FR2867479A1 - Polymere de haut poids moleculaire a base de n,n- dimethylacrylamide et de monomeres fonctionnalises par des molecules sondes et ses utilisations - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à des polymères de haut poids moléculaires à base de N,N-dialkylacrylamide et de monomères fonctionnalisés de façon latérale par des molécules d'intérêt, à leur utilisation pour la préparation de supports solides comportant au moins une surface sur laquelle lesdits polymères sont adsorbés. La présente invention se rapporte également aux supports solides ainsi modifiés et à leur procédé d'obtention, ainsi qu'à leurs diverses utilisations, notamment pour l'immobilisation de molécules d'intérêts ou la réalisation de réactions chimiques, biochimiques ou biologiques.
Description
La présente invention se rapporte à des polymères de haut poids
moléculaires à base de N,N-dialkylacrylamide et de monomères fonctionnalisés de façon latérale par des molécules d'intérêt, à leur utilisation pour la préparation de supports solides comportant au moins une surface sur laquelle lesdits polymères sont
adsorbés. La présente invention se rapporte également aux supports solides ainsi modifiés et à leur procédé d'obtention, ainsi qu'à leurs diverses utilisations, notamment pour l'immobilisation de molécules d'intérêts ou la réalisation de réactions chimiques, biochimiques ou biologiques.
Ces dernières années, un intérêt grandissant a été porté aux puces à ADN, à protéines ou à peptides qui ont radicalement révolutionné l'approche expérimentale en biologie moléculaire. Typiquement, des telles puces sont fabriquées à partir d'un petit support solide à base de silicium (par exemple en verre) ou en plastique, sur lequel sont immobilisées des milliers de molécules biologiques ou chimiques d'intérêt.
Les supports porteurs de ces molécules d'intérêt immobilisées peuvent avantageusement être utilisés pour la détection et la reconnaissance d'espèces biologiques, mais d'autres applications de ces supports, comme par exemple la synthèse ou modification chimique sur support ou encore l'exaltation de réactions biologiques sur support et la digestion de protéines, sont également possibles.
Dans le cadre de ces diverses applications, il est primordial de pouvoir disposer de supports solides fonctionnalisés présentant un certain nombre de qualités.
Ces supports doivent en particulier permettre l'immobilisation reproductible des molécules d'intérêt, dans la mesure où une immobilisation reproductible est conditionnelle d'un résultat, par exemple une détection, lui-même reproductible.
D'autre part, il est important de pouvoir disposer de supports faciles à préparer et ce de façon rapide sans mettre en oeuvre une chimie coûteuse et compliquée.
Enfin, il peut être avantageux de pouvoir disposer de supports à fonctionnalisation réversible, c'est-à-dire de supports qu'il est possible de régénérer en refonctionnalisant la surface sur laquelle ont été immobilisées des molécules d'intérêt (supports régénérables).
De nombreuses méthodes permettant l'immobilisation de molécules biologiques ou chimiques sur des surfaces ont été décrites dans la littérature dans le but de réaliser des réactions biochimiques ou de capturer, détecter ou tester différentes molécules cibles. Dans la plupart des cas, et notamment en ce qui concerne les puces à ADN ou à protéines "jetables", c'est-à-dire à utilisation unique, les molécules biologiques sont immobilisées sur le support par l'intermédiaire d'une liaison covalente de façon à ce que les molécules ne se détachent pas du support au cours pendant l'utilisation des puces, notamment lors des étapes de lavages. Dans ce cas, cette immobilisation s'effectue généralement en deux étapes distinctes: - une première étape de fonctionnalisation des supports qui consiste en une modification chimique de leur surface par greffage de molécules de synthèse (agents de couplage) qui vont assurer la fixation des molécules biologiques sur le support; - une deuxième étape d'immobilisation consistant à établir une liaison covalente entre Ies molécules biologiques et ces supports fonctionnalisés.
