EP1732963A2 - Polymere de haut poids moleculaire a base n,n-dimethylacrylamide - Google Patents

Polymere de haut poids moleculaire a base n,n-dimethylacrylamide

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Publication number
EP1732963A2
EP1732963A2 EP05739585A EP05739585A EP1732963A2 EP 1732963 A2 EP1732963 A2 EP 1732963A2 EP 05739585 A EP05739585 A EP 05739585A EP 05739585 A EP05739585 A EP 05739585A EP 1732963 A2 EP1732963 A2 EP 1732963A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polymer
solid support
molecules
chosen
polymers
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05739585A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jan Sudor
Valessa Barbier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP1732963A2 publication Critical patent/EP1732963A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F265/00—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to polymers of unsaturated monocarboxylic acids or derivatives thereof as defined in group C08F20/00
    • C08F265/10—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to polymers of unsaturated monocarboxylic acids or derivatives thereof as defined in group C08F20/00 on to polymers of amides or imides

Definitions

  • the present invention relates to high molecular weight statistical polymers based on N, N-dialkylacrylamide and monomers functionalized laterally by molecules of interest.
  • the present invention relates to N, N-DIMETHYLACRYLAMIDE AND MONOMERS FUNCTIONALIZED BY PROBE MOLECULES AND USES THEREOF. , when used for the preparation of solid supports comprising at least one surface on which said polymers are adsorbed.
  • the present invention also relates to the solid supports thus modified and to their process for obtaining, as well as to their various uses, in particular for the immobilization of molecules of interest or the carrying out of chemical, biochemical or biological reactions.
  • the biological molecules are immobilized on the support via a bond covalent so that the molecules do not detach from the support during the use of the chips, especially during the washing steps.
  • this immobilization is generally carried out in two distinct stages: - a first stage of functionalization of the supports which consists in a chemical modification of their surface by grafting of synthetic molecules
  • Another approach consists in immobilizing ON via the copolymerization of ON functionalized by acrylamide with a crosslinked polyacrylamide (Rehman FN, et al., Nucleic Acid Research, 1999, 27 (2), 649-655).
  • the gels can be prepared by the techniques of conventional polymerization and well known to those skilled in the art such as radical polymerization.
  • the surfaces thus prepared have a high density of probes stably attached.
  • the surfaces of these supports on the other hand, have the drawback of being permanently modified and therefore cannot be easily regenerated. It has also already been proposed, in particular by Southern E. et al, Nat.
  • 5,695,936 describes a method of detecting a nucleotide sequence of interest using a nucleotide probe labeled with a tracer.
  • a reagent consisting of a copolymer based on N-vinylpyrrolidone or maleic anhydride, having a molecular mass of between 5000 and 400,000 g / mol and comprising lateral substituents of oligonucleotide nature.
  • the immobilization of this copolymer on the surface of the support is carried out in a fairly complicated manner via a complex between the solid support, a probe labeled with a tracer, a reagent and a target nucleic acid.
  • US Patent 5,453,461 also describes biologically active polymers of formula P- (A) q in which P represents a linear, branched or crosslinked polymer formed for example from acrylic monomers, A represents a biologically active section and can for example be biotin or an ON comprising from 1 to 80 nucleotide units and q is an integer equal to 1 or 2. Depending on the structure of these polymers, A is always positioned at the end of the polymer chain and not sideways.
  • 5,723,344 describes the preparation of copolymers formed from an N-vinylpyrrolidone monomer and a second monomer comprising a reactive function allowing the attachment by covalent bond of a biological ligand capable of forming a complex with a target molecule such as for example an antigen / antibody complex, polynucleotide / polynucleotide, polynucleotide / nucleic acid, antibody / hapten, hormone / receptor, as well as their capacity to adsorb on the surface of solid supports.
  • Such copolymers have a molecular weight generally between 1000 and 500,000, preferably between 10,000 and 250,000 and contain 25 to 70% of units derived from N-vinylpyrrolidone.
  • the supports thus prepared can be used for the immobilization of target molecules in solution, in particular in methods for detecting and assaying nucleotide sequences.
  • the layers of polymers adsorbed on such supports nevertheless have the disadvantage of being very unstable, due to the relatively small molecular size of these copolymers and the high percentage of lateral substituents (30 to 75%).
  • American patent US Pat. No. 6,692,914 also describes sensors made up of a substrate, the surface of which comprises a plurality of chains of segmented polymers (block polymers) in the form of a brush comprising a water-soluble or water-dispersible segment and at least one chosen probe. among biological molecules, linked to said segment.
  • trypsin can be attached to the surface of reactors and undergoes, in this case, very little autolysis compared to trypsin in solution.
  • the fixation of the trypsin is carried out on quartz or silica microbeads which are then inserted into microcapillaries which serve as reactors for trypsin.
  • the fixation of trypsin is carried out by means of a Schiff base reduction reaction between a residual primary amino group of trypsin and an aldehyde group carried by the surface (see in particular Muilin C, in “Methods in Enzymology", Colowick, SP, Caplan NO Eds., Académie Press, New York, 1987, Vol 136).
  • Such methods are however long and laborious and are not entirely satisfactory.
  • after immobilization of the trypsin on the surface of the supports there remain parts of the surface which have not been modified and which it is necessary to saturate in order to minimize the non-specific reactions of adsorption of molecules. in solution (peptides, proteins for example).
  • the present invention firstly relates to a water-soluble statistical polymer (not segmented) comprising probe molecules as lateral substituents, characterized by the fact: - that it results from the copolymerization of a monomer A of
  • the water-soluble statistical polymers in accordance with the present invention and as defined above are capable of physically adsorbing stably to the surface of solid supports, and thus make it possible to lead to solid supports comprising at least one surface functionalized by probe molecules such as for example nucleic acid or protein chips on which it is then possible to immobilize target molecules of interest while minimizing the adsorption of other molecules in solution.
  • probe molecules such as for example nucleic acid or protein chips
  • the polymers in accordance with the invention do not lead to the formation of a brush of polymers adsorbed by one of their ends on the surface of the support.
  • the term “small organic molecule” is understood to mean organic molecules preferably having a molecular weight less than or equal to 1000 g / mole.
  • said polymer has a molecular mass greater than or equal to 1.10 g / mole. The inventors have indeed found that the stability of surfaces functionalized by such polymers was even greater when the polymers used had such a molecular weight.
  • N, N- [dialkyl (C] -C 4 ) acrylamide] constituting the copolymers in accordance with the invention, mention may be made of methyl, ethyl, w-propyl and zz-butyl groups, the methyl group being very particularly preferred.
  • monomer A the
  • N, N-dimethylacrylamide is therefore very particularly preferred.
  • monomers B mention may in particular be made of vinyl monomers and acrylamides such as acrylic and methacrylic acids, N-aminoalkyl acrylamides, N-aminoalkyl methacrylamides, aminoalkyl acrylates and aminoalkyl methacrylates, in which the alkyl group may represent for example the ethyl, propyl, butyl, pentyl, or hexyl group.
  • the probe molecules present in the polymer as lateral substituents are preferably chosen from active biological molecules having a limited lifespan, such as enzymes.
  • the degree of incorporation of the probe molecules is between 1 and 20% by number relative to the total number of monomeric units of monomer A of N, N- [dialkyl (Cj -
  • the polymers in accordance with the invention and as described above can be prepared according to conventional copolymerization techniques well known to those skilled in the art, such as, for example, radical copolymerization, by reacting the monomers A as defined above. above with monomers Bl or B2 as defined above in a suitable solvent such as water, in the presence of a polymerization activator such as for example a red / ox couple such as the ammonium persulfate / sodium metabisulfite couple.
  • a polymerization activator such as for example a red / ox couple such as the ammonium persulfate / sodium metabisulfite couple.
