FR2917425A1 - Procede de proliferation de cellules sur des multicouches de polyelectrolytes et son application, notamment a la preparation de biomateriaux cellularises - Google Patents
Procede de proliferation de cellules sur des multicouches de polyelectrolytes et son application, notamment a la preparation de biomateriaux cellularises Download PDFInfo
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Abstract
L'invention concerne l'utilisation d'un ensemble comprenant un support et des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support,- pour la mise en oeuvre d'un procédé de prolifération de cellules initiales, souches ou différenciées, mises en contact avec le susdit ensemble, et,- l'obtention d'un recouvrement du susdit ensemble par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales,- le susdit recouvrement étant obtenu au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours, notamment 11 jours, en particulier 7 jours, après la mise en contact des susdites cellules initiales avec le susdit ensemble.
Description
PROCÉDÉ DE PROLIFÉRATION DE CELLULES SUR DES MULTICOUCHES DE
POLYÉLECTROLYTES ET SON APPLICATION, NOTAMMENT A LA PRÉPARATION DE BIOMATÉRIAUX CELLULARISÉS Cette invention a pour objet un procédé de prolifération de cellules sur des multicouches de polyélectrolytes et son application, notamment à la préparation de biomatériaux cellularisés. Les polyélectrolytes sont des polymères dont les monomères portent un groupe électrolytique. Ces polymères sont donc chargés. Le dépôt couche par couche de polyélectrolytes est une méthode simple pour concevoir des surfaces ayant des propriétés particulières [a) G. Decher, J. B. Schlenoff, Multilayer thin ,films : Sequential Assembly of Nanocomposite Materials, Wiley-VCH, Weinheim, 2003. b) G. Decher, Science 277, 1232, 1997]. Par des trempages ou dépôts successifs d'un support alternativement dans une solution de polyanions et de polycations, on prépare un ensemble : support et multicouche de polyélectrolytes, dans laquelle les couches anioniques et cationiques sont alternées. Le moteur de la croissance de ces multicouches réside dans l'excès de charges qui apparaît après chaque nouveau dépôt d'un polyélectrolyte et qui permet ainsi une nouvelle interaction avec le polyélectrolyte de signe opposé. Cette méthode de traitement est simple d'utilisation, s'applique quelle que soit la géométrie du support et ne met généralement en oeuvre que des solutions aqueuses. Les propriétés physicochimiques, viscoélastiques, structurales, de rugosité de surface et de mouillabilité de l'ensemble support et multicouche de polyélectrolytes peuvent être ajustées selon l'utilisation requise [A. Izquierdo, S. Ono, J.C. Voegel, P. Schaaf, G. Decher, Langmuir, 21, 7558, 2005]. L'utilisation de multicouches de polyélectrolytes permet de fonctionnaliser des surfaces. L'amélioration de l'interaction entre des cellules et des surfaces est importante dans les domaines de la médecine, des biomatériaux et de la biotechnologie. Des interactions électrostatiques existent entre les supports chargés négativement (par exemple le verre ou le polytétrafluoroéthylène expansé PTFEe) et les cellules globalement chargées négativement, ce qui défavorise l'adhésion de cellules sur ces supports. La formation d'une multicouche de polyélectrolytes sur un biomatériau permet de favoriser l'adhérence et la prolifération de cellules. Les multicouches de polyélectrolytes ont été utilisées pour la prolifération de cellules différenciées, par exemple des cellules endothéliales sur un support lame de verre [C. Boura, P. menu, E. Payan, C. Picart, J.C. Voegel, S. Muller, J.F. Stoltz, Biomaterials 24, 3521, 2003] et des cellules nerveuses sur du support TCPS (polystyrène dit traité pour culture cellulaire ) [S. Forry, D. Reyes, M. Gaitan, L. Locascio, Langmuir 22, 5770, 2006].
D'autres techniques sont utilisées dans l'art antérieur pour favoriser l'adhérence de cellules sur des supports, en particulier le recouvrement des supports par des constituants de la matrice extracellulaire tels que : le collagène [H. Itoh, Y. Aso, M. Furuse, Y. Noishiki, T. Miyata, Artif. Organs, 25, 213, 2001], la fibronectine [A. Rademacher, M. Paulitschke, R. Meyer, R. Hetzer, Int. J. Artif. Organs, 24, 235, 2001], la laminine [A. Sank, K. Rostami, F. Weaver, D. Ertl, A. Yellin, M. Nimni, T. L. Tuan. Am. J. Surg. 164, 199, 1992], la gélatine [J. S. Budd, P. R. Bell, R. F. James. Br. J. Surg. 76, 1259, 1989], la poly-lysine [a) J. S. Budd, P.
R. Bell, R. F. James, Br. J. Surg. 76, 1259, 1989, b), G. Stansby, N. Shukla, B. Fuller, G. Hamilton. Br. J Surg. 78, 1189, 1991]. La fibronectine est, à ce jour, la protéine la plus efficace pour augmenter l'attachement et la rétention cellulaire. Les travaux publiés à la suite des investigations cliniques ont montré une forte hydrolyse de la fibronectine peu compatible avec une utilisation in vivo de cette protéine [A. Tiwari, H. J. Salacinski, G. Punshon, G.
Hamilton, A. M. Seifalian, FASEB J. 16, 791, 2002]. L'amélioration de l'adhérence de cellules sur des supports pour la préparation de greffons qui seront utilisés in vivo est donc nécessaire. De plus, l'utilisation de ces différents constituants hétérologues (origine humaine mais souvent animale) et la nécessité de temps de prolifération longs sont parfois incompatibles avec les exigences thérapeutiques (par exemple vaisseaux artificiels ou greffe de peau) .
Par ailleurs, les techniques de prolifération de cellules pour la préparation de greffons sont réalisées en deux étapes avec les techniques de l'homme de l'art : une première étape de maturation, prolifération, et différenciation de cellules souches et/ou l'expansion de cellules différenciées sur un premier support, puis détachement des cellules et ensemencement sur un autre support qui sera greffé. La nécessité d'utiliser deux supports, et donc d'avoir à détacher puis re-ensemencer les cellules est coûteuse en temps et augmente les risques de contamination.
L'un des aspects de l'invention est de fournir un procédé de prolifération de cellules, différenciées ou non, qui soit suffisamment rapide pour la préparation de greffons.
L'un des aspects de l'invention est de fournir un procédé de prolifération de cellules, différenciées ou non, dans lequel la prolifération, la maturation et éventuellement la différenciation des cellules ont lieu sur le même support que celui qui est destiné à être greffé.
L'un des autres aspects de l'invention est de fournir des matériaux recouverts de cellules viables, tels que de la peau artificielle ou des substituts de vaisseaux ou d'artères.
Dans l'un de ces aspects les plus généraux, l'invention concerne l'utilisation d'un ensemble comprenant un support et des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, - pour la mise en oeuvre d'un procédé de prolifération de cellules initiales, souches ou différenciées, mises en contact avec le susdit ensemble, et, - l'obtention d'un recouvrement du susdit ensemble par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales, - le susdit recouvrement étant obtenu au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours, notamment 11 jours, en particulier 7 jours, après la mise en contact des susdites cellules initiales avec le susdit ensemble. L'un des aspects de l'invention concerne l'utilisation de multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support, les dites multicouches : - étant éventuellement revêtues, partiellement ou complètement, d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, - et / ou comprenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, * pour la mise en oeuvre d'un procédé de prolifération de cellules initiales, souches ou différenciées, mises en contact - avec les susdites multicouches de polyélectrolytes - ou avec le susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives revêtant les susdites multicouches de polyélectrolytes, * et l'obtention d'un recouvrement - des susdites multicouches de polyélectrolytes - ou du susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales, * le susdit recouvrement étant obtenu au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours, notamment 11 jours, en particulier 7 jours, après la mise en contact des susdites cellules initiales, - avec les susdites multicouches de polyélectrolytes 3 -1 4 2917425
- ou avec le susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives. L'invention repose sur la mise en évidence que l'obtention d'une couche de cellules viables. con-fluentes et adhérentes est plus rapide qu'avec les techniques de l'homme de l'art. Dans le cas particulier de l'utilisation de l'invention pour la préparation de tissus qui 5 seront utilisés comme greffons (par exemple des substituts de vaisseaux ou d'artères), l'invention repose sur la mise en évidence du gain de temps et de moyen apporté par l'utilisation de multicouches de polyélectrolytes pour la maturation la prolifération, et la différenciation de cellules souches et / ou pour la prolifération de cellules différenciées. En effet, la maturation la prolifération, et la différenciation de cellules souches et / ou la 10 prolifération de cellules différenciées peuvent être effectuées directement sur le support qui sera utilisé pour la greffe, à la différence des techniques de l'homme de l'art qui sont effectuées en deux étapes : - maturation, prolifération et différenciation de cellules souches et / ou prolifération de cellules différenciées sur un premier support, puis 15 - détachement des cellules et ensemencement sur un autre support qui sera greffé. Par support , on désigne tout matériau sur lequel le dépôt couche par couche de polyélectrolytes peut être effectué. Par polyélectrolytes , on désigne des polymères dont les monomères portent un groupe électrolytique. 20 Par multicouches de polyélectrolytes , on désigne l'ensemble des couches obtenues par le dépôt couche par couche de polyélectrolytes [G. Decher, J. B. Schlenoff, Multilayer thin,films : Sequential Assembly of Nanocomposite Materials, Wiley-VCH, Weinheim, 2003]. Par couche supérieure de polyélectrolytes , on désigne la dernière couche de polyélectrolytes déposée par la technique de dépôt couche par couche. 25 Par couches internes de polyélectrolytes , on désigne les couches de polyélectrolytes situées entre le support et la couche supérieure de polyélectrolytes. Par polycation , on désigne un polymère qui est globalement chargé positivement. globalement chargé positivement signifie que la charge totale est positive, mais cela n'exclut pas la présence de monomères chargés négativement dans le polymère. 30 Par polyanion , on désigne un polymère qui est globalement chargé négativement. globalement chargé négativement signifie que la charge totale est négative, mais cela n'exclut pas la présence de monomères chargés positivement dans le polymère. 5 2917425
Par molécules biologiques , on désigne des molécules qui participent au processus métabolique et à l'entretien d'un organisme vivant, par exemple des protéines, de l'ADN, de l'ARN, des cytokines, des facteurs de croissance, par exemple ceux nécessaires au recrutement et à la différenciation du type cellulaire voulu (notamment VEGF dans le cas des 5 cellules vasculaires). Par molécules biologiquement actives , on désigne des molécules qui ont des propriétés curatives ou préventives, par exemple qui accélèrent ou réduisent la différenciation et / ou la prolifération cellulaires, ou par exemple des médicaments (notamment VEGF dans le cas d'une ischémie, ou le taxol dans le cas de cancers). 10 L'expression multicouches revêtues d'un ensemble de molécules , signifie qu'un ensemble de molécules est déposé à la surface des multicouches. Les molécules peuvent être adsorbées en surface. Des interactions existent entre les molécules et la couche supérieure de polyélectrolytes mais les molécules peuvent également être enfouies entre les couches des polyélectrolytes plus internes de la multicouche. Par exemple, dans le cas où la molécule est 15 une protéine globalement chargée positivement revêtant une multicouche de polyélectrolytes dont la couche supérieure de polyélectrolytes est un polyanion, les interactions électrostatiques principales seront celles entre les charges positives de la protéine et les charges négatives de la couche supérieure de polyélectrolytes. Cependant, une protéine globalement chargée positivement peut contenir des acides aminés chargés négativement, qui 20 n'interagissent pas avec la couche supérieure du polyélectrolyte, mais plutôt avec les polyélectrolytes chargés positivement de la couche interne de polyélectrolytes. L'expression complètement revêtues , signifie que le les molécules revêtent toute la surface de la multicouche de polyélectrolytes. L'expression partiellement revêtues , signifie que les molécules ne sont présentes qu'à certains endroits sur la multicouche de 25 polyélectrolytes. Ce revêtement partiel peut être obtenue par des techniques de sprays, telles que celles utilisées dans les publications [Porcel et al., Langmuir 22, 4376-83, 2006 et Porcel et al., Langmuir 21, 800-02, 2005]. Des images au microscope à fluorescence laser ou microscope à forces atomiques peuvent permettre de déterminer si le revêtement est partiel ou complet 30 L'expression comprenant des molécules biologiques ou biologiquement actives , signifie que des molécules sont présentes dans la multicouche de polyélectrolytes. Ces molécules sont intégrées entre les couches de polyélectrolytes de la multicouche de polyélectrolytes. Les techniques d'intégration de molécules entre des polyélectrolytes sont explicitées dans les publications de N. Jessel, M.Oulad-Abdelghani, F. Meyer, P. Lavalle, Y. 6 2917425 Haîkel, P. Schaaf, J.C. Voegel, PNAS 103, 8618, 2006 (exemple d'intégration de molécule biologiquement active, la (3-cyclodextrine) et de A. Dierich, E. Le Guen, N. Messaddeq, J.F. Stoltz, P. Netter, P. Schaaf, J.C. Voegel, N. Benkirane-Jessel, Adv. Mater. 16, 693, 2007 (exemple d'intégration de facteurs de croissance TGF(31). 5 Par couches adjacentes , on désigne deux couches de polyélectrolytes qui ont été déposées l'une après l'autre lors de la formation de la multicouche de polyélectrolytes. Par propriétés de la multicouche de polyélectrolytes , on désigne les propriétés physicochimiques, notamment la viscoélasticité, la rugosité de surface et la mouillabilité de la multicouche de polyélectrolytes. 10 Par propriétés biologiques des dites molécules , on désigne les propriétés curatives ou préventives des molécules biologiquement actives. Par prolifération de cellules , on désigne la division et la maturation de cellules. Par cellules initiales , on désigne les cellules qui sont mise en contact initialement avec la multicouche de polyélectrolytes. 15 Par recouvrement des multicouches par des cellules , on désigne l'obtention d'une couche, de préférence une monocouche, de cellules déposée sur la multicouche de polyélectrolytes. Les cellules peuvent être adsorbées sur la couche supérieure de polyélectrolytes de la multicouche, mais il peut également exister des interactions avec des couches internes de polyélectrolytes de la multicouche de polyélectrolytes. Ces interactions 20 peuvent par exemple être des liaisons ioniques, hydrogène, de Van der Waals... Par cellules adhérentes , on désigne des cellules qui adhèrent à la multicouche de polyélectrolytes ou aux éventuelles molécules biologiques ou biologiquement actives qui la revête. Cette adhérence peut par exemple être visualisée par des images de coupes histologiques ou d'observation au microscope électronique à balayage et confirmée au travers 25 de l'expression de marqueurs spécifiques des cellules (par exemple, les intégrines et l'arrangement du cytosquelette) Par cellules viables , on désigne des cellules qui sont capables de survivre. La viabilité cellulaire peut par exemple être déterminée par le test ABRA (Alamar Blue redox assay). 30 Par cellules confluentes , on désigne des cellules dont les membranes cellulaires établissent des jonctions. Ceci se produit quand les cellules initiales mises en culture ont proliféré de façon à occuper tout l'espace disponible en une monocouche. La confluence peut être mise en évidence par des images obtenues en microscopie à contraste de phase ou à balayage laser. Par cellules issues de la prolifération des cellules initiales , on désigne les cellules issues de la division, de la maturation, et éventuellement de la différentiation (lorsque les 5 cellules initiales sont des cellules souches), des cellules initiales.
Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation de multicouches de polyélectrolytes déposés sur un support, les dites multicouches :
- étant éventuellement revêtues, partiellement ou complètement, d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives,
10 - et / ou comprenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que les liaisons chimiques éventuelles entre les susdites molécules et les couches de polyélectrolytes ne soient pas de nature covalente, pour :
* la mise en oeuvre d'un procédé de prolifération de cellules initiales, souches ou 15 différenciées, mises en contact
- avec les susdites multicouches de polyélectrolytes
- ou avec le susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives revêtant les susdites multicouches de polyélectrolytes,
* et l'obtention d'un recouvrement
20 - des susdites multicouches de polyélectrolytes
- ou du susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales,
* le susdit recouvrement étant obtenu au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, 25 notamment 14 jours, notamment 11 jours, en particulier 7 jours, après la mise en contact des susdites cellules initiales,
- avec les susdites multicouches de polyélectrolytes
- ou avec le susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives. L'expression liaison chimique n'étant pas de nature covalente , signifie que les
30 liaisons entre les molécules et les couches de polyélectrolytes sont, par exemple, des liaisons
ioniques, hydrogène, de Van der Waals, qui ne modifient pas les propriétés des molécules et
de la multicouche de polyélectrolytes. 8 2917425
Selon un des aspects de l'invention, la couche supérieure de polyélectrolytes des multicouches est un polycation et les multicouches ne sont pas revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et ne contiennent pas de molécules biologiques ou biologiquement actives intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes. Lorsque la couche supérieure de polyélectrolytes est chargée positivement, les cellules, dont la membrane est chargée négativement, adhèrent en général sur la multicouche de polyélectrolytes. Selon un autre des aspects de l'invention, la couche supérieure de polyélectrolytes des multicouches est un polyanion et les multicouches ne sont pas revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et ne contiennent pas de molécules biologiques ou biologiquement actives intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes. Lorsque la couche supérieure de polyélectrolytes est chargée négativement, les cellules, dont la membrane est chargée négativement, n'adhèrent en général pas sur la multicouche de polyélectrolytes (interactions électrostatiques répulsives). Ces deux derniers cas correspondent à l'utilisation d'une multicouche de polyélectrolytes pour la prolifération de cellules sans intervention de molécules biologiques ou biologiquement actives.
Selon un des aspects de l'invention, la couche supérieure de polyélectrolytes des multicouches est un polycation et dans laquelle les multicouches sont revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et contiennent éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes.
Selon un autre des aspects de l'invention, la couche supérieure de polyélectrolytes des multicouches est un polyanion et dans laquelle les multicouches sont revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et contiennent éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes.
Ces deux derniers aspects concernent différents cas : - les multicouches sont revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et dans ce cas les cellules adhèrent sur cet ensemble de molécules, ou, 9 2917425
- les multicouches contiennent des molécules biologiques ou biologiquement actives intégrées entre au moins deux couches adjacentes, et dans ce cas les cellules adhèrent sur les multicouches de polyélectrolytes, ou, - les multicouches sont revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement 5 actives et elles contiennent des molécules biologiques ou biologiquement actives intégrées entre au moins deux couches adjacentes et dans ce cas les cellules adhèrent sur cet ensemble de molécules. Lorsque la couche supérieure de polyélectrolytes est chargée négativement, et donc lorsque les cellules n'adhèrent pas sur la multicouche, le revêtement de la multicouche de 10 polyélectrolytes par des molécules biologiques est particulièrement avantageux car il peut permettre d'inverser la polarité du support et donc de favoriser l'adhérence des cellules. Par exemple, la couche supérieure d'une multicouche (PAH-PSS)3 est chargée négativement et les cellules n'adhèrent généralement pas. Si des protéines globalement chargées positivement revêtent la multicouche, la polarité de la surface est inversée et 15 l'adhérence des cellules est favorisée. Dans la présente invention et selon un mode de réalisation avantageux, les cellules initiales sont des cellules différenciées, notamment choisies parmi les kératinocytes, chondrocytes, cellules nerveuses, cellules dendritiques, cellules endothéliales, fibroblastes, épiblastes, myoblastes, cardio-myoblastes, myocytes, cellules épithéliales, ostéocytes, 20 ostéoblastes, hépatocytes et cellules des îlots de Langerhans. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les cellules initiales sont des cellules souches, notamment choisies parmi les cellules totipotentes, pluripotentes et multipotentes. Par cellules totipotentes , on désigne les cellules qui peuvent être différenciées en tout type cellulaire de l'organisme. Elles permettent le développement d'un individu complet. 25 Par cellules pluripotentes , on désigne les cellules qui peuvent être différenciées en cellules issues de n'importe lequel des trois feuillets embryonnaires. Elles ne peuvent pas produire un organisme entier. Par cellules multipotentes , on désigne les cellules qui peuvent être différenciées en plusieurs types de cellules différenciées mais seulement pour des types de cellules 30 particuliers. Par exemple, les cellules multipotentes hématopoïétiques peuvent se différencier en globules rouges, en plaquette, en lymphocytes ou en macrophages mais elles ne peuvent pas se différencier en cellules musculaires. 10 2917425
Comme exemple de cellules souches, on peut citer les cellules souches embryonnaires, hématopoïétiques, cellules mésenchymateuses, les précurseurs tels que les EPC (endothelial progenitor cells). Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans l'invention, les multicouches de 5 polyélectrolytes sont constituées de couches alternées de polycations et de polyanions, - les dits polycations étant notamment choisis parmi la polyallylamine (PAH), la polyethylèneimine (PEI), la polyvinylamine, la polyaminoamide (PAMAM), le polyacrylamide (PAAm), le chlorure de polydiallyldimethylammonium (PDAC), des polypeptides chargés positivement tels que la polylysine et des polysaccharides chargés 10 positivement tels que le chitosane, - et les dits polyanions étant notamment choisis parmi l'acide polyacrylique (PAA), l'acide polymétacrylique (PMA), l'acide polystyrène sulfonique (PSS ou SPS), des polypeptides chargés négativement tels que l'acide polyglutamique et l'acide polyaspartique et des polysaccharides chargés négativement tels que le hyaluronane et l'alginate. 15 Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans l'invention, le nombre de couches des multicouches de polyélectrolytes est de 3 à 100, en particulier 3 à 50, notamment 5 à 10 et en particulier 7. En dessous de 7 couches, le film est encore perméable aux petites molécules, par exemple au Hoechst 33258 (poids moléculaire 623 Da). 20 Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans l'invention, les multicouches de polyélectrolytes sont choisies parmi (PAH-PSS)3, (PAH-PSS)3-PAH et PEI-(PSS-PAH)3. [a) H. Kerdjoudj et al. Bio-Medical Materials and Engineering, 16(4), 123, 2006 b) C. Boura et al. Biomaterials 26, 4568, 2005] Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans l'invention, le support est un 25 support synthétique avantageusement choisi parmi le verre, le TCPS (polystyrène dit traité culture cellulaire ), le polysiloxane, les polyéthers de perfluoroalkyle, les polymères biocompatibles en particulier le Dacron , le polyuréthane, le polydiméthylsiloxane, le chlorure de polyvinyle, le Silastic , le polytétrafluoroéthylene (PTFEe), et tout matériau utilisé pour les prothèses et / ou les systèmes implantés. 30 Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans l'invention, le support est un support naturel avantageusement choisi parmi les vaisseaux sanguins, les veines, les artères, notamment les artères ombilicales décellularisées, notamment déendothélialisées, les dits vaisseaux, veines et artères provenant d'organes de donneurs ou d'animaux. 11 2917425
Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans l'invention, le support est un support naturel avantageusement choisi parmi le derme de placenta, la vessie ou tout autre support (organe) d'origine humain ou animal. Selon un mode de réalisation avantageux de la présente invention, les multicouches de 5 polyélectrolytes déposées sur un support sont suffisamment rigides pour permettre l'adhérence de cellules et suffisamment flexibles pour se déformer sous l'effet des pulsations artérielles et résister aux pressions physiologiques de 10 à 300 mm Hg, notamment 50 à 250 mm Hg et avantageusement 80 à 230 mm Hg. Ces bornes de pression correspondent à celles observées pour les pressions 10 physiologiques. Chez l'homme l'hypertension est dite sévère si la pression systolique est supérieure à 180 mm Hg. L'hypotension est atteinte lorsque la pression est inférieure à 50 mm Hg. Par pressions physiologiques , on désigne les pressions du sang dans les artères, les veines et les vaisseaux chez un sujet sain 15 Selon un mode avantageux de la présente invention, le recouvrement des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le support par les cellules adhérentes est tel qu'il résiste au cisaillement du flux sanguin, notamment in vivo. Par cisaillement du flux sanguin , on désigne la force tangentielle frictionnelle induite par le flux sanguin qui s'exerce sur la multicouche de polyélectrolytes lorsque 20 l'ensemble : support, multicouche de polyélectrolytes, et cellules la recouvrant, est dans des conditions physiologiques. Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention permet de préparer des endoprothèses vasculaires, des ballons d'angioplastie, des artères ou des vaisseaux artificiels pour des greffes, des dérives vasculaires, des valves cardiaques, des composants artificiels 25 pour le coeur, des pacemakers, des appareils d'assistance ventriculaire, des cathéters, des lentilles de contact, des lentilles intraoculaires, des matrices pour l'ingénierie de tissu, des membranes biomédicales, des membranes dedialyse, des membranes d'encapsulation de cellules, des prothèses pour la chirurgie cosmétique, des prothèses orthopédiques, des prothèses dentaires, des pansements, des sutures, des biosenseurs de diagnostic. 30 L'invention concerne également un procédé de recouvrement de cellules initiales, souches ou différenciées, comprenant : - la mise en contact de cellules initiales avec des multicouches de polyélectrolytes déposées sur tus support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et / ou contenant éventuellement des 12 2917425
molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et de préférence tel que les liaisons chimiques 5 éventuelles entre les susdites molécules et les couches de polyélectrolytes ne soient pas de nature covalente, dans des milieux permettant la prolifération des dites cellules initiales, - la prolifération des susdites cellules initiales, - l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours, notamment 11 jours, en particulier 7 jours, après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des 10 susdites multicouches ou du susdit ensemble de molécules revêtant les multicouches, par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales, - la récupération éventuelle des dites cellules adhérentes, viables et confluentes. A l'issue du procédé, les cellules peuvent ou non être détachées de la multicouche de 15 polyélectrolytes. Par exemple, pour la préparation de peau artificielle, les cellules seront détachées de la multicouche. Par contre, pour la préparation de substituts vasculaires ou artériels, les cellules endothéliales ne sont pas détachées, à condition que le support soit biocompatibles, car l'ensemble : support biocompatible / multicouche de polyélectrolytes / cellules endothéliales, est greffé. 20 Par support biocompatible , on désigne un support bien toléré par un organisme vivant, qui ne provoque pas de réaction de rejet, de réactions toxiques, de lésions ou d'effet nocif sur les fonctions biologiques de ce dernier. Selon un mode avantageux de la présente invention, le procédé est un procédé de recouvrement de cellules souches initiales comprenant: 25 -la mise en contact de cellules souches initiales avec des multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support dans des milieux permettant la prolifération des dites cellules initiales, - la prolifération des susdites cellules souches - la maturation et la différenciation des susdites cellules souches en cellules différenciées, 30 - la prolifération des susdites cellules différenciées issues des susdites cellules initiales, - l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours, après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales, -la récupération éventuelle des dites cellules adhérentes, viables et confluentes.
Dans ce cas, les cellules initiales sont des cellules souches. On a constaté que, de façon inattendue, les cellules souches peuvent proliférer et se différencier jusqu'à confluence dans une durée inférieure à celle des procédés de l'art antérieur. La durée impliquée dans l'invention étant 14 jours, notamment 11 jours, en particulier 7 jours. Par exemple, sur le support lame de verre et avec la multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH, la confluence est atteinte en 14 jours alors qu'il faut 60 jours en utilisant de la fibronectine (qui est la protéine donnant les durées de prolifération et différenciation les plus rapides parmi les techniques connues de l'homme de l'art). Selon un mode avantageux de la présente invention, le procédé est un procédé de 10 recouvrement de cellules différenciées initiales comprenant: - la mise en contact de cellules différenciées initiales avec des multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support dans des milieux permettant la prolifération des dites cellules initiales, - la prolifération des susdites cellules différenciées, 15 - l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 7 jours, en particulier 3 jours après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales, - la récupération éventuelle des dites cellules adhérentes, viables et confluentes. 20 Dans ce cas, les cellules initiales sont des cellules différenciées. On a constaté que, de façon inattendue, les cellules initiales peuvent proliférer jusqu'à confluence dans une durée inférieure à celle des procédés de l'art antérieur. La durée impliquée dans l'invention étant 7 jours. notamment 5 jours, en particulier 3 jours. Par exemple, sur le support PTFEe et avec la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3, la confluence est atteinte en 7 jours ou 25 moins, alors que sans dépôt de multicouche de polyélectrolytes, aucune cellule n'adhère. Selon un mode avantageux, dans le procédé de l'invention les multicouches sont revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et / ou contenant des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant 30 telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées. Selon un mode avantageux de la présente invention, le procédé comprend: - la mise en contact de cellules initiales avec des multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de 14 2917425
molécules biologiques ou biologiquement actives, et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des 5 dites molécules ne soient modifiées, et de préférence tel que les liaisons chimiques éventuelles entre les susdites molécules et les couches de polyélectrolytes ne soient pas de nature covalente, dans des milieux permettant la prolifération des dites cellules initiales, - la prolifération des susdites cellules initiales, - l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours, notamment 11 jours, en particulier 7 jours, après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches ou du susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives revêtant les multicouches, par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales, - la récupération des dites cellules adhérentes, viables et confluentes.