Dans le cas particulier des puces à ADN qui sont conçues dans le but de détecter différentes séquences et variations de séquences, ceci sur de nombreux sites et de façon simultanée, les méthodes utilisant des supports à base de polyacrylamide sont des plus intéressantes pour immobiliser des oligonucléotides (ON) à la surface des supports. Selon la littérature, peu d'interactions non spécifiques sont observées avec de telles surfaces et les puces qui en résultent présentent une grande efficacité et une densité de sondes facilement modulables. Cependant, malgré ces avantages, l'immobilisation de sondes sur des surfaces à base de polyacrylamide nécessite l'activation des gels et/ou des sondes via une chimie délicate. C'est donc un procédé difficile à mettre en oeuvre. Une autre approche consiste à immobiliser des ON via la copolymérisation d'ON fonctionnalisés par de l'acrylamide avec un polyacrylamide réticulé (Rehman F. N., et al., Nucleic Acid Research, 1999, 27(2), 649-655). Dans ce cas, les gels peuvent être préparés par Ies techniques de polymérisation classiques et bien connues de l'homme de l'art telles que la polymérisation radicalaire. Les surfaces ainsi préparées présentent une grande densité de sondes accrochées de manière stable. Les surfaces de ces supports présente par contre l'inconvénient d'être modifiées de façon permanente et de ce fait ne peuvent pas être facilement régénérées.
Il a également déjà été proposé, notamment par Southern E. et al., Nat. Genet., 1999. 21, 5-9, de préparer des puces à ADN en modifiant la surface d'un support solide par de la poly-L-lysine sur laquelle des ON peuvent ensuite être fixés de façon électrostatique. Dans ce cas, les surfaces peuvent être régénérées assez facilement mais les ON sont en contact direct avec la surface, ce qui a des conséquences négatives sur leur capacité à s'hybrider avec des séquences complémentaires cibles en solutions compte tenu de contraintes géométriques.
l0 II est également possible, d'immobiliser des ON ou des peptides biotinylés sur des surfaces fonctionnalisées par de la streptavidine en mettant à profit le couplage biotine-streptavidine, ou bien encore sur des surfaces d'or lorsque les ON ont préalablement été fonctionnalisés par un groupement thiol à une de leurs extrémités. Les surfaces ainsi obtenues en utilisant ces techniques sont également difficiles à régénérer et requlerent une fonctionnalisa-bon préalable des molécules avant leur attachement sur le support.
Toujours dans la même optique, il a également été proposé de nouveaux polymères synthétiques conjugués chimiquement à différentes protéines afin de créer de nouvelles molécules fonctionnelles hybrides protéinepolymère. A ce titre, le polyéthylèneglycol (PEG) conjugué avec des protéines thérapeutiques ou des enzymes telles que par exemple la catalase compte parmi les molécules hybrides les plus étudiées (Abuchowski A. et al., J. Biol. Chem., 1977, 252, 3582-3586). Si de tels conjugués polymère-protéines présentent généralement une meilleure stabilité, une plus grande solubilité dans les solvants organiques et en conditions in vivo, ils présentent néanmoins le désavantage de ne pas être fixés à la surface d'un support solide et ne peuvent donc pas être utilisés pour la préparation de puces à protéines.
Aussi, il a également déjà été proposé de remédier à ce problème en proposant des systèmes microfluidiques de type "laboratoires sur puces" ("Labs-on-chips") dans lesquels des enzymes sont immobilisées à la surface de microcapillaires de façon covalente (voir notamment Mao H et al., Anal Chem., 2002, 74, 379-385). Tout comme les puces ADN décrites ci- dessus, ces systèmes présentent également l'inconvénient d'être difficilement régénérables compte tenu de mode de fixation des protéines par l'intermédiaire d'une liaison covalente.
Selon encore une autre approche, il a également déjà été proposé différents types de support solides dont la surface est fonctionnalisée par des homopolymères ou des copolymères comportant une pluralité de molécules ligands qui sont aptes à capturer des molécules cibles en solutions. C'est ainsi par exemple que le brevet US 5.695,936 décrit une méthode de détection d'une séquence nucléotidique d'intérêt à l'aide d'une sonde nucléotidique marquée avec un traceur. Selon cette méthode, on utilise un réactif constitué d'un copolymère à base de N- vinylpyrrolidone ou d'anhydride maléique, ayant une masse moléculaire comprise entre 5000 et 400000 l0 g/mole et comportant des substituants latéraux de nature oligonucléotidique. L'immobilisation de ce copolymère à la surface du support est réalisée de manière assez compliquée par l'intermédiaire d'un complexe entre le support solide, une sonde marquée avec un traceur, un réactif et un acide nucléique cible. Les supports ainsi obtenus présentent une bonne sensibilité de détection mais sont longs et coûteux à préparer et difficilement régénérables.