  • the preparation of the monomers B2 can also be carried out according to conventional methods and well known to those skilled in the art, for example by reacting, under anhydrous conditions in a suitable organic solvent such as dichloromethylene, tetrahydrofuran (THF), dimethylformamide ( DMF) or dimethylsulfoxide (DMSO), a probe molecule containing a carboxylic group (biotin for example) with the vinyl group of a copolymerized monomer such as for example N-aminopropyl methacrylamide, in the presence of a coupling agent such as for example the dicyclohexyl carbodiimide; the reaction of a carboxyl group and of an ine group being in fact well known for a long time in the literature, in particular in the article by Khorana HG et al, Chem.
  • a suitable organic solvent such as dichloromethylene, tetrahydrofuran (THF), dimethylformamide ( DMF) or dimethylsulfoxide (DM
  • trypsin modified with a vinyl group can be prepared according to the method described by Plate NA et al, Polymer Science USSR, 1989, 31, 216-219.
  • the polymers according to the invention can be characterized by classical analytical techniques such as refractive index diffusion exclusion chromatography and detection by light scattering or by viscosimetry in order to collect information on the size of the polymers or even by magnetic resonance techniques nuclear (NMR) to gather information on their structure.
  • NMR magnetic resonance techniques nuclear
  • the present invention also relates to the use of at least one water-soluble statistical polymer as described above for the preparation of a solid support comprising at least one surface functionalized by probe molecules, and in particular for the preparation of chips proteins or nucleic acids and in particular DNA.
  • a process for the preparation of a solid support comprising at least one surface functionalized with a water-soluble statistical polymer in accordance with the invention characterized in that it comprises the following steps: '' a solid support comprising at least one surface to be functionalized, with a solution in a compatible solvent of at least one water-soluble random polymer in accordance with the invention and as defined above, - incubation of said surface with said polymer solution for a time sufficient for the adsorption of the polymer on the surface of the solid support, - rinsing of the support solid using a polymer-free solvent to obtain a solid support comprising at least one surface functionalized by an adsorbed layer of polymers.
  • the solid supports which can be functionalized according to this method are preferably chosen from the supports comprising at least one surface of the silica type and its derivatives such as glass and quartz, or any other material covered with silica, glass or quartz.
  • the term “compatible solvent” is understood to mean any solvent allowing the dissolution of the polymer, not causing any alteration of the probe molecules which it comprises as lateral substituent and for which the surface of the solid support to be functionalized will have an affinity lower than that which it will have for the polymers confused with the invention.
  • the polymers in solution may spontaneously adsorb on the surface of the support.
  • the first factor is the level of interaction between the surface of the solid support and the monomeric units constituting the polymer, that is to say the amount of energy necessary for the adsorption of the polymer (forces of attraction).
  • the second factor is the reduction in the conformational states of the polymer on the surface of the solid support, that is to say the reduction in chain entropy. This is due to the impenetrability of the surface for the monomeric units of the polymer and corresponds to the energy which tends to repel the polymer from the surface of the solid support (repulsive forces). The thickness of the polymer layer adsorbed on the surface of the solid support will be greater the greater the repulsive forces.
  • the solidity of the adsorption of the polymer layer on the surface of the solid support will therefore depend on the ratio between the forces of attraction and the repulsive forces.
  • the duration of the incubation of the solid support with the polymers in solution is preferably between 1 and 60 minutes approximately, and even more preferably between 5 and 40 minutes approximately.
  • the quantity of polymers in solution is between approximately 0.001% and 5% by weight relative to the volume of the polymer solution and even more preferably between approximately 0.1% and 2% ( weight / volume).
  • the solvents used to rinse the support after adsorption of the polymers and before their use are preferably chosen from the solvents described above and used to make the polymer solution.
  • the solvent used to rinse the support is identical to that used to make the polymer solution.
  • the present invention also relates to the solid supports obtained by implementing the preparation process in accordance with the invention, said supports being characterized by the fact that they comprise at least one surface functionalized by an adsorbed layer of water-soluble carrier polymers of probe molecules as lateral substituents as defined above.
  • Such supports can in particular be in the form of studs, channels, capillaries, reactors or reaction chambers such as, for example, the devices usually used to carry out enzymatic reactions (enzymatic digestion).
  • the adsorption of the polymers on the surface of the solid support is carried out via the monomers A of N, N- [dialkyl (C] -C 4 ) a_crylamide].
  • These solid supports are in particular protein chips and in particular enzyme, peptide or polypeptide chips, acid chips nucleic acid and in particular DNA or RNA, oligosaccharide or polysaccharide chips.
  • the thickness of the polymer layer is generally between 1 and 100 nm.
  • the thickness of the polymer layers can be measured for example by elipsometry or using more sophisticated techniques using evanescent waves (Allain C. and ⁇ /., Phys. Rev. Leti, 1982, 49, 1694) or the neutron scattering (Barnett K. et al, "The effects of Polymers on Dispersion Stability", Tadros,
  • biochemical refers to reactions, processes and protocols which involve at least one substrate and its enzyme.
  • biochemical reaction can be used within the framework of the present invention to designate the methods of amplification of nucleic acids such as polymerase chain reactions (PCR), the determination of a genotype such as microsequencing, or alternatively nucleic acid sequencing.
  • PCR polymerase chain reactions
  • biochemical also includes other types of enzyme-catalyzed reactions such as digestion of proteins by proteases, cleavage of DNA by nucleases, phosphorylation of molecules by kinases, isomerization of molecules by isomerases, the conversion of dopamine to norepinephrine by dopamine hydrolase, etc.
  • chemical is used to denote reactions, methods and processes in which there is at least one step involving a reaction which is not catalyzed by an enzyme.
  • the term “chemical” can be used to designate syntheses of organic or inorganic molecules, degradation reactions in which one of the steps is not catalyzed by an enzyme as well as the chemical reactions catalyzed by the ultra violet radiation.
  • the term “biological” is used to designate reactions of which at least one of the stages involves a living organism such as a cell, a culture of cells, a cluster of cells. adherent, a mono- or multicellular organism, parts of tissues or organs.
  • the term “biological” used in the context of the present invention therefore includes mono- or pluricellular eukaryotic organisms, as well as prokaryotic organisms such as bacteria and viruses.
  • the subject of the invention is also a method for immobilizing target molecules and for screening complementary target molecules in solution or for carrying out biochemical, chemical or biological reactions on a solid support, characterized in that it comprises at least the following steps: a) bringing a solid support into contact with at least one surface functionalized by an adsorbed layer of water-soluble random polymers carrying probe molecules as lateral substituents with a liquid sample capable of containing target molecules, during sufficient time to carry out said immobilization or said reaction, b) desorption of the polymer layer from the surface of the support by rinsing the support with an alkaline solution or a solvent, c) optionally, repeating steps a) and b) above.
  • the alkaline solutions which can be used to carry out the stage of regeneration of the support can be chosen from solutions of sodium hydroxide, potassium or ammonium.
  • the solvents which can be used to carry out the stage of regeneration of the support are preferably chosen from solvents for which the adsorbed polymers have more affinity than for the surface on which they have previously been adsorbed.
  • step b) of regeneration of the support is carried out using a sodium hydroxide solution.
  • the invention also comprises other arrangements which will emerge from the description which follows, which refers to an example of the preparation of a copolymer of N, N-dimethylacrylamide and acrylic acid comprising trypsin as a probe molecule, to an example of the preparation of a glass capillary comprising a surface functionalized by such a polymer and to the use of such a capillary to carry out a creatine digestion reaction, to an example of preparation of a copolymer of N, N-dimethylacrylamide and biotin functionalized by a vinyl group, to an example of preparation of a solid support comprising a surface modified by such a copolymer and its use for the immobilization of target molecules biotinylated by through streptavidin. It should be understood, however, that these examples are given solely by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not in any way constitute a limitation.
