EP1952153A2 - Procédé d'identification du génotype en position 171 de la protéine prion d'ovin ainsi que trousses de mise en oeuvre de ce procédé - Google Patents

Procédé d'identification du génotype en position 171 de la protéine prion d'ovin ainsi que trousses de mise en oeuvre de ce procédé

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Publication number
EP1952153A2
EP1952153A2 EP06842041A EP06842041A EP1952153A2 EP 1952153 A2 EP1952153 A2 EP 1952153A2 EP 06842041 A EP06842041 A EP 06842041A EP 06842041 A EP06842041 A EP 06842041A EP 1952153 A2 EP1952153 A2 EP 1952153A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
saf
antibody
prp
bar
denaturing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP06842041A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jacques Grassi
Nathalie Morel
Jean-Marc Gilles Bilheude
Juan-Maria Torres Trillo
Alejandro Brun Torres
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACION Y TECNOLOGIA A
Bio Rad Innovations SAS
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Instituto Nacional de Investigacion y Tecnologia Agraria y Alimentaria INIA
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Bio Rad Pasteur SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Instituto Nacional de Investigacion y Tecnologia Agraria y Alimentaria INIA, Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Bio Rad Pasteur SA filed Critical Instituto Nacional de Investigacion y Tecnologia Agraria y Alimentaria INIA
Publication of EP1952153A2 publication Critical patent/EP1952153A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease

Definitions

  • the invention relates to a method for identifying or analyzing the genotype at position 171 of the prion protein, called PrP, of ovine as well as kits for carrying out this method.
  • TSEs transmissible spongiform encephalopathies
  • Scrapie is a disease that affects sheep, known for over two centuries in Europe. It is manifested in particular by disorders of the social behavior of the animal which has a tendency to put aside, disorders of its feeding behavior and locomotive disorders such as the appearance of tremors and stiffness of the back train . It is also usually manifested by pruritus and loss of wool.
  • the infectivity associated with these abnormal prion proteins has proved extremely resistant to inactivation processes known and implemented to inactivate "conventional" pathogenic microorganisms (bacteria, viruses, yeasts).
  • the ovine PrP gene is carried on chromosome 13 and encodes a polypeptide of 256 amino acids.
  • sheep can be classified in 3 groups according to their genotype and resistance to ESSTs: - resistant animals that are not (or extremely rarely) infected, even when placed in an environment with a high incidence of the disease or have very high resistance in experimental infections. These are animals of genotypes ARRZARR. Note, however, that the recent discovery of atypical cases of scrapie also affecting the genotype ARR / ARR partially questioned the almost absolute resistance that was commonly associated with this genotype.
  • TSEs transmissible spongiform encephalopathies
  • the French program includes the elimination of animals carrying the Vi 36 R 1 S 4 Qm allele associated with maximum sensitivity. Its high frequency in the population is a major risk factor for the spread of the disease. As a result, a sheep carrying this allele is considered an "unapproved" animal. As such, it can not be marketed for breeding purposes. "Scrapie susceptible genotype” is indicated on the certificate issued by UPRA (Union for the Promotion of
  • the genotype is the genotype that one wishes to select in the animal intended for reproduction.
  • the genotype Vi 36 Ri54Qi7i / is the genotype that is to be avoided in the animal intended for reproduction.
  • the present invention also aims to solve the new technical problem of providing a genotype identification kit at position 171 of ovine PrP.
  • the object of the invention is in particular to solve the new technical problem consisting in providing a method for identifying the genotype at position 171 and / or an identification kit for this genotype to enable sheep farmers to select, select, or identify resistant or sensitive animals, and in particular to discriminate between resistant animals and susceptible animals.
  • the invention aims in particular to solve these technical problems in the context of a breeding program to eradicate or at least reduce the presence of the prion in sheep.
  • the invention aims in particular to solve this technical problem in order to fight against scrapie sheep.
  • the present invention aims in particular to solve these technical problems by a method other than the type of PCR or Western Blot, which are expensive and require specialized laboratory equipment.
  • the invention also aims to solve these technical problems by a rapid test, not requiring in particular specialized equipment other than that of a conventional analysis laboratory.
  • the present invention aims in particular to solve these technical problems reproducibly, industrial, reliable, quickly, and at lower costs.
  • This method can be implemented on a biological fluid of the sheep such as plasma, blood, serum, milk, saliva, and urine.
  • the invention provides a method for identifying or analyzing the 171 positional genotype of ovine PrP comprising the steps of: a) treating a sample of ovine biological fluid to be tested containing PrP with a denaturing and reducing solution, b) immobilization, possibly via a ligand, of the denatured PrP and reduced on a solid phase, c) contacting the denatured PrP, reduced and immobilized with at least one antibody detecting, and d) detecting the possible presence of said at least one detection antibody, and wherein one of the ligand and at least one detection antibody specifically binds to PrP having a particular allelic form at position 171.
  • the denaturing and reducing solution comprises: a) at least one denaturing agent chosen from: a surfactant chosen from the group consisting of:
  • Anionic surfactants such as SDS (sodium dodecyl sulphate), sarcosyl (lauroyl sarcosine), sodium cholate, sodium glycocholate, sodium deoxycholate, sodium taurocholate, sodium caprylate, Sodium 1-decanesulfonate, sodium lauryl sulphate and lithium lauryl sulphate;
  • Zwitterionic surfactants such as SB 3-10 (decyl sulfobetaine), SB 3-12 (dodecyl sulphobetaine), SB 3-14 (tetradecyl sulphobetaine), SB 3-16
  • Nonionic surfactants such as Triton X-100, Triton X-114, Tween 20, Tween 80, Brij 35 (polyoxyethylene lauryl ether), nonidet P-40, n-decyl- beta-D-glucopyranoside, n-dodecyl-beta-D-glucopyranoside, n-octyl-beta-D-glucopyranoside, n-octyl-alpha-D-glucopyranoside;
  • a chaotropic agent a chaotropic agent, and b) at least one reducing agent.
  • the chaotropic agent is chosen from urea, guanidine, guanidine hydrochloride, guanidine thiocyanate or a mixture thereof. More preferably, the denaturing and reducing solution comprises a mixture of ionic surfactants, in particular anionic surfactants, and more particularly SDS and sarcosyl.
  • the denaturing and reducing solution contains at least 0.5% by weight of surfactant relative to the total volume of the mixture consisting of the sample to be treated and the denaturing and reducing solution, and in particular greater than or equal to at 2% by weight relative to the total volume of the mixture.
  • the at least one reducing agent is selected from the group consisting of DTT (dithiothreitol), TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride), DTE (dithio erythritol), beta-mercaptoethanol, 2-mercaptoethylamine or a mixture thereof.
  • the concentration of reducing agent is between 2.5 mM and 100 mM, in particular between 5 mM and 50 mM and more particularly between 5 mM and 30 mM in the mixture consisting of the sample to treat and the denaturing and reducing solution.
  • the denaturing and reducing solution comprises a mixture of sarcosyl, SDS and DTT.
  • the concentration of this chaotropic agent is preferably greater than or equal to 1 M, and more particularly greater than or equal to
  • the chaotropic agent is urea, it is preferably 8 M.
  • the denatured and reduced PrP is immobilized via a ligand which is a capture antibody. capable of retaining PrP by affine binding and the detection antibody is an antibody specifically binding to PrP having a particular allelic form at position 171, which position is different from the epitope site recognized by the capture antibody.
  • the denatured and reduced PrP is immobilized via a ligand which is a capture antibody specifically binding to PrP having a particular allelic form at position 171.
  • the detection antibody is an antibody capable of binding to PrP by affinity binding to an epitopic site different from that recognized by the capture antibody.
  • the denatured and reduced PrP is immobilized via a ligand chosen from the following molecules: plasminogen, avidin, streptavidin, glycose aminoglycans, Phespiridine, porphyrins, streptamicin and tetracycline, and the detection antibody is an antibody specifically binding to PrP having a particular allelic form at position 171.
  • the denatured and reduced PrP is immobilized directly on the solid phase, and the detection antibody is an antibody specifically binding to PrP having a particular allelic form in position.
  • the solid phase is selected from microtiter plates, beads, tubes, polymer, especially polystyrene, polyethylene or latex.
  • the solid phase is a polystyrene microtiter plate.
  • the biological fluid sample is selected from blood, plasma, serum, or milk.
  • the capture antibody is an antibody which binds to PrP without competition with PrP binding of the detection antibody which is specific to the allelic form in position 171.
  • This antibody can be in particular chosen from SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5, SAF-84, SHA-31, BAR-222, BAR-224, BAR-233, and 8G8.
  • an antibody targeting the octa repeat region of PrP is preferred, namely SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, and 3B5.
  • the detection antibody is preferably selected from labeled 2Al 1 antibody, labeled 11C6 antibody, labeled BAR226 antibody, and labeled 12F10 antibody.
  • the capture antibody is the SAF-34 antibody or the 3B5 antibody and the detection antibody is the labeled 2Al 1 antibody.
  • the ligand is a capture antibody selected from the antibodies 2Al 1, 11C6, BAR-226, and 12F10.
  • the detection antibody is selected from SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5, SAF-84, SHA-31, BAR- 222, BAR-224, BAR-233, and 8G8.
  • the capture antibody may be chosen from the antibodies
  • the detection antibody is selected from the SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37 antibodies, 3B5, BAR-224, SHA-31, and 8G8, labeled.
  • the invention also proposes a method for screening an ovine population according to its resistance to transmissible spongiform subacute encephalopathies, characterized in that it comprises the implementation of the previously described method.
  • the invention also proposes a method for screening an ovine population according to its susceptibility to subacute spongiform transmissible encephalopathies, characterized in that it comprises the implementation of the previously described method.
  • the screening method comprises a step of comparing the signal measured on the sample (s) to be analyzed with respect to one or more sample (s) resistant (s) and / or sensitive (s).
  • the invention further provides a genotype identification kit at position 171 of ovine PrP comprising:
  • a solid phase on which at least one capture antibody is immobilized in particular chosen from SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5 antibodies; , SAF-84, SHA-31, BAR-222, BAR-224, BAR-233, and 8G8;
  • At least one detection antibody in particular chosen from the labeled 12F10, BAR226, 11C6, and 2Al 1 antibodies, and more particularly the labeled 2Al 1.
  • the invention also proposes a kit for identifying genotype at position 171 of ovine PrP, characterized in that it comprises: a solid phase on which at least one capture antibody is immobilized, in particular chosen from antibodies 12F10, BAR226, 11C6, and 2A11,
  • a denaturing and reducing solution and at least one detection antibody, in particular chosen from SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5 antibodies; , SAF-84, SHA-31, BAR-222, BAR-224, BAR-233, and 8G8, marked.
  • FIG. 1 illustrates the relative absorbances, normalized relative to the Q / Q genotype, obtained on ARR / ARR sheep plasmas, that is to say having the R / R genotype at position 171 of the PrP, or ARR / VRQ, that is to say having the R / Q genotype at position 171 of PrP, or VRQ / VRQ, i.e. having the Q / Q genotype at position 171 of PrP.
  • SAF-34 anti octa repeat
  • SAF-34 antibody is used as a capture antibody (SAF-34) or as a detection antibody (SAF-34-AChE, SAF-34 labeled with acetylcholinesterase of gymnote);
  • FIG. 2 illustrates the distribution of the optical densities (OD) obtained on sheep plasmas having in the 171 position of PrP, the amino acids R / R, or R / H, or R / Q, or H / Q, or Q / Q. These tests were performed using the SAF-34 antibody as capture antibody and the detection antibody 2Al 1 labeled biotin as detection antibody.
  • FIG. 3 illustrates the distribution of the optical densities (OD) obtained on sheep plasmas having in position 171 the amino acids Q / Q, or the amino acids R / Q, or the amino acids R / R.
  • FIG. 4 illustrates the influence of the presence or absence of a reducing agent which is dithiothreitol as well as the absence of a denaturing agent which is urea in the composition of the denaturing solution.
  • FIG. 5 illustrates the distribution of the optical densities (OD) obtained on sera of sheep having in position 171 of PrP, the amino acids R / R, or R / H, or R / Q, or H / Q, or H / H, or Q / Q.
  • OD optical densities
  • FIG. 7 illustrates the influence of the concentration of DTT in the denaturing solution on samples of sera. These tests were performed using the 3B5 antibody as the capture antibody and the labeled 2Al 1 antibody as biotin detection antibody.
  • FIG. 8 illustrates the distribution of optical densities obtained as a function of different serum samples taken from sheep, which have been found to correspond to different genotypes of PrP. Tests were performed using the 3B5 antibody as the capture antibody and the biotin labeled 2Al 1 antibody as the detection antibody.
  • the subject of the invention is a method for identifying the genotype at position 171 of ovine PrP, in which an ovine biological fluid to be tested, containing PrP, is treated with a denaturing and reducing solution, the PrP is immobilized. denatured and reduced and the denatured and reduced PrP is contacted with at least one antibody specifically binding to ovine PrP having a particular allelic form at position 171 and detecting the possible presence of the antibody at PrP.
  • a "biological fluid” may be especially blood, plasma, serum, urine, cerebrospinal fluid, saliva, milk, etc.
  • this biological fluid is selected from blood, serum, plasma and milk.
  • This biological fluid contains PrP.
  • antibody refers to any whole antibody or functional fragment of an antibody comprising or consisting of at least one antigenic combination site, allowing said antibody to bind to at least one antigenic determinant of an antigenic compound .
  • antibody fragments mention may be made of the Fab, Fab ', F (ab02) fragments as well as the scFv (single chain variable fragment), dsFv (double-stranded variable fragment) chains, etc. These functional fragments can be obtained by genetic engineering.
  • the term "specifically”, when referring to specific recognition of, or specific binding to, a particular allelic form at position 171 of ovine PrP by an antibody, means that the antibody interacts with the allelic form. particularly preferable with respect to other possible allelic forms, making it possible to differentiate and discriminate between the different allelic forms possible between them. Association constants greater than 10 8 L mol -1 are preferable.
  • the antibodies used in the present invention are antibodies specifically directed against the prion protein, and for this reason are preferentially monoclonal antibodies or monospecific polyclonal antibodies, ie they do not recognize any other protein.
