EP1843704A1 - Dispositif de prelevement moleculaire par contact - Google Patents

Dispositif de prelevement moleculaire par contact

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Publication number
EP1843704A1
EP1843704A1 EP06709471A EP06709471A EP1843704A1 EP 1843704 A1 EP1843704 A1 EP 1843704A1 EP 06709471 A EP06709471 A EP 06709471A EP 06709471 A EP06709471 A EP 06709471A EP 1843704 A1 EP1843704 A1 EP 1843704A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
capture
support
protuberances
zones
zone
Prior art date
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Ceased
Application number
EP06709471A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Marie-Line Cosnier
Franck Martin
Patrice Caillat
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP1843704A1 publication Critical patent/EP1843704A1/fr
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B10/00—Instruments for taking body samples for diagnostic purposes; Other methods or instruments for diagnosis, e.g. for vaccination diagnosis, sex determination or ovulation-period determination; Throat striking implements
    • A61B10/02—Instruments for taking cell samples or for biopsy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B10/00—Instruments for taking body samples for diagnostic purposes; Other methods or instruments for diagnosis, e.g. for vaccination diagnosis, sex determination or ovulation-period determination; Throat striking implements
    • A61B10/02—Instruments for taking cell samples or for biopsy
    • A61B10/0291—Instruments for taking cell samples or for biopsy for uterus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B10/00—Instruments for taking body samples for diagnostic purposes; Other methods or instruments for diagnosis, e.g. for vaccination diagnosis, sex determination or ovulation-period determination; Throat striking implements
    • A61B10/02—Instruments for taking cell samples or for biopsy
    • A61B10/04—Endoscopic instruments, e.g. catheter-type instruments
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B10/00—Instruments for taking body samples for diagnostic purposes; Other methods or instruments for diagnosis, e.g. for vaccination diagnosis, sex determination or ovulation-period determination; Throat striking implements
    • A61B10/02—Instruments for taking cell samples or for biopsy
    • A61B2010/0216—Sampling brushes

Definitions

  • the invention relates to the field of clinical diagnosis and / or noninvasive therapeutic monitoring. More particularly, the invention relates to a microscopic device for collecting molecules of biological interest by contact, which does not require ablation or biopsy, and whose architecture is such that its insertion does not cause damage to the body. surrounding tissue.
  • the invention is particularly suitable for proteomics or genomics.
  • the invention also relates to a method for determining the protein composition of the different layers of a tissue.
  • this method is suitable for mapping tumors, for example in the brain.
  • the method of sampling target molecules is crucial.
  • the existing tools for performing molecular analysis are all based on the principle of biopsy, that is to say on the collection of more or less whole cells or tissues, which will be analyzed ex situ. These techniques therefore alter the biological integrity; moreover, they can not always be used, all the more so since the very insertion of a sampling device must be minimal in certain regions, in particular for example in the brain.
  • the invention in one of its aspects aims to overcome the disadvantages of existing sampling devices.
  • Molecular imprinting is a new approach. It consists of not extracting tissues from the area of interest, but simply affixing them the sampling tool. By contact, on a suitable associated surface, many molecules, such as proteins, become trapped on the tool and can then be desorbed and analyzed ex situ.
  • the invention therefore proposes to use simple contact for the collection of molecules of biological interest: a tissue imprint is obtained on a device according to the invention, and the molecules thus recovered in a capture zone of the device can be analyzed. In particular, as the size of the device, usually plane, is reduced, the developed area of the capture area of the device according to the invention is increased so that the amount of trapped target molecules is sufficient to allow effective subsequent analysis.
  • the sampling device thus comprises a support having at least one molecular capture zone on one side.
  • the capture zone is such that its developed surface is at least three times larger than its surface when viewed from above; the ratio between developed and projected surfaces can reach a factor of twenty or more.
  • the device according to the invention is of small size and in particular "microtechnological”, that is to say that its microscopic section, less than 1 mm ⁇ 1 mm, can be achieved by methods used. in microtechnology.
  • microtechnological it should be understood that the insertion section of the device according to the invention does not exceed 1 mm 2 and, preferably, it is included in a cylinder of diameter 800 ⁇ m, by For example, it has a parallelepipedal section of the order of 300 to 600 ⁇ m over 100 to 300 ⁇ m.
  • the support may include another capture area on a face opposite to the first.
  • the device according to the invention comprises, on one or both faces, several stepped capture zones, that is to say separated by zones of interval preferably defined physically.
  • the device is breakable between the different capture zones.
  • separation means such as notches obtained by partial etching of the support, are present in the gap zones.
  • Capture areas include a bottom wall, which may delimit a cavity.
  • the bottom wall can serve as a base for the introduction of microbeads, which are maintained by a semi-permeable membrane, and / or have protrusions.
  • microtechnological techniques silicon etching for example, or plastic molding are possible, to create for example organized networks of square, hexagonal or octagonal columns of 3 to 50 microns or 80 microns, for example between 5 and 20 ⁇ m, side and height between 10 and 400 microns, for example of the order of 50 microns.
  • the capture zones are functionalized, that is to say that the walls of the support and / or the microbeads are associated with markers, which may carry affinity functions of the molecules of interest or be used. for saturation of the majority species, in which case the use of beads having ligands specific to the majority and minority species is preferred.
  • the device according to the invention is preferably associated with a handling rod and a guide sleeve which allow to position it accurately within the tissue to be analyzed.
  • the sleeve may comprise means which make it possible to put the capture zones in contact with the surrounding medium only when the device is in place.
  • the invention provides a method for performing differentiated mapping or analysis according to the depth of the target area. A device having several staged capture zones is inserted into the tissue to be analyzed, a contact sample is taken, and the molecules taken by the different capture zones are analyzed separately.
  • the capture zones can be separated from each other by section of the device, or the support of the zones of capture can be used in measuring equipment.
  • Figure 1 shows a contact pickup system according to an embodiment of the invention.
  • Figure 2 shows an embodiment of a capture area for a device according to the invention.
  • Figures 3A and 3B show, in section, another embodiment of a capture zone for a device according to the invention.
  • FIG. 4 shows another embodiment of a capture zone for a device according to the invention.
  • Figure 5 shows a functionalization of the device surface.
  • Figures 6A to 6C show different types of ball functionalization.
  • Figures 7 show different embodiments of means for separating the capture areas of a device according to the invention.
  • Figure 8 shows a method of using a device according to the invention for mapping.
  • Figure 9 shows the results of an analysis by a device according to the invention (B) and functionalized (A).
  • a sampling system 1 may comprise a guide sleeve 2, for example a catheter: the guide 2 makes it possible, among other things, to define the passageway for the sampling device. In particular, it may be put in place, possibly under optical or radiological control, beforehand in the target zone 3, for example a tumor or a tissue, in vivo or already removed, for example by biopsy.
  • the end portion 4 of the guide 2 is provided with closure means 5 which protect the sampling device 6 during its insertion and allow to bring it into contact with the tissue of interest 3 once in place.
  • the sealing means 5 are preferably located along the longitudinal axis of the guide 2, the distal end of which is closed.
  • the sealing means 5 may for example be a rotary or sliding window, or a partially absorbable membrane.
  • the sampling device 6 advantageously comprises a handling rod 7, the length of which depends on the use and the depth of insertion, and which can slide in the guide 2.
  • the end portion 8 of the rod 7 is intended to to the sample itself.
  • the guide 2 and therefore the manipulation rod 7 have a very small diameter so as not to alter the tissue 3, and allow non-invasive procedures in a patient.
  • the rod 7 may have a diameter restricted to a few millimeters, or even 100 microns; the guide 2 has an outer diameter close to the diameter of the rod 7.
  • the rod may, for example, be of surgical stainless steel.
  • the amount of fluid removed must be sufficient to allow the extraction of information on the tissue nature.
  • the use of a simple needle 7 of small diameter does not allow a subsequent efficient analysis because of the small amount of target molecules trapped on its surface, which is reduced even if machining is performed.
  • the sampling system 1 can be used without restriction, in particular also in the brain, and therefore the device 6 is included in a cylinder with a diameter of the order of 995 ⁇ m or less.
  • the end portion 8 of the sampling device 6 has at least one capture zone 10, the developed surface of which is very thin. greater than the normal surface, from 3 to more than 20 times, which reduces the size of the device 6 while maintaining the sample in adequate proportions.
  • the sampling device 6 thus comprises a support 12 which is preferably independent of the handling rod 7 at the end of which
  • the support 12 is preferably made of a biocompatible material, in particular silicon as specified below; the different elements making up the guide sleeve 2 are also compatible with a biological and / or medical use, for example in gold or plastic, ....