  • the mixture is then stirred for 20 minutes under strong bubbling with nitrogen in order to remove the dissolved oxygen.
  • the reaction mixture is then brought to a temperature of 32 ° C. using a water bath. 1% by mole of ammonium peroxydi sulphate and 0.1% by mole of sodium metabisulphite relative to the amount of monomers are added in order to initiate the copolymerization reaction.
  • the reaction is carried out for 1 hour and 30 minutes, the mixture becoming highly viscous after approximately 45 minutes.
  • the reaction medium is then diluted to 500 ml with MilliQ water, acidified to a pH of 3 with 3 N hydrochloric acid, then ultrafiltered on membranes of 1,000,000 g / mol and finally lyophilized.
  • the product of the reaction was characterized by proton NMR and acid-base assay to determine the rate of incorporation of acrylic acid.
  • a copolymer of P (DMA-s-AA) is obtained in which for an initial fraction of
  • the grafting protocol used is based on the EDC / NHS couple (ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride /
  • the reaction medium is stirred at room temperature for 15 minutes then filtered on a Microcon® membrane having a threshold of 100,000 g / mole cut off to remove unreacted NHS and EDC.
  • the reaction mixture is then centrifuged at 10,000 rpm for 1 hour and 15 minutes.
  • the reaction mixture is then heated at a temperature of 4 ° C followed by addition of 2.4 mg (1., 04.10 "7 moles) of a trypsin solution at 2 mg / ml in 0.1 M MES, 0 , 5 M NaCl, pH 6.
  • the mixture is then maintained at a temperature of
  • reaction mixture is diluted to 300 ml by addition of MilliQ water then ultrafiltered on membranes having a cutoff threshold of 100,000 Da in order to remove the unreacted trypsin, the secondary reaction product (NHS) and to desalt the medium.
  • the reaction mixture is then concentrated to a volume of 50 to 100 ml and then lyophilized.
  • EXAMPLE 2 Preparation of a glass capillary Functionalized AR COPOLYMER CARRIER TRYPSIN AS MOLECULE PROBE
  • the trypsin copolymer as prepared above in Example 1 is suspended in NH 4 HCO 3 buffer 25 mM ( pH 8) filtered through a 0.22 ⁇ m filter, at a rate of 3% (w / y) of trypsinized copolymer / ml of buffer.
  • a capillary 20 cm long and 75 ⁇ m in diameter (Polymicro®) is treated by passing the following solutions: NaOH 3 N; 25 mM NH 4 HCO 3 buffer; 0.2 M HCl; Buffer and finally the solution of P (D As-AA) trypsin.
  • EXAMPLE 3 PREPARATION OF A COPOLYMER OF NN-DIMETHYLACRYLA1MIDE AND BIOTIN FUNCTIONALIZED BY A VINYL GROUP
  • This example illustrates the synthesis of a copolymer of N, N-dimethylacrylamide and biotin functionalized with a vinyl group.
  • the functionalization of biotin is carried out by reaction of a carboxylic group of biotin with N-aminopropyl methacrylamide containing a vinyl group.
  • the reaction is carried out under anhydrous condition in an organic solvent such as dichloromethylene, tetrahydrofuran (THF), dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (D SO), using a coupling agent such as dicycloh exyl carbodiimide.
  • an organic solvent such as dichloromethylene, tetrahydrofuran (THF), dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (D SO)
  • a coupling agent such as dicycloh exyl carbodiimide.
  • the copolymerization of biotin with the monomer of N, N-dimethylacrylamide is carried out under the same conditions as those described above in Example 1 by reacting 2.7 g (0.0272 moles) and 1.2 g ( 0.0042 moles) of biotin modified by a vinyl group.
  • a copolymer is obtained which is purified by ultrafiltration using a threshold cut-off filter of 100,000 Da and then lyophilized.

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Abstract

La présente invention se rapporte à des polymères statistiques hydrosolubles de haut poids moléculaires à base de N,N-dialkylacrylamide et de monomères fonctionnalisés de façon latérale par des molécules d'intérêt, à leur utilisation pour la préparation de supports solides comportant au moins une surface sur laquelle lesdits polymères sont adsorbés. La présente invention se rapporte également aux supports solides ainsi modifiés et à leur procédé d'obtention, ainsi qu'à leurs diverses utilisations, notamment pour l'immobilisation de molécules d'intérêts ou la réalisation de réactions chimiques, biochimiques ou biologiques.

Description

POLYMERE DE HAUT POIDS MOLECULAIRE À BASE DE
N,N-DIMETHYLACRYLAMIDE ET DE MONOMERES FONCTIONNALISES PAR DES MOLECULES SONDES ET SES UTILISATIONS La présente invention se rapporte à des polymères statistiques de haut poids moléculaires à base de N,N-dialkylacrylamide et de monomères fonctionnalisés de façon latérale par des molécules d'intérêt, à leur utilisation pour la préparation de supports solides comportant au moins une surface sur laquelle lesdits polymères sont adsorbés. La présente invention se rapporte également aux supports solides ainsi modifiés et à leur procédé d'obtention, ainsi qu'à leurs diverses utilisations, notamment pour l'immobilisation de molécules d'intérêts ou la réalisation de réactions chimiques, biochimiques ou biologiques. Ces dernières années, un intérêt grandissant a été porté aux puces à ADN, à protéines ou à peptides qui ont radicalement révolutionné l'approche expérimentale en biologie moléculaire. Typiquement, des telles puces sont fabriquées à partir d'un petit support solide à base de silicium (par exemple en verre) ou en plastique, sur lequel sont immobilisées des milliers de molécules biologiques ou chimiques d'intérêt. Les supports porteurs de ces molécules d'intérêt immobilisées peuvent avantageusement être utilisés pour la détection et la reconnaissance d'espèces biologiques, mais d'autres applications de ces supports, comme par exemple la synthèse ou modification chimique sur support ou encore l'exaltation de réactions biologiques sur support et la digestion de protéines, sont également possibles. Dans le cadre de ces diverses applications, il est primordial de pouvoir disposer de supports solides fonctionnalisés présentant un certain nombre de qualités. Ces supports doivent en particulier permettre l'immobilisation reproductible des molécules d'intérêt, dans la mesure où une immobilisation reproductible est conditionnelle d'un résultat, par exemple une détection, lui-même reproductible. D'autre part, il est important de pouvoir disposer de supports faciles à préparer et ce de façon rapide sans mettre en œuvre une chimie coûteuse et compliquée. Enfin, il peut être avantageux de pouvoir disposer de supports à fonctionnalisation réversible, c'est-à-dire de supports qu'il est possible de régénérer en refonctionnalisant la surface sur laquelle ont été immobilisées des molécules d'intérêt (supports régén érables). De nombreuses méthodes permettant l'immobilisation de molécules biologiques ou chimiques sur des surfaces ont été décrites dans la littérature dans le but de réaliser des réactions biochimiques ou de capturer, détecter ou tester différentes molécules cibles. Dans la plupart des cas, et notamment en ce qui concerne les puces à ADN ou à protéines "jetables", c'est-à-dire à utilisation unique, les molécules biologiques sont immobilisées sur le support par l'intermédiaire d'une liaison covalente de façon à ce que les molécules ne se détachent pas du support au cours pendant l'utilisation des puces, notamment lors des étapes de lavages. Dans ce cas, cette immobilisation s'effectue généralement en deux étapes distinctes : - une première étape de fonctionnalisation des supports qui consiste en une modification chimique de leur surface par greffage de molécules de synthèse