  • the monoclonal antibodies can be obtained according to the conventional method of lymphocyte fusion and hybridoma culture described by Kohler and Milstein, (1975). Other methods of preparing monoclonal antibodies are also known (Harlow et al (1988)). Monoclonal antibodies can be prepared by immunizing a mammal (eg, a mouse, a rat, a rabbit, or even a human, etc.) and using the lymphocyte fusion technique leading to hybridomas (Kohler and Milstein, 1975). .
  • a mammal eg, a mouse, a rat, a rabbit, or even a human, etc.
  • monoclonal antibodies can be produced by expression of a cloned nucleic acid from a hybridoma.
  • Antibodies can also be produced by the phage display technique by introducing antibody cDNAs into vectors, which are typically filamentous phages (e.g., fUSE5 for E. coli, Scott et al. . (1990)). The latter are banks and have scFv fragments on their surface. Protocols for constructing these antibody libraries are described in Marks et al. (1991).
  • polyclonal antibodies can be obtained from the serum of an animal immunized against an antigen of peptide nature according to the usual procedures.
  • rabbits are immunized with the equivalent of 1 mg of the peptide immunogen according to the procedure described by Benoit et al. (1982).
  • the animals are treated with injections of 200 ⁇ g of antigen and bled 10 to 14 days later.
  • the ability of the antiserum to bind to the radiolabeled antigen peptide prepared by the chloramine-T method is evaluated. It is then purified by chromatography ion exchange column consisting of carboxymethyl cellulose (CMC).
  • CMC carboxymethyl cellulose
  • the antibody molecules collected by elution are then adjusted to the desired concentration by methods well known to those skilled in the art, for example, using DEAE Sephadex to obtain the IgG fraction.
  • the antibodies can be purified by immunoaffinity (or immunoadsorption) chromatography using peptides as immunization and immobilized in solid phase.
  • the antiserum is contacted with such solid phase immobilized peptide for a time sufficient to immuno-react the peptide with the antibody molecule to form a solid phase immunological complex.
  • This antibody binds to the sequence 171-179 (QVYYRPVDQ) bovine PrP and has strong cross-reactions with the PrP most mammalian species that share the sam e epitope (sheep, goat, cat, rabbit, mouse, pig and hamster) but not with the human PrP that has the sequence (QVYYRPMDE). It has also been shown that its affinity is greatly increased when PrP is reduced and denatured, most likely due to the proximity of the epitope to the first serine residue involved in a disulfide bridge of PrP. In addition, immunohistochemistry analysis shows that immunoreactivity is greatly increased after treatment with proteinase K.
  • 2Al 1 antibody binds specifically to allelic forms of sheep PrP carrying a glutamine residue. (Q) or histidine (H) at position 171 whereas no immunoreactivity is observed with ARR.
  • the antibody of 2Al 1 does not bind to the residue R. Therefore, an absence of binding between the antibody 2Al 1, used both as detection antibody and as capture antibody, and PrP protein, absence of binding which results in a null or near zero optical density, in the identification method of the invention, proves that the genotype at position 171 of the PrP contained in the biological fluid studied is the R / R genotype, which is to say the genotype Ai 36 Ri 54 Ri 7I /
  • the antibody 2Al 1 binds in a quantitatively different and preferential manner to the residue Q at the position 171 of the PrP, with respect to the residue H, if a binding between the antibody 2Al 1 and the protein PrP is detected, it will be possible to discriminate, according to the intensity of the signal obtained (which is expressed by the OD), between a biological fluid originating from a Q / Q homozygous sheep and a biological fluid originating from a heterozygous sheep Q / H, or homozygous H / H.
  • this test makes it possible to identify the heterozygous animals (R / (Q, H)) with respect to the other genotypes (Q / Q,
  • the method of the invention comprises contacting the biological fluid sample with an appropriate amount of a denaturing and reducing solution.
  • said solution comprises: a) at least one denaturing agent chosen from:
  • a surfactant chosen from the group consisting of:
  • Anionic surfactants such as SDS (sodium dodecyl sulphate), sarcosyl (lauroyl sarcosine), sodium cholate, sodium glycocholate, sodium deoxycholate, sodium taurocholate, sodium caprylate, Sodium 1-decanesulfonate, sodium lauryl sulphate and lithium lauryl sulphate;
  • Zwitterionic surfactants such as SB 3-10 (decyl-sulphobetaine), SB 3-12 (dodecyl sulphobetaine), SB 3-14 (tetradecyl sulphobetaine), SB 3-16 (hexadecyl sulphobetaine), SB 3-18 (octadecyl sulfobetaine), CHAPS and CHAPSO and CHAPS deoxy;
  • Nonionic surfactants such as Triton X-100, Triton X-114, Tween 20, Tween 80, Brij 35 (polyoxyethylene 23 lauryl ether), nonidet P-40, n-decyl beta-D-glucopyranoside, n-dodecyl-beta-D-glucopyranoside, n-octyl-beta-D-glucopyranoside, n-octyl-alpha-D-glucopyranoside;
  • reducing agent an agent capable of cleaving the disulfide bridge of the PrP protein.
  • the reducing agent is generally present in the mixture constituted by the sample to be treated and the denaturing and reducing solution at a content ranging from 2.5 mM to 100 mM, in particular from 5 mM to 50 mM and more particularly to a content ranging from 5 mM to 30 mM.
  • the chaotropic agent is chosen from urea, guanidine, guanidine hydrochloride, guanidine thiocyanate or a mixture thereof. When chaotropic agents are present, their concentration is generally greater than or equal to 1 M, preferably greater than or equal to 3 M.
  • the preferred chaotropic agent is urea, preferably at a concentration of 8 M.
  • the mixture consisting of the sample to be treated and the denaturing and reducing solution is generally heated to a temperature ranging from 37 ° C. to 100 ° C., in particular from 50 ° C. to 70 ° C. and more particularly to approximately 60 ° C. for 5 minutes to one hour, especially between 7 and 20 minutes and more particularly about 10 minutes.
  • said solution comprises a mixture of surfactants, in particular a mixture of ionic surfactants, in particular a mixture of anionic surfactants and more particularly a mixture of SDS and sarcosyl.
  • the concentration of surfactants in the mixture consisting of the sample to be treated and the denaturing and reducing solution is generally greater than or equal to 0.5% by weight relative to the total volume of the mixture, in particular greater than or equal to 2% by weight relative to the total volume of the mixture.
  • the denaturing and reducing solution comprises at least one denaturing agent which may be a surfactant and / or a chaotropic agent and at least one reducing agent.
  • the treatment of PrP with this solution, which is both denaturing and reducing, is essential to implement the process of the invention, as will be demonstrated in Example 4.
  • the solution containing the amino acid-specific antibody at position 171 is left in contact with the solid phase on which the PrP is immobilized for at least 10 minutes, in particular about one minute. hour, at a temperature ranging from 4 to 50 ° C., and in particular 37 ° C.
  • the method for detecting the marking on the solid phase depends on the marker used.
  • a biotin labeling may be mentioned.
  • a biotin labeling discloses the presence of biotin immobilized on the support by adding a solution of streptavidin-peroxidase conjugate which is allowed to react for about 10 to 30 minutes at a temperature of about 37 0 C.
  • a carrier-bound peroxidase activity is revealed by the addition of a chromogenic substrate, for example tetramethylbenzidine, which is allowed to react for about 30 minutes at 20 ° C.
  • the absorbance at 20 ° C. is measured. 450 and at 620 nm.
  • the immobilization of the denatured and purified prion protein it may be a direct immobilization on the solid phase or an indirect immobilization.
  • the solid phase can be a microtiter plate, beads, tubes, polymer, especially polystyrene, polyethylene or latex.
  • the solid phase is a polystyrene microtiter plate.
  • the prion protein which like all proteins binds to the plate, must be purified (denatured) to remove as much unwanted protein from the sample as possible. before immobilizing the PrP protein itself.
  • the prion protein must be reduced.
  • the immobilization can be carried out via an antibody or other specific ligand that is not an antibody.
  • the indirect immobilization can be carried out via an antibody, called capture antibody, which is capable of retaining PrP by affine binding, or with the aid of an antibody specifically binding to a specific form. particular of Pallthrough in position 171, or through a ligand that is not an antibody.
  • This ligand may be a molecule such as plasminogen, avidin, streptavidin, glycose aminoglycans, hesperidin, porphyrins, streptamicin and tetracycline.
  • the PrP protein thus immobilized is reacted with an antibody specifically binding to a particular form of PrP. allele 171, which is marked directly or indirectly.
  • the immobilized PrP protein is then reacted with an antibody capable of retaining it by affine binding. In this case, it is this antibody that is labeled directly or indirectly.
  • the method of the invention is advantageously implemented in the form of a sandwich-type immunoassay, most particularly of the ELISA type. In such a case, it is appropriate to use both a so-called capture antibody and a so-called detection antibody which can bind simultaneously to the purified and reduced PrP protein.
  • capture antibody an antibody, or a portion of antibody, preferably attached to a solid phase which is capable of retaining an antigen present in a biological sample either by single affine binding or by affine binding recognizing a particular epitopic site.
  • the detection antibody When the antigen is immobilized by a capture antibody, the detection antibody must be able to bind to an accessible epitope site other than that recognized by the capture antibody.
  • labeled refers both to direct labeling (via enzymes, radioisotropes, fluorochromes, luminescent compounds, etc.) and to indirect labeling, for example by means of antibodies which are themselves labeled. directly or using a pair of reagents labeled affinity, such as, but not exclusively, the labeled avidin-biotin pair, etc.
  • the subject of the present invention is in particular a method for identifying the genotype at position 171 of the PrP, comprising the steps of:
  • detection antibody a solution of labeled antibody
  • antibodies specifically recognizing PrP regardless of the allelic variant at position 171 of PrP, mention will in particular be made of antibodies capable of specifically recognizing the repeated octapeptide motif such as those described in patent application WO 01/35104.
  • antibodies capable of specifically recognizing the repeated octapeptide motif such as those described in patent application WO 01/35104.
  • the SAF-34 antibody or the 3B5 antibody was most preferred.
  • antibodies specifically recognizing a particular allelic variant of PrP at position 171 there will be mentioned the antibody 2A11.
  • the peptide was covalently coupled with the gymnote acetylcholinesterase (AChE) via a heterobifunctional reagent, succinimidyl 4- (Amaleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC, Calbiochem, France), as previously described for other peptides or proteins (McLaughiin et al., 1987, Grassi et al., 1989).
  • This method involves the reaction of a thiol group introduced into the peptide with the maleimide function which has been attached to the AChE by reaction with the SMCC.
  • the thiol group was introduced into the peptide by reaction with N-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA) as previously described (McLaughiin et al., 1987). Coupling was achieved by reacting AChE-SMCC with an excess of thiolated peptide.
  • SATA N-succinimidyl S-acetylthioacetate
  • SAFs "Scrapie-associated fibrils"
  • PrPres preparation A preparation of "Scrapie-associated fibrils" (SAFs, PrPres preparation) was obtained from infected hamster brains (263 K scrapie strain) as previously described (Lasmezas et al., 1997). This preparation was inactivated by treatment with formic acid before immunization of the mice. Mice disabled (knock-or ⁇ for PrP gene (PrP 0/0 mice) were immunized with these SAF preparations and hybridoma cells were prepared as previously described (Grassi et al., 1988, 1989).
  • Monoclonal antibodies labeled with I 1 AChE are prepared by coupling of Fab 'fragments reduced with the tetrameric form of the enzyme via a heterobifunctional reagent, succinimidyl 4- (/ V-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC, Calbiochem, France), as previously described (Grassi et al., 1989).
  • SMCC succinimidyl 4- (/ V-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate
  • Monoclonal antibodies 3B5, 11C6 and 12F10 were obtained after immunization of knockout mice for PrP with recombinant human PrP and screened according to various techniques as described in Krasemann and al.
  • 3B5 is an antibody directed against recombinant human PrP and recognizes peptide 79-92.
  • 11C6 is an antibody that recognizes an unidentified conformational epitope.
  • 12F10 is an antibody directed against recombinant human PrP and recognizes peptide 142-160. Obtaining the monoclonal antibody Bar226
  • the Bar-226 antibody was obtained by immunizing knockout mice for the PrP gene with recombinant PrP (ARQ allotype) as described in C. Feraudet, N. Morel, S. Simon, H. Volland, Y. Frobert, C. Creminon, D. Vilette, S. Lehmann, J. Grassi (2005) Screening of 145 anti PrP Monoclonal antibodies for their ability to inhibit PrPSc Replication in Infected CeIIs J. Biol. Chem., 280, 11247-11258.
  • the monoclonal antibody 2Al 1 is prepared according to the protocol described in Brun et al; J. Neuroscience Research 48, 2004, 75-83. Conjugate: Monoclonal antibody 2Al 1 - biotin
  • a conjugate of the biotin-labeled monoclonal antibody 2Al 1 is prepared according to the protocol described by Greg T. Hermanson in 1996.
  • a streptavidin conjugate labeled with peroxidase is prepared according to the protocol described by Greg T. Hermanson in 1996.
  • the biological fluids used were sera or plasmas of sheep of Cheviot, Romanov, Casserarde and Manech breeds.
  • Ambient temperature is defined as a temperature between 18 ° C and 30 ° C, inclusive.
  • Plasma samples were taken from sheep with the R / R, or R / Q or Q / Q genotype at position 171.
  • 100 .mu.l of the mixture obtained are deposited in a well of a microtiter plate containing a capture antibody which is either the 12F10 antibody, the BAR233 antibody, the BAR226 antibody or the SAF-34 antibody, or antibody 11C6.
  • washings of the wells are then carried out with a washing solution containing 10 ⁇ 2 M phosphate buffer, pH 7.4 and 0.05% Tween 20.
  • a washing solution containing 10 ⁇ 2 M phosphate buffer, pH 7.4 and 0.05% Tween 20.
  • After washing is deposited 100 .mu.l per well of detection antibody which is either the antibodies SAF-34 labeled I 1 AChE when the capture antibody is the antibody 12F10 or BAR233 or BAR226 OR 11C6, either the antibody BAR 224 labeled with I 1 AChE, either the 2Al 1 antibody labeled with biotin, or the BAR 208 antibody labeled with biotin, at 3 ⁇ g per liter of antibody relative to the final mixture thus obtained.