  • the support 12 may be of any shape, but advantageously it is plane, in the form of a plate, as will be apparent from the description of the manufacturing processes. Whatever the case, it is possible to define on the support 12 a first face 14 and a second opposite face 16: in the case of a non-planar support 12, the terms "face” and “opposite face” designate portions of the outer surface of the support
  • the faces 14, 16 are included in a support 12 which is of the order of 1 to 3 cm long (in the direction of the rod) on a width from 300 to 800 ⁇ m, for a thickness of the order of 200 to 400 ⁇ m.
  • the first face 14 of the support 12 is provided with a capture zone 10; it is preferable that the capture zone 10 leaves a proximal end portion 8 sufficiently long, for example from 2 to 5 mm, to allow easy attachment to the rod 7.
  • a preferred embodiment P relates to a support 12 rectangular silicon of dimensions 300 ⁇ m ⁇ 600 ⁇ m ⁇ 2 cm, the structured zone 10 starting at 3.2 mm from the edge secured to the rod 7.
  • capture zones 10a, 10b, 10c, 10d are present on the face 14 of the support 12, separated by zones of interval 18.
  • four capture zones are present , but it is clear that their number depends on the use, in particular the size of the device 6, the size of the target zone 3 and the concentration of molecules of interest in this zone 3, as well as the surface area. developed capture areas 10 and the manufacturing process.
  • the zones of interval 18 may be only "virtual", that is to say that the capture zones 10 are a priori confused at the macroscopic level, but that means make it possible to distinguish them at the microscopic level. or even to separate them.
  • capture zones 20 are placed on the second face 16.
  • the second capture zones 20 are in alignment and in opposition with the first zones 10.
  • the second capture zones 20 may be identical in nature and geometry to the first zones 10, or different, as shown diagrammatically in FIG. 1: the various embodiments presented below may be combined .
  • the developed area of each of the capture areas 10, 20 is greater than three times the planar area of the capture area 10, 20.
  • An embodiment is shown in Fig. 2.
  • the capture zone 10 comprises a bottom wall 22.
  • the bottom wall 22 may be located on the support 12, or may delimit a cavity therein (see FIG. 4).
  • the bottom wall 22 has a surface _s, and has a plurality of protuberances 24.
  • the height of the protuberances 24 is identical to the depth of the cavity, but it is possible that they are salient.
  • the surface of the support 12 is uniform, preferably plane, with the exception of the capture zones 10, and any separation means
  • the developed area _S of the capture zone 10 is therefore equal to the surface _s of the bottom wall 22 to which is added the surface of each of the lateral walls of the protuberances 24.
  • the surfaces satisfy the relation: S> 3.
  • the factor 3 may advantageously take the values 5 or 10 for example.
  • the protuberances 24 can take any desired geometry, for example square columns or hexagonal section. Preferably, the protuberances 24 are arranged in a regular manner, for example in a square or hexagonal mesh network. According to the preferred embodiment P, the surface pattern is in the form of octagonal spikes 24 of silicon, 50 ⁇ m high and 20 or 80 ⁇ m wide.
  • the support 12 is made of plastic, it is possible to use injection techniques or hot stamping ("hot embossing"), which allow to obtain by replication additional mold parts previously produced. It will thus be possible to produce protrusions 24 of 20 ⁇ m on a side, at a height of 50 ⁇ m at low cost, on a support 12 made of polyethylene, or poly (methyl) methacrylate (PMMA), or polycarbonate, or polydimethylsiloxane (PDMS), or parylene, or Teflon TM; an option is also to deposit one of these materials, including parylene or Teflon TM, on a plastic surface, or even metal, to make it biocompatible.
  • hot embossing injection techniques or hot stamping
  • microtechnology techniques For example, the method described with reference to FIG. 7 of document FR-A-2 846 957 may be used; the process described in this document is however, simplified because only the support 12 is machined: there is no formation of supply channels and / or hood sealing. Such a method makes it possible to obtain protuberances 24 of 5 ⁇ m per side over a height of 100 ⁇ m on a support 12 made of silicon.
  • the protrusions 24 can be 5 to 20 microns (even if sizes up to 80 or 100 microns can also be made in this way) aside for 50 to 400 microns in depth; the machining of the support 12 is such that at the end of the process, the device is biocompatible.
  • a support 12 of silicon is oxidized to be coated with SiO 2 , biocompatible behavior similar to glass.
  • microbeads 28 are commonly used in microbiology; they conventionally have a diameter of the order of ten nanometers up to a hundred microns, and may be composed of glass, porous or not, which allows them to be functionalized and remain biocompatible. According to the embodiment of the capture zone 10 and the positioning of the protuberances 24, as explained in the document FR-A-2 846 957, it is possible to achieve an alignment of the balls 28 in the spaces 26 between the protuberances 24 ( Figure 3B), which facilitates the quantification of the developed surface.
  • the spaces 26 between the protuberances have a width less than 50 microns.
  • any other embodiment is possible, including random packing. It is also possible to size the spaces 26 so that first balls 28 are precisely located and second balls 28 'of smaller diameter can then be put in place (Figure 3A).
  • the microbeads 28 increase the developed area of the capture zone 10 significantly. It may be advantageous in this case not to have protrusions 24, but capture areas 30 composed of cups 32 filled with balls 28, as shown diagrammatically in FIG. 4.
  • the cups 32 of the capture zones 30 can be made by example by microtechnological etching of the support 12, or by transfer of a mesh of walls 34, or by molding plastic material. They are then filled with microbeads 28, advantageously calibrated.
  • porous membrane 36 In the presence of microbeads as in FIGS. 3 and 4, it is advantageous to maintain the balls 28 in place by a porous membrane 36.
  • the porous film 36 is chosen so as to leave the molecules of interest to migrate within the capture zone 10, 30. It is possible to use commercial polycarbonate filters with a porosity of less than 1 ⁇ m which can be glued to the cavities by screen printing (for example Dynamask TM, from the Dynatech company) ), or dry films of photoresist (such as Ordyl TM from Elga) which is photolithographically insulated to achieve porosity; this technique is more suitable for balls 28 with a diameter greater than 1 ⁇ m.
  • the modified support will undergo one or more post - silanization reactions until it is obtained. the latter.
  • the coupling function A corresponds to the set of existing organic and mineral functions such as the functions: CH 3 , alkenes, alkynes, aryl derivatives, halogens (Br, Cl, I, F), organometallic derivatives, alcohols, phenols, diols , ethers, epoxies, carbonyl derivatives (aldehydes, ketones, carboxylic acids, carboxylates, esters, amides, acid chlorides, acid anhydrides), nitrogen derivatives (Amines, nitrates, diazos, imines, enamines, oximes, nitriles), phosphorus derivatives (phosphines, phosphites, phosphates, phosphonates), silicon derivatives, sulfur derivatives (sulphides, disulfides, thiols, thioethers, sulphones, sulphites, sulfates, sulfonic acids, sulfonates, azasulf
  • a spacer group E, used between the two functions A, Y of the coupling agent, makes it possible to confer particular properties on the film obtained by silanization.
  • the group E is chosen from among the radicals making it possible to obtain an organized monolayer: a long chain alkylene radical E allows interchain interaction (among the radicals E of the alkylene type, those having from 8 to 24 atoms are particularly preferred.
  • a radical E comprising two triple bonds -C C- allows crosslinking; a radical E comprising a conjugated aromatic chain confers nonlinear optical properties (for example, mention may be made of the phenylene-vinylene and phenylene-acetylene radicals); a radical E of the pyrrole, thiophene or polysilane type confers an electronic conduction; a radical E of the heterosubstituted polyaromatic type confers photo / electroluminescence properties (for example, mention may be made of quinones and diazo compounds); a group E of the alkyl or fluoroalkyl type, in particular an alkyl or fluoroalkyl group having from 3 to 24 carbon atoms, makes it possible to use the layers obtained by chromatography or electrophoresis. Regarding the functionalization of the beads, the same principle is used.
  • the surface ester functions located on the tool will react with functionalized beads bearing primary hydroxyl function. After the immobilization of the balls 28, the tool has a hydrophilic developed surface (FIG. 6A).
  • n types of beads 28 each carrying a specific ligand are prepared in n specimens n types of beads 28 each carrying a specific ligand, to mix them, and then to fix them to the tool via ligand Y (NH 2 for Figure 6B).
  • Another option is to mix n specific types of ligands and fix them on a tool previously functionalized with beads (FIG. 6C).
  • the sampling device 6 has several capture areas 10i (see FIG. 1), it is possible to use the same functions on each capture zone, or to perform a spatial differentiation, for example by the known localized spotting ("spotting”) for DNA chips.