(agents de couplage) qui vont assurer la fixation des molécules biologiques sur le support ; - une deuxième étape d'immobilisation consistant à établir une liaison covalente entre les molécules biologiques et ces supports fonctionnalisés. Dans le cas particulier des puces à ADN qui sont conçues dans le but de détecter différentes séquences et variations de séquences, ceci sur de nombreux sites et de façon simultanée, les méthodes utilisant des supports à base de polyacrylamide sont des plus intéressantes pour immobiliser des oligonucléotides (ON) à la surface des supports. Selon la littérature, peu d'interactions non spécifiques sont observées avec de telles surfaces et les puces qui en résultent présentent une grande efficacité et une densité de sondes facilement modulables. Cependant, malgré ces avantages, l'immobilisation de sondes sur des surfaces à base de polyacrylamide nécessite l'activation des gels et/ou des sondes via une chimie délicate. C'est donc un procédé difficile à mettre en œuvre. Une autre approche consiste à immobiliser des ON via la copolymérisation d'ON fonctionnalisés par de l'acrylamide avec un polyacrylamide réticulé (Rehman F. N., et al., Nucleic Acid Research, 1999, 27(2), 649-655). Dans ce cas, les gels peuvent être préparés par les techniques de polymérisation classiques et bien connues de l'homme de l'art telles que la polymérisation radicalaire. Les surfaces ainsi préparées présentent une grande densité de sondes accrochées de manière stable. Les surfaces de ces supports présente par contre l'inconvénient d'être modifiées de façon permanente et de ce fait ne peuvent pas être facilement régénérées. Il a également déjà été proposé, notamment par Southern E. et al, Nat. Genêt., 1999, 21, 5-9, de préparer des puces à ADN en modifiant la surface d'un support solide par de la poly-L-lysine sur laquelle des ON peuvent ensuite être fixés de façon électrostatique. Dans ce cas, les surfaces peuvent être régénérées assez facilement mais les ON sont en contact direct avec la surface, ce qui a des conséquences négatives sur leur capacité à s'hybrider avec des séquences complémentaires cibles en solutions compte tenu de contraintes géométriques. Il est également possible, d'immobiliser des ON ou des peptides biotinylés sur des surfaces fonctionnalisées par de la streptavidine en mettant à profit le couplage biotine-streptavidine, ou bien encore sur des surfaces d'or lorsque les ON ont préalablement été fonctionnalisés par un groupement thiol à une de leurs extrémités. Les surfaces ainsi obtenues en utilisant ces techniques sont également difficiles à régénérer et requièrent une fonctionnalisation préalable des molécules avant leur attachement sur le support. Toujours dans la même optique, il a également été proposé de nouveaux polymères synthétiques conjugués chimiquement à différentes protéines afin de créer de nouvelles molécules fonctionnelles hybrides protéine-polymère. A ce titre, le polyéthylèneglycol (PEG) conjugué avec des protéines thérapeutiques ou des enzymes telles que par exemple la catalase compte parmi les molécules hybrides les plus étudiées (Abuchowski A. et al, J. Biol. Chem., 1977, 252, 3582-3586). Si de tels conjugués polymère-protéines présentent généralement une meilleure stabilité, une plus grande solubilité dans les solvants organiques et en conditions in vivo, ils présentent néanmoins le désavantage de ne pas être fixés à la surface d'un support solide et ne peuvent donc pas être utilisés pour la préparation de puces à protéines. Aussi, il a également déjà été proposé de remédier à ce problème en proposant des systèmes microfluidiques de type "laboratoires sur puces" ("Labs-on-chips") dans lesquels des enzymes sont immobilisées à la surface de microcapillaires de façon covalente (voir notamment Mao H et al, Anal Chem., 2002, 74, 379-385). Tout comme les puces ADN décrites ci-dessus, ces systèmes présentent également l'inconvénient d'être difficilement régénérables compte tenu de mode de fixation des protéines par l'intermédiaire d'une liaison covalente. Selon encore une autre approche, il a également déjà été proposé différents types de support solides dont la surface est fonctionnalisée par des homopolymères ou des copolymères comportant une pluralité de molécules ligands qui sont aptes à capturer des molécules cibles en solutions. C'est ainsi par exemple que le brevet US 5,695,936 décrit une méthode de détection d'une séquence nucléotidique d'intérêt à l'aide d'une sonde nucléotidique marquée avec un traceur. Selon cette méthode, on utilise un réactif constitué d'un copolymère à base de N-vinylpyrrolidone ou d'anhydride maléique, ayant une masse moléculaire comprise entre 5000 et 400000 g/mole et comportant des substituants latéraux de nature oligonucléotidique. L'immobilisation de ce copolymère à la surface du support est réalisée de manière assez compliquée par l'intermédiaire d'un complexe entre le support solide, une sonde marquée avec un traceur, un réactif et un acide nucléique cible. Les supports ainsi o~btenus présentent une bonne sensibilité de détection mais sont longs et coûteux à préparer et difficilement régénérables. Le brevet US 5,453,461 décrit par ailleurs des polymères biologiquement actifs de formule P-(A)q dans laquelle P représente un polymère linéaire, ramifié ou réticulé formé par exemple à partir de monomères acryliques, A représente une section active biologiquement et peut par exemple être de la biotine ou un ON comportant de 1 à 80 unités nucléotidiques et q est un nombre entier égal à 1 ou 2. Selon la structure de ces polymères, A est toujours positionné à l'extrémité de la chaîne polymère et non de façon latérale. Ces polymères ont généralement une masse moléculaire inférieure à 1000000 et sont destinés à être fixés de façon covalente (par l'intermédiaire d'une liaison amide, urée, ester, éther ou d'un groupe uréthane) à la surface de supports solides dans le but d'être utilisés dans des réactions d'identifications biochimiques ou dans des réactions avec d'autres molécules biologiquement actives telles que des protéines ou des acides nucléiques. Une fois encore, ce type de support est difficilement régénérable. Enfin, selon une dernière approche, il a déjà été proposé de préparer des supports solides dont la surface est recouverte par une couche de polymères comportant des substituants biologiquement actifs par simple adsorption desdits polymères sur la surface du support. C'est ainsi que le brevet US 5,723,344 décrit la préparation de copolymères formés à partir d'un monomère de N-vinylpyrrolidone et d'un second monomère comportant une fonction réactive permettant la fixation par liaison covalente d'un ligand biologique capable de former un complexe avec une molécule cible tel que par exemple un complexe antigène/anticorps, polynucléotide/polynucléotide, polynucléotide/acide nucléique, anticorps/haptène, hormone/récepteur, ainsi que leur capacité à s'adsorber à la surface de supports solides. De tels copolymères ont une masse moléculaire généralement comprise entre 1000 et 500000, de préférence entre 10000 et 250000 et comportent de 25 à 70 % d'unités dérivées de la N-vinylpyrrolidone. Les supports ainsi préparés peuvent être utilisés pour l'immobilisation de molécules cibles en solution, en particulier dans des procédés de détection et de dosage de séquences nucléotidiques. Les couches de polymères adsorbés sur de tels supports présentent néanmoins l'inconvénient d'être très peu stables, du fait de la taille moléculaire relativement petite de ces copolymères et du pourcentage élevé de substituants latéraux (30 à 75 %). Le brevet américain US 6,692,914 décrit par ailleurs des capteurs constitués d'un substrat dont la surface comporte une pluralité de chaînes de polymères segmentés (polymères blocs) sous forme d'une brosse comprenant un segment hydrosoluble ou hydro-dispersible et au moins une sonde choisie parmi les molécules biologiques, liée audit segment. La qualité d'un tel capteur est intimement liée à la densité des brosses de polymères qui est un paramètre souvent difficile à contrôler. Ainsi une densité trop faible de la brosse de polymères conduira à une surface présentant des parties non fonctionnalisées (trous) sur lesquelles les molécules cibles pourront d'adsorber de manières non spécifique alors qu'une densité trop élevée conduira à un capteur sur lequel seules les fonctions situées à l'extrémité terminale des chaînes de polymères seront accessible, ce