Le brevet US 5,453,461 décrit par ailleurs des polymères biologiquement actifs de formule P-(A)q dans laquelle P représente un polymère linéaire, ramifié ou réticulé formé par exemple à partir de monomères acryliques, A représente une section active biologiquement et peut par exemple être de la biotine ou un ON comportant de 1 à 80 unités nucléotidiques et q est un nombre entier égal à 1 ou 2. Selon la structure de ces polymères, A est toujours positionné à l'extrémité de la chaîne polymère et non de façon latérale. Ces polymères ont généralement une masse moléculaire inférieure à 1000000 et sont destinés à être fixés de façon covalente (par l'intermédiaire d'une liaison amide, urée, ester, éther ou d'un groupe uréthane) à la surface de supports solides dans le but d'être utilisés dans des réactions d'identifications biochimiques ou dans des réactions avec d'autres molécules biologiquement actives telles que des protéines ou des acides nucléiques. Une fois encore, ce type de support est difficilement régénérable.
Enfin, selon une dernière approche, il a déjà été proposé de préparer des supports solides dont la surface est recouverte par une couche de polymères comportant des substituants biologiquement actifs par simple adsorption desdits polymères sur la surface du support.
C'est ainsi que le brevet US 5.723,344 décrit la préparation de copolymères formés à partir d'un monomère de N-vinylpyrrolidone et d'un second monomère comportant une fonction réactive permettant la fixation par liaison covalente d'un ligand biologique capable de former un complexe avec une molécule cible tel que par exemple un complexe antigène/anticorps, polynucléotide/polynucléotide, polynucléotide/acide nucléique, anticorps/haptène, hormone/récepteur, ainsi que leur capacité à s'adsorber à la surface de supports solides. De tels copolymères ont une masse moléculaire généralement comprise entre 1000 et 500000, de préférence entre 10000 et 250000 et comportent de 25 à 70 % l0 d'unités dérivées de la N-vinylpyrrolidone. Les supports ainsi préparés peuvent être utilisés pour l'immobilisation de molécules cibles en solution, en particulier dans des procédés de détection et de dosage de séquences nucléotidiques. Les couches de polymères adsorbés sur de tels supports présentent néanmoins l'inconvénient d'être très peu stables, du fait de la taille moléculaire relativement petite de ces copolymères et du pourcentage élevé de substituants latéraux (30 à 75 %).
Il existe par ailleurs différents cas, notamment dans le cadre de la protéomique, où des molécules ayant une durée de vie limitée, telles que les enzymes par exemple, sont fixées à la surface de supports solides. A titre d'exemple, la trypsine peut être fixée à la surface de réacteurs et subit, dans ce cas, très peu d'autolyse comparativement à de la trypsine en solution. Dans le but d'augmenter le taux de digestion de différentes protéines, il est en effet possible de maximiser le ratio surface (protéines fixées à la surface) volume (protéines libres en solution). De façon habituelle, la fixation de la trypsine est réalisée sur des microbilles de quartz ou de silice qui sont ensuite insérées dans des microcapillaires qui servent de réacteurs à la trypsine. Dans ce cas la fixation de la trypsine est réalisée par l'intermédiaire d'une réaction de réduction d'une base de Schiff entre un groupe amine primaire résiduel de la trypsine et un groupe aldéhyde portée par la surface (voir notamment Muilin C., dans "Methods in Enzymology", Colowick. S.P., Caplan N.O. Eds., Academic Press, New York, 1987, Vol 136). De telles méthodes sont cependant longues et laborieuses et ne donnent pas entière satisfaction. En particulier, après l'immobilisation de la trypsine à la surface des supports, il reste des parties de la surface qui n'ont pas été modifiées et qu'il est nécessaire de saturer afin de minimiser les réactions non spécifiques d'adsorption de molécules en solution (peptides, protéines par exemple).
C'est donc afin de remédier à l'ensemble de ces inconvénients et de pourvoir à un support solide comportant au moins une surface sur laquelle il soit possible d'immobiliser des molécules chimiques ou biologiques d'intérêt et qui soit à la fois simple à préparer et à régénérer tout en gardant une bonne sensibilité de détection et une bonne stabilité dans le temps que les Inventeurs ont mis au point ce qui fait l'objet de la présente Invention.