Dans ce cas, les cellules adhérentes, viables et confluentes sont détachées de la multicouche de polyélectrolytes. Selon un mode avantageux de la présente invention, le procédé comprend: - la mise en contact de cellules initiales avec des multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et de préférence tel que les liaisons chimiques éventuelles entre les susdites molécules et les couches de polyélectrolytes ne soient pas de nature covalente, dans des milieux permettant la prolifération des dites cellules initiales, - la prolifération des susdites cellules initiales, -l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours, notamment 11 jours, après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches ou du susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives revêtant les multicouches, par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales. 15 2917425
Dans ce cas, les cellules adhérentes, viables et confluentes ne sont pas détachées de la multicouche de polyélectrolytes. Selon un mode de réalisation préféré, le procédé est un procédé de recouvrement de cellules endothéliales initiales qui comprend: 5 - la mise en contact de cellules endothéliales initiales avec des multicouches de polyélectrolytes choisies parmi (PAH-PSS)3, (PAH-PSS)3-PAH et PEI-(PSS-PAH)3, déposées sur un support, notamment un support naturel tel qu'un vaisseau sanguin ou une artère décellularisé, notamment déendothélialisé, ou un support synthétique biocompatible ayant une forme de vaisseau ou d'artère, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un 10 ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et de préférence tel que les 15 liaisons chimiques éventuelles entre les susdites molécules et les couches de polyélectrolytes ne soient pas de nature covalente, dans des milieux permettant la prolifération des susdites cellules endothéliales initiales, - la prolifération des susdites cellules endothéliales initiales, -l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 7 jours, notamment 5 20 jours, en particulier 3 jours, après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches ou du susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives revêtant les multicouches, par des cellules endothéliales adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules endothéliales initiales. Ce cas correspond un procédé de prolifération de cellules endothéliales sur une 25 multicouche de polyélectrolytes pour la préparation de substituts vasculaires ou artériels qui seront utilisés comme greffons. L'utilisation de multicouches de polyélectrolytes présente de nombreux avantages. En effet, l'ensemble support artère ou vaisseau / multicouche de polyélectrolytes est suffisamment rigide pour permettre l'adhérence des cellules et suffisamment élastique pour permettre d'accepter la déformation imposée par le flux sanguin. 30 De plus, la monocouche de cellules obtenue doit permettre le passage d'oxygène et de nutriments, ce qui doit autoriser les échanges essentiels entre le sang et les tissus environnants. 16 2917425
Selon un autre mode de réalisation préféré, le procédé est un procédé de recouvrement de cellules souches initiales comprenant : - la mise en contact de cellules souches initiales avec des multicouches de polyélectrolytes choisies parmi (PAH-PSS)3, (PAH-PSS)3-PAH et PEI-(PSS-PAH);, déposées sur un support, 5 les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules 10 ne soient modifiées, et de préférence tel que les liaisons chimiques éventuelles entre les susdites molécules et les couches de polyélectrolytes ne soient pas de nature covalente, dans des milieux permettant la prolifération des susdites cellules souches initiales, - la prolifération des susdites cellules souches initiales, - la maturation et la différenciation des susdites cellules souches en cellules endothéliales, 15 - la prolifération des susdites cellules endothéliales issues des susdites cellules souches initiales, - l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas 14 jours après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches ou du susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives revêtant les multicouches, par des cellules endothéliales 20 adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules souches initiales. Ce cas correspond un procédé de prolifération de cellules souches, puis différenciation en cellules endothéliales, sur une multicouche de polyélectrolytes pour la préparation de substituts vasculaires ou artériels qui seront utilisés comme greffons. 25 Dans le procédé de l'invention, les cellules souches initiales sont notamment choisies parmi les cellules totipotentes, pluripotentes et multipotentes. Dans le procédé de l'invention, les cellules différenciées initiales sont notamment choisies parmi les kératinocytes, chondrocytes, cellules nerveuses, cellules dendritiques, cellules endothéliales, fibroblastes, épiblastes, myoblastes, cardio-myoblastes, myocytes, 30 cellules épithéliales, ostéocytes, ostéoblastes, hépatocytes et cellules des îlots de Langerhans. Selon un mode de réalisation particulier, dans le procédé de l'invention, les multicouches de polyélectrolytes sont constituées de couches de préférence alternées de polycations et de polyanions, 17 2917425
- les polycations étant notamment choisis parmi la polyallylamine (PAH), la polyethylèneimine (PEI), la polyvinylamine, la polyaminoamide (PAMAM), le polyacrylamide (PAAm), le chlorure de polydiallyldimethylammonium (PDAC), des polypeptides chargés positivement tels que la polylysine et des polysaccharides chargés 5 positivement tels que le chitosane, - et les polyanions étant notamment choisis parmi l'acide polyacrylique (PAA), l'acide polymétacrylique (PMA), l'acide polystyrène sulfonique (PSS ou SPS), des polypeptides chargés négativement tels que l'acide polyglutamique et l'acide polyaspartique et des polysaccharides chargés négativement tels que le hyaluronane et l'alginate. 10 De façon avantageuse, le nombre de couches des dites multicouches de polyélectrolytes est de 3 à 100, en particulier 3 à 50, notamment 5 à 10 et en particulier 7. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, dans le procédé de l'invention, les multicouches de polyélectrolytes sont choisies parmi (PAH-PSS)3, (PAH-PSS)3-PAH et PEI-(PSS-PAH)3. 15 Selon un autre mode de réalisation de l'invention, dans le procédé de l'invention, le support est choisi parmi les supports synthétiques tels que le verre, le TCPS (polystyrène dit traité culture cellulaire ), le polysiloxane, les polyéthers de perfluoroalkyle, les polymères biocompatibles en particulier le Dacron , le polyuréthane, le polydiméthylsiloxane, le chlorure de polyvinyle, le Silastic , le polytetrafluoroéthylene (PTFEe) et tout matériau utilisé 20 pour les prothèses et / ou les systèmes implantés, Selon un autre mode de réalisation de l'invention, dans le procédé de l'invention, le support est choisi parmi les supports naturels tels que les vaisseaux sanguins, les veines, les artères, notamment les artères ombilicales décellularisées, notamment déendothélialisées, les dits vaisseaux, veines et artères provenant d'organes de donneurs ou d'animaux. 25 Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans l'invention, le support est un support naturel avantageusement choisi parmi le derme de placenta, la vessie ou tout autre support (organe) d'origine humain ou animal. La présente invention a pour objet une composition comprenant : - un support, 30 - des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de 18 2917425
polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et de préférence tel que les liaisons chimiques éventuelles entre les susdites molécules et les couches de polyélectrolytes ne soient pas de nature covalente, et, - une couche de cellules souches recouvrant les dites multicouches de polyélectrolytes. 5 Selon un autre mode de réalisation, la composition de l'invention comprend un support, des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, les dites multicouches sont revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et / ou contiennent des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes. 10 Selon un autre mode de réalisation, la composition de l'invention comprend un support, des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, et une couche de cellules souches recouvrant les dites multicouches de polyélectrolytes. Selon un mode de réalisation particulier, les cellules souches initiales sont notamment choisies parmi les cellules totipotentes, pluripotentes et multipotentes. 15 Selon un autre mode de réalisation, la composition de l'invention comprend : - un support naturel, - des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, 20 intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et de préférence tel que les liaisons chimiques éventuelles entre les susdites molécules et les couches de polyélectrolytes ne soient pas de nature covalente, et, 25 - une couche de cellules différenciées recouvrant les dites multicouches de polyélectrolytes. Selon un mode avantageux de réalisation, la composition de l'invention comprend : - un support naturel, - des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, les dites multicouches étant revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et / ou contenant 30 des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et de préférence tel que les liaisons chimiques 19 2917425
éventuelles entre les susdites molécules et les couches de polyélectrolytes ne soient pas de nature covalente, et, - une couche de cellules différenciées recouvrant les dites molécules biologiques ou biologiquement actives. 5 Selon un autre mode de réalisation avantageux, la composition de l'invention comprend : - un support naturel, - des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, et, - une couche de cellules différenciées recouvrant les dites multicouches de polyélectrolytes. 10 Selon un autre mode de réalisation, la composition de l'invention comprend : - un support, - des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, les dites multicouches étant revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et / ou contenant des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins 15 deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et de préférence tel que les liaisons chimiques éventuelles entre les susdites molécules et les couches de polyélectrolytes ne soient pas de nature covalente, et, 20 - une couche de cellules différenciées recouvrant les dites molécules biologiques ou biologiquement actives. Dans la composition de l'invention définie ci-dessus, le support est un support synthétique ou naturel, et en particulier un support synthétique. Dans les compositions de l'invention, les cellules différenciées initiales sont 25 notamment choisies parmi les kératinocytes, chondrocytes, cellules nerveuses, cellules dendritiques, cellules endothéliales, fibroblastes, épiblastes, myoblastes, cardio-myoblastes, myocytes, cellules épithéliales, ostéocytes, ostéoblastes, hépatocytes et cellules des ilots de Langerhans. Dans les compositions de l'invention, les multicouches de polyélectrolytes sont 30 constituées de couches de préférence alternées de polycations et de polyanions, - les polycations étant notamment choisis parmi la polyallylamine (PAH), la polyethylèneimine (PEI), la polyvinylamine, la polyaminoamide (PAMAM), le polyacrylamide (PAAm), le chlorure de polydiallyldimethylammonium (PDAC), des 20 2917425
polypeptides chargés positivement tels que la polylysine et des polysaccharides chargés positivement tels que le chitosane, - et les polyanions étant notamment choisis parmi l'acide polyacrylique (PAA), l'acide polymétacrylique (PMA), l'acide polystyrène sulfonique (PSS ou SPS), des polypeptides 5 chargés négativement tels que l'acide polyglutamique et l'acide polyaspartique et des polysaccharides chargés négativement tels que le hyaluronane et l'alginate. Selon un mode de réalisation avantageux, dans les compositions de l'invention, le nombre de couches des dites multicouches de polyélectrolytes est de 3 à 100, en particulier 3 à 50, notamment 5 à 10 et en particulier 7. 10 Selon un mode de réalisation avantageux, dans les compositions de l'invention, les multicouches de polyélectrolytes sont choisies parmi (PAH-PSS)3, (PAH-PSS)3-PAH et PEI-(PSS-PAH)3. Dans les compositions de l'invention, le support est choisi parmi les supports naturels, tels que les vaisseaux sanguins, les veines, les artères, notamment les artères ombilicales 15 décellularisées, notamment déendothélialisées, les dits vaisseaux, veines et artères provenant d'organes de donneurs ou d'animaux, et le derme de placenta. Dans les compositions de l'invention, le support est avantageusement choisi parmi le derme de placenta, la vessie ou tout autre support (organe) d'origine humain ou animal. Dans les compositions de l'invention, le support est choisi parmi les supports 20 synthétiques notamment le verre, le TCPS (polystyrène dit traité culture cellulaire ), le polysiloxane, les polyéthers de perfluoroalkyle, les polymères biocompatibles en particulier le Dacron , le polyuréthane, le polydiméthylsiloxane, le chlorure de polyvinyle, le Silastic , le polytetrafluoroéthylene (PTFEe) et tout matériau utilisé pour les prothèses et / ou les systèmes implantés. 25 30 21 2917425 LÉGENDE DES FIGURES
Figure 1 : La figure 1 représente une image obtenue au microscope confocal objectif 40 d'un 5 support PTFEe sur lequel a été déposée la multicouche de polyélectrolytes [PEI-(PSS-PAH)2-PSS-PAH*], PAH* étant de l'hydrochlorure de poly(allylamine) couplé à la rhodamine. Le microscope est un microscope Leica SP2-AOBS (objectif : x40, ON=0.8, Allemagne) La petite flèche correspond à une microfibrille ou à la distance entre deux noeuds, et la grande flèche correspond aux noeuds. L'astérisque correspond à un pore. 10 Figures 2A, 2B, 2C, 2D et 2E : La figure 2A représente une image obtenue au microscope confocal objectif 40 (n=4) d'une artère sur laquelle a été déposée la multicouche de polyélectrolytes [(PAH-PSS)2-PAH*-PSS-PAH*]. PAH* étant de l'hydrochlorure de poly(allylamine) (PAH) couplé à la 15 rhodamine. Cette image montre la topologie de la surface interne de l'artère. La figure 2B représente une image obtenue au microscope confocal objectif 40 (n=4) d'une artère sur laquelle a été déposée la multicouche de polyélectrolytes [(PAH-PSS)2-PAH*-PSS-PAH*], PAH* étant de l'hydrochlorure de poly(allylamine) (PAH) couplé à la rhodamine. Cette image est une coupe transversale et montre que le recouvrement par la 20 multicouche de polyélectrolytes a eu lieu sur toute la surface interne de l'artère. La figure 2C représente une image obtenue au microscope confocal objectif 40 (n=4) d'une artère ombilicale en lumière transmise. La figure 2D est une superposition des figures 2B et 2C. La figure 2E représente le spectre de la rhodamine confirmant la présence de la de 25 polyélectrolytes [(PAH-PSS)2-PAH*-PSS-PAH*]. L'axe des abscisses représente la longueur d'onde en nanomètres. L'axe des ordonnées représente la luminosité exprimée en niveaux de gris.
Figure 3 : 30 La figure 3 représente des courbes de déformation des artères en fonction de la pression exercée dans ces artères. L'axe des ordonnées représente la pression dans les artères en cm Hg. L'axe des abscisses représente le pourcentage de déformation de l'artère. La courbe avec des points • représente des artères fraîches. 22 2917425
La courbe avec des carrés ^ représente les artères déendothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'ont été déposées. La courbe avec des triangles ^ représente les artères déendothélialisées sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée. 5 Figure 4 : La figure 4 représente la compliance en pourcentage par rapport à des artères fraîches, c'est-à- dire que les données ont été normalisées pour que la compliance d'artères fraîches soit de 100%. 10 L'axe des ordonnées représente la compliance en pourcentage par rapport à des artères fraîches. L'axe des abscisses représente le type d'artères : des artères fraîches, des artères déendothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, et des artères déendothélialisées sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH- 15 PSS)3-PAH a été déposée. Le symbole * signifie que la compliance des artères déendothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, diffère de manière significative avec celle des artères fraîches avec une probabilité d'erreur inférieure à 0.05%.
20 Figure 5 : La figure 5 représente le résultat du test de viabilité par le test à 1'Alamar Blue de cellules endothéliales HUVECs ensemencées sur : - du TCPS (courbe avec les triangles vides v), - du PTFEe (courbe avec les triangles pleins 'y ), 25 - du PTFEe sur lequel le polyélectrolyte PAH a été déposé (courbe avec les ronds vides o), ou. - du PTFEe sur lequel la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3 a été déposée (courbe avec les ronds pleins .). L'axe des ordonnées représente A DO = [DO(570nm)expùDO(630nm)exp] ù [DO(570nm)tem.ù30 DO(630mn)te,,,] avec exp. = expérimental, tém. = témoin sans cellules et A = différence. L'axe des abscisses représente la durée de culture en jours. 23 2917425
Le symbole * signifie que l'activité métabolique des cellulesendothéliales sur les supports considérés diffère de manière significative avec celle des cellules sur le support TCPS avec une probabilité d'erreur inférieure à 0.05%. Le temps d'incubation est de 3 heures. 5 Figure 6A, 6B, 6C, 6D, 6E et 6F : La figure 6A représente l'image observée au microscope électronique (agrandissement de x169) du support PTFEe sur lequel ont été cultivées des cellules endothéliales. La figure 6B représente l'image observée au microscope électronique (agrandissement 10 de x508) du support PTFEe sur lequel ont été cultivées des cellules endothéliales. La figure 6C représente l'image observée au microscope électronique (agrandissement de x149) du support PTFEe sur lequel le polyélectrolyte PAH a été déposé et sur lequel ont été cultivées des cellules endothéliales. La figure 6D représente l'image observée au microscope électronique (agrandissement 15 de x503) du support PTFEe sur lequel le polyélectrolyte PAH a été déposé et sur lequel ont été cultivées des cellules endothéliales. La figure 6E représente l'image observée au microscope électronique (agrandissement de x112) du support PTFEe sur lequel la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3 a été déposée et sur lequel ont été cultivées des cellules endothéliales. 20 La figure 6F représente l'image observée au microscope électronique (agrandissement de x513) du support PTFEe sur lequel la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3 a été déposée et sur lequel ont été cultivées des cellules endothéliales. Pour les figures 6A, 6B, 6C, 6D, 6E et 6F, la durée de culture des cellules endothéliales HUVECs est de 7 jours, et le microscope est un microscope électronique 25 STEREOSCAN S 240, CAMBRIDGE (UK).
Figure 7 : La figure 7 représente l'image obtenue en microscopie confocale (bar: 75 m, objectif x40) de cellules endothéliales HUVECs adhérentes au support PTFEe sur lequel la 30 multicouche PEI (PSS-PAH)3 a été déposée, après 7 jours de culture. Le facteur Von Willebrand est visualisé gràce au fluorochrome Alexa Fluor 488 (tex: 494nm, hem: 517nm) et apparaît en gris clair. Les ronds gris foncés qui apparaissent au milieu des parties grises claires représentent les noyaux, qui ont été marqués à l'iodure de propidium (Xex: 536nm, ?,.em: 617nm) 24 2917425
Figures 8A, 8B, 8C, 8D : La figure 8A représente l'image d'une coupe histologique d'une artère réendothélialisée sur laquelle aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée. La coloration basique est effectuée à l'hematoxyline-eosine-Safran. Le grossissement est de 20. La figure 8B représente l'image d'une coupe histologique d'une artère réendothélialisée sur laquelle une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée. La coloration basique est effectuée à l'hematoxyline-eosine-Safran. Le grossissement est de 20. 10 La figure 8C représente l'image obtenue en immunohistochimie mettant en évidence le récepteur membranaire PECAM-1 exprimé à la surface des cellules endothéliales ensemencées dans la lumière de l'artère sur laquelle aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée. La révélation est effectuée par une peroxydase et la contre coloration est effectuée avec l'hématoxyline. Le grossissement est de 20. 15 La figure 8D représente l'image obtenue en immunohistochimie mettant en évidence le récepteur membranaire PECAM-1 exprimé à la surface des cellules endothéliales ensemencées dans la lumière de l'artère sur laquelle une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée. La révélation est effectuée par une peroxydase et la contre coloration est effectuée avec l'hématoxyline. Le grossissement est de 20. 20 Figures 9A, 9B, 9C : La figure 9A représente une image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 50 m) des artères ombilicales endothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée. 25 La figure 9B représente une image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 50 m) des artères ombilicales endothélialisées sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée. La figure 9C représente une image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 50 m) d'une artère fraîche (contrôle). 30 Figures 10A, 10B, 10C, 10D : La figure 10A représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser (objectif 40) après marquage de PECAM-1, d'artères endothélialisées sur 25 2917425
lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, dans des conditions statiques après une semaine de culture. La figure 10B représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser (objectif 40) après marquage de PECAM-1, d'artères endothélialisées sur 5 lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, dans des conditions dynamiques (artères endothélialisées soumises à une contrainte de cisaillement de 1 Pa pendant 1 heure) après une semaine de culture. La figure 10C représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser (objectif 40) après marquage de PECAM-1, d'artères endothélialisées sur 10 lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée, dans des conditions statiques après une semaine de culture. La figure 10D représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser (objectif 40) après marquage de PECAM-1, d'artères endothélialisées sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée, dans des 15 conditions dynamiques (artères endothélialisées soumises à une contrainte de cisaillement de 1 Pa pendant 1 heure) après une semaine de culture.
