EP1761646A1 - Verfahren zur quantifizierung methylierter dna - Google Patents

Verfahren zur quantifizierung methylierter dna

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Publication number
EP1761646A1
EP1761646A1 EP05756101A EP05756101A EP1761646A1 EP 1761646 A1 EP1761646 A1 EP 1761646A1 EP 05756101 A EP05756101 A EP 05756101A EP 05756101 A EP05756101 A EP 05756101A EP 1761646 A1 EP1761646 A1 EP 1761646A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
methylation
sequence
fragment
amplified
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05756101A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Matthias Schuster
Philipp Schatz
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Epigenomics AG
Original Assignee
Epigenomics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Epigenomics AG filed Critical Epigenomics AG
Publication of EP1761646A1 publication Critical patent/EP1761646A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the present invention relates to a method for the quantification of methylated cytosine positions in DNA.
  • 5-Methylcytosine is the most common covalently modified base in the DNA of eukaryotic cells. It plays an important biological role, inter alia in transcription regulation, in genetic imprinting and in tumorigenesis (for an overview: Millar et al.: Five not four: History and significance of the fifth base. In: The Epigenome, S. Beck and A. Olek (eds.), iley-VCH Verlag Weinheim 2003, pp. 3-20).
  • the identification of 5-methylcytosine is of particular interest for cancer diagnosis. Detection of methylcytosine is difficult, however, because cytosine and methylcytosine have the same base pairing behavior.
  • methylation-specific restriction enzymes are used, on the other hand there is a selective chemical conversion of non-methylated cytosines into uracil (so-called: bisulfite treatment, see for example: DE 101 54 317 AI; DE 100 29 915 AI).
  • bisulfite treatment see for example: DE 101 54 317 AI; DE 100 29 915 AI.
  • the enzymatically or chemically pretreated DNA is then mostly amplified and can be analyzed in various ways (for an overview: WO 02/072880 p. 1 ff; Fraga and Esteller: DNA methylation: a profile of methods and applications. Biotechniques. 2002 Sep ; 33 (3): 632, 634, 636-49.).
  • the DNA is usually bisulfited and then amplified by means of different PCR methods (see, for example, Her an et al.: Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation Status of CpG Islands. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1996 Sep 3; 93 (18 ): 9821-6 Cottrell et al.: A real-time PCR assay for DNA methylation using methylation-specific blockers. Nucl. Acids. Res. 2004 32: elO).
  • Real-time PCR variants are also used (for example: “MethyLight”; for an overview: Trinh et al.: DNA methylation analysis by Methy-Light technology. Methods. 2001 Dec.; 25 (4): 456-62) ; WO 00/70090; US 6,331,393).
  • a quantification of the degree of methylation is necessary for various applications, for example for the classification of tumors, for prognostic statements or for the prediction of drug effects.
  • Different methods for quantifying the degree of methylation are known.
  • the DNA is first chemically converted and then amplified, for example with Ms-SNuPE, with hybridizations on microarrays, with hybridization assays in solution or with direct bisulfite sequencing (for an overview: Fraga and Esteller 2002, aao).
  • a problem with these "endpoint analyzes" is that the amplification can take place unevenly due to, among other things, product inhibition, enzyme instability and decrease in the concentration of the reaction components. A correlation between the amount of amplificate and the amount of DNA used is therefore not always given.
  • the quantification is therefore incorrect - Vulnerable to the user (cf.: Kains: The PCR plateau phase - towards an understanding of its limitations. Biochem. Biophys. Acta 1494 (2000) 23-27).
  • the threshold value analysis based on real-time PCR determines the amount of amplificate not at the end of the amplification, but in the exponential amplification phase This method assumes that the amplification efficiency in the exponential phase is constant.
  • the so-called threshold value Ct (cycle threshold) is a measure of the PCR cycle in which the signal in the exponential phase of the amplification is for the first time greater than the background noise.
  • the absolute quantification is then carried out by comparing the Ct value of the examined DNA with the Ct value of a standard (see: Trinh et al. 2001, loc. Cit.; Lehmann et al.: Quantitative assessment of promoter hypermethylation during breast cancer development Am J Pathol. 2002 Feb; 160 (2): 605-12).
  • a fundamental problem of the quantification methods described above is that the bisulfite conversion leads to high yield losses and damage to the DNA, e.g. by fragmentation, leads (to the overview: Grünau et al.: Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters. Nuclear Acids Res. 2001 Jul. 1; 29 (13)).
  • Grünau et al. Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters. Nuclear Acids Res. 2001 Jul. 1; 29 (13).
  • An additional problem is that the majority of the clinical samples are embedded in paraffin (paraffin embedded tissue - PET). With this sample material, the DNA is already highly fragmented before the bisulfite treatment, so that an analysis after bisulfite conversion is even more difficult.
  • a fragment is amplified, which comprises a recognition site for a restriction enzyme.
  • the DNA to be examined is reacted with a restriction enzyme which cuts the unmethylated but not the methylated DNA.
  • a restriction enzyme which cuts the unmethylated but not the methylated DNA.
  • the uncut - methylated - DNA can be amplified.
  • DNA concentration determination requires an additional work step and thus creates an additional source of error.
  • DNA concentration determination using the conventional methods is difficult. Because of irreversible modifications, often only a part of this DNA can actually be amplified.
  • the DNA to be examined is made accessible or isolated for the restriction enzymes.
  • the DNA can come from different sources. Tissue samples are the preferred starting material for diagnostic questions.
  • the use of the method according to the invention for the analysis of paraffin-embedded samples has particular advantages. It is next to it but also preferred to analyze the DNA from body fluids, especially serum. In this case, isolation of the DNA is not always necessary. It is also conceivable to use DNA from sputum, stool, urine or brain spinal fluid. DNA isolation is carried out according to standard methods, for example from blood using the Qiagen UltraSens DNA extraction kit.
  • the DNA is reacted with at least one methylation-specific restriction enzyme.
  • At least one restriction site lies within the sequence that is to be amplified in the third step. This ensures that only the DNA of a methylation status is amplified.
  • the restriction is preferably carried out with enzymes which specifically cut unmethylated DNA, so that only the methylated DNA is amplified. If available, enzymes that specifically cut methylated DNA (e.g. McrB, New England Biolabs, U-SA) can also be used. There are a variety of restriction enzymes that can be used in the method of the invention. More information on restriction enzymes can be found in the “Rebase” database (http://rebase.neb.com/; see also: Roberts et al.: REBASE: restriction enzymes and methyltransferases. Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, No. 1 418-420).
  • the sequence to be amplified there are several restriction sites within the sequence to be amplified. This increases the likelihood that the fragment will be cut. The risk of false positive signals is thus reduced. This is especially true when analyzing DNA from paraffin samples.
  • the sequence to be amplified is particularly preferably carried up to five interfaces. On the one hand, it is possible for the sequence to contain several restriction sites of the same enzyme. Furthermore, it is also conceivable that the sequence carries several restriction sites of different enzymes. The restriction is then carried out in parallel with several enzymes at the same time, the various enzymes being active under the same reaction conditions. Alternatively, the restriction is carried out one after the other.
  • the restriction depends on the enzyme used according to standard conditions. These can be found in the protocols supplied by the manufacturers.
  • a real-time PCR is understood to be a PCR which allows the amplificates to be detected already during the amplification.
  • Different real-time PCR variants are related to the person skilled in the art, for example SYBR-Green, Lightcycler, Taqman, Sunrise, Molecular Beaconon or Eclipse forms. Details of the structure of the primers and the probes belong to the prior art (cf. US Pat. No. 6,331,393 with further evidence).
  • the probes can be designed using the "PrimerExpress" software from Applied Biosystems (for Taqman probes) or MGB Eclipse Design Software from Epoch Biosciences (for Eclipse probes).
  • the PCR is designed so that the amplificates span the restriction sites. Therefore, amplificates are only formed if no restriction has previously been carried out.
  • the amplificates are chosen so that they are between 50 bp and 150 bp long. In this way, fragmented DNA from paraffin-embedded tissue can be examined more easily.
  • the proportion of methylated DNA in the original sample is calculated from the signal of the sequence to be examined and the signal from a reference measurement.
  • the reference measurement can either be done before the restriction so that each reaction contains the same amount of DNA.
  • the amount of DNA detected after the restriction e.g. methylated DNA
  • the total DNA can be determined according to the known methods, e.g. using a real-time PCR.
  • the degree of methylation of the sample can then be calculated from this ratio.
  • part of the DNA to be examined is not treated with enzymes and the amount of DNA of this DNA is quantified in parallel in a second reaction with the same fragment (see in detail below).
  • a reference fragment is used.
  • the reference fragment is a sequence which, regardless of the methylation status, represents the total DNA in the reaction mixture.
  • the restriction enzyme does not cut the reference fragment and therefore amplifies it in the PCR regardless of the methylation status. In one embodiment, this can be achieved in that the reference fragment has no interfaces for the restriction enzymes used.
  • the proportion of methylated DNA can be quantified by comparing the signals of the total DNA and the methylated DNA.
  • the reference fragment preferably has approximately the same size as the sequence to be analyzed and can be amplified with the same efficiency. In addition, it is preferably in the vicinity, particularly preferably in the immediate vicinity of the sequence to be analyzed. This ensures that fragmentation of the DNA, as is often the case in paraffin samples, does not lead to incorrect results.
