EP1984720A1 - Verfahren und vorrichtung zum präparieren von biologischen proben - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum präparieren von biologischen proben

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Publication number
EP1984720A1
EP1984720A1 EP07702451A EP07702451A EP1984720A1 EP 1984720 A1 EP1984720 A1 EP 1984720A1 EP 07702451 A EP07702451 A EP 07702451A EP 07702451 A EP07702451 A EP 07702451A EP 1984720 A1 EP1984720 A1 EP 1984720A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
chamber
opening
liquid
liquids
valve
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07702451A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Björn QUAST
Alexander Gruhl
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Freie Universitaet Berlin
Original Assignee
Freie Universitaet Berlin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Freie Universitaet Berlin filed Critical Freie Universitaet Berlin
Publication of EP1984720A1 publication Critical patent/EP1984720A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G01N1/31—Apparatus therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for the preparation of biological samples by a sequence of different, preparation-containing liquids according to the preamble of claim 1 or 8.
  • a marking of the samples by staining done.
  • the company Leica Microsysteme GmbH distributes under the name "EMSTAIN" a device for automatic contrasting of up to 25 grids in one operation.
  • the grids are positioned in a fixed chamber, which has a line connection at the top and bottom.
  • the solutions required for a contrasting process are pumped into the chamber one after the other.
  • the liquid flow must be reversed several times via a valve circuit during the contrasting process.
  • the invention has for its object to simplify the change of the liquids to be introduced into the chamber in a method or apparatus of the type mentioned.
  • the invention is in particular based on the object, the line paths that must flow through the introduced into the chamber liquids, and reduce their dead spaces in a method or apparatus of the type mentioned.
  • the invention is further based on the object to simplify the cleaning in a method or apparatus of the type mentioned.
  • the device For supplying and discharging the liquids used for preparing biological samples to or from a chamber, the device has a device which comprises at least one supply line, at least one discharge line, at least one liquid reservoir or container and preferably at least one valve, which is assigned in particular to a liquid reservoir and regulates the supply of the liquid from this liquid reservoir into the supply line connected to the liquid reservoir.
  • a valve which is assigned in particular to a liquid reservoir and regulates the supply of the liquid from this liquid reservoir into the supply line connected to the liquid reservoir.
  • Another valve or valves may divide the waste stream between different waste lines and waste containers to allow separate collection of the different liquids used after use.
  • a sequence of different liquids containing a preparation means the subsequent introduction of different liquids into the chamber or the sequential hicontacting of the (biological) samples to be prepared with different liquids.
  • the method according to the invention and the device according to the invention are designed in such a way that not only preparations containing liquids, but also rinsing liquids, in particular water, can be used.
  • the liquid is introduced from above into the chamber when the liquid to be introduced has a lower specific gravity than the liquid present in the chamber, and from introduced below into the chamber when the liquid to be introduced has a higher specific gravity than the liquid in the chamber.
  • the direction of the liquid flow is not changed by a valve circuit when the chamber is to be filled from above or from below.
  • the liquids of the chamber are always supplied via one and the same Kammeröffhung and always discharged via one and the same Kammeröffhung of the chamber.
  • the optional filling of the chamber from above or below is achieved in that the chamber can be brought into two different positions. Depending on the position, the inlet opening is then located above or below the outlet opening.
  • the supply line which is connected to a first opening in the chamber
  • the discharge which is connected to a second opening in the chamber
  • the supply line moved with the chamber. That is, when the first opening is arranged above the second opening, the supply line (at least in the contact area with the first opening) is also arranged above the discharge line. A separation between the supply line and the associated first opening or between the discharge and the associated second opening does not take place during the preparation of the sample.
  • the inlet opening and the outlet opening can each be brought to the right place. This eliminates the need for a complicated valve system which otherwise would regulate the inlet and outlet of the chamber and would have to periodically reverse the direction of flow in the chamber. The ability to bring the chamber in different positions, so that a change of direction of the liquid flow is not required, a significant reduction of the line paths used in the system can be achieved.
  • additional valves are required which, by design, always have some dead space.
  • alternative conduits are required either at the chamber or in the valve area for the supply and discharge of the marking solutions at the respective chamber opening. However, if the direction of the fluid flow is not reversed, only one inlet and outlet port conduit is needed.
  • the lines through which the heavy metal solutions are routed to the chamber must generally be additionally rinsed, since lead citrate must not hit uranyl acetate (precipitation).
  • lead citrate must not hit uranyl acetate (precipitation).
  • heavier solutions are supplied and removed respectively through the conduits connected to the bottom of the chamber, specifically lighter solutions through the conduits connected to the top of the chamber.
  • the residues of marking solutions remaining in the lines must be additionally rinsed out.
  • the line system does not require alternative routes for reverse inversion.
  • the cleaning solutions like the marking solutions, can be pumped through the system in one direction, reaching all the conduit leading to the chamber. In a system with reversal of direction, however, the cleaning solutions must be rinsed one after the other through the alternative routes. Not having to reverse the direction also minimizes the number of valves required in the device and the dead spaces necessarily associated therewith.
  • Embodiments of the invention are the subject of the dependent claims.
  • the pump and / or valves a hollow body made of a resistant to the aggressive media used, flexible material, preferably a hose, wherein the flowing through the pump and / or valves during the liquids Streaming through the pump and / or valves come into contact exclusively with this hollow body.
  • the pumps and / or valves preferably consist of hose peristaltic pumps or hose clamp valves.
  • the hoses used are then selected according to the chemical properties of the solutions used.
  • the hoses can be replaced much easier and less expensive if damaged than other mechanical components of pumps and valves.
  • those provided with a resistant to aggressive media hollow body pumps and / or valves not only in the device according to the invention, but in any device according to the prior art are used in which aggressive media flow through the pump and / or valves, especially at Devices for the preparation of biological samples by a series of different, preparation-containing liquids according to the preamble of claim 8.
  • the chemical nature of the solutions used and the high purity standard place the following demands on a contrasting apparatus that can be achieved by the method according to the invention and the apparatus according to the invention:
  • the device should be designed to prevent air contact (especially of lead citrate with CO 2 ).
  • HNO 3 nitric acid
  • the first opening of the device according to the invention is preferably connected to a supply system which has at least one liquid reservoir and at least one valve in order to allow a supply of the liquid required for preparing or rinsing the sample to the chamber.
  • a supply system which has at least one liquid reservoir and at least one valve in order to allow a supply of the liquid required for preparing or rinsing the sample to the chamber.
  • more than one liquid reservoir is provided in order to be able to introduce a series of different liquids into the chamber in a simple manner.
  • the chamber has a third opening which is adjacent, that is, in particular in close proximity to the first opening arranged such that the geometric orientation of the third opening with respect to the second opening in the chamber substantially equal is the geometric orientation of the first opening with respect to the second opening in the chamber.
  • the third opening of the chamber is connected to a supply system which is constructed substantially equivalent to the supply system to which the first opening is connected in a preferred embodiment of the invention.
  • the number of fluid reservoirs used can vary between the supply system connected to the first and the third port.
  • the third opening is designed such that it can receive a manually operable filling device.
  • an adapter can also be attached to the third opening or integrated into the third opening, which serves to mediate the reception of the filling device in the third opening.
  • a manually operable filling device in the sense of the present invention is, for example, an ordinary disposable syringe or a hemiliter syringe or a comparable device for metering fluids.
  • the device is designed such that in the supply system, a mixing device is integrated, in which the various liquids to be used are introduced in a specific, predetermined mixing ratio. After mixing the introduced liquids, these can then be supplied to the chamber and the sample arranged therein.