Figures 11A, 11B, 11C, 11D : La figure 11A représente l'image obtenue après observation au microscope 20 électronique à balayage (Bar: 50 m) après marquage de PECAM-1, d'artères endothélialisées sur lesquels aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, dans des conditions statiques après une semaine de culture. La figure 11B représente l'image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 50 m) après marquage de PECAM-1, d'artères 25 endothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, dans des conditions dynamiques (artères endothélialisées soumises à une contrainte de cisaillement de 1 Pa pendant 1 heure) après une semaine de culture. La figure 11C représente l'image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 50 m) après marquage de PECAM-1, d'artères 30 endothélialisées sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée, dans des conditions statiques après une semaine de culture. La figure 11D représente l'image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 50 m) après marquage de PECAM-1, d'artères endothélialisées sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été 26 2917425
déposée, dans des conditions dynamiques (artères endothélialisées soumises à une contrainte de cisaillement de 1 Pa pendant 1 heure) après une semaine de culture.
Figures 12A, 12B, 12C, 12D, 12E, 12F : 5 La figure 12A représente une image obtenue après observation d'une coupe histologique d'artères ombilicales cryoconservées déendothélialisées de lapin sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, une semaine après l'implantation (contrôle). La figure 12B représente une image obtenue après observation d'une coupe 10 histologique d'allogreffes déendothélialisées de lapin sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, une semaine après l'implantation (contrôle). La figure 12C représente une image obtenue après observation d'une coupe histologique d'artères ombilicales cryoconservées déendothélialisées de lapin sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 a été déposée, une semaine après 15 l'implantation. La figure 12D représente une image obtenue après observation d'une coupe histologique d'allogreffes déendothélialisées de lapin sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 a été déposée, une semaine après l'implantation. La figure 12E représente une image obtenue après observation d'une coupe 20 histologique d'artères ombilicales cryoconservées déendothélialisées de lapin sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 a été déposée, 12 semaines après l'implantation. La figure 12F représente une image obtenue après observation d'une coupe histologique d'allogreffes déendothélialisées de lapin sur lesquelles une multicouche de 25 polyélectrolytes (PAH-PSS)3 a été déposée, 12 semaines après l'implantation. Dans les figures 12A à 12F, la coloration basique a été effectuée à l'hématoxyline- éosine-Safran et le grossissement est de 20.
Figure 13A, 13B, 13C, 13D, 13E, 13F : 30 La figure 13A représente une image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 1 mm) d'artères ombilicales cryoconservées déendothélialisées de lapin sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, une semaine après l'implantation (contrôle).
La figure 13B représente une image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 1 mm) d'allogreffes déendothélialisées de lapin sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée, une semaine après l'implantation (contrôle).
La figure 13C représente une image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 1 mm) d'artères ombilicales cryoconservées déendothélialisées de lapin sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 a été déposée, une semaine après l'implantation. La figure 13D représente une image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 1 mm) d'allogreffes déendothélialisées de lapin sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 a été déposée, une semaine après l'implantation. La figure 13E représente une image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 1 mm) d'artères ombilicales cryoconservées déendothélialisées de lapin sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 a été déposée, 12 semaines après l'implantation. La figure 13F représente une image obtenue après observation au microscope électronique à balayage (Bar: 1 mm) d'allogreffes déendothélialisées de lapin sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 a été déposée, 12 semaines après l'implantation.
Figures 14A,14B,14C : La figure 14A représente une image obtenue après observation à l'écho-doppler 10 semaines après l'implantation pour la carotide témoin, qui est la carotide native du lapin (contrôle). Le tracé en bas de l'image montre que la vitesse du sang est de 40 cm/s. La figure 14B représente une image obtenue après observation à l'écho- doppler 10 semaines après l'implantation pour des artères ombilicales cryoconservées déendothélialisées sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 a été déposée. Le tracé en bas de l'image montre que la vitesse du sang est de 40 cm/s.
La figure 14C représente une image obtenue après observation à l'écho-doppler 10 semaines après l'implantation pour des artères ombilicales cryoconservées déendothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée. Le tracé en bas de l'image montre que la vitesse du sang est nulle : le sang ne circule pas car l'artère est bouchée.
Figures 15A, 15B, 15C, 15D, 15E :
La figure 15A représente l'image obtenue par observation en microscopie à contraste de phase (Objectif 20) d'une lame de verre recouverte de fibronectine puis de progéniteurs endothéliaux, à 4 jours de culture.
La figure 15B représente l'image obtenue par observation en microscopie à contraste de phase (Objectif 20) d'une lame de verre sur laquelle une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée puis des progéniteurs endothéliaux ont été ensemencés, à 4 jours de culture.
La figure 15C représente l'image obtenue par observation en microscopie à contraste 10 de phase (Objectif 20) d'une lame de verre recouverte de fibronectine puis de progéniteurs endothéliaux, à 14 jours de culture.
La figure 15D représente l'image obtenue par observation en microscopie à contraste de phase (Objectif 20) d'une lame de verre sur laquelle une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée puis des progéniteurs endothéliaux ont été ensemencés, à 14 15 j ours de culture.
La figure 15E représente l'image obtenue par observation en microscopie à contraste de phase (Objectif 20) de TCPS (polystyrène dit traité culture cellulaire ) recouvert d'une monocouche de cellules endothéliales matures issues de la veine jugulaire de lapin (JVEC) (contrôle).
20
Figures 16A,16B,16C,16D,16E,16F,16G,16H,16I,16J,16K,16L:
La figure 16A représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules endothéliales d'une veine jugulaire (contrôle) et dont le récepteur membranaire PECAM-1 a été marqué. Le marquage
25 est un immunomarquage indirect : un anticorps primaire qui reconnaît l'antigène PECAM-1 est reconnu par un anticorps secondaire marqué par un fluorochrome (Alexa 488). L'adhésion et l'étalement des cellules sur le support ont été évalués par l'apparition des fibres d'actine. En gris clair apparaît le PECAM-1 mis en évidence par un fluorochrome (Alexa 488).
30 La figure 16B représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules endothéliales d'une veine jugulaire (contrôle) et dont le marqueur intracellulaire (Facteur de von Willebrand (vWF)) a été marqué. Le marquage est un immunomarquage indirect : un anticorps primaire qui reconnaît l'antigène vWF est reconnu par un anticorps secondaire marqué par un fluorochrome (Alexa 488). L'adhésion et l'étalement des cellules sur le support ont été évalués par l'apparition des fibres d'actine. En gris clair apparaît le marqueur intracellulaire (Facteur de von Willebrand (vWF)) mis en évidence par un fluorochrome (Alexa 488). La figure 16C représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules endothéliales d'une veine jugulaire (contrôle) et dont le cytosquelette est mis en évidence par reconnaissance par un anticorps lié à un fluorochrome (Alexa 488). L'adhésion et l'étalement des cellules sur le support ont été évalués par l'apparition des fibres d'actine. En gris clair apparaît le cytosquelette.
La figure 16D représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules endothéliales d'une veine jugulaire (contrôle) et dont le LDL a été couplé au Dil (molécule fluorescente). La capacité des cellules à incorporer les LDL est une caractéristique de la fonctionnalité des cellules endothéliales matures. En gris apparaissent les LDL couplés au Dil (molécule fluorescente).
En gris clair apparaît le Syto 16 (marqueur spécifique au noyau) qui permet de montrer la répartition périnucléaire des LDL couplés au Dil. La figure 16E représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules EPC ensemencées sur une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH et dont le récepteur membranaire PECAM-1 a été marqué selon la même méthode que pour la figure 16A. L'adhésion et l'étalement des cellules sur le support ont été évalués par l'apparition des fibres d'actine. En gris clair apparaît le PECAM-1 mis en évidence par un fluorochrome (Alexa 488). La figure 16F représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules EPC ensemencées sur une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH et dont le marqueur intracellulaire (Facteur de von Willebrand (vWF)) a été marqué selon la même méthode que pour la figure 16B. L'adhésion et l'étalement des cellules sur le support ont été évalués par l'apparition des fibres d'actine. En gris clair apparaît le marqueur intracellulaire (Facteur de von Willebrand (vWF)) mis en évidence par un fluorochrome (Alexa 488).
La figure 16G représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules EPC ensemencées sur une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH et dont le cytosquelette est mis en évidence par reconnaissance par un anticorps lié à un fluorochrome (Alexa 488). L'adhésion 30 2917425
et l'étalement des cellules sur le support ont été évalués par l'apparition des fibres d'actine. En gris clair apparaît le cytosquelette. La figure 16H représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules EPC ensemencées sur une 5 multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH et dont le LDL a été couplé au Dil (molécule fluorescente). La capacité des cellules à incorporer les LDL est une caractéristique de la fonctionnalité des cellules endothéliales matures. En gris apparaissent les LDL couplés au Dil (molécule fluorescente). En gris clair apparaît le Syto 16 (marqueur spécifique au noyau) qui permet de montrer la répartition périnucléaire des LDL couplés au Dil. 10 La figure 16I représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules EPC ensemencées sur une couche de fibronectine et dont le récepteur membranaire PECAM-1 a été marqué selon la même méthode que pour la figure 16A. L'adhésion et l'étalement des cellules sur le support ont été évalués par l'apparition des fibres d'actine. En gris clair apparaît le PECAM-1 mis en 15 évidence par un fluorochrome (Alexa 488). La figure 16J représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules EPC ensemencées sur une couche de fibronectine et dont le marqueur intracellulaire (Facteur de von Willebrand (vWF)) a été marqué selon la même méthode que pour la figure 16B. L'adhésion et l'étalement des 20 cellules sur le support ont été évalués par l'apparition des fibres d'actine. En gris clair apparaît le marqueur intracellulaire (Facteur de von Willebrand (vWF)) mis en évidence par un fluorochrome (Alexa 488). La figure 16K représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules EPC ensemencées sur une 25 couche de fibronectine et dont le cytosquelette est mis en évidence par reconnaissance par un anticorps lié à un fluorochrome (Alexa 488). L'adhésion et l'étalement des cellules sur le support ont été évalués par l'apparition des fibres d'actine. En gris clair apparaît le cytosquelette. La figure 16L représente l'image obtenue après observation en microscopie confocale 30 à balayage laser après 14 jours de culture (Objectif 40) de cellules EPC ensemencées sur une couche de fibronectine et dont le LDL a été couplé au Dil (molécule fluorescente). La capacité des cellules à incorporer les LDL est une caractéristique de la fonctionnalité des cellules endothéliales matures. En gris apparaissent les LDL couplés au Dil (molécule 31 2917425
fluorescente). En gris clair apparaît le Syto 16 (marqueur spécifique au noyau) qui permet de montrer la répartition périnucléaire des LDL couplés au Dil.
Figures 17A, 17B, 17C : 5 La figure 17A représente un graphe qui correspond à l'étude semi-quantitative de la fluorescence des figures 16A, 16E et 16I pour le récepteur membranaire PECAM-1. L'axe des ordonnées représente le niveau de gris par pixel. L'axe des abscisses représente la provenance des cellules endothéliales : - cellules endothéliales d'une veine jugulaire (JVE) (fluorescence de la figure 16A), 10 - cellules EPC ensemencées sur une couche de fibronectine après 14 jours de culture (Fn ou F) (fluorescence de la figure 16E) et, - cellules EPC ensemencées sur une multicouche de polyélectrolytes après 14 jours de culture (PEM) (fluorescence de la figure 16I). La figure 17B représente un graphe qui correspond à l'étude serai-quantitative de la 15 fluorescence des figures 16B, 16F et 16J pour le marqueur intracellulaire vWF. L'axe des ordonnées représente le niveau de gris par pixel. L'axe des abscisses représente la provenance des cellules endothéliales : - cellules endothéliales d'une veine jugulaire (JVE) (fluorescence de la figure 16B), - cellules EPC ensemencées sur une couche de fibronectine après 14 jours de culture (Fn ou 20 F) (fluorescence de la figure 16F) et, - cellules EPC ensemencées sur une multicouche de polyélectrolytes après 14 jours de culture (PEM) (fluorescence de la figure 16J). La figure 17C représente un graphe qui correspond à l'étude semi-quantitative de la fluorescence des figures 16A, 16E et 161 pour le LDL couplé au Di avec du Sito 16. L'axe des 25 ordonnées représente le niveau de gris par pixel. L'axe des abscisses représente la provenance des cellules endothéliales : - cellules endothéliales d'une veine jugulaire (JVE) (fluorescence de la figure 16D), - cellules EPC ensemencées sur une couche de fibronectine après 14 jours de culture (Fn ou F) (fluorescence de la figure 16H) et, 30 - cellules EPC ensemencées sur une multicouche de polyélectrolytes après 14 jours de culture (PEM) (fluorescence de la figure 16L). Dans les figures 17A à 17C, le symbole 3 étoiles * * * signifie que la fluorescence des cellules EPC ensemencées sur une couche de fibronectine est significativement différente de 32 2917425
celle des cellules endothéliales d'une veine jugulaire avec une probabilité d'erreur inférieure à 0.001%.
Figure 18 : 5 La figure 18 représente le résultat du test de viabilité par le test à 1'Alamar Blue de cellules endothéliales. L'axe des ordonnées représente A DO = [DO(570nm)expùDO(630nm)exp] ù [DO(570nm)tém.ùDO(630nm)té,,,] avec exp. = expérimental, tém. = témoin sans cellules et A = différence. L'axe des abscisses représente la provenance des cellules endothéliales : cellules endothéliales 10 d'une veine jugulaire (JVE), cellules EPC ensemencées sur une couche de fibronectine après 14 jours de culture (F) et cellules EPC ensemencées sur une multicouche de polyélectrolytes après 14 jours de culture (PEM). Le symbole 2 étoiles ** signifie que la différence d'absorbance des cellules EPC ensemencées sur une couche de fibronectine est significativement différente de celle des 15 cellules endothéliales d'une veine jugulaire avec une probabilité d'erreur inférieure à 0.05%. Figure 19 : La figure 19 représente le schéma de la chambre de cisaillement utilisée au cours de l'étude de différenciation d'EPC ensemencés sur une artère sur laquelle a été déposée ou non 20 une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH.
Figure 20 : La figure 20 représente la courbe d'étalonnage de la pompe péristaltique. L'axe des ordonnées représente la contrainte de cisaillement en Pascal. 25 L'axe des abscisses représente la graduation. 30 33 2917425 EXEMPLES 5 Exemple 1 : Préparation de multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support 1.1. Préparation des supports
_ 1:l,.répartion.des_lmes de verre 10 Les lames de verre sont lavées pour mettre en évidence la silice (Si-) et rendre la surface des lames négative. Plus précisément, les lames de verre sont lavées pendant 15 min à 100 C dans une solution de Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 0,01 M. Trois lavages sont alors effectués avec de l'eau distillée filtrée. Les lames sont ensuite plongées dans une solution d'acide chlorhydrique 15 0,12 M pendant 15 min à 100 C. Trois lavages sont effectués avec de l'eau distillée filtrée. Les lames sont conservées à 4 C dans l'eau distillée filtrée avant traitement.