  • the reference fragment is identical to the fragment to be analyzed. The reaction mixture is then split up and only a part is digested (see below).
  • the sequence to be analyzed and the reference fragment are amplified simultaneously in a reaction vessel. This has the advantage that the reaction conditions are identical for both fragments. In this embodiment, however, it is necessary that the two probes have different markings.
  • the amplifications take place in different vessels. In this way, interfering interactions between the fluorescent dyes can be avoided and competition between the two amplifications can be ruled out.
  • Quantify sequence The signal detection takes place depending on the real-time variant used according to the prior art.
  • the quantification can be done using different calculation methods.
  • the difference between the two ct values (threshold values) is preferably used as a quantitative criterion for the degree of methylation.
  • the Ct value is a measure of the PCR cycle in which the signal in the exponential phase of the amplification is greater than the background noise for the first time.
  • the quantification takes place according to the following principle: If enzymes that specifically cut the unmethylated status are used, only the methylated DNA is amplified. The smaller the difference between the Ct of the reference fragment (amplification of the entire DNA) and the Ct of the digested sample to be analyzed (amplification of only the methylated DNA), the higher the proportion of methylated DNA.
  • the degree of methylation M can be calculated from the ratio of the DNA quantities determined by two independent DNA quantifications.
  • the first quantification takes place with the fragment to be examined, only the amount of uncut DNA is determined.
  • the second quantification can optionally take place with the aid of a second reference fragment, the sequence of which does not contain any interfaces, or with the aid of the fragment to be examined by examining the uncut DNA sample.
  • This reference DNA can be an aliquot of the DNA to be analyzed which has not been treated with restriction enzymes.
  • the threshold value (CT) is determined for each quantification and the amount of DNA is obtained by comparison with a number of DNA quantification standards. This is related to the amount of DNA in the reference measurement.
  • the degree of methylation M can be determined using the following formula:
  • ⁇ Ct corresponds to the systematic difference between the threshold value of the uncut fragment examined and the reference fragment with the same amount of DNA used. This difference is a constant ⁇ Ct to be determined individually for each fragment to be examined. It is the difference between the threshold value of the restricted fragment examined and the reference fragment minus the systematic difference ⁇ Ct. To simplify, it is also possible to use the following formula:
  • ⁇ Ct corresponds to the difference in the threshold value between the restricted and non-restricted sample.
  • PCR is carried out with optimal efficiency. Quantification using the methods described above is particularly possible if the assay conditions have been optimized in terms of PCR efficiency beforehand. This can be done, for example, by varying the primers, the probes, the temperature program and the other reaction parameters.
  • the PCR efficiency can be determined using standard methods, for example using a standard from uncut genomic DNA.
  • the degree of methylation can also be determined using standard DNA dilutions, as are customary in quantitative PCR. For this purpose, both for the examined fragment and for the reference fragment
  • Standard amplification curves were determined and used to convert the threshold values for both fragments into amounts of DNA. In this way, after the restriction has taken place, the amount of methylated DNA in the sample is determined from the threshold value of the examined fragment and the total amount of DNA in the sample is determined from the threshold value of the reference fragment. The ratio of the two values corresponds to the degree of methylation of the examined fragment in the sample.
  • the quantification can be calibrated using a methylation standard (e.g. with 0%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% and 100% degree of methylation).
  • a methylation standard e.g. with 0%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% and 100% degree of methylation.
  • EP 04 090 037.5 (applicant: Epigenomics AG).
  • a particularly preferred embodiment of the method according to the invention uses controls with which it can be checked whether the restriction is completely implemented is. This can happen in different variations.
  • unmethylated DNA is used as a control.
  • the restriction enzymes should completely convert the unmethylated DNA so that no amplificate is formed in the PCR.
  • Unmethylated DNA is available from various sources, for example a genome-wide amplification method (cf. European patent application 04 090 037.5, filing date: February 5, 2004, applicant: Epigenomics AG).
  • Another embodiment ensures that the restriction enzymes are not inhibited by components of the biological sample.
  • a further restriction enzyme can be used as a control, which cuts independently of methylation within the fragment to be amplified. In this control, the entire DNA should be digested regardless of its methylation status.
  • the PCR should therefore not generate an amplificate.
  • isoschizomers which have the same recognition sequence as the other restriction enzymes used, but cut independently of methylation.
  • a control gene that is never methylated is analyzed in parallel to the fragments to be examined. The corresponding DNA should be cut completely during the restriction, so that no amplificate should arise here either in the PCR. In this way, problems such as improper preparation of paraffin samples can be addressed.
  • the sequence to be analyzed and the reference fragment are identical.
  • the sample to be examined is divided and only part of the sample is reacted with restriction enzymes.
  • the other part remains untreated.
  • the invention is therefore a method for the quantification of methylated DNA, the following steps being carried out: a) the DNA is divided into two equal parts, b) the first part of the DNA is reacted with a methylation-specific restriction enzyme, while the other part remains untreated , c) the DNA of both parts is amplified by means of a real-time PCR, fragments being formed in the first part of the sample only if the DNA has not been cut beforehand, d) the part of the signals from the two parts is methylated and unmethylated DNA calculated in the original sample.
  • the DNA to be examined is made accessible or isolated from the restriction enzymes from different sources as described above.
  • paraffin samples are examined.
  • the isolated DNA is divided into two equal parts.
  • the third part of the samples is then reacted with a methylation-specific restriction enzyme.
  • At least one restriction site lies within the sequence that is to be amplified in the fourth step. This ensures that only the DNA of a methylation status is amplified.
  • the second reaction approach is not implemented with a restriction enzyme.
  • the entire DNA amplified regardless of methylation status.
  • the restriction is preferably carried out using enzymes which specifically cut unmethylated DNA, so that only the methylated DNA is amplified. If available, it is also possible to use enzymes that cut specifically methylated DNA (see above). As described in detail above, there are a variety of restriction enzymes that can be used in the method of the invention.
  • the sequence to be amplified there are several restriction sites within the sequence to be amplified (see above). This increases the likelihood that the fragment will be cut. The risk of false positive signals is thus reduced. This is especially true when analyzing DNA from paraffin samples.
  • the sequence to be amplified particularly preferably carries up to five interfaces. On the one hand, it is possible for the sequence to contain several restriction sites of the same enzyme. Furthermore, it is also conceivable that the sequence carries several restriction sites of different enzymes. The restriction is then carried out in parallel with several enzymes at the same time, the various enzymes being active under the same reaction conditions.
  • both reaction batches are amplified by means of real-time PCR (see above).
  • the PCR is designed so that the amplificates span the restriction sites. Therefore, amplificates are only formed if no restriction has previously been carried out.
  • the proportion of methylated and unmethylated DNA in the original sample is calculated from the signals obtained from the two previously separated sample parts.
  • the signal detection takes place depending on the real-time variant used according to the prior art.
  • the quantification can be carried out as described in detail above using different calculation methods.
  • the difference between the two ct values (threshold values) is preferably used as a quantitative criterion for the degree of methylation.
  • the quantification takes place according to the following principle: If enzymes that specifically cut the unmethylated status are used, only the methylated DNA is amplified.
  • a quantification using the methods described above is particularly possible if the assay conditions have been optimized with regard to the PCR efficiency (see above).
  • Different control systems can be used, which are described in detail above, and which can also be used for this embodiment.
  • the method according to the invention is particularly well suited for the sensitive quantification of degrees of methylation.
  • the method according to the invention is particularly suitable for detecting the DNA of a methylation status (for example methylated DNA) against a strong background of DNA of the other methylation status (for example: unmethylated DNA).
  • the proportion of DNA to be detected is preferably less than 10%. In other preferred embodiments, the proportion of the DNA to be detected is less than 5% or less than 1%.
  • Clinical samples are particularly preferably examined, in particular body fluids or tissue embedded in paraffin.
  • a particularly preferred use of the method according to the invention lies in the diagnosis or prognosis of cancer diseases or other diseases associated with a change in the methylation status. These include CNS malfunctions, aggression symptoms or behavioral disorders; clinical, psychological and social consequences of brain damage; psychotic disorders and personality disorders; Dementia and / or associated syndromes; cardiovascular diseases, malfunction and damage; Malfunction, damage or disease of the gastrointestinal tract; Malfunction, damage or disease of the respiratory system; Injury, inflammation, infection, immunity and / or convalescence; Malfunction, damage or illness of the body as a deviation in the development process; Malfunction, damage or disease of the skin, muscles, connective tissue or bones; endocrine and metabolic dysfunction, injury or illness; Headache or sexual malfunction.
  • the method according to the invention is also suitable for predicting undesirable drug effects and for differentiating between cell types or tissues or for examining cell differentiation.
  • a kit for performing the method according to the invention which consists of at least one restriction enzyme, two primers, a polymerase and either a sequence-specific real-time probe or a non-sequence-specific intercalating fluorescent dye, and optionally contains further reagents required for a PCR.
  • the following example illustrates the invention.
  • the methylation of the RASSFl gene in lung tumor samples should be quantified.
  • the DNA was prepared from cut, paraffin-embedded sections from 10 lung tumor samples and 10 normal tissue samples (normal adjacent lung tissue). The deparaffinization and the lysis of the tissue were carried out according to standard procedures. The DNA was extracted from the lysis buffer using the QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen) and quantified using a UC measurement.