La présente invention a pour premier objet un polymère comportant des molécules sondes à titre de substituants latéraux, caractérisé par le fait: - qu'il résulte de la copolymérisation d'un monomère A de N,N-[dialkyl(Cj- C4)acrylamide] et d'un monomère B choisi parmi: a) les monomères BI comportant au moins une fonction chimique réactive apte à former une liaison covalente avec une fonction chimique complémentaire d'une molécule sonde et b) les molécules sondes fonctionnalisées par un monomère copolymérisable (monomère B2), lesdites molécules sondes citées ci-dessus en a) et b) étant choisies parmi les protéines et notamment Ies protéines à activité enzymatique, les anticorps, les antigènes et les peptides; les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques tels que les oligonucléotides, l'ADN et I'ARN; et les petites molécules organiques, Iesdits substituants latéraux étant au moins au nombre de deux par molécule de copolymère, - qu'il présente une masse moléculaire strictement supérieure à 500000 g/mole, et - que le taux d'incorporation desdites molécules sondes est strictement inférieur à 30 % en nombre par rapport au nombre total d'unités monomériques de N,N-[dialkyl(Cj-C4)acrylamide].
Les Inventeurs ont en effet découvert que les polymères conformes à la présente Invention et tels que définis ci-dessus sont capables de s'adsorber physiquement de façon stable à la surface de supports solides, et permettent ainsi de conduire à des supports solides comportant au moins une surface fonctionnalisée par des molécules sondes tels que par exemple des puces à acide nucléique ou à protéines sur lesquels il est ensuite possible d'immobiliser des molécules cibles d'intérêt tout en minimisant l'adsorption d'autres molécules en solution.
Selon la présente Invention, on entend par petite molécule organique, des molécules organiques présentant préférentiellement un poids moléculaire inférieur ou égal à 1000 g/mole. Parmi de telles molécules, on peut en particulier citer les molécules hydrocarbonées telles que le N-propyl méthacrylate, le N-décyl méthacrylate et la N-octadécyl acrylamide, ainsi que les médicaments et les principes actifs.
Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, ledit polymère a une masse moléculaire supérieure ou égale à 1.106 g/mole. Les Inventeurs ont en effet constaté que la stabilité des surfaces fonctionnalisées par de tels polymères était encore plus grande lorsque les polymères utilisés présentaient une telle masse moléculaire.
Parmi les groupes alkyle en C1-C4 des monomères A de N,N-[dialkyl(Cj-C4) acrylamide] constitutifs des copolymères conformes à l'Invention, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, n-propyle et n-butyle, le groupe méthyle étant tout particulièrement préféré. A titre de monomère A, le N, N-diméthylacrylamide est donc tout particulièrement préféré.
Parmi les monomères B. on peut en particulier citer les monomères vinyliques et acrylamides tels que les acides acrylique et méthacrylique, les N-aminoalkyl acrylamides, les N-aminoalkyl méthacrylamides, les aminoalkyl acrylates et les aminoalkyl méthacrylates, dans lesquels le groupe alkyl peut représenter par exemple le groupe éthyle. propyle, butyle, pentyle, ou hexyle.
Parmi les fonctions chimiques réactives des monomères BI, on peut citer les fonctions carboxylique. amine, alcool et thiol, qui seront aptes à interagir avec une fonction complémentaire portée par lesdits substituants latéraux telle que les donneurs de doublets libres comme les amines, les alcools, les thiols, les carboxyles, les carbonyles. On pourra trouver facilement, dans toute monographie de chimie organique, une liste plus exhaustive des paires de groupements fonctionnels complémentaires.
Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, les molécules sondes présentes dans le polymère à titre de substituants latéraux sont de préférence choisies parmi les molécules biologiques actives présentant une durée de vie limitée, telles que les enzymes.
Selon une autre forme de réalisation préférée de l'Invention, le taux d'incorporation des molécules sondes est compris entre 1 et 20 % en nombre par rapport au nombre total d'unités monomériques de monomère A de N,N-[dialkyl(CIC4)acrylamide].
Les polymères conformes à l'Invention et tels que décrits précédemment peuvent être préparés selon les techniques classiques de copolymérisation bien connues de l'homme du métier telles que par exemple la l0 copolymérisation par voie radicalaire, en faisant réagir les monomères A tels que définis ci-dessus avec des monomères BI ou B2 tels que définis ci-dessus dans un solvant approprié tel que l'eau, en présence d'un activateur de polymérisation tel que par exemple un couple red/ox comme le couple persulfate d'ammonium/métabisulfite de sodium. La préparation des monomères B2 peut être également réalisée selon les méthodes classiques et bien connues de l'homme du métier en faisant par exemple réagir, en conditions anhydres dans un solvant organique adapté tel que le dichlorométhylène, le tetrahydrofurane (THF), la diméthylformamide (DMF) ou le diméthylsulfoxyde (DMSO), une molécule sonde contenant un groupe carboxylique (la biotine par exemple) avec le groupe vinyle d'un monomère copolymérisable tel que par exemple la N-aminopropyI méthacrylamide, en présence d'un agent de couplage tel que par exemple le carbodiimide dicyclohexyle; la réaction d'un groupe carboxyle et d'un groupe amine étant en effet bien connue depuis longue date dans la littérature, notamment dans l'article de Khorana H. G. et al., Chem. Rev., 1953, 53, 145-166. De façon similaire, de la trypsine modifiée par un groupement vinyle peut être préparée selon la méthode décrite par Plate N. A. et al., Polymer Science USSR, l 989, 31, 216-219.