  • a mixing device is integrated, in which the various liquids to be used are introduced in a specific, predetermined mixing ratio. After mixing the introduced liquids, these can then be supplied to the chamber and the sample arranged therein.
  • This variant of the invention can only be usefully used if the liquids to be mixed do not undergo any incompatibility reactions (such as the precipitation of a precipitate or the like) with one another.
  • Figure 1 is a schematic representation of a first embodiment of the
  • FIG. 2 shows a schematic representation of the first exemplary embodiment of the invention in a second operating state
  • FIG. 3 is a schematic representation of a second embodiment of the invention.
  • FIG. 4 shows a schematic representation of a third exemplary embodiment of the invention, Preferred embodiment of the invention
  • 10 designates a chamber.
  • the chamber 10 has an inlet opening 12 and an outlet opening 14.
  • the chamber 10 is rotatably mounted on a support (not shown in the figure) about an axis 16, so that the chamber 10 can be brought into different position.
  • the rotation of the chamber 10 via an (not shown in the figure) electric motor.
  • the chamber 10 can be locked in two angularly offset by 180 ° positions.
  • the inlet opening 12 is below the outlet opening 14.
  • the outlet opening 14 is located vertically above the inlet opening 12. This corresponds to the second position of the chamber 10 according to the invention, which corresponds to a first operating state of the device ,
  • the surface of the chamber 10 pointing upwards in FIG. 1 is actually upwardly oriented in the apparatus according to the invention, while the surface of the chamber 10 facing downwards in FIG. 1 (in FIG the inlet opening 12 is arranged) in the device according to the invention is oriented downward.
  • the chamber consists of two parts, namely a base plate and a cover plate.
  • the base plate is square, with about 5 cm side length and 5 mm height. It serves as a support for the grid plate.
  • the cover plate has the same side lengths and has a height of 10 mm.
  • the cover plate has a 4 mm deep circular recess with a diameter of 38 mm. This recess forms the cavity in which the grids are lapped by the solutions.
  • two approximately 1 mm holes (openings 12 and 14) which lie with the chamber mounted at the lowest and highest point of the recess.
  • the two chamber parts are held together with the grid plate arranged therebetween by a receiving device, not shown, which is connected directly to the electric motor.
  • the inlet opening 12 and the outlet opening 14 need not necessarily as shown in Figure 1 from below or from above on the circumference of the cylindrical cavity of the chamber 10 to run, but may also perpendicular to the circumference of the cavity, that is perpendicular to the in the figure 1 forward-facing top surface of the cylindrical cavity, run and a corresponding Connection of the cavity of the chamber 10 with the supply or dissipation system of the tubes 18, 36 produce.
  • the inlet opening 12 and the outlet opening 14 would be in the assembled state of the chamber 10 at the substantially highest or substantially lowest point of the recess or the cavity of the chamber 10, which is also the highest or lowest point of the chamber 10 in FIG Meaning of the invention are to be understood.
  • the chamber 10 or its cavity does not necessarily have a cylindrical shape, but may have any desired shape. Also with regard to the volume of the chamber 10 or its cavity large variations are conceivable. For a treatment of grids, a volume of about 3.5 ml has proven favorable. For other applications significantly larger or significantly smaller volumes may be beneficial.
  • the inlet opening 12 of the chamber 10 is connected via the hose or hoses 18 and electromagnetic hose clamp valves with liquid containers.
  • hose clamping valves 20, 22, 24 and 26 and four such liquid containers 28, 30, 32 and 34 are provided.
  • the supply of the necessary liquids from the liquid containers 28, 30, 32 and 34 to the chamber 10 is regulated via the electromagnetic hose clamping valves 20, 22, 24 and 26.
  • the liquid container 28 contains water, the liquid container 30 nitric acid, the liquid container 32 uranyl acetate and the liquid container 34 lead citrate.
  • the chamber 10 is used to hold a grid plate equipped with grids (Hiraoka company, distribution by Electron Microscopy Sciences under article number 71560-10). This is made of a flexible plastic and has slots for receiving the grids. The slots can be opened by bending the plate and loaded with grids. When relaxing the plate, the grids are locked.
  • the outlet opening 14 of the chamber 10 is connected via a hose 36 with a Schlauchperistaltikpumpe 38.
  • the Schlauchperistaltikpumpe 38 Via a hose 40, the Schlauchperistaltikpumpe 38 is still connected to two 3-way Schlauchklemmventilen 42 and 44.
  • Behind the 3-way hose clamp valves 42 and 44 lead hoses 46, 48 and 50 (not shown in the figure) waste containers. (In the case of the device of the company Leica Microsystems GmbH described above, the waste is also sorted, but not with 3-way hose clamp valves).
  • tubing peristaltic pump used here is model SR 25 from Rietschle Thomas Puchheim GmbH, Siemensstr. 4, 82178 Puchheim, and the hose clamp valves used here are model S 104.09 and S305.07 the company Sirai Germany GmbH, Oberer Straße 15, 85643 Stein craftinging.
  • the device performs the contrasting process with the following steps:
  • valve 20 is opened and H 2 O from the container 28 is sucked by the pump 38 into the chamber 10 until it is completely filled.
  • the H 2 O remains for about 5 min. in the chamber.
  • Rinsing The chamber 10 is rotated through 180 °, the valve 20 is opened and the uranyl acetate present in the chamber 10 is replaced by water (compare FIG. In this case, the valves 42 and 44 are connected, so that the liquid is discharged via the hose 50. This process is repeated several times. The chamber 10 is rotated back at the end again by 180 °.
  • valve 26 is opened and lead citrate from the container 34 is sucked into the chamber 10. After complete replacement of the water by lead citrate, the pump 38 is turned off and the valve 26 is closed. The lead citrate remains for about 20 minutes. in the chamber 10.
  • Rinsing The chamber 10 is rotated by 180 °, the valve 20 is opened and the lead citrate present in the chamber 10 is replaced by water (compare FIG. In this case, the valve 42 is connected, so that the liquid is discharged via the hose 48. This process is repeated several times.
  • the chamber 10 is rotated back at the end again by 180 °.
  • Emptying the chamber 10 The chamber 10 is rotated by 180 ° (see Figure 2).
  • the hose 18 is decoupled from the inlet opening 12.
  • the pump 38 is turned on and pumps the water in the chamber 10 through the hose 46.
  • the tube 18 is again connected to the inlet opening 12.
  • the emptying of the chamber 10 takes place by means of an additional valve, which allows the supply of air through the inlet opening 12 into the chamber 10.
  • decoupling and subsequent reconnection of the tube 18 with the inlet opening 12 can be dispensed with, which facilitates the handling of the device according to the invention.
  • valve 22 is opened and HNO 3 is pumped out of the container 30 through the chamber 10, the pump 38 and the outlet hoses 36, 40. After approx. 2 min. the valve 22 is closed again and the valve 20 is opened, so that water is pumped through the system in the same way and the ENT 3 rinsed out.
  • the method is preferably controlled by a computer program.
  • the program sequence is controlled by a computer, not shown in FIG. 1, which controls the pump 38, the valves 20, 22, 24, 26, 42 and 44 and the motor for rotating the chamber 10 via a relay module.
  • the inventive method and apparatus of the invention allows the use of individually prepared solutions (as they are traditionally used in manual contrasting), which can thus be adapted locally to the corresponding application areas.
  • the axis 16 is arranged symmetrically spaced in the embodiment shown in the figure 1 in the middle of the chamber 10 to the inlet opening 12 and the outlet opening s 14.