  • the presence of the labeled antibody on the solid phase is revealed by the addition of a streptavidin-peroxidase conjugate at 0.2 ⁇ g / ml of final mixture. minutes at 37 ° C. Then washing 5 times with a washing solution containing 10 ⁇ 2 M phosphate buffer, pH 7.4 and Tween 20 0.05% by weight relative to the total weight of the wash solution. 100 ⁇ l of the peroxidase substrate plus 2 ml of tetramethylbenzidine (TMB) solution as chromogen are deposited in each well. Incubate for 30 minutes at room temperature in the dark. 100 ⁇ l of sulfuric acid solution IN, as a stop solution, are deposited in each well. Absorbance is measured at 450 nm and 620 nm.
  • TMB tetramethylbenzidine
  • the SAF-34 antibody which is an antibody that does not bind to a specific allelic form at position 171
  • SAF-34 antibody can be used both as a capture antibody and as an antibody. detection.
  • detection antibody When used as a detection antibody, it is labeled with AChE.
  • the 2Al 1 antibody does not bind at all to the R-allelic form at position 171 of PrP.
  • Plasma samples were taken from sheep with the R / R or R / H or R / Q or H / Q or Q / Q genotype at position 171 of the PrP.
  • 75 ⁇ l of each sheep plasma sample were mixed with 75 ⁇ l of denaturing and reducing solution composed of 2% by weight, relative to the total volume of the denaturing and reducing solution, sarcosyl, of 2% by weight, relative to to the total volume of denaturing and reducing solution, dodecyl sulfate and dithiothreitol at 10 mM.
  • the mixture is then heated for 10 minutes at 60 ° C.
  • 100 ⁇ l of the mixture obtained are deposited in a well of a microtiter plate containing a capture antibody which is the SAF-34 antibody.
  • the wells are then washed three times with a washing solution containing 0.01 M tris, 0.3M NaCl, pH 7.4, and 0.1% by weight of Tween 20, relative to the total weight of the wash solution.
  • the wash solution is buffered at neutral or slightly alkaline pH and contains a low concentration neutral / nonionic detergent (Tween 20 0.01%).
  • detection antibody which is the 2Al 1 conjugated biotin antibody, which is present at a concentration of 3 .mu.g per liter of antibody relative to the total weight of the final mixture thus obtained.
  • the wells are incubated for one hour at 37 ° C.
  • TMB tetramethylbenzidine solution
  • Absorbance (optical density) is measured at 450 and 620 nm.
  • Figure 2 shows the distribution of the optical densities obtained on the plasmas of each category of sheep genotypes.
  • the biotin-labeled pair of SAF-34 / 2A11 antibodies makes it possible to obtain an excellent discrimination between the different genotypes of sheep.
  • the denaturing agent is a chaotropic agent, more specifically 8 M urea.
  • Plasma samples were taken from sheep having the R / R or R / Q or Q / Q genotype in position 171 of the PrP.
  • EIA buffer Enzyme Immuno Assay
  • a 1 M potassium phosphate buffer, pH 7.4, 0.15 M NaCl, and 0.1% by weight based on the total volume of the EIA buffer
  • Serum albumin (BSA) 100 ⁇ l of the mixture obtained are deposited in a well of a microtiter plate containing a capture antibody which is the SAF-34 antibody.
  • the mixture is allowed to incubate for one hour at 20 ° C.
  • the wells are then washed three times with a washing solution containing 0.01 M tris, 0.3 M NaCl, pH 7.4, and 0.1% by weight. , based on the total volume of the Tween 20 wash solution.
  • detection antibody which is the 2Al 1 antibody labeled with biotin
  • the 2Al-biotin antibody conjugate being at a concentration of 0.5 .mu.g / ml relative to the final mixture thus obtained.
  • the mixture is incubated for 30 minutes at +20 ° C. Five washings are carried out with the previously described washing solution.
  • TMB tetramethylbenzidine
  • the absorbance is measured at 450 and 620 nm. The results obtained are shown in FIG.
  • This example was intended to evaluate the importance of the presence of a reducing agent and a denaturing agent in the denaturing and reducing solution used.
  • sheep plasmas having the genotype Q / Q or R / Q or R / R at position 171 of the PrP were tested according to the protocol of Example 3, that is to say with a solution containing as a denaturing agent for 8 M urea and as a reducing agent for 10 mM DTT.
  • results obtained are illustrated in FIG. 4, where the white columns represent the optical densities obtained on the plasmas treated with a solution containing a denaturing agent and a reducing agent, the dotted columns represent the densities obtained on the samples of biological fluid treated with a solution containing only a denaturing agent and not containing a reducing agent and cross-hatched columns represent the optical densities obtained on the samples treated with a solution containing a reducing agent and not containing denaturing agent.
  • the combined presence of a reducing agent and a denaturing agent is absolutely necessary to discriminate the different genotypes.
  • sheep with the R / R genotype which are the most resistant to scrapie, will be selected.
  • the method of the invention may be implemented by means of kits.
  • the kit of the invention will comprise: a solid phase on which is immobilized at least one capture antibody selected from SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5, SAF- 84, SHA-31, BAR-222, BAR-224, BAR-233, and 8G8, a denaturing and reducing solution, and
  • At least one detection antibody in particular chosen from the labeled 12F10, BAR226, 11C6, and 2Al 1 antibodies, and more particularly the labeled 2Al 1.
  • the kit of the invention comprises:
  • a denaturing and reducing solution and at least one detection antibody chosen from the SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5, SAF- 84, SHA-31, BAR-222, BAR-224, BAR-233 and 8G8, marked.
  • the solid phase is a microtiter plate, preferably of polystyrene.
  • the capture antibody is the SAF-34 antibody or the 3B5 antibody and the detection antibody is the 2Al 1 antibody.
  • the denaturing solution contains sodium dodecyl sulfate, dithiothreitol and sarcosyl.
  • Plasma samples were taken from sheep with the R / R or R / Q or Q / Q genotype at position 171 of the PrP.
  • 75 ⁇ l of each sheep plasma sample were mixed with 75 ⁇ l of denaturing and reducing solution composed of 2% by weight, relative to the total volume of the denaturing and reducing solution, sarcosyl, of 2% by weight, relative to to the total volume of denaturing and reducing solution, dodecyl sulphate and dithiothreitol at 10 mM, 20 mM or 30 mM.
  • the mixture is then heated for 10 minutes at 60 ° C. 100 ⁇ l of the mixture obtained are deposited in a well of a microtiter plate containing a capture antibody which is the 3B5 antibody.
  • washings of the wells are then carried out with a washing solution containing 0.01 M tris, 0.3 M NaCl, pH 7.4, and 0.1% by weight of Tween 20, relative to the total weight of the solution. washing.
  • the wash solution is buffered at neutral or slightly alkaline pH and contains a low concentration neutral / nonionic detergent (Tween 20 0.01%).
  • detection antibody which is the 2Al 1 conjugated biotin antibody, which is present at a concentration of 3 .mu.g per liter of antibody relative to the total weight of the final mixture thus obtained.
  • the wells are incubated for one hour at 37 ° C. Three washes are then carried out with the previously described washing solution. The presence of the labeled antibody on the solid phase is revealed by adding the streptavidin-peroxidase conjugate described in the "Materials" section to 0.4 ⁇ g / ml of the final mixture.
  • TMB tetramethylbenzidine solution
  • Serum samples were taken from sheep with the R / R or R / Q or Q / Q genotype at position 171 of the PrP.
  • 75 ⁇ l of each sheep plasma sample were mixed with 75 ⁇ l of denaturing and reducing solution composed of 2% by weight, relative to the total volume of the denaturing and reducing solution, sarcosyl, of 2% by weight, relative to to the total volume of denaturing and reducing solution, dodecyl sulphate and dithiothreitol at 20mM or 30mM.
  • the mixture is then heated for 10 minutes at 60 ° C.
  • washings of the wells are then carried out with a washing solution containing 0.01 M tris, 0.3 M NaCl, pH 7.4, and 0.1% by weight of Tween 20, relative to the total weight of the solution. washing.
  • the wash solution is buffered at neutral or slightly alkaline pH and contains a low concentration neutral / nonionic detergent (Tween 20 0.01%).
  • the wells are incubated for one hour at 37 ° C.
  • TMB tetramethylbenzidine solution
  • a sample of 195 sera of different sheep is taken.
  • the protocol according to Example 5 is used on the 195 samples collected.

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Abstract

L'invention concerne un procédé d'identification du génotype en position 171 de la PrP d'ovin ainsi qu'un procédé de sélection d'un ovin pour la reproduction. Elle concerne également des trousses pour la mise en œuvre de ces procédés. Le procédé d'identification de l'invention comprend les étapes de traitement d'un échantillon de fluide biologique ovin à tester contenant de la PrP avec une solution dénaturante et réductrice, d'immobilisation, éventuellement par l'intermédiaire d'un ligand, de la PrP dénaturée et réduite sur une phase solide, de mise en contact de la PrP dénaturée, réduite et immobilisée avec au moins un anticorps de détection, et de détection de la présence éventuelle dudit au moins anticorps de détection, l'un du ligand et du au moins un anticorps de détection se liant spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position 171. L'invention trouve notamment son application dans le domaine médical, plus particulièrement vétérinaire et sanitaire.

Description

Procédé d'identification du génotype en position 171 de la protéine prion d'ovin ainsi que trousses de mise en œuyre de ce procédé.
L'invention concerne un procédé d'identification ou d'analyse du génotype en position 171 de la protéine prion, appelée PrP, d'ovin ainsi que des trousses de mise en œuvre de ce procédé.
Elle concerne également un procédé permettant le criblage d'une population d'ovins en fonction de leur résistance aux encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles (ESST). Elle concerne aussi un procédé de criblage d'une population d'ovins sur la base de sa sensibilité aux ESST.
Etat de l'art
La tremblante est une maladie qui affecte les ovins, connue depuis plus de deux siècles en Europe. Elle se manifeste notamment par des troubles du comportement social de l'animal qui a tendance à se mettre à l'écart, des troubles de son comportement alimentaire et des troubles locomoteurs tels que l'apparition de tremblements et une raideur de l'arrière train. Elle se manifeste en outre généralement par un prurit et une perte de la laine.
Des travaux portant sur la transmission expérimentale de la tremblante du mouton ont débuté en 1938 sur des moutons britanniques et ont contribué de façon très importante à montrer l'implication de facteurs génétiques dans la transmission de la maladie. La nature exacte de l'agent de la tremblante comme des autres encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles (ESST) n'est pas encore définitivement établie mais fait aujourd'hui l'objet d'un quasi consensus scientifique établi sur de nombreuses preuves expérimentales. L'agent transmissible responsable de ces maladies serait une protéine de l'hôte, la PrP (protéine prion), sous une forme anormale, partiellement résistante à la digestion protéolytique, appelée communément PrPres pour "protéine prion résistante". Le pouvoir infectieux associé à ces protéines prions anormales s'est révélé extrêmement résistant aux procédés d'inactivation connus et mis en œuvre pour inactiver les microorganismes pathogènes "conventionnels" (bactéries, virus, levures). Le gène de la PrP ovine est porté par le chromosome 13 et code un polypeptide de 256 acides aminés.
Il est connu depuis longtemps que l'incidence de la tremblante naturelle chez les ovins est liée au polymorphisme du gène de la PrP et en particulier aux polymorphismes des codons 136, 154 et 171 de cette protéine.
Plusieurs allèles (ou allotypes) de la PrP ont été décrits, les principaux sont les allèles ARQ, VRQ, ARR, AHQ et ARH. La combinaison de deux de ces allèles peut produire un grand nombre de génotypes différents. Selon le NSP britannique (National Scrapie Plan), la majorité de la population de moutons possède l'un des quinze génotypes, dont la liste suit, aux codons 136, 154 et 171:
- A136Ri54RmZA136Ri54Rm, noté ARR/ARR
- A136R154Rm/Ai36H154Qm, noté ARR/AHQ - Ai36R154Rm/Ai36Ri54Hm, noté ARR/ARH
- A136R154Rm/Ai36Ri54Qm, noté ARR/ARQ
- A136H154Qi7i/Ai36Hi54Qi7i, noté AHQ/AHQ
- Ai36Hi54QmZAi36R154Hm, noté AHQ/ARH
- Ai36H154QmZAi36Ri54Qm, noté AHQZARQ - Ai36Ri54Hi7iZAi36Ri54Hm, noté ARHZARH
- Ai36Ri54H17IZAi36Ri54Qm, noté ARHZARQ
- Ai36RiS4QmZAi36Ri54Qm, noté ARQZARQ
- Ai36Ri54Ri7iZVi36Ri54Qi7i, noté ARRZVRQ
- Ai36Hi54QmZVi36Ri54Qm, noté AHQZVRQ - AI36RI54HI71ZVI36RI54QI7I, noté ARHZVRQ
- Ai36Ri54QmZVi36Ri54Qm, noté ARQZVRQ
- VI36Ri54QmZVi36RiS4Qm, note VRQZVRQ.
De façon simplifiée les moutons peuvent être classés en 3 groupes en fonction de leur génotype et de leur résistance aux ESSTs.: - les animaux résistants qui ne sont pas (ou extrêmement rarement) infectés, même lorsqu'ils sont placés dans un environnement présentant une incidence élevée de la maladie ou qui présentent une résistance très élevée dans le cadre d'infections expérimentales. Il s'agit des animaux de génotypes ARRZARR. Notons toutefois, que la découverte récente de cas atypiques de tremblante affectant aussi le génotype ARR/ARR a partiellement remis en cause la résistance quasi absolue qui était couramment associée à ce génotype.