qui peut également limiter la sensibilité du capteur. II existe par ailleurs différents cas, notamment dans le cadre de la protéomique, où des molécules ayant une durée de vie limitée, telles que les enzymes par exemple, sont fixées à la surface de supports solides. A titre d'exemple, la trypsine peut être fixée à la surface de réacteurs et subit, dans ce cas, très peu d'autolyse comparativement à de la trypsine en solution. Dans le but d'augmenter le taux de digestion de différentes protéines, il est en effet possible de maximiser le ratio surface (protéines fixées à la surface) volume (protéines libres en solution). De façon habituelle, la fixation de la trypsine est réalisée sur des microbilles de quartz ou de silice qui sont ensuite insérées dans des microcapillaires qui servent de réacteurs à la trypsine. Dans ce cas la fixation de la trypsine est réalisée par l'intermédiaire d'une réaction de réduction d'une base de Schiff entre un groupe aminé primaire résiduel de la trypsine et un groupe aldéhyde portée par la surface (voir notamment Muilin C, dans "Methods in Enzymology", Colowick, S.P., Caplan N.O. Eds., Académie Press, New York, 1987, Vol 136). De telles méthodes sont cependant longues et laborieuses et ne donnent pas entière satisfaction. En particulier, après l'immobilisation de la trypsine à la surface des supports, il reste des parties de la surface qui n'ont pas été modifiées et qu'il est nécessaire de saturer afin de minimiser les réactions non spécifiques d'adsorption de molécules en solution (peptides, protéines par exemple). C'est donc, afin de remédier à l'ensemble de ces inconvénients et de pourvoir à un support solide comportant au moins une surface sur laquelle il soit possible d'immobiliser des molécules chimiques ou biologiques d'intérêt et qui soit à la fois simple à préparer et à régénérer tout en gardant une bonne sensibilité de détection et une bonne stabilité dans le temps que les Inventeurs ont mis au point ce qui fait l'objet de la présente Invention. La présente invention a pour premier objet un polymère statistique (non segmenté) hydrosoluble comportant des molécules sondes à titre de substituants latéraux, caractérisé par le fait : - qu'il résulte de la copolymérisation d'un monomère A de
N,N-[dialkyl(C]-C )acrylamide] et d'un monomère B choisi parmi : a) les monomères Bl comportant au moins une fonction chimique réactive apte à former une liaison covalente avec une fonction chimique complémentaire d'une molécule sonde et b) les molécules sondes fonctionnalisées par un monomère copolymérisable (monomère B2), lesdites molécules sondes citées ci-dessus en a) et b) étant choisies parmi les protéines et notamment les protéines à activité enzymatique, les anticorps, les antigènes et les peptides ; les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques tels que les oligonucléotides, l'ADN et l'ARN ; et les petites molécules organiques, lesdits substituants latéraux étant au moins au nombre de deux par molécule de copolymère, - qu'il présente une masse moléculaire strictement supérieure à 500000 g/mole, et - que le taux d'incorporation desdites molécules sondes est strictement inférieur à 30 % en nombre par rapport au nombre total d'unités monomériques de N,N-[dialkyl(C]-C4)acrylamide]. Les Inventeurs ont en effet découvert que les polymères statistiques hydrosolubles conformes à la présente Invention et tels que définis ci-dessus sont capables de s'adsorber physiquement de façon stable à la surface de supports solides, et permettent ainsi de conduire à des supports solides comportant au moins une surface fonctionnalisée par des molécules sondes tels que par exemple des puces à acide nucléique ou à protéines sur lesquels il est ensuite possible d'immobiliser des molécules cibles d'intérêt tout en minimisant l'adsorption d'autres molécules en solution. Contrairement aux polymères utilisés pour réaliser les capteurs décrits dans le brevet US 6,692,914, les polymères conformes à l'Invention ne conduisent pas à la formation d'une brosse de polymères adsorbés par l'une de leurs extrémités à la surface du support. Us forment par contre une couche de polymères adsorbés à la surface du support au sein de laquelle les deux extrémités terminales de la chaîne polymère sont libres. Selon la présente Invention, on entend par petite molécule organique, des molécules organiques présentant preférentiellement un poids moléculaire inférieur ou égal à 1000 g/mole. Parmi de telles molécules, on peut en particulier citer les molécules hydrocarbonées telles que le N-propyl méthacrylate, le N-décyl méthacrylate et la N-octadécyl acrylamide, ainsi que les médicaments et les principes actifs. Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, ledit polymère a une masse moléculaire supérieure ou égale à 1.10 g/mole. Les Inventeurs ont en effet constaté que la stabilité des surfaces fonctionnalisées par de tels polymères était encore plus grande lorsque les polymères utilisés présentaient une telle masse moléculaire. Parmi les groupes alkyle en C]-C4 des monomères A de
N,N-[dialkyl(C]-C4)acrylamide] constitutifs des copolymères conformes à l'Invention, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, w-propyle et zz-butyle, le groupe méthyle étant tout particulièrement préféré. A titre de monomère A, le
N,N-diméthylacrylamide est donc tout particulièrement préféré. Parmi les monomères B, on peut en particulier citer les monomères vinyliques et acrylamides tels que les acides acrylique et méthacrylique, les N- aminoalkyl acrylamides, les N-aminoalkyl méthacrylamides, les aminoalkyl acrylates et les aminoalkyl méthacrylates, dans lesquels le groupe alkyl peut représenter par exemple le groupe éthyle, propyle, butyle, pentyle, ou hexyle. Parmi les fonctions chimiques réactives des monomères Bl, on peut citer les fonctions carboxylique, aminé, alcool et thiol, qui seront aptes à interagir avec une fonction complémentaire portée par lesdits substituants latéraux telle que les donneurs de doublets libres comme les aminés, les alcools, les thiols, les carboxyles, les carbonyles. On pourra trouver facilement, dans toute monographie de chimie organique, une liste plus exhaustive des paires de groupements fonctionnels compl émentaires . Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, les molécules sondes présentes dans le polymère à titre de substituants latéraux sont de préférence choisies parmi les molécules biologiques actives présentant une durée de vie limitée, telles que les enzymes. Selon une autre forme de réalisation préférée de l'Invention, le taux d'incorporation des molécules sondes est compris entre 1 et 20 % en nombre par rapport au nombre total d'unités monomériques de monomère A de N,N-[dialkyl(Cj-
C4)acrylamide]. Les polymères conformes à l'Invention et tels que décrits précédemment peuvent être préparés selon les techniques classiques de copolymérisation bien connues de l'homme du métier telles que par exemple la copolymérisation par voie radicalaire, en faisant réagir les monomères A tels que définis ci-dessus avec des monomères Bl ou B2 tels que définis ci-dessus dans un solvant approprié tel que F eau, en présence d'un activateur de polymérisation tel que par exemple un couple red/ox comme le couple persulfate d'ammonium/rnétabisulfite de sodium. La préparation des monomères B2 peut être également réalisée selon les méthodes classiques et bien connues de l'homme du métier en faisant par exemple réagir, en conditions anhydres dans un solvant organique adapté tel que le dichlorométhylène, le tetrahydrofurane (THF), la diméthylformamide (DMF) ou le diméthylsulfoxyde (DMSO), une molécule sonde contenant un groupe carboxylique (la biotine par exemple) avec le groupe vinyle d'un monomère copolymérisahle tel que par exemple la N-aminopropyl méthacrylamide, en présence d'un agent de couplage tel que par exemple le carbodiimide dicyclohexyle ; la réaction d'un groupe carboxyle et d'un groupe a iné étant en effet bien connue depuis longue date dans la littérature, notamment dans l'article de