  • the axis is closer to the Inlet opening 12 as arranged at the outlet 14.
  • the hose 36 on the discharge side has to be made slightly longer, since it must follow a greater movement with a corresponding rotation of the chamber 10 than with a central arrangement of the axle 16.
  • the advantages of a volume saving in the hose 16 on the supply side clearly outweigh any disadvantages of an increased volume at the hose 36 on the discharge side.
  • Figure 2 shows a schematic representation of the first embodiment of the invention, in which the chamber 10 in the first position, and not as in Figure 1 in the second position, is arranged.
  • the inlet opening 12 is arranged above the outlet opening 14, so that liquids which have a lower density than the liquid located in the chamber 10 can be filled into the chamber 10 or into its cavity 100.
  • FIG. 2 merely reflects a second operating state of the first exemplary embodiment, which differs from the first operating state shown in FIG. 1 by a different position of the chamber 10. Otherwise, the devices of FIGS. 1 and 2 do not differ from one another, so that reference is made to the above explanations regarding FIG.
  • FIG 3 shows a schematic representation of a second embodiment of the invention, wherein unchanged elements of the device are provided with the same reference numerals as in Figures 1 and 2; for a corresponding explanation, reference is made to the above statements to the figures 1 and 2.
  • the chamber 10 has a second inlet opening 15 as a third opening, which is arranged adjacent to the inlet opening 12 substantially perpendicular to the outlet opening 14.
  • the second inlet port 15 is an adapter 19 in flow communication
  • the Recording a syringe 17 is used.
  • small quantities of liquid can be introduced into the chamber 10 or its cavity 100 in addition to the liquid supplied via the tube 18.
  • This liquid can be the same liquid as in the chamber 10 or a different liquid than the liquid already present in the chamber 10.
  • the arrangement of an adapter can also be dispensed with.
  • FIG 4 shows a schematic representation of a third embodiment of the invention, wherein unchanged elements of the device are provided with the same reference numerals as in Figures 1 and 2; for a corresponding explanation, reference is made to the above statements to the figures 1 and 2.
  • a mixer 21 is provided as a mixing device between the containers 28, 30, 32, 34 and the chamber 10. Liquids from the containers 28, 30, 32, 34 are thus first passed into the mixer 21, mixed there and then fed to the chamber 10 and its cavity.
  • the apparatus or the method according to the invention is suitable not only for the treatment of grids used in electron microscopy, but for the treatment of numerous different samples.
  • the particular liquids to be used then differ accordingly.
  • the number of provided liquid reservoirs or containers can be adjusted accordingly. While four containers 28, 30, 32, 34 are used for different liquids in the exemplary embodiments explained in more detail here, more or fewer containers or liquid reservoirs can accordingly be provided.
  • the number of valves to be provided is then adjusted accordingly.
  • a device for preparing biological samples by a series of different fluids containing dissecting agents comprising: (a) a chamber (10) having first and second openings (12, 14 ), and (b) means (38) for supplying and discharging liquid to and from the chamber (10), wherein (c) the apparatus comprises at least one pump and / or at least one valve which is a hollow body has a resistant to the media used, flexible material, wherein the flowing through the pump and / or the valve fluids come into contact exclusively with this hollow body.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Präparieren von biologischen Proben durch eine Folge von unterschiedlichen, Präparierungsmittel enthaltenden Flüssigkeiten in einer Kammer (10) mit einer ersten und einer zweiten Öffnung (12, 14) zur Zufuhr und Abfuhr von Flüssigkeit zu bzw. von der Kammer (10). Wenn die in die Kammer (10) einzubringende Flüssigkeit eine geringere Dichte aufweist als die in der Kammer (10) befindliche Flüssigkeit, wird die Kammer (10) in eine erste Stellung gebracht, in welcher sich die erste Öffnung (12) oberhalb der zweiten Öffnung (14) befindet. Wenn die in die Kammer (10) einzubringende Flüssigkeit eine höhere Dichte aufweist als die in der Kammer (10) befindliche Flüssigkeit, wird die Kammer (10) in eine zweite Stellung gebracht, in welcher sich die erste Öffnung (12) unterhalb der zweiten Öffnung (14) befindet.

Description

Verfahren und Vorrichtung zum Präparieren von biologischen Proben
Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Präparieren von biologischen Proben durch eine Folge von unterschiedlichen, Präparierungsmittel enthaltenden Flüssigkeiten nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 bzw. 8. Durch solche Verfahren kann beispielsweise eine Markierung der Proben durch Einfärben erfolgen.
Zugrunde liegender Stand der Technik
Für mehrere Untersuchungsmethoden von biologischen Proben, z.B. die transmissions- elektronenmikroskopische Untersuchung von biologischen Gewebeschnitten, ist es' notwendig, diese zu präparieren, indem die Proben durch Einfärbung markiert werden. Die Einfärbung erfolgt durch Behandlung mit Präparierungsmitteln wie Schwermetalllösungen. In der Elektronenmikroskopie werden hierzu in der Regel Uranylacetat- und Bleicitratlösungen benutzt. Die gelösten Schwermetalle lagern sich an bestimmten Zellstrukturen an und verstärken so den Kontrast im elektronenmikroskopischen Bild. Zur Behandlung der Gewebeschnitte werden bisher unterschiedliche Verfahren eingesetzt, die von der manuellen Kontrastierung bis zu automatisierten Verfahren reichen.
Manuelle Kontrastierungverfahren werden mit Hilfe von Tropfen der Markierungslösung in Petrischalen durchgeführt. Dabei ist ein beträchtlicher Aufwand an manueller Tätigkeit notwendig, insbesondere wenn große Serien von Gewebeproben markiert werden sollen. Außerdem besteht die Gefahr der Beeinträchtigung durch Verunreinigungen, welche bei der manuellen Arbeit auf die Proben und in die Markierungslösungen eingetragen werden können.
Diese manuellen Kontrastierungsverfahren haben mehrere Nachteile. Uranylacetat und Bleicitrat sind hochgiftig. Aus Bleicitratlösungen fällt bei Kontakt mit CO2 Bleicarbonat aus. Außerdem können die Gewebeschnitte während der Behandlung durch Verunreinigungen unbrauchbar werden. Daher sind mit einer manuellen Kontrastierung sehr große Probleme verbunden. Außerdem können nur wenige Gitter (= "Grids", d.h. kleine Objektträger für elektronenmikroskopische Präparate) gleichzeitig behandelt werden. Es gibt zwar manuelle Verfahren, bei denen eine größere Menge von Gittern in einfachen Haltevorrichtungen behandelt werden können, diese lösen aber nicht die Probleme des Ausfalls und der Verunreinigung.
Bei einem Verfahren und einer Vorrichtung der eingangs genannten Art ist es aus US 4,358,470 bekannt, eine feststehende Kammer mit einem ersten, oberen und einem zweiten, unteren Anschluss zu versehen, welche über ein Ventilsystem mit Flüssigkeitsbehältern verbunden sind. Das Ventilsystem steuert die Zu- und Abfuhr der Flüssigkeiten zu bzw. von der Kammer derart, dass die Flüssigkeit über den ersten, oberen Anschluss in die Kammer eingebracht wird, wenn die einzubringende Flüssigkeit ein niedrigeres spezifisches Gewicht aufweist als die in der Kammer befindliche Flüssigkeit, und die Flüssigkeit über den zweiten, unteren Anschluss in die Kammer eingebracht wird, wenn die einzubringende Flüssigkeit ein höheres spezifisches Gewicht aufweist als die in der Kammer befindliche Flüssigkeit. Dadurch soll eine Vermischung der Flüssigkeiten vermieden werden.
