figure 2D is an overlay of Figures 2B and 2C.
  • Figure 2E shows the spectrum of rhodamine confirming the presence of polyelectrolyte [(PAH-PSS) 2 -PAH * -PSS-PAH *].
  • the x-axis represents the wavelength in nanometers.
  • the y-axis represents the brightness expressed in gray levels.
  • Figure 3 shows curves of deformation of the arteries as a function of the pressure exerted in these arteries.
  • the ordinate axis represents the pressure in the arteries in cm Hg.
  • the x-axis represents the percentage of deformation of the artery.
  • the curve with dots • represents fresh arteries.
  • the curve with squares B represents deendothelialized arteries on which no polyelectrolyte multilayers have been deposited.
  • the curve with triangles - * - represents the endothelialized arteries on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 -PAH was deposited.
  • Figure 4 shows percentage compliance with fresh arteries, i.e., the data has been normalized so that fresh artery compliance is 100%.
  • the y-axis represents percent compliance with fresh arteries.
  • the x-axis represents the type of arteries: fresh arteries, deendothelialized arteries on which no polyelectrolyte multilayers have been deposited, and deendothelialized arteries on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 -PAH has been filed.
  • PHA-PSS polyelectrolyte multilayer
  • the symbol * means that the compliance of the deendothelialized arteries on which no polyelectrolyte multilayer has been deposited differs significantly with that of the fresh arteries with a probability of error of less than 0.05%.
  • FIG. 5 represents the result of the viability test by the Alamar Blue® test of HUVECs endothelial cells seeded on:
  • the x-axis represents the culture time in days.
  • the symbol * means that the metabolic activity of the endothelial cells on the supports considered differs significantly with that of the cells on the TCPS support with an error probability of less than 0.05%.
  • the incubation time is 3 hours.
  • Figure 6A shows the electron microscopic image (magnification x 169) of the PTFEe support on which endothelial cells were cultured.
  • Figure 6B shows the electron microscopic image (x508 magnification) of the PTFEe support on which endothelial cells were cultured.
  • FIG. 6C shows the image observed under an electron microscope (x 149 magnification) of the PTFEe support on which the PAH polyelectrolyte was deposited and on which endothelial cells were cultured.
  • FIG. 6D represents the image observed under an electron microscope (x503 magnification) of the PTFEe support on which the PAH polyelectrolyte was deposited and on which endothelial cells were cultured.
  • Figure 6E shows the electron microscopic image (magnification xl 12) of the PTFEe support on which the polyelectrolyte multilayer PEI- (PSS-PAH) 3 was deposited and on which endothelial cells were cultured.
  • FIG. 6F represents the image observed under an electron microscope (x513 magnification) of the PTFEe support on which the polyelectrolyte multilayer PEI- (PSS-PAH) 3 was deposited and on which endothelial cells were cultured.
  • the culture time of the HUVECs endothelial cells is 7 days, and the microscope is a STEREOSCAN S 240, CAMBRIDGE (UK) electron microscope.
  • FIG. 7 represents the image obtained by confocal microscopy (bar: 75 ⁇ m, objective ⁇ 40) of HUVECs endothelial cells adhering to the PTFEe support on which the PEI multilayer (PSS-PAH) 3 was deposited, after 7 days of culture.
  • the factor Von Willebrand is visualized thanks to fluorochrome Alexa Fluor 488 ( ⁇ ex: 494nm, ⁇ em: 517nm) and appears in light gray.
  • the dark gray circles that appear in the middle of the gray parts clear are the nuclei, which have been labeled with propidium iodide ( ⁇ ex: 536nm, ⁇ em: 617nm)
  • FIG. 8A represents the image of a histological section of a reendothelialized artery on which no polyelectrolyte multilayer has been deposited.
  • the basic staining is carried out with Phematoxylin-Eosin-Safran.
  • the magnification is 20.
  • Figure 8B shows the image of a histological section of a reendothelialized artery on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 -PAH was deposited.
  • the basic staining is performed with hematoxylin-eosine-Safran. The magnification is 20.
  • FIG. 8C represents the image obtained in immunohistochemistry demonstrating the PECAM-I membrane receptor expressed on the surface of the endothelial cells seeded in the lumen of the artery on which no polyelectrolyte multilayer has been deposited.
  • the revelation is carried out by peroxidase and the counterstaining is performed with hematoxylin.
  • the magnification is 20.
  • FIG. 8D represents the image obtained in immunohistochemistry demonstrating the PECAM-I membrane receptor expressed on the surface of the endothelial cells seeded in the lumen of the artery on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 -PAH has been filed.
  • the revelation is carried out by peroxidase and the counterstaining is performed with hematoxylin.
  • the magnification is 20.
  • FIG. 9A represents an image obtained after observation by scanning electron microscope (Bar: 50 ⁇ m) of the endothelialized umbilical arteries on which no polyelectrolyte multilayer has been deposited.
  • FIG. 9B represents an image obtained after observation with a scanning electron microscope (Bar: 50 ⁇ m) of the endothelialized umbilical arteries on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 -PAH was deposited.
  • Bar 50 ⁇ m
  • FIG. 9C represents an image obtained after observation with a scanning electron microscope (Bar: 50 ⁇ m) of a fresh (control) artery.
  • FIG. 10A represents the image obtained after observation by laser scanning confocal microscopy (objective 40) after labeling PECAM-I, of endothelialized arteries on which no polyelectrolyte multilayer was deposited, under static conditions after one week of culture.
  • FIG. 10B shows the image obtained after observation by laser scanning confocal microscopy (Objective 40) after labeling PECAM-I, of endothelialized arteries on which no polyelectrolyte multilayer has been deposited, under dynamic conditions (endothelialized arteries). subjected to a shear stress of 1 Pa for 1 hour) after one week of culture.
  • FIG. 10C represents the image obtained after observation by laser scanning confocal microscopy (objective 40) after labeling of PECAM-I, of endothelialized arteries on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 -PAH was deposited, in static conditions after one week of culture.
  • object 40 laser scanning confocal microscopy
  • PAH-PSS polyelectrolyte multilayer
  • FIG. 10D represents the image obtained after observation by laser scanning confocal microscopy (objective 40) after labeling PECAM-I, of endothelialized arteries on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 -PAH was deposited, in dynamic conditions (endothelialized arteries subjected to shear stress of 1 Pa for 1 hour) after one week of culture.
  • object 40 laser scanning confocal microscopy
  • PAH-PSS polyelectrolyte multilayer
  • FIG. HA represents the image obtained after observation under a scanning electron microscope (Bar: 50 ⁇ m) after labeling PECAM-I, of endothelialized arteries on which no polyelectrolyte multilayer has been deposited, under static conditions after a week of culture.
  • FIG. HB represents the image obtained after observation with a scanning electron microscope (Bar: 50 ⁇ m) after labeling PECAM-I, of endothelialized arteries on which no polyelectrolyte multilayer has been deposited, under dynamic conditions (arteries endothelialized shear stress of 1 Pa for 1 hour) after one week of culture.
  • FIG. HC represents the image obtained after observation under a scanning electron microscope (Bar: 50 ⁇ m) after labeling of PECAM-I, of endothelialized arteries on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 -PAH was deposited, under static conditions after one week of culture.
  • FIG. 11D represents the image obtained after observation with a scanning electron microscope (Bar: 50 ⁇ m) after labeling of PECAM-I, of endothelialized arteries on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 -PAH was deposited, under dynamic conditions (endothelialized arteries subjected to shear stress of 1 Pa for 1 hour) after one week of culture.
  • Figures 12A, 12B, 12C, 12D, 12E, 12F are Figures 12A, 12B, 12C, 12D, 12E, 12F:
  • FIG. 12A represents an image obtained after observation of a histological section of cryopreserved cryopreserved deendothelialized rabbit umbilical arteries on which no polyelectrolyte multilayer was deposited, one week after implantation (control).
  • Figure 12B shows an image obtained after observation of a histological section of deendothelialized rabbit allografts on which no polyelectrolyte multilayer was deposited, one week after implantation (control).
  • Figure 12C shows an image obtained after observation of a histological section of cryopreserved cryopreserved deendothelialized rabbit umbilical arteries on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 was deposited , one week after implantation.
  • PAH-PSS polyelectrolyte multilayer
  • Figure 12D shows an image obtained after observation of a histological section of deendothelialized rabbit allografts on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 was deposited, one week after implantation.
  • PAH-PSS polyelectrolyte multilayer
  • Figure 12E shows an image obtained after observation of a histological section of cryopreserved cryopreserved deendothelialized rabbit umbilical arteries on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 was deposited, 12 weeks after implantation.
  • PAH-PSS polyelectrolyte multilayer
  • FIG. 12F represents an image obtained after observation of a histological section of deendothelialized rabbit allografts on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 was deposited, 12 weeks after implantation.
  • PAH-PSS polyelectrolyte multilayer
  • FIG. 13A represents an image obtained after observation with a scanning electron microscope (Bar: 1 mm) of cryopreserved cryopreserved arteries deendothelialized of rabbits on which no polyelectrolyte multilayer was deposited, one week after implantation (control).
  • FIG. 13B represents an image obtained after observation by scanning electron microscope (Bar: 1 mm) of deendothelialized rabbit allografts on which no polyelectrolyte multilayer was deposited, one week after implantation (control).
  • FIG. 13C represents an image obtained after observation with a scanning electron microscope (Bar: 1 mm) of cryopreserved cryopreserved arteries of endothelialized rabbit on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 was deposited, one week after implantation. .
  • a scanning electron microscope Bar: 1 mm
  • PAH-PSS polyelectrolyte multilayer
  • FIG. 13D represents an image obtained after observation with a scanning electron microscope (Bar: 1 mm) of deendothelialized rabbit allografts on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 was deposited, one week after implantation.
  • a scanning electron microscope Bar: 1 mm
  • PAH-PSS polyelectrolyte multilayer
  • FIG. 13E shows an image obtained after observation with a scanning electron microscope (Bar: 1 mm) of cryopreserved cryopreserved deendothelialized rabbit umbilical arteries on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 was deposited, 12 weeks after implantation. .
  • a scanning electron microscope Bar: 1 mm
  • PAH-PSS polyelectrolyte multilayer
  • FIG. 13F represents an image obtained after observation with a scanning electron microscope (Bar: 1 mm) of deendothelialized rabbit allografts on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 was deposited, 12 weeks after implantation.
  • a scanning electron microscope Bar: 1 mm
  • PAH-PSS polyelectrolyte multilayer
  • FIG. 14A represents an image obtained after doppler ultrasound observation 10 weeks after implantation for the control carotid, which is the native carotid of the rabbit (control).
  • the trace at the bottom of the image shows that the blood velocity is 40 cm / s.
  • FIG. 14B represents an image obtained after echo-Doppler observation 10 weeks after implantation for cryopreserved de-endothelialized umbilical arteries on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 has been deposited.
  • the trace at the bottom of the image shows that the blood velocity is 40 cm / s.
  • FIG. 14C represents an image obtained after echo-Doppler observation 10 weeks after implantation for cryopreserved, de-endothelialized umbilical arteries on which no polyelectrolyte multilayer has been deposited.
  • the route down the image shows that the speed of the blood is zero: the blood does not flow because the artery is blocked.
  • FIG. 15A represents the image obtained by observation by phase contrast microscopy (Objective 20) of a glass slide coated with fibronectin and then endothelial progenitors, at 4 days of culture.
  • FIG. 15B shows the image obtained by observation by phase contrast microscopy (Objective 20) of a glass slide on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 -PAH was deposited and then endothelial progenitors were seeded. at 4 days of culture.
  • Phase contrast microscopy Objective 20
  • PAH-PSS polyelectrolyte multilayer
  • FIG. 15C represents the image obtained by observation by phase contrast microscopy (Objective 20) of a glass slide coated with fibronectin and then endothelial progenitors, at 14 days of culture.
  • FIG. 15D represents the image obtained by observation by phase contrast microscopy (Objective 20) of a glass slide on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 -PAH was deposited and then endothelial progenitors were seeded. , 14 days of culture.
  • Phase contrast microscopy Objective 20
  • PAH-PSS polyelectrolyte multilayer
  • FIG. 15E represents the image obtained by observation in phase contrast microscopy (Objective 20) of TCPS (polystyrene called "cell culture treated") covered with a monolayer of mature endothelial cells derived from the jugular vein of rabbit (JVEC) (control).
  • TCPS polystyrene called "cell culture treated”
  • JVEC jugular vein of rabbit
  • FIG. 16A represents the image obtained after observation by confocal laser scanning microscopy after 14 days of culture (objective 40) of endothelial cells of a jugular vein (control) and of which the PECAM-I membrane receptor has been labeled.
  • the labeling is indirect immunostaining: a primary antibody that recognizes the PECAM-I antigen is recognized by a secondary antibody labeled with a fluorochrome (Alexa® 488).
  • the adhesion and the spread of the cells on the support were evaluated by the appearance of the actin fibers. In light gray appears the PECAM-I highlighted by a fluorochrome (Alexa® 488).
  • FIG. 16B represents the image obtained after observation by laser scanning confocal microscopy after 14 days of culture (Target 40) of endothelial cells of a jugular vein (control) and whose intracellular marker (von Willebrand factor (vWF)) at been marked. Labeling is indirect immunostaining: a primary antibody that recognizes the vWF antigen is recognized by a fluorochrome-labeled secondary antibody (Alexa® 488). The adhesion and the spread of the cells on the support were evaluated by the appearance of the actin fibers. In light gray appears the intracellular marker (von Willebrand factor (vWF)) highlighted by a fluorochrome (Alexa® 488).
  • FIG. 16C represents the image obtained after observation by laser scanning confocal microscopy after 14 days of culture (target 40) of endothelial cells of a jugular vein (control) and whose cytoskeleton is demonstrated by recognition by a bound antibody to a fluorochrome (Alexa® 488).
  • the adhesion and the spread of the cells on the support were evaluated by the appearance of the actin fibers. In light gray appears the cytoskeleton.
  • FIG. 16D represents the image obtained after observation by laser scanning confocal microscopy after 14 days of culture (Target 40) of endothelial cells of a jugular vein (control) and whose LDL has been coupled to DiI (fluorescent molecule).
  • the ability of cells to incorporate LDL is a feature of the functionality of mature endothelial cells.
  • In gray appear the LDL coupled to DiI (fluorescent molecule).
  • Syto 16 marker specific to the nucleus
  • FIG. 16E represents the image obtained after observation by laser scanning confocal microscopy after 14 days of culture (Objective 40) of EPC cells seeded on a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 -PAH and whose PECAM-I membrane receptor was labeled in the same manner as for Figure 16A.
  • the adhesion and the spread of the cells on the support were evaluated by the appearance of the actin fibers.
  • In light gray appears the PECAM-I highlighted by a fluorochrome (Alexa® 488).
  • FIG. 16F represents the image obtained after observation by laser scanning confocal microscopy after 14 days of culture (Target 40) of EPC cells seeded on a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 -PAH and whose intracellular marker (Factor of von Willebrand (vWF)) was labeled using the same method as for Figure 16B.
  • the adhesion and the spread of the cells on the support were evaluated by the appearance of the actin fibers. In light gray appears the intracellular marker (von Willebrand factor (vWF)) highlighted by a fluorochrome (Alexa® 488).
  • FIG. 16G represents the image obtained after observation by laser scanning confocal microscopy after 14 days of culture (objective 40) of EPC cells seeded on a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 -PAH and whose cytoskeleton is put into evidence by recognition by an antibody linked to a fluorochrome (Alexa® 488).
  • the adhesion and the spread of the cells on the support were evaluated by the appearance of the actin fibers. In light gray appears the cytoskeleton.
  • FIG. 16H represents the image obtained after observation by laser scanning confocal microscopy after 14 days of culture (objective 40) of EPC cells seeded on a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 -PAH and whose LDL was coupled to DiI (fluorescent molecule).
  • PHA-PSS polyelectrolyte multilayer
  • DiI fluorescent molecule
  • the ability of cells to incorporate LDL is a feature of the functionality of mature endothelial cells.
  • In gray appear the LDL coupled to DiI (fluorescent molecule).
  • In light gray appears the Syto 16 (marker specific to the nucleus) which makes it possible to show the perinuclear distribution of the LDL coupled to DiI.
  • FIG. 161 represents the image obtained after observation by laser scanning confocal microscopy after 14 days of culture (objective 40) of EPC cells seeded on a fibronectin layer and whose PECAM-I membrane receptor was labeled according to the same method as for Figure 16 A. Adhesion and spreading of cells on the support were evaluated by the appearance of actin fibers. In light gray appears the PECAM-I highlighted by a fluorochrome (Alexa® 488).
  • FIG. 16J represents the image obtained after observation by laser scanning confocal microscopy after 14 days of culture (Target 40) of EPC cells seeded on a layer of fibronectin and whose intracellular marker (von Willebrand factor (vWF)) was marked in the same manner as for Figure 16B.
  • the adhesion and the spread of the cells on the support were evaluated by the appearance of the actin fibers.
  • In light gray appears the intracellular marker (von Willebrand factor (vWF)) highlighted by a fluorochrome (Alexa® 488).
  • FIG. 16K represents the image obtained after observation by laser scanning confocal microscopy after 14 days of culture (Objective 40) of EPC cells seeded on a layer of fibronectin and whose cytoskeleton is demonstrated by recognition by an antibody bound to a fluorochrome (Alexa® 488).
  • the adhesion and the spread of the cells on the support were evaluated by the appearance of the actin fibers. In light gray appears the cytoskeleton.
  • FIG. 16L represents the image obtained after observation by laser scanning confocal microscopy after 14 days of culture (Target 40) of EPC cells seeded on a fibronectin layer and the LDL of which was coupled to DiI (fluorescent molecule).
  • DiI fluorescent molecule
  • Figure 17A shows a graph that corresponds to the semi-quantitative fluorescence study of Figures 16A, 16E and 161 for the PECAM-I membrane receptor.
  • the y-axis represents the gray level per pixel.
  • the x-axis represents the origin of the endothelial cells:
  • JVE jugular vein
  • Figure 17B shows a graph that corresponds to the semi-quantitative fluorescence study of Figures 16B, 16F and 16J for the vWF intracellular marker.
  • the y-axis represents the gray level per pixel.
  • the x-axis represents the origin of the endothelial cells:
  • JVE jugular vein
  • Fig. 17C shows a graph which corresponds to the semi-quantitative fluorescence study of Figs. 16A, 16E and 161 for Di-coupled LDL with Sito 16.
  • the y-axis represents the gray level per pixel.
  • the x-axis represents the origin of the endothelial cells:
  • JVE jugular vein
  • the 3-star symbol *** signifies that the fluorescence of the EPC cells seeded on a fibronectin layer is significantly different from that of endothelial cells of a jugular vein with a probability of error of less than 0.001%.
  • Figure 18 shows the result of the viability test by the PAlamar Blue® test of endothelial cells.
  • the x-axis represents the origin of the endothelial cells: endothelial cells of a jugular vein (JVE), EPC cells seeded on a layer of fibronectin after 14 days of culture (F) and EPC cells seeded on a polyelectrolyte multilayer after 14 days. days of culture (PEM).
  • the 2-star symbol ** means that the absorbance difference of EPC cells seeded on a fibronectin layer is significantly different from that of endothelial cells of a jugular vein with a probability of error of less than 0.05%.
  • FIG. 19 represents the schematic of the shear chamber used during the EPC differentiation study seeded on an artery on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 -PAH has been deposited.
  • PAH-PSS polyelectrolyte multilayer
  • Figure 20 shows the calibration curve of the peristaltic pump.
  • the y-axis represents the shear stress in Pascal.
  • the x-axis represents the graduation.
  • the glass slides are washed to highlight the silica (Si-) and make the surface of the slides negative.
  • the glass slides are washed for 15 min at 100 ° C in a solution of Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 0.01 M. Three washes are then performed with filtered distilled water. The slides are then immersed in a 0.12 M hydrochloric acid solution for 15 min at 100 ° C. Three washes are made with filtered distilled water. The slides are stored at 4 ° C. in filtered distilled water before treatment.
  • SDS Sodium Dodecyl Sulfate
  • Patches of ePTFE expanded polytetrafluoroethylene, 9 mm in diameter, are prepared from tubular vascular prostheses of PTFEe (6 mm internal diameter and 25 ⁇ m fibrillar length). These patches are then glued in 48-well culture plates. The polyelectrolyte multilayers are then constructed directly on the PTFEe inside the wells. Previous studies have shown the lack of cytotoxicity of the glue.
  • composition of the complete medium Composition of the culture medium for the cells
  • the arteries are recovered from the human umbilical cord. Using two surgical tweezers, the umbilical cord is dilated and artery lengths of at least 6 cm are isolated and immersed in Hank's Balanced Sister Solution HBSS. After several rinses, usually three to five (until the artery no longer contains blood) the arteries are placed in cryotubes containing 1 mL of a freezing solution, which consists of 70% supplemented complete medium 10% DiMethylSulfoxide (DMSO, Sigma, France) and 20% fetal calf serum (Gibco BRL, France), previously decomplemented at 56 ° C for 30 min.
  • DMSO DiMethylSulfoxide
  • Gibco BRL fetal calf serum
  • cryotubes are kept overnight at -80 ° C. and then immersed in liquid nitrogen at -180 ° C.
  • the shelf life is normally 6 months (time required to perform the serological tests during the use of allografts taken from corpses).