_ 1_,_Préparation..0 PTEEe Des patchs de polytétrafluoroéthylène expensé PTFEe de 9 mm de diamètre sont 20 préparés à partir de prothèses vasculaires tubulaires de PTFEe (6 mm de diamètre interne et 25 1an1 de longueur fibrillaire). Ces patchs sont ensuite collés dans des plaques de culture de 48 puits. Les multicouches de polyélectrolytes sont ensuite construits directement sur le PTFEe à l'intérieur des puits. Des études préalables ont montré l'absence de cytotoxicité de la colle. 25 1_, 1.:5.:_Cpmppsition du_milieu cpmplet Composition du milieu de culture pour les cellules • Sérum humain AB (provenant de donneurs volontaires sains) utilisé à 20%. Il est décomplémenté à 56 C pendant 30 min. 30 • M199 et RPMI 1640 v/v (Gibco BRL, France). • 2 mM de glutamine (Gibco BRL, France). • 100 U/mL de Pénicilline (Gibco BRL, France). • 100 g/mL de Streptomycine (Gibco BRL, France). • 2,5 g/mL de Fungizone"' (Gibco BRL, France). • 20 mM HEPES (Sigma, France). Lorsque le mélange RPMI 1640/M199 est supplémenté de ces additifs, il forme le milieu dit complet . La durée de conservation du milieu complet, conservé à 4 C, n'excède pas 2 semaines.
1 1 4 Préparation des artères cryoconservées et dé-endothélialisées Les artères sont récupérées à partir du cordon ombilical humain. A l'aide de deux pinces chirurgicales, le cordon ombilical est dilacéré et des longueurs d'artères d'au moins 6 cm sont isolées et plongées dans du Tampon (Raffles Balanced Salt Solution HBSS). Après plusieurs rinçages, généralement trois à cinq (jusqu'à ce que l'artère ne contiennent plus de sang) les artères sont placées dans des cryotubes contenant 1 mL d'une solution de congélation, qui est constituée de 70% de milieu complet supplémenté de 10% de DiMéthylSulfoxide (DMSO, Sigma, France) et de 20% de sérum de veau foetal (Gibco BRL, France), préalablement décomplémenté à 56 C pendant 30 min. Les cryotubes sont conservés une nuit à - 80 C, puis plongés dans de l'azote liquide à - 180 C. La durée de conservation est normalement de 6 mois (durée nécessaire pour effectuer les tests sérologiques lors de l'utilisation des allogreffes prélevées sur des cadavres). Les artères ombilicales sont décongelées en plongeant les cryotubes dans un bain- marie à 37 C. Elles sont ensuite lavées avec une solution de décontamination, qui est constituée de milieu RPMI 1640 (Gibco BRL, France) supplémenté de 100 UI/mL de pénicilline (Gibco BRL, France), de 100 .ig/mL de streptomycine (Gibco BRL, France) et de 2,5 tg/mL de Fungizone (Gibco BRL, France). La lumière de l'artère est lavée trois fois avec du tampon (HBSS), puis est remplie avec une solution de digestion (trypsine/EDTA 0,25%). Après 20 min d'incubation à 37 C, l'artère est lavée avec 2 mL de milieu contenant du sérum complet. Les artères dénommées par la suite artères dé-endothélialisées sont celles qui ont subi ce processus de cryoconservation. 1.2. Préparation des solutions de polyélectrolytes : PAH, PSS, PEI Les multicouches de polyélectrolytes sont constitués par l'alternance de solutions de polycations et de polyanions. 2917425
1.2.1. Matériel utilisé Tampon : Solution de Tris/NaCl (Tris 10mM et NaCl 150mM). Polyéleçtrolytes utilisés : ( ùCH, CH \ ,n n SO3Na PAH PSS Structure chimique des polyélectrolytes utilisés pour la construction desmulticouches de polyélectrolytes 10 e- Pol; cations utilisés :
- Poly (allylamine hydrochloride) (PAR) (Sigma Aldrich, France, PM=70kDa) 5g/L dans du tampon (pour artères et verre) ou dans du NaCl 1M (PTFEe). -Polyethylenimine (PEI) 10 g/L (Sigma Aldrich, France, MW = 750 kDa) dans une solution 15 de NaCl 1M. Polyanion utilisé :
- Poly (sodium-4-styrène sulfonate) (PSS) (Sigma Aldrich, France, PM=70kDa) 5g/L dans du tampon (pour artères et verre) ou dans du NaCl 1M (PTFEe). L'utilisation de ces polyélectrolytes est décrite dans les publications suivantes : 20 - C. Boura, P. Menu, E. Payan, J.C. Voegel, S. Muller, J.F. Stoltz, Biomaterials, "Endothelial tells grown on multilayered thin polyelectrolyte films: An evaluation of a new versatile surface modification" 24, 3521-3530, 2003. - C. Boura, S. Muller, D. Vautier, D. Dumas, P. Schaaf, J-C Voegel, J-F Stoltz, P. Menu, Biomaterials "Endothelial tell û interactions with polyelectrolyte multilayer films" 26, 4568-25 75, 2005. - D. Vautier, V. Karsten, C. Egles, J. Chluba, P. Schaaf, J.C. Voegel, J. Ogier, JBiomater Sci Polym Ed. "Polyelectrolyte multilayer films modulate cytoskeletal organization in chondrosarcoma tell" 13(6), 713-32, 2002. - P. Tryoen-Tôth, D. Vautier, Y. Haikel, J.C. Voegel, P. Schaaf, J. Chluba, J. Ogier, J Biomed 30 Mater Res. "Viability, adhesion, and bone phenotype of osteoblast-like tells on polyelectrolyte multilayer films" 60(4), 657-67, 2002. HCI CH, NH2 Iù CH2CH-- 5 ù NH CH2 CH2 ( N CH2 ù) 1 -Y CH,CH,NH2 PEI 1_.__Coilstrucioil__de. nlultiçouches__de__polyéleçtrolytes._(PAH-PS)3,PAH-PS)3AH__e PEI-(PSSPAH)3_sur les_supports_(verre,.PTFE ou_artèr
_Construçtionl de rnultiçouches.de_polyélectrolytes, Selon le cas, les multicouches de polyélectrolytes ont été déposés dans la lumière des artères ombilicales préalablement dé-endothélialisées, sur des lames de verres ou sur du PTFEe. Ces assemblages sont réalisés à température ambiante par des dépôts successifs du support alternativement dans une solution de polycation et de polyanion. Après deux lavages avec du tampon Tris/NaCl pour les supports verre et artères, et de l'eau distillée pour le support PTFEe, les supports sont mis au contact - de la solution de polycations (PAH) pendant 15 à 30 min, à température ambiante, pour la construction des multicouches (PAH-PSS)3 et (PAH-PSS)3-PAH (cas où le support est le verre ou une artère), ou, - de la solution de polycations (PEI) pour la construction de la multicouche PEI-(PSS-PAH)3 (cas où le support est le PTFEe). Cette étape est suivie par trois lavages avec du tampon Tris/NaCI pour les supports verre et artères, et de l'eau distillée pour le support PTFEe, permettant de déplacer les polyélectrolytes libres. La procédure est répétée avec une solution de polyanion (PSS), puis une solution de polycation (PAH). Une durée comprise entre 8 et 20 min est nécessaire pour permettre aux solutions de PSS et PAH d'être alternativement adsorbées sur le support. Entre chaque dépôt, trois lavages, avec du tampon Tris/NaCl pour les supports verre et artères, et de l'eau distillée pour le support PTFEe, sont effectués. Les multicouches de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 (finissant par une charge négative), (PAH-PSS)3-PAH et PEI-(PSS-PAH)3 (finissant par une charge positive) sont construites progressivement. Toutes les étapes de construction se font en maintenant le substrat dans une solution de polyélectrolytes ou d'eau distillée pour éviter le dessèchement de la surface.
Conservation_ des _supports.sur_lesuels. une multiçouçhe_ de_polyéleçtroytes__été . _éposée et définition des Supports utilisés coinine téinoiil pour_les.expérieilces_ suiyaiites *Ca des lames de verre sur lesquels AH_(PSS =PAH..3 a été_deposé Avant chaque expérience, les plaques pour cultures cellulaires contenant les lames de verres sont exposées aux UV pendant 15 min permettant ainsi la stérilisation. 37 2917425
Les lames de verre recouvertes de fibronectine (Sigma, France) à une concentration de inférieure à 250 ELg/mL sont utilisées comme témoins positifs.
*_Cas du_PTFEe sur lequel PEI-0PSS_PAH),_a été déposé 5 Le support PTFEe sur lequel une multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH); a été déposée est séché au minimum une nuit à 4 C après que le dépôt de la multicouche ai été effectué et avant leur utilisation. Il est conservé au maximum 15 jours à 4 C. Le support TCPS (Tissue Culture Polystyrene Surface) est le matériau le plus couramment utilisé pour la culture cellulaire, et il représente un polymère largement employé 10 pour l'étude des mécanismes des interactions entre cellules et matériau artificiel. Il est utilisé comme contrôle positif
*_Cas desquelles (PAH=PSS),_ou~PAH-PS)3-PAH_ont été_déosés. -- - --- -Les artères dé-endothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes 15 n'a été déposée, sont soumises à plusieurs injections de tampon de lavages et sont considérées comme contrôle (artère témoin). Les artères sur lesquelles des multicouches de polyélectrolytes ont été déposées et les artères contrôles sont conservées pendant toute une nuit à 4 C dans une solution de décontamination avant utilisation. Celle-ci est constituée de milieu RPMI 1640 (Gibco BRL, France) supplémenté de 100 UI/mL de pénicilline (Gibco 20 BRL, France), de 100 g/mL de streptomycine (Gibco BRL, France) et de 2,5 g/mL de Fungizone (Gibco BRL, France).
1.3. Validation du dépôt de la multicouche de polyélectrolyte 25 1__3 Lorsque le _ support est_Ie.PTFEe La vérification du dépôt homogène de la multicouche de polyélectrolytes sur le support PTFEe a été effectuée par microscopie confocale à balayage laser. La figure 1 montre la mise en évidence du recouvrement de toute la surface par la multicouche de 30 polyélectrolytes [PEI-(PSS-PAH)2-PSS-PAH*] grâce à l'utilisation du polycation hydrochlorure de poly(allylamine) couplé de façon covalente à la rhodamine (PAH*) (excitation = 541nm, ,émission. = 572nm, ICS, UPR 22 CNRS, Strasbourg, France) lors de la construction des multicouches de polyélectrolytes. 1.:3.2:_Lorsque_1 e_support est_n_yaisseau ou une artère
La vérification du dépôt homogène de la multicouche de polyélectrolytes sur la surface interne des vaisseaux a été effectuée par microscopie confocale à balayage laser. Les figures 2A à 2E montrent la mise en évidence du recouvrement de toute la surface interne d'une artère par la multicouche de polyélectrolytes [(PAH-PSS)2-PAH*-PSS-PAH*] grâce à l'utilisation du polycation hydrochlorure de poly(allylamine) couplé à la rhodamine (PAH*) lors de la construction des multicouches de polyélectrolytes. 39 2917425 Exemple 2 : Evaluation mécanique de la matrice artérielle
2.1. Description du banc et de l'expérience Les tests mécaniques sont effectués à l'aide d'un banc d'essai développé au 5 laboratoire. La pression est fournie par un capteur de pression (XTC-190M-0.35 BARVG, Kulite, Inc) situé en sortie de la pompe (EX303C-50, Prodera, France). L'information est représentative de la pression exercée sur les parois internes de l'artère. Le diamètre extérieur de l'artère est évalué par une caméra CCD (FZS 1024, Sensopart UK Ltd), qui en mesure la déformation. Le bloc CCD délivre une tension en fonction de la quantité de lumière reçue par un néon, qui sert de source de lumière étalon. Chaque extrémité de l'artère (traitée et témoin) est montée sur des embouts en plastique, puis l'artère est fixée dans une chambre en plexiglas remplie d'eau physiologique préchauffée à 37 C. Il est nécessaire que l'artère soit bien tendue. À l'aide d'une seringue munie d'un tuyau, l'intérieur de l'artère est rempli d'eau physiologique en évitant la formation de bulles d'air. L'extrémité libre de l'artère est clampée pour fermer le circuit. La pompe augmente ainsi la pression dans ce circuit fermé. Les paramètres sont entrés dans un logiciel permettant de contrôler la pompe. La pression dans l'artère augmente par paliers constants toutes les 15 secondes jusqu'à 230 mm Hg (avec un incrément de 30 mm Hg). Le diamètre externe de l'artère est enregistré pour chaque pression. Le pourcentage de déformation est calculé selon l'équation suivante : AD=100 x (Dp - D0)/D0 dans laquelle Dp, le diamètre correspondant à chaque pression.
DO, le diamètre à 0 mmHg. L'élasticité des artères correspond à la droite AD sur pression, mesurée à des pressions physiologiques (entre 80 et 150 mmHg).
2.2. Résultats Les figures 3 et 4 montre que les propriétés mécaniques de la paroi artérielle après dépôt de la multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH sur une artère déendothélialisée sont restaurées. En effet, le pourcentage de déformation de l'artère en fonction de la pression exercée sur cette artère est similaire pour des artères fraîches (•) et des artères déendothélialisées sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3- PAH a été déposée (à ), et est supérieur à celui des artères déendothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée (^ ).