Die Firma Leica Microsysteme GmbH vertreibt unter der Bezeichnung "EMSTAIN" ein Gerät zur automatischen Kontrastierung von bis zu 25 Gittern in einem Arbeitsgang. Bei diesem Gerät werden die Gitter in einer feststehenden Kammer, die an der Ober- und Unterseite jeweils einen Leitungsanschluss aufweist, positioniert. Über ein System aus Leitungen und Ventilen werden die für einen Kontrastiervorgang nötigen Lösungen nacheinander in die Kammer gepumpt. Um schwere und leichte Lösungen nicht unnötig zu durchmischen, muss der Flüssigkeitsstrom während des Kontrastierprozesses mehrmals über eine Ventilschaltung umgepolt werden.
Bei der US 4,358,470 und bei dem Gerät der Firma Leica Microsysteme GmbH wird eine komplexe Ventilschaltung benötigt, um die Richtung des Flüssigkeitsstromes zu ändern. Dies führt zu einem hohen Verbrauch an Lösungen. Weiterhin sind aufwändige Reinigungsroutinen notwendig. Offenbarung der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den Wechsel der in die Kammer einzubringenden Flüssigkeiten bei einem Verfahren oder einer Vorrichtung der eingangs genannten Art zu vereinfachen.
Der Erfindung liegt insbesondere die Aufgabe zugrunde, die Leitungswege, die die in die Kammer einzubringenden Flüssigkeiten durchströmen müssen, und deren Toträume bei einem Verfahren oder Vorrichtung der eingangs genannten Art zu reduzieren.
Der Erfindung liegt weiterhin die Aufgabe zugrunde, die Reinigung bei einem Verfahren oder Vorrichtung der eingangs genannten Art zu vereinfachen.
Diese Aufgaben werden verfahrensgemäß durch die im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmale und vorrichtungsgemäß durch die im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 8 angegebenen Merkmale gelöst.
Zum Zuführen und Abführen der Flüssigkeiten, die zum Präparieren biologischer Proben eingesetzt werden, zu bzw. von einer Kammer weist die Vorrichtung eine Einrichtung auf, die aus mindestens einer Zuleitung, mindestens einer Ableitung, mindestens einem Flüssigkeitsreservoir bzw. Behälter und vorzugsweise mindestens einem Ventil, das insbesondere einem Flüssigkeitsreservoir zugeordnet ist und die Zuführung der Flüssigkeit aus diesem Flüssigkeitsreservoir in die mit dem Flüssigkeitsreservoir verbundene Zuleitung reguliert, besteht. Ein weiteres Ventil oder mehrere weitere Ventile können den Abfallfluss auf verschiedene Abfallleitungen und Abfallbehälter aufteilen, um eine getrennte Sammlung der unterschiedlichen eingesetzten Flüssigkeiten nach deren Benutzung zu ermöglichen.
Unter einer Folge von unterschiedlichen, Präparierungsmittel enthaltenden Flüssigkeiten wird das nachfolgende Einbringen unterschiedlicher Flüssigkeiten in die Kammer bzw. das sequentielle hikontaktbringen der zu präparierenden (biologischen) Proben mit unterschiedlichen Flüssigkeiten verstanden. Dabei sind das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung derart ausgelegt, dass nicht nur Präparierungsmittel enthaltende Flüssigkeiten, sondern auch Spülflüssigkeiten, wie insbesondere Wasser, verwendet werden können. Wie bei der US 4,358,470 und bei dem erwähnten Gerät der Firma Leica Microsysteme GmbH wird zur Vermeidung einer Vermischung der Flüssigkeiten die Flüssigkeit von oben in die Kammer eingebracht, wenn die einzubringende Flüssigkeit ein niedrigeres spezifisches Gewicht aufweist als die in der Kammer befindliche Flüssigkeit, und von unten in die Kammer eingebracht, wenn die einzubringende Flüssigkeit ein höheres spezifisches Gewicht aufweist als die in der Kammer befindliche Flüssigkeit.
Im Gegensatz zu der US 4,358,470 und zu dem erwähnten Gerät der Firma Leica Microsysteme GmbH wird erfindungsgemäß jedoch nicht die Richtung des Flüssigkeitsstromes durch eine Ventilschaltung gewechselt, wenn die Kammer von oben oder von unten befüllt werden soll. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden die Flüssigkeiten der Kammer immer über ein und dieselbe Kammeröffhung zugeführt und immer über ein und dieselbe Kammeröffhung von der Kammer abgeführt.
Das wahlweise Befüllen der Kammer von oben oder von unten wird dadurch erreicht, dass die Kammer in zwei verschiedene Stellungen gebracht werden kann. Je nach Stellung befindet sich dann die Einlassöffhung oberhalb oder unterhalb der Auslassöffnung.
Dabei werden die Zuleitung, die mit einer ersten Öffnung in der Kammer verbunden ist, und die Ableitung, die mit einer zweiten Öffnung in der Kammer verbunden ist, mit der Kammer bewegt. Das heißt, wenn die erste Öffnung oberhalb der zweiten Öffnung angeordnet ist, ist auch die Zuleitung (zumindest im Kontaktbereich mit der ersten Öffnung) oberhalb der Ableitung angeordnet. Eine Trennung zwischen der Zuleitung und der damit verbundenen ersten Öffnung bzw. zwischen der Ableitung und der damit verbundenen zweiten Öffnung findet während der Präparation der Probe nicht statt.
Durch die Möglichkeit die Kammer zu drehen, können also die Einlassöffhung und die Auslassöffhung jeweils an die richtige Stelle gebracht werden. Damit wird ein kompliziertes Ventilsystem überflüssig, das sonst den Zu- und Ablauf der Kammer regulieren und regelmäßig eine Umkehr der Fließrichtung in der Kammer bewirken müsste. Durch die Möglichkeit die Kammer in verschiedene Stellungen zu bringen, so dass ein Richtungswechsel des Flüssigkeitsstromes nicht erforderlich ist, ist eine erhebliche Verkürzung der im System eingesetzten Leitungswege erreichbar. Für ein System mit Richtungsumkehr werden zusätzliche Ventile benötigt, die konstruktionsbedingt immer einen gewissen Totraum haben. Für die Richtungsumkehr werden entweder an der Kammer oder im Ventilbereich alternative Leitungen für die Zufuhr und den Abfluss der Markierungslösungen an der jeweiligen Kammeröffnung benötigt. Wenn die Richtung des Flüssigkeitsstromes jedoch nicht umgedreht wird, ist nur je eine Leitung für Einlassund Auslassöffnung nötig.
Die Leitungen, über die die Schwermetalllösungen zur Kammer geführt werden, müssen grundsätzlich zusätzlich gespült werden, da Bleicitrat nicht auf Uranylacetat treffen darf (Niederschlag). Bei einem System mit Richtungsumkehr werden spezifisch schwerere Lösungen jeweils durch die unten mit der Kammer verbundenen Leitungen zu- und abgeführt, spezifisch leichtere Lösungen durch die oben mit der Kammer verbundenen Leitungen. Damit unverträgliche schwere Lösungen nicht direkt nacheinander durch die unteren Leitungen gepumpt werden, müssen die in den Leitungen verbliebenen Reste von Markierungslösungen zusätzlich ausgespült werden.