  • the umbilical arteries are thawed by immersing the cryotubes in a 37 ° C water bath. They are then washed with a decontamination solution, which consists of RPMI 1640 medium (Gibco BRL, France) supplemented with 100 IU / mL penicillin (Gibco BRL, France), 100 ⁇ g / mL streptomycin (Gibco BRL, France). ) and 2.5 ⁇ g / mL of Fungizone ® (Gibco BRL, France).
  • the artery lumen is washed three times with buffer (HBSS) and then filled with digestion solution (trypsin / EDTA 0.25%). After 20 minutes of incubation at 37 ° C., the artery is washed with 2 ml of medium containing complete serum.
  • the arteries referred to as "de-endothelialized arteries" are those that have undergone this process of cryopreservation.
  • Polyelectrolyte multilayers consist of the alternation of polycation and polyanion solutions. 1 . - . 2, 1 :. Material , used
  • TaffiEQn Tris / NaCl solution (10mM Tris and 15OmM NaCl).
  • PEI Polyethylenimine
  • PSS sodium-4-styrene sulfonate
  • MW 70kDa
  • the polyelectrolyte multilayers were deposited in the lumen of the de-endothelialized umbilical arteries, on glass slides or on PTFEe. These assemblies are made at room temperature by successive deposits of the support alternately in a polycation solution and polyanion. After two washes with Tris / NaCl buffer for the glass and arterial supports, and distilled water for the PTFEe support, the supports are put in contact
  • PAH polycation solution
  • PEI polycation solution
  • This step is followed by three washings with Tris / NaCl buffer for the glass and arterial supports, and distilled water for the PTFEe support, making it possible to displace the free polyelectrolytes.
  • the procedure is repeated with a polyanion solution (PSS) and then a polycation solution (PAH). A time of between 8 and 20 min is necessary to allow the PSS and PAH solutions to be alternately adsorbed on the support. Between each deposit, three washes, with Tris / NaCl buffer for the glass and arterial supports, and distilled water for the PTFEe support, are carried out.
  • PAH-PSS Polyelectrolytes
  • PAH-PSS Polyelectrolytes
  • PAH-PSS Polyelectrolytes
  • PAH and PEI- (PSS-PAH) 3 ending with a positive charge
  • All construction steps are done by holding the substrate in a solution of polyelectrolytes or distilled water to prevent drying out of the surface.
  • the cell culture plates containing the glass slides Prior to each experiment, the cell culture plates containing the glass slides are exposed to UV for 15 min thereby allowing sterilization.
  • the glass slides coated with fibronectin (Sigma, France) at a concentration of less than 250 ⁇ g / mL are used as positive controls.
  • the PTFEe support on which a polyelectrolyte multilayer PEI- (PSS-PAH) 3 was deposited is dried at least overnight at 4 ° C. after the deposition of the multilayer has been carried out and before their use. It is kept for a maximum of 15 days at 4 ° C.
  • TCPS tissue Culture Polystyrene Surface
  • the de-endothelialized arteries on which no polyelectrolyte multilayer has been deposited are subjected to several injections of wash buffer and are considered as control (control artery).
  • the arteries on which polyelectrolyte multilayers were deposited and the control arteries are stored overnight at 4 ° C. in a decontamination solution before use.
  • This consists of RPMI 1640 medium (Gibco BRL, France) supplemented with 100 IU / mL penicillin (Gibco BRL, France), 100 ⁇ g / mL streptomycin (Gibco BRL, France) and 2.5 ⁇ g / mL.
  • mL of Fungizone ® Gibco BRL, France.
  • FIGS. 2A to 2E show the demonstration of the covering of the entire internal surface of an artery by the polyelectrolyte multilayer [(PAH-PSS) 2 -PAH * -PSS-PAH *] thanks to the use of the polycation hydrochloride poly (allylamine) coupled to rhodamine (PAH *) during the construction of the polyelectrolyte multilayers.
  • the mechanical tests are carried out using a test bench developed in the laboratory. Pressure is provided by a pressure sensor (XTC-190M-0.35 BARVG, Kulite, Inc.) located at the outlet of the pump (EX3O3C-5O, Prodera, France). The information is representative of the pressure exerted on the internal walls of the artery.
  • the outer diameter of the artery is evaluated by a CCD camera (FZS 1024, Sensopart UK Ltd), which measures the deformation.
  • the CCD block delivers a voltage depending on the amount of light received by a neon, which serves as a source of standard light.
  • Each end of the artery (treated and control) is mounted on plastic tips, then the artery is fixed in a plexiglass chamber filled with physiological saline preheated to 37 0 C. It is necessary that the artery is well tense. Using a syringe with a hose, the inside of the artery is filled with saline water avoiding the formation of air bubbles. The free end of the artery is clamped to close the circuit. The pump thus increases the pressure in this closed circuit.
  • the parameters are entered in a software to control the pump.
  • the pressure in the artery increases steadily every 15 seconds up to 230 mm Hg (with an increment of 30 mm Hg).
  • the outer diameter of the artery is recorded for each pressure.
  • the percentage of deformation is calculated according to the following equation:
  • Dp the diameter corresponding to each pressure.
  • OD the diameter at 0 mmHg.
  • the elasticity of the arteries corresponds to the straight line ⁇ D on pressure, measured at physiological pressures (between 80 and 150 mmHg).
  • Figures 3 and 4 shows that the mechanical properties of the arterial wall after deposition of the polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 -PAH on a deendothelialized artery are restored.
  • the percentage of deformation of the artery as a function of the pressure exerted on this artery is similar for fresh arteries (•) and deendothelialized arteries on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PS S) 3 - PAH has been deposited (- * •), and is superior to that of deendothelialized arteries on which no polyelectrolyte multilayer has been deposited (B).
  • HBSS Hanks balanced salts
  • Trypsin is a proteolytic enzyme that hydrolyzes peptide bonds.
  • the endothelial cells required for this study are from human umbilical veins (HUVECs Human Umbilical Vein Endothelial Cells). They are taken from umbilical cords of newborns (donations from the Regional Maternity of Nancy). The cords come from healthy donors, after their consent. Collected from the placental expulsion, the cord is cut to a size of 20 to 25 cm and immediately put in a 75 cm 2 culture flask containing 150 ml of sterile HBSS. Placed quickly at 4 ° C, the cord is used as soon as possible. It can be kept between 4 and 6 hours.
  • the cells are cultured according to the method of Jaffe (E. A. Jaffe,
  • the HBSS buffer is removed from the box and the cord is placed in a sterile culture dish. The outside of the cord is cleaned with 75% ethanol. A valve is attached to one of the orifices of the umbilical vein and strongly ligated to the cord. Using a syringe, the vein is washed three times with HBSS buffer (filtered and preheated to 37 ° C) to remove blood. Then, the other end of the cord is clamped.
  • the cell suspension is centrifuged at 1200 rpm (300g) for 6 minutes at room temperature. After centrifugation and deposition of the supernatant, the cell pellet is resuspended in 10 ml of HBSS. Then a second centrifugation is performed. The cells are resuspended in 5 ml of complete medium, seeded in a 25 cm 2 culture flask and placed in an incubator at 37 ° C (5% CO 2 and 95% air) and saturated with moisture.
  • the cells are washed twice with HBSS buffer by making small oscillatory movements to remove red blood cells.
  • the cells are then put back into the incubator with 5 ml of complete medium.
  • the medium is renewed every two days. Normally, after 5-7 days, the cells are confluent.
  • the cells are washed twice with 5 ml of HBSS (preheated at 37 ° C.) and placed in contact with 5 ml of 0.125% trypsin-EDTA (filtered) at 37 ° C. for 3 minutes.
  • the digestion action of the trypsin is stopped by the addition of 5 ml of complete medium.
  • the cell suspension is collected in sterile conical tubes and then centrifuged at 1200 rpm (300g) for 6 minutes. The cells are then resuspended in 5 ml of complete medium.
  • the cells are seeded, after their second passage (P2), to the cell density of 5 ⁇ 10 4 cells / well on PTFEe on which the polyelectrolyte multilayer PEI- (PSS-PAH) 3 was deposited on PTFEe on which A monolayer of PAH was deposited on PTFEe alone and on TCPS (Tissue Culture Polystyrene Surface) (positive control).
  • P2 polyelectrolyte multilayer PEI-
  • PAH Polyelectrolyte multilayer PEI-
  • TCPS Tissue Culture Polystyrene Surface
  • Alamar blue redox assay (ABRA) (Alamar blue ® test) is a technique that has been used to monitor the viability of endothelial cells seeded to the vascular substitute (ePTFE). This technique makes it possible to quantitatively measure cell proliferation, cytotoxicity and viability.
  • Alamar blue is composed of a redox indicator (colorimetric indicator) that changes color depending on the chemical reduction of the culture medium. Alamar blue is reduced by the mitochondrial activity, representative of the cellular metabolic activity and thus of the cell viability.
  • Alamar Blue has interesting properties because it is soluble in the medium, stable in solution, non-toxic to cells and produces easily measurable changes. The test does not require lysis of the cells, which makes it possible to follow the kinetics of the signal.
  • the measurement of the cell viability is therefore based on the Alamar blue redox ratio determined by the difference between the densitometric measurement at 570 nm (absorbance of the reduced compound) and that at 630 nm (absorbance of the oxidized compound). Taking into account the partial recovery of the absorption spectra of the reduced compound (red) and the oxidized compound (blue), the absorbance is measured at 2 wavelengths and the difference in optical density (OD) is determined according to the formula:
  • the procedure is as follows.
  • the Alamar blue test is performed according to the chosen protocol. Endothelial cells are seeded on the surfaces for 1, 3, or 7 days. At the chosen time, the culture medium is replaced by a fresh serum-free medium containing 10% v / v of Alamar blue (the sensitivity of the Alamar blue technique depends on the volumetric ratio between Alamar blue and the DMEM medium (Dulbecco's Modi ⁇ ed Eagle Medium) without phenol red (GibcoBRL, France)). 500 ⁇ L of this mixture is deposited in each well. The culture plate is placed in the incubator at 37 ° C.
  • FIG. 5 shows the result of the endothelial cell viability test inoculated on:
  • the observed metabolic activity values for the PTFEe on which the polyelectrolyte multilayer PEI- (PSS-PAH) 3 (0.59 ⁇ 0.20) was deposited were similar to those observed for the TCPS support.
  • the metabolic activity values observed for the PTFEe on which the PAH polyelectrolyte was deposited and for the PTFEe alone are significantly lower than those observed for the PTFEe on which the multilayer has been deposited. of polyelectrolytes PEI- (PSS-PAH) 3 .
  • the endothelial cells therefore began to proliferate on the PTFEe on which the polyelectrolyte multilayer PEI- (PSS-PAH) 3 was deposited after three days of culture and the maturation to obtain confluent cells takes place within seven days of culture.
  • a low cell density (5.10 4 cells / cm 2 ) was sufficient to obtain a monolayer of confluent cells.
  • Figures 6A, 6B, 6C, 6D and 6E show that after 7 days of culture: the endothelial cells seeded on the PTFEe support (control) are few in number and have a round appearance, representative of poor spreading and poor adhesion of the cells to this support (FIGS. 6A and 6B),
  • the endothelial cells seeded on the polyelectrolyte multilayer PEI- (PSS-PAH) 3 deposited on the PTFEe support are numerous and spread out, which means that they are adherent to the multilayer; a confluent monolayer of endothelial cells was obtained in less than seven days of culture; the cell density is high and it is difficult to differentiate cells from each other; a homogeneous distribution is observed.
  • the phenotype of endothelial cells is evaluated by the expression of von Willebrand factor (vWf) in confocal microscopy.
  • vWf von Willebrand factor
  • the nuclei are labeled with propidium iodide.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • PAF paraformaldehyde
  • the cells are permeabilized using 0.5% Triton-X100 (Sigma, France) in PBS.
  • the cells are then incubated for 45 minutes with an anti-human mouse monoclonal antibody vWf (clone F8 / 86, Dako, Trappes, France) diluted 1/50 in 0.1% Triton.
  • the cells are then washed with DMEM in order to remove excess antibodies and are incubated for 30 minutes with an anti-mouse IgG anti-mouse polyclonal conjugate conjugated to Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Oregon, USA) diluted at 1 / 100th in DMEM.
  • Isotype control is prepared under the same conditions.
  • IP propidium iodide
  • ⁇ excitation 535 nm
  • emission 617 nm
  • Molecular Probes 1 mg / ml in distilled water
  • the labeled cells are then visualized under a laser scanning confocal microscope using a 40 objective and a He-Ne laser for 543nm excitation (IP) and an Ar laser for 488 nm excitation (vWf).
  • FIG. 7 shows that all the cells adhering to the polyelectrolyte multilayer PEI- (PSS-PAH) 3 deposited on the PTFEe support express the factor vWF, endothelial cell characteristics after 7 days of culture.
  • the medium used is that described in paragraph 1.1.3. "Composition of the complete medium” above. t . Cells . used The cells used are those described in paragraph 3.1.2. "Cells used"
  • An umbilical cord is placed in a sterile Petri dish. The outside of the bead is cleaned with 70 ° ethanol. The opening of the umbilical vein is marked with forceps to insert a sterile stopcock. To remove blood from the umbilical vein, the vein is washed three times with HBSS (Hank's Balanced Sense Solution) buffer. The umbilical vein is then filled with 15 to 20 ml of a digestion solution preheated to 37 ° C (trypsin / EDTA 0.25%). The cord, immersed in HBSS buffer, is placed in a water bath. After 12 min of incubation, the digestion solution is collected in a 50 ml flask containing 5 ml of complete medium.
  • HBSS Hort's Balanced Sense Solution
  • the vein is washed with HBSS buffer.
  • the cell suspension is centrifuged at 300 g for 10 min at room temperature.
  • the cell pellet is resuspended in 10 mL of HBSS buffer.
  • After the second wash the cells are resuspended in 5 mL of complete medium.
  • the endothelial cells (HUVEC) are seeded in a culture flask of 25 cm 2 and placed in an incubator at 37 ° C (5% CO 2 and 95% air).
  • the culture medium is removed and the cells are washed twice with 5 ml of HBSS buffer without Ca 2+ or Mg 2+ .
  • This washing makes it possible on the one hand to eliminate the serum which inhibits the enzymatic activity of trypsin, and on the other hand to release Ca 2+ ions which, secondarily, facilitate the detachment of the cells.
  • the cells are then detached with 5 mL of Trypsin-EDTA solution 0.125%.
  • the action of trypsin is stopped after 2 min at 37 ° C by adding 10 ml of complete medium.
  • the cell suspension is collected in a sterile 50 ml Falcon tube and centrifuged at 300 g. The cell pellet is resuspended in complete medium.
  • the second passage (Pl) 5 the cells are then seeded at a cell density of 10 5 cells / cm 2 in the different matrices (arteries on which were deposited a multilayer polyelectrolyte (PAH-PSS) 3 -PAH and controls arteries) .
  • the endothelialized substitutes are placed in sterile Falcon with gentle stirring for 4 hours. They are cultured in an incubator at 37 ° C, 5% CO 2 for 7 days.
  • FIGS. 8A to 8D show that the endothelial cells cover the entire luminal surface of the re-endothelialized artery on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 -PAH has been deposited.
  • Figures 8C and 8D show the maintenance of the endothelial phenotype after endothelialization.
  • FIGS. 9A to 9C show that the spreading of the endothelial cells seeded on the artery on which the polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 -PAH (9B) has been deposited is close to the control (fresh artery 9C) and is better than that on the artery on which no multilayer has been deposited (9A).
  • PAH-PSS polyelectrolyte multilayer
  • the retention evaluation of the HUVECs seeded in the lumen of the arteries is performed in a flow chamber developed in the laboratory.
  • the endothelial cells are exposed to laminar flows of 1 Pa (10 dynes / cm 2 ) for a period of one hour.
  • a peristaltic pump (Ismatech, Switzerland) allows circulation of the culture medium. Upstream of the chamber, two syringes are added to the circuit, creating a sinusoidal modulation to dampen the parasitic fluctuations of the flow. A gaseous mixture (5% CO 2 and 95% air) is introduced into the medium tank to regulate pH variations. The system is placed in an oven at 37 ° C.
  • the shear stress is calculated by the following equation:
  • the value of the flow rate of the peristaltic pump makes it possible to know the shear stress exerted in the lumen of the artery.
  • the peristaltic pump has been calibrated by measuring the flow rate as a function of the speed of rotation.
  • FIGS. 10A to 1 OD show that, after having subjected the arteries to a shear stress of 1 Pa for one hour, detachment of the endothelial cells is observed on the endothelialized arteries on which no polyelectrolyte multilayer has been deposited (arrows) .
  • the endothelial cell layer is always present.
  • FIGS. 1A-1I show that, after having subjected the arteries to a shear stress of 1 Pa for one hour, detachment of the endothelial cells is observed on the endothelialized arteries on which no polyelectrolyte multilayer has been deposited ( arrows).
  • the endothelial cell layer is still present.
  • the junctions between the cells are no longer visible, which means that the staging of the endothelial cells is very good.
  • FIGS. 10A to 10D and HA to HD show that the retention of the endothelial cells seeded on the inner surface of the arteries on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 -PAH was deposited is better than that of the seeded endothelial cells. on the inner surface of the arteries on which no multilayer has been deposited.
  • PAH-PSS polyelectrolyte multilayer
  • vascular substitutes umbilical arteries
  • PH-PSS polyelectrolyte multilayer
  • De-endothelialized untreated arteries are used as a control.
  • Induction of anesthesia is performed, via the external marginal vein of the ear, by means of an intravenous catheter (Salva Epicranial Needle, COOPER, Rhone-Poulenc Rorer, Melun, France), by slow injection of a dose of 40 mg / kg of sodium pentobarbital (Ceva Santé Animale, France), diluted quarterly in physiological saline (NaCl 0.9% Cooper, Rhône-Poulenc, France).
  • pentobarbital sodium does not appear to alter the behavior of neutrophils or platelets.
  • the effectiveness of the anesthesia is verified before the start of any surgical procedure by interdigital pinching of the hind paw of the rabbit.
  • Anesthesia is maintained by intravenous injection (marginal vein of the ear) of pentobarbital diluted 1 A in physiological saline iteratively.
  • the anesthetized animal is placed supine on the heating table and its body temperature is kept constant at 37 ° C. Surgical areas are shaved and then disinfected with polyvidone iodine (10% Dermal Betadine TM Laboratory Sarget, Mérignac, France).
  • the wound is cleaned with iodinated polyvidone and the skin is sutured with 2 - 0 polyglactin (Vicryl, Ethicon).
  • the animal is then returned to the animal house under the conditions described above.
  • an arteriotomy (0.5 cm) is performed proximally, at a distance of about 1 cm from the clamp, and distally to insert the vascular graft by end-to-side grafting.
  • the anastomosis is performed using vascular threads 8 - 0.
  • the carotid artery is ligated and the blood circulation in the graft is verified. 6, 1: 6.
  • the grafts and the control carotides are removed, gently rinsed with heparinized physiological saline, and then subjected to macroscopic and microscopic examinations.
  • the animals are euthanized by injection of a lethal dose of pentobarbital sodium, in accordance with the recommendations published by the European Commission (Decree No. 2001-131 of 6 February 2001, related to the European Directive 86-609-EEC of 1986).
  • the death of the animal is observed after respiratory and cardiac arrest.
  • the arteries on which a polyelectrolyte multilayer has been deposited remain permeable after 1 week and up to 3 months of implantation, with weekly monitoring of the passage of blood through the arteries.
  • the functionality of arterial substitutes is followed on a vigilant animal by a non-invasive technique: the "echo-doppler".
  • This device made it possible to measure the speed of the blood as well as the evolution of the diameter of the arterial substitutes.
  • the plots obtained show that the artery on which a polyelectrolyte multilayer (PAH-PSS) 3 has been deposited has good permeability.
  • the calculation of the area under the curve of the plots shows that the blood velocity in the arterial substitute is equal to that measured in the control carotid.
  • the measurement of the diameter of each arterial substitute shows no dilatation or aneurysm.
  • composition of the culture medium of p . endothelial regenerators Composition of the culture medium of p . endothelial regenerators:
  • EBM-2 supplemented with a growth factor cocktail (VEGF, hydrocortisone, hFGF, IGF, Ascorbic Ac, hEGF, heparin) (Single Quot ® ) (Clonetics,
  • a leukocyte fraction of the peripheral circulation was obtained after separation by a density gradient.
  • a mixture of blood and heparin PBS (Phosphate Buffer Saline) (10 mL of blood in 16 raL of PBS) is added slowly to 10 mL of Histopaque ® 1077 (Sigma, France) and centrifuged at 400 g for 30 min.
  • the leukocyte ring is aspirated with a sterile pasteur pipette and transferred to a 50 ml tube containing 10 ml of MCDB 131 (Gibco, France) supplemented with 5 U / ml of sodium heparin (Sigma, France).
  • the tube is then centrifuged at 250 g for 10 min, the supernatant is removed and the pellet is resuspended in 10 ml of heparin MCDB 131. This last operation is repeated three times.
  • the pellet is then resuspended in EBM-2 culture medium supplemented with a growth factor cocktail (Single Quot ®) (Clonetics, Belgium).
  • About l * 10 of 6 EPC (Endothelial Progenitor Cell) per cm 2 are cultured in a culture flask of 25 cm 2 treated with fibronectin (20 ug / mL) or a polyelectrolyte multilayer (PAH- PSS) 3 - PAH.