Lorsque la synthèse est terminée, les polymères conformes à l'Invention peuvent être caractérisés par les techniques analytiques classiques telles que la chromatographie d'exclusion diffusion à indice de réfraction et à détection par diffusion de la lumière ou par viscosimétrie afin de recueillir des informations sur la taille des polymères ou bien encore par les techniques de résonance magnétique nucléaire (RMN) afin de recueillir des informations sur leur structure.
La présente Invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un polymère tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par des molécules sondes, et notamment pour la préparation de puces à protéines ou à acides nucléiques et en particulier à ADN.
Elle a donc également pour objet un procédé de préparation d'un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par un polymère conforme à l'Invention, caractérisé par le fait qu'il comprend Ies étapes suivantes: - la mise en contact d'un support solide comportant au moins une l0 surface à fonctionnaliser, avec une solution dans un solvant compatible d'au moins un polymère conforme à l'Invention et tel que défini ci-dessus, - l'incubation de ladite surface avec ladite solution de polymère pendant un temps suffisant à l'adsorption du polymère sur la surface du support solide, - le rinçage du support solide à l'aide d'un solvant exempt de polymère pour obtenir un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par une couche adsorbée de polymères.
Les supports solides pouvant être fonctionnalisés selon ce procédé sont de préférence choisis parmi les supports comportant au moins une surface de type silice et ses dérivés tels que le verre et le quartz, ou tout autre matériel recouvert de silice, de verre ou de quartz.
Selon l'Invention, on entend par solvant compatible tout solvant permettant la dissolution du polymère, n'entraînant pas d'altération des molécules sondes qu'il comporte à titre de substituant latéral et pour lequel la surface du support solide à fonctionnaliser aura une affinité inférieure à celle qu'elle aura pour les polymères conformes à l'Invention. Ainsi, lors de la mise en contact de la solution de polymères avec le support, les polymères en solution pourront s'adsorber spontanément sur la surface du support. Le choix d'un tel solvant en fonction de la nature des polymères et de la surface à fonctionnaliser peut être réalisé en mesurant la tension de surface du solvant pur (ys) ainsi que celle des polymères (yp) lorsque ceux- ci sont liquides. Lorsque ys est supérieur à yp, alors le polymère sera capable de s'adsorber à la surface du support solide lorsqu'il est solution dans le solvant.
De tels solvants compatibles sont généralement choisis parmi l'eau et des tampons aqueux comme par exemple le bicarbonate d'ammonium ou d'autres tampons salins.
Il existe également deux autres facteurs déterminant vis-à-vis de l'adsorption des polymères sur la surface. Le premier facteur est le niveau d'interaction entre la surface du support solide et les unités monomériques constitutives du polymère, c'est-à-dire la quantité d'énergie nécessaire à l'adsorption du polymère (forces d'attraction). Le deuxième facteur est la réduction des états conformationnels du polymère sur la surface du support solide, c'est-à-dire la diminution de l'entropie de chaîne. Ceci est dû à l'impénétrabilité de la surface pour les unités monomériques du polymère et correspond à l'énergie qui tend à repousser le polymère de la surface du support solide (forces répulsives). L'épaisseur de la couche de polymères adsorbée à la surface du support solide sera d'autant plus grande que les forces répulsives seront importantes. La solidité de l'adsorption de la couche de polymères à la surface du support solide sera donc fonction du ratio entre les forces d'attraction et les forces répulsives.
La durée de l'incubation du support solide avec les polymères en solution est de préférence comprise entre 1 et 60 minutes environ, et encore plus préférentiellement entre 5 et 40 minutes environ.
Selon une forme de réalisation préférée de ce procédé, la quantité de polymères en solution est comprise entre environ 0,001 % et 5 % en poids par rapport au volume de la solution de polymères et encore plus préférentiellement entre environ 0,1 % et 2 % (poids/volume).