- les animaux très sensibles manifestant la maladie à un taux élevé d'incidence et des périodes d'incubation courtes. Il s'agit des animaux ayant les génotypes VRQ/VRQ (le génotype réputé le plus sensible), ARQ/VRQ et ARQ/ARQ, et
- les animaux qui peuvent manifester la maladie avec une incidence variable et après une longue période d'incubation. Il s'agit des animaux ayant les autres génotypes. Depuis longtemps, les programmes de lutte contre la tremblante du mouton sont basés sur l'abattage total des troupeaux infectés. Mais on constate que les animaux réintroduits sont généralement réinfectés. Cette situation est probablement liée à la forte persistance de l'agent contagieux dans l'environnement des animaux d'élevage et à sa résistance aux techniques de décontamination. Aux USA, des campagnes d'éradication ont été mises en œuvre depuis 1952, et d'un point de vue global, n'ont pas été couronnées de succès. Seule la politique de l'Islande semble donner de bons résultats dans ce domaine. Mais elle est très coûteuse et contraignante. En effet, elle repose en particulier sur la division du territoire en zones affectées et zones saines, sur l'abattage total des troupeaux infectés avec la destruction de l'ensemble de l'équipement utilisé pour l'élevage, sur l'élimination du sol autour de la zone d'élevage et sur l'interdiction de réintroduire des animaux sur ladite zone pendant cinq ans. Bien entendu, les animaux utilisés pour repeupler les zones "assainies" proviennent de zones non affectées.
La sélection des animaux homozygotes portant l'allèle Ai36Ri54Rm, même si elle ne peut pas être considérée comme la solution absolue pour éradiquer les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST) dans le troupeau ovin, demeure toutefois une stratégie très appropriée pour un contrôle de la propagation de la plupart des souches d'EST y compris de l'agent l'encéphalopathie spongiforme bovine (ESB) et présente un intérêt économique évident.
La Grande-Bretagne, la France et les Pays-Bas ont par exemple déjà commencé la mise en œuvre de programmes d'enrichissement de la population en animaux résistants dans le but de lutter contre la tremblante.
Le programme français comprend ainsi notamment l'élimination des animaux porteurs de l'allèle Vi36R1S4Qm associé à une sensibilité maximale. Sa fréquence élevée au sein de la population représente un facteur de risque important de propagation de la maladie. En conséquence, un mouton portant cet allèle est considéré comme un animal "non agréé". En tant que tel, il ne peut être commercialisé à des fins de reproduction. La mention "génotype sensible à la tremblante" est indiquée sur le certificat délivré par l'UPRA (Union Pour la Promotion des
Races Animales) ou par tout autre organisme similaire.
Un tel objectif nécessite d'identifier le génotype de la PrP des moutons. Un certain nombre de méthodes basées sur la biologie moléculaire ont déjà été proposées dans ce but. On citera ainsi plusieurs méthodes utilisant la PCR, une méthode dite de pyroséquençage et une méthode permettant une simple détermination colorimétrique après une unique amplification du gène de la PrP par PCR.
Cependant ces méthodes qui impliquent toutes une amplification par PCR, requièrent une mise en oeuvre par des laboratoires spécialisés et sont très coûteuses, ce qui constitue un réel obstacle à leur utilisation à grande échelle.
On l'a vu, le génotype est le génotype que l'on souhaite sélectionner chez l'animal destiné à la reproduction.
C'est le seul génotype, parmi les quinze génotypes connus, qui a deux acides aminés R aux positions 171 de la PrP. Ce génotype est noté R/R.
On l'a vu, le génotype Vi36Ri54Qi7i/ est le génotype que l'on souhaite éviter chez l'animal destiné à la reproduction.
Buts de l'invention
La présente invention a pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'un procédé d'identification du génotype en position 171 de la protéine prion (PrP) d'ovin. La présente invention a également pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une trousse d'identification du génotype en position 171 de la PrP d'ovin.
L'invention a en particulier pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'un procédé d'identification du génotype en position 171 et/ou d'une trousse d'identification de ce génotype pour permettre aux éleveurs d'ovins de sélectionner, choisir, ou identifier, les animaux résistants ou sensibles, et notamment de discriminer les animaux résistants des animaux sensibles ou inversement.
L'invention a notamment pour but de résoudre ces problèmes techniques dans le cadre d'un programme de reproduction pour éradiquer ou tout au moins diminuer la présence du prion chez les ovins.
L'invention a notamment pour but de résoudre ce problème technique dans le but de lutter contre la tremblante du mouton.
La présente invention a notamment pour but de résoudre ces problèmes techniques par une méthode autre que celle du type PCR ou Western Blot, qui sont coûteuses et nécessitent un matériel de laboratoire spécialisé. Ainsi, l'invention a également pour but de résoudre ces problèmes techniques par un test rapide, ne nécessitant notamment pas de matériel spécialisé autre que celui d'un laboratoire d'analyse classique.
La présente invention a notamment pour but de résoudre ces problèmes techniques de manière reproductible, industrielle, fiable, de manière rapide, et aux plus faibles coûts.
Description de l'invention
On a maintenant découvert qu'il était possible d'identifier l'acide aminé présent à la position 171 de la PrP d'ovin grâce à l'utilisation d'au moins un anticorps qui reconnaît spécifiquement certaines formes alléliques de la PrP. .
Cette méthode peut être mise en œuvre sur un fluide biologique du mouton tel que le plasma, le sang, le sérum, le lait, la salive, et l'urine.
De plus, cette méthode est facile à mettre en œuvre, rapide et économique. A cet effet, l'invention propose un procédé d'identification ou d'analyse du génotype en position 171 de la PrP d'ovin comprenant les étapes de : a) traitement d'un échantillon de fluide biologique ovin à tester contenant de la PrP avec une solution dénaturante et réductrice, b) immobilisation, éventuellement par l'intermédiaire d'un ligand, de la PrP dénaturée et réduite sur une phase solide, c) mise en contact de la PrP dénaturée, réduite et immobilisée avec au moins un anticorps de détection, et d) détection de la présence éventuelle dudit au moins un anticorps de détection, et dans lequel l'un du ligand et du au moins un anticorps de détection se lie spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position 171.
De préférence la solution dénaturante et réductrice comprend : a) au moins un agent dénaturant choisi parmi : un agent tensio-actif choisi dans le groupe constitué par :
• les tensio-actifs anioniques, tels que le SDS (dodécylsulfate de sodium), le sarcosyl (lauroyl sarcosine), le cholate de sodium, le glycocholate de sodium, le désoxycholate de sodium, le taurocholate de sodium, le caprylate de sodium, le 1-décanesulfonate de sodium, le laurylsulfate de sodium et le laurylsulfate de lithium ;
• les tensio-actifs zwitterioniques, tels que SB 3-10 (décyl-sulfobétaïne), SB 3-12 (dodécyl-sulfobétaïne), SB 3-14 (tétradécyl-sulfobétaïne), SB 3-16
(hexadécyl-sulfbbétaïne), SB 3-18 (octadécγi-sulfobétaïne), CHAPS et CHAPSO et désoxy CHAPS ;
• les tensio-actifs non ioniques, tels que le Triton X-IOO, le Triton X-114, le Tween 20, le Tween 80, le Brij 35 (polyoxyéthylène 23 lauryléther), le nonidet P-40, le n-décyl-béta-D-glucopyranoside, le n-dodécyl-béta-D- glucopyranoside, le n-octyl-béta-D-glucopyranoside, le n-octyl-alpha-D- glucopyranoside ;
• leurs mélanges, et/ou
- un agent chaotrope, et b) au moins un agent réducteur.
L'agent chaotrope est choisi parmi l'urée, la guanidine, l'hydrochlorure de guanidine, le thiocyanate de guanidine ou un de leurs mélanges. Plus préférablement, la solution dénaturante et réductrice comprend un mélange d'agents tensio-actifs ioniques, en particulier d'agents tensio-actifs anioniques, et plus particulièrement de SDS et de sarcosyl.
Plus précisément, la solution dénaturante et réductrice contient au moins 0,5 % en poids d'agent tensio-actif par rapport au volume total du mélange constitué par l'échantillon à traiter et la solution dénaturante et réductrice, et en particulier supérieure ou égale à 2 % en poids par rapport au volume total du mélange.
Préférablement, le au moins un agent réducteur est choisi dans le groupe constitué par le DTT (dithiothréitol), le TCEP (hydrochlorure de Tris(2-carboxyéthyl)phosphine), le DTE (dithio érythritol), le Béta mercaptoéthanol, la 2-mercaptoéthylamine ou un de leurs mélanges.
Dans ce cas, de préférence, la concentration en agent réducteur est comprise entre 2,5 mM et 100 mM, en particulier entre 5 mM et 50 mM et plus particulièrement comprise entre 5 mM et 30 mM dans le mélange constitué par l'échantillon à traiter et la solution dénaturante et réductrice. Le plus préférablement, la solution dénaturante et réductrice comprend un mélange de sarcosyl, de SDS et de DTT.
Lorsque la solution dénaturante et réductrice comprend un agent chaotrope, la concentration en cet agent chaotrope, est de préférence supérieure ou égale à 1 M, et plus particulièrement supérieure ou égale à
3 M. Lorsque l'agent chaotrope est de l'urée, elle est de préférence égale à 8 M.
Dans un premier mode de mise en œuvre du procédé d'identification du génotype en position 171 de la PrP d'ovin de l'invention, la PrP dénaturée et réduite est immobilisée par l'intermédiaire d'un ligand qui est un anticorps de capture capable de retenir la PrP par liaison affine et l'anticorps de détection est un anticorps se liant spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position 171, cette position étant différente du site épitopique reconnu par l'anticorps de capture. Dans un second mode de mise en œuvre du procédé de l'invention, la PrP dénaturée et réduite est immobilisée par l'intermédiaire d'un ligand qui est un anticorps de capture se liant spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position 171 et l'anticorps de détection est un anticorps capable de se lier à la PrP par liaison affine à un site épitopique différent de celui reconnu par l'anticorps de capture.
Dans un troisième mode de mise en œuvre du procédé de l'invention, la PrP dénaturée et réduite est immobilisée par l'intermédiaire d'un ligand choisi parmi les molécules suivantes : le plasminogène, l'avidine, la streptavidine, les glycose aminoglycans, Phespéridine, les porphyrines, la streptamicine et la tetracycline, et l'anticorps de détection est un anticorps se liant spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position 171.
Dans un quatrième mode de mise en œuvre du procédé de l'invention, la PrP dénaturée et réduite est immobilisée directement sur la phase solide, et l'anticorps de détection est un anticorps se liant spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position
171.
Dans tous les modes de mise en œuvre du procédé de l'invention, de préférence, la phase solide est choisie parmi des plaques de microtitrage, des billes, des tubes, en polymère, notamment en polystyrène, polyéthylène ou latex. De préférence la phase solide est une plaque de microtitrage en polystyrène.
Egalement, dans tous les modes de mise en œuvre du procédé de l'invention, de préférence, l'échantillon de fluide biologique est choisi parmi du sang, du plasma, du sérum, ou du lait.
Dans le premier mode de mise en œuvre du procédé de l'invention, -, l'anticorps de capture est un anticorps qui se lie à la PrP sans compétition avec la liaison à la PrP de l'anticorps de détection qui est spécifique de la forme allélique en position 171. Cet anticorps peut être en particulier choisi parmi les anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5 , SAF-84, SHA-31, BAR-222, BAR-224, BAR- 233, et 8G8. On préfère comme anticorps de capture un anticorps ciblant la région octa repeat de la PrP à savoir: SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, et 3B5.
Dans ce cas, l'anticorps de détection est de préférence choisi parmi l'anticorps 2Al 1 marqué, l'anticorps 11C6 marqué, l'anticorps BAR226 marqué, et l'anticorps 12F10 marqué.
Mais, de préférence, dans le premier mode de mise en œuvre du procédé de l'invention, l'anticorps de capture est l'anticorps SAF-34 ou l'anticorps 3B5 et l'anticorps de détection est l'anticorps 2Al 1 marqué, Avantageusement, dans le second mode de réalisation, le ligand est un anticorps de capture choisi parmi les anticorps 2Al 1, 11C6, BAR-226, et 12F10.
Avantageusement, l'anticorps de détection est choisi parmi SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5, SAF-84, SHA-31, BAR-222, BAR-224, BAR-233, et 8G8.
De préférence, dans le second mode de mise en œuvre du procédé de l'invention, l'anticorps de capture peut être choisi parmi les anticorps
2Al 1, 12F10, BAR226, 11C6 et en ce que l'anticorps de détection est choisi parmi les anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF- 35, SAF-37, 3B5, BAR-224, SHA-31, et 8G8, marqués.
L'invention propose également un procédé de criblage d'une population ovine en fonction de sa résistance aux encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en œuvre du procédé précédemment décrit. L'invention propose également un procédé de criblage d'une population ovine en fonction de sa sensibilité aux encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en œuvre du procédé précédemment décrit.
Ceci permet notamment aux éleveurs d'écarter les animaux sensibles ou de ne conserver que les animaux résistants. Ces procédés de criblage peuvent être utilisés dans le cadre d'un programme de reproduction, en particulier.
Avantageusement, le procédé de criblage comprend une étape de comparaison du signal mesuré sur le ou les échantillon(s) à analyser par rapport à un ou des échantillon(s) résistant(s) et/ou sensible(s). L'invention propose encore une trousse d'identification de génotype en position 171 de Ia PrP d'ovin comprenant :
- une phase solide sur laquelle est immobilisée au moins un anticorps de capture, en particulier choisi parmi les anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5, SAF-84, SHA-31, BAR-222, BAR- 224, BAR-233, et 8G8 ;
- une solution dénaturante et réductrice, et
- au moins un anticorps de détection, en particulier choisi parmi les anticorps 12F10, BAR226, 11C6, et 2Al 1, marqués et plus particulièrement le 2Al 1 marqué.
L'invention propose également une trousse d'identification de génotype en position 171 de la PrP d'ovin, caractérisé en ce qu'il comprend : une phase solide sur laquelle est immobilisée au moins un anticorps de capture, en particulier choisi parmi les anticorps 12F10, BAR226, 11C6, et 2A11,
- une solution dénaturante et réductrice, et au moins un anticorps de détection, en particulier choisi parmi les anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5, SAF-84, SHA-31, BAR-222, BAR-224, BAR-233, et 8G8, marqués.