  • the supports 12 may be divisible for each of the preceding embodiments.
  • the gap zones 18 between the capture zones 10, 30 are provided with separation means.
  • notches may have been etched together with the production of protuberances 24 and / or walls 34: FIGS. 7.
  • the gap areas 18, 34 can then be easily cut.
  • Different embodiments can be envisaged: for example, it is possible to carry out a cleavage primer 42 by etching the support 12 on the face 16 opposite to the face 14 comprising the capture zones 10, by mask and etching for example (FIG. 7A ). It is also possible to make this notch 44 on the "front" face 14, or to choose, for example, an isotropic chemical etching, for example KOH (FIG. 7B).
  • the zones of interval are composed of walls 34. It may be desirable in this case also to define notches cleavage 46 on the rear face below the walls 34: FIG. 7C.
  • capture zones 10, 20 are present on each face 14, 16, it is possible to position separation means only on one of the faces (FIG. 7D), or both (FIG. 7E).
  • Two embodiments can be noted in this regard for the devices comprising capture zones 10, 20 on each of their opposite faces 14, 16: a support 12 (FIG. 7D) or bonding of two supports 12, 12 '(FIG. 7E ).
  • notches 42, 44, 46 can be used interchangeably and in combination.
  • a silicon wafer 100 mm in diameter is machined to obtain 142 end devices after cutting.
  • the support 12 made of silicon is advantageously marked: In particular, the name of the device, alignment crosses, cutting marks, etc. are engraved, for example at 500 nm, by photolithography with a mask and dry etching.
  • the rear face undergoes a similar treatment (photolithography with mask aligned with the previous one, dry etching of 5 to 10 ⁇ m, removal of the resin from the mask) to form the notches 46.
  • the front face is then drawn and etched for microstructuring, with photolithography with aligned mask, 50 ⁇ m deep dry etching and resin removal.
  • the surfaces are then prepared to allow their biological and / or medical use: in particular the polymer (for example C 4 F 8 ) formed on the flanks of the cavities during etching is removed, by total deoxidation, followed by wet oxidation. over 100 nm, then complete deoxidation; a final SiO 2 layer is obtained by wet oxidation over 500 nm.
  • the guide 2 is first put in place, preferably under control in the target zone 3; the support 12 is glued at the end of the rod 7.
  • the rod 7 is inserted into the guide 2, under optical control also to ensure the accuracy of its positioning, and in particular to determine the areas A, B, C, D of the tumor 3 corresponding to each of the capture zones 10a-10d.
  • the closure means 5 are open, and the sampling is done by apposition; no manipulation of the device itself is not necessary, the contact area of the capture areas 10 being directly accessible (without cover for example). This also allows a miniaturization of the assembly, including the support 12.
  • the closure means 5 can then optionally be closed.
  • the rod 7 is then removed from the guide 2, the support 12 is detached, and the capture areas 10a-10d can be analyzed. Two approaches to the treatment of the sample taken can be implemented during the analysis:
  • the device 6 is breakable, and each zone 10a-10d is treated independently.
  • the support 12 is broken and the different zones 10a-10d are introduced into washing and extraction tubes 50a-50d.
  • the molecules A, B, C, D thus extracted can be stored in a data bank and / or deposited on a bar for analysis, for example a Ciphergen® bar used in particular to perform a mass spectrometric analysis for a proteomic analysis. like SELDI-TOFF®.
  • the support 12 itself which serves as a substrate for the final analysis device 60, for example by laser assisted direct desorption. Whichever approach is chosen, one can obtain a map of the tissue of interest, and Protein composition versus depth in the target area 3.
  • the sample is not very invasive: in particular, the apparent diameter of the device 6, and even of the system 1, is reduced, in particular to a few millimeters, preferably 1 mm, while retaining a strong surface developed to capture enough target molecules;
  • the sample is not aggressive: it is done by contact (or "apposition") without tissue section 3; - The portion of the machined device and actually used for sampling is reduced and covers only the support 12, which can be associated with a low cost manipulation rod 7;
  • the machining of the sampling portion 12 is reduced to the manufacture of the contact areas 10, 20, 30, without other mechanical elements or additional steps of sealing or gluing;
  • the large developed area of the capture zones 10, 20, 30 compensates for the miniaturization and allows reliable analyzes
  • the device 6 can be used in operative procedure in vivo or post-operatively, or in vitro on a tissue removed and requesting molecular analysis; the presence of staged capture zones 10a-IOd makes it possible to analyze after imprint the distribution of the molecules of interest in the sampling zone 3;
  • each capture zone 10, 30 may be functionalized according to the targeted molecules and / or the type of final analysis (genomic, proteomic);
  • each capture zone 10a-10d can be separated from the others and be analyzed by a specific technique
  • the support of the device 12 may be compatible with any subsequent analysis equipment, for example it may comprise a specific matrix for mass spectrography;
  • a mapping according to the depth axis of the zone 3 analyzed can be established according to the successive active zones A-D differentiated along the device; the stereoscopic operating method indeed makes it possible to precisely guide the device 6 and to know exactly which A-D region has been probed.
  • the previous device P (Si support 600 ⁇ 300 ⁇ m 2 , with 24 octagonal protuberances) was silanized and then functionalized to give the carboxylate function. Indeed, physiological pH, biological systems including proteins are naturally charged; ionic interactions
  • the acid function is protected in the form of a methyl ester after reaction of undecenoic acid with sulfuric acid and methanol; the incorporation of the silyl group is carried out conventionally by a hydrosilylation reaction.
  • a methyl ester of 10-undec-1-enoic acid is manufactured to form the methyl ester of trimethoxysilylundecan-10-oic acid by the following method: - A solution of undecenoic acid ( 98%) (10.47 g, 11.5 mL, 56 mmol) dissolved in 500 mL of methanol is treated with concentrated sulfuric acid (12.88 g, 7 mL, 131 mmol, 2.3 equiv). . The reaction is carried out at 0 ° C. for 4 hours.
  • the hydroxylation of the silicon substrate coated with a thermal oxide layer of 500 nm is carried out in a 3.5 M sodium hydroxide solution for 2 hours, with a silanizing solution of concentration 10 -2 M in anhydrous trichlorethylene, the silanization reactions being carried out at a controlled temperature of 20 ° C. for 24 hours.
  • the modified support is contacted with a solution of aluminum iodide to release the carboxylic acid function, which in turn will react with an aqueous sodium hydroxide solution to give the corresponding carboxylate function.
  • This device was used for mass analysis on a brain tumor (glioma), obtained after excision.
  • the fabric is affixed to the tool and after rinsing and depositing the matrix, the analysis is carried out directly on the surface.

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Abstract

Un dispositif (6) de prélèvement de molécules d'intérêt biologique est décrit. Le dispositif (6) comprend des zones de capture (10) dont la surface développée est très supérieure à la surface de sorte que le prélèvement par contact permet d' obtenir une quantité suffisante de molécules pour aboutir à une analyse fiable, tout en étant de dimensions telles que le dispositif (6) n'est ni invasif, ni agressif . En particulier, le dispositif comprend des zones de captures (10) étagées localisées sur un support (12) manufacturé selon des techniques de microtechnologie ; les zones de capture (10) peuvent avantageusement être fonctionnalisées.

Description

DISPOSITIF DE PRELEVEMENT MOLECULAIRE PAR CONTACT
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQtJE
L' invention concerne le domaine du diagnostic clinique et/ou du suivi thérapeutique non invasifs . Plus particulièrement , l' invention se rapporte à un dispositif microscopique de prélèvement de molécules d' intérêt biologique par contact , qui ne nécessite pas d' ablation ni de biopsie, et dont l' architecture est telle que son insertion ne cause pas de dommage au tissu environnant . L' invention est notamment adaptée à la protéomique ou la génomique .
L' invention concerne également un procédé permettant la détermination de la composition protéique des différentes couches d' un tissu . En particulier, ce procédé est adapté à la cartographie de tumeurs , par exemple dans le cerveau .
ÉTAT DE LA TECHNIQtJE ANTERIEtJRE
Tout comme la chirurgie tend à être de moins en moins invasive, les techniques de diagnostic clinique et de suivi thérapeutique tendent à la miniaturisation des outils nécessaires aux divers prélèvements et contrôles .
Les progrès de l' imagerie ont fortement contribué à cette évolution à travers , par exemple, deux voies , en particulier en cancérologie : amélioration de la limite de détection de tumeurs cancéreuses , aide accrue pour le chirurgien grâce à l' utilisation systématique de méthodologies de repérage et d' assistance au positionnement .