  • the culture medium is changed after four days which eliminates the non-adherent cells, then every other day. These cells are cultured for 2 weeks at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Figures 15A to 15F show images obtained after observation by phase contrast microscopy and illustrates the differentiation of endothelial progenitors into mature endothelial cells.
  • a monolayer of cells is obtained after 14 days of culture (addition of growth factors (VEGF, hydrocortisone, hFGF, IGF, Ascorbic Ac, hEGF, heparin) in the middle).
  • the morphological appearance of the monolayer obtained is similar to that of mature endothelial cells derived from the rabbit jugular vein (JVEC). In comparison, 60 days are required to obtain a monolayer of cells on a glass slide coated with fibronectin.
  • the phenotypic characterization of the cells after 14 days of culture is carried out by observation by confocal microscopy with laser scanning (FIGS. 16A to 16L).
  • the cell monolayer obtained on the polyelectrolyte multilayer corresponds well to a monolayer of endothelial cells (PECAM-I, vWF positive).
  • the cells are functional because they have acquired the ability to incorporate LDL. These cells also express actin fibers, a sign of good adhesion and good spreading.
  • the cell monolayer obtained on the polyelectrolyte multilayer corresponds well to a monolayer of endothelial cells (PECAM-I, vWF positive);
  • endothelial cells derived from the EPCs seeded on a fibronectin layer after 14 days of culture were less proliferated than the endothelial cells derived from EPCs seeded on a multilayer of polyelectrolytes after 14 days of culture.
  • Figure 18 shows the result of a cell viability test with Alamar Blue®. The principle and procedure of this test were explained in Example 3.
  • Figure 14 shows that the polyelectrolyte multilayer has no impact on the viability of the progenitors. A significant difference is observed between the endothelial cells resulting from the seeding of EPC on a multilayer of polyelectrolytes, and those resulting from the seeding of EPC on fibronectin. A good metabolic activity of the cells, sign of a good cell proliferation, is observed for the endothelial cells resulting from the seeding of EPC on a multilayer of polyelectrolytes.
  • EPCs derived from peripheral blood of rabbits are recovered and the cells are counted on a Thoma cell. Viability is estimated using the Trypan blue exclusion test (Sigma, France). One volume of the final Trypan blue solution is added to the same volume of cell suspension. Cells that do not allow dye entry are considered alive.
  • the cell suspension is adjusted and injected into the various matrices (arteries on which a polyelectrolyte monolayer (PAH-PSS) 3 -PAH has been deposited, and the control arteries) (with a length of 4 cm), the cell density is 1 x 10 cells / cm.
  • the endothelialized substitutes are placed in sterile Falcon with gentle stirring for 4 hours.
  • the arteries are then placed in flasks (one artery per flask) of culture and put in an incubator at 37 ° C (5% CO 2 and 95% air).
  • the cultivation time is one week.
  • a peristaltic pump allows circulation of the culture medium without growth factors. Upstream of the chamber, two syringes are added to the circuit, creating a sinusoidal modulation to dampen the parasitic fluctuations of the flow. A gaseous mixture (5% CO 2 and 95% air) is introduced into the medium tank to regulate the pH variations. The system is placed in an oven at 37 ° C.
  • the shear stress is calculated by the following equation:
  • the value of the flow rate of the peristaltic pump makes it possible to know the shear stress exerted in the lumen of the artery.
  • the peristaltic pump has been calibrated by measuring the flow rate as a function of the speed of rotation.
  • the flow rate of the peristaltic pump is calibrated by the graduation of the rotational speed ( Figure 20).
  • the evaluation of the retention of mature endothelial cells on the support is carried out by: counting of the cells in the medium, evaluation of their presence on the matrix by scanning electron microscopy, verification of the phenotype by confocal microscope (marking of PECAM 1, vWF , VEGFR2 and incorporation of LDL, as in Section 7.3.2.)
  • the culture supports are glass slides:
  • the culture medium is the following: alpha MEM + 0, 5% or 2% FCS
  • Human mesenchymal stem cells are cultured with a seed density of 5.10 3 cells per cm 2 .
  • the methods of differentiation into endothelial cells are:
  • VEGF growth factor 50 ng / mL
  • the incubator is at 37 ° C. under 5% CO 2 .
  • the shear stresses in the flow chamber are 0.5 Pa, 1 Pa, 1.5 Pa, 2 Pa for 24 h, 48 h, 72 h or 96 h started at 7 days of culture (culture time after which the cells are confluent).
  • the evaluation of the angiogenic potential can be carried out by
  • VE-cadherin CD 144
  • vWF von Willebrand factor
  • PECAM-I CD31
  • VEcadherin genetic expression of endothelial markers: VEcadherin, VEGFR2 / R1, CD31, vWF.

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'un ensemble comprenant un support et des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, pour la mise en œuvre d'un procédé de prolifération de cellules initiales, souches ou différenciées, mises en contact avec le susdit ensemble, et, l'obtention d'un recouvrement du susdit ensemble par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales, le susdit recouvrement étant obtenu au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours, notamment 11 jours, en particulier 7 jours, après la mise en contact des susdites cellules initiales avec le susdit ensemble.

Description

PROCÉDÉ DE PROLIFÉRATION DE CELLULES SUR DES MULTICOUCHES DE
POLYÉLECTROLYTES ET SON APPLICATION, NOTAMMENT A LA
PRÉPARATION DE BIOMATÉRIAUX CELLULARISÉS
Cette invention a pour objet un procédé de prolifération de cellules sur des multicouches de polyélectrolytes et son application, notamment à la préparation de biomatériaux cellularisés.
Les polyélectrolytes sont des polymères dont les monomères portent un groupe électrolytique. Ces polymères sont donc chargés. Le dépôt couche par couche de polyélectrolytes est une méthode simple pour concevoir des surfaces ayant des propriétés particulières [a) G. Decher, J. B. Schlenoff, Multilayer thin films : Sequential Assembly of Nanocomposite Materials, Wiley-VCH, Weinheim, 2003. b) G. Decher, Science 277, 1232, 1997]. Par des trempages ou dépôts successifs d'un support alternativement dans une solution de polyanions et de polycations, on prépare un ensemble : support et multicouche de polyélectrolytes, dans laquelle les couches anioniques et cationiques sont alternées. Le moteur de la croissance de ces multicouches réside dans l'excès de charges qui apparaît après chaque nouveau dépôt d'un polyélectrolyte et qui permet ainsi une nouvelle interaction avec le polyélectrolyte de signe opposé. Cette méthode de traitement est simple d'utilisation, s'applique quelle que soit la géométrie du support et ne met généralement en œuvre que des solutions aqueuses. Les propriétés physicochimiques, viscoélastiques, structurales, de rugosité de surface et de mouillabilité de l'ensemble support et multicouche de polyélectrolytes peuvent être ajustées selon l'utilisation requise [A. Izquierdo, S. Ono, J.C. Voegel, P. Schaaf, G. Decher, Langmuir, 21, 7558, 2005].
L'utilisation de multicouches de polyélectrolytes permet de fonctionnaliser des surfaces. L'amélioration de l'interaction entre des cellules et des surfaces est importante dans les domaines de la médecine, des biomatériaux et de la biotechnologie.
Des interactions électrostatiques existent entre les supports chargés négativement (par exemple le verre ou le polytétrafluoroéthylène expansé PTFEe) et les cellules globalement chargées négativement, ce qui défavorise l'adhésion de cellules sur ces supports. La formation d'une multicouche de polyélectrolytes sur un biomatériau permet de favoriser l'adhérence et la prolifération de cellules.
Les multicouches de polyélectrolytes ont été utilisées pour la prolifération de cellules différenciées, par exemple des cellules endothéliales sur un support lame de verre [C. Boura, P. Menu, E. Payan, C. Picart, J.C. Voegel, S. Muller, J.F. Stoltz, Biomaterials 24, 3521, 2003] et des cellules nerveuses sur du support TCPS (polystyrène dit « traité pour culture cellulaire ») [S. Forry, D. Reyes, M. Gaitan, L. Locascio, Langmuir 22, 5770, 2006].
D'autres techniques sont utilisées dans l'art antérieur pour favoriser l'adhérence de cellules sur des supports, en particulier le recouvrement des supports par des constituants de la matrice extracellulaire tels que : le collagène [H. Itoh, Y. Aso, M. Furuse, Y. Noishiki, T. Miyata, Artif. Organs, 25, 213, 2001], la fibronectine [A. Rademacher, M. Paulitschke, R. Meyer, R. Hetzer, Int. J. Artif. Organs, 24, 235, 2001], la laminine [A. Sank, K. Rostami, F. Weaver, D. Ertl, A. Yellin, M. Nimni, T. L. Tuan. Am. J. Surg. 164, 199, 1992], la gélatine [J. S. Budd, P. R. Bell, R. F. James. Br. J. Surg. 76, 1259, 1989], la poly-lysine [a) J. S. Budd, P. R. Bell, R. F. James, Br. J. Surg. 16, 1259, 1989, b), G. Stansby, N. Shukla, B. Fuller, G. Hamilton. Br. J. Surg. 78, 1189, 1991]. La fibronectine est, à ce jour, la protéine la plus efficace pour augmenter l'attachement et la rétention cellulaire. Les travaux publiés à la suite des investigations cliniques ont montré une forte hydrolyse de la fibronectine peu compatible avec une utilisation in vivo de cette protéine [A. Tiwari, H. J. Salacinski, G. Punshon, G. Hamilton, A. M. Seifalian, FASEB J. 16, 791, 2002]. L'amélioration de l'adhérence de cellules sur des supports pour la préparation de greffons qui seront utilisés in vivo est donc nécessaire.
De plus, l'utilisation de ces différents constituants hétérologues (origine humaine mais souvent animale) et la nécessité de temps de prolifération longs sont parfois incompatibles avec les exigences thérapeutiques (par exemple vaisseaux artificiels ou greffe de peau) .
Par ailleurs, les techniques de prolifération de cellules pour la préparation de greffons sont réalisées en deux étapes avec les techniques de l'homme de l'art : une première étape de maturation, prolifération, et différenciation de cellules souches et/ou l'expansion de cellules différenciées sur un premier support, puis détachement des cellules et ensemencement sur un autre support qui sera greffé. La nécessité d'utiliser deux supports, et donc d'avoir à détacher puis re-ensemencer les cellules est coûteuse en temps et augmente les risques de contamination.
L'un des aspects de l'invention est de fournir un procédé de prolifération de cellules, différenciées ou non, qui soit suffisamment rapide pour la préparation de greffons.
L'un des aspects de l'invention est de fournir un procédé de prolifération de cellules, différenciées ou non, dans lequel la prolifération, la maturation et éventuellement la différenciation des cellules ont lieu sur le même support que celui qui est destiné à être greffé.
L'un des autres aspects de l'invention est de fournir des matériaux recouverts de cellules viables, tels que de la peau artificielle ou des substituts de vaisseaux ou d'artères. Dans l'un de ces aspects les plus généraux, l'invention concerne l'utilisation d'un ensemble comprenant un support et des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support,
- pour la mise en œuvre d'un procédé de prolifération de cellules initiales, souches ou différenciées, mises en contact avec le susdit ensemble, et,
- l'obtention d'un recouvrement du susdit ensemble par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales,
- le susdit recouvrement étant obtenu au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours, notamment 11 jours, en particulier 7 jours, après la mise en contact des susdites cellules initiales avec le susdit ensemble.
Dans le cas des cellules souches, le procédé comprend en outre une étape de différentiation qui a également lieu sur l'ensemble susmentionné.
L'un des aspects de l'invention concerne l'utilisation de multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support, les dites multicouches :
- étant éventuellement revêtues, partiellement ou complètement, d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives,
- et / ou comprenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées,
* pour la mise en œuvre d'un procédé de prolifération de cellules initiales, souches ou différenciées, mises en contact
- avec les susdites multicouches de polyélectrolytes
- ou avec le susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives revêtant les susdites multicouches de polyélectrolytes,
* et l'obtention d'un recouvrement
- des susdites multicouches de polyélectrolytes
- ou du susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales, * le susdit recouvrement étant obtenu au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours, notamment 11 jours, en particulier 7 jours, après la mise en contact des susdites cellules initiales,
- avec les susdites multicouches de polyélectrolytes
- ou avec le susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives. L'invention repose sur la mise en évidence que l'obtention d'une couche de cellules viables, confluentes et adhérentes est plus rapide qu'avec les techniques de l'homme de l'art.
Dans le cas particulier de l'utilisation de l'invention pour la préparation de tissus qui seront utilisés comme greffons (par exemple des substituts de vaisseaux ou d'artères), l'invention repose sur la mise en évidence du gain de temps et de moyen apporté par l'utilisation de multicouches de polyélectrolytes pour la maturation la prolifération, et la différenciation de cellules souches et / ou pour la prolifération de cellules différenciées. En effet, la maturation la prolifération, et la différenciation de cellules souches et / ou la prolifération de cellules différenciées peuvent être effectuées directement sur le support qui sera utilisé pour la greffe, à la différence des techniques de l'homme de l'art qui sont effectuées en deux étapes :
- maturation, prolifération et différenciation de cellules souches et / ou prolifération de cellules différenciées sur un premier support, puis
- détachement des cellules et ensemencement sur un autre support qui sera greffé.
Par « support », on désigne tout matériau sur lequel le dépôt couche par couche de polyélectrolytes peut être effectué.
Par « polyélectrolytes », on désigne des polymères dont les monomères portent un groupe électrolytique.
Par « multicouches de polyélectrolytes », on désigne l'ensemble des couches obtenues par le dépôt couche par couche de polyélectrolytes [G. Decher, J. B. Schlenoff, Multilayer thin films : Sequential Assembly of Nanocomposite Materials, Wiley-VCH, Weinheim, 2003].
Par « couche supérieure de polyélectrolytes», on désigne la dernière couche de polyélectrolytes déposée par la technique de dépôt couche par couche.
Par « couches internes de polyélectrolytes», on désigne les couches de polyélectrolytes situées entre le support et la couche supérieure de polyélectrolytes.
Par « polycation », on désigne un polymère qui est globalement chargé positivement, «globalement chargé positivement » signifiant que la charge totale est positive, mais cela n'exclut pas la présence de monomères chargés négativement dans le polymère. Par « polyanion », on désigne un polymère qui est globalement chargé négativement, «globalement chargé négativement » signifiant que la charge totale est négative, mais cela n'exclut pas la présence de monomères chargés positivement dans le polymère.
Par « molécules biologiques », on désigne des molécules qui participent au processus métabolique et à l'entretien d'un organisme vivant, par exemple des protéines, de l'ADN, de l'ARN, des cytokines, des facteurs de croissance, par exemple ceux nécessaires au recrutement et à la différenciation du type cellulaire voulu (notamment VEGF dans le cas des cellules vasculaires).
Par « molécules biologiquement actives », on désigne des molécules qui ont des propriétés curatives ou préventives, par exemple qui accélèrent ou réduisent la différenciation et / ou la prolifération cellulaires, ou par exemple des médicaments (notamment VEGF dans le cas d'une ischémie, ou le taxol dans le cas de cancers).
L'expression « multicouches revêtues d'un ensemble de molécules », signifie qu'un ensemble de molécules est déposé à la surface des multicouches. Les molécules peuvent être adsorbées en surface. Des interactions existent entre les molécules et la couche supérieure de polyélectrolytes mais les molécules peuvent également être enfouies entre les couches des polyélectrolytes plus internes de la multicouche. Par exemple, dans le cas où la molécule est une protéine globalement chargée positivement revêtant une multicouche de polyélectrolytes dont la couche supérieure de polyélectrolytes est un polyanion, les interactions électrostatiques principales seront celles entre les charges positives de la protéine et les charges négatives de la couche supérieure de polyélectrolytes. Cependant, une protéine globalement chargée positivement peut contenir des acides aminés chargés négativement, qui n'interagissent pas avec la couche supérieure du polyélectrolyte, mais plutôt avec les polyélectrolytes chargés positivement de la couche interne de polyélectrolytes.
L'expression « complètement revêtues», signifie que les molécules revêtent toute la surface de la multicouche de polyélectrolytes. L'expression « partiellement revêtues», signifie que les molécules ne sont présentes qu'à certains endroits sur la multicouche de polyélectrolytes. Ce revêtement partiel peut être obtenue par des techniques de sprays, telles que celles utilisées dans les publications [Porcel et al., Langmuir 22, 4376-83, 2006 et Porcel et al., Langmuir 21, 800-02, 2005]. Des images au microscope à fluorescence laser ou microscope à forces atomiques peuvent permettre de déterminer si le revêtement est partiel ou complet L'expression « comprenant des molécules biologiques ou biologiquement actives », signifie que des molécules sont présentes dans la multicouche de polyélectrolytes. Ces molécules sont intégrées entre les couches de polyélectrolytes de la multicouche de polyélectrolytes. Les techniques d'intégration de molécules entre des polyélectrolytes sont explicitées dans les publications de N. Jessel, M.Oulad-Abdelghani, F. Meyer, P. Lavalle, Y. Haîkel, P. Schaaf, J.C. Voegel, PNAS 103, 8618, 2006 (exemple d'intégration de molécule biologiquement active, la β-cyclodextrine) et de A. Dierich, E. Le Guen, N. Messaddeq, J.F. Stoltz, P. Netter, P. Schaaf, J.C. Voegel, N. Benkirane- Jessel, Adv. Mater. 16, 693, 2007 (exemple d'intégration de facteurs de croissance TGFβi).
Par « couches adjacentes », on désigne deux couches de polyélectrolytes qui ont été déposées l'une après l'autre lors de la formation de la multicouche de polyélectrolytes.
Par « propriétés de la multicouche de polyélectrolytes », on désigne les propriétés physicochimiques, notamment la viscoélasticité, la rugosité de surface et la mouillabilité de la multicouche de polyélectrolytes.
Par « propriétés biologiques des dites molécules », on désigne les propriétés curatives ou préventives des molécules biologiquement actives.
Par « prolifération de cellules», on désigne la division et la maturation de cellules. Par « cellules initiales », on désigne les cellules qui sont mise en contact initialement avec la multicouche de polyélectrolytes.
Par « recouvrement des multicouches par des cellules», on désigne l'obtention d'une couche, de préférence une monocouche, de cellules déposée sur la multicouche de polyélectrolytes. Les cellules peuvent être adsorbées sur la couche supérieure de polyélectrolytes de la multicouche, mais il peut également exister des interactions avec des couches internes de polyélectrolytes de la multicouche de polyélectrolytes. Ces interactions peuvent par exemple être des liaisons ioniques, hydrogène, de Van der Waals...
Par « cellules adhérentes », on désigne des cellules qui adhèrent à la multicouche de polyélectrolytes ou aux éventuelles molécules biologiques ou biologiquement actives qui la revête. Cette adhérence peut par exemple être visualisée par des images de coupes histologiques ou d'observation au microscope électronique à balayage et confirmée au travers de l'expression de marqueurs spécifiques des cellules (par exemple, les intégrines et l'arrangement du cytosquelette) Par « cellules viables », on désigne des cellules qui sont capables de survivre. La viabilité cellulaire peut par exemple être déterminée par le test ABRA (Alamar Blue® redox assay).
Par « cellules confluentes », on désigne des cellules dont les membranes cellulaires établissent des jonctions. Ceci se produit quand les cellules initiales mises en culture ont proliféré de façon à occuper tout l'espace disponible en une monocouche. La confluence peut être mise en évidence par des images obtenues en microscopie à contraste de phase ou à balayage laser.
Par « cellules issues de la prolifération des cellules initiales », on désigne les cellules issues de la division, de la maturation, et éventuellement de la différentiation (lorsque les cellules initiales sont des cellules souches), des cellules initiales.
Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation de multicouches de polyélectrolytes déposés sur un support, les dites multicouches :
- étant éventuellement revêtues, partiellement ou complètement, d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives,
- et / ou comprenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que les liaisons chimiques éventuelles entre les susdites molécules et les couches de polyélectrolytes ne soient pas de nature covalente, pour :
* la mise en œuvre d'un procédé de prolifération de cellules initiales, souches ou différenciées, mises en contact
- avec les susdites multicouches de polyélectrolytes
- ou avec le susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives revêtant les susdites multicouches de polyélectrolytes,
* et l'obtention d'un recouvrement
- des susdites multicouches de polyélectrolytes
- ou du susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales,
* le susdit recouvrement étant obtenu au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours, notamment 11 jours, en particulier 7 jours, après la mise en contact des susdites cellules initiales,
- avec les susdites multicouches de polyélectrolytes
- ou avec le susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives. L'expression « liaison chimique n'étant pas de nature covalente », signifie que les liaisons entre les molécules et les couches de polyélectrolytes sont, par exemple, des liaisons ioniques, hydrogène, de Van der Waals, qui ne modifient pas les propriétés des molécules et de la multicouche de polyélectrolytes.
Selon un des aspects de l'invention, la couche supérieure de polyélectrolytes des multicouches est un polycation et les multicouches ne sont pas revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et ne contiennent pas de molécules biologiques ou biologiquement actives intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes.
Lorsque la couche supérieure de polyélectrolytes est chargée positivement, les cellules, dont la membrane est chargée négativement, adhèrent en général sur la multicouche de polyélectrolytes.
Selon un autre des aspects de l'invention, la couche supérieure de polyélectrolytes des multicouches est un polyanion et les multicouches ne sont pas revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et ne contiennent pas de molécules biologiques ou biologiquement actives intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes.