Exemple 3 : Prolifération de cellules endothéliales sur du PTFEe sur lequel une multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3 a été déposée 3.1. Culture des cellules endothéliales 3 positi9tl des- s91uti9ns_ utilisées • Tampon HBSS (Hank's balanced salis solution) (Sigma, France) sans Cal+ ni Mg2+ contenant 0,4 g/L de KCI, 8 g/L de NaCl, 0,06 g/L de KH2PO4, 0,04778 g/L de Na2HPO4, 1 g/L de D-glucose, 0,011 g/L de rouge de phénol, pour 1L d'eau distillée (pH 7,2). Il doit être filtré sur 0,22 m et conservé à 4 C. • Solution de digestion trypsine-EDTA à 0,25% (Sigma, France) contenant 2,5 g de trypsine porcine et 0,2 g de EDTA-Na4 dans 100 mL d'HBSS. La trypsine est une enzyme protéolytique qui hydrolyse les liaisons peptidiques. • Milieu de culture ou milieu complet constitué de : ^ Milieu M199 et milieu RPMI 1640 volume par volume (GibcoBRL, France) ^ 20% de sérum humain AB décomplémenté (provenant de donneurs volontaires sains). ^ 2 mM de glutamine (GibcoBRL, France) ^ 100 U/mL de pénicilline (GibcoBRL, France) ^ 100 g/mL de streptomycine (GibcoBRL, France) ^ 2,5 g/mL de Fungizone (GibcoBRL, France) ^ 20 mM d'HEPES (Sigma, France) • Phosphate Buffer Saline (PBS) contenant NaCl 137 mM, KC1 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,4 mM. 3.1.2. Cellules utilisées Les cellules endothéliales nécessaires à cette étude proviennent de veines ombilicales humaines (HUVECs Human Umbilical Vein Endothelial Cells). Elles sont prélevées à partir de cordons ombilicaux de nouveaux-nés (dons de la Maternité Régionale de Nancy). Les cordons proviennent de donneurs sains, après leur consentement. Recueilli dès l'expulsion placentaire, le cordon est coupé à une dimension de 20 à 25 cm et immédiatement mis dans un flacon de culture de 75 cm2 contenant 150 mL de HBSS stérile. Placé rapidement à 4 C, le cordon est utilisé le plus tôt possible. Il peut se garder entre 4 et 6 heures. 42 .l l t es_cellt}le s_ endotl?é....les. à_partir.de.coi:dons_ombili~aux. La mise en culture des cellules est effectuée selon la méthode de Jaffe (E.A. Jaffe, R.L. Nachinan, C.G. Becker, C.R. Minick, J Clin Invest, "Culture of humais endothelial tells derived from umbilical veins. Identification by morphologie and immunologie criteria." 52(11), 2745-56, 1973) et se fait en plusieurs étapes : 3.1.3.1. Lavage de la veine ombilicale Le tampon HBSS est éliminé de la boîte et le cordon est déposé dans une boîte de culture stérile. L'extérieur du cordon est nettoyé à l'éthanol 75%. Un robinet est fixé à l'un des orifices de la veine ombilicale et ligaturé fortement au cordon. A l'aide d'une seringue, la veine est lavée trois fois avec du tampon HBSS (filtré et préchauffé à 37 C) pour en éliminer le sang. Puis, l'autre extrémité du cordon est clampée. 3.1.3.2. Détachement des cellules de la veine ombilicale On injecte 15-20 mL de la solution de digestion (filtrée et préchauffée à 37 C) dans la veine jusqu'à ce qu'elle soit suffisamment dilatée. Le cordon est immergé dans 200 mL d'HBSS ; l'ensemble est placé 10 minutes à 37 C dans un bain-marie. Le cordon est ensuite posé délicatement sur une boîte de culture et massé quelques secondes. Il est ensuite déclampé au-dessus d'un tube plastique de 50 mL (Polylabo, France) contenant 20 mL de milieu complet pour arrêter l'action de la trypsine et dans lequel est recueillie la solution de digestion contenant les cellules endothéliales libres. La veine est alors rincée avec du tampon HBSS pour entraîner dans le tube les cellules encore présentes. La suspension cellulaire est centrifugée à 1200 tr/min (300g) pendant 6 minutes, à température ambiante. Après centrifugation et dépôt du surnageant, le culot cellulaire est remis en suspension dans 10 mL d'HBSS. Puis on effectue une deuxième centrifugation. Les cellules sont remises en suspension dans 5 mL de milieu complet, ensemencées dans un flacon de culture de 25 cm2 et placées dans un incubateur à 37 C (5% CO2 et 95% d'air) et à saturation en humidité. 3.1.4. Culture des cellules
.......................................... Le jour suivant l'extraction des cellules endothéliales, les cellules sont lavées deux fois avec du tampon HBSS en effectuant de petits mouvements oscillatoires de façon à éliminer les globules rouges. Puis les cellules sont remises dans l'incubateur avec 5mL de milieu complet. Le milieu est renouvelé tous les deux jours. Normalement, après 5-7 jours, les cellules sont confluentes... DTD: A confluence, les cellules sont lavées par deux fois avec 5 mL d'HBSS (préchauffé à 37 C) et placées en contact avec 5 mL de trypsine-EDTA 0,125% (filtrée), à 37 C, pendant 3 minutes. L'action de digestion de la trypsine est arrêtée grâce à l'ajout de 5 mL de milieu complet. La suspension cellulaire est recueillie dans des tubes coniques stériles puis centrifugée à 1200 tr/min (300g) pendant 6 minutes. Les cellules sont alors remises en suspension dans 5 mL de milieu complet. ~.1.__Eilsemeiiçernpilt des_cellules endothéliales sur_le PTFEe star lequel a été déposée_une multicouche de polyélectrolytes Les cellules sont ensemencées, après leur deuxième passage (P2), à la densité cellulaire de 5.104 cellules/puits sur du PTFEe sur lequel a été déposée la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3, sur du PTFEe sur lequel a été déposée une monocouche de PAH, sur du PTFEe seul et sur TCPS (Tissue Culture Polystyrene Surface) (contrôle positif).
Le milieu est changé tous les 3 jours. 3.2. Evaluation de la biocompatibilité des surfaces
3.2 1 Evaluation de la viabilité cellulaire avec Alamar blue Seifalian et col. (A.M. Seifalian, H.J. Salacinski, G. Punshon, B. Krijgsman, G. Hamilton, J. Biomed. Mater. Res. "A new technique for measuring the tell growth and metabolism of endothelial tells seeded on vascular prostheses. " 15, 55(4), 637-44, 2001) ont démontré que Alamar blue (Serotec Ltd, Kidlington, England) est un agent qui a de nombreux avantages dans l'évaluation du métabolisme des cellules endothéliales et donc de la viabilité des cellules en croissance sur les prothèses vasculaires. Alamar blue redox assay (ABRA) (test Alamar bluee) est une technique que l'on a utilisée pour contrôler la viabilité des cellules endothéliales ensemencées sur le substitut vasculaire (PTFEe). Cette technique permet de mesurer quantitativement la prolifération cellulaire, la cytotoxicité et la viabilité. Alamar blue est composé d'un indicateur Rédox (indicateur colorimétrique) qui change de couleur en fonction de la réduction chimique du milieu de culture. Alamar blue est réduit par l'activité mitochondriale, représentative de l'activité métabolique cellulaire et donc de la viabilité cellulaire.
Alamar Blue a des propriétés intéressantes car il est soluble dans le milieu, stable en solution, non toxique pour les cellules et produit des changements facilement mesurables. Le test ne nécessite pas la lyse des cellules, ce qui permet de suivre la cinétique du signal. La mesure de la viabilité cellulaire est donc basée sur le taux d'oxydoréduction d'Alamar blue déterminé par la différence entre la mesure densitométrique à 570 nm (absorbance du composé réduit) et celle à 630 nm (absorbance du composé oxydé). Compte tenu du recouvrement partiel des spectres d'absorption du composé réduit (rouge) et du composé oxydé (bleu), l'absorbante est mesurée à 2 longueurs d'onde et la différence de densité optique (DO) est déterminée selon la formule : A DO = [DO(570nm)exp.ùDO(630nm)exp.] û [DO(570nm)tér.û DO(630nm)tém.] exp. = expérimental tém. = témoin sans cellules A = différence
La procédure est la suivante. Le test Alamar blue est réalisé selon le protocole choisi.
Les cellules endothéliales sont ensemencées sur les surfaces pendant 1, 3, ou 7 jours. Au temps choisi, le milieu de culture est remplacé par un milieu frais sans sérum contenant 10% v'v d'Alamar blue (la sensibilité de la technique Alamar blue dépend du ratio volumétrique entre Alamar blue et le milieu DMEM (Dulbecco 's Modified Eagle Medium) sans rouge de phénol (GibcoBRL, France)). On dépose 500 L de ce mélange dans chaque puit. La plaque de culture est placée dans l'incubateur à 37 C. La mesure densitométrique intervient 3 heures après l'adjonction du marqueur. La différence de densité optique (indice de la viabilité cellulaire) est alors déterminée. Des puits sans cellules sont utilisés comme référence. La figure 5 montre le résultat du test de viabilité des cellules endothéliales 25 ensemencées sur : - du TCPS, - du PTFEe, - du PTFEe sur lequel a été déposé le polyélectrolyte PAH (monocouche), ou, - du PTFEe sur lequel a été déposée la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH);. 30 Après un jour de culture, aucune différence d'activité métabolique n'est détectable. Après 3 jours de culture, une augmentation significative de l'activité métabolique des cellules est mesurée sur le TCPS. Sur les supports PTFEe, l'activité métabolique reste similaire à celle observée après un jour de culture.
Après sept jours de culture, les valeurs de l'activité métabolique observées pour le PTFEe sur lequel a été déposée la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3 (0.59 0.20) sont similaires à celles observées pour le support TCPS. Par contre, pour la même durée de culture, les valeurs de l'activité métabolique observées pour le PTFEe sur lequel a été déposé le polyélectrolyte PAH et pour le PTFEe seul sont significativement inférieures à celles observées pour le PTFEe sur lequel a été déposée la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3. Les cellules endothéliales ont donc commencé à proliféré sur le PTFEe sur lequel a été déposée la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3 après trois jours de culture et la maturation pour obtenir des cellules confluentes a lieu dans les sept jours de culture. De plus, une faible densité cellulaire (5.104 cellules / cm) a été suffisante pour obtenir une monocouche de cellules confluentes. Par contre, le dépôt d'une seule couche de polyélectrolyte PAH sur le PTFEe n'est pas suffisant pour observer une viabilité cellulaire similaire après une durée de culture identique. 3.2.2._Moiphologie_cellulaire_parmicroscopie.électronique_à balayage__(MEB) Pour réaliser l'observation au microscope électronique (STEREOSCAN S 240, CAMBRIDGE (UK)), les cellules doivent être fixées. On réalise deux lavages avec du tampon PBS chauffé à 37 C, puis les cellules sont fixées avec du glutaraldéhyde 2,5%, et conservées à 4 C avant observation au MEB. Les échantillons sont ensuite préparés pour permettre l'observation en microscopie électronique (déshydratation, fixation et recouvrement avec une couche d'or-palladium). Cette étude a été faite au laboratoire de Microscopie électronique (Pr Folliguet, Faculté de Médecine, Nancy). Les figures 6A, 6B, 6C, 6D et 6E montrent que, après 7 jours de culture : - les cellules endothéliales ensemencées sur le support PTFEe (témoin) sont peu nombreuses et ont un aspect rond, représentatif d'un mauvais étalement et d'une mauvaise adhérence des cellules sur ce support (figures 6A et 6B), - les cellules endothéliales ensemencées sur un polyélectrolyte PAH déposé sur le support PTFEe ne sont que rarement bien étalées (figures 6C et 6D) et le nombre de cellules adhérentes est faible, - les cellules endothéliales ensemencées sur la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSSPAH); déposée sur le support PTFEe sont nombreuses et étalées, ce qui signifie qu'elles sont adhérente à la multicouche; une monocouche de cellules endothéliales confluente a été 46 2917425
obtenue en moins de sept jours de culture; la densité cellulaire est élevée et il difficile de différencier les cellules les unes des autres; une distribution homogène est observée. 3.2.3. Caractérisation des cellules endothéliales 5 Le phénotype des cellules endothéliales est évalué par l'expression du facteur von Willebrand (vWf) en microscopie confocale. Dans le but de visualiser chaque cellule les noyaux sont marqués avec de l'iodure de propidium. Après 7 jours de culture, les cellules endothéliales sont lavées avec du DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) sans rouge de phénol (Gibco BRL, France) à 37 . Elles sont ensuite immédiatement fixées avec du PAF 10 (paraforrnaldehyde) 1% v/v dans du PBS. Après 10 minutes à température ambiante, on retire le PAF et on perrnéabilise les cellules en utilisant du Triton-X100 (Sigma, France) à 0,5% dans du PBS. Les cellules sont ensuite incubées pendant 45 minutes avec un anti-corps monoclonal vWf de souris anti-humain (clone F8/86, Dako, Trappes, France) dilué au 1/50 éme dans du Triton 0.1%. Les cellules sont ensuite lavées avec du DMEM poour enlever les 15 excès d'anti-corps et sont incubées pendant 30 minutes avec un anti-corps polyclonal IgG anti-souris conjugué à de l'Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Oregon, USA) dilué à 1/100e1'e dans du DMEM. Le contrôle isotypique est préparé dans les mêmes conditions. Les cellules sont incubées pendant 30 minutes avec de l'iodure de propidium (IP) (excitation =-535 nm, 2émission. = 617 nm, Molecular Probes, 1 mg/mL dans de l'eau distillée) dilué au 20 1/1000ème dans du DMEM. Les cellules marquées sont ensuite visualisées au microscope confocale à balayage laser en utilisant un objectif 40 et un laser He-Ne pour l'excitation 543nm (IP) et un laser Ar pour l'excitation 488 nm (vWf). La figure 7 montre que toutes les cellules adhérentes à la multicouche de polyélectrolytes PEI-(PSS-PAH)3 déposée sur le support PTFEe expriment le facteur vWF, 25 caractéristiques de cellules endothéliales, après 7 jours de culture. Ces observations montrent l'absence de dé-différenciation : les cellules ont conservé leur fonctionnalité endothéliale. 30 47 2917425
Exemple 4 : Prolifération de cellules endothéliales sur des artères sur lesquelles ont été déposée une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH
5 4,1. Matériel utilisé omposition du milieu de culture_ pour les_ cellules_ endothéliales Le milieu utilisé est celui décrit au paragraphe 1.1.3. Composition du milieu complet ci-dessus. > Cellules utilisées 10 Les cellules utilisées sont celles décrites au paragraphe 3.1.2. cellules utilisées
4.2. Mise en culture de cellules endothéliales issues de la veine ombilicale Un cordon ombilical est placé dans une boîte de Pétri stérile. L'extérieur du cordon est nettoyé avec de l'éthanol 70 . L'orifice de la veine ombilicale est repéré à l'aide d'une pince 15 pour y insérer un robinet stérile. Afin d'éliminer le sang de la veine ombilicale, cette dernière est lavée trois fois avec du tampon HBSS (Hank's Balanced Salt Solution). La veine ombilicale est alors remplie avec 15 à 20 mL d'une solution de digestion préchauffée à 37 C (trypsine/EDTA 0,25%). Le cordon, immergé dans du tampon HBSS, est placé dans au bain marie. Après 12 min d'incubation, la solution de digestion est recueillie dans un flacon de 50 20 mL contenant 5 mL de milieu complet. La veine est lavée avec du tampon HBSS. La suspension cellulaire est centrifugée à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Le culot cellulaire est remis en suspension dans 10 mL de tampon HBSS. Après le deuxième lavage, les cellules sont remises en suspension dans 5 mL de milieu complet. Les cellules endothéliales (HUVEC) sont ensemencées dans un flacon de culture de 25 cm2, puis placées 25 dans un incubateur à 37 C (5% de CO2 et 95% d'air).
4.3. Endothélialisation des artères Lorsque la confluence des cellules endothéliales est atteinte, le milieu de culture est éliminé et les cellules sont lavées deux fois avec 5 mL de tampon HBSS sans Cal+ ni Mg2+ 30 Ce lavage permet d'une part d'éliminer le sérum qui inhibe l'activité enzymatique de la trypsine, et d'autre part de libérer des ions Cal+qui secondairement, facilitent le détachement des cellules. Les cellules sont alors détachées à l'aide de 5 mL de solution de Trypsine-EDTA 0,125%. L'action de la trypsine est arrêtée, après 2 min à 37 C en ajoutant 10 mL de milieu complet. La suspension cellulaire est recueillie dans un tube Falcon stérile de 50 mL, puis centrifugée à 300 g. Le culot cellulaire est remis en suspension dans du milieu complet. Au deuxième passage (Pl), les cellules sont alors ensemencées à une densité cellulaire de 105 cellules/cm2 dans les différentes matrices (artères sur lesquelles ont été déposée une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH et artères contrôles). Afin de permettre une meilleure répartition des cellules, les substituts endothélialisés sont placés dans des Falcon stériles sous légère agitation pendant 4 heures. Ils sont mis en culture dans un incubateur à 37 C, 5% CO2 pendant 7 jours. 4.4. Résultats
1_,_Suivi du_pliénotype_par histologie Les figures 8A à 8D montrent que les cellules endothéliales recouvrent toute la surface luminale de F artère re-endothélialisée sur laquelle a été déposée ou non une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH . Les figures 8C et 8D montrent le maintien du phénotype endothélial après endothélialisation.
4.4.2..Evaluation.de.l'étalernent_par miçrosçopie éleçtronique Les figures 9A à 9C montrent que l'étalement des cellules endothéliales ensemencées sur l'artère sur laquelle a été déposée la multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH (9B) est proche du témoin (artère fraîche 9C) et est meilleur que celui sur l'artère sur laquelle aucune multicouche n'a été déposée (9A). 49 2917425
Exemple 5 : Rétention cellulaire après flux
5.1. Description de l'expérience L'évaluation de rétention des HUVEC ensemencés dans la lumière des artères est 5 effectuée dans une chambre de flux développée au laboratoire. Les cellules endothéliales sont exposées à des flux laminaires de 1 Pa (10 dynes/cm2), pendant une durée d'une heure. Une pompe péristaltique (Ismatech, Suisse) permet une circulation du milieu de culture. En amont de la chambre, deux seringues sont ajoutées au circuit, permettant de créer une modulation sinusoïdale afin d'amortir les fluctuations parasitaires de l'écoulement. Un 10 mélange gazeux (5% CO2 et 95% air) est introduit dans le réservoir de milieu pour réguler les v ariations de pH. Le système est placé dans une étuve régulée à 37 C. La contrainte de cisaillement est calculée par l'équation suivante :
i=4 Q t/icr3 15 T = contrainte de cisaillement (Pa) = viscosité du milieu complet 0.9.10"3 Pa.s à 37 C. Q = débit (m'/s). r= rayon (m).