Khorana H. G. et al, Chem. Rev., 1953, 53, 145-166. De façon similaire, de la trypsine modifiée par un groupement vinyle peut être préparée selon la méthode décrite par Plate N.A. et al, Polymer Science USSR, 1989, 31, 216- 219. Lorsque la synthèse est terminée, les polymères conformes à l'Invention peuvent être caractérisés par les techniques analytiques classiques telles que la chromatographie d'exclusion diffusion à indice de réfraction et à détection par diffusion de la lumière ou par viscosimétrie afin de recueillir des informations sur la taille des polymères ou bien encore par les techniques de résonance magnétique nucléaire (RMN) afin de recueillir des informations sur leur structure. La présente Invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un polymère statistique hydrosoluble tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par des molécules sondes, et notamment pour la préparation de puces à protéines ou à acides nucléiques et en particulier à ADN. Elle a donc également pour objet un procédé de préparation d'un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par un polymère statistique hydrosoluble conforme à l'Invention, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes suivantes : - la mise en contact d'un support solide comportant au moins une surface à fonctionnaliser, avec une solution dans un solvant compatible d'au moins un polymère statistique hydrosoluble conforme à l'Invention et tel que défini ci-dessus, - l'incubation de ladite surface avec ladite solution de polymère pendant un temps suffisant à l'adsorption du polymère sur la surface du support solide, - le rinçage du support solide à l'aide d'un solvant exempt de polymère pour obtenir un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par une couche adsorbée de polymères. Les supports solides pouvant être fonctionnalisés selon ce procédé sont de préférence choisis parmi les supports comportant au moins une surface de type silice et ses dérivés tels que le verre et le quartz, ou tout autre matériel recouvert de silice, de verre ou de quartz. Selon l'Invention, on entend par solvant compatible tout solvant permettant la dissolution du polymère, n'entraînant pas d'altération des molécules sondes qu'il comporte à titre de substituant latéral et pour lequel la surface du support solide à fonctionnaliser aura une affinité inférieure à celle qu'elle aura pour les polymères confonues à l'Invention. Ainsi, lors de la mise en contact de la solution de polymères avec le support, les polymères en solution pourront s'adsorber spontanément sur la surface du support. Le choix d'un tel solvant en fonction de la nature des polymères et de la surface à fonctionnaliser peut être réalisé en mesurant la tension de surface du solvant pur (γs) ainsi que celle des polymères (γp) lorsque ceux- ci sont liquides. Lorsque γs est supérieur à γp, alors le polymère sera capable de s'adsorber à la surface du support solide lorsqu'il est solution dans le solvant. De tels soldants compatibles sont généralement choisis parmi l'eau et des tampons aqueux comme par exemple le bicarbonate d'ammonium ou d'autres tampons salins. II existe également deux autres facteurs déterminant vis-à-vis de l'adsorption des polymères sur la surface. Le premier facteur est le niveau d'interaction entre la surface du support solide et les unités monomériques constitutives du polymère, c'est-à-dire la quantité d'énergie nécessaire à l'adsorption du polymère (forces d'attraction). Le deuxième facteur est la réduction des états conformationnels du polymère sur la surface du support solide, c'est-à-dire la diminution de l'entropie de chaîne. Ceci est dû à l'impénétrabilité de la surface pour les unités monomériques du polymère et correspond à l'énergie qui tend à repousser le polymère de la surface du support solide (forces répulsives). L'épaisseur de la couche de polymères adsorbée à la surface du support solide sera d'autant plus grande que les forces répulsives seront importantes. La solidité de l'adsorption de la couche de polymères à la surface du support solide sera donc fonction du ratio entre les forces d'attraction et les forces répulsives. La durée de l'incubation du support solide avec les polymères en solution est de préférence comprise entre 1 et 60 minutes environ, et encore plus preférentiellement entre 5 et 40 minutes environ. Selon une forme de réalisation préférée de ce procédé, la quantité de polymères en solution est comprise entre environ 0,001 % et 5 % en poids par rapport au volume de la solution de polymères et encore plus preférentiellement entre environ 0,1 % et 2 % (poids/volume). Selon une forme de réalisation préférée du procédé conforme à l'Invention, les solvants utilisés pour rincer le support après adsorption des polymères et avant leur utilisation sont de préférence choisis parmi les solvants décrits ci-dessus et utilisés pour réaliser la solution de polymères. De façon encore plus préférée, le solvant utilisé pour rincer le support est identique à celui utilisé pour réaliser la solution de polymère. La présente Invention a également pour objet les supports solides obtenus en mettant en œuvre le procédé de préparation conforme à l'Invention, lesdits supports étant caractérisés par le fait qu'ils comportent au moins une surface fonctionnalisée par une couche adsorbée de polymères statistiques hydrosolubles porteurs de molécules sondes à titre de substituants latéraux tels que définis précédemment. De tels supports peuvent en particulier se présenter sous la forme de plot, de canal, de capillaire, de réacteur ou de chambre réactionnelle tels que par exemple les dispositifs habituellement utilisés pour réaliser des réactions enzymatiques (digestion enzymatique)-. Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, l'adsorption des polymères à la surface du support solide est réalisée par l'intermédiaire des monomères A de N,N-[dialkyl(C]-C4)a_crylamide]. Ces supports solides sont notamment des puces à protéines et en particulier des puces à enzymes, à peptides ou à polypeptides, des puces à acides nucléiques et en particulier à ADN ou à ARN, des puces à oligosaccharides ou à polysaccharides. Dans de tels supports, l'épaisseur de la couche de polymère est généralement comprise entre 1 et 100 nm. L'épaisseur des couches de polymères peut être mesurée par exemple par élipsométrie ou à l'aide de techniques plus élaborées employant des ondes évanescentes (Allain C. et α/., Phys. Rev. Leti, 1982, 49, 1694) ou la diffusion de neutrons (Barnett K. et al, "The effects of Polymers on Dispersion Stability", Tadros,
J., Ed., Académie Press, 1982). L'invention a également pour objet l'utilisation de ces supports pour l'immobilisation et le criblage de molécules cibles complémentaires en solution ou la réalisation de réactions biochimiques, chimiques ou biologiques sur support solide telles que par exemple de réactions enzymatiques. Selon l'Invention, le terme "biochimique" se réfère aux réactions, aux procédés et aux protocoles qui font intervenir au moins un substrat et son enzyme. A titre d'exemple, les termes "réaction biochimique" peut être utilisé dans le cadre de la présente Invention pour désigner les procédés d'amplification d'acides nucléiques tels que les réactions de polymérisation en chaîne (PCR), la détermination d'un génotype tel que le microséquençage, ou bien encore le séquençage d'acides nucléiques. Le terme "biochimique" inclus également d'autres types de réactions catalysées par une enzyme tels que la digestion des protéines par les protéases, le clivage de l'ADN par des nucléases, la phosphorylation de molécules par des kinases, l'isomérisation de molécules par des isomérases, la conversion de dopamine en norépinéphrine par la dopamine hydrolase, etc. Selon la présente Invention, le terme "chimique" est utilisé pour désigner des réactions, méthodes et procédés dans lesquelles il existe au moins étape faisant intervenir une réaction qui n'est pas catalysée par une enzyme. A titre d'exemple, le terme "chimique" peut être utilisé pour désigner