Lorsque la couche supérieure de polyélectrolytes est chargée négativement, les cellules, dont la membrane est chargée négativement, n'adhèrent en général pas sur la multicouche de polyélectrolytes (interactions électrostatiques répulsives).
Ces deux derniers cas correspondent à l'utilisation d'une multicouche de polyélectrolytes pour la prolifération de cellules sans intervention de molécules biologiques ou biologiquement actives.
Selon un des aspects de l'invention, la couche supérieure de polyélectrolytes des multicouches est un polycation et dans laquelle les multicouches sont revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et contiennent éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes.
Selon un autre des aspects de l'invention, la couche supérieure de polyélectrolytes des multicouches est un polyanion et dans laquelle les multicouches sont revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et contiennent éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes.
Ces deux derniers aspects concernent différents cas : - les multicouches sont revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et dans ce cas les cellules adhèrent sur cet ensemble de molécules, ou,
- les multicouches contiennent des molécules biologiques ou biologiquement actives intégrées entre au moins deux couches adjacentes, et dans ce cas les cellules adhèrent sur les multicouches de polyélectrolytes, ou,
- les multicouches sont revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et elles contiennent des molécules biologiques ou biologiquement actives intégrées entre au moins deux couches adjacentes et dans ce cas les cellules adhèrent sur cet ensemble de molécules.
Lorsque la couche supérieure de polyélectrolytes est chargée négativement, et donc lorsque les cellules n'adhèrent pas sur la multicouche, le revêtement de la multicouche de polyélectrolytes par des molécules biologiques est particulièrement avantageux car il peut permettre d'inverser la polarité du support et donc de favoriser l'adhérence des cellules.
Par exemple, la couche supérieure d'une multicouche (PAH-PSS)3 est chargée négativement et les cellules n'adhèrent généralement pas. Si des protéines globalement chargées positivement revêtent la multicouche, la polarité de la surface est inversée et l'adhérence des cellules est favorisée.
Dans la présente invention et selon un mode de réalisation avantageux, les cellules initiales sont des cellules différenciées, notamment choisies parmi les kératinocytes, chondrocytes, cellules nerveuses, cellules dendritiques, cellules endothéliales, fibroblastes, épiblastes, myoblastes, cardio-myoblastes, myocytes, cellules épithéliales, ostéocytes, ostéoblastes, hépatocytes et cellules des îlots de Langerhans.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les cellules initiales sont des cellules souches, notamment choisies parmi les cellules totipotentes, pluripotentes et multipotentes.
Par « cellules totipotentes », on désigne les cellules qui peuvent être différenciées en tout type cellulaire de l'organisme. Elles permettent le développement d'un individu complet. Par « cellules pluripotentes », on désigne les cellules qui peuvent être différenciées en cellules issues de n'importe lequel des trois feuillets embryonnaires. Elles ne peuvent pas produire un organisme entier.
Par « cellules multipotentes », on désigne les cellules qui peuvent être différenciées en plusieurs types de cellules différenciées mais seulement pour des types de cellules particuliers. Par exemple, les cellules multipotentes hématopoïétiques peuvent se différencier en globules rouges, en plaquette, en lymphocytes ou en macrophages mais elles ne peuvent pas se différencier en cellules musculaires. Comme exemple de cellules souches, on peut citer les cellules souches embryonnaires, hématopoïétiques, cellules mésenchymateuses, les précurseurs tels que les EPC (endothelial progenitor cells).
Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans l'invention, les multicouches de polyélectrolytes sont constituées de couches alternées de polycations et de polyanions,
- les dits polycations étant notamment choisis paπni la polyallylamine (PAH), la polyethylèneimine (PEI), la polyvinylamine, la polyaminoamide (PAMAM), le polyacrylamide (PAAm), le chlorure de polydiallyldimethylammonium (PDAC), des polypeptides chargés positivement tels que la polylysine et des polysaccharides chargés positivement tels que le chitosane,
- et les dits polyanions étant notamment choisis parmi l'acide polyacrylique (PAA), l'acide polymétacrylique (PMA), l'acide polystyrène sulfonique (PSS ou SPS), des polypeptides chargés négativement tels que l'acide polyglutamique et l'acide polyaspartique et des polysaccharides chargés négativement tels que le hyaluronane et Palginate.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans l'invention, le nombre de couches des multicouches de polyélectrolytes est de 3 à 100, en particulier 3 à 50, notamment 5 à 10 et en particulier 7.
En dessous de 7 couches, le film est encore perméable aux petites molécules, par exemple au Hoechst 33258 (poids moléculaire 623 Da).
Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans l'invention, les multicouches de polyélectrolytes sont choisies parmi (PAH-PSS)3, (PAH-PSS)3-PAH et PEI-(PSS-PAH)3. [a) H. Kerdjoudj et al. Bio-Medical Materials and Engineering, 16(4), 123, 2006 b) C. Boura et al. Biomaterials 26, 4568, 2005]
Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans l'invention, le support est un support synthétique avantageusement choisi parmi le verre, le TCPS (polystyrène dit « traité culture cellulaire »), le polysiloxane, les polyéthers de perfluoroalkyle, les polymères biocompatibles en particulier le Dacron®, le polyuréthane, le polydiméthylsiloxane, le chlorure de polyvinyle, le Silastic®, le polytétrafluoroéthylene (PTFEe), et tout matériau utilisé pour les prothèses et / ou les systèmes implantés.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans l'invention, le support est un support naturel avantageusement choisi parmi les vaisseaux sanguins, les veines, les artères, notamment les artères ombilicales décellularisées, notamment déendothélialisées, les dits vaisseaux, veines et artères provenant d'organes de donneurs ou d'animaux
Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans l'invention, le support est un support naturel avantageusement choisi parmi le derme de placenta, la vessie ou tout autre support (organe) d'origine humain ou animal.
Selon un mode de réalisation avantageux de la présente invention, les multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support sont suffisamment rigides pour permettre l'adhérence de cellules et suffisamment flexibles pour se déformer sous l'effet des pulsations artérielles et résister aux pressions physiologiques de 10 à 300 mm Hg, notamment 50 à 250 mm Hg et avantageusement 80 à 230 mm Hg.
Ces bornes de pression correspondent à celles observées pour les pressions physiologiques. Chez l'homme l'hypertension est dite sévère si la pression systolique est supérieure à 180 mm Hg. L'hypotension est atteinte lorsque la pression est inférieure à 50 mm Hg.
Par « pressions physiologiques », on désigne les pressions du sang dans les artères, les veines et les vaisseaux chez un sujet sain
Selon un mode avantageux de la présente invention, le recouvrement des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le support par les cellules adhérentes est tel qu'il résiste au cisaillement du flux sanguin, notamment in vivo.
Par « cisaillement du flux sanguin », on désigne la force tangentielle frictionnelle induite par le flux sanguin qui s'exerce sur la multicouche de polyélectrolytes lorsque l'ensemble : support, multicouche de polyélectrolytes, et cellules la recouvrant, est dans des conditions physiologiques.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention permet de préparer des endoprothèses vasculaires, des ballons d'angioplastie, des artères ou des vaisseaux artificiels pour des greffes, des dérives vasculaires, des valves cardiaques, des composants artificiels pour le cœur, des pacemakers, des appareils d'assistance ventriculaire, des cathéters, des lentilles de contact, des lentilles intraoculaires, des matrices pour l'ingénierie de tissu, des membranes biomédicales, des membranes de dialyse, des membranes d'encapsulation de cellules, des prothèses pour la chirurgie cosmétique, des prothèses orthopédiques, des prothèses dentaires, des pansements, des sutures, des biosenseurs de diagnostic.
L'invention concerne également un procédé de recouvrement de cellules initiales, souches ou différenciées, comprenant : - la mise en contact de cellules initiales avec des multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et de préférence tel que les liaisons chimiques éventuelles entre les susdites molécules et les couches de polyélectrolytes ne soient pas de nature covalente, dans des milieux permettant la prolifération des dites cellules initiales,
- la prolifération des susdites cellules initiales,
- l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours, notamment 11 jours, en particulier 7 jours, après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches ou du susdit ensemble de molécules revêtant les multicouches, par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales,
- la récupération éventuelle des dites cellules adhérentes, viables et confluentes.
A l'issue du procédé, les cellules peuvent ou non être détachées de la multicouche de polyélectrolytes. Par exemple, pour la préparation de peau artificielle, les cellules seront détachées de la multicouche. Par contre, pour la préparation de substituts vasculaires ou artériels, les cellules endothéliales ne sont pas détachées, à condition que le support soit biocompatibles, car l'ensemble : support biocompatible / multicouche de polyélectrolytes / cellules endothéliales, est greffé.
Par « support biocompatible », on désigne un support bien toléré par un organisme vivant, qui ne provoque pas de réaction de rejet, de réactions toxiques, de lésions ou d'effet nocif sur les fonctions biologiques de ce dernier.
Selon un mode avantageux de la présente invention, le procédé est un procédé de recouvrement de cellules souches initiales comprenant:
- la mise en contact de cellules souches initiales avec des multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support dans des milieux permettant la prolifération des dites cellules initiales,
- la prolifération des susdites cellules souches
- la maturation et la différenciation des susdites cellules souches en cellules différenciées,
- la prolifération des susdites cellules différenciées issues des susdites cellules initiales, - l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours, après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales,
- la récupération éventuelle des dites cellules adhérentes, viables et confluentes.
Dans ce cas, les cellules initiales sont des cellules souches. On a constaté que, de façon inattendue, les cellules souches peuvent proliférer et se différencier jusqu'à confluence dans une durée inférieure à celle des procédés de l'art antérieur. La durée impliquée dans l'invention étant 14 jours, notamment 11 jours, en particulier 7 jours. Par exemple, sur le support lame de verre et avec la multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH, la confluence est atteinte en 14 jours alors qu'il faut 60 jours en utilisant de la fibronectine (qui est la protéine donnant les durées de prolifération et différenciation les plus rapides parmi les techniques connues de l'homme de l'art).
Selon un mode avantageux de la présente invention, le procédé est un procédé de recouvrement de cellules différenciées initiales comprenant:
- la mise en contact de cellules différenciées initiales avec des multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support dans des milieux permettant la prolifération des dites cellules initiales,
- la prolifération des susdites cellules différenciées,
- l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 7 jours, en particulier 3 jours après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales,
- la récupération éventuelle des dites cellules adhérentes, viables et confluentes.
Dans ce cas, les cellules initiales sont des cellules différenciées. On a constaté que, de façon inattendue, les cellules initiales peuvent proliférer jusqu'à confluence dans une durée inférieure à celle des procédés de l'art antérieur. La durée impliquée dans l'invention étant 7 jours, notamment 5 jours, en particulier 3 jours. Par exemple, sur le support PTFEe et avec la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3, la confluence est atteinte en 7 jours ou moins, alors que sans dépôt de multicouche de polyélectrolytes, aucune cellule n'adhère.
Selon un mode avantageux, dans le procédé de l'invention les multicouches sont revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et / ou contenant des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées.
Selon un mode avantageux de la présente invention, le procédé comprend:
- la mise en contact de cellules initiales avec des multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et de préférence tel que les liaisons chimiques éventuelles entre les susdites molécules et les couches de polyélectrolytes ne soient pas de nature covalente, dans des milieux permettant la prolifération des dites cellules initiales,
- la prolifération des susdites cellules initiales,
- l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours, notamment 11 jours, en particulier 7 jours, après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches ou du susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives revêtant les multicouches, par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales,
- la récupération des dites cellules adhérentes, viables et confluentes.
Dans ce cas, les cellules adhérentes, viables et confluentes sont détachées de la multicouche de polyélectrolytes.
Selon un mode avantageux de la présente invention, le procédé comprend:
- la mise en contact de cellules initiales avec des multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et de préférence tel que les liaisons chimiques éventuelles entre les susdites molécules et les couches de polyélectrolytes ne soient pas de nature covalente, dans des milieux permettant la prolifération des dites cellules initiales,
- la prolifération des susdites cellules initiales,
- l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours, notamment 11 jours, après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches ou du susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives revêtant les multicouches, par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales.
Dans ce cas, les cellules adhérentes, viables et confluentes ne sont pas détachées de la multicouche de polyélectrolytes.
Selon un mode de réalisation préféré, le procédé est un procédé de recouvrement de cellules endothéliales initiales qui comprend:
- la mise en contact de cellules endothéliales initiales avec des multicouches de polyélectrolytes choisies parmi (PAH-PSS)3, (PAH-PSS)3-PAH et PEI-(PSS-PAH)3, déposées sur un support, notamment un support naturel tel qu'un vaisseau sanguin ou une artère décellularisé, notamment déendothélialisé, ou un support synthétique biocompatible ayant une forme de vaisseau ou d'artère, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et de préférence tel que les liaisons chimiques éventuelles entre les susdites molécules et les couches de polyélectrolytes ne soient pas de nature covalente, dans des milieux permettant la prolifération des susdites cellules endothéliales initiales,
- la prolifération des susdites cellules endothéliales initiales,
- l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 7 jours, notamment 5 jours, en particulier 3 jours, après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches ou du susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives revêtant les multicouches, par des cellules endothéliales adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules endothéliales initiales.
Ce cas correspond un procédé de prolifération de cellules endothéliales sur une multicouche de polyélectrolytes pour la préparation de substituts vasculaires ou artériels qui seront utilisés comme greffons. L'utilisation de multicouches de polyélectrolytes présente de nombreux avantages. En effet, l'ensemble support artère ou vaisseau / multicouche de polyélectrolytes est suffisamment rigide pour permettre l'adhérence des cellules et suffisamment élastique pour permettre d'accepter la déformation imposée par le flux sanguin. De plus, la monocouche de cellules obtenue doit permettre le passage d'oxygène et de nutriments, ce qui doit autoriser les échanges essentiels entre le sang et les tissus environnants.
Selon un autre mode de réalisation préféré, le procédé est un procédé de recouvrement de cellules souches initiales comprenant :
- la mise en contact de cellules souches initiales avec des multicouches de polyélectrolytes choisies parmi (PAH-PSS)3, (PAH-PSS)3-PAH et PEI-(PSS-PAH)3, déposées sur un support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et de préférence tel que les liaisons chimiques éventuelles entre les susdites molécules et les couches de polyélectrolytes ne soient pas de nature covalente, dans des milieux permettant la prolifération des susdites cellules souches initiales,
- la prolifération des susdites cellules souches initiales,
- la maturation et la différenciation des susdites cellules souches en cellules endothéliales,
- la prolifération des susdites cellules endothéliales issues des susdites cellules souches initiales,
- l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas 14 jours après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches ou du susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives revêtant les multicouches, par des cellules endothéliales adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules souches initiales.
Ce cas correspond un procédé de prolifération de cellules souches, puis différenciation en cellules endothéliales, sur une multicouche de polyélectrolytes pour la préparation de substituts vasculaires ou artériels qui seront utilisés comme greffons.
Dans le procédé de l'invention, les cellules souches initiales sont notamment choisies parmi les cellules totipotentes, pluripotentes et multipotentes.
Dans le procédé de l'invention, les cellules différenciées initiales sont notamment choisies parmi les kératinocytes, chondrocytes, cellules nerveuses, cellules dendritiques, cellules endothéliales, fibroblastes, épiblastes, myoblastes, cardio-myoblastes, myocytes, cellules épithéliales, ostéocytes, ostéoblastes, hépatocytes et cellules des îlots de Langerhans. Selon un mode de réalisation particulier, dans le procédé de l'invention, les multicouches de polyélectrolytes sont constituées de couches de préférence alternées de polycations et de polyanions,
- les polycations étant notamment choisies parmi la polyallylamine (PAH), la polyethylèneimine (PEI), la polyvinylamine, la polyaminoamide (PAMAM), le polyacrylamide (PAAm), le chlorure de polydiallyldimethylammonium (PDAC), des polypeptides chargés positivement tels que la polylysine et des polysaccharides chargés positivement tels que le chitosane,
- et les polyanions étant notamment choisis parmi l'acide polyacrylique (PAA), l'acide polymétacrylique (PMA), l'acide polystyrène sulfonique (PSS ou SPS), des polypeptides chargés négativement tels que l'acide polyglutamique et l'acide polyaspartique et des polysaccharides chargés négativement tels que le hyaluronane et Palginate.
De façon avantageuse, le nombre de couches des dites multicouches de polyélectrolytes est de 3 à 100, en particulier 3 à 50, notamment 5 à 10 et en particulier 7.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, dans le procédé de l'invention, les multicouches de polyélectrolytes sont choisies parmi (PAH-PSS)3, (PAH-PSS)3-PAH et PEI- (PSS-PAH)3.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, dans le procédé de l'invention, le support est choisi parmi les supports synthétiques tels que le verre, le TCPS (polystyrène dit « traité culture cellulaire »), le polysiloxane, les polyéthers de perfluoroalkyle, les polymères biocompatibles en particulier le Dacron®, le polyuréthane, le polydiméthylsiloxane, le chlorure de polyvinyle, le Silastic®, le polytetrafluoroéthylene (PTFEe) et tout matériau utilisé pour les prothèses et / ou les systèmes implantés,
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, dans le procédé de l'invention, le support est choisi parmi les supports naturels tels que les vaisseaux sanguins, les veines, les artères, notamment les artères ombilicales décellularisées, notamment déendothélialisées, les dits vaisseaux, veines et artères provenant d'organes de donneurs ou d'animaux.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans l'invention, le support est un support naturel avantageusement choisi parmi le derme de placenta, la vessie ou tout autre support (organe) d'origine humain ou animal.
La présente invention a pour objet une composition comprenant : - un support, - des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et de préférence tel que les liaisons chimiques éventuelles entre les susdites molécules et les couches de polyélectrolytes ne soient pas de nature covalente, et,
- une couche de cellules souches recouvrant les dites multicouches de polyélectrolytes.
Selon un autre mode de réalisation, la composition de l'invention comprend un support, des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, les dites multicouches sont revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et / ou contiennent des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes.
Selon un autre mode de réalisation, la composition de l'invention comprend un support, des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, et une couche de cellules souches recouvrant les dites multicouches de polyélectrolytes.
Selon un mode de réalisation particulier, les cellules souches initiales sont notamment choisies parmi les cellules totipotentes, pluripotentes et multipotentes.
Selon un autre mode de réalisation, la composition de l'invention comprend :
- un support naturel,
- des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et de préférence tel que les liaisons chimiques éventuelles entre les susdites molécules et les couches de polyélectrolytes ne soient pas de nature covalente, et,
- une couche de cellules différenciées recouvrant les dites multicouches de polyélectrolytes.
Selon un mode avantageux de réalisation, la composition de l'invention comprend :
- un support naturel,
- des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, les dites multicouches étant revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et / ou contenant des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et de préférence tel que les liaisons chimiques éventuelles entre les susdites molécules et les couches de polyélectrolytes ne soient pas de nature_ςovalente, et,
- une couche de cellules différenciées recouvrant les dites molécules biologiques ou biologiquement actives.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, la composition de l'invention comprend :
- un support naturel,
- des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, et,
- une couche de cellules différenciées recouvrant les dites multicouches de polyélectrolytes.
Selon un autre mode de réalisation, la composition de l'invention comprend :
- un support,
- des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, les dites multicouches étant revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et / ou contenant des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et de préférence tel que les liaisons chimiques éventuelles entre les susdites molécules et les couches de polyélectrolytes ne soient pas de nature covalente, et,
- une couche de cellules différenciées recouvrant les dites molécules biologiques ou biologiquement actives.
Dans la composition de l'invention définie ci-dessus, le support est un support synthétique ou naturel, et en particulier un support synthétique.
Dans les compositions de l'invention, les cellules différenciées initiales sont notamment choisies parmi les kératinocytes, chondrocytes, cellules nerveuses, cellules dendritiques, cellules endothéliales, fibroblastes, épiblastes, myoblastes, cardio-myoblastes, myocytes, cellules épithéliales, ostéocytes, ostéoblastes, hépatocytes et cellules des ilôts de Langerhans.
Dans les compositions de l'invention, les multicouches de polyélectrolytes sont constituées de couches de préférence alternées de polycations et de polyanions, - les polycations étant notamment choisis parmi la polyallylamine (PAH), la polyethylèneimine (PEI), la polyvinylamine, la polyaminoamide (PAMAM), le polyacrylamide (PAAm), le chlorure de polydiallyldimethylammonium (PDAC), des polypeptides chargés positivement tels que la polylysine et des polysaccharides chargés positivement tels que le chitosane,
- et les polyanions étant notamment choisis parmi l'acide polyacrylique (PAA), l'acide polymétacrylique (PMA), l'acide polystyrène sulfonique (PSS ou SPS), des polypeptides chargés négativement tels que l'acide polyglutamique et l'acide polyaspartique et des polysaccharides chargés négativement tels que le hyaluronane et l'alginate.
Selon un mode de réalisation avantageux, dans les compositions de l'invention, le nombre de couches des dites multicouches de polyélectrolytes est de 3 à 100, en particulier 3 à 50, notamment 5 à 10 et en particulier 7.
Selon un mode de réalisation avantageux, dans les compositions de l'invention, les multicouches de polyélectrolytes sont choisies parmi (PAH-PSS)3, (PAH-PSS)3-PAH et PEI- (PSS-PAH)3.