  • the real-time PCR was carried out in an ABI 7700 device with the following temperature profile: 15 minutes at 95 ° C; 50 cycles of: 15 seconds at 95 ° C, 45 seconds at 65 ° C, 75 seconds at 72 ° C; 15 seconds at 95 ° C; followed by an hour at 50 ° C.
  • E represents the PCR efficiency, which can easily be determined using standard methods (see above).
  • FIG. 1 shows the ⁇ Ct values for the 20 samples embedded in paraffin (RASSF.l lung samples 1-20) which were investigated in this experiment
  • the figure shows that 5 out of 10 tumor samples, but only a single one of the ten normal reference tissue samples, had a RASSFL methylation of over one percent. This result corresponds to the expectation that the area examined in pulmonary tumor tissue is in hypermethylated form.
  • DNA from "buffy coat” was mixed with Sssl-methyltransferase-treated DNA.
  • the investigated promoter of the FOXL2 gene is not methylated in healthy lymphocytes. This produced DNA mixtures with different methylation levels (100%; 75%; 50% ; 25%; 10%; 5%; 2.5%; 1.25%; 0.625%; 0.3125%; 0.156%; 0.078%; 0.039%; 0.019% and 0%).
  • primers Forward primer: ccccaagactgttaaggtgtg (Seq ID 3); Reverse primer: acttctgggtgatgcgagtg (Seq ID 4); Taqman sample: cgcagctca-gaacccttggaagc (Seq ID5).
  • the amount of methylated DNA used is plotted in percent on the x-axis.
  • the ratio of the two quantification reactions is plotted on the y-axis (2 - ⁇ c ⁇ ).
  • the error bars correspond to the standard deviation of four repetitions.
  • the methylation level is plotted logarithmically on the x-axis in FIG.
  • the y-axis represents the ⁇ CTs.
  • FIG. 5 lists the calculated Fisher scores for the differentiation of the methylation levels examined.
  • a Fisher score of> 2 allows a distinction. Values under 2 are marked with an asterisk (*) in FIG. 5.
  • Example 2 Different DNA mixtures were prepared as in Example 2. Before the treatment with restriction enzymes, all samples were quantified and the same amounts of DNA were used. The degree of methylation can be determined from the ratio of the total amount of DNA to the amount of DNA measured after the restriction.
  • FIG. 7 lists the calculated Fisher scores for the differentiation of the methylation levels examined.
  • a Fisher score of> 2 allows a distinction. Values under 2 are marked with an asterisk (*) in FIG.
  • Example 4 Calibration using a second fragment in a second reaction.
  • the degree of methylation of a sequence of the GSTPi gene in samples from prostate cancer patients is to be examined.
  • a control fragment was used in an experiment that was not cut by the restriction enzymes used.
  • the control fragment also lies within the GSTPi gene and has a length of 135 bp.
  • the sequence to be investigated was divided into two batches, of which only one batch was implemented with restriction enzymes.
  • the amplificate has a length of 153 bp.
  • the PCR was carried out under standard conditions with a SYBR " Green Master Mix with the following temperature program: 10 min 95 ° C; 45 cycles (15 sec 95 ° C; 45 sec 65 ° C; 1:15 min 72 ° C).
  • Control fragment Forward primer: acgcttgcatttgtgtcgg (Seq ID 6); Reverse primer: cagccctgttcagacttctcaat (Seq ID 7). Fragment to be analyzed: Forward primer: gacctgggaaagagggaaag (Seq ID 8); Reverse primer: ggcga ,
  • the FOXL2 gene is to be analyzed.
  • DNA mixtures are prepared analogously to Example 1. Then only the cut fraction is quantified.
  • a fragment whose sequence contains interfaces of the enzymes used and a fragment without interfaces are amplified in a reaction.
  • the PCR is carried out under standard conditions with the following temperature program: 10 min 95 ° C, 45 cycles: 15 sec 95 ° C, 60 sec 65 ° C.
  • primers Forward primer ccccaagactgttaaggtgtg (Seq ID 3); Reverse primer: acttctgggtgatgcgagtg (Seq ID 4); Taqman Probe: cgcagctcagaacccttggaagc (Seq ID 5); Control fragment forward primer: acgcttgcatttgtgtcgg (Seq ID 6); Control fragment reverse primer: cagccctgttcagacttctcaat (Seq ID 7); Control fragment Taqman probe: taaggagataga- gatgggcgggcagtagg (Seq ID 10).
  • the amount of DNA used can be determined with the aid of the fragment without interfaces.
  • the other fragment can detect the methylation of the sequence. This allows the amount of DNA used to be reduced and the variability of the quantification to be reduced.
  • FIG. 1 shows the results of Example 1. The ⁇ Ct values are shown for the 20 samples embedded in paraffin, which were examined in this experiment.
  • FIG. 2 shows the results of Example 1.
  • the methylation rates for an assumed PCR Efficiency of E 2.
  • the figure shows that 5 out of 10 tumor samples, but only a single one of the ten normal reference tissue samples, had a RASSFL methylation of over one percent. This result corresponds to the expectation that the area examined in pulmonary tumor tissue is in hypermethylated form.
  • Figure 3 shows the results of Example 2.
  • the amount of methylated DNA used is plotted in percent on the x-axis.
  • the ratio of the two quantification reactions is plotted on the y-axis (2 ⁇ c ⁇ ).
  • the error bars correspond to the standard deviation of four repetitions.
  • FIG. 4 also shows results from example 2 (cf. FIG. 3).
  • the methylation level is plotted logarithmically on the x-axis.
  • the y-axis represents the ⁇ CTs.
  • FIG. 5 shows further results of Example 2. (see Figures 3 and 4).
  • the Fisher scores are shown for differentiating the investigated methylation levels.
  • a Fisher score of> 2 allows a distinction. Values below 2 are marked with an asterisk (*) in FIG. 5.
  • FIG. 6 shows the results of Example 3. The mean value of the CT values over the methylation level is plotted.
  • FIG. 7 also shows results from Example 3.
  • the Fisher scores for differentiating the methylation levels examined are shown.
  • a Fisher score of> 2 allows a distinction. Values under 2 are marked with an asterisk (*) in FIG.
  • FIG. 8 shows the results of Example 4.
  • the data were normalized using an external quantitative RealTime PCR. The results are shown below with the aid of an undigested control. It can be seen that both methods come to the same results.

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Abstract

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine Quantifi­zierung von methylierter DNA durch eine Kombination aus Restriktionsverdau und Real-Time-PCR. Hierzu wird die zu untersuchende DNA zunächst aus einer biologischen Probe isoliert. Danach wird die isolierte DNA mit einem methy­lierungsspezifischen Restriktionsenzym umgesetzt und an­ schließend mittels einer Real-Time-PCR amplifiziert, wo­bei nur dann Amplifikate gebildet werden, wenn die DNA zuvor nicht geschnitten wurde. Anschließend wird mit Hil­fe einer Referenzmessung der Anteil methylierter und un­methylierter DNA in der ursprünglichen Probe berechnet. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Diagnose und Prognose von Krebs und anderen mit einer Veränderung des Methylierungsstatus assoziierten Krank­heiten sowie zur Vorhersage von Arzneimittelwirkungen.

Description

Verfahren zur Quantifizierung methylierter DNA
Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung von methylierten Cytosinpositionen in DNA. 5 -Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifi- zierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt eine wichtige biologische Rolle, u.a. bei der Transkriptionsregulation, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese (zur Übersicht: Millar et al . : Five not four: History and significance of the fifth base . In: The Epi- genome, S. Beck and A. Olek (eds.), iley-VCH Verlag Weinheim 2003, S. 3-20). Die Identifizierung von 5- Methylcytosin ist insbesondere für die Krebsdiagnostik von erheblichem Interesse. Ein Nachweis von Methylcytosin ist allerdings schwierig, da Cytosin und Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweisen. Die herkömmlichen, auf Hybridisierung beruhenden DNA- Analyseverfahren sind daher nicht anwendbar. Dementsprechend arbeiten die gängigen Methoden zur Methylierungsa- nalyse nach zwei unterschiedlichen Prinzipien. Zum einen werden methylierungsspezifische Restriktionsenzyme benutzt, zum anderen erfolgt eine selektive chemische Umwandlung von nicht-methylierten Cytosinen in Uracil (sog. : Bisulfit-Behandlung, siehe etwa: DE 101 54 317 AI; DE 100 29 915 AI) . Die enzymatisch oder chemisch vorbe- handelte DNA wird dann meist amplifiziert und kann auf unterschiedliche Weise analysiert werden (zur Übersicht: WO 02/072880 S. 1 ff; Fraga and Esteller: DNA methylation: a profile of methods and applications . Biotechniques . 2002 Sep;33 (3) :632, 634, 636-49.). Zur sensitiven Analyse wird die DNA üblicherweise bisulfitiert und anschließend mittels unterschiedlicher PCR-Verfahrens amplifiziert (vgl.: etwa Her an et al . : Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation Status of CpG Islands. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1996 Sep 3; 93 (18) : 9821-6 Cottrell et al . : A real-time PCR assay for DNA- methylation using methylation-specific blockers. Nucl . Acids. Res. 2004 32: elO) . Verwendet werden dabei auch Real-Time-PCR-Varianten (etwa: „MethyLight" ; zur Übersicht: Trinh et al . : DNA methylation analysis by Methy- Light technology. Methods . 2001 Dec . ; 25 (4) : 456-62) ; WO 00/70090; US 6,331,393).