Bei dem System nach der vorliegenden Erfindung werden alle Flüssigkeiten über die gleiche Leitung in der Reihenfolge, in der sie in die Kammer gelangen sollen, herangeführt. Reste der Markierungslösungen werden somit automatisch mit der nächsten für die Markierung vorgesehenen (und damit verträglichen) Lösung aus der Leitung ausgespült.
Durch die kurzen Leitungswege des Systems nach der vorliegenden Erfindung ist der zeitliche Aufwand für die routinemäßige Reinigung erheblich geringer als bei entsprechenden Geräten nach dem Stand der Technik. Das Leitungssystem benötigt keine alternativen Leitungswege für die Richrungsumkehr. Die Reinigungslösungen können, wie die Markierungslösungen in einer Richtung durch das System gepumpt werden und erreichen dabei das gesamte zur Kammer zu- und abführende Leitungssystem. Bei einem System mit Richtungsumkehr müssen die Reinigungslösungen hingegen nacheinander durch die alternativen Leitungswege gespült werden. Der Verzicht auf eine Richtungsumkehr minimiert außerdem die in der Vorrichtung notwendige Anzahl der Ventile und die damit notwendigerweise verbundenen Toträume.
Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
Weiterhin stehen bei dem erwähnten Gerät der Firma Leica Microsysteme GmbH empfindliche Bauteile der Ventile und der Pumpe in direktem Kontakt mit den Flüssigkeiten. Diese Bauteile sind aus Materialien gefertigt, welche gegen aggressive Medien, wie sie hier vorkommen, nicht hinreichend beständig sind. Dadurch können zum einen Ablagerungen, zum anderen der niedrige pH-Wert der eingesetzten Lösungen zu Beschädigungen und Funktionsstörungen fuhren. Daher kann mit diesem Gerät über längere Zeiträume keine gleich bleibende Qualität der Kontrastierungen erzielt werden.
Zur Vermeidung von solchen Beschädigungen und Funktionsstörungen enthalten bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung die Pumpen und/oder Ventile einen Hohlkörper aus einem gegen die verwendeten, aggressiven Medien beständigen, flexiblen Material, vorzugsweise einen Schlauch, wobei die durch die Pumpen und/oder Ventile strömenden Flüssigkeiten während des Strömens durch die Pumpen und/oder Ventile ausschließlich mit diesem Hohlkörper in Kontakt kommen. Dadurch kommen die Flüssigkeiten nicht mit empfindlichen Bauteilen der Pumpen oder Ventile in Berührung. Dementsprechend bestehen die Pumpen und/oder Ventile vorzugsweise aus Schlauchperistaltikpumpen bzw. Schlauchklemmventilen.
Vorzugsweise werden die eingesetzten Schläuche dann entsprechend der chemischen Eigenschaften der eingesetzten Lösungen ausgesucht. Weiterhin können die Schläuche bei einer Beschädigung sehr viel einfacher und kostengünstiger ersetzt werden, als sonstige mechanische Bauteile von Pumpen und Ventilen. Selbstverständlich können solche mit einem gegen aggressive Medien beständigen Hohlkörper versehene Pumpen und/oder Ventile nicht nur bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung, sondern bei jedem Gerät nach dem Stand der Technik eingesetzt werden, bei welchem aggressive Medien durch die Pumpen und/oder Ventile strömen, insbesondere bei Vorrichtungen zum Präparieren von biologischen Proben durch eine Folge von unterschiedlichen, Präparierungsmittel enthaltenden Flüssigkeiten nach dem Oberbegriff des Anspruchs 8. Die chemische Beschaffenheit der eingesetzten Lösungen sowie der hohe Reinheitsstandard beispielsweise für elektronenmikroskopische Präparate stellen folgende Anforderungen an ein Kontrastiergerät, die durch das erfmdungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung erfüllbar sind:
(1) Die Vorrichtung sollte so beschaffen sein, dass ein Luftkontakt (besonders des Bleicitrats mit CO2) verhindert wird.
(2) Das Leitungssystem sowie die Ventile und die Pumpe sollten gegenüber den aggressiven Substanzen der Flüssigkeiten und eventuellen Ablagerungen möglichst unempfindlich sein.
(3) Das System sollte mit Salpetersäure (HNO3), die Ablagerungen löst, gut zu spülen sein. Dies wird durch kurze Leitungswege und möglichst geringe Toträume begünstigt. Außerdem wird hierdurch der Verbrauch an (giftigen) Chemikalien reduziert.
(4) Alle Bestandteile des Leitungssystems sollten einfach und preisgünstig austauschbar sein.
Vorzugsweise ist die erste Öffnung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem Zuleitungssystem verbunden, das mindestens ein Flüssigkeitsreservoir und mindestens ein Ventil aufweist, um eine Zuführung der zum Präparieren oder Spülen der Probe benötigte Flüssigkeit zur Kammer zu ermöglichen. Insbesondere ist es vorteilhaft, wenn mehr als ein Flüssigkeitsreservoir vorgesehen ist, um in einfacher Weise eine Folge von unterschiedlichen Flüssigkeiten in die Kammer einführen zu können.
hi einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung weist die Kammer eine dritte Öffnung auf, die benachbart, das heißt insbesondere in unmittelbarer Nähe, zur ersten Öffnung derart angeordnet ist, dass die geometrische Ausrichtung der dritten Öffnung in Bezug auf die zweite Öffnung in der Kammer im Wesentlichen gleich der geometrischen Ausrichtung der ersten Öffnung in Bezug auf die zweite Öffnung in der Kammer ist.
Vorzugsweise ist die dritte Öffnung der Kammer mit einem Zuleitungssystem verbunden, das im Wesentlichen äquivalent zu dem Zuleitungssystem aufgebaut ist, mit dem die erste Öffnung in einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung verbunden ist. Die Anzahl der eingesetzten Flüssigkeitsreservoirs kann allerdings zwischen dem mit der ersten und dem mit der dritten Öffnung verbundenen Zuleitungssystem variieren.
In einer alternativen Ausgestaltung der Erfindung ist die dritte Öffnung derart ausgebildet, dass sie eine manuell bedienbare Einfüllvorrichtung aufnehmen kann. Hierzu kann auch ein Adapater an die dritte Öffnung angebracht oder in die dritte Öffnung integriert sein, der zur Vermittlung der Aufnahme der Einfüllvorrichtung in der dritten Öffnung dient. Eine manuell bedienbare Einfüllvorrichtung im Sinne der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise eine gewöhnliche Einwegspritze oder eine Hamütonspritze bzw. eine vergleichbare Vorrichtung zur Dosierung von Fluiden.
Vorzugsweise ist die Vorrichtung derart ausgestaltet, dass in dem Zuleitungssystem eine Mischvorrichtung integriert ist, in die die verschiedenen einzusetzenden Flüssigkeiten in einem bestimmten, vorgebbaren Mischungsverhältnis eingeleitet werden. Nach Mischung der eingeleiteten Flüssigkeiten können diese dann der Kammer und der darin angeordneten Probe zugeführt werden. Diese Variante der Erfindung ist nur dann sinnvoll einsetzbar, wenn die zu mischenden Flüssigkeiten keine Unverträglichkeitsreaktionen (wie beispielsweise das Ausfallen eines Niederschlags oder ähnliches) untereinander eingehen.