20 Par conséquent, la valeur du débit de la pompe péristaltique permet de connaître la contrainte de cisaillement exercée dans la lumière del'artère. La pompe péristaltique a été étalonnée en réalisant une mesure du débit en fonction de la vitesse de rotation. Suite à cet étalonnage, la relation suivante a été obtenue par régression linéaire :
25 Débit (cm3/s) = 0,458e-3 vitesse de rotation (graduation) + 7,049e_4 permettant de choisir précisément la contrainte de cisaillement appliquée.
5.2. Résultats 1__Evaluati9il_de_la_rétention.çellulair_par.miçrosçopie.eonfocale à balay_age_laser Les figures 10A à 10D montrent que, après avoir soumis les artères à une contrainte de cisaillement de 1 Pa pendant une heure, un détachement des cellules endothéliales est observé sur les artères endothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été 50 2917425
déposée (Flèches). Par contre, pour les artères sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée, la couche de cellules endothéliales est toujours présente.
5 5.2,2,_Evaluatiop.de_la_rétenition_cellulair. par_microscopie_électronique_ Les figures 11A à 11D montrent que, après avoir soumis les artères à une contrainte de cisaillement de 1 Pa pendant une heure, un détachement des cellules endothéliales est observé sur les artères endothélialisées sur lesquelles aucune multicouche de polyélectrolytes n'a été déposée (Flèches). Par contre, pour les artères sur lesquelles une multicouche de 10 polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée, la couche de cellules endothéliales est toujours présente. De plus, les jonctions entre les cellules ne sont plus visibles, ce qui signifie que l'étalement des cellules endothéliales est très bon.
5.2.3. Conclusion ............................. 15 Les résultats des figures 10A à 10D et 11A à 11D montrent que la rétention des cellules endothéliales ensemencées sur la surface interne des artères sur lesquelles une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée est meilleure que celle des cellules endothéliales ensemencées sur la surface interne des artères sur lesquelles aucune multicouche n'a été déposée. 20 51 2917425 Exemple 6 : Evaluation In vivo des substituts artériels
Dans cet exemple, les substituts vasculaires (artères ombilicales) traités avec une multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 sont évalués chez l'animal (le lapin). Les artères 5 non traitées dé-endothélialisées sont utilisées comme contrôle.
6.1. Description de l'expérience
6.1.1. Animaux 10 Toutes les expérimentations effectuées sur le lapin ont été réalisées en respectant les règles de bioéthique en vigueur en Europe (Décret n 2001-131 du 6 février 2001, lié à la directive européenne 86-609-CEE de 1986). Ainsi les animaux (lapins blancs néo-zélandais mâles, pesant 3 0,25 kg) ont une origine contrôlée (CEGAV, St Mars d'Egrenne, France), et ont été hébergés dans une animalerie agrées et toutes les précautions nécessaires ont été prises 15 pour éviter toute souffrance à l'animal lors des expérimentations.
6.1.2. Anesthésie L'induction de l'anesthésie est réalisée, via la veine marginale externe de l'oreille, au moyen d'un cathéter intraveineux (Nécessaire épicrânien Salva, COOPER, Rhône-Poulenc 20 Rorer, Melun, France), par l'injection lente d'une dose de 40 mg/kg de pentobarbital sodique (Ceva Santé Animale, France), dilué au quart dans du sérum physiologique (NaCl 0,9% Cooper, Rhône-Poulenc, France). Contrairement aux anesthésiques volatils, le pentobarbital sodique ne semble pas modifier le comportement des polynucléaires neutrophiles ni des plaquettes. L'efficacité de l'anesthésie est vérifiée avant le début de tout acte chirurgical par 25 pincement interdigital de la patte arrière du lapin. L'anesthésie est entretenue par injection intra-veineuse (veine marginale de l'oreille) de pentobarbital dilué au t/4 dans du sérum physiologique de façon itérative.
1-,-Çhirurgip 30 L'animal anesthésié est placé en décubitus dorsal sur la table chauffante et sa température corporelle est maintenue constante à 37 C. Les zones d'intervention chirurgicales sont rasées puis désinfectées à la polyvidone iodée (Bétadine dermique 10% TM Laboratoire Sarget, Mérignac, France). 52 2917425
6.1.:4:_Çzthétérisation_de l'artère fémorale pour_prélèyement dusang Après anesthésie locale à la Xylocaïne, une incision est pratiquée dans la région du pli de l'aine droite, sur environ 3 cm. L'artère fémorale est isolée du trajet du nerf et de la veine, puis dégagée et incisée pour introduire un cathéter en polyéthylène, de diamètre interne : 5 0,58 mm et diamètre externe : 0,96 mm, rempli de sérum physiologique hépariné. Ce cathéter est avancé sur environ 1 cm et permet de prélever 50 mL de sang recueillie dans des seringues de 20 mL préalablement héparinées. La plaie est nettoyée avec de la polyvidone iodée et la peau est suturée avec du fil en polyglactine 2 - 0 (Vicryl, Ethicon). L'animal est ensuite remis à l'animalerie dans les 10 conditions décrites précédemment.
1_,5,_hnplantation_des_substituts artériels Sur un animal préalablement anesthésié, une anesthésie locale supplémentaire à la Xylocaïne (Astra Zenaca, Monts, France) est appliquée, puis une incision d'environ 4 cm est 15 pratiquée au niveau du cou, le long de la trachée. L'artère carotide droite est dégagée. Une administration intra-veineuse de 300 U/mL d'Héparine de sodium (Sanofi synthelabo, France) est effectuée juste avant mise en place des clamps vasculaires (niveau proximal et distal). Après avoir clampé la carotide, une artériotomie (0,5 cm) est pratiquée au niveau proximal, à une distance d'environ 1 cm du clamp, puis au niveau distal, pour y insérer le 20 greffon vasculaire par pontage termino-latéral. L'anastomose est réalisée à l'aide de fils vasculaire 8 -O. Une fois le greffon en place, l'artère carotide est ligaturée et la circulation sanguine dans le greffon est vérifiée.
1_: _ Suivi _du_ substitut_ artériel_ ..u_ cours. du_ temps 25 Les substituts artériels sont suivis jusqu'à 3 mois. La perméabilité des substituts est vérifiée par Echo-doppler. Cet appareil a permis de mesurer le flux sanguin ainsi que l'évolution du diamètre du substitut.
1_,7,_Euthanasie_ et prélèyement_des substituts artériel 30 Après 1 et 12 semaines de mise en place du substitut, les greffons ainsi que les carotides témoins (gauches) sont prélevés, rincés délicatement avec de l'eau physiologique héparinée, puis soumis à des examens macroscopique et microscopique. Les animaux sont euthanasies par injection d'une dose létale de pentobarbital sodique, conformément aux recommandations publiées par la Commission Européenne (décret n 2001-131 du 6 février 2001, lié à la Directive européenne 86-609-CEE de 1986). La mort de l'animal est constatée après arrêts respiratoire et cardiaque. 6.2. Résultats 6,2 1 __Hisologie.
L'étude histologique des substituts des figures 12A à 12F montre:
- l'obstruction de la lumière des artères contrôles après 1 semaine d'implantation,
- que les artères sur lesquelles ont été déposée une multicouche de polyélectrolytes restent perméables après 1 semaine et jusqu'à 3 mois d'implantation, avec suivi hebdomadaire du passage du sang dans les artères. 6.2,2,_Mim.ç.Qpie_élpctronigue à balaya e
Les observations effectuées au microscope électronique à balayage (figures 13A à 15 13F) montrent
- l'obstruction de la lumière des artères contrôles après 1 semaine d'implantation,
- que les artères traitées ne montrent pas la présence de caillots après 1 semaine et 3 mois d'implantation. 20 6.2,3,_Eçho-doppler
La fonctionnalité des substituts artériels est suivie sur un animal vigile par une technique non invasive : 1 < echo-doppler . Cet appareil a permis de mesurer la vitesse du sang ainsi que l'évolution du diamètre des substituts artériels.
Les tracés obtenus (figures 14A à 14C) montrent que, l'artère sur laquelle une
25 multicouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3 a été déposée, a une bonne perméabilité. Le calcul de l'aire sous la courbe des tracés montre que la vitesse du sang dans le substitut artériel est égale à celle mesurée dans la carotide témoin. La mesure du diamètre de chaque substitut artériel ne montre aucune dilatation ni anévrisme. 30 54 2917425
Exemple 7 : Cellules souches EPC se différenciant en cellules endothéliales sur support synthétique
7.1. Matériel 5 Çompositioil du milie_de_çulture de_progéniteurs endothéliaux__ Milieu commercial : EBM-2 supplémenté avec un cocktail de facteurs de croissance (VEGF, hydrocortisone, hFGF, IGF, Ac Ascorbique, hEGF, héparine) (Single Quot ) (Clonetics, Belgique).
10 7.2. Mise en culture des progéniteurs endothéliaux Une fraction leucocytaire de la circulation périphérique a été obtenue après séparation par un gradient de densité. Un mélange de sang hépariné et de PBS (Phosphate Buffer Saline) (10 mL de sang dans 16 mL de PBS) est ajouté doucement à 10 mL d'Histopaque 1077 (Sigma, France), puis centrifugé à 400 g pendant 30 min. L'anneau de leucocytes est aspiré avec une pipette pasteur stérile et transféré dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de MCDB 131 (Gibco, France) supplémenté de 5 U/mL d'héparine de sodium (Sigma, France). Le tube est ensuite centrifugé à 250 g pendant 10 min, le surnageant est éliminé et le culot est resuspendu dans 10 mL de MCDB 131 hépariné. Cette dernière opération est répétée trois fois. Le culot est alors resuspendu dans du milieu de culture EBM-2 supplémenté avec un cocktail de facteurs de croissance (Single Quot ) (Clonetics, Belgique). Environ 1 x 106 EPC (Endothelial Progenitor Cell) par cm2 sont mise en culture dans un flacon de culture de 25 cm2 traité avec de la fibronectine (20 g/mL) ou une multicouche de polyélectrolytes (PAHPSS)3-PAH. Le milieu de culture est changé après quatre jours ce qui permet d'éliminer les cellules non adhérentes, puis tous les deux jours. Ces cellules sont cultivées pendant 2 semaines à 37 C et 5% de CO2.
7.3. Résultats
1,_Miçrosçopie_à_çontrate_dg_phase, Les figures 15A à 15F montrent des images obtenues après observation en microscopie à contraste de phase et illustre la différenciation des progéniteurs endothéliaux en cellules endothéliales matures. Sur la lame de verre sur laquelle une multicouche de polyélectrolytes a été déposée, une monocouche de cellules est obtenue après 14 jours de culture (addition de facteurs de croissance (VEGF, hydrocortisone, hFGF, IGF, Ac Ascorbique, hEGF, héparine) dans le milieu). L'aspect morphologique de la monocouche obtenue est semblable à celle des cellules endothéliales matures issues de la veine jugulaire de lapin (JVEC). En comparaison, 60 jours sont nécessaires pour obtenir une monocouche de cellules sur lame de verre recouverte de fibronectine. 7.3.2._ Microscopie_confoçale_ à_balayage_laser La caractérisation phénotypique des cellules après 14 jours de culture est effectuée par observation en microscopie confocale à balayage laser (Figures 16A à 16L). La monocouche de cellules obtenue sur la multicouche de polyélectrolytes correspond bien à une monocouche de cellules endothéliales (PECAM-1, vWF positifs). Les cellules sont fonctionnelles car elles ont acquis la capacité à incorporer les LDL. Ces cellules expriment également les fibres d'actine, signe d'une bonne adhésion et d'un bon étalement.
7.3.3._ Etude emi-quantitatiye__de_ la fluorescence. sur des_ images _ obtenues__eii microscopie 15 confocale L'étude semi-quantitative de la fluorescence sur des images obtenues en microscopie confocale après 14 jours de culture (figures 17A à 17C) confirme que : - la monocouche de cellules obtenue sur la multicouche de polyélectrolytes correspond bien à une monocouche de cellules endothéliales (PECAM-1, vWF positifs); 20 - ces cellules sont fonctionnelles car elles ont acquis la capacité à incorporer les LDL; - les cellules endothéliales issues des EPC ensemencées sur une couche de fibronectine après 14 jours de culture ont moins bien proliféré que les cellules endothéliales issues des EPC ensemencées sur une multicouche de polyélectrolytes après 14 jours de culture.
25 7.3.4. Test de viabilité La figure 18 montre le résultat d'un test de la viabilité cellulaire avec Alamar Blue . Le principe et la procédure de ce test ont été explicités dans l'exemple 3. La figure 14 montre que la multicouche de polyélectrolytes n'a aucune incidence sur la viabilité des progéniteurs. Une différence significative est observée entre les cellules endothéliales issues de 30 l'ensemencement de EPC sur une multicouche de polyélectrolytes, et celles issues de l'ensemencement de EPC sur la fibronectine. Une bonne activité métabolique des cellules signe d'une bonne prolifération cellulaire, est observée pour les cellules endothéliales issues de l'ensemencement de EPC sur une multicouche de polyélectrolytes. 56 2917425
Exemple 8 : cellules souches EPC se différenciant en cellules endothéliales sur support naturel
8.1. Ensemencement de cellules endothéliales progénitrices dans la lumière des matrices 5 artérielles. Réactif • • Bleu de trypan (Sigma, France). • Agitateur à balancement générant des mouvements de bascule lents (APELEX, 10 France). • Milieu de culture EBM-2 supplémenté de facteurs de croissances (Clonectics, Belgique).
Des EPC issus du sang périphérique de lapins, sont récupérés et les cellules sont comptées sur une cellule de Thoma. La viabilité est estimée selon le test d'exclusion au bleu de Trypan (Sigma, France). Un volume de la solution de bleu de Trypan finale est additionné à un même volume de suspension cellulaire. Les cellules ne permettant pas l'entrée du colorant sont considérées comme vivantes. La suspension cellulaire est ajustée et injectée dans les différentes matrices (Artères sur lesquelles une monocouche de polyélectrolytes (PAH-PSS)3-PAH a été déposée, et les artères contrôles) (avec une longueur de 4 cm), la densité cellulaire est de 1 x 10' cellules/cm`. Afin de permettre une meilleure répartition des cellules, les substituts endothélialisés sont placés dans des Falcon stériles sous légère agitation pendant 4 heures. Les artères sont ensuite placées dans des flacons (une artère par flacon) de culture et mises dans un incubateur à 37 C (5% de CO2 et 95% d'air). La durée de culture est d'une semaine.
8.2. Stimulation mécanique : Différenciation sous contraintes de cisaillement. Afin d'évaluer la rétention des EPC ensemencés dans la lumière des artères (sur lesquelles une multicouche de polyélectrolyte a été déposée, et contrôles (sans multicouche)) et d'améliorer leurs différenciations, celles-ci ont été exposées à un flux laminaire. Ce dernier permet de générer des contraintes de cisaillement de 0,1 à 0,25 Pa. Cette étude est réalisée dans une chambre d'écoulement développée au laboratoire (Figure 19). La durée d'exposition est de 48 heures. 57 2917425
Descriptif_ du circuit_;, • Un réservoir de milieu de culture complet. • Une pompe péristaltique (Ismatech, Suisse). • Une arrivée d'air. 5 • Des tuyaux en Pharmed ainsi que des raccords autoclavables (Bioblocic, France). • Chambre d'écoulement.