Selon une forme de réalisation préférée du procédé conforme à l'Invention, les solvants utilisés pour rincer le support après adsorption des polymères et avant leur utilisation sont de préférence choisis parmi les solvants décrits ci-dessus et utilisés pour réaliser la solution de polymères. De façon encore plus préférée, le solvant utilisé pour rincer le support est identique à celui utilisé pour réaliser la solution de polymère.
La présente Invention a également pour objet les supports solides obtenus en mettant en oeuvre le procédé de préparation conforme à l'Invention, lesdits supports étant caractérisés par le fait qu'ils comportent au moins une surface fonctionnalisée par une couche adsorbée de polymères porteurs de molécules sondes à titre de substituants latéraux tels que définis précédemment. De tels supports peuvent en particulier se présenter sous la forme de plot, de canal, de capillaire, de réacteur ou de chambre réactionnelle tels que par exemple les dispositifs habituellement utilisés pour réaliser des réactions enzymatiques (digestion enzymatique).
Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, l'adsorption des polymères à la surface du support solide est réalisée par I'intermédiaire des monomères A de N,N-[dialkvl(Cj-C4)acrylamide].
Ces supports solides sont notamment des puces à protéines et en particulier des puces à enzymes, à peptides ou à polypeptides, des puces à acides nucléiques et en particulier à ADN ou à ARN, des puces à oligosaccharides ou à polysaccharides. Dans de tels supports, l'épaisseur de la couche de polymère est généralement comprise entre l et 100 nm.
L'épaisseur des couches de polymères peut être mesurée par exemple par élipsométrie ou à l'aide de techniques plus élaborées employant des ondes évanescentes (Allain C. et al., Phys. Rev. Lett., 1982, 49, 1694) ou la diffusion de neutrons (Barnett K. et al., "The effects of Polymers on Dispersion Stability", Tadros, J., Ed., Academic Press, 1982).
L'invention a également pour objet l'utilisation de ces supports pour l'immobilisation et le criblage de molécules cibles complémentaires en solution ou la réalisation de réactions biochimiques, chimiques ou biologiques sur support solide telles que par exemple de réactions enzymatiques. Selon l'Invention, le terme "biochimique" se réfère aux réactions, aux procédés et aux protocoles qui font intervenir au moins un substrat et son enzyme. A titre d'exemple, les termes "réaction biochimique" peut être utilisé dans le cadre de la présente Invention pour désigner les procédés d'amplification d'acides nucléiques tels que les réactions de polymérisation en chaîne (PCR), la détermination d'un génotype tel que le microséquençage, ou bien encore le séquençage d'acides nucléiques. Le terme "biochimique" inclus également d'autres types de réactions catalysées par une enzyme tels que la digestion des protéines par les protéases, le clivage de l'ADN par des nucléases, la phosphorylation de molécules par des kinases, l'isomérisation de molécules par des isomérases, la conversion de dopamine en norépinéphrine par la dopamine hydrolase, etc. Selon la présente Invention, le terme "chimique" est utilisé pour désigner des réactions, méthodes et procédés dans lesquelles il existe au moins étape faisant intervenir une réaction qui n'est pas catalysée par une enzyme. A titre d'exemple, le terme "chimique" peut être utilisé pour désigner des synthèses de molécules organiques ou inorganiques, des réactions de dégradation dont l'une des étapes n'est pas catalysée par une enzyme ainsi que les réactions chimiques catalysées par le rayonnement ultra violet.
Toujours selon la présente Invention, le terme "biologique" est utilisé pour désigner des réactions dont au moins l'une des étapes fait intervenir un organisme vivant telle qu'une cellule, une culture de cellules, un amas de cellules adhérentes, un organisme mono- ou pluricellulaire, des parties de tissus ou d'organes. Le terme "biologique" utilisé dans le cadre de la présente Invention englobe donc les organismes eucaryotes mono- ou pluricellulaires, ainsi que les organismes procaryotes tels les bactéries et les virus.
Ainsi, l'Invention a également pour objet un procédé d'immobilisation de molécules cibles et de criblage de molécules cibles complémentaires en solution ou de réalisation de réactions biochimiques, chimiques oubiologiques sur support solide, caractérisé par le fait qu'il comprend au moins les étapes suivantes: a) la mise en contact d'un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par une couche adsorbée de polymères porteurs de molécules sondes à titre de substituants latéraux avec un échantillon liquide susceptible de renfermer des molécules cibles, pendant un temps suffisant à la réalisation de ladite immobilisation ou de ladite réaction, b) la désorption de la couche de polymère de la surface du support 25 par rinçage du support avec une solution alcaline ou un solvant, c) éventuellement, la répétition des étapes a) et b) ci-dessus.