Eine Quantifizierung des Methylierungsgrades ist für verschiedene Anwendungen erforderlich, etwa für Klassifizie- rungen von Tumoren, für prognostische Aussagen oder für die Vorhersage von Arzneimittelwirkungen. Es sind unterschiedliche Verfahren zur Quantifizierung des Methylierungsgrades bekannt . In der Regel erfolgt dabei zunächst eine chemische Umwandlung der DNA und eine anschließende Amplifikation, etwa bei Ms-SNuPE, bei Hybridisierungen auf Microarrays, bei Hybridisierungsassays in Lösung oder bei der direkten Bisulfit-Sequenzierung (zur Übersicht: Fraga and Esteller 2002, a.a.o.) . Ein Problem bei diesen „Endpunktanalysen" besteht darin, dass die Amplifikation u.a. aufgrund Produkthemmung, Enzyminstabilität und Konzentrationsabnahme der Reaktionskomponenten ungleichmäßig erfolgen kann. Eine Korrelation zwischen der Menge an Amplifikat und der Menge an eingesetzter DNA ist daher nicht immer gegeben. Die Quantifizierung wird daher feh- leranfällig (vgl. : Kains : The PCR plateau phase - towards an understanding of its limitations. Biochem. Biophys . Acta 1494 (2000) 23-27) . Die auf einer Real-Time-PCR basierende Schwellenwertanalyse bestimmt die Menge an Amplifikat dagegen nicht am Ende der Amplifikation, son- dern in der exponentiellen Amplifikationsphase . Diese Methode setzt voraus, dass die Amplifikationseffizienz in der exponentiellen Phase konstant ist. Der sog. Schwellenwert Ct (cycle threshold) ist ein Maß für denjenigen PCR-Zyklus, bei dem das Signal in der exponentiellen Phase der Amplifikation zum ersten Mal größer als das Hin- tergrundrauschen ist. Die absolute Quantifizierung erfolgt dann über einen Vergleich des Ct-Werts der untersuchten DNA mit dem Ct-Wert eines Standards (vgl.: Trinh et al . 2001, a.a.O.; Lehmann et al . : Quantitative assess- ment of promoter hypermethylation during breast cancer development. Am J Pathol . 2002 Feb; 160 (2) : 605-12) .
Ein grundsätzliches Problem der oben beschriebenen Quantifizierungsverfahren besteht darin, dass die Bisulfitum- wandlung zu hohen Ausbeuteverlusten und zur Schädigung der DNA, z.B. durch Fragmentierung, führt (zur Übersicht: Grünau et al . : Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters . Nuc- leic Acids Res . 2001 Jul . 1;29(13)) . Zudem ist es schwierig, die Bisulfitsalze nach der Umwandlung aus der Reak- tionslösung zu entfernen, so dass es zu einer Inhibition der DNA-Polymerase in der anschließenden Amplifikation kommen kann. Ein zusätzliches Problem besteht darin, dass ein Großteil der klinischen Proben in Paraffin eingebettet ist (paraffin embedded tissue - PET) . Bei diesem Pro- benmaterial liegt die DNA bereits vor der Bisulfitbehand- lung stark fragmentiert vor, so dass eine Analyse nach einer Bisulfitumwandlung noch schwieriger ist.
Die oben beschriebenen Schwierigkeiten können umgangen werden, wenn es gelingt, eine schlagkräftige Kombination aus Restriktionsverdau und Real-Time-PCR zur Verfügung stellen. Ein auf Restriktion und Real-Time-PCR basierender Quantifizierungsassays für methylierte DNA ist bereits beschrieben (Lebrun et al . : A methyltransferase targeting assay reveals silencer-telomere interactions in budding yeast . Mol. Cell Biol . 2003 Mar; 23(5): Seiten 1498-1508, insbesondere Seite 1500, Fig. 1 b; Chu et al . : The use of real-time quantitative polymerase chain reac- tion to detect hypermethylation of the CpG islands in the Promoter region flanking the GSTP1 gene to diagnose pros- täte carcinoma. J. Urol . 2002 Apr.; 167 (4) : 1854-8) . Bei diesen Verfahren wird ein Fragment amplifiziert, das eine Erkennungstelle für ein Restriktionsenzym umfasst. Vor der Amplifikation wird die zu untersuchende DNA mit einem Restriktionsenzym umgesetzt, das die unmethylierte, nicht aber die methylierte DNA schneidet. In der anschließenden PCR kann nur die ungeschnittene - methylierte - DNA amplifiziert werden. Für eine Quantifizierung nach diesen Verfahren ist es jedoch erforderlich, dass zunächst die Gesamtmenge an eingesetzter DNA bestimmt wird. Nur so ist es möglich, die erzeugten Signale einem tatsächlichen
Wert zuzuordnen. Die DNA-Konzent ationsbeStimmung erfordert jedoch einen zusätzlichen Arbeitsschritt und schafft so eine zusätzliche Fehlerquelle. Insbesondere bei in Paraffin eingebettetem Gewebe ist eine DNA- Konzentrationsbestimmung nach den herkömmlichen Verfahren schwierig. Aufgrund irreversibler Modifikationen ist oft nur ein Teil dieser DNA tatsächlich amplifizierbar.
Eine weitere Kombination aus Restriktionsverdau und Real- time-PCR ist in Fukuzawa et al beschrieben (Epigenetic differences between Wilms ' tumours in white and east- Asian children. Lancet . 2004 Feb 7; 363 (9407) : 446-51) . Dieses Verfahren wird zur Untersuchung des Imprinting eingesetzt. Eine sensitive Quantifizierung wird nicht durchgeführt.
Im Folgenden wird zum ersten Mal eine Kombination aus Restriktionsverdau und Real-Time-PCR beschrieben, die auf überraschend einfache Weise eine sensitive Quantifizie- rung auch ohne eine DNA-Konzentrationsbestimmung ermöglicht. Versuchsaufbau, Durchführung und Auswertung der quantitativen Methylierungsanalyse werden so deutlich vereinfacht. Aufgrund der besonderen biologischen und medizinischen Bedeutung der Cytosin-Methylierung und aufgrund der oben erwähnten Nachteile der bisherigen Quantifizierungsverfahren stellt das erfindungsgemäße Verfahren einen wichtigen technischen Fortschritt dar.
Beschreibung
Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Quantifizierung von methylierter DNA, wobei folgende Schritte durchgeführt werden : a) die DNA wird mit mindestens einem methylie- rungsspezifischen Restriktionsenzym umgesetzt, b) es wird eine Real-Time-PCR durchgeführt, wobei die zu untersuchende Sequenz nur dann amplifiziert wird, wenn sie zuvor in Schritt a) nicht geschnitten worden ist, c) aus dem Signal der zu untersuchenden Sequenz und dem Signal einer Referenz-Messung wird der Anteil methylierter DNA in der ursprünglichen Probe berechnet .
Im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die zu untersuchende DNA für die Restriktionsenzyme zu- gänglich gemacht bzw. isoliert. Dabei kann die DNA je nach diagnostischer oder wissenschaftlicher Fragestellung aus unterschiedlichen Quellen stammen. Für diagnostische Fragestellungen dienen als Ausgangsmaterial bevorzugt Gewebeproben. Wie oben beschrieben hat die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Analyse Paraffineingebetteter Proben besondere Vorteile. Daneben ist es aber auch bevorzugt, die DNA aus Körperflüssigkeiten, insbesondere Serum, zu analysieren. In diesem Fall ist eine Isolierung der DNA nicht in jedem Fall notwendig. Weiter ist es denkbar, DNA aus Sputum, Stuhl, Urin oder Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit zu verwenden. Die DNA- Isolierung erfolgt nach Standardmethoden, aus Blut etwa unter Verwendung des Qiagen UltraSens DNA Extraktions- Kits.
Im zweiten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die DNA mit mindestens einem methylierungsspezifischen Restriktionsenzym umgesetzt. Dabei liegt mindestens eine Restriktionsstelle innerhalb der Sequenz, die im dritten Schritt amplifiziert werden soll. So wird erreicht, dass nur die DNA eines Methylierungsstatus amplifiziert wird.
Bevorzugt erfolgt die Restriktion mit Enzymen, die spezifisch unmethylierte DNA schneiden, so dass nur die methylierte DNA amplifiziert wird. Soweit verfügbar können a- ber auch Enzyme eingesetzt werden, die spezifisch methylierte DNA schneiden (z.B. McrB, New England Biolabs, U- SA) . Es gibt eine Vielzahl von Restriktionsenzymen, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden können. Nähere Informationen zu Restriktionsenzymen sind et- wa in der Datenbank „Rebase" zu finden (http://rebase.neb.com/; vgl. auch: Roberts et al . : REBASE: restriction enzymes and methyltransferases . Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, No . 1 418-420) .
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung liegen mehrere Restriktionsschnittstellen innerhalb der zu amplifizierenden Sequenz. So wird die Wahrscheinlichkeit, dass das Fragment geschnitten wird, erhöht. Die Gefahr falsch-positiver Signale ist damit verringert. Dies gilt insbesondere bei der Analyse von DNA aus Paraffinproben. Besonders bevorzugt trägt die zu amplifizierende Sequenz bis zu fünf Schnittstellen. Dabei ist es zum einen möglich, dass die Sequenz mehrere Restriktionsschnittstellen desselben Enzyms enthält. Weiterhin ist es auch denkbar, dass die Sequenz mehrere Restriktionsschnittstellen unterschiedlicher Enzyme trägt. Die Restriktion erfolgt dann parallel mit mehreren Enzymen gleichzeitig, wobei die verschiedenen Enzyme unter denselben Reaktionsbedingungen aktiv sein sollten. Alternativ wird die Restriktion nacheinander durchgeführt.