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist nachstehend unter Bezugnahme auf die Figuren, insbesondere auf Figur 1, näher erläutert. Es zeigen:
Figur 1 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels der
Erfindung in einem ersten Betriebszustand,
Figur 2 eine schematische Darstellung des ersten Ausführungsbeispiels der Erfindung in einem zweiten Betriebszustand,
Figur 3 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels der Erfindung,
Figur 4 eine schematische Darstellung eines dritten Ausführungsbeispiels der Erfindung, Bevorzugte Ausführung der Erfindung
In der Figur 1 ist mit 10 eine Kammer bezeichnet. Die Kammer 10 weist eine Einlassöffnung 12 und eine Auslassöffnung 14 auf. Die Kammer 10 ist an einem (in der Figur nicht dargestellten) Träger um eine Achse 16 drehbar gelagert, so dass die Kammer 10 in unterschiedliche Stellung gebracht werden kann. Die Drehung der Kammer 10 erfolgt über einen (in der Figur nicht dargestellten) Elektromotor. Die Kammer 10 ist in zwei um 180° winkelversetzten Stellungen arretierbar.
In der in der Figur 1 dargestellten Stellung der Kammer 10 befindet sich die Einlassöffnung 12 unterhalb der Auslassöffnung 14. Dabei befindet sich die Auslassöffnung 14 senkrecht über der Einlassöffnung 12. Dies entspricht der erfindungsgemäß zweiten Stellung der Kammer 10, die einem ersten Betriebszustand der Vorrichtung entspricht. Die in der Figur 1 auf dem Papier nach oben weisende Fläche der Kammer 10 (in der die Auslassöffhung 14 angeordnet ist) ist auch tatsächlich in der erfindungsgemäßen Vorrichtung nach oben ausgerichtet, während die in der Figur 1 nach unten weisende Fläche der Kammer 10 (in der die Einlassöffnung 12 angeordnet ist) in der erfindungsgemäßen Vorrichtung nach unten ausgerichtet ist.
In dem dargestellten Ausführungsbeispiel besteht die Kammer aus zwei Teilen, nämlich aus einer Grundplatte und einer Deckplatte. Die Grundplatte ist quadratisch, mit etwa 5 cm Seitenlänge und 5 mm Höhe. Sie dient als Auflage für die Gridplatte. Die Deckplatte hat dieselben Seitenlängen und weist eine Höhe von 10 mm auf. Die Deckplatte hat eine 4 mm tiefe kreisförmige Aussparung mit einem Durchmesser von 38 mm. Diese Aussparung bildet den Hohlraum, in dem die Grids von den Lösungen umspült werden. In die Aussparung führen zwei ca. 1 mm Bohrungen (Öffnungen 12 und 14), die bei montierter Kammer am jeweils tiefsten und höchsten Punkt der Aussparung liegen. Die beiden Kammerteile werden mit der dazwischen angeordneten Gridplatte durch eine nicht dargestellte Aufnahmevorrichtung, die direkt mit dem Elektromotor verbunden ist, zusammengehalten.
Die Einlassöffnung 12 und die Auslassöffnung 14 müssen nicht notwendigerweise wie in der Figur 1 dargestellt von unten bzw. von oben auf den Kreisumfang des zylinderförmigen Hohlraums der Kammer 10 zulaufen, sondern können auch senkrecht zum Kreisumfang des Hohlraums, das heißt senkrecht auf die in der Figur 1 nach vorn weisende Deckfläche des zylinderförmigen Hohlraums, zulaufen und eine entsprechende Verbindung des Hohlraums der Kammer 10 mit dem zuführenden oder ableitenden Leitungssystem der Schläuche 18, 36 herstellen. In diesem Fall wären die Einlassöffnung 12 und die Auslassöffnung 14 im montierten Zustand der Kammer 10 an dem im Wesentlichen höchsten bzw. im Wesentlichen niedrigsten Punkt der Aussparung bzw. des Hohlraums der Kammer 10 angeordnet, die auch als höchster oder niedrigster Punkt der Kammer 10 im Sinne der Erfindung zu verstehen sind.
Die Kammer 10 bzw. deren Hohlraum muss nicht notwendigerweise eine zylindrische Form, sondern kann jede beliebige Form aufweisen. Auch hinsichtlich des Volumens der Kammer 10 bzw. deren Hohlraum sind große Variationsmöglichkeiten denkbar. Für eine Behandlung von Grids hat sich ein Volumen von rund 3,5 ml als günstig erwiesen. Für andere Anwendungszwecke können deutlich größere oder deutlich kleinere Volumina von Vorteil sein.
Die Einlassöffnung 12 der Kammer 10 ist über den Schlauch bzw. die Schläuche 18 und elektromagnetische Schlauchklemmventile mit Flüssigkeitsbehältern verbindbar. Li dem dargestellten Ausführungsbeispiel sind vier solche Schlauchklemmventile 20, 22, 24 und 26 und vier solche Flüssigkeitsbehälter 28, 30, 32 und 34 vorgesehen. Über die elektromagnetischen Schlauchklemmventile 20, 22, 24 und 26 wird der Zulauf der notwendigen Flüssigkeiten aus den Flüssigkeitsbehältern 28, 30, 32 und 34 zu der Kammer 10 reguliert.
Bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel handelt es sich um einen Kontrastierer, durch welchen Gewebedünnschnitte mit Schwermetalllösungen behandelt werden sollen. Dementsprechend enthält der Flüssigkeitsbehälter 28 Wasser, der Flüssigkeitsbehälter 30 Salpetersäure, der Flüssigkeitsbehälter 32 Uranylacetat und der Flüssigkeitsbehälter 34 Bleicitrat. Die Kammer 10 dient zur Aufnahme einer mit Grids bestückten Gridplatte (Firma Hiraoka, Vertrieb durch Electron Microscopy Sciences unter der Artikelnummer 71560-10). Diese besteht aus einem biegsamen Kunststoff und besitzt Schlitze zur Aufnahme der Grids. Die Schlitze können durch Biegen der Platte geöffnet und mit Grids beladen werden. Beim Entspannen der Platte werden die Grids arretiert.
Die Auslassöffnung 14 der Kammer 10 ist über einen Schlauch 36 mit einer Schlauchperistaltikpumpe 38 verbunden. Über einen Schlauch 40 ist die Schlauchperistaltikpumpe 38 weiterhin mit zwei 3-Wege-Schlauchklemmventilen 42 und 44 verbunden. Hinter den 3-Wege-Schlauchklemmventilen 42 und 44 führen Schläuche 46, 48 und 50 zu (in der Figur nicht dargestellten) Abfallbehältern. (Bei dem oben beschriebenen Gerät der Firma Leica Microsysteme GmbH werden die Abfälle ebenfalls sortiert, jedoch nicht mit 3-Wege-Schlauchklemmventilen).
Bei der hier verwendeten Schlauchperistaltikpumpe handelt es sich um Modell SR 25 der Firma Rietschle Thomas Puchheim GmbH, Siemensstr. 4, 82178 Puchheim, und bei den hier verwendeten Schlauchklemmventilen handelt es sich um Modell S 104.09 und S305.07 der Firma Sirai Deutschland GmbH, Münchener Straße 15, 85643 Steinhöring.
Die Vorrichtung führt das Kontrastierungsverfahren mit den folgenden Schritten durch:
1. Wässern: das Ventil 20 wird geöffnet und H2O aus dem Behälter 28 wird durch die Pumpe 38 in die Kammer 10 gesogen, bis diese vollständig gefüllt ist. Das H2O bleibt ca. 5 min. in der Kammer.
2. Kontrastierung mit Uranylacetat: Das Ventil 24 wird geöffnet und Uranylacetat aus dem Behälter 32 wird in die Kammer 10 gesogen. Nach vollständigem Austausch des Wassers durch Uranylacetat wird die Pumpe ausgeschaltet und das Ventil 24 geschlossen. Das Uranylacetat verbleibt für ca. 30 min. in der Kammer.