Grâce à ce procédé, il est en effet possible d'effectuer une série de plusieurs immobilisations ou de plusieurs réactions sur le même support grâce à l'étape de régénération de la surface à l'aide de la solution alcaline ou du solvant qui permet de conduire à un support dont la surface peut à nouveau être fonctionnalisée par un polymère portant les mêmes molécules sondes ou par un polymère portant des molécules sondes différentes. l3
Les solutions alcalines utilisables pour effectuer l'étape de régénération du support peuvent être choisies parmi les solutions d'hydroxyde de sodium, de potassium ou d'ammonium.
Les solvants utilisables pour effectuer l'étape de régénération du support sont de préférence choisis parmi les solvants pour lesquels les polymères adsorbés ont plus d'affinité que pour la surface sur laquelle ils se sont préalablement adsorbés.
Parmi de tels solvants, on peut en particulier citer les solvants organiques qui sont miscibles à l'eau tels que le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol, 10 l'acétonitrile, l'acétone, etc. De préférence, l'étape b) de régénération du support est réalisée à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de préparation d'un copolymère de N,Ndiméthylacrylamide et d'acide acrylique comportant de la trypsine à titre de molécule sonde, à un exemple de préparation d'un capillaire en verre comportant une surface fonctionnalisée par un tel polymère et à l'utilisation d'un tel capillaire pour effectuer une réaction de digestion de la créatine, à un exemple de préparation d'un copolymère de N,N-diméthylacrylamide et de biotine fonctionnalisée par un groupement vinyle, à un exemple de préparation d'un support solide comportant une surface modifiée par un tel copolymère et son utilisation pour l'immobilisation de molécules cibles biotinylées par l'intermédiaire de la streptavidine.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés 25 uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1: PREPARATION D'UN COPOLYMERE DE N,NDIMETHYLACRYLAMIDE ET D'ACIDE ACRYLIQUE P(DMA-S-AA) PORTEUR DE MOLECULES DE TRYPSINE A TITRE DE MOLECULE
SONDE
1) Synthèse du copolymère P(DMA-s-AA) Dans un ballon tricol de 100 ml, on introduit 2,7 g de N,N-diméthylacrylamide (0,0272 moles) et 0,3 g d'acide acrylique (0,0042 moles) dans 30 ml d'eau MilliQ. Le mélange est amené à pH basique (entre 8 et 10) par ajout de soude 3N afin d'éviter toute réaction parasite qui pourrait perturber le contrôle des masses molaires. Le mélange est ensuite agité pendant 20 minutes sous fort barbotage d'azote afin d'éliminer l'oxygène dissous.
Le mélange réactionnel est ensuite porté à une température de 32 C à l'aide d'un bain marie. On ajoute 1 % en mole de peroxydisulfate d'ammonium et 0,1 l0 % en mole de métabisulfite de sodium par rapport à la quantité de monomères afin d'amorcer la réaction de copolymérisation. La réaction est conduite pendant 1 heure et 30 minutes, le mélange devenant fortement visqueux au bout de 45 minutes environ. Le milieu réactionnel est ensuite dilué à 500 ml avec de l'eau Mi]liQ, acidifié à un pH de 3 avec de l'acide chlorhydrique 3 N puis ultrafiltré sur membranes de 100000 g/mole et enfin lyophilisé.
Le produit de la réaction a été caractérisé par RMN du proton et dosage acido-basique afin de déterminer le taux d'incorporation de l'acide acrylique. On obtient un copolymère de P(DMA-s-AA) dans lequel pour une fraction initiale de 10 % en masse d'acide acrylique, 4,8 % (en masse) sont incorporés dans le copolymère.
2) Greffage de la trypsine Dans cette étape, on effectue le greffage de la trypsine sur le copolymère de P(DMA-s-AA) préparé ci-dessus à l'étape l via son extrémité N-terminale qui réagit avec les groupements carboxyliques de l'acide acrylique pour former une amide. Le protocole de greffage utilisé est basé sur le couple EDC/NHS (chlorhydrate de I -éthyl3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide / N-hydroxysuccinimide).