Dans les compositions de l'invention, le support est choisi parmi les supports naturels, tels que les vaisseaux sanguins, les veines, les artères, notamment les artères ombilicales décellularisées, notamment déendothélialisées, les dits vaisseaux, veines et artères provenant d'organes de donneurs ou d'animaux, et le derme de placenta, (idem)
Dans les compositions de l'invention, le support est avantageusement choisi parmi le derme de placenta, la vessie ou tout autre support (organe) d'origine humain ou animal.
Dans les compositions de l'invention, le support est choisi parmi les supports synthétiques notamment le verre, le TCPS (polystyrène dit « traité culture cellulaire »), le polysiloxane, les polyéthers de perfluoroalkyle, les polymères biocompatibles en particulier le Dacron®, le polyuréthane, le polydiméthylsiloxane, le chlorure de polyvinyle, le Silastic®, le polytetrafluoroéthylene (PTFEe) et tout matériau utilisé pour les prothèses et / ou les systèmes implantés. LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 :
La figure 1 représente une image obtenue au microscope confocal objectif 40 d'un support PTFEe sur lequel a été déposée la multicouche de polyélectrolytes [PEI-(PSS-PAH)2- PSS-PAH*], PAH* étant de l' hydrochlorure de poly(allylamine) couplé à la rhodamine. Le microscope est un microscope Leica SP2-AOBS (objectif : x40, ON=O.8, Allemagne) La petite flèche correspond à une microfïbrille ou à la distance entre deux nœuds, et la.grande flèche correspond aux nœuds. L'astérisque correspond à un pore.
Figures 2A, 2B, 2C, 2D et 2E :
La figure 2A représente une image obtenue au microscope confocal objectif 40 (n=4) d'une artère sur laquelle a été déposée la multicouche de polyélectrolytes [(PAH-PSS)2- PAH*-PSS-PAH*], PAH* étant de l' hydrochlorure de poly(allylamine) (PAH) couplé à la rhodamine. Cette image montre la topologie de la surface interne de l'artère.
La figure 2B représente une image obtenue au microscope confocal objectif 40 (n=4) d'une artère sur laquelle a été déposée la multicouche de polyélectrolytes [(PAH-PSS)2- PAH* -PSS-P AH*], PAH* étant de l'hydrochlorure de poly(allylamine) (PAH) couplé à la rhodamine. Cette image est une coupe transversale et montre que le recouvrement par la multicouche de polyélectrolytes a eu lieu sur toute la surface interne de l'artère.
La figure 2C représente une image obtenue au microscope confocal objectif 40 (n=4) d'une artère ombilicale en lumière transmise.
La figure 2D est une superposition des figures 2B et 2C.
La figure 2E représente le spectre de la rhodamine confirmant la présence de la de polyélectrolytes [(PAH-PSS)2-PAH*-PSS-PAH*]. L'axe des abscisses représente la longueur d'onde en nanomètres. L'axe des ordonnées représente la luminosité exprimée en niveaux de gris.
Figure 3 :
La figure 3 représente des courbes de déformation des artères en fonction de la pression exercée dans ces artères. L'axe des ordonnées représente la pression dans les artères en cm Hg.
L'axe des abscisses représente le pourcentage de déformation de l'artère.
La courbe avec des points • représente des artères fraîches.
La courbe avec des carrés B représente les artères déendothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'ont été déposées.
La courbe avec des triangles-*- représente les artères déendothélialisées sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée.
Figure 4 :
La figure 4 représente la compliance en pourcentage par rapport à des artères fraîches, c'est-à-dire que les données ont été normalisées pour que la compliance d'artères fraîches soit de 100%.
L'axe des ordonnées représente la compliance en pourcentage par rapport à des artères fraîches.
L'axe des abscisses représente le type d'artères : des artères fraîches, des artères déendothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, et des artères déendothélialisées sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3- PAH a été déposée.
Le symbole * signifie que la compliance des artères déendothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, diffère de manière significative avec celle des artères fraîches avec une probabilité d'erreur inférieure à 0.05%.
Figure 5 :
La figure 5 représente le résultat du test de viabilité par le test à l'Alamar Blue® de cellules endothéliales HUVECs ensemencées sur :
- du TCPS (courbe avec les triangles vides v),
- du PTFEe (courbe avec les triangles pleins -»- ),
- du PTFEe sur lequel le polyélectrolyte PAH a été déposé (courbe avec les ronds vides o), ou,
- du PTFEe sur lequel la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3 a été déposée (courbe avec les ronds pleins •)
L'axe des ordonnées représente Δ DO = [DO(570nm)eχp-DO(630nm)eλp ] - [DO(570nm)tém- DO(630nm)tém ] avec exp. = expérimental, tém. = témoin sans cellules et Δ = différence. L'axe des abscisses représente la durée de culture en jours.
Le symbole * signifie que l'activité métabolique des cellules endothéliales sur les supports considérés diffère de manière significative avec celle des cellules sur le support TCPS avec une probabilité d'erreur inférieure à 0.05%.
Le temps d'incubation est de 3 heures.
Figure 6A, 6B, 6C, 6D, 6E et 6F :
La figure 6A représente l'image observée au microscope électronique (agrandissement de x 169) du support PTFEe sur lequel ont été cultivées des cellules endothéliales.
La figure 6B représente l'image observée au microscope électronique (agrandissement de x508) du support PTFEe sur lequel ont été cultivées des cellules endothéliales.
La figure 6C représente l'image observée au microscope électronique (agrandissement de x 149) du support PTFEe sur lequel le polyélectrolyte PAH a été déposé et sur lequel ont été cultivées des cellules endothéliales.
La figure 6D représente l'image observée au microscope électronique (agrandissement de x503) du support PTFEe sur lequel le polyélectrolyte PAH a été déposé et sur lequel ont été cultivées des cellules endothéliales.
La figure 6E représente l'image observée au microscope électronique (agrandissement de xl l2) du support PTFEe sur lequel la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3 a été déposée et sur lequel ont été cultivées des cellules endothéliales.
La figure 6F représente l'image observée au microscope électronique (agrandissement de x513) du support PTFEe sur lequel la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3 a été déposée et sur lequel ont été cultivées des cellules endothéliales.
Pour les figures 6A, 6B, 6C, 6D, 6E et 6F, la durée de culture des cellules endothéliales HUVECs est de 7 jours, et le microscope est un microscope électronique STEREOSCAN S 240, CAMBRIDGE (UK).
Figure 7 :
La figure 7 représente l'image obtenue en microscopie confocale (bar: 75μm, objectif x40) de cellules endothéliales HUVECs adhérentes au support PTFEe sur lequel la multicouche PEI (PSS-PAH)3 a été déposée, après 7 jours de culture. Le facteur Von Willebrand est visualisé grâce au fluorochrome Alexa Fluor 488 (λex: 494nm, λem: 517nm) et apparaît en gris clair. Les ronds gris foncés qui apparaissent au milieu des parties grises claires représentent les noyaux, qui ont été marqués à l'iodure de propidium (λex: 536nm, λem: 617nm)
Figures 8A, 8B, 8C, 8D :
La figure 8A représente l'image d'une coupe histologique d'une artère réendothélialisée sur laquelle aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée. La coloration basique est effectuée à Phematoxyline-eosine-Safran. Le grossissement est de 20.
La figure 8B représente l'image d'une coupe histologique d'une artère réendothélialisée sur laquelle une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée. La coloration basique est effectuée à l'hematoxyline-eosine-Safran. Le grossissement est de 20.
La figure 8C représente l'image obtenue en immunohistochimie mettant en évidence le récepteur membranaire PECAM-I exprimé à la surface des cellules endothéliales ensemencées dans la lumière de l'artère sur laquelle aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée. La révélation est effectuée par une peroxydase et la contre coloration est effectuée avec l'hématoxyline. Le grossissement est de 20.
La figure 8D représente l'image obtenue en immunohistochimie mettant en évidence le récepteur membranaire PECAM-I exprimé à la surface des cellules endothéliales ensemencées dans la lumière de l'artère sur laquelle une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée. La révélation est effectuée par une peroxydase et la contre coloration est effectuée avec l'hématoxyline. Le grossissement est de 20.
Figures 9A, 9B, 9C :
La figure 9A représente une image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 50 μm) des artères ombilicales endothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée.
La figure 9B représente une image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 50 μm) des artères ombilicales endothélialisées sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée.
La figure 9C représente une image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 50 μm) d'une artère fraîche (contrôle).
Figures 10A, 10B, 10C, 10D : La figure 10A représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser (objectif 40) après marquage de PECAM-I, d'artères endothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, dans des conditions statiques après une semaine de culture.
La figure 1OB représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser (Objectif 40) après marquage de PECAM-I, d'artères endothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, dans des conditions dynamiques (artères endothélialisées soumises à une contrainte de cisaillement de 1 Pa pendant 1 heure) après une semaine de culture.
La figure 10C représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser (objectif 40) après marquage de PECAM-I, d'artères endothélialisées sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée, dans des conditions statiques après une semaine de culture.
La figure 10D représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser (objectif 40) après marquage de PECAM-I, d'artères endothélialisées sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée, dans des conditions dynamiques (artères endothélialisées soumises à une contrainte de cisaillement de 1 Pa pendant 1 heure) après une semaine de culture.
Figures HA, HB, HC, HD :
La figure HA représente l'image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 50 μm) après marquage de PECAM-I, d'artères endothélialisées sur lesquels aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, dans des conditions statiques après une semaine de culture.
La figure HB représente l'image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 50 μm) après marquage de PECAM-I, d'artères endothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, dans des conditions dynamiques (artères endothélialisées soumises à une contrainte de cisaillement de 1 Pa pendant 1 heure) après une semaine de culture.
La figure HC représente l'image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 50 μm) après marquage de PECAM-I, d'artères endothélialisées sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée, dans des conditions statiques après une semaine de culture. La figure 11D représente l'image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 50 μm) après marquage de PECAM-I, d'artères endothélialisées sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée, dans des conditions dynamiques (artères endothélialisées soumises à une contrainte de cisaillement de 1 Pa pendant 1 heure) après une semaine de culture.
Figures 12A, 12B, 12C, 12D, 12E, 12F :
La figure 12A représente une image obtenue après observation d'une coupe histologique d'artères ombilicales cryoconservées déendothélialisées de lapin sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, une semaine après l'implantation (contrôle).
La figure 12B représente une image obtenue après observation d'une coupe histologique d'allogreffes déendothélialisées de lapin sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, une semaine après l'implantation (contrôle).
La figure 12C représente une image obtenue après observation d'une coupe histologique d'artères ombilicales cryoconservées déendothélialisées de lapin sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 a été déposée, une semaine après l'implantation.
La figure 12D représente une image obtenue après observation d'une coupe histologique d'allogreffes déendothélialisées de lapin sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 a été déposée, une semaine après l'implantation.
La figure 12E représente une image obtenue après observation d'une coupe histologique d'artères ombilicales cryoconservées déendothélialisées de lapin sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 a été déposée, 12 semaines après l'implantation.
La figure 12F représente une image obtenue après observation d'une coupe histologique d'allogreffes déendothélialisées de lapin sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 a été déposée, 12 semaines après l'implantation.
Dans les figures 12A à 12F, la coloration basique a été effectuée à l'hématoxyline- éosine-Safran et le grossissement est de 20.
Figure 13A, 13B, 13C, 13D, 13E, 13F :
La figure 13A représente une image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 1 mm) d'artères ombilicales cryoconservées déendothélialisées de lapin sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, une semaine après l'implantation (contrôle).
La figure 13B représente une image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 1 mm) d'allogreffes déendothélialisées de lapin sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, une semaine après l'implantation (contrôle).
La figure 13C représente une image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 1 mm) d'artères ombilicales cryoconservées déendothélialisées de lapin sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 a été déposée, une semaine après l'implantation.
La figure 13D représente une image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 1 mm) d'allogreffes déendothélialisées de lapin sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 a été déposée, une semaine après l'implantation.
La figure 13E représente une image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 1 mm) d'artères ombilicales cryoconservées déendothélialisées de lapin sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 a été déposée, 12 semaines après l'implantation.
La figure 13F représente une image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 1 mm) d'allogreffes déendothélialisées de lapin sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 a été déposée, 12 semaines après l'implantation.
Figures 14A, 14B, 14C :
La figure 14A représente une image obtenue après observation à Pecho-doppler 10 semaines après l'implantation pour la carotide témoin, qui est la carotide native du lapin (contrôle). Le tracé en bas de l'image montre que la vitesse du sang est de 40 cm/s.
La figure 14B représente une image obtenue après observation à l'eçho-doppler 10 semaines après l'implantation pour des artères ombilicales cryoconservées déendothélialisées sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 a été déposée. Le tracé en bas de l'image montre que la vitesse du sang est de 40 cm/s.
La figure 14C représente une image obtenue après observation à l'echo-doppler 10 semaines après l'implantation pour des artères ombilicales cryoconservées déendothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée. Le tracé en bas de l'image montre que la vitesse du sang est nulle : la sang ne circule pas car l'artère est bouchée.
Figures 15A, 15B, 15C, 15D, 15E :
La figure 15A représente l'image obtenue par observation en microscopie à contraste de phase (Objectif 20) d'une lame de verre recouverte de fibronectine puis de progéniteurs endothéliaux, à 4 jours de culture.
La figure 15B représente l'image obtenue par observation en microscopie à contraste de phase (Objectif 20) d'une lame de verre sur laquelle une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée puis des progéniteurs endothéliaux ont été ensemencés, à 4 jours de culture.
La figure 15C représente l'image obtenue par observation en microscopie à contraste de phase (Objectif 20) d'une lame de verre recouverte de fibronectine puis de progéniteurs endothéliaux, à 14 jours de culture.
La figure 15D représente l'image obtenue par observation en microscopie à contraste de phase (Objectif 20) d'une lame de verre sur laquelle une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée puis des progéniteurs endothéliaux ont été ensemencés, à 14 jours de culture.
La figure 15E représente l'image obtenue par observation en microscopie à contraste de phase (Objectif 20) de TCPS (polystyrène dit « traité culture cellulaire ») recouvert d'une monocouche de cellules endothéliales matures issues de la veine jugulaire de lapin (JVEC) (contrôle).
Figures 16A, 16B, 16C, 16D, 16E, 16F, 16G, 16H, 161, 16J, 16K, 16L :
La figure 16A représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules endothéliales d'une veine jugulaire (contrôle) et dont le récepteur membranaire PECAM-I a été marqué. Le marquage est un immunomarquage indirect : un anticorps primaire qui reconnaît l'antigène PECAM-I est reconnu par un anticorps secondaire marqué par un fluorochrome (Alexa® 488). L'adhésion et l'étalement des cellules sur le support ont été évalués par l'apparition des fibres d'actine. En gris clair apparaît le PECAM-I mis en évidence par un fluorochrome (Alexa® 488).
La figure 16B représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules endothéliales d'une veine jugulaire (contrôle) et dont le marqueur intracellulaire (Facteur de von Willebrand (vWF)) a été marqué. Le marquage est un immunomarquage indirect : un anticorps primaire qui reconnaît l'antigène vWF est reconnu par un anticorps secondaire marqué par un fluorochrome (Alexa® 488). L'adhésion et l'étalement des cellules sur le support ont été évalués par l'apparition des fibres d'actine. En gris clair apparaît le marqueur intracellulaire (Facteur de von Willebrand (vWF)) mis en évidence par un fluorochrome (Alexa® 488).
La figure 16C représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules endothéliales d'une veine jugulaire (contrôle) et dont le cytosquelette est mis en évidence par reconnaissance par un anticorps lié à un fluorochrome (Alexa® 488). L'adhésion et l'étalement des cellules sur le support ont été évalués par l'apparition des fibres d'actine. En gris clair apparaît le cytosquelette.
La figure 16D représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules endothéliales d'une veine jugulaire (contrôle) et dont le LDL a été couplé au DiI (molécule fluorescente). La capacité des cellules à incorporer les LDL est une caractéristique de la fonctionnalité des cellules endothéliales matures. En gris apparaissent les LDL couplés au DiI (molécule fluorescente). En gris clair apparaît le Syto 16 (marqueur spécifique au noyau) qui permet de montrer la répartition périnucléaire des LDL couplés au DiI.
La figure 16E représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules EPC ensemencées sur une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH et dont le récepteur membranaire PECAM-I a été marqué selon la même méthode que pour la figure 16A. L'adhésion et l'étalement des cellules sur le support ont été évalués par l'apparition des fibres d'actine. En gris clair apparaît le PECAM-I mis en évidence par un fluorochrome (Alexa® 488).
La figure 16F représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules EPC ensemencées sur une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH et dont le marqueur intracellulaire (Facteur de von Willebrand (vWF)) a été marqué selon la même méthode que pour la figure 16B. L'adhésion et l'étalement des cellules sur le support ont été évalués par l'apparition des fibres d'actine. En gris clair apparaît le marqueur intracellulaire (Facteur de von Willebrand (vWF)) mis en évidence par un fluorochrome (Alexa® 488).
La figure 16G représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules EPC ensemencées sur une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH et dont le cytosquelette est mis en évidence par reconnaissance par un anticorps lié à un fluorochrome (Alexa® 488). L'adhésion et l'étalement des cellules sur le support ont été évalués par l'apparition des fibres d'actine. En gris clair apparaît le cytosquelette.
La figure 16H représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules EPC ensemencées sur une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH et dont le LDL a été couplé au DiI (molécule fluorescente). La capacité des cellules à incorporer les LDL est une caractéristique de la fonctionnalité des cellules endothéliales matures. En gris apparaissent les LDL couplés au DiI (molécule fluorescente). En gris clair apparaît le Syto 16 (marqueur spécifique au noyau) qui permet de montrer la répartition périnucléaire des LDL couplés au DiI.
La figure 161 représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules EPC ensemencées sur une couche de fibronectine et dont le récepteur membranaire PECAM-I a été marqué selon la même méthode que pour la figure 16 A. L'adhésion et l'étalement des cellules sur le support ont été évalués par l'apparition des fibres d'actine. En gris clair apparaît le PECAM-I mis en évidence par un fluorochrome (Alexa® 488).
La figure 16J représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules EPC ensemencées sur une couche de fibronectine et dont le marqueur intracellulaire (Facteur de von Willebrand (vWF)) a été marqué selon la même méthode que pour la figure 16B. L'adhésion et l'étalement des cellules sur le support ont été évalués par l'apparition des fibres d'actine. En gris clair apparaît le marqueur intracellulaire (Facteur de von Willebrand (vWF)) mis en évidence par un fluorochrome (Alexa® 488).
La figure 16K représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules EPC ensemencées sur une couche de fibronectine et dont le cytosqueletle est mis en évidence par reconnaissance par un anticorps lié à un fluorochrome (Alexa® 488). L'adhésion et l'étalement des cellules sur le support ont été évalués par l'apparition des fibres d'actine. En gris clair apparaît le cytosquelette.
La figure 16L représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules EPC ensemencées sur une couche de fibronectine et dont le LDL a été couplé au DiI (molécule fluorescente). La capacité des cellules à incorporer les LDL est une caractéristique de la fonctionnalité des cellules endothéliales matures. En gris apparaissent les LDL couplés au DiI (molécule fluorescente). En gris clair apparaît le Syto 16 (marqueur spécifique au noyau) qui permet de montrer la répartition périnucléaire des LDL couplés au DiI.
Figures 17A, 17B, 17C :
La figure 17A représente un graphe qui correspond à l'étude semi-quantitative de la fluorescence des figures 16A, 16E et 161 pour le récepteur membranaire PECAM-I. L'axe des ordonnées représente le niveau de gris par pixel. L'axe des abscisses représente la provenance des cellules endothéliales :
- cellules endothéliales d'une veine jugulaire (JVE) (fluorescence de la figure 16A),
- cellules EPC ensemencées sur une couche de fibronectine après 14 jours de culture (Fn ou F) (fluorescence de la figure 16E) et,
- cellules EPC ensemencées sur une multicouche de polyélectrolytes après 14 jours de culture (PEM) (fluorescence de la figure 161).
La figure 17B représente un graphe qui correspond à l'étude semi-quantitative de la fluorescence des figures 16B, 16F et 16J pour le marqueur intracellulaire vWF. L'axe des ordonnées représente le niveau de gris par pixel. L'axe des abscisses représente la provenance des cellules endothéliales :
- cellules endothéliales d'une veine jugulaire (JVE) (fluorescence de la figure 16B),
- cellules EPC ensemencées sur une couche de fibronectine après 14 jours de culture (Fn ou F) (fluorescence de la figure 16F) et,
- cellules EPC ensemencées sur une multicouche de polyélectrolytes après 14 jours de culture (PEM) (fluorescence de la figure 16J).
La figure 17C représente un graphe qui correspond à l'étude semi-quantitative de la fluorescence des figures 16A, 16E et 161 pour le LDL couplé au Di avec du Sito 16. L'axe des ordonnées représente le niveau de gris par pixel. L'axe des abscisses représente la provenance des cellules endothéliales :
- cellules endothéliales d'une veine jugulaire (JVE) (fluorescence de la figure 16D),
- cellules EPC ensemencées sur une couche de fibronectine après 14 jours de culture (Fn ou F) (fluorescence de la figure 16H) et,
- cellules EPC ensemencées sur une multicouche de polyélectrolytes après 14 jours de culture (PEM) (fluorescence de la figure 16L).