3. Spülen: Die Kammer 10 wird um 180° gedreht, das Ventil 20 wird geöffnet und das in der Kammer 10 befindliche Uranylacetat durch Wasser ersetzt (vgl. Figur 2). Hierbei sind die Ventile 42 und 44 geschaltet, so dass die Flüssigkeit über den Schlauch 50 abgeleitet wird. Dieser Vorgang wird mehrmals wiederholt. Die Kammer 10 wird am Ende wieder um 180° zurückgedreht.
4. Kontrastierung mit Bleicitrat: Das Ventil 26 wird geöffnet und Bleicitrat aus dem Behälter 34 wird in die Kammer 10 gesogen. Nach vollständigem Austausch des Wassers durch Bleicitrat wird die Pumpe 38 ausgeschaltet und das Ventil 26 geschlossen. Das Bleicitrat verbleibt für ca. 20 min. in der Kammer 10.
5. Spülen: Die Kammer 10 wird um 180° gedreht, das Ventil 20 wird geöffnet und das in der Kammer 10 befindliche Bleicitrat durch Wasser ersetzt (vgl. Figur 2). Hierbei ist das Ventil 42 geschaltet, so dass die Flüssigkeit über den Schlauch 48 abgeleitet wird. Dieser Vorgang wird mehrmals wiederholt. Die Kammer 10 wird am Ende wieder um 180° zurückgedreht. 6. Entleeren der Kammer 10: Die Kammer 10 wird um 180° gedreht (vgl. Figur 2). Der Schlauch 18 wird von der Einlassöffhung 12 entkoppelt. Die Pumpe 38 wird eingeschaltet und pumpt das in der Kammer 10 stehende Wasser durch den Schlauch 46 ab. Der Schlauch 18 wird wieder mit der Einlassöffhung 12 verbunden.
Bei einer alternativen Ausgestaltung der Erfindung erfolgt die Entleerung der Kammer 10 mittels eines zusätzlichen Ventils, das die Zufuhr von Luft durch die Einlassöffnung 12 in die Kammer 10 ermöglicht. In diesem Fall kann auf ein Entkoppeln und anschließendes erneutes Verbinden des Schlauchs 18 mit der Einlassöffnung 12 verzichtet werden, was die Handhabung der erfindungsgemäßen Vorrichtung erleichtert.
7. Reinigung: Hierzu wird das Ventil 22 geöffnet und HNO3 aus dem Behälter 30 durch die Kammer 10, die Pumpe 38 und die Auslassschläuche 36, 40 gepumpt. Nach ca. 2 min. wird das Ventil 22 wieder geschlossen und das Ventil 20 geöffnet, so dass Wasser in gleicher Weise durch das System gepumpt wird und die HNO3 herausspült.
Das Verfahren wird bevorzugt durch ein Rechnerprogramm gesteuert. Der Programmablauf wird durch einen in der Figur 1 nicht dargestellten Rechner kontrolliert, der über ein Relaismodul die Pumpe 38, die Ventile 20, 22, 24, 26, 42 und 44 und den Motor zur Drehung der Kammer 10 steuert.
Es hat sich gezeigt, dass durch das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung eine Reduktion der eingesetzten Kontrastierlösungen um mehr als 40% und eine Reduktion des Abfallvolumens um mehr als 60% gegenüber dem Stand der Technik erreichbar ist. Weiterhin erlaubt die erfindungsgemäße Vorrichtung den Einsatz individuell hergestellter Lösungen (wie sie bei Handkontrastierungen traditionell benutzt werden), welche damit vor Ort auf die entsprechenden Einsatzgebiete abgestimmt werden können.
Die Achse 16 ist in dem in der Figur 1 dargestellten Ausführungsbeispiel in der Mitte der Kammer 10 symmetrisch beabstandet zur Einlassöffhung 12 und zur Auslas s Öffnung 14 angeordnet. In einer nicht dargestellten Variante der Erfindung ist die Achse näher an der Einlassöffhung 12 als an der Auslassöffhung 14 angeordnet. Dies hat bei einer Drehung der Kammer 10 den Vorteil, dass der sich mitdrehende Schlauch 18 des Zuleitungssystems nur eine kleinere Bewegung nachvollziehen muss. Dadurch kann der Schlauch 18 eine geringere Länge als im Fall einer mittigen Anordnung der Achse 16 aufweisen, was in einem geringeren zu durchströmenden Volumen auf der Zuleitungsseite resultiert.
Li dieser Variante muss allerdings der Schlauch 36 auf der Ableitungsseite etwas länger ausgestaltet sein, da er bei einer entsprechenden Drehung der Kammer 10 eine größere Bewegung als bei einer mittigen Anordnung der Achse 16 nachvollziehen muss. Allerdings überwiegen die Vorteile einer Volumenersparnis beim Schlauch 16 auf der Zuleitungsseite deutlich eventuelle Nachteile eines vergrößerten Volumens beim Schlauch 36 auf der Ableitungsseite.
Die Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung des ersten Ausführungsbeispiels der Erfindung, bei dem die Kammer 10 in der ersten Stellung, und nicht wie in der Figur 1 in der zweiten Stellung, angeordnet ist. In dieser ersten Stellung ist die Einlassöffnung 12 oberhalb der Auslassöffnung 14 angeordnet, so dass Flüssigkeiten, die eine geringere Dichte aufweisen als die in der Kammer 10 befindliche Flüssigkeit in die Kammer 10 bzw. in deren Hohlraum 100 eingefüllt werden können.
Die in der Figur 2 gezeigte Darstellung spiegelt lediglich einen zweiten Betriebszustand des ersten Ausführungsbeispiels dar, der sich von dem in der Figur 1 gezeigten ersten Betriebszustand durch eine unterschiedliche Stellung der Kammer 10 unterscheidet. Ansonsten unterscheiden sich die Vorrichtungen der Figuren 1 und 2 nicht voneinander, so dass auf die obigen Erläuterungen zur Figur 1 verweisen wird.
Die Figur 3 zeigt eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels der Erfindung, wobei unveränderte Elemente der Vorrichtung mit den gleichen Bezugszeichen wie in den Figuren 1 und 2 versehen sind; bezüglich einer entsprechenden Erläuterung wird auf die obigen Ausführungen zu den Figuren 1 und 2 verweisen.
Im Unterschied zum ersten Ausführungsbeispiel weist die Kammer 10 eine zweite Einlassöffnung 15 als dritte Öffnung auf, die benachbart zur Einlassöffnung 12 im Wesentlichen senkrecht gegenüber liegend zur Auslassöffnung 14 angeordnet ist. Mit der zweiten Einlassöffnung 15 steht ein Adapater 19 in Strömungsverbindung, der zur Aufnahme einer Spritze 17 dient. Mittels der Spritze 17 können geringe Flüssigkeitsmengen zusätzlich zu der über den Schlauch 18 zugeführten Flüssigkeit in die Kammer 10 bzw. deren Hohlraum 100 eingebracht werden. Bei dieser Flüssigkeit kann es sich um die gleiche Flüssigkeit wie in der Kammer 10 oder um eine andere Flüssigkeit als die in der Kammer 10 bereits vorhandene Flüssigkeit handeln.
Bei einer entsprechenden Ausgestaltung der zweiten Einlassöffhung 15 kann auf die Anordnung eines Adapters auch verzichtet werden.