Die Restriktion erfolgt abhängig von dem eingesetzten Enzym nach Standardbedingungen. Diese sind etwa in den von den Herstellern mitgelieferten Protokollen zu finden.
Im dritten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Real-Time-PCR durchgeführt, wobei die zu untersuchende Sequenz nur dann amplifiziert wird, wenn sie zuvor im zweiten Schritt nicht geschnitten worden ist.
Unter einer Real-Time-PCR wird im Folgenden eine PCR verstanden, die es erlaubt, die Amplifikate bereits während der Amplifikation nachzuweisen. Dem Fachmann sind unterschiedliche Real-Time-PCR-Varianten verwandt, etwa SYBR- Green-, Lightcycler- , Taqman- , Sunrise-, Molecular Bea- con- oder Eclipse-Formen. Einzelheiten zum Aufbau der Primer und der Sonden gehören zum Stand der Technik (vgl.: US Patent 6,331,393 mit weiteren Nachweisen). So kann das Design der Sonden etwa über die „PrimerExpress"- Software von Applied Biosystems (für Taqman-Sonden) oder über MGB Eclipse Design Software von Epoch Biosciences (für Eclipse-Sonden) erfolgen.
Die PCR ist so konzipiert, dass die Amplifikate die Restriktionsstellen überspannen. Es werden daher nur dann Amplifikate gebildet, wenn zuvor keine Restriktion erfolgt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung sind die Amplifikate so gewählt, dass sie zwischen 50 bp und 150 bp lang sind. Auf diese Weise kann fragmentierte DNA aus Paraffin eingebettetem Gewebe leichter untersucht werden .
Im vierten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird aus dem Signal der zu untersuchenden Sequenz und dem Sig- nal einer Referenz-Messung der Anteil methylierter DNA in der ursprünglichen Probe berechnet. Die Referenz-Messung kann entweder vor der Restriktion erfolgen, so dass jede Reaktion die gleiche Menge DNA enthält. Die Menge der nach der Restriktion nachgewiesenen DNA (z.B. methylierte DNA) wird dann auf die eingesetzte Menge (Gesamt-DNA) bezogen. Die Gesamt-DNA kann dabei nach den bekannten Verfahren bestimmt werden, z.B. mittels einer Real-Time-PCR. Aus diesem Verhältnis lässt sich dann der Methylie- rungsgrad der Probe berechnen. Alternativ wird ein Teil der zu untersuchenden DNA nicht mit Enzymen behandelt und die DNA-Menge dieser DNA parallel in einer zweiten Reaktion mit dem selben Fragment quantifiziert (siehe im einzelnen unten) . In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein Referenz-Fragment verwendet.
Bei dem Referenz-Fragment handelt es sich um eine Sequenz, die unabhängig vom Methylierungsstatus die Gesamt- DNA im Reaktionsansatz repräsentiert. Das Referenzfragment wird von den Restriktionsenzymen nicht geschnitten und daher in der PCR unabhängig vom Methylierungsstatus amplifiziert. Dies lässt sich in einer Ausfuhrungsform dadurch erreichen, dass das Referenzfragment keine Schnittstellen für die eingesetzten Restriktionsenzyme aufweist. Durch einen Vergleich der Signale der Gesamt- DNA und der methylierten DNA lässt sich der Anteil der methylierten DNA quantifizieren. Das Referenz-Fragment besitzt bevorzugt in etwa die gleiche Größe wie die zu analysierende Sequenz und lässt sich mit gleicher Effizienz amplifizieren. Zudem befindet es sich bevorzugt in der Nähe, besonders bevorzugt in der unmittelbaren Nach- barschaft der zu analysierenden Sequenz. So ist sichergestellt, dass Fragmentierungen der DNA, wie sie etwa in Paraffin-Proben häufig vorkommen, nicht zu falschen Ergebnissen führen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Refe- renzfragment mit dem zu analysierenden Fragment identisch. Der Reaktionsansatz wird dann aufgeteilt, und nur ein Teil wird verdaut (s.u.).
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemä- ßen Verfahrens erfolgt die Amplifizierung der zu analysierenden Sequenz und des Referenzfragmentes gleichzeitig in einem Reaktionsgefäß. Dies hat den Vorteil, dass die Reaktionsbedingungen für beide Fragmente identisch sind. Bei dieser Ausfuhrungsform ist allerdings erforderlich, dass die beiden Sonden unterschiedliche Markierungen tragen.
In einer anderen bevorzugten Ausfuhrungsform finden die Amplifikationen in unterschiedlichen Gefäßen statt. Hier- durch lassen sich störende Wechselwirkungen zwischen den Fluoreszenzfarbstoffen vermeiden und eine Konkurrenz zwischen den beiden Amplifikationen ausschließen.
Mit Hilfe der Signale des Referenzfragmentes lässt sich schließlich der Methylierungsgrad der zu analysierenden
Sequenz quantifizieren. Die Signaldetektion erfolgt dabei je nach eingesetzter Real-Time-Variante nach dem Stand der Technik. Die Quantifizierung kann über unterschiedliche Berechnungsmethoden erfolgen. Bevorzugt wird die Dif- ferenz der beiden ct-Werte (Schwellenwerte) als quantitatives Kriterium für den Methylierungsgrad benutzt. Der Ct-Wert ist - wie oben beschrieben - ein Maß für denjenigen PCR-Zyklus, bei dem das Signal in der exponentiellen Phase der Amplifikation zum ersten Mal größer als das Hintergrundrauschen ist. Erfindungsgemäß erfolgt die Quantifizierung nach folgendem Prinzip: Verwendet man Enzyme, die spezifisch den unmethylierten Status schneiden, so wird nur die methylierte DNA amplifiziert. Je kleiner die Differenz zwischen dem Ct des Referenzfragmentes (Amplifikation der gesamten DNA) und dem Ct der zu analy- sierenden verdauten Probe (Amplifikation nur der methylierten DNA) ist, desto höher ist der Anteil der methylierten DNA.
Der Methylierungsgrad M kann über das Verhältnis der durch zwei unabhängige DNA-Quantifizierungen ermittelten DNA-Mengen berechnet werden. Die erste Quantifizierung erfolgt mit dem zu untersuchenden Fragment, es wird nur die Menge der ungeschnittenen DNA bestimmt. Die zweite Quantifizierung kann wahlweise mit Hilfe eines zweiten Referenzfragmentes, dessen Sequenz keine Schnittstellen enthält erfolgen, oder mit Hilfe des zu untersuchenden Fragments, indem die ungeschnittene DNA-Probe untersucht wird. Diese Referenz-DNA kann ein Aliquot der zu analysierenden DNA sein, welches nicht mit Restriktionsenzymen behandelt wurde. Im einfachsten Fall bestimmt man für jede Quantifizierung den Schwellenwert (CT) und erhält über den Vergleich mit einer Reihe von DNA- Quantifizierungsstandards die DNA-Menge. Diese setzt man mit der DNA-Menge der Referenzmessung ins Verhältnis.
M = DNA-MengeFragment/ DNA-MengeReferenz •
In anderen Fällen kann der Methylierungsgrad M etwa nach folgender Formel bestimmt werden :
M = E -ΔΔCt Dabei handelt es sich bei E um die PCR-Effizienz, die im optimalen Fall 2 beträgt. ΔCt entspricht der systematischen Differenz zwischen dem Schwellenwert des unge- schnittenen untersuchten Fragments und des Referenzfragmentes bei identischer Menge eingesetzter DNA. Diese Differenz ist eine für jedes zu untersuchende Fragment individuell zu bestimmende Konstante ΔΔCt ist die Differenz zwischen dem Schwellenwert des restringierten untersuch- ten Fragments und des Referenzfragments abzüglich der systematischen Differenz ΔCt . Zur Vereinfachung ist es auch möglich, folgende Formel zu verwenden:
M= 2 -ΔΔCt
Hier wird davon ausgegangen, dass die PCR mit optimaler Effizienz erfolgt.
Wird anstelle eines Referenzfragments die ungeschnittene Probe mit der restringierten Probe verglichen, erfolgt die Amplifikation nur des untersuchten Fragments und der systematische Unterschied entfällt. In diesem Fall wird der Methylierungsgrad nach folgender Formel berechnet:
M = E _ΔCt,
wobei hier ΔCt der Differenz des Schwellenwerts zwischen restringierter und nichtrestringierter Probe entspricht.
Zur Vereinfachung ist es auch möglich, folgende Formel zu verwenden :
M= 2 "ΔCt
Hier wird davon ausgegangen, dass die PCR mit optimaler Effizienz erfolgt. Eine Quantifizierung über die oben beschriebenen Verfahren ist besonders gut möglich, wenn die Assaybedingungen bezüglich der PCR-Effizienz zuvor optimiert wurden. Dies kann etwa mittels Variation der Primer, der Sonden, des Temperaturprogramms und der weiteren Reaktionsparameter geschehen. Eine Bestimmung der PCR-Effizienz ist über Standardverfahren möglich, etwa mittels eines Standards aus ungeschnittener genomischer DNA.