Dans les figures 17A à 17C, le symbole 3 étoiles *** signifie que la fluorescence des cellules EPC ensemencées sur une couche de fibronectine est significativement différente de celle des cellules endothéliales d'une veine jugulaire avec une probabilité d'erreur inférieure à 0.001%.
Figure 18 :
La figure 18 représente le résultat du test de viabilité par le test à PAlamar Blue® de cellules endothéliales.
L'axe des ordonnées représente Δ DO = [DO(570nm)eλp-DO(630nni)eχp ] - [DO(570nm)tém- DO(630nm)tém ] avec exp. = expérimental, tém. = témoin sans cellules et Δ = différence. L'axe des abscisses représente la provenance des cellules endothéliales : cellules endothéliales d'une veine jugulaire (JVE), cellules EPC ensemencées sur une couche de fibronectine après 14 jours de culture (F) et cellules EPC ensemencées sur une multicouche de polyélectrolytes après 14 jours de culture (PEM).
Le symbole 2 étoiles ** signifie que la différence d'absorbance des cellules EPC ensemencées sur une couche de fibronectine est significativement différente de celle des cellules endothéliales d'une veine jugulaire avec une probabilité d'erreur inférieure à 0.05%.
Figure 19 :
La figure 19 représente le schéma de la chambre de cisaillement utilisée au cours de l'étude de différenciation d'EPC ensemencés sur une artère sur laquelle a été déposée ou non une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH.
Figure 20 :
La figure 20 représente la courbe d'étalonnage de la pompe péristaltique. L'axe des ordonnées représente la contrainte de cisaillement en Pascal. L'axe des abscisses représente la graduation.
EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation de multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support
1.1. Préparation des supports
L 1 : 1 : .P. réparation des James de verre
Les lames de verre sont lavées pour mettre en évidence la silice (Si-) et rendre la surface des lames négative.
Plus précisément, les lames de verre sont lavées pendant 15 min à 100°C dans une solution de Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 0,01 M. Trois lavages sont alors effectués avec de l'eau distillée filtrée. Les lames sont ensuite plongées dans une solution d'acide chlorhydrique 0,12 M pendant 15 min à 100°C. Trois lavages sont effectués avec de l'eau distillée filtrée. Les lames sont conservées à 4°C dans l'eau distillée filtrée avant traitement.
Lî.-2..Prép.aration du PTFEe
Des patchs de polytétrafluoroéthylène expensé PTFEe de 9 mm de diamètre sont préparés à partir de prothèses vasculaires tubulaires de PTFEe (6 mm de diamètre interne et 25 μm de longueur fibrillaire). Ces patchs sont ensuite collés dans des plaques de culture de 48 puits. Les multicouches de polyélectrolytes sont ensuite construits directement sur le PTFEe à l'intérieur des puits. Des études préalables ont montré l'absence de cytotoxicité de la colle.
1.1.3. Composition du milieu complet Composition du milieu de culture pour les cellules
• Sérum humain AB (provenant de donneurs volontaires sains) utilisé à 20%. Il est décomplémenté à 56°C pendant 30 min.
• M 199 et RPMI 1640 v/v (Gibco BRL, France).
• 2 mM de glutamine (Gibco BRL, France).
• 100 U/mL de Pénicilline (Gibco BRL, France).
• 100 μg/mL de Streptomycine (Gibco BRL, France). • 2,5 μg/mL de Fungizone® (Gibco BRL, France).
• 20 mM HEPES (Sigma, France).
Lorsque le mélange RPMI 1640/M199 est supplémenté de ces additifs, il forme le milieu dit « complet ». La durée de conservation du milieu complet, conservé à 4°C, n'excède pas 2 semaines.
L.L4:.Pjép.aratipn des artères çryoçonse
Les artères sont récupérées à partir du cordon ombilical humain. A l'aide de deux pinces chirurgicales, le cordon ombilical est dilacéré et des longueurs d'artères d'au moins 6 cm sont isolées et plongées dans du Tampon (Hank's Balanced Sait Solution HBSS). Après plusieurs rinçages, généralement trois à cinq (jusqu'à ce que l'artère ne contiennent plus de sang) les artères sont placées dans des cryotubes contenant 1 mL d'une solution de congélation, qui est constituée de 70% de milieu complet supplémenté de 10% de DiMéthylSulfoxide (DMSO, Sigma, France) et de 20% de sérum de veau fœtal (Gibco BRL, France), préalablement décomplémenté à 56°C pendant 30 min.
Les cryotubes sont conservés une nuit à - 80 0C, puis plongés dans de l'azote liquide à - 180 0C. La durée de conservation est normalement de 6 mois (durée nécessaire pour effectuer les tests sérologiques lors de l'utilisation des allogreffes prélevées sur des cadavres).
Les artères ombilicales sont décongelées en plongeant les cryotubes dans un bain- marie à 37°C. Elles sont ensuite lavées avec une solution de décontamination, qui est constituée de milieu RPMI 1640 (Gibco BRL, France) supplémenté de 100 UI/mL de pénicilline (Gibco BRL, France), de 100 μg/mL de streptomycine (Gibco BRL, France) et de 2,5 μg/mL de Fungizone® (Gibco BRL, France).
La lumière de l'artère est lavée trois fois avec du tampon (HBSS), puis est remplie avec une solution de digestion (trypsine/EDTA 0,25%). Après 20 min d'incubation à 37°C, l'artère est lavée avec 2 mL de milieu contenant du sérum complet. Les artères dénommées par la suite « artères dé-endothélialisées » sont celles qui ont subi ce processus de cryoconservation.
1.2. Préparation des solutions de polyélectrolvtes : PAH, PSS, PEI
Les multicouches de polyélectrolytes sont constitués par l'alternance de solutions de polycations et de polyanions. 1.-.2 , 1 : . Matériel, utilisé
TaffiEQn : Solution de Tris/NaCl (Tris 1OmM et NaCl 15OmM).
Pplyéleçtrolytes_utjHsés :
CH2 CH2 - 1
Figure imgf000036_0001
PAH PSS PEI
Structure chimique des polyélectrolytes utilisés pour la construction des multicouches de polyélectrolytes
y Polycations utilisés :
- PoIy (allylamine hydrochloride) (PAH) (Sigma Aldrich, France, PM=70kDa) 5g/L dans du tampon (pour artères et verre) ou dans du NaCl IM (PTFEe).
- Polyethylenimine (PEI) 10 g/L (Sigma Aldrich, France, MW = 750 kDa) dans une solution de NaCl IM.
> Polyanion utilisé :
- PoIy (sodium-4-styrène sulfonate) (PSS) (Sigma Aldrich, France, PM=70kDa) 5g/L dans du tampon (pour artères et verre) ou dans du NaCl IM (PTFEe).
L'utilisation de ces polyélectrolytes est décrite dans les publications suivantes :
- C. Boura, P. Menu, E. Payan, J.C. Voegel, S. Muller, J.F. Stoltz, Biomaterials, " Endothelial cells grown on multilayered thin polyelectrolyte films: An évaluation ofa new versatile surface modification" 24, 3521-3530, 2003.
- C. Boura, S. Muller, D. Vautier, D. Dumas, P. Schaaf, J-C Voegel, J-F Stoltz, P. Menu, Biomaterials "Endothelial cell - interactions with polyelectrolyte multilayer films" 26, 4568- 75, 2005.
- D. Vautier, V. Karsten, C. Egles, J. Chluba, P. Schaaf, J.C. Voegel, J. Ogier, J Biomater Sci Polym Ed. "Polyelectrolyte multilayer films modulate cytoskeletal organization in chondrosarcoma cell" 13(6), 713-32, 2002.
- P. Tryoen-Tόth, D. Vautier, Y. Haikel, J.C. Voegel, P. Schaaf, J. Chluba, J. Ogier, J Biomed Mater Res. "Viability, adhésion, and bone phenotype of osteoblast-like cells on polyelectrolyte multilayer films" 60(4), 657-67, 2002.
Figure imgf000037_0001
PEI:.(PS.S:PAH)j.sur..les.supports.£yerre^
^"..Construction de multiçouçhes .de.polyéleçtrolytes
Selon le cas, les multicouçhes de polyélectrolytes ont été déposés dans la lumière des artères ombilicales préalablement dé-endothélialisées, sur des lames de verres ou sur du PTFEe. Ces assemblages sont réalisés à température ambiante par des dépôts successifs du support alternativement dans une solution de polycation et de polyanion. Après deux lavages avec du tampon Tris/NaCl pour les supports verre et artères, et de l'eau distillée pour le support PTFEe, les supports sont mis au contact
- de la solution de polycations (PAH) pendant 15 à 30 min, à température ambiante, pour la construction des multicouçhes (PAH-PSS)3 et (PAH-PSS)3-PAH (cas où le support est le verre ou une artère), ou,
- de la solution de polycations (PEI) pour la construction de la multicouche PEI-(PSS-PAH)3 (cas où le support est le PTFEe).
Cette étape est suivie par trois lavages avec du tampon Tris/NaCl pour les supports verre et artères, et de l'eau distillée pour le support PTFEe, permettant de déplacer les polyélectrolytes libres. La procédure est répétée avec une solution de polyanion (PSS), puis une solution de polycation (PAH). Une durée comprise entre 8 et 20 min est nécessaire pour permettre aux solutions de PSS et PAH d'être alternativement adsorbées sur le support. Entre chaque dépôt, trois lavages, avec du tampon Tris/NaCl pour les supports verre et artères, et de l'eau distillée pour le support PTFEe, sont effectués. Les multicouçhes de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 (finissant par une charge négative), (PAH-PSS)3-PAH et PEI-(PSS-PAH)3 (finissant par une charge positive) sont construites progressivement. Toutes les étapes de construction se font en maintenant le substrat dans une solution de polyélectrolytes ou d'eau distillée pour éviter le dessèchement de la surface.
^.Conservation .des [.supports. sur .lesquels .une multiço^ et définition des supports utilisés comme témoin pour, les .expériences .suivantes
*_Ças des _lames_de yerre_s_ ur_ lesquels, P AH1(PJSS-JPAH)J _a_été_dé_p_qs_é_
Avant chaque expérience, les plaques pour cultures cellulaires contenant les lames de verres sont exposées aux UV pendant 15 min permettant ainsi la stérilisation. Les lames de verre recouvertes de fibronectine (Sigma, France) à une concentration de inférieure à 250 μg/mL sont utilisées comme témoins positifs.
*_Ças du_PTFEASur_lAqμeJ_PJEI_-{PSS_-PAH)3.a été déposé
Le support PTFEe sur lequel une multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3 a été déposée est séché au minimum une nuit à 4°C après que le dépôt de la multicouche ai été effectué et avant leur utilisation. Il est conservé au maximum 15 jours à 4°C.
Le support TCPS (Tissue Culture Polystyrène Surface) est le matériau le plus couramment utilisé pour la culture cellulaire, et il représente un polymère largement employé pour l'étude des mécanismes des interactions entre cellules et matériau artificiel. Il est utilisé comme contrôle positif.
*_Ças des .artères _Sur .lesquelles. (P AH-PS S)3_qu XPAH1P S S)3rP AH_ont_été_dép_os_é_s
Les artères dé-endothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, sont soumises à plusieurs injections de tampon de lavages et sont considérées comme contrôle (artère témoin). Les artères sur lesquelles des multicouches de polyélectrolytes ont été déposées et les artères contrôles sont conservées pendant toute une nuit à 40C dans une solution de décontamination avant utilisation. Celle-ci est constituée de milieu RPMI 1640 (Gibco BRL, France) supplémenté de 100 UI/mL de pénicilline (Gibco BRL, France), de 100 μg/mL de streptomycine (Gibco BRL, France) et de 2,5 μg/mL de Fungizone® (Gibco BRL, France).
1.3. Validation du dépôt de la multicouche de polyélectrolyte
L 3.1.. Lorsque le .support est le PTFEe
La vérification du dépôt homogène de la multicouche de polyélectrolytes sur le support PTFEe a été effectuée par microscopie confocale à balayage laser. La figure 1 montre la mise en évidence du recouvrement de toute la surface par la multicouche de polyélectrolytes [PEI-(PSS-PAH)2-PSS-PAH*] grâce à l'utilisation du polycation hydrochlorure de poly(allylamine) couplé de façon covalente à la rhodamine (PAH*) (λexcitation = 541nm, λémission. = 572nm, ICS, UPR 22 CNRS, Strasbourg, France) lors de la construction des multicouches de polyélectrolytes. 1...3.2..Lorsque i.le.support est.un .vaisseau ,pu. une. artère
La vérification du dépôt homogène de la multicouche de polyélectrolytes sur la surface interne des vaisseaux a été effectuée par microscopie confocale à balayage laser. Les figures 2A à 2E montrent la mise en évidence du recouvrement de toute la surface interne d'une artère par la multicouche de polyélectrolytes [(PAH-PSS)2-PAH*-PSS-PAH*] grâce à l'utilisation du polycation hydrochlorure de poly(allylamine) couplé à la rhodamine (PAH*) lors de la construction des multicouches de polyélectrolytes.
Exemple 2 : Evaluation mécanique de la matrice artérielle
2.1. Description du banc et de l'expérience
Les tests mécaniques sont effectués à l'aide d'un banc d'essai développé au laboratoire. La pression est fournie par un capteur de pression (XTC- 190M-0.35 BARVG, Kulite, Inc) situé en sortie de la pompe (EX3O3C-5O, Prodera, France). L'information est représentative de la pression exercée sur les parois internes de l'artère. Le diamètre extérieur de l'artère est évalué par une caméra CCD (FZS 1024, Sensopart UK Ltd), qui en mesure la déformation. Le bloc CCD délivre une tension en fonction de la quantité de lumière reçue par un néon, qui sert de source de lumière étalon.
Chaque extrémité de l'artère (traitée et témoin) est montée sur des embouts en plastique, puis l'artère est fixée dans une chambre en plexiglas remplie d'eau physiologique préchauffée à 370C. Il est nécessaire que l'artère soit bien tendue. À l'aide d'une seringue munie d'un tuyau, l'intérieur de l'artère est rempli d'eau physiologique en évitant la formation de bulles d'air. L'extrémité libre de l'artère est clampée pour fermer le circuit. La pompe augmente ainsi la pression dans ce circuit fermé.
Les paramètres sont entrés dans un logiciel permettant de contrôler la pompe. La pression dans l'artère augmente par paliers constants toutes les 15 secondes jusqu'à 230 mm Hg (avec un incrément de 30 mm Hg). Le diamètre externe de l'artère est enregistré pour chaque pression.
Le pourcentage de déformation est calculé selon l'équation suivante :
ΔD=100 x (Dp - D0)/D0 dans laquelle
Dp, le diamètre correspondant à chaque pression. DO, le diamètre à 0 mmHg. L'élasticité des artères correspond à la droite ΔD sur pression, mesurée à des pressions physiologiques (entre 80 et 150 mmHg).
2.2. Résultats
Les figures 3 et 4 montre que les propriétés mécaniques de la paroi artérielle après dépôt de la multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH sur une artère déendothélialisée sont restaurées. En effet, le pourcentage de déformation de l'artère en fonction de la pression exercée sur cette artère est similaire pour des artères fraîches (•) et des artères déendothélialisées sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PS S)3- PAH a été déposée (-*• ), et est supérieur à celui des artères déendothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée ( B ).
Exemple 3 : Prolifération de cellules endothéliales sur du PTFEe sur lequel une multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3 a été déposée
3.1. Culture des cellules endothéliales
3. •. It  : Composition .des solutions, utilisées
• Tampon HBSS (Hank's balanced salts solution) (Sigma, France) sans Ca2+ ni Mg2+ contenant 0,4 g/L de KCl, 8 g/L de NaCl, 0,06 g/L de KH2PO4, 0,04778 g/L de Na2HPO4, 1 g/L de D-glucose, 0,011 g/L de rouge de phénol, pour IL d'eau distillée (pH 7,2). Il doit être filtré sur 0,22μm et conservé à 4°C.
• Solution de digestion trypsine-EDTA à 0,25% (Sigma, France) contenant 2,5 g de trypsine porcine et 0,2 g de EDTA-Na4 dans 100 mL d'HBSS. La trypsine est une enzyme protéolytique qui hydrolyse les liaisons peptidiques.
• Milieu de culture ou « milieu complet » constitué de :
" Milieu M 199 et milieu RPMI 1640 volume par volume (GibcoBRL, France) " 20% de sérum humain AB décomplémenté (provenant de donneurs volontaires sains).
• 2 mM de glutamine (GibcoBRL, France)
• 100 LVmL de pénicilline (GibcoBRL, France)
" 100 μg/mL de streptomycine (GibcoBRL, France) " 2,5 μg/mL de Fungizone (GibcoBRL, France)
• 20 mM d'HEPES (Sigma, France) • Phosphate Buffer Saline (PBS) contenant NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 InM5 KH2PO4 1,4 mM.
3. L 2. Cellules .utilisées
Les cellules endothéliales nécessaires à cette étude proviennent de veines ombilicales humaines (HUVECs Human Umbilical Vein Endothelial Cells). Elles sont prélevées à partir de cordons ombilicaux de nouveaux-nés (dons de la Maternité Régionale de Nancy). Les cordons proviennent de donneurs sains, après leur consentement. Recueilli dès l'expulsion placentaire, le cordon est coupé à une dimension de 20 à 25 cm et immédiatement mis dans un flacon de culture de 75 cm2 contenant 150 mL de HBSS stérile. Placé rapidement à 4°C, le cordon est utilisé le plus tôt possible. Il peut se garder entre 4 et 6 heures.
3-.1.3..Isolement: des cellules ; endothéli.ales à partir de çprdon^^
La mise en culture des cellules est effectuée selon la méthode de Jaffe (E.A. Jaffe,
R.L. Nachman, CG. Becker, CR. Minick, J Clin Invest. "Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologie and immunologie criteria. " 52(11), 2745-56, 1973) et se fait en plusieurs étapes :
3.1.3.1. Lavage de la veine ombilicale
Le tampon HBSS est éliminé de la boîte et le cordon est déposé dans une boîte de culture stérile. L'extérieur du cordon est nettoyé à l'éthanol 75%. Un robinet est fixé à l'un des orifices de la veine ombilicale et ligaturé fortement au cordon. A l'aide d'une seringue, la veine est lavée trois fois avec du tampon HBSS (filtré et préchauffé à 37°C) pour en éliminer le sang. Puis, l'autre extrémité du cordon est clampée.
3.1.3.2. Détachement des cellules de la veine ombilicale
On injecte 15-20 mL de la solution de digestion (filtrée et préchauffée à 37°C) dans la veine jusqu'à ce qu'elle soit suffisamment dilatée. Le cordon est immergé dans 200 mL d'HBSS ; l'ensemble est placé 10 minutes à 370C dans un bain-marie. Le cordon est ensuite posé délicatement sur une boîte de culture et massé quelques secondes. Il est ensuite déclampé au-dessus d'un tube plastique de 50 mL (Polylabo, France) contenant 20 mL de milieu complet pour arrêter l'action de la trypsine et dans lequel est recueillie la solution de digestion contenant les cellules endothéliales libres. La veine est alors rincée avec du tampon HBSS pour entraîner dans le tube les cellules encore présentes. La suspension cellulaire est centrifugée à 1200 tr/min (300g) pendant 6 minutes, à température ambiante. Après centrifugation et dépôt du surnageant, le culot cellulaire est remis en suspension dans 10 mL d'HBSS. Puis on effectue une deuxième centrifugation. Les cellules sont remises en suspension dans 5 mL de milieu complet, ensemencées dans un flacon de culture de 25 cm2 et placées dans un incubateur à 37°C (5% CO2 et 95% d'air) et à saturation en humidité.
3 , 1.4. Culture des. cellules
Le jour suivant l'extraction des cellules endothéliales, les cellules sont lavées deux fois avec du tampon HBSS en effectuant de petits mouvements oscillatoires de façon à éliminer les globules rouges. Puis les cellules sont remises dans l'incubateur avec 5mL de milieu complet. Le milieu est renouvelé tous les deux jours. Normalement, après 5-7 jours, les cellules sont confluentes.
A confluence, les cellules sont lavées par deux fois avec 5 mL d'HBSS (préchauffé à 37°C) et placées en contact avec 5 mL de trypsine-EDTA 0,125% (filtrée), à 37 0C, pendant 3 minutes.
L'action de digestion de la trypsine est arrêtée grâce à l'ajout de 5 mL de milieu complet. La suspension cellulaire est recueillie dans des tubes coniques stériles puis centrifugée à 1200 tr/min (300g) pendant 6 minutes. Les cellules sont alors remises en suspension dans 5 mL de milieu complet.
3.1.5.. Ensemencement de.s.çeπuk multiçp.uçhe de poly.électrolytes
Les cellules sont ensemencées, après leur deuxième passage (P2), à la densité cellulaire de 5.104 cellules/puits sur du PTFEe sur lequel a été déposée la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3, sur du PTFEe sur lequel a été déposée une monocouche de PAH, sur du PTFEe seul et sur TCPS (Tissue Culture Polystyrène Surface) (contrôle positif). Le milieu est changé tous les 3 jours.
3.2. Evaluation de la biocompatibilité des surfaces
3,2..1..Evaluation^
Seifalian et col. (A. M. Seifalian, HJ. Salacinski, G. Punshon, B. Krijgsman, G.