Die Figur 4 zeigt eine schematische Darstellung eines dritten Ausführungsbeispiels der Erfindung, wobei unveränderte Elemente der Vorrichtung mit den gleichen Bezugszeichen wie in den Figuren 1 und 2 versehen sind; bezüglich einer entsprechenden Erläuterung wird auf die obigen Ausführungen zu den Figuren 1 und 2 verweisen.
Bei diesem Ausführungsbeispiel ist im Schlauch 18, das heißt im zuführenden Schlauchsystem, zusätzlich ein Mischer 21 als Mischungsvorrichtung zwischen den Behältern 28, 30, 32, 34 und der Kammer 10 bereitgestellt. Flüssigkeiten aus den Behältern 28, 30, 32, 34 werden somit zuerst in den Mischer 21 geleitet, dort vermischt und anschließend der Kammer 10 bzw. deren Hohlraum zugeführt.
Die unterschiedlichen Elemente der verschiedenen Ausführungsbeispiele können in beliebiger Zusammenstellung miteinander kombiniert werden. Es ist für den Fachmann auch unmittelbar offenbar, dass sich die erfϊndungsgemäße Vorrichtung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur zur Behandlung von in der Elektronenmikroskopie eingesetzten Grids, sondern zur Behandlung zahlreicher unterschiedlicher Proben geeignet ist. Die jeweils einzusetzenden Flüssigkeiten unterscheiden sich dann entsprechend. Die Anzahl der bereitgestellten Flüssigkeitsreservoirs bzw. Behälter kann dementsprechend angepasst werden. Während bei den hier näher erläuterten Ausführungsbeispielen jeweils vier Behälter 28, 30, 32, 34 für unterschiedliche Flüssigkeiten verwendet werden, können dementsprechend mehr oder weniger Behälter bzw. Flüssigkeitsreservoirs vorgesehen sein. Die Anzahl der vorzusehenden Ventile ist dann entsprechend anzupassen. Ein weiteres, nicht einer Figur explizit dargestelltes Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung ist eine Vorrichtung zum Präparieren von biologischen Proben durch eine Folge von unterschiedlichen, Präparierungsmittel enthaltenden Flüssigkeiten, enthaltend: (a) eine Kammer (10) mit einer ersten und einer zweiten Öffnung (12, 14), und (b) eine Einrichtung (38) zum Zuführen und Abführen von Flüssigkeit zu bzw. von der Kammer (10), wobei (c) die Vorrichtung zumindest eine Pumpe und/oder zumindest ein Ventil aufweist, welche(s) einen Hohlkörper aus einem gegen die verwendeten Medien beständigen, flexiblen Material aufweist, wobei die durch die Pumpe und/oder das Ventil strömenden Flüssigkeiten ausschließlich mit diesem Hohlkörper in Kontakt kommen.
* * * * *

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Präparieren von biologischen Proben durch eine Folge von unterschiedlichen, Präparierungsmittel enthaltenden Flüssigkeiten in einer Kammer (10) mit einer ersten und einer zweiten Öffnung (12, 14) zur Zufuhr und Abfuhr von Flüssigkeit zu bzw. von der Kammer (10), dadurch gekennzeichnet, dass
(a) die Kammer (10) in eine erste Stellung gebracht wird, in welcher sich die erste Öffnung (12) oberhalb der zweiten Öffnung (14) befindet, wenn die in die Kammer (10) einzubringende Flüssigkeit eine geringere Dichte aufweist als die in der Kammer (10) befindliche Flüssigkeit,
(b) die Kammer (10) in eine zweite Stellung gebracht wird, in welcher sich die erste Öffnung (12) unterhalb der zweiten Öffnung (14) befindet, wenn die in die
.. Kammer (10) einzubringende Flüssigkeit eine höhere Dichte. aufweist als die in der Kammer .(10) befindliche Flüssigkeit. • .. .•. .
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die erste Öffnung (12) in der ersten Stellung am höchsten Punkt der Kammer (10) und/oder sich. - die zweite Öffnung (14) in der ersten Stellung am tiefsten Punkt der Kammer (10) befindet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sich die erste Öffnung (12) in der zweiten Stellung am tiefsten Punkt der Kammer (10) befindet und/oder sich die zweite Öffnung (14) in der zweiten Stellung am höchsten Punkt der Kammer (10) befindet.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sich die erste Öffnung (12) senkrecht über der zweiten Öffnung (14) in der ersten Stellung der Kammer (10) befindet und/oder sich die zweite Öffnung (14) senkrecht über der ersten Öffnung (12) in der zweiten Stellung der Kammer (10) befindet.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Strömung der Flüssigkeiten durch die Kammer (10) stets von der ersten Öffnung (12) zu der zweiten Öffnung (14) erfolgt.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bewegung der Kammer (10) von der ersten Stellung zu der zweiten Stellung und von der zweiten Stellung zu der ersten Stellung durch eine Rotation der Kammer (10) um jeweils 180° erfolgt.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Bewegen der Kammer (10) durch einen Elektromotor erfolgt.
8. Vorrichtung zum Präparieren von biologischen Proben durch eine Folge von unterschiedlichen, Präparierungsmittel enthaltenden Flüssigkeiten, enthaltend:
(a) eine Kammer (10) mit einer ersten und einer zweiten Öffnung (12, 14), und
(b) eine Einrichtung (38) zum Zuführen und Abführen von Flüssigkeit zu bzw. von der Kammer (10),
dadurch gekennzeichnet, dass
(c) die Kammer (10) drehbar gelagert ist und
(d) die Vorrichtung eine Drehvorrichtung zum Drehen der Kammer (10) wahlweise in eine erste und in eine zweite Stellung aufweist, wobei
(e) in der ersten Stellung der Kammer (10) die erste Öffnung (12) sich oberhalb der zweiten Öffnung (14) befindet, und
(f) in der zweiten Stellung der Kammer (10) die erste Öffnung (12) sich unterhalb der zweiten Öffnung (14) befindet.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass
(a) die erste Öffnung (12) ausschließlich als Einlassöffoung ausgebildet ist, und (b) die zweite Öffnung (14) ausschließlich als Auslassöffhung ausgebildet ist, wobei
(c) die Strömung der Flüssigkeiten durch die Kammer (10) stets von der ersten Öffnung (12) zu der zweiten Öffnung (14) erfolgt.
10. Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die
Drehvorrichtung einen Elektromotor aufweist.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die
Vorrichtung zumindest eine Pumpe und/oder zumindest ein Ventil aufweist, welche(s) einen Hohlkörper aus einem gegen die verwendeten Medien beständigen, flexiblen Material aufweist, wobei die durch die Pumpe und/oder das Ventil strömenden 'Flüssigkeiten ausschließlich mit diesem Hohlkörper in Kontakt kommen.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Öffnung (12) mit einem Zuleitungssystem verbunden ist, das mindestens ein Flüssigkeitsreservoir und mindestens ein Ventil aufweist. ' .:
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die
Vorrichtung eine dritte Öffnung (15) aufweist, die benachbart zur ersten Öffnung (12) angeordnet ist.
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die dritte Öffnung (15) mit einem Zuleitungssystem verbunden ist, das mindestens ein Flüssigkeitsreservoir und mindestens ein Ventil aufweist.
15. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die dritte Öffnung (15) zur Aufnahme einer manuell bedienbaren Einfullvorrichtung (17) ausgebildet ist.
16. Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Zuleitungssystem eine Mischvorrichtung (21) aufweist, die dazu vorgesehen und eingerichtet ist, unterschiedliche der Kammer (10) zuzuführende Flüssigkeiten in einem vorgebbaren Mischungsverhältnis aufzunehmen und zu mischen.
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