Bei Verwendung eines Referenzfragments kann der Methylierungsgrad auch unter Verwendung von Standard-DNA- Verdünnungen, wie sie in der Quantitativen PCR üblich sind, ermittelt werden. Hierfür werden sowohl für das un- tersuchte Fragment als auch für das Referenzfragment
Standardamplifikationskurven ermittelt und dazu verwendet, die Schwellenwerte für beide Fragmente in DNA-Mengen umzurechnen. Auf diese Weise wird nach erfolgter Restriktion aus dem Schwellenwert des untersuchten Fragments die Menge methylierter DNA in der Probe und aus dem Schwellenwert des Referenzfragments die Gesamtmenge an DNA in der Probe ermittelt. Das Verhältnis beider Werte entspricht dem Methylierungsgrad des untersuchten Fragments in der Probe .
Eine Kalibrierung der Quantifizierung ist über den Einsatz eines MethylierungsStandards möglich (etwa mit 0%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% und 100% Methylierungsgrad) . Die Herstellung von Methylierungsstandards und ihre Anwendung in der Methylierungsanalyse ist ausführlich in der Europäischen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen
EP 04 090 037.5 (Anmelderin: Epigenomics AG) beschrieben.
Eine besonders bevorzugte Ausfuhrungsform des erfindungs- gemäßen Verfahrens verwendet Kontrollen, mit denen überprüft werden kann, ob die Restriktion vollständig erfolgt ist. Dies kann in unterschiedlichen Variationen geschehen. In einer Ausführungsform wird als Kontrolle unmethylierte DNA verwendet. Die unmethylierte DNA sollte durch die Restriktionsenzyme vollständig umgesetzt werden, so dass in der PCR kein Amplifikat gebildet wird. Unmethylierte DNA ist aus unterschiedliche Quellen verfügbar, etwa eine genomweites Amplifikationsverfahren (vgl. Europäische Patentanmeldung 04 090 037.5, Anmeldetag: 5. Februar 2004, Anmelderin: Epigenomics AG). Eine andere Aus- führungsform stellt sicher, dass die Restriktionsenzyme nicht von Bestandteilen der biologischen Probe inhibiert werden. So können als Kontrolle ein weiteres Restriktionsenzym eingesetzt werden, das methylierungsunabhängig innerhalb des zu amplifizierenden Fragmentes schneidet. In dieser Kontrolle sollte die gesamte DNA - unabhängig von ihrem Methylierungsstatus - verdaut werden. Die PCR sollte daher kein Amplifikat generieren. Besonders bevorzugt ist es in dieser Variante, Isoschizomere einzusetzen, die über die gleiche Erkennungssequenz wie die ande- ren eingesetzte Restriktionsenzyme verfügen, aber methy- lierungunabhängig schneiden. In einer dritten Kontroll- Variante wird parallel zu den zu untersuchenden Fragmenten ein Kontroll-Gen analysiert, das nie methyliert vorliegt. Die entsprechende DNA sollte bei der Restriktion vollständig geschnitten werden, so dass auch hier in der PCR kein Amplifikat entstehen sollte. Auf diese Weise können Probleme, wie z.B. die unsachgemäße Präparation von Paraffinproben, adressiert werden.
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die zu analysierende Sequenz und das Referenzfragment identisch. Dabei wird die zu untersuchende Probe aufgeteilt, und nur ein Teil der Probe wird mit Restriktionsenzymen umgesetzt. Der andere Teil bleibt unbehandelt. Erfindungsgemäß ist demnach ein Verfahren zur Quantifizierung von methylierter DNA, wobei folgende Schritte durchgeführt werden: a) die DNA wird in zwei gleiche Teile aufgeteilt, b) der erste Teil der DNA wird mit einem methylie- rungsspezifischen Restriktionsenzym umgesetzt, während der andere Teil unbehandelt bleibt, c) die DNA beider Teile wird mittels einer Real- Time-PCR amplifiziert, wobei im ersten Teil der Probe nur dann Fragmente gebildet werden, wenn die DNA zuvor nicht geschnitten wurde, d) aus den Signalen der beiden Teile wird der Anteil methylierter und unmethylierter DNA in der ursprünglichen Probe berechnet.
Im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die zu untersuchende DNA aus unterschiedlichen Quellen wie oben beschrieben den Restriktionsenzymen zugänglich gemacht bzw. isoliert. In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform werden Paraffin-Proben untersucht.
Im zweiten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die isolierte DNA in zwei gleiche Teile aufgeteilt. Der eine Teil der Proben wird dann im dritten Schritt mit einem methylierungsspezifischen Restriktionsenzym umge- setzt. Dabei liegt mindestens eine Restriktionsstelle innerhalb der Sequenz, die im vierten Schritt amplifiziert werden soll. So wird erreicht, dass nur die DNA eines Methylierungsstatus amplifiziert wird. Der zweite Reaktionsansatz wird dagegen nicht mit einem Restriktionsenzym umgesetzt. Hier wird in der anschließenden PCR dann die gesamte DNA unabhängig vom Methylierungsstatus amplifiziert .
Bevorzugt erfolgt die Restriktion mit Enzymen, die spezi- fisch unmethylierte DNA schneiden, so dass nur die methylierte DNA amplifiziert wird. Soweit verfügbar können a- ber auch Enzyme eingesetzt werden, die spezifisch methylierte DNA schneiden (siehe oben) . Wie oben im Detail beschrieben, gibt es eine Vielzahl von Restriktionsenzymen, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden können .
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung liegen mehrere Restriktionsschnittstellen innerhalb der zu amplifizierenden Sequenz (s.o.). So wird die Wahrscheinlichkeit, dass das Fragment geschnitten wird, erhöht. Die Gefahr falsch-positiver Signale ist damit verringert. Dies gilt insbesondere bei der Analyse von DNA aus Paraffinproben. Besonders bevorzugt trägt die zu amplifizie- rende Sequenz bis zu fünf Schnittstellen. Dabei ist es zum einen möglich, dass die Sequenz mehrere Restriktions- schnittstellen desselben Enzyms enthält. Weiterhin ist es auch denkbar, dass die Sequenz mehrere Restrik ions- schnittstellen unterschiedlicher Enzyme trägt. Die Re- striktion erfolgt dann parallel mit mehreren Enzymen gleichzeitig, wobei die verschiedenen Enzyme unter denselben Reaktionsbedingungen aktiv sein sollten.
Die Restriktion erfolgt abhängig von dem eingesetzten En- zym nach Standardbedingungen. Diese sind etwa in den von den Herstellern mitgelieferten Protokollen zu finden. Es ist sinnvoll, dem zweiten Reaktionsansatz, bei dem keine Restriktion erfolgt, diejenigen Reagenzien zuzufügen, die auch im ersten Ansatz enthalten sind. So kann erreicht werden, dass die anschließende Amplifikation unter möglichst identischen Reaktionsbedingungen erfolgt. Im vierten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens werden beide Reaktionsansätze mittels einer Real-Time-PCR amplifiziert (s.o.). Die PCR ist so konzipiert, dass die Amplifikate die Restriktionsstellen überspannen. Es werden daher nur dann Amplifikate gebildet, wenn zuvor keine Restriktion erfolgt ist.
Im vierten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird aus den erhaltenen Signalen der beiden zuvor getrennten Probenteile der Anteil methylierter und unmethylierter DNA in der ursprünglichen Probe berechnet. Die Signaldetektion erfolgt dabei je nach eingesetzter Real-Time- Variante nach dem Stand der Technik. Die Quantifizierung kann wie oben im Detail beschrieben über unterschiedliche Berechnungsmethoden erfolgen. Bevorzugt wird die Differenz der beiden ct-Werte (Schwellenwerte) als quantitatives Kriterium für den Methylierungsgrad benutzt. Erfindungsgemäß erfolgt die Quantifizierung nach folgendem Prinzip: Verwendet man Enzyme, die spezifisch den un- methylierten Status schneiden, so wird nur die methylierte DNA amplifiziert. Je kleiner die Differenz zwischen dem Ct der nicht verdauten Probe (Amplifikation der gesamten DNA) und dem Ct der verdauten Probe (Amplifikation nur der methylierten DNA) ist, desto höher ist der Anteil der methylierten DNA. Mögliche Formeln zur Berechnung des Methylierungsgrades sind oben angegeben. Insbesondere kann folgende Formel benutzt werden: M = E ΔCt.
Eine Quantifizierung über die oben beschriebenen Verfahren ist besonders gut möglich, wenn die Assaybedingungen bezüglich der PCR-Effizienz zuvor optimiert wurden (s.o.). Es können unterschiedliche KontrollSysteme eingesetzt werden, die im Detail oben beschrieben sind, und die auch für diese Ausfuhrungsform anwendbar sind. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders gut zur sensitiven Quantifizierung von Methylierungsgraden. Dabei wird das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders, um die DNA eines Methylierungsstatus (etwa me- thylierte DNA) vor einem starken Hintergrund an DNA des anderen Methylierungsstatus (etwa: unmethylierter DNA) nachzuweisen. Dabei beträgt der Anteil der nachzuweisenden DNA bevorzugt weniger als 10%. In anderen bevorzugten Ausfuhrungsformen beträgt der Anteil der nachzuwei- senden DNA weniger als 5% bzw. weniger als 1%.