Parallèlement , la biologie moléculaire, que ce soit au niveau de la génomique ou de la protéomique, est de plus en plus associée à l' établissement d' un diagnostic . En fait , il est envisagé de remplacer dans certains cas l' oeil de l' anatomopathologiste par une méthode d' analyse moléculaire , et de nombreux développements ont lieu dans les domaines de la protéomique et de l' analyse de masse associée pour identifier et caractériser des marqueurs biologiques .
Il n' en reste pas moins que la méthode de prélèvement des molécules cibles est cruciale . Or les outils existants permettant de faire de l' analyse moléculaire sont tous basés sur le principe de la biopsie, c' est-à-dire sur le prélèvement de cellules ou de tissus plus ou moins entiers , qui seront analysés ex situ . Ces techniques altèrent donc l' intégrité biologique ; de plus , elles ne peuvent pas toujours être utilisées , d' autant plus que l' insertion même d' un dispositif de prélèvement doit être minimale dans certaines régions , en particulier par exemple dans le cerveau .
EXPOSÉ DE I/ INVENTION
L' invention sous l' un de ses aspects vise à pallier les inconvénients des dispositifs de prélèvement existants .
L' empreinte moléculaire est une nouvelle approche . Elle consiste à non plus extraire des tissus de la zone d' intérêt mais à simplement y apposer l' outil de prélèvement . Par contact , sur une surface associée adaptée, de nombreuses molécules , comme les protéines , se retrouvent piégées sur l' outil et peuvent ensuite être désorbées et analysées ex situ . L' invention se propose donc d' utiliser le simple contact pour le prélèvement de molécules d' intérêt biologique : une empreinte du tissu est obtenue sur un dispositif selon l' invention, et les molécules ainsi récupérées dans une zone de capture du dispositif peuvent être analysées . En particulier, comme la taille du dispositif, habituellement plan, est réduite, la surface développée de la zone de capture du dispositif selon l' invention est augmentée de sorte que la quantité de molécules cibles piégées soit suffisante pour permettre une analyse ultérieure efficace .
Le dispositif de prélèvement selon l' invention comprend ainsi un support ayant au moins une zone de capture moléculaire sur une face . La zone de capture est telle que sa surface développée est au moins trois fois plus grande que sa surface en vue de dessus ; le rapport entre les surfaces développée et projetée peut atteindre un facteur vingt , voire plus .
Au vu de son utilisation, le dispositif selon l' invention est de taille restreinte et notamment « microtechnologique », c ' est-à-dire que sa section, microscopique, inférieure à 1 mm x 1 mm, peut être réalisée par des procédés utilisés en microtechnologie . En particulier, par « microtechnologique », il faut comprendre que la section d' insertion du dispositif selon l' invention n' excède pas 1 mm2 et de préférence, il est inclus dans un cylindre de diamètre 800 μm, par exemple il est à section parallélépipédique de l' ordre de 300 à 600 μm sur 100 à 300 μm.
Le support peut comprendre une autre zone de capture sur une face opposée à la première . Avantageusement , le dispositif selon l' invention comprend, sur une face ou les deux, plusieurs zones de capture étagées , c' est-à-dire séparées par des zones d' intervalle définies de préférence matériellement . Ainsi, il est possible d' analyser les molécules présentes à différentes profondeurs dans le tissu où le dispositif a été inséré .
De préférence, le dispositif est sécable entre les différentes zones de capture . Par exemple, des moyens de séparation, comme des encoches obtenues par gravure partielle du support , sont présents dans les zones d' intervalle .
Différents modes de réalisation sont prévus pour les zones de capture . Les zones de capture comprennent une paroi de fond, qui peut délimiter une cavité . Pour augmenter la surface développée, la paroi de fond peut servir de base à la mise en place de microbilles , qui y sont maintenues par une membrane semi-perméable, et/ou présenter des protubérances . Pour réaliser ces protubérances , les techniques microtechnologiques , de gravure sur silicium par exemple, ou de moulage plastique sont possibles , afin de créer par exemple des réseaux organisés de colonnes carrées , hexagonales ou octogonales de 3 à 50 μm ou 80 μm, par exemple entre 5 et 20 μm, de côté et de hauteur comprise entre 10 et 400 μm, par exemple de l' ordre de 50 μm.
De façon avantageuse, les zones de capture sont fonctionnalisées , c' est-à-dire que les parois du support et/ou les microbilles sont associées à des marqueurs , qui peuvent porter des fonctions d' affinité des molécules d' intérêt ou être utilisés pour une saturation des espèces majoritaires , auquel cas l' utilisation de billes possédant des ligands spécifiques aux espèces majoritaire et minoritaire est préférée .
Le dispositif selon l' invention est de préférence associé à une tige de manipulation et un manchon de guidage qui permettent de le positionner avec précision au sein du tissu à analyser . En particulier, le manchon peut comprendre des moyens qui permettent de ne mettre les zones de capture en contact avec le milieu environnant que lorsque le dispositif est en place . Sous un autre aspect , l' invention concerne un procédé permettant de réaliser une cartographie ou une analyse différenciée selon la profondeur de la zone cible . Un dispositif possédant plusieurs zones de capture étagées est inséré dans le tissu à analyser, un prélèvement par contact est effectué, et les molécules prélevées par les différentes zones de capture sont analysées séparément .
Pour réaliser les analyses , les zones de capture peuvent être séparées les unes des autres par section du dispositif, ou le support des zones de capture peut être utilisé dans l' appareillage de mesure .
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
Les caractéristiques et avantages de l' invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre et en référence aux dessins annexés , donnés à titre illustratif et nullement limitatifs .
La figure 1 représente un système de prélèvement par contact selon un mode de réalisation de 1' invention .
La figure 2 montre un mode de réalisation d' une zone de capture pour un dispositif selon 1' invention . Les figures 3A et 3B montrent , en coupe, un autre mode de réalisation d' une zone de capture pour un dispositif selon l' invention .
La figure 4 présente un autre mode de réalisation d' une zone de capture pour un dispositif selon l' invention .
La figure 5 montre une fonctionnalisation de la surface du dispositif .
Les figures 6A à 6C montrent différents types de fonctionnalisation par billes . Les figures 7 montrent différents modes de réalisation de moyens pour séparer les zones de capture d' un dispositif selon l' invention .
La figure 8 présente un procédé d' utilisation d' un dispositif selon l' invention pour une cartographie . La figure 9 montre les résultats d' une analyse par un dispositif selon l' invention (B) et fonctionnalisé (A) .
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS
La biochimie moléculaire, par exemple la génomique ou surtout la protéomique, à savoir l' étude des ensembles de protéines , permet d' analyser des composants individuels d' intérêt , en particulier biologique . Ainsi, un système de prélèvement 1 selon l' invention, schématisé en figure 1 , peut comprendre un manchon de guidage 2 , par exemple un cathéter : le guide 2 permet entre autres de définir la voie de passage du dispositif de prélèvement . On peut en particulier le mettre en place, éventuellement sous contrôle optique ou radiologique, préalablement dans la zone cible 3 , par exemple une tumeur ou un tissu, in vivo ou déjà prélevée, par exemple par biopsie . Avantageusement , la partie d' extrémité 4 du guide 2 est munie de moyens d' obturation 5 qui protègent le dispositif de prélèvement 6 lors de son insertion et permettent de le mettre en contact avec le tissu d' intérêt 3 une fois en place . Dans le cadre de l' invention, les moyens d' obturation 5 sont de préférence localisés le long de l' axe longitudinal du guide 2 dont l' extrémité distale est fermée . Les moyens d' obturation 5 peuvent par exemple être une fenêtre rotative ou coulissante, ou une membrane résorbable partiellement . Le dispositif de prélèvement 6 comprend avantageusement une tige de manipulation 7 , dont la longueur dépend de l' utilisation et de la profondeur d' insertion, et qui peut coulisser dans le guide 2. La partie d' extrémité 8 de la tige 7 est destinée au prélèvement proprement dit . Avantageusement , le guide 2 et donc la tige de manipulation 7 ont un diamètre très faible de façon à ne pas altérer le tissu 3 , et à permettre des interventions non invasives chez un patient . Ainsi, la tige 7 peut avoir un diamètre restreint à quelques millimètres , voire 100 μm ; le guide 2 a un diamètre externe voisin du diamètre de la tige 7. La tige peut , par exemple, être en acier inoxydable chirurgical . Cependant , pour des analyses fines et précises de composés présents de façon minoritaire dans la zone d' intérêt 3 , comme des molécules , la quantité de fluide prélevé doit être suffisante pour permettre l' extraction d' informations quant à la nature tissulaire . En particulier, l' utilisation d' une simple aiguille 7 de petit diamètre ne permet pas une analyse ultérieure efficace en raison de la faible quantité de molécules cibles piégées sur sa surface, qui est réduite même si un usinage est réalisé . Or selon l' invention, le système de prélèvement 1 peut être utilisé sans restriction, en particulier également dans le cerveau, et donc le dispositif 6 est inclus dans un cylindre de diamètre de l' ordre de 995 μm, voire moins .