des synthèses de molécules organiques ou inorganiques, des réactions de dégradation dont l'une des étapes n'est pas catalysée par une enzyme ainsi que les réactions chimiques catalysées par le rayonnement ultra violet. Toujours selon la présente Invention, le terme "biologique" est utilisé pour désigner des réactions dont au moins l'une des étapes fait intervenir un organisme vivant telle qu'une cellule, une culture de cellules, un amas de cellules adhérentes, un organisme mono- ou pluricellulaire, des parties de tissus ou d'organes. Le terme "biologique" utilisé dans le cadre de la présente Invention englobe donc les organismes eucaryotes mono- ou pluricellul aires, ainsi que les organismes procaryotes tels les bactéries et les virus. Ainsi, l'Invention a également pour objet un procédé d'immobilisation de molécules cibles et de criblage de molécules cibles complémentaires en solution ou de réalisation de réactions biochimiques, chimiques ou biologiques sur support solide, caractérisé par le fait qu'il comprend au moins les étapes suivantes : a) la mise en contact d'un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par une couche adsorbée de polymères statistiques hydrosolubles porteurs de molécules sondes à titre de substituants latéraux avec un échantillon liquide susceptible de renfermer des molécules cibles, pendant un temps suffisant à la réalisation de ladite immobilisation ou de ladite réaction, b) la désorption de la couche de polymère de la surface du support par rinçage du support avec une solution alcaline ou un solvant, c) éventuellement, la répétition des étapes a) et b) ci-dessus. Grâce à ce procédé, il est en effet possible d'effectuer une série de plusieurs immobilisations ou de plusieurs réactions sur le même support grâce à l'étape de régénération de la surface à l'aide de la solution alcaline ou du solvant qui permet de conduire à un support dont la surface peut à nouveau être fonctionnalisée par un polymère portant les mêmes molécules sondes ou par un polymère portant des molécules sondes différentes. Les solutions alcalines utilisables pour effectuer l'étape de régénération du support peuvent être choisies parmi les solutions d'hydroxyde de sodium, de potassium ou d'ammonium. Les solvants utilisables pour effectuer l'étape de régénération du support sont de préférence choisis parmi les solvants pour lesquels les polymères adsorbés ont plus d'affinité que pour la surface sur laquelle ils se sont préalablement adsorbés. Parmi de tels solvants, on peut en particulier citer les solvants organiques qui sont miscibles à l'eau tels que le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol, l'acétonitrile, l'acétone, etc. De préférence, l'étape b) de régénération du support est réalisée à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de préparation d'un copolymère de N,N-diméthylacrylamide et d'acide acrylique comportant de la trypsine à titre de molécule sonde, à un exemple de préparation d'un capillaire en verre comportant une surface fonctionnalisée par un tel polymère et à l'utilisation d'un tel capillaire pour effectuer une réaction de digestion de la créatine, à un exemple de préparation d'un copolymère de N,N-diméthylacrylamide et de biotine fonctionnalisée par un groupement vinyle, à un exemple de préparation d'un support solide comportant une surface modifiée par un tel copolymère et son utilisation pour l'immobilisation de molécules cibles biotinylées par l'intennédiaire de la streptavidine. II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : PREPARATION D'UN COPOLYMERE DE N N- DIMETHYLACRYLAMIDE ET D'ACIDE ACRYLIQUE P(DMA-S-AA) PORTEUR DE MOLECULES DE TRYPSINE A TITRE DE MOLECULE SONDE 1) Synthèse du copo>lvmère P(DMA-s-AA) Dans un ballon tricol de 100 ml, on introduit 2,7 g de N,N-diméthylacrylamide (0,0272 moles) et 0,3 g d'acide acrylique (0,0042 moles) dans 30 ml d'eau MilliQ. Le mélange est amené à pH basique (entre 8 et 10) par ajout de soude 3N afin d'éviter toute réaction parasite qui pourrait perturber le contrôle des masses molaires. Le mélange est ensuite agité pendant 20 minutes sous fort barbotage d'azote afin d'éliminer l'oxygène dissov s. Le mélange réactionnel est ensuite porté à une température de 32 °C à l'aide d'un bain marie. On ajoute 1 % en mole de peroxydi sulfate d'ammonium et 0,1 % en mole de métabisulfite de sodium par rapport à la quantité de monomères afin d'amorcer la réaction de copolymérisation. La réaction est conduite pendant 1 heure et 30 minutes, le mélange devenant fortement visqueux au bout de 45 minutes environ.
Le milieu réactionnel est ensuite dilué à 500 ml avec de l'eau MilliQ, acidifié à "un pH de 3 avec de l'acide chlorhydrique 3 N puis ultrafiltré sur membranes de 1 00000 g/mole et enfin lyophilisé. Le produit de la réaction a été caractérisé par RMN du proton et dosage acido-basique afin de déterminer le taux d'incorporation de l'acide acrylique.
On obtient un copolymère de P(DMA-s-AA) dans lequel pour une fraction initiale de
10 % en masse d'acide acrylique, 4,8 % (en masse) sont incorporés dans le copolymère. 2) Greffage de la trypsine Dans cette étape, on effectue le greffage de la trypsine sur le copolymère de P(DMA-s-AA) préparé ci-dessus à l'étape 1 via son extrémité
N-terminale qui réagit avec les groupements carboxyliques de l'acide acrylique pour former une amide. Le protocole de greffage utilisé est basé sur le couple EDC/NHS (chlorhydrate de l -éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide /
N-hydroxysuccinimide). Pour ce faire, on dissout 100 mg de P(DMA-s-AA) préparé ci-dessus à l'étape 1 dans 10 ml d'acide 2-(N-morpholino)-éthane sulfonique (MES) 0,1 M renfermant 0,5 M de chlorure de sodium et présentant un pH de 6. Lorsque le copolymère est dissous, on ajoute 52 mg (2,71.10" moles) de EDC et 63 mg (5,47.10" moles) de NHS, chacun de ces deux composés ayant préalablement été dissous dans 1 ml de MES 0,1 M renfermant 0,5M de NaCl et présentant un pH de 6. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 15 minutes puis filtré sur une membrane Microcon ® ayant un seuil de coupure de 100000 g/mole de façon à éliminer le NHS et l'EDC n'ayant pas réagi. Le mélange réactionnel est ensuite centrifugé à 10 000 tours par minute pendant 1 heure et 15 minutes. Le mélange réactionnel est ensuite porté à une température de 4 °C puis on y ajoute 2,4 mg (1 .,04.10"7 moles) d'une solution de trypsine à 2 mg/ml dans le MES 0,1 M, 0,5 M NaCl, pH 6. Le mélange est ensuite maintenu à une température de
4°C sous agitation pendant 12 heures. A la fin de la réaction, le mélange réactionnel est dilué à 300 ml par ajout d'eau MilliQ puis ultrafiltré sur membranes ayant une seuil de coupure de 100000 Da afin d'éliminer la trypsine n'ayant pas réagi, le produit de réaction secondaire (NHS) et pour dessaler le milieu. Le mélange réactionnel est ensuite concentré jusqu'à un volume de 50 à 100 ml puis lyophilisé. EXEMPLE 2 : PREPARATION D'UN CAPILLAIRE EN VERRE FONCTIONNALISE AR UN COPOLYMERE PORTEUR DE TRYPSINE A TITRE DE MOLECULE SONDE Le copolymère trypsine tel que préparé ci-dessus à l'exemple 1 est mis en suspension dans du tampon NH4HCO3 25 mM (pH 8) filtré sur filtre de 0,22 μm, à raison de 3 % (p/y) de copolymère trypsiné/ml de tampon. Un capillaire de 20 cm de longueur et de 75 μm de diamètre (Polymicro ®) est traité par passage des solutions suivantes : NaOH 3 N ; Tampon NH4HCO3 25 mM; HCl 0,2 M ; Tampon et enfin la solution de P(D A-s-AA) trypsine. Cette dernière solution est laissée à incuber avec le capillaire pendant 30 minutes puis un dernier rinçage au NH HCO3 est réalisé. On obtient ainsi un capillaire en vene dont la surface interne est fonctionnalisée par une couche adsorbée de polymère statistique hydrosoluble de P(DMA-s-AA) trypsine. Ce type de capillaire peut ensuite être utilisé pour la digestion de la créatine selon les techniques classiques et bien connues de l'homme du métier, par exemple par passage d'une solution de créatine dans du NH4HCO3, et analyse du produit de digestion par spectrométrie de masse.