Besonders bevorzugt werden klinische Proben untersucht, insbesondere Körperflüssigkeiten oder in Paraffin eingebettetes Gewebe . Eine besonders bevorzugte Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Diagnose oder Prognose von Krebserkrankungen oder anderen mit einer Veränderung des Methylierungsstatus assoziierten Krankheiten. Hierzu gehören u.a. CNS-Fehlfunktionen, Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psycho- logische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheiten, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungspro- zess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich außerdem zur Vorhersage von unerwünschten Arzneimittelwirkungen und zur Unterschei- düng von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung. Erfindungsgemäß ist auch ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, der aus mindestens einem Restriktionsenzym, zwei Primern, einer Polymerase sowie entweder einer sequenzspezifischen Real-Time-Sonde oder einem nicht sequenzspezifischen interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff besteht, sowie optional weitere für eine PCR erforderliche Reagenzien enthält.
Beispiele
Beispiel 1: Untersuchung von Paraffinproben
Das folgende Beispiel verdeutlicht die Erfindung. Die Me- thylierung des RASSFl-Gens in Lungentumorproben sollte quantifiziert werden. Dazu wurde die DNA aus geschnittenen, paraffin-eingebetteten Sektionen aus 10 Lungentumorproben und 10 normalen Gewebeproben (normal adjacent lung tissue) präpariert. Die Deparaffinierung und die Lysis des Gewebes erfolgten nach Standardverfahren. Die DNA wurde aus dem Lysispuffer mit Hilfe des QIAmp DNA Mini Kits (Qiagen) extrahiert und mittels einer UC-Messung quantifiziert .
Die folgenden Schritte wurden für alle 20 Proben parallel durchgeführt. 2μg der DNA wurden in 380μl Y+/Tango Puffer (Fermentas) in 0,5ml PCR Gefäßen gelöst. 190μl dieser Lösung - genau die Hälfte des Gesamtvolumens - wurden in ein identisches zweites PCR-Gefäß pipettiert. Zu dem ersten Ansatz wurden 2,5μl Hpall und 2 , 5μl Hin6I Restrikti- onsendonuklease (beide Fermentas) gegeben. Zum zweiten Ansatz wurden 5μl einer Mischung aus Glycerin und Wasser (v:v =1:1) gegeben. Alle 40 Proben wurden bei 37 °C in einem Eppendorf-Thermocycler für fünf Stunden inkubiert. Anschließend wurde eine weiteres Mal eine Restriktionsen- zymmischung (bzw. Wasser-Glycerin-Mischung) zu den einzelnen Ansätzen gegeben. Die Inkubation wurde auf 10 Stunden ausgedehnt. Nach dieser Zeit wurden die Restriktionsenzyme hitzeinaktiviert (65 °C für 10 Minuten) .
Anschließend wurden 38 μl aus jedem Ansatz in eine 96er Platte pipettiert und mit 62 μl Wasser versetzt. Schließlich wurden sowohl die mit Restriktionsenzym behandelten wie auch die nicht behandelten Proben mittels einer quan- titativen Real-Time PCR analysiert. Dazu wurden 12 μl eines Mastermixes, der SybrGreen und die Primer CGGCTCTCCTCAGCTCCTT (SEQ ID NO 1) und GTGCTTCGCTGGCTTTGG (SEQ ID NO 2) enthielt, in eine 96er Taqman Platte pipettiert. Anschließend wurden jeweils 8μl der Proben zugege- ben (jeweils als Doppelwert) . Die Real-Time PCR wurde in einem ABI 7700 Gerät mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt: 15 Minuten bei 95 °C; 50 Zyklen von: 15 Sekunden bei 95 °C, 45 Sekunden bei 65 °C, 75 Sekunden bei 72 °C; 15 Sekunden bei 95 °C; gefolgt von einer Stunde bei 50 °C.
In dem Enzym-behandelten Ansatz wurde nur eine Amplifika- tion der methylierten Kopien des RASSF1 Gens beobachtet, da die unmethylierten Kopien vor der PCR verdaut wurden. Im unverdauten Ansatz dagegen wurden sowohl methylierte wie auch unmethylierte DNA amplifiziert. Die Gleichung
ΔCt = Ctbiank - Ctrestricted
beschreibt die relative Menge an unmethylierter DNA in einer DNA Probe. Ein ΔCt Wert von Null bedeutet, dass die untersuchte DNA vollständig methyliert war. Ein Wert von 0,5 repräsentiert eine 50%ige Methylierung im Falle optimierter PCR-Reaktionsbedingungen. Geringere Methylie- rungsgrade führen zu höheren ΔCt Werten. Die relative Menge an methylierten RASSFl-Gen in einer Probe wird durch folgende Gleichung beschrieben:
M = E"Δct
Dabei stellt E die PCR-Effizienz dar, die leicht über Standardverfahren (s.o.) bestimmt werden kann.
Figur 1 zeigt die ΔCt Werte für die 20 in Paraffin einge- betteten Proben (RASSF.l lung-samples 1-20), die in diesem Experiment untersucht wurden, Figur 2 die entsprechenden Methylierungsraten für die angenommene PCR- Effizienz E=2. Der Figur ist zu entnehmen, dass 5 von 10 Tumorproben, jedoch nur eine einzige der zehn normalen Referenzgewebeproben, eine RASSFl-Methylierung von über einem Prozent aufwiesen. Dieses Ergebnis entspricht der Erwartung, dass der untersuchte Bereich in Lungentumorge- webe in hypermethylierter Form vorliegt.
Beispiel 2 : Kalibrierung mit Hilfe einer unbehandelten Referenzprobe
DNA aus „buffy coat" (Lymphozyten) wurde mit Sssl - Methyltransferase behandelter DNA gemischt. Der untersuchte Promoter des FOXL2-Gens ist in gesunden Lymphozyten nicht methyliert. Dadurch wurden DNA-Mischungen mit unterschiedlichen Methylierungsniveaus hergestellt (100%; 75%; 50%; 25%; 10%; 5%; 2,5%; 1,25%; 0,625%; 0,3125%; 0,156%; 0,078%; 0,039%; 0,019% und 0%). Diese wurden mit Restriktionspuffer (Y-Tango Puffer) vermischt und in zwei Teile geteilt. Ein Teil wurde mit den methylierungssensi- tiven Enzymen Hpall und Hinβl geschnitten. Der andere wurde nicht behandelt. Die DNA-Menge wurde mit einem 5'- Exonuklease Verfahren (TaqMan) quantifiziert. Die PCR erfolgte unter Standardbedingungen mit folgendem Tempera- turprogramm: 10 min 95°C, 45 Zyklen: 15 sec 95°C, 60 sec 65 °C. Es wurde ein Fragment mit einer Länge von 141 bp amplifiziert. Als Primer wurden verwendet: Forward Primer: ccccaagactgttaaggtgtg (Seq ID 3) ; Reverse Primer: acttctgggtgatgcgagtg (Seq ID 4); Taqman Probe: cgcagctca- gaacccttggaagc (Seq ID5) .
In Figur 3 ist auf der x-Achse die Menge der eingesetzten methylierten DNA in Prozent aufgetragen. Auf der y-Achse ist das Verhältnis der beiden Quantifizierungsreaktionen aufgetragen (2-Δcτ) . Die Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung von vier Wiederholungen. In Figur 4 ist auf der x-Achse das Methylierungsniveau logarithmisch aufgetragen. Die y-Achse stellt die ΔCTs dar.
Figur 5 listet die berechneten Fisher-Scores für die Unterscheidung der untersuchten Methylierungsniveaus auf. Ein Fisher-Score von >2 erlaubt eine Unterscheidung. Werte unter 2 sind in der Figur 5 mit einem Stern (*) ge- kennzeichnet.
Beispiel 3 : Kalibrierung durch die Verwendung gleicher DNA-Mengen
Unterschiedliche DNA-Mischungen wurden wie in Beispiel 2 hergestellt. Vor der Behandlung mit Restriktionsenzymen wurden alle Proben quantifiziert und jeweils gleiche DNA- Mengen eingesetzt. Aus dem Verhältnis der Gesamtmenge an DNA zu der DNA-Menge, die nach der Restriktion gemessen wurde, lässt sich der Methylierungsgrad bestimmen.
In Figur 6 ist der Mittelwert der CT-Werte über dem Methylierungsniveau aufgetragen. Figur 7 listet die berechneten Fisher-Scores für die Unterscheidung der untersuchten Methylierungsniveaus auf. Ein Fisher-Score von >2 erlaubt eine Unterscheidung. Werte unter 2 sind in der Figur 7 mit einem Stern (*) gekennzeichnet .
Beispiel 4: Kalibrierung mit Hilfe eines zweiten Fragments in einer zweiten Reaktion.