L'invention sera mieux comprise et d'autres caractéristiques et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de la description explicative qui suit et qui est faite en référence aux figures dans lesquelles : - la figure 1 illustre les absorbances relatives, normalisées par rapport au génotype Q/Q, obtenues sur des plasmas de moutons ARR/ARR, c'est- à-dire ayant le génotype R/R en position 171 de la PrP, ou ARR/VRQ, c'est-à-dire ayant le génotype R/Q en position 171 de la PrP, ou VRQ/VRQ, c'est-à-dire ayant le génotype Q/Q en position 171 de la PrP. Ces tests, de format ELISA sandwich, sont réalisés après dénaturation et réduction du plasma comme décrit à l'exemple 1. Tous les sandwichs impliquent l'anticorps SAF-34 (anti octa repeat) qui reconnaît indifféremment tous les allotypes en position 171. Selon les cas, l'anticorps SAF-34 est utilisé en tant qu'anticorps de capture (SAF-34) ou en tant qu'anticorps de détection (SAF-34-AChE, SAF-34 marqué à l'acétylcholinestérase de gymnote) ;
- la figure 2 illustre la répartition des densités optiques (DO) obtenues sur des plasmas de moutons ayant en position 171 de la PrP, les acides aminés R/R, ou R/H, ou R/Q, ou H/Q, ou Q/Q. Ces tests ont été réalisés en utilisant l'anticorps SAF-34 comme anticorps de capture et l'anticorps de détection 2Al 1 marqué biotine comme anticorps de détection.
- la figure 3 illustre la répartition des densités optiques (DO) obtenues sur des plasmas de moutons ayant en position 171 les acides aminés Q/Q, ou les acides aminés R/Q, ou les acides aminés R/R. Ces tests ont été réalisés en utilisant comme anticorps de capture l'anticorps SAF-34 et comme anticorps de détection l'anticorps 2Al 1 marqué AChE,
- la figure 4 illustre l'influence de la présence ou l'absence d'un agent réducteur qui est le dithiothréitol ainsi que de l'absence d'un agent dénaturant qui est l'urée, dans la composition de la solution dénaturante. Ces tests ont été réalisés en utilisant en tant qu'anticorps de détection l'anticorps 2Al 1 marqué biotine et en tant qu'anticorps de capture l'anticorps SAF-34.
- la figure 5 illustre la répartition des densités optiques (DO) obtenues sur des sérums de moutons ayant en position 171 de la PrP, les acides aminés R/R, ou R/H, ou R/Q, ou H/Q, ou H/H, ou Q/Q. Ces tests ont été réalisés en utilisant l'anticorps 3B5 comme anticorps de capture et l'anticorps 2Al 1 marqué biotine comme anticorps de détection et avec une concentration en DTT de 20 mM. - la figure 6 illustre l'influence de la concentration en DTT dans la solution dénaturante sur des échantillons de plasmas. Ces tests ont été réalisés en utilisant l'anticorps 3B5 comme anticorps de capture et l'anticorps 2Al 1 marqué biotine comme anticorps de détection.
- la figure 7 illustre l'influence de la concentration en DTT dans la solution dénaturante sur des échantillons de sérums. Ces tests ont été réalisés en utilisant l'anticorps 3B5 comme anticorps de capture et l'anticorps 2Al 1 marqué biotine comme anticorps de détection.
- la figure 8 illustre la distribution des densités optiques obtenues en fonction de différents échantillons de sérum prélevés sur des moutons, qui se sont avérés correspondre à différents génotypes de la PrP. Des tests ont été réalisés en utilisant l'anticorps 3B5 comme anticorps de capture et l'anticorps 2Al 1 marqué biotine comme anticorps de détection.
L'invention a pour objet un procédé d'identification du génotype en position 171 de la PrP d'ovin, dans lequel on traite un fluide biologique ovin à tester, contenant de la PrP, avec une solution dénaturante et réductrice, on immobilise la PrP dénaturée et réduite et on met en contact la PrP dénaturée et réduite avec au moins un anticorps se liant spécifiquement à la PrP d'ovin ayant une forme allélique particulière en position 171 et on détecte la présence éventuelle de l'anticorps à la PrP. Dans le contexte de l'invention, un "fluide biologique" peut être notamment du sang, du plasma, du sérum, de l'urine, du liquide céphalorachidien, de la salive, du lait etc..
Selon un mode de réalisation préféré, ce fluide biologique est choisi parmi du sang, du sérum, du plasma et du lait. Ce fluide biologique contient la PrP.
Le terme "anticorps" se réfère à tout anticorps entier ou à un fragment fonctionnel d'un anticorps comprenant ou consistant en au moins un site de combinaison antigénique, permettant au dit anticorps de se lier à au moins un déterminant antigénique d'un composé antigénique. A titre d'exemple de fragments d'anticorps on peut citer les fragments Fab, Fab', F(abθ2 ainsi que les chaînes scFv (Single chain variable fragment), dsFv (Double-stranded variable fragment), etc.. Ces fragments fonctionnels peuvent notamment être obtenus par génie génétique.
La production d'anticorps monoclonaux ou de sérums polyclonaux monospécifiques utiles dans le cadre de l'invention relève de techniques conventionnelles, qui sont détaillées plus loin.
Le terme "spécifiquement", quand il se réfère à une reconnaissance spécifique de, ou à une liaison spécifique à, une forme allélique particulière en position 171 de la PrP d'ovin par un anticorps, signifie que l'anticorps interagit avec la forme allélique particulière de manière préférentielle par rapport aux autres formes alléliques possibles, permettant de différencier et discriminer les différentes formes alléliques possibles entre elles. Des constantes d'association supérieures à 108 L mol"1 sont préférables. Les anticorps utilisés dans la présente invention sont des anticorps spécifiquement dirigés contre la protéine prion , et, pour cette raison, sont des anticorps préférentiellement monoclonaux ou des anticorps polyclonaux monospécifiques, c'est à dire qu'ils ne reconnaissent pas d'autre protéine.
Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de fusion lymphocytaire et culture d'hybridomes décrite par Kôhler et Milstein, (1975). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues (Harlow et al. (1988)). Les anticorps monoclonaux peuvent être préparés en immunisant un mammifère (par exemple une souris, un rat, un lapin, voire un être humain, etc..) et en utilisant la technique de fusion lymphocytaire conduisant à des hybridomes (Kôhler et Milstein, 1975).
Des techniques alternatives à cette technique usuelle existent. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux (par exemple, fUSE5 pour E coli, Scott et al. (1990)). Ces derniers constituent des banques et présentent des fragments scFv à leur surface. Des protocoles de construction de ces banques d'anticorps sont décrits dans Marks et al. (1991).
Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre un antigène de nature peptidique selon les modes opératoires usuels.
D'une manière générale, on peut utiliser, par exemple, comme immunogène, un polypeptide, en particulier recombiné, ou un oligopeptide. Selon un protocole classique, des lapins sont immunisés avec l'équivalent de lmg de l'immunogène peptidique selon la procédure décrite par Benoit et al. (1982). A intervalles de quatre semaines, les animaux sont traités par des injections de 200 μg d'antigène et saignés 10 à 14 jours plus tard. Après la troisième injection, on évalue la capacité de l'anti-sérum à se lier au peptide antigène radiomarqué à l'iode, préparé par la méthode chloramine-T. On le purifie ensuite par chromatographie sur colonne échangeuse d'ions constituée de carboxyméthyl cellulose (CMC). Les molécules d'anticorps recueillies par élution sont ensuite ajustées à la concentration souhaitée par des méthodes bien connues de l'homme du métier, par exemple, en utilisant du DEAE Sephadex pour obtenir la fraction IgG.
Afin d'augmenter la spécificité du sérum polyclonal, les anticorps peuvent être purifiés par une chromatographie d'immuno-affinité (ou d'immunoadsorption) en utilisant des peptides à titre ayant servi à l'immunisation et immobilisés en phase solide. L'antisérum est mis en contact avec un tel peptide immobilisé en phase solide pendant une durée suffisante de façon à faire immuno-réagir le peptide avec la molécule d'anticorps afin de former un complexe immunologique en phase solide.
Comme anticorps approprié se liant spécifiquement à une forme allélique particulière en position 171 de la PrP, on citera les anticorps 2Al 1, 11C6, BAR226, 12F10, V5 et V61.
Cependant, on préférera utiliser comme anticorps se liant spécifiquement à la PrP ayant une forme particulière en position 171, l'anticorps 2Al 1, l'anticorps 11C6, l'anticorps BAR226 ou l'anticorps 12F10. On préférera, plus particulièrement, utiliser l'anticorps 2Al 1. Cet anticorps a été produit selon le protocole décrit dans J. Brun et al; Neuroscience Research 48, 2004, 75-83, en immunisant des souris PrP0/0 avec de la PrP recombinante bovine. Cet anticorps se lie à la séquence 171-179 (QVYYRPVDQ) de la PrP bovine et présente de fortes réactions croisées avec la PrP de la plupart des espèces mammifères qui partagent le même épitope (mouton, chèvre, chat, lapin, souris, cochon et hamster) mais pas avec la PrP humaine qui présente la séquence (QVYYRPMDE). Il a également été montré que son affinité était fortement augmentée lorsque la PrP est réduite et dénaturée, très probablement en raison de la proximité de l'épitope avec le premier résidu de serine impliqué dans un pont disulfure de la PrP. En outre, une analyse par immunohistochimie montre que l'immunoréactivité est grandement augmentée après un traitement à la protéinase K.
Il a été en outre montré que l'anticorps 2Al 1 se lie spécifiquement aux formes alléliques de la PrP de mouton portant un résidu de glutamine (Q) ou d'histidine (H) en position 171 alors qu'aucune immunoréactivité n'est observée avec l'ailèle ARR.
Autrement dit, l'anticorps de 2Al 1 ne se lie pas au résidu R. Donc une absence de liaison entre l'anticorps 2Al 1, utilisé aussi bien comme anticorps de détection que comme anticorps de capture, et la protéine PrP, absence de liaison qui se traduit par une densité optique nulle ou proche de nulle, dans le procédé d'identification de l'invention, prouve que le génotype en position 171 de la PrP contenue dans le fluide biologique étudié est le génotype R/R, c'est-à-dire le génotype Ai36Ri54Ri7I/
Comme de plus l'anticorps 2Al 1 se lie de façon quantitativement différente et préférentielle au résidu Q en position 171 de la PrP, par rapport au résidu H, si une liaison entre l'anticorps 2Al 1 et la protéine PrP est détectée, il sera possible de discriminer, selon l'intensité du signal obtenu (qui se traduit par la DO), entre un fluide biologique provenant d'un mouton homozygote Q/Q et un fluide biologique provenant d'un mouton hétérozygote Q/H, ou homozygote H/H.
De la même façon les animaux hétérozygotes porteurs d'un seul allèle R en position 171 (R/Q ou R/H) produiront un signal encore plus faible puisque la moitié de la PrP contenue dans l'échantillon n'est pas reconnue par l'anticorps 2Al 1.
C'est donc bien l'existence d'une éventuelle liaison entre la PrP de l'échantillon et l'anticorps spécifique qui est détectée dans le procédé d'identification de l'invention. II a ainsi été possible de concevoir un simple test de type immunologique permettant de mettre en évidence une claire différence entre les animaux sur la base du génotype exprimé. Selon un premier mode de réalisation, ce test permet d'identifier les animaux ARR/ARR.
Selon un second mode de réalisation, ce test permet d'identifier les animaux hétérozygotes (R/(Q,H)) par rapport aux autres génotypes (Q/Q,
Q/H, H/H).
Le procédé de l'invention comprend la mise en contact de l'échantillon de fluide biologique avec une quantité appropriée d'une solution dénaturante et réductrice. Avantageusement, ladite solution comprend: a) au moins un agent dénaturant choisi parmi :
- un agent tensio-actif choisi dans le groupe constitué par :
• les tensio-actifs anioniques, tels que le SDS (dodécylsulfate de sodium), le sarcosyl (lauroyl sarcosine), le cholate de sodium, le glycocholate de sodium, le désoxycholate de sodium, le taurocholate de sodium, le caprylate de sodium, le 1-décanesulfonate de sodium, le laurylsulfate de sodium et le laurylsulfate de lithium;
• les tensio-actifs zwitterioniques, tels que SB 3-10 (décyl-sulfobétaïne), SB 3-12 (dodécyl-sulfobétaïne), SB 3-14 (tétradécyl-sulfobétaïne), SB 3-16 (hexadécyl-sulfobétaïne), SB 3-18 (octadécyl-sulfobétaïne), CHAPS et CHAPSO et désoxy CHAPS;
• les tensio-actifs non-ioniques, tels que le Triton X-IOO, le Triton X- 114, le Tween 20, le Tween 80, le Brij 35 (polyoxyéthylène 23 lauryléther), le nonidet P-40, le n-décyl-béta-D-glucopyranoside, le n- dodécyl-béta-D-glucopyranoside, le n-octyl-béta-D-glucopyranoside, le n- octyl-alpha -D-glucopyranoside ;
• les mélanges de ces tensio-actifs, et/ou
- un agent chaotrope, et b) au moins un agent réducteur. On entend par agent réducteur un agent capable de cliver le pont disulfure de la protéine PrP.
Parmi les agents réducteurs pouvant être utilisés dans la présente invention, on peut citer notamment le DTT (dithiothréitol), le TCEP
(hydrochlorure de Tris(2-carboxyéthyl)phosphine), le DTE (dithio érythritol), le Béta mercaptoéthanol, la 2— mercaptoéthylamine ou un mélange de ceux-ci.
L'agent réducteur est généralement présent dans le mélange constitué par l'échantillon à traiter et la solution dénaturante et réductrice à une teneur allant de 2,5 mM à 100 mM, en particulier de 5 mM à 50 mM et plus particulièrement à une teneur allant de 5 mM à 30 mM.
L'agent chaotrope est choisi parmi l'urée, la guanidine, l'hydrochlorure de guanidine, le thiocyanate de guanidine ou un de leurs mélanges. Lorsque des agents chaotropes sont présents, leur concentration est généralement supérieure ou égale à 1 M, de préférence supérieure ou égale à 3 M.
L'agent chaotrope préféré est l'urée, de préférence, à une concentration égale à 8 M.
Le mélange constitué par l'échantillon à traiter et la solution dénaturante et réductrice est généralement chauffé à une température allant de 37°C à 1000C, en particulier de 500C à 70 0C et plus particulièrement à 600C environ, pendant 5 minutes à une heure, en particulier entre 7 et 20 minutes et plus particulièrement environ 10 minutes.
Ces conditions sont sélectionnées afin de répondre à des exigences contradictoires qui sont d'altérer suffisamment la PrP pour que l'épitope formé par l'acide aminé en position 171 soit démasqué mais de ne pas altérer trop la PrP pour que l'épitope puisse encore être reconnu par l'anticorps. De plus ce traitement ne doit pas affecter la fixation ultérieure de l'anticorps.