Selon l' invention, la partie d' extrémité 8 du dispositif de prélèvement 6 possède au moins une zone de capture 10 dont la surface développée est très supérieure à la surface normale , de 3 à plus de 20 fois , ce qui permet de diminuer la taille du dispositif 6 tout en maintenant le prélèvement dans des proportions adéquates . Le dispositif de prélèvement 6 comprend ainsi un support 12 qui est de préférence indépendant de la tige de manipulation 7 à l' extrémité de laquelle
11 peut être solidarisé, par exemple par collage de préférence par une colle biocompatible . Ceci permet notamment de séparer les procédés de fabrication des deux parties de manipulation et de prélèvement , et d' utiliser une tige biocompatible 7 classique de faible coût . Le support 12 est fabriqué de préférence en un matériau biocompatible, notamment le silicium tel que précisé plus loin ; les différents éléments composant le manchon de guidage 2 sont eux aussi compatibles avec un usage biologique et/ou médical, par exemple en or ou en plastique, ....
Le support 12 peut être de forme quelconque, mais avantageusement il est plan, sous forme de plaque, tel qu' il apparaîtra à la description des procédés de fabrication . Quoi qu' il en soit , on peut définir sur le support 12 une première face 14 et une deuxième face opposée 16 : dans le cas d' un support 12 non plan, les termes « face » et « face opposée » désignent des portions de la surface externe du support
12 qui sont symétriques par rapport à un plan sécant du support 12. Avantageusement , les faces 14 , 16 sont comprises dans un support 12 qui fait de l' ordre de 1 à 3 cm de long (dans le sens de la tige) sur une largeur de 300 à 800 μm, pour une épaisseur de l' ordre de 200 à 400 μm.
La première face 14 du support 12 est munie d' une zone de capture 10 ; il est préférable que la zone de capture 10 laisse une partie proximale d' extrémité 8 suffisamment longue, par exemple de 2 à 5 mm, pour permettre une solidarisation aisée avec la tige 7. Ainsi, un mode de réalisation préféré P concerne un support 12 en silicium, rectangulaire de dimensions 300 μm x 600 μm x 2 cm, la zone structurée 10 commençant à 3 , 2 mm du bord solidarisé à la tige 7.
De façon préférée, et tel que schématisé, plusieurs zones de capture 10a, 10b, 10c, 1Od sont présentes sur la face 14 du support 12 , séparées par des zones d' intervalle 18. Dans le cadre représenté, quatre zones de capture sont présentes , mais il est clair que leur nombre dépend de l' utilisation, en particulier de la taille du dispositif 6 , de la taille de la zone cible 3 et de la concentration de molécules d' intérêt dans cette zone 3 , ainsi que de la surface développée des zones de capture 10 et du procédé de fabrication . De même, les zones d' intervalle 18 peuvent n' être que « virtuelles », c ' est-à-dire que les zones de capture 10 sont confondues a priori au niveau macroscopique, mais que des moyens permettent de les distinguer au niveau microscopique, voire de les séparer .
Il est possible aussi que des zones de capture 20 soient placées sur la deuxième face 16. De façon préférée, et tel qu' il apparaîtra plus clairement plus loin, les deuxièmes zones de capture 20 sont alignées et en opposition avec les premières zones 10. Les deuxièmes zones de capture 20 peuvent être de nature et géométrie identiques aux premières zones 10 , ou différentes , tel que schématisé dans la figure 1 : les divers modes de réalisation présentés plus loin peuvent être combinés .
La surface développée de chacune des zones de capture 10 , 20 est supérieure à trois fois la surface plane de la zone de capture 10 , 20. Un mode de réalisation est présenté sur la figure 2.
La zone de capture 10 comprend une paroi de fond 22. Suivant le mode de fabrication, la paroi de fond 22 peut être localisée sur le support 12 , ou peut y délimiter une cavité (voir figure 4 ) . La paroi de fond 22 a une surface _s , et présente une pluralité de protubérances 24. De préférence, si la zone de capture comprend une cavité, la hauteur des protubérances 24 est identique à la profondeur de la cavité, mais il est possible qu' elles soient saillantes . Par ailleurs , il est préférable que la surface du support 12 soit uniforme, de préférence plane, à l' exception des zones de capture 10 , et des éventuels moyens de séparation
(décrits plus loin) . En effet , une telle surface plane peut plus aisément être analysée par exemple lors d' une désorption laser en analyse de masse au vu de l' uniformité de l' énergie d' impact .
La surface développée _S de la zone de capture 10 est donc égale à la surface _s de la paroi de fond 22 à laquelle s ' ajoute la surface de chacune des parois latérales des protubérances 24. Selon l' invention, les surfaces vérifient la relation : S > 3. s , le facteur 3 pouvant avantageusement prendre les valeurs 5 ou 10 par exemple .
Les protubérances 24 peuvent prendre toute géométrie désirée, par exemple des colonnes carrées ou à section hexagonale . De préférence, les protubérances 24 sont arrangées de façon régulière, par exemple en réseau à mailles carrées ou hexagonales . Selon le mode de réalisation préféré P , la structuration de surface se présente sous la forme de picots octogonaux 24 de silicium, de 50 μm de hauteur et 20 ou 80 μm de largeur .
Différents procédés de fabrication sont envisageables pour de telles zones de capture 10 : par exemple, si le support 12 est en plastique, il est possible d' utiliser des techniques d' injection ou d' empreinte à chaud (« hot embossing ») , qui permettent d' obtenir par réplication des pièces complémentaires de moules réalisés préalablement . On pourra ainsi fabriquer des protubérances 24 de 20 μm de côté, sur une hauteur de 50 μm à bas coût , sur un support 12 en polyéthylène, ou poly (méthyl) métacrylate (PMMA) , ou polycarbonate, ou polydiméthylsiloxane (PDMS ) , ou parylène, ou Téflon™ ; une option est également de déposer un de ces matériaux, notamment le parylène ou le Téflon™, sur une surface plastique, voire métallique, quelconque afin de la rendre biocompatible .
Si un rapport surface/volume plus élevé est souhaité, il est possible d' utiliser des techniques de microtechnologie . Par exemple, le procédé décrit en référence aux figures 7 du document FR-A-2 846 957 peut être utilisé ; le procédé décrit dans ce document est cependant simplifié car seul le support 12 est usiné : il n' y a pas de formation de canaux d' alimentation et/ou de scellement de capot . Un tel procédé permet d' obtenir des protubérances 24 de 5 μm de côté sur une hauteur de 100 μm sur un support 12 en silicium. Plus généralement , les protubérances 24 peuvent faire de 5 à 20 μm (même si des tailles jusque 80 ou 100 μm peuvent aussi être réalisées de cette manière) de côté pour 50 à 400 μm de profondeur ; l' usinage du support 12 est tel qu' en fin de procédé, le dispositif soit biocompatible . En particulier, un support 12 en silicium est oxydé pour être revêtu de SiO2, de comportement biocompatible analogue au verre .
Pour réaliser des zones de capture 10 , 20 sur les deux faces opposées du support 12 , il est possible par exemple de coller deux supports 12 , 12 ' réalisés comme précédemment (voir figure 7E) , ou de fabriquer un module double face par les techniques microtechnologiques sur silicium ou de moulage plastique ( figure 7D) .
Afin d' augmenter encore la surface développée de la zone de capture 10 , il est possible de remplir les espaces 26 entre les protubérances 24 par des microbilles 28. Les microbilles 28 sont utilisées de façon courante en microbiologie ; elles ont classiquement un diamètre de l' ordre d' une dizaine de nanomètres jusqu' à une centaine de microns , et peuvent être composées de verre, poreux ou non, ce qui leur permet d' être fonctionnalisées et de rester biocompatibles . Suivant le mode de réalisation de la zone de capture 10 et le positionnement des protubérances 24 , tel qu' expliqué dans le document FR-A-2 846 957 , il est possible d' aboutir à un alignement des billes 28 dans les espaces 26 entre les protubérances 24 ( figure 3B) , ce qui facilite la quantification de la surface développée . Par exemple, les espaces 26 entre les protubérances ont une largeur inférieure à 50 μm. Cependant , tout autre mode de réalisation est possible, avec notamment un entassement au hasard . Il est possible également de dimensionner les espaces 26 de sorte que des premières billes 28 soient localisées précisément et que des deuxièmes billes 28 ' de diamètre inférieur puissent ensuite être mises en place ( figure 3A) .