Es soll der Methylierungsgrad einer Sequenz des GSTPi- Gens in Proben von Prostatakrebspatienten untersucht werden. Dazu wurde in einem Versuch ein Kontrollfragment benutzt, dass von den eingesetzten Restriktionsenzymen nicht geschnitten wird. Das Kontrollfragment liegt ebenfalls innerhalb des GSTPi-Gens und hat eine Länge von 135 bp . In einem anderen Versuch wurde die zu untersuchende Sequenz in zwei Ansätze aufgeteilt, von denen nur der eine Ansatz mit Restriktionsenzymen umgesetzt wurde. Das Amplifikat hat eine Länge von 153 bp . Die PCR erfolgte unter Standardbedingungen mit einem SYBR" Green Master Mix mit folgendem Temperaturprogramm: 10 min 95 °C; 45 Zyklen (15 sec 95 °C; 45 sec 65 °C; 1:15 min 72 °C) . Folgende Primer wurden verwendet: Kontrollfragment : Forward- Primer: acgcttgcatttgtgtcgg (Seq ID 6); Reverse-Primer: cagccctgttcagacttctcaat (Seq ID 7) . Zu analysierendes Fragment: Forward-Primer : gacctgggaaagagggaaag (Seq ID 8) ; Reverse-Primer: ggcgaaactccagcgaag (Seq ID 9) .
Die Ergebnisse sind in Figur 8 dargestellt. Es zeigt sich, dass beide Verfahren zu den gleichen Ergebnissen kommen. Oben erfolgte die Normalisierung der Daten mit Hilfe einer externen quantitativen Real-Time PCR. Unten sind die Ergebnisse mit Hilfe einer unverdauten Kontrolle gezeigt. Beispiel 5: Kalibrierung mit Hilfe eines zweiten Fragments in einer Duplex Reaktion.
Wie in Beispiel 2 soll das FOXL2-Gen analysiert werde. Dazu werden DNA-Mischungen analog zu Beispiel 1 hergestellt. Anschließend wird ausschließlich die geschnittene Fraktion quantifiziert. In einer Reaktion werden dafür ein Fragment, dessen Sequenz Schnittstellen der verwende- ten Enzyme enthält, und ein Fragment ohne Schnittstellen amplifiziert. Die PCR erfolgt unter Standardbedingungen mit folgendem Temperaturprogramm: 10 min 95 °C, 45 Zyklen: 15 sec 95 °C, 60 sec 65 °C. Als Primer werden verwendet: Forward Primer ccccaagactgttaaggtgtg (Seq ID 3); Reverse Primer: acttctgggtgatgcgagtg (Seq ID 4) ; Taqman Probe: cgcagctcagaacccttggaagc (Seq ID 5); Kontrollfragment Forward Primer: acgcttgcatttgtgtcgg (Seq ID 6) ; Kontrollfragment Reverse Primer: cagccctgttcagacttctcaat (Seq ID 7); Kontrollfragment Taqman Probe: taaggagataga- gatgggcgggcagtagg (Seq ID 10) .
Mit Hilfe des Fragmentes ohne Schnittstellen kann die Menge der eingesetzten DNA bestimmt werden. Das andere Fragment kann die Methylierung der Sequenz nachweisen. Dadurch lässt sich die Menge der eingesetzten DNA reduzieren und die Variabilität der Quantifizierung reduzieren.
Beschreibung der Figuren
Figur 1 zeigt die Ergebnisse des Beispiels 1. Gezeigt sind die ΔCt Werte für die 20 in Paraffin eingebetteten Proben, die in diesem Experiment untersucht wurden.
Figur 2 zeigt die Ergebnisse des Beispiels 1. Gezeigt sind die Methylierungsraten für eine angenommene PCR- Effizienz von E=2. Der Figur ist zu entnehmen, dass 5 von 10 Tumorproben, jedoch nur eine einzige der zehn normalen Referenzgewebeproben, eine RASSFl-Methylierung von über einem Prozent aufwiesen. Dieses Ergebnis entspricht der Erwartung, dass der untersuchte Bereich in Lungentumorge- webe in hypermethylierter Form vorliegt.
Figur 3 zeigt die Ergebnisse des Beispiels 2. Auf der x- Achse ist die Menge der eingesetzten methylierten DNA in Prozent aufgetragen. Auf der y-Achse ist das Verhältnis der beiden Quantifizierungsreaktionen aufgetragen (2~ cτ) . Die Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung von vier Wiederholungen.
Figur 4 zeigt ebenfalls Ergebnisse des Beispiels 2 (vgl. Figur 3) . Auf der x-Achse ist das Methylierungsniveau logarithmisch aufgetragen. Die y-Achse stellt die ΔCTs dar.
Figur 5 zeigt weitere Ergebnisse des Beispiels 2. (vgl. Figuren 3 und 4) . Gezeigt sind die Fisher-Scores für die Unterscheidung der untersuchten Methylierungsniveaus. Ein Fisher-Score von >2 erlaubt eine Unterscheidung. Werte unter 2 sind in der Figur 5 mit einem Stern (*) gekennzeichnet .
Figur 6 zeigt die Ergebnisse des Beispiels 3. Aufgetragen ist der Mittelwert der CT-Werte über dem Methylierungsniveau.
Figur 7 zeigt ebenfalls Ergebnisse des Beispiels 3. Gezeigt sind die Fisher-Scores für die Unterscheidung der untersuchten Methylierungsniveaus. Ein Fisher-Score von >2 erlaubt eine Unterscheidung. Werte unter 2 sind in der Figur 7 mit einem Stern (*) gekennzeichnet. Figur 8 zeigt die Ergebnisse des Beispiels 4. Oben erfolgte die Normalisierung der Daten mit Hilfe einer externen quantitativen RealTime PCR. Unten sind die Ergebnisse mit Hilfe einer unverdauten Kontrolle gezeigt Es zeigt sich, dass beide Verfahren zu den gleichen Ergebnissen kommen.

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur Quantifizierung von methylierter DNA, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Schritte durchgeführt werden:
a) die DNA wird mit mindestens einem methylie- rungsspezifischen Restriktionsenzym umgesetzt,
b) es wird eine Real-Time-PCR durchgeführt, wobei die zu untersuchende Sequenz nur dann amplifiziert wird, wenn sie zuvor in Schritt a) nicht geschnitten worden ist,
c) aus dem Signal der zu untersuchenden Sequenz und dem Signal einer Referenz-Messung wird der Anteil methylierter DNA in der ursprünglichen Probe berechnet .
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzmessung mit Hilfe eines Referenzfragmentes durchgeführt wird, das sich in der Nähe der zu analysierenden Sequenz befindet.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation der zu analysierenden Sequenz und des Referenzfragmentes gleichzeitig in einem Reaktionsgefäß erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation der zu analysierenden Sequenz und des Referenzfragmentes in unterschiedlichen Gefäßen stattfinden.
5. Verfahren zur Quantifizierung von methylierter DNA, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Schritte durchgeführt werden: a) die isolierte DNA wird in zwei gleiche Teile aufgeteilt, b) der erste Teil der DNA wird mit einem methylie- rungsspezifischen Restriktionsenzym umgesetzt, wäh- rend der andere Teil unbehandelt bleibt, c) die DNA beider Teile wird mittels einer Real-Time- PCR amplifiziert, wobei im ersten Teil der Probe nur dann Fragmente gebildet werden, wenn die DNA zuvor nicht geschnitten wurde, d) aus den Signalen der beiden Teile wird der Anteil methylierter und unmethylierter DNA in der ursprünglichen Probe berechnet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe in Paraffin eingebettet ist.
7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die zu amplifizierende Sequenz mehrere Restriktionsschnittstellen trägt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zu amplifizierende Sequenz mehrere Restriktionsschnittstellen desselben Enzyms trägt.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zu amplifizierende Sequenz Restriktions- Schnittstellen unterschiedlicher Enzyme trägt.
10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Methylierungsgrad M nach folgender Formel berechnet wird: M = E" Δct, wobei es sich bei E um die PCR-Effizienz und bei -ΔΔCt um die Differenz zwischen dem Schwellenwert des restringierten untersuchten Fragments und des Referenzfragments abzüglich der systematischen Differenz ΔCt handelt .
11. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Methylierungsgrad M nach folgender Formel Δct berechnet wird: M = E" , wobei es sich bei E um die PCR-Effizienz und bei -ΔCt um die Differenz zwischen dem Schwellenwert des Referenzfragmentes und dem Schwellenwert der geschnittenen Probe handelt.
12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kontrolle durchgeführt wird, mit der überprüft werden kann, ob die Restriktion vollständig erfolgt ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass als Kontrolle unmethylierte DNA eingesetzt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass zur Kontrolle ein weiteres Restriktionsenzym eingesetzt wird, das methylierungsunabhängig innerhalb des zu amplifizierenden Fragmentes schneidet.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass ein Isoschizomer eingesetzt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass ein Kontrollgen analysiert wird, dass nicht me- thyliert vorliegt.
17. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Quantifizierung zur Diagnose von Krebserkrankungen oder anderen mit einer Veränderung des Methylierungsstatus assoziier- ten Krankheiten erfolgt.
18. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Quantifizierung zur Vorhersage von unerwünschten Arzneimittelwirkun- gen und zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben, oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung erfolgt .
19. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine sensitive Quantifizierung erfolgt.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil des nachzuweisenden Methylierungssta- tus weniger als 10% beträgt.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil des nachzuweisenden Methylierungsstatus weniger als 5% beträgt.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil des nachzuweisenden Methylierungsstatus weniger als 1% beträgt.
23. Ein Kit zur Durchführung eines der Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 22, der aus mindestens einem Restriktionsenzym, zwei Primern, einer Poly erase und einer spezifischen Real-Time-Sonde oder einem nicht sequenzspezifischen interkalierenden Fluoreszenzfarb- Stoff besteht sowie optional weitere für eine PCR erforderliche Reagenzien enthält.
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