Hamilton, J. Biomed. Mater. Res. "A new technique for 'measuring the cell growth and metabolism of endothelial cells seeded on vascular prostheses. " 15, 55(4), 637-44, 2001) ont démontré que Alamar blue (Serotec Ltd, Kidlington, England) est un agent qui a de nombreux avantages dans l'évaluation du métabolisme des cellules endothéliales et donc de la viabilité des cellules en croissance sur les prothèses vasculaires.
Alamar blue redox assay (ABRA) (test Alamar blue®) est une technique que l'on a utilisée pour contrôler la viabilité des cellules endothéliales ensemencées sur le substitut vasculaire (PTFEe). Cette technique permet de mesurer quantitativement la prolifération cellulaire, la cytotoxicité et la viabilité. Alamar blue est composé d'un indicateur Rédox (indicateur colorimétrique) qui change de couleur en fonction de la réduction chimique du milieu de culture. Alamar blue est réduit par l'activité mitochondriale, représentative de l'activité métabolique cellulaire et donc de la viabilité cellulaire.
Alamar Blue a des propriétés intéressantes car il est soluble dans le milieu, stable en solution, non toxique pour les cellules et produit des changements facilement mesurables. Le test ne nécessite pas la lyse des cellules, ce qui permet de suivre la cinétique du signal.
La mesure de la viabilité cellulaire est donc basée sur le taux d'oxydoréduction d'Alamar blue déterminé par la différence entre la mesure densitométrique à 570 nm (absorbance du composé réduit) et celle à 630 nm (absorbance du composé oxydé). Compte tenu du recouvrement partiel des spectres d'absorption du composé réduit (rouge) et du composé oxydé (bleu), l'absorbance est mesurée à 2 longueurs d'onde et la différence de densité optique (DO) est déterminée selon la formule :
Δ DO = [DO(570nm)cxp -DO(630nm)cxp.] - [DO(570nm),ém - DO(630nm)tém ] exp. = expérimental tém. = témoin sans cellules Δ = différence
La procédure est la suivante. Le test Alamar blue est réalisé selon le protocole choisi. Les cellules endothéliales sont ensemencées sur les surfaces pendant 1, 3, ou 7 jours. Au temps choisi, le milieu de culture est remplacé par un milieu frais sans sérum contenant 10% v/v d'Alamar blue (la sensibilité de la technique Alamar blue dépend du ratio volumétrique entre Alamar blue et le milieu DMEM (Dulbecco 's Modiβed Eagle Médium) sans rouge de phénol (GibcoBRL, France)). On dépose 500 μL de ce mélange dans chaque puit. La plaque de culture est placée dans l'incubateur à 370C.
La mesure densitométrique intervient 3 heures après l'adjonction du marqueur. La différence de densité optique (indice de la viabilité cellulaire) est alors déterminée. Des puits sans cellules sont utilisés comme référence. La figure 5 montre le résultat du test de viabilité des cellules endothéliales ensemencées sur :
- du TCPS,
- du PTFEe,
- du PTFEe sur lequel a été déposé le polyélectrolyte PAH (monocouche), ou,
- du PTFEe sur lequel a été déposée la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3
Après un jour de culture, aucune différence d'activité métabolique n'est détectable.
Après 3 jours de culture, une augmentation significative de l'activité métabolique des cellules est mesurée sur le TCPS. Sur les supports PTFEe, l'activité métabolique reste similaire à celle observée après un jour de culture.
Après sept jours de culture, les valeurs de l'activité métabolique observées pour le PTFEe sur lequel a été déposée la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3 (0.59 ± 0.20) sont similaires à celles observées pour le support TCPS. Par contre, pour la même durée de culture, les valeurs de l'activité métabolique observées pour le PTFEe sur lequel a été déposé le polyélectrolyte PAH et pour le PTFEe seul sont significativement inférieures à celles observées pour le PTFEe sur lequel a été déposée la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3.
Les cellules endothéliales ont donc commencé à proliféré sur le PTFEe sur lequel a été déposée la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3 après trois jours de culture et la maturation pour obtenir des cellules confluentes a lieu dans les sept jours de culture. De plus, une faible densité cellulaire (5.104 cellules / cm2) a été suffisante pour obtenir une monocouche de cellules confluentes.
Par contre, le dépôt d'une seule couche de polyélectrolyte PAH sur le PTFEe n'est pas suffisant pour observer une viabilité cellulaire similaire après une durée de culture identique.
3.2.2..Moiphologie cellulaire par m
Pour réaliser l'observation au microscope électronique (STEREOSCAN S 240, CAMBRIDGE (UK)), les cellules doivent être fixées. On réalise deux lavages avec du tampon PBS chauffé à 37°C, puis les cellules sont fixées avec du glutaraldéhyde 2,5%, et conservées à 4°C avant observation au MEB. Les échantillons sont ensuite préparés pour permettre l'observation en microscopie électronique (déshydratation, fixation et recouvrement avec une couche d'or-palladium). Cette étude a été faite au laboratoire de Microscopie électronique (Pr Folliguet, Faculté de Médecine, Nancy).
Les figures 6A, 6B, 6C, 6D et 6E montrent que, après 7 jours de culture : - les cellules endothéliales ensemencées sur le support PTFEe (témoin) sont peu nombreuses et ont un aspect rond, représentatif d'un mauvais étalement et d'une mauvaise adhérence des cellules sur ce support (figures 6A et 6B),
- les cellules endothéliales ensemencées sur un polyélectrolyte PAH déposé sur le support PTFEe ne sont que rarement bien étalées (figures 6C et 6D) et le nombre de cellules adhérentes est faible,
- les cellules endothéliales ensemencées sur la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS- PAH)3 déposée sur le support PTFEe sont nombreuses et étalées, ce qui signifie qu'elles sont adhérente à la multicouche; une monocouche de cellules endothéliales confluente a été obtenue en moins de sept jours de culture; la densité cellulaire est élevée et il difficile de différencier les cellules les unes des autres; une distribution homogène est observée.
3.2,3.. Caractéπsatipn des cellules endothéliales
Le phénotype des cellules endothéliales est évalué par l'expression du facteur von Willebrand (vWf) en microscopie confocale. Dans le but de visualiser chaque cellule les noyaux sont marqués avec de l'iodure de propidium. Après 7 jours de culture, les cellules endothéliales sont lavées avec du DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium) sans rouge de phénol (Gibco BRL, France) à 37°. Elles sont ensuite immédiatement fixées avec du PAF (paraformaldehyde) 1% v/v dans du PBS. Après 10 minutes à température ambiante, on retire le PAF et on perméabilise les cellules en utilisant du Triton-XlOO (Sigma, France) à 0,5% dans du PBS. Les cellules sont ensuite incubées pendant 45 minutes avec un anti-corps monoclonal vWf de souris anti-humain (clone F8/86, Dako, Trappes, France) dilué au 1/50 éme dans du Triton 0.1%. Les cellules sont ensuite lavées avec du DMEM poour enlever les excès d'anti-corps et sont incubées pendant 30 minutes avec un anti-corps polyclonal IgG anti-souris conjugué à de l'Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Oregon, USA) dilué à 1/100eme dans du DMEM. Le contrôle isotypique est préparé dans les mêmes conditions. Les cellules sont incubées pendant 30 minutes avec de l'iodure de propidium (IP) (λexcitation = 535 nm, λémission. = 617 nm, Molecular Probes, 1 mg/mL dans de l'eau distillée) dilué au l/1000ème dans du DMEM. Les cellules marquées sont ensuite visualisées au microscope confocale à balayage laser en utilisant un objectif 40 et un laser He-Ne pour l'excitation 543nm (IP) et un laser Ar pour l'excitation 488 nm (vWf).
La figure 7 montre que toutes les cellules adhérentes à la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3 déposée sur le support PTFEe expriment le facteur vWF, caractéristiques de cellules endothéliales, après 7 jours de culture. Ces observations montrent l'absence de dé-différenciation : les cellules ont conservé leur fonctionnalité endothéliale.
Exemple 4 : Prolifération de cellules endothéliales sur des artères sur lesquelles a été déposée une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH
4.1. Matériel utilisé ^..Composition du milieu de ç.^
Le milieu utilisé est celui décrit au paragraphe 1.1.3. « Composition du milieu complet» ci- dessus. t. Cellules .utilisées Les cellules utilisées sont celles décrites au paragraphe 3.1.2. « cellules utilisées »
4.2. Mise en culture de cellules endothéliales issues de la veine ombilicale
Un cordon ombilical est placé dans une boîte de Pétri stérile. L'extérieur du cordon est nettoyé avec de l'éthanol 70°. L'orifice de la veine ombilicale est repéré à l'aide d'une pince pour y insérer un robinet stérile. Afin d'éliminer le sang de la veine ombilicale, cette dernière est lavée trois fois avec du tampon HBSS (Hank's Balanced Sait Solution). La veine ombilicale est alors remplie avec 15 à 20 mL d'une solution de digestion préchauffée à 37°C (trypsine/EDTA 0,25%). Le cordon, immergé dans du tampon HBSS, est placé dans au bain marie. Après 12 min d'incubation, la solution de digestion est recueillie dans un flacon de 50 mL contenant 5 mL de milieu complet. La veine est lavée avec du tampon HBSS. La suspension cellulaire est centrifugée à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Le culot cellulaire est remis en suspension dans 10 mL de tampon HBSS. Après le deuxième lavage, les cellules sont remises en suspension dans 5 mL de milieu complet. Les cellules endothéliales (HUVEC) sont ensemencées dans un flacon de culture de 25 cm2, puis placées dans un incubateur à 37°C (5% de CO2 et 95% d'air).
4.3. Endothélialisation des artères
Lorsque la confluence des cellules endothéliales est atteinte, le milieu de culture est éliminé et les cellules sont lavées deux fois avec 5 mL de tampon HBSS sans Ca2+ ni Mg2+. Ce lavage permet d'une part d'éliminer le sérum qui inhibe l'activité enzymatique de la trypsine, et d'autre part de libérer des ions Ca2+ qui secondairement, facilitent le détachement des cellules. Les cellules sont alors détachées à l'aide de 5 mL de solution de Trypsine-EDTA 0,125%. L'action de la trypsine est arrêtée, après 2 min à 37°C en ajoutant 10 mL de milieu complet. La suspension cellulaire est recueillie dans un tube Falcon stérile de 50 mL, puis centrifugée à 300 g. Le culot cellulaire est remis en suspension dans du milieu complet.
Au deuxième passage (Pl)5 les cellules sont alors ensemencées à une densité cellulaire de 105 cellules/cm2 dans les différentes matrices (artères sur lesquelles ont été déposée une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH et artères contrôles). Afin de permettre une meilleure répartition des cellules, les substituts endothélialisés sont placés dans des Falcon stériles sous légère agitation pendant 4 heures. Ils sont mis en culture dans un incubateur à 37°C, 5% CO2 pendant 7 jours.
4.4. Résultats
4- .4..1.. S uivi du phénotype par .hi s to lpgie
Les figures 8A à 8D montrent que les cellules endothéliales recouvrent toute la surface luminale de l'artère re-endothélialisée sur laquelle a été déposée ou non une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH . Les figures 8C et 8D montrent le maintien du phénotype endothélial après endothélialisation.
4,4 -.2.. Evaluation, de 1 ' étalement .par rniçroscpp.ie électronique
Les figures 9A à 9C montrent que l'étalement des cellules endothéliales ensemencées sur l'artère sur laquelle a été déposée la multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH (9B) est proche du témoin (artère fraîche 9C) et est meilleur que celui sur l'artère sur laquelle aucune multicouche n'a été déposée (9A).
Exemple 5 : Rétention cellulaire après flux
5.1. Description de l'expérience
L'évaluation de rétention des HUVEC ensemencés dans la lumière des artères est effectuée dans une chambre de flux développée au laboratoire. Les cellules endothéliales sont exposées à des flux laminaires de 1 Pa (10 dynes/cm2), pendant une durée d'une heure.
Une pompe péristaltique (Ismatech, Suisse) permet une circulation du milieu de culture. En amont de la chambre, deux seringues sont ajoutées au circuit, permettant de créer une modulation sinusoïdale afin d'amortir les fluctuations parasitaires de l'écoulement. Un mélange gazeux (5% CO2 et 95% air) est introduit dans le réservoir de milieu pour réguler les variations de pH. Le système est placé dans une étuve régulée à 37°C.
La contrainte de cisaillement est calculée par l'équation suivante :
τ = 4 Q μ/ π r3 τ = contrainte de cisaillement (Pa) μ = viscosité du milieu complet 0.9.10"3 Pa.s à 37°C.
Q = débit (mVs). r= rayon (m).
Par conséquent, la valeur du débit de la pompe péristaltique permet de connaître la contrainte de cisaillement exercée dans la lumière de l'artère. La pompe péristaltique a été étalonnée en réalisant une mesure du débit en fonction de la vitesse de rotation.
Suite à cet étalonnage, la relation suivante a été obtenue par régression linéaire :
Débit (crm/s) = 0,458e"3 vitesse de rotation (graduation) + 7,049e"4
permettant de choisir précisément la contrainte de cisaillement appliquée.
5.2. Résultats
5 ,2. ! . Evaluation de la rétention. cellulaire p.ar miçroscopie. çonfocale à balayage laser
Les figures 10A à 1OD montrent que, après avoir soumis les artères à une contrainte de cisaillement de 1 Pa pendant une heure, un détachement des cellules endothéliales est observé sur les artères endothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée (Flèches). Par contre, pour les artères sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée, la couche de cellules endothéliales est toujours présente.
5.2.2. Evaluation, de. la rétention cellulaire par .miçrosçopie. électronique .
Les figures 1 IA à 1 ID montrent que, après avoir soumis les artères à une contrainte de cisaillement de 1 Pa pendant une heure, un détachement des cellules endothéliales est observé sur les artères endothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée (Flèches). Par contre, pour les artères sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée, la couche de cellules endothéliales est toujours présente. De plus, les jonctions entre les cellules ne sont plus visibles, ce qui signifie que l'étalement des cellules endothéliales est très bon.
5.2.3.. Conclusion
Les résultats des figures 1OA à 10D et HA à HD montrent que la rétention des cellules endothéliales ensemencées sur la surface interne des artères sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée est meilleure que celle des cellules endothéliales ensemencées sur la surface interne des artères sur lesquelles aucune multicouche n'a été déposée.
Exemple 6 : Evaluation In vivo des substituts artériels
Dans cet exemple, les substituts vasculaires (artères ombilicales) traités avec une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 sont évalués chez l'animal (le lapin). Les artères non traitées dé-endothélialisées sont utilisées comme contrôle.
6.1. Description de l'expérience
6 -. ! : i : Ani m .aux
Toutes les expérimentations effectuées sur le lapin ont été réalisées en respectant les règles de bioéthique en vigueur en Europe (Décret n° 2001-131 du 6 février 2001, lié à la directive européenne 86-609-CEE de 1986). Ainsi les animaux (lapins blancs néo-zélandais mâles, pesant 3 ± 0,25 kg) ont une origine contrôlée (CEGAV, St Mars d'Egrenne, France), et ont été hébergés dans une animalerie agrées et toutes les précautions nécessaires ont été prises pour éviter toute souffrance à l'animal lors des expérimentations.
6.-.l.;2..Anesthésie
L'induction de l'anesthésie est réalisée, via la veine marginale externe de l'oreille, au moyen d'un cathéter intraveineux (Nécessaire épicrânien Salva, COOPER, Rhône-Poulenc Rorer, Melun, France), par l'injection lente d'une dose de 40 mg/kg de pentobarbital sodique (Ceva Santé Animale, France), dilué au quart dans du sérum physiologique (NaCl 0,9% Cooper, Rhône-Poulenc, France). Contrairement aux anesthésiques volatils, le pentobarbital sodique ne semble pas modifier le comportement des polynucléaires neutrophiles ni des plaquettes. L'efficacité de l'anesthésie est vérifiée avant le début de tout acte chirurgical par pincement interdigital de la patte arrière du lapin. L'anesthésie est entretenue par injection intra-veineuse (veine marginale de l'oreille) de pentobarbital dilué au 1A dans du sérum physiologique de façon itérative.
6.1.3. Chirurgie
L'animal anesthésié est placé en décubitus dorsal sur la table chauffante et sa température corporelle est maintenue constante à 37°C. Les zones d'intervention chirurgicales sont rasées puis désinfectées à la polyvidone iodée (Bétadine dermique 10% ™ Laboratoire Sarget, Mérignac, France).
. , 1.4. Çathétérisation de 1.' artèr e_ fémorale pour prélèvement du sang
Après anesthésié locale à la Xylocaïne, une incision est pratiquée dans la région du pli de l'aine droite, sur environ 3 cm. L'artère fémorale est isolée du trajet du nerf et de la veine, puis dégagée et incisée pour introduire un cathéter en polyéthylène, de diamètre interne : 0,58 mm et diamètre externe : 0,96 mm, rempli de sérum physiologique héparine. Ce cathéter est avancé sur environ 1 cm et permet de prélever 50 mL de sang recueillie dans des seringues de 20 mL préalablement héparinées.
La plaie est nettoyée avec de la polyvidone iodée et la peau est suturée avec du fil en polyglactine 2 - 0 (Vicryl, Ethicon). L'animal est ensuite remis à l'animalerie dans les conditions décrites précédemment.
6... ! ..5. Imp 1 antation des s ub s titut s artérie 1 s
Sur un animal préalablement anesthésié, une anesthésié locale supplémentaire à la Xylocaïne (Astra Zenaca, Monts, France) est appliquée, puis une incision d'environ 4 cm est pratiquée au niveau du cou, le long de la trachée. L'artère carotide droite est dégagée. Une administration intra-veineuse de 300 LVmL d'Héparine de sodium (Sanofi synthelabo, France) est effectuée juste avant mise en place des clamps vasculaires (niveau proximal et distal).
Après avoir clampé la carotide, une artériotomie (0,5 cm) est pratiquée au niveau proximal, à une distance d'environ 1 cm du clamp, puis au niveau distal, pour y insérer le greffon vasculaire par pontage termino-latéral. L'anastomose est réalisée à l'aide de fils vasculaire 8 - 0. Une fois le greffon en place, l'artère carotide est ligaturée et la circulation sanguine dans le greffon est vérifiée. 6 , 1 :6.. S.uiy i du substitut artériel au. cours du temps
Les substituts artériels sont suivis jusqu'à 3 mois. La perméabilité des substituts est vérifiée par Echo-doppler. Cet appareil a permis de mesurer le flux sanguin ainsi que l'évolution du diamètre du substitut.
6 , 1.7. Euthanasie et prélèvement. des .substituts artériel
Après 1 et 12 semaines de mise en place du substitut, les greffons ainsi que les carotides témoins (gauches) sont prélevés, rincés délicatement avec de l'eau physiologique héparinée, puis soumis à des examens macroscopique et microscopique.
Les animaux sont euthanasies par injection d'une dose létale de pentobarbital sodique, conformément aux recommandations publiées par la Commission Européenne (décret n° 2001-131 du 6 février 2001, lié à la Directive européenne 86-609-CEE de 1986). La mort de l'animal est constatée après arrêts respiratoire et cardiaque.
6.2. Résultats
6,2.J...Histplpgie
L'étude histologique des substituts des figures 12A à 12F montre:
- l'obstruction de la lumière des artères contrôles après 1 semaine d'implantation,
- que les artères sur lesquelles ont été déposée une multicouche de polyélectrolytes restent perméables après 1 semaine et jusqu'à 3 mois d'implantation, avec suivi hebdomadaire du passage du sang dans les artères.
. ,2.2. Micrpsçopie .électronique à balayage
Les observations effectuées au microscope électronique à balayage (figures 13A à 13F) montrent
- l'obstruction de la lumière des artères contrôles après 1 semaine d'implantation,
- que les artères traitées ne montrent pas la présence de caillots après 1 semaine et 3 mois d'implantation.
6.2.3. Echo-dpppler
La fonctionnalité des substituts artériels est suivie sur un animal vigile par une technique non invasive : l' « echo-doppler ». Cet appareil a permis de mesurer la vitesse du sang ainsi que l'évolution du diamètre des substituts artériels. Les tracés obtenus (figures 14A à 14C) montrent que, l'artère sur laquelle une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 a été déposée, a une bonne perméabilité. Le calcul de l'aire sous la courbe des tracés montre que la vitesse du sang dans le substitut artériel est égale à celle mesurée dans la carotide témoin. La mesure du diamètre de chaque substitut artériel ne montre aucune dilatation ni anévrisme.
Exemple 7 : Cellules souches EPC se différenciant en cellules endothéliales sur support synthétique
7.1. Matériel
Composition du milieu de culture de p.rpgéniteurs endothéliaux :
Milieu commercial : EBM-2 supplémenté avec un cocktail de facteurs de croissance (VEGF, hydrocortisone, hFGF, IGF, Ac Ascorbique, hEGF, héparine) (Single Quot®) (Clonetics,
Belgique).