Une pompe péristaltique permet une circulation du milieu de culture sans facteurs de croissance. En amont de la chambre, deux seringues sont ajoutées au circuit, permettant de 10 créer une modulation sinusoïdale afin d'amortir les fluctuations parasitaires de l'écoulement. Un mélange gazeux (5% de CO2 et 95% d'air) est introduit dans le réservoir de milieu pour réguler les variations de pH. Le système est placé dans une étuve régulée à 37 C. La contrainte de cisaillement est calculée par l'équation suivante : 15 i=4Q 1.1/ n r' 't : contrainte de cisaillement (Pa), : viscosité du milieu complet 0.9.10"3 Pa.s à 37 C, Q : débit (m'Is), r : rayon (ln).
Par conséquent, la valeur du débit de la pompe péristaltique permet de connaître la 20 contrainte de cisaillement exercée dans la lumière de l'artère. La pompe péristaltique a été étalonnée en réalisant une mesure du débit en fonction de la vitesse de rotation. Le débit de la pompe péristaltique est étalonné par la graduation de la vitesse de rotation (Figure 20). La relation :
25 y = 0,0018 x
a été obtenue par régression linéaire. Elle permet de choisir précisément la contrainte de cisaillement appliquée.
30 8.3. Evaluation de la rétention des cellules endothéliales matures sur le support L'évaluation de la rétention des cellules endothéliales matures sur le support est effectuée par : - comptage des cellules dans le milieu, évaluation de leur présence sur la matrice par microscopie électronique à balayage, vérification du phénotype par microscope confocal (marquage de PECAM 1, vWF, VEGFR2 et incorporation les LDL, comme au paragraphe 7.3.2.) 59 2917425
Exemple 9 : Cellules souches mésenchymateuses humaines se différenciant en cellules endothéliales sur support synthétique
9.1. Matériel Les supports de culture sont des lames de verre : -recouvertes de fibronectine (densité : 5 g/puits), - sur lesquelles une multicouche de PET-(PSS-PAH)3 ou (PSS-PAH)2-PAH a été déposée, -recouvertes de gélatine (à 1%, 5001ÀL/puits) Le milieu de culture est le suivant : alpha MEM + 0 ,5% ou 2% de SVF 10 9.2. Mise en culture de cellules souches mésenchymateuses humaines et différenciation Des cellules souches mésenchymateuses humaines sont mises en culture avec une densité d'ensemencement de 5.103 cellules par cm2. Les méthodes de différenciation en cellules endothéliales sont: 15 - avec ou sans facteur de croissance VEGF (50 ng/mL), - en conditions statiques ou avec cisaillement. L'incubateur est à 37 C, sous 5% CO2. Les contraintes de cisaillement dans la chambre de flux sont de 0.5 Pa, 1 Pa, 1.5 Pa, 2 Pa pendant 24 h, 48 h, 72 h ou 96 h débutées à 7 jours de culture (durée de culture au bout de 20 laquelle les cellules sont confluentes).
9.3. Résultats La vérification de la qualité des cellules endothéliales différenciées peut être effectuée : 25 - par comptage de la présence éventuelle de cellules dans le milieu, qui représentent les cellules décrochées ou mal adhérentes), ou, - par test de viabilité (comme au paragraphe 7.3.4.). L'évaluation du potentiel angiogénique peut être effectuée par - libération de NO et PGI2 (prostaglandine), 30 -incorporation de DiI-acLDL (fonction associée aux cellules endothéliales car elles seules l'absorbent) - liaison à la lectine UEA-1 (Ulex europaeus 1) : lectine spécifique des cellules endothéliales - marquage des filaments d'actine (confocal) - étude la morphologie en microscopie de fluorescence et confocale, 60 2917425
- détermination de l'expression de VE-cadhérine (CD144), du facteur von Willebrand (vWF) et PECAM-1 (CD31) par cytométrie en flux et microscopie confocale, - RT-PCR : expression génétique des marqueurs endothéliaux : VEcadhérine, VEGFR2/R1, CD31, vWF. 5 10 15 20 25 30 35
Claims (20)
1. Utilisation de multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support, les dites multicouches : - étant éventuellement revêtues, partiellement ou complètement, d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, - et / ou comprenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, pour : * la mise en oeuvre d'un procédé de prolifération de cellules initiales, souches ou différenciées, mises en contact - avec les susdites multicouches de polyélectrolytes - ou avec le susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives revêtant les susdites multicouches de polyélectrolytes, * et l'obtention d'un recouvrement - des susdites multicouches de polyélectrolytes - ou du susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales, * le susdit recouvrement étant obtenu au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours après la mise en contact des susdites cellules initiales, - avec les susdites multicouches de polyélectrolytes - ou avec le susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, sous réserve que les dites cellules souches ne soient pas des cellules souches embryonnaires humaines.
2. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle les cellules initiales sont des cellules différenciées ou des cellules souches, - les dites cellules différenciées étant notamment choisies parmi les kératinocytes, chondrocytes, cellules nerveuses, cellules dendritiques, cellules endothéliales, fibroblastes,épiblastes, myoblastes, cardio-myoblastes, myocytes, cellules épithéliales, ostéocytes, ostéoblastes, hépatocytes et cellules des ilots de Langerhans, et, - les dites cellules souches étant notamment choisies parmi les cellules totipotentes, pluripotentes et multipotentes.
3. Utilisation selon une quelconque des revendications 1 et 2, dans laquelle les multicouches de polyélectrolytes : • comprennent ou sont constituées de couches de préférence alternées de polycations et de polyanions, - les dits polycations étant notamment choisis parmi la polyallylamine (PAH), la polyethylèneimine (PEI), la polyvinylamine, la polyaminoamide (PAMAM), le polyacrylamide (PAAm), le chlorure de polydiallyldimethylammonium (PDAC), des polypeptides chargés positivement tels que la polylysine et des polysaccharides chargés positivement tels que le chitosane, - et les dits polyanions étant notamment choisis parmi l'acide polyacrylique (PAA), l'acide polymétacrylique (PMA), l'acide polystyrène sulfonique (PSS ou SPS), des polypeptides chargés négativement tels que l'acide polyglutamique et l'acide polyaspartique et des polysaccharides chargés négativement tels que le hyaluronane et l'alginate, * et sont en particulier choisies parmi (PAH-PSS)3, (PAH-PSS)3-PAH et PEI-(PSS-PAH)3. 20
4. Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le nombre de couches des multicouches de polyélectrolytes est de 3 à 100, en particulier 3 à 50, notamment 5 à 10 et en particulier 7. 25
5. Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le support est un support synthétique ou un support naturel, - le dit support synthétique étant notamment choisi parmi le verre, le TCPS (polystyrène dit traité culture cellulaire ), le polysiloxane, les polyéthers de perfluoroalkyle, les polymères biocompatibles en particulier le Dacron , le polyuréthane, le polydiméthylsiloxane, le 30 chlorure de polyvinyle, le Silastic , le polytetrafluoroéthylene (PTFEe), et tout matériau utilisé pour les prothèses et / ou les systèmes implantés, - le dit support naturel étant notamment choisi parmi les vaisseaux sanguins, les veines, les artères, notamment les artères ombilicales décellularisées, les dits vaisseaux, veines et artèresprovenant d'organes de donneurs ou d'animaux, le derme de placenta, la vessie et tout autre support (organe) d'origine humain ou animal.
6. Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 5, pour la préparation d'endoprothèses vasculaires, de ballons d'angioplastie, d'artères ou de vaisseaux artificiels pour des greffes, de dérives vasculaires, de valves cardiaques, de composants artificiels pour le coeur, de pacemakers, d'appareil d'assistance ventriculaire, de cathéters, de lentilles de contact, de lentilles intraoculaires, de matrices pour l'ingénierie de tissu, de membranes biomédicales, de membranes de dialyse, de membranes d'encapsulation de cellules, de prothèse pour la chirurgie cosmétique, de prothèses orthopédiques, de prothèses dentaires, de pansements. de sutures, de biosenseurs de diagnostic.
7. Procédé de recouvrement in vitro de cellules initiales, souches ou différenciées, comprenant : - la mise en contact de cellules initiales avec des multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, dans des milieux permettant la prolifération des dites cellules initiales, - la prolifération des susdites cellules initiales, - l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches ou du susdit ensemble de molécules revêtant les multicouches, par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales, - la récupération éventuelle des dites cellules adhérentes, viables et confluentes sous réserve que les dites cellules souches ne soient pas des cellules souches embryonnaires humaines.
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel le procédé est un procédé de recouvrement de cellules souches initiales comprenant: 64 2917425 - la mise en contact de cellules souches initiales avec des multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support dans des milieux permettant la prolifération des dites cellules initiales. - la prolifération des susdites cellules souches, 5 - la maturation et la différenciation des susdites cellules souches en cellules différenciées, - la prolifération des susdites cellules différenciées issues des susdites cellules initiales, - l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment quatorze jours après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales, 10 - la récupération éventuelle des dites cellules adhérentes, viables et confluentes.
9. Procédé selon la revendication 7, dans lequel le procédé est un procédé de recouvrement de cellules différenciées initiales comprenant: - la mise en contact de cellules différenciées initiales avec des multicouches de 15 polyélectrolytes déposées sur un support dans des milieux permettant la prolifération des dites cellules initiales, - la prolifération des susdites cellules différenciées, - l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment quatorze jours et en particulier sept jours après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites 20 multicouches par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules initiales, - la récupération éventuelle des dites cellules adhérentes, viables et confluentes.
10. Procédé selon une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel le procédé comprend: 25 - la mise en contact de cellules initiales avec des multicouches de polyélectrolytes déposées sur un support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les 30 propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, dans des milieux permettant la prolifération des dites cellules initiales, - la prolifération des susdites cellules initiales, 65 2917425 - l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches ou du susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives revêtant les multicouches, par des cellules adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules 5 initiales, - la récupération des dites cellules adhérentes, viables et confluentes.
11. Procédé de recouvrement de cellules endothéliales initiales selon une quelconque des revendications 7, 9 et 10 comprenant: 10 - la mise en contact de cellules endothéliales initiales avec des multicouches de polyélectrolytes choisies parmi (PAH-PSS)3, (PAH-PSS)3-PAH et PEI-(PSS-PAH)3, déposées sur un support, notamment un support naturel tel qu'un vaisseau sanguin ou une artère décellularisés, ou un support synthétique biocompatible ayant une forme de vaisseau ou d'artère, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules 15 biologiques ou biologiquement actives, et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, dans des milieux permettant la prolifération des susdites cellules 20 endothéliales initiales, - la prolifération des susdites cellules endothéliales initiales, -l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas un mois, notamment 14 jours et en particulier 7 jours après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches ou du susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives 25 revêtant les multicouches, par des cellules endothéliales adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules endothéliales initiales.
12. Procédé de recouvrement de cellules souches initiales selon une quelconque des revendications 7, 8 et 10, comprenant : 30 - la mise en contact de cellules souches initiales avec des multicouches de polyélectrolytes choisies parmi (PAH-PSS)3, (PAH-PSS)3-PAH et PEI-(PSS-PAH)3, déposées sur un support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susditesmulticouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, dans des milieux permettant la prolifération des susdites cellules souches initiales, - la prolifération des susdites cellules souches initiales, - la maturation et la différenciation des susdites cellules souches en cellules endothéliales, -la prolifération des susdites cellules endothéliales issues des susdites cellules souches initiales. - l'obtention, au bout d'une durée ne dépassant pas tus. 14 jours après la susdite mise en contact, d'un recouvrement des susdites multicouches ou du susdit ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives revêtant les multicouches, par des cellules endothéliales adhérentes, viables et confluentes issues de la prolifération des susdites cellules souches initiales.
13. Procédé selon une quelconque des revendications 7, 8, 10 et 12, dans lequel les dites cellules souches initiales sont notamment choisies parmi les cellules totipotentes, pluripotentes et multipotentes.
14. Procédé selon une quelconque des revendications 7, 9 et 10, dans lequel les dites cellules différenciées initiales sont notamment choisies parmi les kératinocytes, chondrocytes, cellules nerveuses, cellules dendritiques, cellules endothéliales, fibroblastes, épiblastes, myoblastes, cardio-myoblastes, myocytes, cellules épithéliales, ostéocytes, ostéoblastes, hépatocytes et cellules des ilots de Langerhans.
15. Procédé selon une quelconque des revendications 7 à 14, dans lequel les dites multicouches de polyélectrolytes * sont constituées de couches de préférence alternées de polycations et de polyanions, - les polycations étant notamment choisies parmi la polyallylamine (PAH), la polyethylèneimine (PEI), la polyvinylamine, la polyaminoamide (PAMAM), le polyacrylamide (PAAm), le chlorure de polydiallyldimethylammonium (PDAC), des polypeptides chargés positivement tels que la polylysine et des polysaccharides chargés positivement tels que le chitosane, - et les polyanions étant notamment choisis parmi l'acide polyacrylique (PAA), l'acide polymétacrylique (PMA), l'acide polystyrène sulfonique (PSS ou SPS), des polypeptides 67 2917425 chargés négativement tels que l'acide polyglutamique et l'acide polyaspartique et des polysaccharides chargés négativement tels que le hyaluronane et l'alginate, et, * sont en particulier choisies parmi (PAH-PSS)3, (PAH-PSS)3-PAH et PEI-(PSS-PAH)3. 5
16. Composition comprenant un support, des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les 10 propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et une couche de cellules souches recouvrant les dites multicouches de polyélectrolytes sous réserve que les dites cellules souches ne soient pas des cellules souches embryonnaires humaines. 15
17. Composition comprenant un support naturel, des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le dit support, les dites multicouches étant éventuellement revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives et / ou contenant éventuellement des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration 20 étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient modifiées, et une couche de cellules différenciées recouvrant les dites multicouches de polyélectrolytes.
18. Composition comprenant un support, des multicouches de polyélectrolytes déposées sur le 25 dit support, les dites multicouches étant revêtues d'un ensemble de molécules biologiques ou biologiquement actives, et / ou contenant des molécules biologiques ou biologiquement actives, intégrées entre au moins deux couches adjacentes des susdites multicouches de polyélectrolytes, l'intégration étant telle que ni les propriétés de la multicouche de polyélectrolytes, ni les éventuelles propriétés biologiques des dites molécules ne soient 30 modifiées, et une couche de cellules différenciées recouvrant les dites molécules biologiques ou biologiquement actives.
19. Composition selon une quelconque des revendications 16 à 18, dans laquelle les dites multicouches de polyélectrolytes* sont constituées de couches de préférence alternées de polycations et de polyanions, - les polycations étant notamment choisis parmi la polyallylamine (PAH), la polyethylèneimine (PEI), la polyvinylamine, la polyaminoamide (PAMAM), le polyacrylamide (PAAm), le chlorure de polydiallyldimethylammonium (PDAC), des polypeptides chargés positivement tels que la polylysine et des polysaccharides chargés positivement tels que le chitosane, - et les polyanions étant notamment choisis parmi l'acide polyacrylique (PAA), l'acide polymétacrylique (PMA), l'acide polystyrène sulfonique (PSS ou SPS), des polypeptides chargés négativement tels que l'acide polyglutamique et l'acide polyaspartique et des polysaccharides chargés négativement tels que le hyaluronane et l'alginate, * et sont en particulier choisies parmi (PAH-PSS)3, (PAH-PSS)3-PAH et PEI-(PSS-PAH)3.
20. Composition selon une quelconque des revendications 16, 18 et 19, dans laquelle le dit support est un support naturel ou synthétique, - le dit support naturel étant notamment choisi parmi les vaisseaux sanguins, les veines, les artères, notamment les artères ombilicales décellularisées, les dits vaisseaux, veines et artères provenant d'organes de donneurs ou d'animaux, le derme de placenta, la vessie et tout autre support (organe) d'origine humain ou animal, - le dit support synthétique étant notamment choisi parmi le verre, le TCPS (polystyrène dit traité culture cellulaire ), le polysiloxane, les polyéthers de perfluoroalkyle, les polymères biocompatibles en particulier le Dacron , le polyuréthane, le polydiméthylsiloxane, le chlorure de polyvinyle, le Silastic , le polytetrafluoroéthylene (PTFEe) et tout matériau utilisé pour les prothèses et / ou les systèmes implantés. 30 35
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