EXEMPLE 3 : PREPARATION D'UN COPOLYMERE DE N.N- DIMETHYLACRYLA1MIDE ET DE BIOTINE FONCTIONNALISEE PAR UN GROUPEMENT VINYLE Cet exemple illustre la synthèse d'un copolymère de N,N-diméthylacrylamide et de biotine fonctionnalisée par un groupement vinyle. La fonctionnalisation de la biotine est réalisée par réaction d'un groupement carboxylique de la biotine avec la N-aminopropyl méthacrylamide contenant un groupe vinyle. La réaction est conduite en condition anliydre dans un solvant organique tel que le dichlorométhylène, le tetrahydrofurane (THF), la diméthylformamide (DMF), le diméthylsulfoxyde (D SO), à l'aide d'un agent de couplage tel que le dicycloh exyl carbodiimide. La copolymérisation de la biotine avec le monomère de N,N- diméthylacrylamide est réalisée dans les mêmes conditions que celles décrites ci- dessus à l'exemple 1 en faisant réagir 2,7 g (0,0272 moles) et 1,2 g (0,0042 moles) de biotine modifiée par un groupement vinyle. On obtient un copolymère qui est purifié par ultrafïltration à l'aide d'un filtre à coupure de seuil de 100000 Da puis lyophilisé.
EXEMPLE 4 : PREPARATION D'UN SUPPORT SOLIDE COMPORTANT UNE SURFACE MODIFIEE PAR UN COPOLYMERE DE N,N- DIMETHYLACRYLAMIDE ET DE BIOTINE ET SON UTILISATION POUR L'IMMOBILISATION DE MOLECULES CIBLES BIOTINYLEES PAR L'INTERMEDIAIRE DE LA STREPTAVIDINE Le copolymère purifié tel que préparé ci-dessus à l'exemple 3, est dissous dans un tampon à la concentration désirée, c'est-à-dire généralement entre 0,1 et 1 % en poids, puis adsorbé à la surface d'un capillaire. De l'avidine ou de la streptavïdine peut alors ensuite être couplée au copolymère fixé à la surface du capillaire. Le complexe copolymère-avidine ou copolymère-streptavidine résultant peut ensuite être utilisé pour capturer des molécules biotinylees en solution telles que par exemple des protéines, des peptides, des oligonucléotides, des anticorps, etc.

Claims

REVENDICATIONS
1. Polymère statistique hydrosoluble comportant des molécules sondes à titre de substituants latéraux, caractérisé par le fait : - qu'il résulte de la copolymérisation d'un monomère A de
N,N-[dialkyl(C]-C )acrylamide] et d'un monomère B choisi parmi : a) les monomères Bl comportant au moins une fonction chimique réactive apte à former une liaison covalente avec une fonction chimique complémentaire d'une molécule sonde et b) les molécules sondes fonctionnalisées par un monomère copolymérisable (monomère B2), lesdites molécules sondes citées ci-dessus en a) et b) étant choisies parmi les protéines ; les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques ; et les petites molécules organiques, lesdits substituants latéraux étant au moins au nombre de deux par molécule de copolymère, - qu'il présente une masse moléculaire strictement supérieure à 500000 g/mole, et - que le taux d'incorporation desdites molécules sondes est strictement inférieur à 30 % en nombre par rapport au nombre total d'unités monomériques de N,N-[dialkyl(C]-C4)acrylamide].
2. Polymère selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les protéines sont choisies parmi les enzymes, les anticorps, les antigènes et les peptides et que les acides nucléiques sont choisis parmi les oligonucléotides, l'ADN et l'ARN.
3. Polymère selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que les petites molécules organiques sont des molécules organiques présentant un poids moléculaire inférieur ou égale à 1000 g/mole.
4. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il a une masse moléculaire supérieure ou égale à 1.106 g/mole.
5. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les groupes alkyle en Cι-C des monomères A de
N,N-[dialky](Cj-C4)acrylamide] sont choisis parmi les groupes méthyle, éthyle, n- propyle et 72-butyle.
6. Polymère selon la revendication 5, caractérisé par le fait que le monomère A de N,N-[dialkyl(C)-C )acrylamide] est un monomère de IS,N-diméthylacrylamide.
7. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les monomères B sont choisis parmi les monomères vinyliques et acrylamides.
8. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les molécules sondes sont choisies parmi les enzymes.
9. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le taux d'incorporation des molécules sondes est compris entre 1 et 20 % en nombre par rapport au nombre total d'unités monomériques de monomère A de N,N-[dialkyl(Cj-C4)acrylamide].
10. Utilisation d'au moins un polymère statistique hydrosoluble tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour la préparation d'un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par des molécules sondes.
11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisé par le fait que le support solide est une puce à protéines ou à acides nucléiques.
12. Procédé de préparation d'un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par une couche de polymères statistiques hydrosolubles, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes suivantes : - la mise en contact d'un support solide comportant au moins une surface à fonctionnaliser, avec une solution dans un solvant compatible d'au moins un polymère tel que défini ci-dessus à l'une quelconque des revendications 1 à 9, - l'incubation de ladite surface avec ladite solution de polymère pendant un temps suffisant à l'adsorption du polymère sur la surface du support solide, - le rinçage du support solide à l'aide d'un solvant exempt de polymère pour obtenir un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par une couche adsorbée de polymères.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que les supports solides sont choisis parmi les supports comportant au moins une surface de type silice et ses dérivés.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé par le fait que les dérivés de la silice sont le verre et le quartz.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé par le fait que la durée de l'incubation du support solide avec les polymères en solution est comprise entre 1 et 60 minutes.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisé par le fait que la quantité de polymères en solution est comprise entre 0,001 % et 5 % en poids par rapport au volume de la solution de polymères.
17. Support solide obtenu en .mettant en œuvre le procédé de préparation tel que défini à l'une quelconque des revendications 12 à 16, caractérisé par le fait qu'il comporte au moins une surface fonctionnalisée par une couche adsorbée de polymères statistiques hydrosolubles porteurs de molécules sondes à titre de substituants latéraux.
18. Support solide selon la revendication 17, caractérisé par le fait qu'il se présente sous la forme de plot, de canal, de capillaire, de réacteur ou de chambre réactionnelle.
19. Support solide selon la revendication 17 ou 18, caractérisé par le fait que l'épaisseur de la couche de polymère est comprise entre 1 et 100 nm.
20. Utilisation d'un support solide tel que défini à l'une quelconque des revendications 17 à 19, pour l'immobilisation et le criblage de molécules cibles complémentaires en solution ou la réalisation de réactions biochimiques, chimiques ou biologiques sur support solide.
21. Procédé d'immobilisation de molécules cibles et de criblage de molécules cibles complémentaires en solution ou de réalisation de réactions biochimiques, chimiques ou biologiques sur support solide, caractérisé par le fait qu'il comprend au moins les étapes suivantes : a) la mise en contact d'un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par une couche adsorbée de polymères statistiques hydrosolubles porteurs de molécules sondes à titre de substituants latéraux tel que défini à l'une quelconque des revendications 17 à 19, avec un échantillon liquide susceptible de renfermer des molécules cibles, pendant un temps suffisant à la réalisation de ladite immobilisation ou de ladite réaction, b) la désorption de la couche de polymère de la surface du support par rinçage du support avec une solution alcaline ou un solvant, et c) éventuellement, la répétition des étapes a) et b) ci-dessus.
22. Procédé selon la revendication 21 , caractérisé par le fait que la solution alcaline utilisée pour effectuer l'étape de régénération du support est choisie parmi l'hydroxyde de sodium, de potassium ou d'ammonium.
23. Procédé selon la revendication 21, caractérisé par le fait que le solvant utilisé pour effectuer l'étape de régénération du support est choisi parmi les solvants organiques qui sont miscibles à l'eau.
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