Selon un mode de réalisation particulier, ladite solution comprend un mélange d'agents tensio-actifs, notamment un mélange d'agents tensio-actifs ioniques, en particulier un mélange d'agents tensio-actifs anioniques et plus particulièrement un mélange de SDS et de sarcosyl.
La concentration en agents tensio-actifs dans le mélange constitué par l'échantillon à traiter et la solution dénaturante et réductrice est généralement supérieure ou égale à 0,5 % en poids par rapport volume total du mélange, en particulier supérieure ou égale à 2% en poids par rapport au volume total du mélange.
Ainsi, la solution dénaturante et réductrice comprend au moins un agent dénaturant qui peut être un agent tensio-actif et/ou un agent chaotrope et au moins un agent réducteur. Le traitement de la PrP par cette solution à la fois dénaturante et réductrice est indispensable pour mettre en œuvre le procédé de l'invention, comme cela sera démontré à l'exemple 4.
Généralement, on laisse la solution contenant l'anticorps spécifique de l'acide aminé en position 171 en contact avec la phase solide sur laquelle est immobilisée la PrP au moins 10 mn, en particulier environ une heure, à une température pouvant aller de 4 à 5O0C, et en particulier de 37°C.
Il est bien évident que la méthode de détection du marquage sur la phase solide dépend du marqueur utilisé. Il s'agit de méthodes bien connues de l'homme du métier. On citera par exemple un marquage à la biotine. Par exemple dans un tel cas, on révèle la présence éventuelle de biotine immobilisée sur le support en ajoutant une solution de conjugué streptavidine-peroxydase que l'on laisse réagir pendant environ 10 à 30 minutes à une température d'environ 370C. Enfin, la présence d'une activité peroxydase liée au support est révélée par l'addition d'un substrat chromogénique, par exemple de la tétraméthylbenzidine, que l'on laisse réagir environ 30 minutes à 200C. On mesure finalement l'absorbance à 450 et à 620 nm.
Quant à l'immobilisation de la protéine prion dénaturée et purifiée, il peut s'agir d'une immobilisation directe sur la phase solide ou d'une immobilisation indirecte.
La phase solide peut être une plaque de microtitrage, des billes, des tubes, en polymère, notamment en polystyrène, polyéthylène ou latex .
De préférence la phase solide est une plaque de microtitrage en polystyrène.
Dans le cas de l'immobilisation de la PrP directement sur la phase solide, la protéine prion, qui comme toutes les protéines se fixe sur la plaque, doit être purifiée (dénaturée) pour éliminer le plus possible de protéines non désirées de l'échantillon, avant d'immobiliser la protéine PrP elle-même.
De plus, Ia protéine prion doit être réduite.
Ensuite, on fait réagir l'anticorps de détection qui sera marqué directement ou indirectement.
Dans le cas de l'immobilisation indirecte de la PrP sur la phase solide, l'immobilisation peut s'effectuer par l'intermédiaire d'un anticorps ou d'un autre ligand spécifique qui n'est pas un anticorps. Ainsi, l'immobilisation indirecte peut s'effectuer par l'intermédiaire d'un anticorps, dit anticorps de capture, qui est capable de retenir la PrP par liaison affine, ou à l'aide d'un anticorps se liant spécifiquement à une forme particulière de Pallèle en position 171, ou encore par l'intermédiaire d'un ligand qui n'est pas un anticorps. Ce ligand peut être une molécule telle que le plasminogène, l'avidine, la streptavidine, les glycose aminoglycans, l'hespéridine, les porphyrines, la streptamicine et la tetracycline. Dans le cas où la PrP est immobilisée par l'intermédiaire d'un ligand ou d'un anticorps capable de retenir par liaison affine la PrP, on fait réagir la protéine PrP ainsi immobilisée avec un anticorps se liant spécifiquement à une forme particulière de l'allèle 171, qui est marquée directement ou indirectement. En revanche, dans le cas où l'immobilisation de la PrP sur la phase solide se fait par l'intermédiaire d'un anticorps se liant spécifiquement à une forme particulière de Pallèle en position 171, la protéine PrP immobilisée est ensuite mise à réagir avec un anticorps capable de la retenir par liaison affine. Dans ce cas, c'est cet anticorps qui est marqué directement ou indirectement.
Puis, dans tous les cas, l'anticorps marqué est détecté. Le procédé de l'invention est avantageusement mis en œuvre sous la forme d'un dosage immunologique de type sandwich, tout particulièrement de type ELISA. Dans un tel cas, il convient d'utiliser à la fois un anticorps dit de capture et un anticorps dit de détection pouvant se lier simultanément à la protéine PrP purifiée et réduite.
Par anticorps de capture, on entend un anticorps, ou une partie d'anticorps, de préférence flxé(e) sur une phase solide qui est capable de retenir un antigène présent dans un échantillon biologique soit par liaison affine simple soit par liaison affine en reconnaissant un site épitopique particulier.
Lorsque l'antigène est immobilisé par un anticorps de capture, l'anticorps de détection doit être capable de se lier à un site épitopique encore accessible différent de celui reconnu par l'anticorps de capture.
Le terme "marqué" se réfère aussi bien à un marquage direct (par le biais d'enzymes, radioisotropes, fluorochromes, composés luminescents, etc.) qu'à un marquage indirect, par exemple par le biais d'anticorps eux- mêmes marqués de manière directe ou à l'aide de réactifs d'une "paire d'affinité" marquée, telle que, mais non exclusivement la paire avidine marquée-biotine, etc.
Ainsi la présente invention a notamment pour objet un procédé d'identification du génotype en position 171 de la PrP comprenant les étapes consistant :
- à traiter un échantillon de fluide biologique à tester, de manière à dénaturer et à réduire la PrP contenue dans ledit échantillon,
- à mettre en contact ledit échantillon traité avec une phase solide sur laquelle est immobilisé un anticorps dit anticorps de capture, - à laver la phase solide obtenue à l'étape précédente,
- à mettre en contact ladite phase solide lavée avec une solution d'anticorps marqué dit anticorps de détection,
- à laver la phase solide obtenue à l'étape précédente, puis
- à détecter la présence éventuelle de marquage sur la phase solide, l'un des anticorps reconnaissant de manière spécifique la PrP quel que soit le variant allélique en position 171 de la PrP, l'autre anticorps se liant de manière spécifique à la PrP d'ovin ayant un variant allélique particulier en position 171.
Comme anticorps reconnaissant de manière spécifique la PrP quel que soit le variant allélique en position 171 de la PrP, on citera en particulier les anticorps capables de reconnaître spécifiquement le motif octapeptide répété tel que ceux décrits dans la demande de brevet WO 01/35104. Parmi ces anticorps, on peut citer en particulier, ceux choisis dans le groupe constitué par les anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37 décrits dans la demande WOO 1/35104.
On peut encore citer l'anticorps 3B5 décrit dans Krasemann et al. Krasemann, S., Groschup, M. H., Harmeyer, S., Hunsmann, G. and Bodemer, W. (1996a) Génération of monoclonal antibodies against human prion proteins in PrP0/0 mice. Molecular Médecine, 2, 725-734. On peut citer en outre l'article de Féraudet, et al (Screening of 145
Anti-PrP Monoclonal Antibodies for Their Capacity to Inhibit PrPSc Replication in Infected CeIIs, the Journal of Biological Chemistry, Vol. 280, No. 12, Issue Of March 25, pp. 11247-11258, 2005). On préféra tout particulièrement l'anticorps SAF-34 ou l'anticorps 3B5. Comme anticorps reconnaissant de manière spécifique un variant allélique particulier de la PrP en position 171, on citera l'anticorps 2A11.
On citera encore l'anticorps 12F10 décrit dans Krasemann, S., Jurgens T. and Bodemer, W. (1999) Génération of monoclonal antibodies against prion proteins an unconventional nucleic acid based immunization strategy. Journal of Biotechnology, 73, 119-129, et l'anticorps 11C6 décrit dans Krasemann, S., Groschup, M. H., Hunsmann, G. and Bodemer, W.
(1996b) Induction of antibodies against human prion proteins (PrP) by
DNA-mediated immunization of PrP0/0 mice. J. Immunol. Methods, 199, 109-118.
On citera encore les anticorps V5 et V61 décrits dans Moudjou et al, Journal of Virology, sept. 2004, page 9270-9276.
Il va de soi qu'il est à portée de l'homme du métier de produire ou de se procurer des anticorps monoclonaux, de spécificité épitopique similaire ou identique à celle décrite pour les anticorps ci-dessus, et qui conviennent à la mise en œuvre de la présente invention.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
EXEMPLES
Matériels
Obtention et caractérisât ion des anticorps monoclonaux spécifiques du motif octapeptide répété (SAF).
On a préparé les anticorps SAF- 15, 31, 32, 33, 34, 35 et 37, spécifiques du motif octapeptide répété comme décrit dans la demande de brevet WO 01/35104.
Synthèse et marquage du peptide 79-92 de la PrP humaine Un peptide représentatif du motif octapeptide répété de la PrP, par exemple le motif G-G-W-G-Q-P-H-G-G-G-W-G- Q-G-(NH2), correspondant à la séquence 79-92 de la PrP humaine, a été synthétisé à l'aide d'un synthétiseur automatique (Milligen 9050, Waters, Milford, MI). Le peptide a été couplé de façon covalente avec l'acétylcholinestérase de gymnote (AChE) par l'intermédiaire d'un réactif hétérobifonctionnel, le succinimidyl 4-( ΛAmaléimidométhyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC, Calbiochem, France), comme décrit précédemment pour d'autres peptides ou protéines (McLaughiin et al., 1987, Grassi et al., 1989). Cette méthode implique la réaction d'un groupement thiol introduit dans le peptide avec la fonction maléimide qui a été fixée sur l'AChE par réaction avec le SMCC. Le groupement thiol a été introduit dans le peptide par réaction avec le N- succinimidyl S- acétylthioacétate (SATA) comme décrit précédemment (McLaughiin et al., 1987). Le couplage a été obtenu en faisant réagir 1'AChE-SMCC avec un excès de peptide thiolé. - Immunisation et préparation des anticorps monoclonaux
Une préparation de "Scrapie-associated fîbrils" (SAFs, préparation de PrPres) a été obtenue à partir de cerveaux de hamster infectés (souche de tremblante 263 K) comme décrit précédemment (Lasmezas et al., 1997). Cette préparation a été inactivée par traitement à l'acide formique avant immunisation des souris. Des souris invalidées (knock-ouή pour le gène de la PrP (souris PrP0/0 ) ont été immunisées avec ces préparations de SAF et des cellules d'hybridome ont été préparées comme décrit précédemment (Grassi et al., 1988, 1989). Le criblage des surnageants de culture a été réalisé comme décrit ci-dessous. 57 hybridomes ont pu être identifiés et stabilisés ; ils ont été appelés SAF-I à SAF-90. Tous ces anticorps se sont avérés reconnaître les SAF immobilisés sur des plaques de microtitrage alors qu'une minorité d'entre eux ont démontré une capacité à reconnaître des conjugués peptide-AChE. Parmi ces derniers, sept reconnaissent clairement le motif octapeptide répété (réaction avec le peptide 79-92 couplé à I1AChE) ;il s'agit des anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35 et SAF-37. Après clonage et expansion sous la forme de liquide d'ascite, les anticorps monoclonaux ont été purifiés par chromatographie d'affinité sur colonne de Protéine A Sépharose et conservés à -200C jusqu'à utilisation. L'isotype des anticorps a été déterminé par immunodiffusion radiale selon la technique d'Ouchterlony.
Criblage des surnageants de culture d'hybridome La présence d'anticorps spécifiques de la PrP dans les surnageants de culture d'hybridome a été mise en évidence de deux façons, en testant soit leur capacité à lier des conjugués peptide-AChE (et notamment le peptide 79-92-AChE) soit des SAFs de hamster. Dans le premier cas, le criblage a été réalisé dans des plaques contenant un anticorps anti-IgG de souris immobilisé comme décrit précédemment (Créminont et al., 1993, Frobert et al., 1991). En résumé, 100 μl de surnageants de culture et 100 μl de conjugué Peptide-AChE ont été mis à réagir une nuit à 4°C dans des plaques contenant des anticorps de chèvre anti-IgG de souris immobilisés. Après lavage des plaques 200 μl de réactif d'Ellman (Eliman et al., 1961) ont été rajoutés dans les puits afin de détecter la présence d'AChE fixée sur la phase solide. Dans le deuxième cas, des plaques contenant une préparation de SAF immobilisée ont été préparées en faisant réagir 50 μl d'une solution à 2 μg/ml dans un tampon phosphate 0,05 M, pH 7,4, pendant une nuit à température ambiante . Après lavage, les plaques ont été saturées avec le tampon EIA (tampon phosphate 100 mM, pH7,4 contenant du NaCI 150 mM, 0,1% de la sérum albumine bovine (BSA) et de l'azoture de sodium 0,01%) pendant une nuit à 40C et ont été conservées à cette température jusqu'à leur utilisation. La liaison des anticorps monoclonaux sur les SAFs immobilisés a été mise en évidence à l'aide d'anticorps de chèvre anti-IgG de souris marqués à 1'AChE comme décrit précédemment (Negroni et al., 1998). Marquage des anticorps monoclonaux par I1AChE.
Les anticorps monoclonaux marqués par I1AChE sont préparés par couplage de fragments Fab' réduits avec la forme tétramérique de l'enzyme par l'intermédiaire d'un réactif hétérobifonctionnel, le succinimidyl 4-( /V-maléimidométhyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC, Calbiochem, France), comme décrit précédemment (Grassi et al., 1989). Cette méthode implique la réaction d'un groupement thîol porté par le fragment Fab1 réduit avec la fonction maléimide qui a été fixée sur l'AChE par réaction avec le SMCC.
Obtention de l'anticorps monoclonal 3B5, 11C6 et 12F10 Les anticorps monoclonaux 3B5, 11C6 et 12F10 ont été obtenus après immunisation de souris "knock-out" pour la PrP avec de la PrP humaine recombinante et criblés selon différentes techniques comme décrit dans Krasemann et al.
3B5 est un anticorps dirigé contre la PrP humaine recombinante et reconnaît le peptide 79-92. 11C6 est un anticorps qui reconnaît un épitope conformationel non identifié.