7.2. Mise en culture des progéniteurs endothéliaux
Une fraction leucocytaire de la circulation périphérique a été obtenue après séparation par un gradient de densité. Un mélange de sang héparine et de PBS (Phosphate Buffer Saline) (10 mL de sang dans 16 raL de PBS) est ajouté doucement à 10 mL d'Histopaque® 1077 (Sigma, France), puis centrifugé à 400 g pendant 30 min. L'anneau de leucocytes est aspiré avec une pipette pasteur stérile et transféré dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de MCDB 131 (Gibco, France) supplémenté de 5 U/mL d'héparine de sodium (Sigma, France). Le tube est ensuite centrifugé à 250 g pendant 10 min, le surnageant est éliminé et le culot est resuspendu dans 10 mL de MCDB 131 héparine. Cette dernière opération est répétée trois fois. Le culot est alors resuspendu dans du milieu de culture EBM-2 supplémenté avec un cocktail de facteurs de croissance (Single Quot®) (Clonetics, Belgique). Environ l * 106 EPC (Endothelial Progenitor CeIl) par cm2 sont mise en culture dans un flacon de culture de 25 cm2 traité avec de la fibronectine (20 μg/mL) ou une multicouche de polyélectrolytes (PAH- PSS)3-PAH. Le milieu de culture est changé après quatre jours ce qui permet d'éliminer les cellules non adhérentes, puis tous les deux jours. Ces cellules sont cultivées pendant 2 semaines à 370C et 5% de CO2.
7.3. Résultats 1.3. -.1 : .MiP.roscopie à .contraste .de .phase
Les figures 15A à 15F montrent des images obtenues après observation en microscopie à contraste de phase et illustre la différenciation des progéniteurs endothéliaux en cellules endothéliales matures. Sur la lame de verre sur laquelle une multicouche de polyélectrolytes a été déposée, une monocouche de cellules est obtenue après 14 jours de culture (addition de facteurs de croissance (VEGF, hydrocortisone, hFGF, IGF, Ac Ascorbique, hEGF, héparine) dans le milieu). L'aspect morphologique de la monocouche obtenue est semblable à celle des cellules endothéliales matures issues de la veine jugulaire de lapin (JVEC). En comparaison, 60 jours sont nécessaires pour obtenir une monocouche de cellules sur lame de verre recouverte de fibronectine.
7.-.3.-.2..Microscopie confoçale à .balayage i.laser
La caractérisation phénotypique des cellules après 14 jours de culture est effectuée par observation en microscopie confoçale à balayage laser (Figures 16A à 16L). La monocouche de cellules obtenue sur la multicouche de polyélectrolytes correspond bien à une monocouche de cellules endothéliales (PECAM-I, vWF positifs). Les cellules sont fonctionnelles car elles ont acquis la capacité à incorporer les LDL. Ces cellules expriment également les fibres d'actine, signe d'une bonne adhésion et d'un bon étalement.
7,3.3...Etude ;.. semi-quantitative de ..la fluorescence sur . des images pb^ confoçale
L'étude semi-quantitative de la fluorescence sur des images obtenues en microscopie confoçale après 14 jours de culture (figures 17A à 17C) confirme que :
- la monocouche de cellules obtenue sur la multicouche de polyélectrolytes correspond bien à une monocouche de cellules endothéliales (PECAM-I, vWF positifs);
- ces cellules sont fonctionnelles car elles ont acquis la capacité à incorporer les LDL;
- les cellules endothéliales issues des EPC ensemencées sur une couche de fibronectine après 14 jours de culture ont moins bien proliféré que les cellules endothéliales issues des EPC ensemencées sur une multicouche de polyélectrolytes après 14 jours de culture.
7-.3:4..Test de viabilité
La figure 18 montre le résultat d'un test de la viabilité cellulaire avec Alamar Blue®. Le principe et la procédure de ce test ont été explicités dans l'exemple 3. La figure 14 montre que la multicouche de polyélectrolytes n'a aucune incidence sur la viabilité des progéniteurs. Une différence significative est observée entre les cellules endothéliales issues de l'ensemencement de EPC sur une multicouche de polyélectrolytes, et celles issues de l'ensemencement de EPC sur la fibronectine. Une bonne activité métabolique des cellules signe d'une bonne prolifération cellulaire, est observée pour les cellules endothéliales issues de l'ensemencement de EPC sur une multicouche de polyélectrolytes.
Exemple 8 : cellules souches EPC se différenciant en cellules endothéliales sur support naturel
8.1. Ensemencement de cellules endothéliales progénitrices dans la lumière des matrices artérielles.
Réactif :
• Bleu de trypan (Sigma, France). β Agitateur à balancement générant des mouvements de bascule lents (APELEX,
France).
• Milieu de culture EBM-2 supplémenté de facteurs de croissances (Clonectics, Belgique).
Des EPC issus du sang périphérique de lapins, sont récupérés et les cellules sont comptées sur une cellule de Thoma. La viabilité est estimée selon le test d'exclusion au bleu de Trypan (Sigma, France). Un volume de la solution de bleu de Trypan finale est additionné à un même volume de suspension cellulaire. Les cellules ne permettant pas l'entrée du colorant sont considérées comme vivantes.
La suspension cellulaire est ajustée et injectée dans les différentes matrices (Artères sur lesquelles une monocouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée, et les artères contrôles) (avec une longueur de 4 cm), la densité cellulaire est de 1 x10 cellules/cm . Afin de permettre une meilleure répartition des cellules, les substituts endothélialisés sont placés dans des Falcon stériles sous légère agitation pendant 4 heures.
Les artères sont ensuite placées dans des flacons (une artère par flacon) de culture et mises dans un incubateur à 37°C (5% de CO2 et 95% d'air). La durée de culture est d'une semaine.
8.2. Stimulation mécanique : Différenciation sous contraintes de cisaillement. Afin d'évaluer la rétention des EPC ensemencés dans la lumière des artères (sur lesquelles une multicouche de polyélectrolyte a été déposée, et contrôles (sans multicouche)) et d'améliorer leurs différenciations, celles-ci ont été exposées à un flux laminaire. Ce dernier permet de générer des contraintes de cisaillement de 0,1 à 0,25 Pa.
Cette étude est réalisée dans une chambre d'écoulement développée au laboratoire (Figure 19). La durée d'exposition est de 48 heures. Descriptif du circuit :
• Un réservoir de milieu de culture complet.
• Une pompe péristaltique (Ismatech, Suisse).
• Une arrivée d'air.
• Des tuyaux en Pharmed® ainsi que des raccords autoclavables (Bioblock, France).
• Chambre d'écoulement.
Une pompe péristaltique permet une circulation du milieu de culture sans facteurs de croissance. En amont de la chambre, deux seringues sont ajoutées au circuit, permettant de créer une modulation sinusoïdale afin d'amortir les fluctuations parasitaires de l'écoulement. Un mélange gazeux (5% de CO2 et 95% d'air)- est introduit dans le réservoir de milieu pour réguler les variations de pH. Le système est placé dans une étuve régulée à 37°C.
La contrainte de cisaillement est calculée par l'équation suivante :
τ = 4 Q μ/ π r3 τ : contrainte de cisaillement (Pa), μ : viscosité du milieu complet 0.9.10"3 Pa.s à 37°C,
Q : débit (mVs), r : rayon (m).
Par conséquent, la valeur du débit de la pompe péristaltique permet de connaître la contrainte de cisaillement exercée dans la lumière de l'artère. La pompe péristaltique a été étalonnée en réalisant une mesure du débit en fonction de la vitesse de rotation.
Le débit de la pompe péristaltique est étalonné par la graduation de la vitesse de rotation (Figure 20). La relation :
y = 0,0018 x a été obtenue par régression linéaire. Elle permet de choisir précisément la contrainte de cisaillement appliquée.
8.3. Evaluation de la rétention des cellules endothéliales matures sur le support
L'évaluation de la rétention des cellules endothéliales matures sur le support est effectuée par : comptage des cellules dans le milieu, évaluation de leur présence sur la matrice par microscopie électronique à balayage, vérification du phénotype par microscope confocal (marquage de PECAM 1, vWF, VEGFR2 et incorporation les LDL, comme au paragraphe 7.3.2.)
Exemple 9 : Cellules souches mésenchymateuses humaines se différenciant en cellules endothéliales sur support synthétique
9.1. Matériel
Les supports de culture sont des lames de verre :
- recouvertes de fibronectine (densité : 5μg/puits),
- sur lesquelles une multicouche de PEI-(PSS-PAH)3 ou (PSS-PAH)2-PAH a été déposée,
- recouvertes de gélatine (à 1%, 500μL/puits)
Le milieu de culture est le suivant : alpha MEM + 0 ,5% ou 2% de SVF
9.2. Mise en culture de cellules souches mésenchymateuses humaines et différenciation
Des cellules souches mésenchymateuses humaines sont mises en culture avec une densité d'ensemencement de 5.1O3 cellules par cm2.
Les méthodes de différenciation en cellules endothéliales sont:
- avec ou sans facteur de croissance VEGF (50 ng/mL),
- en conditions statiques ou avec cisaillement.
L'incubateur est à 370C, sous 5% CO2.
Les contraintes de cisaillement dans la chambre de flux sont de 0.5 Pa, 1 Pa, 1.5 Pa, 2 Pa pendant 24 h, 48 h, 72 h ou 96 h débutées à 7 jours de culture (durée de culture au bout de laquelle les cellules sont confluentes).
9.3. Résultats La vérification de la qualité des cellules endothéliales différenciées peut être effectuée :
- par comptage de la présence éventuelle de cellules dans le milieu, qui représentent les cellules décrochées ou mal adhérentes), ou,
- par test de viabilité (comme au paragraphe 7.3.4.).
L'évaluation du potentiel angiogénique peut être effectuée par
- libération de NO et PGI2 (prostaglandine),
- incorporation de Dil-acLDL (fonction associée aux cellules endothéliales car elles seules l'absorbent)
- liaison à la lectine UEA-I (Ulex europaeus I) : lectine spécifique des cellules endothéliales
- marquage des filaments d'actine (confocal)
- étude la morphologie en microscopie de fluorescence et confocale,
- détermination de l'expression de VE-cadhérine (CD 144), du facteur von Willebrand (vWF) et PECAM-I (CD31) par cytométrie en flux et microscopie confocale,
- RT-PCR : expression génétique des marqueurs endothéliaux : VEcadhérine, VEGFR2/R1, CD31, vWF.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation de multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support, les dites multicouches :
- étant éventuellement revêtues, partiellement ou complètement, d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives,
- et / ou comprenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, pour :
* la mise en œuvre d'un procédé de prolifération de cellules initiales, souches ou différenciées, mises en contact
- avec les susdites multicouches de polyélectrolytes
- ou avec le susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives revêtant les susdites multicouches de polyélectrolytes,
* et l'obtention d'un recouvrement
- des susdites multicouches de polyélectrolytes
- ou du susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales,
* le susdit recouvrement étant obtenu au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours après la mise en contact des susdites cellules initiales,
- avec les susdites multicouches de polyélectrolytes
- ou avec le susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, sous réserve que les dites cellules souches ne soient pas des cellules souches embryonnaires humaines.
2. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle les cellules initiales sont des cellules différenciées ou des cellules souches,
- les dites cellules différenciées étant notamment choisies parmi les kératinocytes, chondrocytes, cellules nerveuses, cellules dendritiques, cellules endothéliales, fibroblastes, épiblastes, myoblastes, cardio-myoblastes, myocytes, cellules épithéliales, ostéocytes, ostéoblastes, hépatocytes et cellules des ilôts de Langerhans, et,
- les dites cellules souches étant notamment choisies parmi les cellules totipotentes, pluripo tentes et multipotentes.
3. Utilisation selon une quelconque des revendications 1 et 2, dans laquelle les multicouches de polyélectrolytes :
* comprennent ou sont constituées de couches de préférence alternées de polycations et de polyanions,
- les dits polycations étant notamment choisis parmi la polyallylamine (PAH), la polyethylèneimine (PEI), la polyvinylamine, la polyaminoamide (PAMAM), le polyacrylamide (PAAm), le chlorure de polydiallyldimethylammonium (PDAC), des polypeptides chargés positivement tels que la polylysine et des polysaccharides chargés positivement tels que le chitosane,
- et les dits polyanions étant notamment choisis parmi l'acide polyacrylique (PAA), l'acide polymétacrylique (PMA), l'acide polystyrène sulfonique (PSS ou SPS), des polypeptides chargés négativement tels que l'acide polyglutamique et l'acide polyaspartique et des polysaccharides chargés négativement tels que le hyaluronane et l'alginate,
* et sont en particulier choisies parmi (PAH-PSS)3, (PAH-PSS)3-PAH et PEI-(PSS-PAH)3.
4. Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le nombre de couches des multicouches de polyélectrolytes est de 3 à 100, en particulier 3 à 50, notamment 5 à 10 et en particulier 7.
5. Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le support est un support synthétique ou un support naturel,
- le dit support synthétique étant notamment choisi parmi le verre, le TCPS (polystyrène dit « traité culture cellulaire »), le polysiloxane, les polyéthers de perfluoroalkyle, les polymères biocompatibles en particulier le Dacron®, le polyuréthane, le polydiméthylsiloxane, le chlorure de polyvinyle, le Silastic®, le polytetrafluoroéthylene (PTFEe), et tout matériau utilisé pour les prothèses et / ou les systèmes implantés,
- le dit support naturel étant notamment choisi parmi les vaisseaux sanguins, les veines, les artères, notamment les artères ombilicales décellularisées, les dits vaisseaux, veines et artères provenant d'organes de donneurs ou d'animaux, le derme de placenta, la vessie et tout autre support (organe) d'origine humain ou animal.
6. Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 5, pour la préparation d'endoprothèses vasculaires, de ballons d'angioplastie, d'artères ou de vaisseaux artificiels pour des greffes, de dérives vasculaires, de valves cardiaques, de composants artificiels pour le cœur, de pacemakers, d'appareil d'assistance ventriculaire, de cathéters, de lentilles de contact, de lentilles intraoculaires, de matrices pour l'ingénierie de tissu, de membranes biomédicales, de membranes de dialyse, de membranes d'encapsulation de cellules, de prothèse pour la chirurgie cosmétique, de prothèses orthopédiques, de prothèses dentaires, de pansements, de sutures, de biosenseurs de diagnostic.
7. Procédé de recouvrement in vitro de cellules initiales, souches ou différenciées, comprenant :
- la mise en contact de cellules initiales avec des multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, dans des milieux permettant la prolifération des dites cellules initiales,
- la prolifération des susdites cellules initiales,
- l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches ou du susdit ensemble de molécules revêtant les multicouches, par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales,
- la récupération éventuelle des dites cellules adhérentes, viables et confluentes sous réserve que les dites cellules souches ne soient pas des cellules souches embryonnaires humaines.
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel le procédé est un procédé de recouvrement de cellules souches initiales comprenant: - la mise en contact de cellules souches initiales avec des multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support dans des milieux permettant la prolifération des dites cellules initiales,
- la prolifération des susdites cellules souches,
- la maturation et la différenciation des susdites cellules souches en cellules différenciées,
- la prolifération des susdites cellules différenciées issues des susdites cellules initiales,
- l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment quatorze jours après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches par des cellules adhérentes, viables et confiuentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales,
- la récupération éventuelle des dites cellules adhérentes, viables et confiuentes.
9. Procédé selon la revendication 7, dans lequel le procédé est un procédé de recouvrement de cellules différenciées initiales comprenant:
- la mise en contact de cellules différenciées initiales avec des multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support dans des milieux permettant la prolifération des dites cellules initiales,
- la prolifération des susdites cellules différenciées,
- l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment quatorze jours et en particulier sept jours après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches par des cellules adhérentes, viables et confiuentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales,
- la récupération éventuelle des dites cellules adhérentes, viables et confiuentes.
10. Procédé selon une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel le procédé comprend:
- la mise en contact de cellules initiales avec des multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, dans des milieux permettant la prolifération des dites cellules initiales,
- la prolifération des susdites cellules initiales, - l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches ou du susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives revêtant les multicouches, par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales,
- la récupération des dites cellules adhérentes, viables et confluentes.
11. Procédé de recouvrement de cellules endothéliales initiales selon une quelconque des revendications 7, 9 et 10 comprenant:
- la mise en contact de cellules endothéliales initiales avec des multicouches de polyélectrolytes choisies parmi (PAH-PSS)3, (PAH-PSS)3-PAH et PEI-(PSS-PAH)3, déposées sur un support, notamment un support naturel tel qu'un vaisseau sanguin ou une artère décellularisés, ou un support synthétique biocompatible ayant une forme de vaisseau ou d'artère, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, dans des milieux permettant la prolifération des susdites cellules endothéliales initiales,
- la prolifération des susdites cellules endothéliales initiales,
- l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours et en particulier 7 jours après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches ou du susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives revêtant les multicouches, par des cellules endothéliales adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules endothéliales initiales.
12. Procédé de recouvrement de cellules souches initiales selon une quelconque des revendications 7, 8 et 10, comprenant :
- la mise en contact de cellules souches initiales avec des multicouches de polyélectrolytes choisies parmi (PAH-PSS)3, (PAH-PSS)3-PAH et PEI-(PSS-PAH)3, déposées sur un support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, dans des milieux permettant la prolifération des susdites cellules souches initiales,
- la prolifération des susdites cellules souches initiales,
- la maturation et la différenciation des susdites cellules souches en cellules endothéliales,
- la prolifération des susdites cellules endothéliales issues des susdites cellules souches initiales,
- l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un 14 jours après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches ou du susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives revêtant les multicouches, par des cellules endothéliales adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules souches initiales.
13. Procédé selon une quelconque des revendications 7, 8, 10 et 12, dans lequel les dites cellules souches initiales sont notamment choisies parmi les cellules totipotentes, pluripotentes et multipo tentes.
14. Procédé selon une quelconque des revendications 7, 9 et 10, dans lequel les dites cellules différenciées initiales sont notamment choisies parmi les kératinocytes, chondrocytes, cellules nerveuses, cellules dendritiques, cellules endothéliales, fïbroblastes, épiblastes, myoblastes, cardio-myoblastes, myocytes, cellules épithéliales, ostéocytes, ostéoblastes, hépatocytes et cellules des ilôts de Langerhans.
15. Procédé selon une quelconque des revendications 7 à 14, dans lequel les dites multicouches de polyélectrolytes
* sont constituées de couches de préférence alternées de polycations et de polyanions,
- les polycations étant notamment choisies parmi la polyallylamine (PAH), la polyethylèneimine (PEI), la polyvinylamine, la polyaminoamide (PAMAM), le polyacrylamide (PAAm), le chlorure de polydiallyldimethylammonium (PDAC), des polypeptides chargés positivement tels que la polylysine et des polysaccharides chargés positivement tels que le chitosane,
- et les polyanions étant notamment choisis parmi l'acide polyacrylique (PAA), l'acide polymétacrylique (PMA), l'acide polystyrène sulfonique (PSS ou SPS), des polypeptides chargés négativement tels que l'acide polyglutamique et l'acide polyaspartique et des polysaccharides chargés négativement tels que le hyaluronane et l'alginate, et,
* sont en particulier choisies parmi (PAH-PSS)3, (PAH-PSS)3-PAH et PEI-(PSS-PAH)3.
16. Composition comprenant :
- un support,
- des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et
- une couche de cellules souches recouvrant les dites multicouches de polyélectrolytes, sous réserve que les dites cellules souches ne soient pas des cellules souches embryonnaires humaines.
17. Composition comprenant :
- un support naturel,
- des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et
- une couche de cellules différenciées recouvrant les dites multicouches de polyélectrolytes.
18. Composition comprenant :
- un support,
- des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, les dites multicouches étant revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et / ou contenant des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et
- une couche de cellules différenciées recouvrant les dites molécules biologiques ou biologiquement actives.
19. Composition selon une quelconque des revendications 16 à 18, dans laquelle les dites multicouches de polyélectrolytes
* sont constituées de couches de préférence alternées de polycations et de polyanions,
- les polycations étant notamment choisis parmi la polyallylamine (PAH), la polyethylèneimine (PEI), la polyvinylamine, la polyaminoamide (PAMAM), le polyacrylamide (PAAm), le chlorure de polydiallyldimethylammonium (PDAC), des polypeptides chargés positivement tels que la polylysine et des polysaccharides chargés positivement tels que le chitosane,
- et les polyanions étant notamment choisis parmi l'acide polyacrylique (PAA), l'acide polymétacrylique (PMA), l'acide polystyrène sulfonique (PSS ou SPS), des polypeptides chargés négativement tels que l'acide polyglutamique et l'acide polyaspartique et des polysaccharides chargés négativement tels que le hyaluronane et l'alginate,
* et sont en particulier choisies parmi (PAH-PSS)3, (PAH-PSS)3-PAH et PEI-(PSS-PAH)3.
20. Composition selon une quelconque des revendications 16, 18 et 19, dans laquelle le dit support est un support naturel ou synthétique,
- le dit support naturel étant notamment choisi parmi les vaisseaux sanguins, les veines, les artères, notamment les artères ombilicales décellularisées, les dits vaisseaux, veines et artères provenant d'organes de donneurs ou d'animaux, le derme de placenta, la vessie et tout autre support (organe) d'origine humain ou animal,
- le dit support synthétique étant notamment choisi parmi le verre, le TCPS (polystyrène dit « traité culture cellulaire »), le polysiloxane, les polyéthers de perfluoroalkyle, les polymères biocompatibles en particulier le Dacron®, le polyuréthane, le polydiméthylsiloxane, le chlorure dé polyvinyle, le Silastic®, le polytetrafluoroéthylene (PTFEe) et tout matériau utilisé pour les prothèses et / ou les systèmes implantés.
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