En particulier, les microbilles 28 augmentent la surface développée de la zone de capture 10 de façon notable . Il peut être avantageux dans ce cas de ne pas avoir de protubérances 24 , mais des zones de capture 30 composées de cuvettes 32 emplies de billes 28 , tel que schématisé sur la figure 4. Les cuvettes 32 des zones de capture 30 peuvent être réalisées par exemple par gravure microtechnologique du support 12 , ou par report d' un maillage de parois 34 , ou par moulage de matériau plastique . Elles sont ensuite remplies par des microbilles 28 , avantageusement calibrées .
En présence de microbilles comme sur les figures 3 et 4 , il est avantageux de maintenir les billes 28 en place par une membrane poreuse 36. Le film poreux 36 est choisi de façon à laisser les molécules d' intérêt migrer à l' intérieur de la zone de capture 10 , 30. On peut utiliser des filtres commerciaux en polycarbonate de porosité inférieure au μm que l' on colle sur les cavités par sérigraphie (par exemple Dynamask™, de la société Dynatech) , ou des films secs de résine photosensible (comme Ordyl™ de la société Elga) que l' on insole par photolithographie pour réaliser la porosité ; cette technique est plus adaptée pour des billes 28 de diamètre supérieur à 1 μm. II peut être intéressant de fonctionnaliser tout ou partie des éléments des zones de capture 10 , 30 en contact avec le milieu 3 à analyser pour assurer une optimisation de la fonction de capture et/ou pour cibler certaines molécules d' intérêt . En particulier, il est possible de fixer un marqueur sur les protubérances 24 et/ou les billes 28 et/ou les parois 22 , 34.
Comme fonctionnalisation, on peut envisager la fixation de sondes ADN, la fixation d' anticorps spécifiques , la fixation d' une matrice d' affinité pour des analyses ultérieures en spectromètre de masse . Par exemple, il est possible de réaliser une chimie de couplage sur le dispositif de la figure 2 qui présente un oxyde épais SiO2 en surface . II est à noter qu' il est possible d' avoir dans une même zone de capture 10 , 30 plusieurs fonctions différentes en jouant soit sur le fait que billes et parois sont fonctionnalisées différemment , soit sur un mélange de billes 28 , 28 ' , en particulier si leur diamètre est différent , tel que décrit dans FR-A-2 846 957. En particulier, en ce qui concerne les parois 22 , 24 , 34 du dispositif, classiquement , la fonctionnalisation s ' effectue en deux ou trois étapes ( figure 5 ) . 1 ) Synthèse d' une molécule organique bifonctionnelle Y-E-A appelée agent de couplage qui va permettre l' adhésion interfaciale non covalente entre les protéines et le support organique .
2 ) Fixation de l' agent de couplage sur le support inorganique 12 , qui peut avoir été préalablement traité pour présenter une fonction de couplage W
(en particulier, il s ' agit de la fonction W silylée
O-Si pour les substrats 12 en silicium recouvert d' une couche d' oxyde de silice) , par réaction d' une des deux fonctions Y avec la surface, l' autre fonction A réagissant avec la protéine en formant une liaison non covalente .
3 ) Si la fonction terminale A permettant l' adsorption de la protéine n' a pu être synthétisée avec la fonction silylée pour cause d' incompatibilité chimique, le support modifié va subir une ou plusieurs réactions post-silanisation jusqu' à l' obtention de cette dernière .
La fonction de couplage A correspond à l' ensemble des fonctions organiques et minérales existantes telles que les fonctions : CH3, alcènes , alcynes , dérivés aryles , halogènes (Br, Cl, I , F) , dérivés organométalliques , alcools , phénols , diols , éthers , époxys , dérivés carbonylés (aldéhydes , cétones , acides carboxyliques , carboxylates , esters , amides , chlorures d' acide, anhydrides d' acides ) , dérivés azotés (aminés , dérivés nitrés , dérivés diazos , imines , énamines , oximes , nitriles ) , dérivés phosphores (phosphines , phosphites , phosphates , phosphonates ) , dérivés du silicium, dérivés du soufre ( sulfures , dissulfures , thiols , thioéthers , sulfones , sulfites , sulfates , acides sulfoniques , sulfonates , azasulfoniums ) , dérivés du sélénium, ....
Un groupe espaceur E, utilisé entre les deux fonctions A, Y de l' agent de couplage, permet de conférer des propriétés particulières au film obtenu par la silanisation . Le groupe E est choisi parmi les radicaux permettant d' obtenir une monocouche organisée : un radical E de type alkylène à longue chaîne permet une interaction interchaînes (parmi les radicaux E du type alkylène, on préfère tout particulièrement ceux qui ont de 8 à 24 atomes de carbone) ; un radical E comprenant deux triples liaisons -C =C- permet une réticulation ; un radical E comprenant une chaîne aromatique conjuguée confère des propriétés d' optique non linéaire (à titre d' exemple, on peut citer les radicaux phénylène-vinylène et phénylène-acétylène) ; un radical E du type pyrrole, thiophène ou polysilane confère une conduction électronique ; un radical E du type polyaromatique hétérosubstitué confère des propriétés de photo/électroluminescence ( à titre d' exemple, on peut citer les quinones et les composés diazoïques ) ; un groupe E du type alkyle ou fluoroalkyle, en particulier un groupe alkyle ou fluoroalkyle ayant de 3 à 24 atomes de carbone, permet d' utiliser les couches obtenues en chromatographie ou en électrophorèse . En ce qui concerne la fonctionnalisation des billes , le même principe est utilisé .
Par ailleurs , il est possible de déposer différents types de billes selon les zones 1Oi de prélèvement , et ainsi d' obtenir un outil présentant un étagement de fonctions d' affinité A.
Par exemple, pour un substrat 12 de surface hydrophile comme Siθ2, silanisé, les fonctions esters de surface situées sur l' outil vont réagir avec des billes fonctionnalisées porteuses de fonction hydroxyle primaire . Après l' immobilisation des billes 28 , l' outil possède une surface développée hydrophile ( figure 6A) .
Il est possible également d' utiliser la fonctionnalisation de billes 28 pour obtenir un autre effet : l' augmentation de la sensibilité de l' analyse en masse par saturation des espèces majoritaires grâce à l' utilisation de pools de billes porteuses de ligands (lissage dynamique) . Par exemple, si une surface recouverte de deux billes porteuses chacune d' un ligand, spécifique d' une protéine majoritaire pour la première et minoritaire pour la seconde, est mise au contact du tissu, la surface piégera autant de protéines majoritaires que minoritaires , ce qui conduit à une détection plus facile de cette deuxième catégorie lors de la phase ultérieure d' analyse par le spectromètre de masse . La dynamique protéines majoritaires/minoritaires étant de 12 log dans la nature, on comprend l' intérêt de cette approche développée par ciphergen® sur ses barrettes lors de la phase de rinçage de l' échantillon avant dépôt sur la barrette . Grâce au dispositif selon l' invention, il est possible d' appliquer ce principe pour un prélèvement par apposition sans transfert postérieur .
L' une des options est de préparer dans n éprouvettes n types de billes 28 porteurs chacun d' un ligand spécifique, de les mélanger, puis de les fixer à l' outil via le ligand Y (NH2 pour la figure 6B) . Une autre option est de mélanger n types de ligands spécifiques et de les fixer sur un outil préalablement fonctionnalisé par des billes ( figure 6C) . Par ailleurs , dans le cas où le dispositif de prélèvement 6 possède plusieurs zones de capture 1Oi (voir figure 1 ) , il est possible d' utiliser les mêmes fonctions sur chaque zone de capture, ou d' opérer une différenciation spatiale, comme par exemple par le dépôt localisé par gouttes (« spotting ») connu pour les puces à ADN .
Selon l' utilisation et notamment les analyses des molécules prélevées , il peut être intéressant de séparer les zones de capture 1Oa-IOd d' un même dispositif 6. En particulier, les supports 12 peuvent être sécables pour chacun des modes de réalisation précédents .