12F10 est un anticorps dirigé contre la PrP humaine recombinante et reconnaît le peptide 142-160. Obtention de l'anticorps monoclonal Bar226
L'anticorps Bar-226 a été obtenu par immunisation de souris "knock-out" pour le gène de la PrP avec de la PrP recombinante (allotype ARQ) comme décrit dans C. Feraudet, N. Morel, S. Simon, H. Volland, Y. Frobert, C. Creminon, D. Vilette, S. Lehmann, J. Grassi (2005) Screening of 145 anti PrP Monoclonal antibodies for their capacity to inhibit PrPSc Replication in Infected CeIIs J. Biol. Chem.,280, 11247-11258.
Obtention de l'anticorps monoclonal 2Al 1
L'anticorps monoclonal 2Al 1 est préparé selon le protocole décrit dans Brun et al; J. Neuroscience Research 48, 2004, 75-83. Conjugué : Anticorps monoclonal 2Al 1 - biotine
Un conjugué de l'anticorps monoclonal 2Al 1 marqué à la biotine est préparé selon le protocole décrit par Greg T. Hermanson en 1996.
Conjugué : Streptavidine marqué à la peroxydase
Un conjugué de streptavidine marqué à la peroxydase est préparé selon le protocole décrit par Greg T. Hermanson en 1996.
Fluides biologiques
Les fluides biologiques utilisés étaient des sérums ou des plasmas de moutons de races Cheviot, Romanov, Casserarde et Manech.
Température ambiante La température ambiante est définie comme une température comprise entre 18°C et 300C, inclus.
EXEMPLE 1 : Mise en œuvre du test avec différents couples d'anticorps
Des échantillons de plasma ont été prélevés sur des moutons ayant le génotype R/R, ou R/Q ou Q/Q en position 171.
65 μl de chaque échantillon de plasma de moutons ont été mélangés à 65 μl de solution dénaturante et réductrice composée d'urée 8M et de DTT 1OmM. On chauffe ensuite Ie mélange pendant 30 minutes à 500C.
100 μl du mélange obtenu sont déposés dans un puits d'une plaque de microtitrage contenant un anticorps de capture qui est soit l'anticorps 12F10, soit l'anticorps BAR233, soit l'anticorps BAR226, soit l'anticorps SAF-34, soit l'anticorps 11C6.
On effectue ensuite trois lavages des puits avec une solution de lavage contenant du tampon phosphate 10~2 M, pH 7,4 et du Tween 20 0,05 %. Après lavage, on dépose 100 μl par puits d'anticorps de détection qui est soit l'anticorps SAF-34 marqué par I1AChE lorsque l'anticorps de capture est l'anticorps 12F10 ou BAR233 ou BAR226 OU 11C6, soit l'anticorps BAR 224 marqué par I1AChE, soit l'anticorps 2Al 1 marqué à la biotine, soit l'anticorps BAR 208 marqué à la biotine, à 3 μg par litre d'anticorps par rapport au mélange final ainsi obtenu.
Les puits sont laissés à incuber une heure à 37°C. On effectue ensuite cinq lavages avec la solution de lavage contenant du tampon phosphate 10"2 M, pH 7,4 et du Tween 20 à 0,05 % en poids par rapport au poids total de la solution de lavage. Quand les anticorps marqués sont l'anticorps 2Al 1 et l'anticorps
Bar-208 marqués à la biotine, la présence de l'anticorps marqué sur la phase solide est révélée par l'addition d'un conjugué streptavidine- peroxydase à 0,2 μg/ml de mélange final Dans ce cas, on laisse incuber 30 minutes à 37°C. On effectue alors 5 lavages avec une solution de lavage contenant du tampon phosphate 10~2 M, pH 7,4 et du Tween 20 à 0,05 % en poids par rapport au poids total de la solution de lavage. 100 μl du substrat de la peroxydase plus 2 ml de solution de tétraméthylbenzidine (TMB) en tant que chromogène sont déposés dans chaque puits. On laisse incuber 30 minutes à température ambiante dans l'obscurité. On dépose 100 μl de solution d'acide sulfurique IN, en tant que solution d'arrêt, dans chaque puits. L'absorbance est mesurée à 450 nm et 620 nm.
Pour les anticorps marqués à I1AChE, après ajout de 200 μl de réactif d'Ellman (Ellman et al., 1961) dans les puits, la présence d'AChE fixée sur la phase solide est détectée par mesure de l'absorbance à 414 nm.
Les résultats obtenus sont représentés en figure 1.
On voit clairement à partir de la figure 1 que les couples d'anticorps de capture/anticorps de détection 12F10/SAF-34-AChE, BAR 226/SAF-34- AChE, 11C6/ SAF-34-AChE, SAF-34/2All-biotine permettent de différencier nettement les animaux ayant le génotype R/R en position 171 des animaux ayant le génotype R/Q et des animaux ayant le génotype Q/Q à cette même position. On constate également que les autres couples anticorps de capture/anticorps de détection ne permettent pas de discriminer entre les différents génotypes en position 171 de la protéine prion PrP.
On voit également clairement en figure 1 que l'anticorps SAF-34 qui est un anticorps ne se liant pas à une forme allélique spécifique en position 171, peut être utilisé aussi bien en tant qu'anticorps de capture qu'en tant qu'anticorps de détection. Lorsqu'il est utilisé en tant qu'anticorps de détection, il est marqué par AChE.
On constate également clairement à partir de la figure 1 que le couple permettant d'identifier avec la plus forte discrimination les animaux de génotype R/R des animaux de génotype R/Q et des animaux de génotype Q/Q en position 171 est le couple SAF-34/2A11 marqué biotine.
En effet, l'anticorps 2Al 1 ne se lie pas du tout à la forme allélique R en position 171 de la PrP.
EXEMPLE 2 : Mise en œuvre du test sur des échantillons de plasma
Des échantillons de plasma ont été prélevés sur des moutons ayant le génotype R/R ou R/H ou R/Q ou H/Q ou Q/Q, en position 171 de la PrP. 75 μl de chaque échantillon de plasma de moutons ont été mélangés à 75 μl de solution dénaturante et réductrice composée de 2 % en poids, par rapport au volume total de la solution dénaturante et réductrice, de sarcosyl, de 2 % en poids, par rapport au volume total de la solution dénaturante et réductrice, de dodécylsulfate et de dithiothréitol à 10 mM. On chauffe ensuite le mélange pendant 10 minutes à 600C.
100 μl du mélange obtenu sont déposés dans un puits d'une plaque de microtitrage contenant un anticorps de capture qui est l'anticorps SAF- 34. On effectue ensuite trois lavages des puits avec une solution de lavage contenant du tris 0,01 M, NaCI 0,3 M, pH 7,4, et 0,1 % en poids de Tween 20, par rapport au poids total de la solution de lavage.
La solution de lavage est tamponnée à pH neutre ou légèrement alcalin et contient un détergent neutre/non ionique à faible concentration (Tween 20 à 0,01 %).
Après lavage, on dépose 100 μl par puits d'anticorps de détection qui est l'anticorps 2Al 1 conjugué biotine, qui est présent à une concentration de 3 μg par litre d'anticorps par rapport au poids total du mélange final ainsi obtenu. Les puits sont laissés à incuber une heure à 37°C.
On effectue ensuite trois lavages avec la solution de lavage précédemment décrite.
La présence de l'anticorps marqué sur la phase solide est révélée par l'addition du conjugué streptavidine-peroxydase décrit au paragraphe "Matériels", à 0,2 μg/ml de mélange final.
On laisse incuber 30 minutes à 37°C.
On effectue cinq lavages avec la solution de lavage précédemment décrite.
100 μl du substrat de la peroxydase plus 2 ml de solution de tétraméthylbenzidine (TMB), en tant que chromogène, sont déposés dans chaque puits.
On laisse incuber 30 minutes à température ambiante dans l'obscurité.
On dépose 100 μl de solution d'acide sulfurique IN, en tant que solution d'arrêt, dans chaque puits.
L'absorbance (densité optique) est mesurée à 450 et 620 nm.
Les résultats obtenus sont représentés en figure 2.
La figure 2 représente la répartition des densités optiques obtenues sur les plasmas de chaque catégorie de génotypes de moutons. Comme on le voit en figure 2, le couple d'anticorps SAF-34/2A11 marqué biotine permet d'obtenir une excellente discrimination entre les différents génotypes de moutons.
EXEMPLE 3 : Mise en œuvre du test sur des échantillons de plasma avec des conditions différentes de l'exemple 2
Dans cet exemple, l'agent dénaturant est un agent chaotrope, plus précisément de l'urée 8 M. Des échantillons de plasma ont été prélevés sur des moutons ayant le génotype R/R ou R/Q ou Q/Q en position 171 de la PrP.
65 μl de chaque échantillon de plasma de moutons ont été mélangés à 65 μl de solution dénaturante et réductrice composée d'urée 8 M et de dithiothréitol 10 mM. On chauffe ensuite le mélange pendant 10 minutes à 600C.
Puis, on ajoute 130 μl de tampon EIA (Enzyme Immuno Assay) contenant un tampon phosphate de potassium 1 M, pH 7,4, NaCI 0,15 M, et 0,1 % en poids, par rapport au volume total du tampon EIA, d'albumine sérique bovine (BSA). 100 μl du mélange obtenu sont déposés dans un puits d'une plaque de microtitrage contenant un anticorps de capture qui est l'anticorps SAF- 34.
On laisse le mélange incuber une heure à 200C. On effectue ensuite trois lavages des puits avec une solution de lavage contenant du tris 0,01 M, NaCI 0,3 M, pH 7,4, et 0,1 % en poids, par rapport au volume total de la solution de lavage de Tween 20.
Après lavage, on dépose 100 μl par puits d'anticorps de détection, qui est l'anticorps 2Al 1 marqué biotine, le conjugué anticorps 2Al 1- biotine étant à une concentration de 0,5 μg/ml par rapport au mélange final ainsi obtenu.
Les puits sont laissés à incuber une heure à + 4°C. On effectue ensuite trois lavages avec la solution de lavage précédemment décrite. Après lavage, on dépose 100 μl par puits de conjugué streptavidine-peroxydase décrit au paragraphe "Matériels" à une concentration de 0,1 μg/ml dans la solution finale.
On laisse incuber 30 minutes à +200C. On effectue cinq lavages avec la solution de lavage précédemment décrite.
100 μl du substrat de la peroxydase plus 2 ml de solution de tétraméthylbenzidine (TMB) en tant que chromogène sont déposés dans chaque puits. On laisse incuber 30 minutes à température ambiante dans l'obscurité.
On dépose 100 μl de solution d'acide sulfurique IN, en tant que solution d'arrêt, dans chaque puits.
L'absorbance est mesurée à 450 et 620 nm. Les résultats obtenus sont représentés en figure 3.
En comparant les figures 2 et 3, on constate que le couple d'anticorps SAF-34/2A11 permet d'obtenir une excellente discrimination entre les différents génotypes des moutons, quelque soit la composition de la solution dénaturante et réductrice.
EXEMPLE 4 : Etude de l'influence de la présence de l'association agent dénaturant/agent réducteur
Cet exemple avait pour but d'évaluer l'importance de la présence d'un agent réducteur et d'un agent dénaturant dans la solution dénaturante et réductrice utilisée.
Pour cela, des plasmas de moutons ayant le génotype Q/Q ou R/Q ou R/R en position 171 de la PrP ont été testés selon le protocole de l'exemple 3, c'est-à-dire avec une solution contenant en tant qu'agent dénaturant de l'urée 8 M et en tant qu'agent réducteur du DTT 10 mM.
Les mêmes plasmas de moutons ont été testés avec une solution contenant uniquement un agent dénaturant, qui est l'urée 8 M.
Ces mêmes échantillons ont également été traités avec une solution ne contenant qu'un agent réducteur, le DTT 10 mM. La densité optique de chacun de ces plasmas a été mesurée à 450- 620 nm.
Les résultats obtenus sont illustrés en figure 4 où les colonnes blanches représentent les densités optiques obtenues sur les plasmas traités avec une solution contenant un agent dénaturant et un agent réducteur, les colonnes en pointillés représentent les densités obtenues sur les échantillons de fluide biologique traité avec une solution contenant uniquement un agent dénaturant et ne contenant pas d'agent réducteur et les colonnes à hachures croisées représentent les densités optiques obtenues sur les échantillons traités avec une solution contenant un agent réducteur et ne contenant pas d'agent dénaturant.
Comme on le voit en figure 4, la présence combinée d'un agent réducteur et d'un agent dénaturant (agent tensio-actif et/ou agent chaotrope) est absolument nécessaire pour discriminer les différents génotypes.
Il est à noter que l'anticorps 2Al 1 ne se liant pas à la forme allélique R en position 171 de la PrP, les résultats obtenus ne montrent pas de différence entre les tests réalisés avec une solution dénaturante comprenant ou non un agent réducteur. Les mêmes essais qu'aux exemples 1 à 4 ont été réalisés sur des sérums de moutons. Des résultats similaires ont été obtenus.
Une fois le génotype en position 171 de la protéine identifié, on pourra sélectionner les moutons destinés à la reproduction.
De préférence, on sélectionnera les moutons ayant le génotype R/R, qui sont les plus résistants à la tremblante.
Ainsi, on pourra, selon le programme, sélectionner les moutons mâles et femelles ayant ce génotype pour ne produire que des moutons de génotype R/R ou sélectionner uniquement les moutons mâles ayant le génotype R/R et les laisser se reproduire avec les femelles de tous génotypes.
Avantageusement, le procédé de l'invention pourra être mis en œuvre grâce à des trousses.
Dans un premier mode de réalisation, la trousse de l'invention comprendra: - une phase solide sur laquelle est immobilisée au moins un anticorps de capture choisi parmi les anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF- 34, SAF-35, SAF-37, 3B5, SAF-84, SHA-31, BAR-222, BAR-224, BAR-233, et 8G8, - une solution dénaturante et réductrice, et
- au moins un anticorps de détection, en particulier choisi parmi les anticorps 12F10, BAR226, 11C6, et 2Al 1, marqués et plus particulièrement le 2Al 1 marqué.
Dans un second mode de réalisation, la trousse de l'invention comprend :
- une phase solide sur laquelle est immobilisée au moins un anticorps de capture choisi parmi les anticorps 12F10, BAR-226, 11C6, et 2Al 1,
- une solution dénaturante et réductrice, et au moins un anticorps de détection choisi parmi les anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5, SAF-84, SHA-31, BAR-222, BAR-224, BAR-233 et 8G8, marqués.
De préférence, dans les trousses de l'invention, la phase solide est une plaque de microtitrage, de préférence en polystyrène.
De préférence, dans le premier mode de réalisation de la trousse de l'invention, l'anticorps de capture est l'anticorps SAF-34 ou l'anticorps 3B5 et l'anticorps de détection est l'anticorps 2Al 1.
Egalement de préférence, dans les trousses de l'invention, la solution dénaturante contient du dodécylsulfate de sodium, du dithiothréitol et du sarcosyl.
EXEMPLE 5 ; Mise en œuvre du test sur des sérums
On a étudié la répartition des densités optiques (DO) obtenues sur des sérums de moutons ayant en position 171 de la PrP, les acides aminés R/R, ou R/H, ou R/Q, ou H/Q, H/H et Q/Q selon un protocole similaire à celui décrit à I "exemple 2 sauf que l'échantillon étudié est du sérum, la concentration en DTT est de 20 Mm, l'anticorps de capture est le 3B5, l'anticorps de détection qui est le 2Al 1 est utilisé à 2,2 μg/L d'anticorps par rapport au poids total du mélange final ainsi obtenu, et la présence de l'anticorps marqué sur la phase solide est révélée par l'addition du conjugué streptavidine/peroxydase décrit au paragraphe matériel, à 0,37μg/ml_ de mélange final.
Les résultats obtenus sont représentés en figure 5.
On observe une bonne discrimination entre les différents génotypes de moutons.
EXEMPLE 6 : Etude de l'influence de la concentration de l'agent réducteur sur des échantillons de plasma
Des échantillons de plasma ont été prélevés sur des moutons ayant le génotype R/R ou R/Q ou Q/Q, en position 171 de la PrP.
75 μl de chaque échantillon de plasma de moutons ont été mélangés à 75 μl de solution dénaturante et réductrice composée de 2 % en poids, par rapport au volume total de la solution dénaturante et réductrice, de sarcosyl, de 2 % en poids, par rapport au volume total de la solution dénaturante et réductrice, de dodécylsulfate et de dithiothréitol à 10 mM, 2OmM ou 3OmM.
On chauffe ensuite le mélange pendant 10 minutes à 600C. 100 μl du mélange obtenu sont déposés dans un puits d'une plaque de microtitrage contenant un anticorps de capture qui est l'anticorps 3B5.
On effectue ensuite trois lavages des puits avec une solution de lavage contenant du tris 0,01 M, NaCI 0,3 M, pH 7,4, et 0,1 % en poids de Tween 20, par rapport au poids total de la solution de lavage.
La solution de lavage est tamponnée à pH neutre ou légèrement alcalin et contient un détergent neutre/non ionique à faible concentration (Tween 20 à 0,01 %).
Après lavage, on dépose 100 μl par puits d'anticorps de détection qui est l'anticorps 2Al 1 conjugué biotine, qui est présent à une concentration de 3 μg par litre d'anticorps par rapport au poids total du mélange final ainsi obtenu.
Les puits sont laissés à incuber une heure à 37°C. On effectue ensuite trois lavages avec la solution de lavage précédemment décrite. La présence de l'anticorps marqué sur la phase solide est révélée par l'addition du conjugué streptavidine-peroxydase décrit au paragraphe "Matériels", à 0,4 μg/ml de mélange final.
On laisse incuber 30 minutes à 37°C. On effectue cinq lavages avec la solution de lavage précédemment décrite.
100 μl du substrat de la peroxydase plus 2 ml de solution de tétraméthylbenzidine (TMB), en tant que chromogène, sont déposés dans chaque puits. On laisse incuber 30 minutes à température ambiante dans l'obscurité.
On dépose 100 μl de solution d'acide sulfurique IN, en tant que solution d'arrêt, dans chaque puits.
L'absorbance (densité optique) est mesurée à 450 et 620 nm. Les résultats obtenus sont représentés en figure 6.
On observe que la variation de concentration d'agent réducteur n'a pas d'impact significatif sur la discrimination des populations.
EXEMPLE 7 : Etude de l'influence de la concentration d'agent réducteur sur les sérums
Des échantillons de sérum ont été prélevés sur des moutons ayant le génotype R/R ou R/Q ou Q/Q, en position 171 de la PrP.
75 μl de chaque échantillon de plasma de moutons ont été mélangés à 75 μl de solution dénaturante et réductrice composée de 2 % en poids, par rapport au volume total de la solution dénaturante et réductrice, de sarcosyl, de 2 % en poids, par rapport au volume total de la solution dénaturante et réductrice, de dodécylsulfate et de dithiothréitol à 2OmM ou 3OmM. On chauffe ensuite le mélange pendant 10 minutes à 600C.
100 μl du mélange obtenu sont déposés dans un puits d'une plaque de microtitrage contenant un anticorps de capture qui est l'anticorps 3B5.
On effectue ensuite trois lavages des puits avec une solution de lavage contenant du tris 0,01 M, NaCI 0,3 M, pH 7,4, et 0,1 % en poids de Tween 20, par rapport au poids total de la solution de lavage. La solution de lavage est tamponnée à pH neutre ou légèrement alcalin et contient un détergent neutre/non ionique à faible concentration (Tween 20 à 0,01 %).
Après lavage, on dépose 100 μl par puits d'anticorps de détection qui est l'anticorps 2Al 1 conjugué biotine, qui est présent à une concentration de 2μg par litre d'anticorps par rapport au poids total du mélange final ainsi obtenu.
Les puits sont laissés à incuber une heure à 37°C.
On effectue ensuite trois lavages avec la solution de lavage précédemment décrite.
La présence de l'anticorps marqué sur la phase solide est révélée par l'addition du conjugué streptavidine-peroxydase décrit au paragraphe "Matériels", à 0,33 μg/ml de mélange final.
On laisse incuber 30 minutes à 37°C. On effectue cinq lavages avec la solution de lavage précédemment décrite.
100 μl du substrat de la peroxydase plus 2 ml de solution de tétraméthylbenzidine (TMB), en tant que chromogène, sont déposés dans chaque puits. On laisse incuber 30 minutes à température ambiante dans l'obscurité.
On dépose 100 μl de solution d'acide sulfurique IN, en tant que solution d'arrêt, dans chaque puits.
L'absorbance (densité optique) est mesurée à 450 et 620 nm. Les résultats obtenus sont représentés en figure 7.
On observe que la variation de concentration d'agent réducteur n'a pas d'impact significatif sur la discrimination des populations.
Exemple 8 : Test en aveugle
On prélève un échantillon de 195 sérums de moutons différents. On met en œuvre le protocole selon l'exemple 5 sur les 195 échantillons collectés.
On met également en œuvre le protocole selon l'exemple 5 sur des sérums dont les génotypes R/R, FVQ et Q/Q sont connus (contrôle) obtient les résultats illustrés à la figure 8.
On observe que l'on peut identifier le génotype de l'échantillon étudié de manière tout à fait avantageuse.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'identification du génotype en position 171 de la PrP d'ovin caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) traitement d'un échantillon de fluide biologique ovin à tester contenant de la PrP avec une solution dénaturante et réductrice, b) immobilisation, éventuellement par l'intermédiaire d'un ligand, de la PrP dénaturée et réduite sur une phase solide, c) mise en contact de la PrP dénaturée, réduite et immobilisée avec au moins un anticorps de détection, et d) détection de la présence éventuelle dudit au moins anticorps de détection, et dans lequel l'un du ligand et du au moins un anticorps de détection se lie spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position 171.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution dénaturante et réductrice comprend : a) au moins un agent dénaturant choisi parmi : un agent tensio-actif choisi dans le groupe constitué par :
• les tensio-actifs anioniques, tels que le SDS (dodécylsulfate de sodium), le sarcosyl (lauroyl sarcosine), le cholate de sodium, le glycocholate de sodium, le désoxycholate de sodium, le taurocholate de sodium, le caprylate de sodium, le 1-décanesulfonate de sodium, le lauryîsulfate de sodium et le laurylsulfate de lithium ;
• les tensio-actifs zwitterioniques, tels que SB 3-10 (décyl-sulfobétaïne), SB 3-12 (dodécyl-sulfobétaïne), SB 3-14 (tétradécyl-sulfobétaïne), SB 3-16 (hexadécyl-sulfobétaïne), SB 3-18 (octadécyl-sulfobétaïne), CHAPS et CHAPSO et désoxy CHAPS ;
• les tensio-actifs non ioniques, tels que le Triton X-IOO, le Triton X-114, le Tween 20, le Tween 80, le Brij 35 (polyoxyéthylène 23 lauryléther), le nonidet P-40, le n-décyl-béta-D-glucopyranoside, le n-dodécyl-béta-D- glucopyranoside, le n-octyl-béta-D-glucopyranoside, le n-octyl-alpha-D- glucopyranoside ; • leurs mélanges, et/ou
- un agent chaotrope, et b) au moins un agent réducteur.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent chaotrope est choisi parmi l'urée, la guanidine, l'hydrochlorure de guanidine et le thiocyanate de guanidine ou un de leurs mélanges.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite solution dénaturante et réductrice comprend un mélange d'agents tensio-actifs ioniques.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la solution dénaturante et réductrice contient au moins 0,5 % en poids d'agent tensio-actif par rapport au volume total du mélange constitué par l'échantillon à traiter et la solution dénaturante et réductrice.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que ledit au moins un agent réducteur est choisi dans le groupe constitué par le DTT (dithiothréitol), le TCEP (hydrochlorure de Tris(2-carboxyéthyl)phosphine), le DTE (dithio érythritol), le béta mercaptoéthanol, la 2-mercaptoéthylamine, et un de leurs mélanges.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, dans lequel la concentration en agent réducteur est comprise entre 2,5 mM et
100 mM dans le mélange constitué par l'échantillon à traiter et la solution dénaturante et réductrice.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite solution dénaturante et réductrice comprend un mélange de sarcosyl, de dodécylsulfate de sodium et de dithiothréitol.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration dans la solution dénaturante et réductrice, de l'agent chaotrope est supérieure ou égale à 1 M.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications, caractérisé en ce que l'agent chaotrope est l'urée.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel à l'étape b) la PrP dénaturée et réduite est immobilisée par l'intermédiaire d'un ligand qui est un anticorps de capture capable de retenir la PrP par liaison affine et dans lequel à l'étape c) l'anticorps de détection est un anticorps se liant spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position 171, cette position étant différente du site épitopique reconnu par l'anticorps de capture.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel à l'étape b) la PrP dénaturée et réduite est immobilisée par l'intermédiaire d'un ligand qui est un anticorps de capture se liant spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position 171 et dans lequel à l'étape c) l'anticorps de détection est un anticorps capable de se lier à la PrP par liaison affine à un site épitopique différent de celui reconnu par l'anticorps de capture.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel à l'étape b) la PrP dénaturée et réduite est immobilisée par l'intermédiaire d'un ligand choisi parmi les plasminogènes, l'avidine, la streptavidine, les glycose aminoglycans, î'hespéridine, les porphyrines, la streptamicine et la tetracycline et dans lequel à l'étape c) l'anticorps de détection est un anticorps se liant spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position 171.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel à l'étape b) la PrP dénaturée et réduite est immobilisée directement sur la phase solide, et dans lequel à l'étape c) l'anticorps de détection est un anticorps se liant spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position 171.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la phase solide est choisie parmi des plaques de microtitrage, des billes, des tubes, en polymère, en polystyrène, en polyéthylène, ou en latex, et une plaque de microtitrage en polystyrène.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'échantillon de fluide biologique est du sang, du plasma, du sérum, ou du lait.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, 13 à 16, caractérisé en ce que le ligand est un anticorps de capture choisi parmi les anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5, SAF-84, SHA-31, BAR-222, BAR-224, BAR-233, et 8G8.
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, 13 à 17, caractérisé en ce que l'anticorps de détection est choisi parmi l'anticorps 2Al 1 marqué, l'anticorps 11C6 marqué, l'anticorps BAR226 marqué, et l'anticorps 12F10 marqué.
19. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'anticorps de capture est l'anticorps SAF-34 ou l'anticorps 3B5 et l'anticorps de détection est l'anticorps 2Al 1 marqué.
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, 12, et 15 à 16, caractérisé en ce que le ligand est un anticorps de capture choisi parmi les anticorps 2Al 1, 11C6, BAR-226, et 12F10.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, 12, 15 à 16, et 20, caractérisé en ce que l'anticorps de détection est choisi parmi SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5, SAF-84, SHA-31, BAR-222, BAR-224, BAR-233, et 8G8.
22. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'anticorps de capture est choisi parmi les anticorps 2Al 1, 12F10, BAR226, et 11C6, et en ce que l'anticorps de détection est choisi parmi les anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5, SAF-84, SHA-31, BAR-222, BAR-224, BAR-233, et 8G8, marqués.
23. Procédé de criblage d'une population ovine en fonction de sa résistance aux encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.
24. Procédé de criblage d'une population ovine en fonction de sa sensibilité aux encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.
25. Trousse d'identification du génotype en position 171 de la PrP d'ovin comprenant :
- une phase solide sur laquelle est immobilisée au moins un anticorps de capture, en particulier choisi parmi les anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5, SAF-84, SHA-31, BAR-222, BAR- 224, BAR-233, et 8G8, - une solution dénaturante et réductrice, et
- au moins un anticorps de détection, en particulier choisi parmi les anticorps 12F10, BAR226, 11C6, et 2Al 1 marqués, et plus particulièrement l'anticorps 2Al 1 marqué.
26. Trousse d'identification du génotype en position 171 de la
PrP d'ovin, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une phase solide sur laquelle est immobilisée au moins un anticorps de capture, en particulier choisi parmi les anticorps 12F10, BAR226, 11C6, et 2Al 1, - une solution dénaturante et réductrice, et
- au moins un anticorps de détection, en particulier choisi parmi les anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5, SAF-84, SHA-31, BAR-222, BAR-224, BAR-233, et 8G8, marqués.
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