Afin de faciliter la section du support 12 , avantageusement , les zones d' intervalle 18 entre les zones de capture 10 , 30 sont munies de moyens de séparation . Par exemple, des encoches peuvent avoir été gravées en même temps que la réalisation des protubérances 24 et/ou des parois 34 : figures 7. Les zones d' intervalle 18 , 34 peuvent alors facilement être sectionnées . Différents modes de réalisation sont envisageables : par exemple, il est possible de réaliser une amorce de clivage 42 par gravure du support 12 sur la face 16 opposée à la face 14 comprenant les zones de capture 10 , par masque et gravure par exemple ( figure 7A) . On peut également réaliser cette encoche 44 sur la face « avant » 14 , ou choisir par exemple une gravure chimique isotrope, par exemple au KOH ( figure 7B) . En ce qui concerne les dispositifs du type de la figure 4 , c' est-à-dire à cuvette simple 32 , habituellement , les zones d' intervalle sont composées de parois 34. Il peut être souhaitable dans ce cas de définir également des encoches de clivage 46 en face arrière en dessous des parois 34 : figure 7C .
Si des zones de capture 10 , 20 sont présentes sur chaque face 14 , 16 , il est possible de ne positionner des moyens de séparation que sur l' une des faces ( figure 7D) , ou sur les deux ( figure 7E) . On peut noter à cet égard deux modes de réalisation pour les dispositifs comprenant des zones de capture 10 , 20 sur chacune de leurs faces opposées 14 , 16 : un support 12 ( figure 7D) ou collage de deux supports 12 , 12 ' ( figure 7E) . II est clair également que les différents modes de réalisation d' encoches 42 , 44 , 46 peuvent être utilisés indifféremment et en combinaison .
Selon le mode de réalisation préféré P , une plaquette de silicium de 100 mm de diamètre est usinée pour obtenir 142 dispositifs finaux après découpe . Le support 12 en silicium est avantageusement marqué : en particulier, le nom du dispositif, des croix d' alignement , des repères de découpe, ... sont gravés , par exemple à 500 nm, par photolithographie avec masque et gravure sèche . La face arrière subit un traitement similaire (photolithographie avec masque aligné sur le précédent , gravure sèche de 5 à 10 μm, retrait de la résine du masque) pour former les encoches 46. La face avant est alors dessinée et gravée pour la microstructuration, avec photolithographie avec masque aligné, gravure sèche profonde à 50 μm et retrait de la résine . Les surfaces sont ensuite préparées afin de permettre leur utilisation biologique et/ou médicale : en particulier le polymère (par exemple C4F8) formé sur les flancs des cavités lors des gravures est éliminé, par désoxydation totale, suivi d' une oxydation humide sur 100 nm, puis d' une désoxydation totale ; une couche de SiO2 finale est obtenue par oxydation humide sur 500 nm. Selon un mode d' utilisation du dispositif selon l' invention schématisé en figure 8 , le guide 2 est d' abord mis en place, de préférence sous contrôle dans la zone cible 3 ; le support 12 est collé en bout de tige 7. La tige 7 est insérée dans le guide 2 , sous contrôle optique également afin d' assurer la précision de son positionnement , et en particulier de déterminer les zones A, B, C, D de la tumeur 3 correspondant à chacune des zones de capture 1Oa-IOd . Une fois les zones de capture 1Oa-IOd en place, les moyens d' obturation 5 sont ouverts , et le prélèvement est effectué par apposition ; aucune manipulation du dispositif lui-même n' est nécessaire, la surface de contact des zones de capture 10 étant directement accessible ( sans capot par exemple) . Ceci permet par ailleurs une miniaturisation de l' ensemble, et notamment du support 12. Les moyens d' obturation 5 peuvent ensuite éventuellement être refermés . La tige 7 est alors retirée du guide 2 , le support 12 en est détaché, et les zones de capture 1Oa-IOd peuvent être analysées . Deux approches pour le traitement de l' échantillon prélevé peuvent être mises en œuvre lors de l' analyse :
1 ) Le dispositif 6 est sécable, et chaque zone 1Oa-IOd est traitée de façon indépendante . De fait , une fois la tige 7 retirée, le support 12 est cassé et les différentes zones 1Oa-IOd sont introduites dans des tubes de lavage et d' extraction 50a-50d . Les molécules A, B, C, D ainsi extraites peuvent être stockées dans une banque de données et/ou déposées sur une barrette pour une analyse, par exemple une barrette Ciphergen® utilisée notamment pour réaliser une analyse par spectrométrie de masse pour une analyse protéomique, comme SELDI-TOFF® .
2 ) II est possible également de ne pas couper le support 12 , qui conserve ainsi la définition des zones actives A-D étagées au sein de la tumeur 3.
C' est le support 12 lui-même qui sert de substrat pour le dispositif 60 d' analyse finale, par exemple par une désorption directe assistée sous laser . Quelle que soit l' approche choisie, on peut obtenir une cartographie du tissu d' intérêt , et des résultats concernant la composition protéique en fonction de la profondeur dans la zone cible 3.
Le dispositif de prélèvement selon l' invention présente ainsi des caractéristiques particulièrement avantageuses :
- le prélèvement est peu invasif : en particulier, le diamètre apparent du dispositif 6 , et même du système 1 , est réduit , notamment à quelques millimètres , de préférence 1 mm tout en conservant une forte surface développée pour capturer suffisamment de molécules cibles ;
- le prélèvement est peu agressif : il se fait par contact (ou « apposition ») sans section de tissu 3 ; - la partie du dispositif usinée et servant réellement au prélèvement est réduite et ne couvre que le support 12 , qui peut être associé à une tige de manipulation 7 de bas coût ;
- l' usinage de la partie servant au prélèvement 12 est réduit à la fabrication des zones de contact 10 , 20 , 30 , sans autres éléments mécaniques ni étapes supplémentaires de scellement ou collage ;
- la forte surface développée des zones de capture 10 , 20 , 30 compense la miniaturisation et permet des analyses fiables ;
- le dispositif 6 peut être utilisé en geste opératoire in vivo ou en post-opératoire, voire in vitro sur un tissu prélevé et demandeur d' analyse moléculaire ; - la présence de zones de capture 1Oa-IOd étagées permet d' analyser après empreinte la répartition des molécules d' intérêt dans la zone de prélèvement 3 ;
- chaque zone de capture 10 , 30 peut être fonctionnalisée selon les molécules ciblées et/ou le type d' analyse finale (génomique, protéomique) ;
- chaque zone de capture 1Oa-IOd peut être séparée des autres et être analysée par une technique propre ;
- le support du dispositif 12 peut être compatible avec tout équipement d' analyse ultérieure, par exemple il peut comprendre une matrice spécifique pour la spectrographie de masse ;
- une cartographie selon l' axe de profondeur de la zone 3 analysée peut être établie selon les zones actives A-D successives différentiées le long du dispositif ; la méthode opératoire sous stéréoscopie permet en effet de guider précisément le dispositif 6 et de savoir exactement quelle région A-D a été sondée .
EXEMPLE DE REALISATION
Le dispositif précédent P ( support 12 en Si de 600 x 300 μm2 , avec protubérances 24 octogonales ) a été silanisé puis fonctionnalisé pour donner la fonction carboxylate . En effet , à pH physiologique, les systèmes biologiques et notamment les protéines sont naturellement chargés ; les interactions ioniques
(basés sur les principes de la chromatographie) peuvent être utilisées pour absorber de façon spécifique des marqueurs protéiques . Pour les surfaces anioniques (chargées négativement ) , les dérivés carboxylates sont les plus couramment utilisés .
Les fonctions carboxylate et silane étant incompatibles , une stratégie de synthèse indirecte via l' ester de méthyle de l' acide triméthoxysilylundécan- 10-oique a été choisie .
HSi(OMe)3 Cat. de Karstedt
La fonction acide est protégée sous la forme d' un ester de méthyle après réaction de l' acide undécénoique avec de l' acide sulfurique et du méthanol ; l' incorporation du groupement silylié s ' effectue classiquement par une réaction d' hydrosilylation .
Par exemple, un ester de méthyle de l' acide 10-undéc-l-ènoique est fabriqué pour former l' ester de méthyle de l' acide triméthoxysilylundécan-10-oique par le procédé suivant : - A une solution d' acide undécénoique ( 98 %) ( 10 , 47 g ; 11 , 5 mL ; 56 mmol) dissout dans 500 mL de méthanol, est additionné de l' acide sulfurique concentré ( 12 , 88 g ; 7 mL ; 131 mmol ; 2 , 3 éq . ) . La réaction se déroule à O 0C durant 4 heures . - Après évaporation du méthanol et reprise à l' acétate d' éthyle, le mélange réactionnel est lavé successivement avec de l' EDI ( χ 2 ) et avec une solution saturée de chlorure de sodium, séché sur du sulfate de magnésium anhydre puis concentré pour donner un liquide incolore ( 10 , 99 g ; 99 %) . On obtient les caractéristiques suivantes :
S11 (200 MHz ; CDCl3) : 1,30 (1OH ; m ; H5-9)
1, 62 (2H ; m ; H4)
2,04 (2H ; m ; H10)
2,31 (2H ; t ; H3 ; : 'JH-H = 7 , 4 Hz ;
3, 67 (3H ; s ; H1)
4, 97 (2H ; m ; H12) δ c (200 MHz ; CDCl3) 25,31
29,26
29,42
29,50
29,58
29, 66
34,16
34,44
51,76 (c1: )
114,51 (C 12 )
139,46 (C n)
174, 61 (C 2)
- L' ester méthylique de l' acide 10-undéc-l-ènoique
( 10 , 58 g ; 53 mmol) est mélangé avec du triméthoxysilane ( 95 %) ( 8 , 75 g ; 9, 1 mL ; 68 mmol ; 1, 3 éq. ) . Le catalyseur de Karstedt
( 0 , 13 g ; 0 , 13 mmol ; 0 , 0025 éq . ) est additionné très lentement . La réaction se déroule à température ambiante durant 16 heures . Le brut réactionnel est purifié par distillation pour donner un liquide incolore ( 120-1250C à 0 , 5 mbar ; 11 , 7 g ; 70 %) :
S 11 (200 MHz ; CDCl3) : 0 , 65 (2H ; m ; H12 )
1,27 (14H ; m ; H5-11)
1, 62 (2H ; m ; H4)
2,30 (2H ; t ; H3 ; 3JH-H = 7, 4 Hz)
3,57 (9H ; s ; H13)
3, 67 (3H ; s ; H1)
[200 MHz ; CDCl. 9,21 (C12)
22, 68
25, 04
29,23
29,38 (2C)
29,50 (2C)
33,17
34,19
50,55 (C13)
51,46 (C1)
174,38 (C2 )
<5 Si (200 MHz ; CDCl3) : -41 , 30 ( s )
L' hydroxylation du substrat en silicium recouvert d' une couche d' oxyde thermique de 500 nm est réalisée dans une solution de soude 3 , 5 M pendant 2 heures , avec une solution silanisante de concentration 10~2 M dans du trichloroéthylène anhydre, les réactions de silanisation étant effectuées à une température contrôlée de 20C pendant 24 h . Le support modifié est mis au contact d' une solution d' iodure d' aluminium afin de libérer la fonction acide carboxylique, qui va à son tour réagir avec une solution aqueuse de soude pour donner la fonction carboxylate correspondante .
Ce dispositif a été utilisé pour une analyse de masse sur une tumeur cérébrale (gliome) , obtenue après exérèse .
Le tissu est apposé sur l' outil puis après rinçage et dépôt de la matrice, l' analyse est réalisée directement sur la surface .
Les spectres de masse obtenus sur un SELDI-
TOFF vendu sous la dénomination ProteinChip® System
Séries 4000 par la société Ciphergen est présenté sur la figure 9, les zones grisées représentant les protéines majoritaires hémoglobine et transferrine .
On note que la chimie de surface a un rôle capital puisque l' analyse de la surface sans chimie B montre un nombre de marqueurs beaucoup moins important que sur la surface chimiquement modifiée A (anionique par CO O") .

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif microtechnologique ( 6 ) de prélèvement de molécules d' intérêt biologique par contact comprenant un support ( 12 ) ayant une première face ( 14 ) opposée à une deuxième face ( 16 ) et au moins une première zone de capture ( 10 ) sur la première face
( 14 ) telle que la surface développée ( S ) de la première zone de capture ( 10 ) est au moins trois fois supérieure à sa surface ( s ) .
2. Dispositif selon la revendication 1 comprenant au moins une deuxième zone de capture (20 ) sur la deuxième face ( 16 ) telle que la surface développée de la deuxième zone de capture (20 ) est supérieure à sa surface .
3. Dispositif selon la revendication 2 dans lequel la surface développée de la deuxième zone de capture (20 ) est au moins trois fois supérieure à sa surface .
4. Dispositif selon l' une des revendications 1 à 3 comprenant une pluralité de premières zones de capture ( 1Oa-IOd) sur la première face ( 14 ) séparées par des premières zones d' intervalle ( 18 ) .
5. Dispositif selon la revendication 4 comprenant une pluralité de deuxièmes zones de capture sur la deuxième face ( 16 ) séparées par des deuxièmes zones d' intervalle, chaque première zone étant opposée à une deuxième zone .
6. Dispositif selon l' une des revendications 4 ou 5 comprenant des moyens ( 42 , 44 ,
46 ) pour séparer les zones de capture ( 1Oa-IOd, 30 ) dans les zones d' intervalle ( 18 , 34 ) .
7. Dispositif selon la revendication 6 dans lequel les moyens pour séparer comprennent des encoches sur la première et/ou la deuxième face ( 14 , 16 ) .
8. Dispositif selon l' une des revendications 1 à 7 dans lequel le support ( 12 ) est sous forme de plaque .
9. Dispositif selon la revendication 8 dans lequel les première et deuxième faces ( 14 , 16 ) du support ( 12 ) sont planes à l' exception des zones de capture ( 10 , 20 ) et des éventuels moyens pour séparer ( 42 , 44 , 46 ) .
10. Dispositif selon l' une des revendications 1 à 9 dans lequel une zone de capture ( 10 ) comprend une paroi de fond (22 ) munie d' une pluralité de protubérances (24 ) .
11. Dispositif selon la revendication 10 dans lequel le support ( 12 ) est en plastique .
12. Dispositif selon la revendication 10 dans lequel le support ( 12 ) est un substrat microtechnologique, notamment en silicium.
13. Dispositif selon l' une des revendications 10 à 12 dans lequel la hauteur des protubérances (24 ) est comprise entre 10 μm et 400 μm et la surface des protubérances (24 ) est comprise entre 3 x 3 μm et 80 x 80 μm.
14. Dispositif selon l' une des revendications 10 à 13 dans lequel les protubérances (24 ) sont séparées par des espaces (26 ) dont la largeur est inférieure à 50 μm.
15. Dispositif selon l' une des revendications 10 à 14 dans lequel les protubérances (24 ) sont à section hexagonale ou octogonale .
16. Dispositif selon l' une des revendications 10 à 15 dans lequel la paroi de fond
(22 ) et/ou les protubérances (24 ) sont fonctionnalisées .
17. Dispositif selon l' une des revendications 10 à 16 comprenant des microbilles (28 ) dans les espaces (26 ) entre les protubérances (24 ) .
18. Dispositif selon l' une des revendications 1 à 17 dans lequel une zone de capture ( 30 ) au moins comprend une cuvette ( 32 ) et des microbilles (28 ) disposées dans la cuvette ( 32 ) .
19. Dispositif selon l' une des revendications 17 à 18 comprenant une membrane ( 36 ) pour maintenir les microbilles (28 ) dans la zone de capture ( 10 , 30 ) .
20. Dispositif selon l' une des revendications 17 à 19 dans lequel les microbilles (28 ) sont fonctionnalisées .
21. Dispositif selon la revendications 20 dans lequel la fonctionnalisation des microbilles ( 18 ) comprend au moins deux ligands différents , spécifiques d' une protéine majoritaire et d' une protéine minoritaire .
22. Dispositif selon l' une des revendications 16 , 20 ou 21 dans lequel la fonctionnalisation comprend la présence de ligands solidarisés à la surface par une fonction silylée .
23. Dispositif selon l' une des revendications 1 à 22 comprenant en outre une tige de manipulation ( 7 ) , le support ( 12 ) pouvant être associé à une extrémité de la tige .
24. Système de prélèvement ( 1 ) comprenant un dispositif ( 6 ) selon la revendication 23 et un manchon de guidage (2 ) .
25. Procédé de cartographie d' un tissu ( 3 ) comprenant :
- la mise en place au sein du tissu d' un dispositif microtechnologique ( 6 ) comprenant une pluralité de zones de capture ( 1Oa-IOd) étagées , une zone de capture ( 10 ) ayant une surface développée supérieure à trois fois sa surface,
- le contact entre le tissu ( 3 ) et les zones de capture ( 10 ) , - l' analyse du prélèvement .
26. Procédé selon la revendication 25 comprenant la section du dispositif ( 6 ) de façon à séparer les zones de capture ( 1Oa-IOd) .
27. Procédé selon l' une des revendications 25 à 26 dans lequel le dispositif microtechnologique est défini selon l' une des revendications 1 à 24.
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