Pour ce faire, on dissout 100 mg de P(DMA-s-AA) préparé ci-dessus à l'étape 1 dans 10 ml d'acide 2-(N-morpholino)-éthane sulfonique (MES) 0, 1 M renfermant 0,5 M de chlorure de sodium et présentant un pH de 6. Lorsque le copolymère est dissous, on ajoute 52 mg (2,71.104 moles) de EDC et 63 mg (5,47.10 moles) de NHS, chacun de ces deux composés ayant préalablement été dissous dans 1 ml de MES 0,1 M renfermant 0,5M de NaCl et présentant un pH de 6.
Le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 15 minutes puis filtré sur une membrane Microcon ayant un seuil de coupure de 100000 g/mole de façon à éliminer le NHS et l'EDC n'ayant pas réagi. Le mélange réactionnel est ensuite centrifugé à 10 000 tours par minute pendant 1 heure et 15 minutes.
Le mélange réactionnel est ensuite porté à une température de 4 C puis on y ajoute 2,4 mg (1,04.10-7 moles) d'une solution de trypsine à 2 mg/ml dans le MES 0,1 M, 0,5 M NaCl. pH 6. Le mélange est ensuite maintenu à une température de 4 C sous agitation pendant 12 heures.
A la fin de la réaction, le mélange réactionnel est dilué à 300 ml par ajout d'eau MiIliQ puis ultrafiltré sur membranes ayant une seuil de coupure de 100000 Da afin d'éliminer la trypsine n'ayant pas réagi. le produit de réaction secondaire (NHS) et pour dessaler le milieu. Le mélange réactionnel est ensuite concentré jusqu'à un volume de 50 à 100 ml puis lyophilisé.
EXEMPLE 2: PREPARATION D'UN CAPILLAIRE EN VERRE FONCTIONNALISE PAR UN COPOLYMERE PORTEUR DE TRYPSINE A TITRE DE MOLECULE SONDE Le copolymère trypsiné tel que préparé ci-dessus à l'exemple 1 est 20 mis en suspension dans du tampon NH4HCO3 25 mM (pH 8) filtré sur filtre de 0,22 m, à raison de 3 % (p/v) de copolymère trypsiné/ml de tampon.
Un capillaire de 20 cm de longueur et de 75 m de diamètre (Polymicro ) est traité par passage des solutions suivantes: NaOH 3 N; Tampon NH4HCO3 25 mM; HCI 0,2 M; Tampon et enfin la solution de P(DMA-s-AA) trypsiné. Cette dernière solution est laissée à incuber avec le capillaire pendant 30 minutes puis un dernier rinçage au NH4HCO3 est réalisé.
On obtient ainsi un capillaire en verre dont la surface interne est fonctionnalisée par une couche adsorbée de polymère de P(DMA-s-AA) trypsiné.
Ce type de capillaire peut ensuite être utilisé pour la digestion de la créatine selon les techniques classiques et bien connues de l'homme du métier, par exemple par passage d'une solution de créatine dans du NH4HCO3, et analyse du produit de digestion par spectrométrie de masse.
EXEMPLE 3: PREPARATION D'UN COPOLYMERE DE N,NDIMETHYLACRYLAMIDE ET DE BIOTINE FONCTIONNALISEE PAR UN GROUPEMENT VINYLE Cet exemple illustre la synthèse d'un copolymère de N,N-diméthylacrylamide et de biotine fonctionnalisée par un groupement vinyle. La fonctionnalisation de la biotine est réalisée par réaction d'un groupement carboxylique de la biotine avec la N-aminopropyI méthacrylamide contenant un groupe vinyle. La réaction est conduite en condition anhydre dans un solvant organique tel que le dichlorométhylène, le tetrahydrofurane (THF), la diméthylformamide (DMF), le diméthylsulfoxyde (DMSO), à l'aide d'un agent de couplage tel que le dicyclohexylcarbodiimide.
La copolymérisation de la biotine avec le monomère de N,Ndiméthylacrylamide est réalisée dans les mêmes conditions que celles décrites ci- dessus à l'exemple 1 en faisant réagir 2,7 g (0,0272 moles) et 1,2 g (0, 0042 moles) de biotine modifiée par un groupement vinyle.
On obtient un copolymère qui est purifié par ultrafiltration à l'aide d'un filtre à coupure de seuil de 100000 Da puis lyophilisé.
EXEMPLE 4: PREPARATION D'UN SUPPORT SOLIDE COMPORTANT UNE SURFACE MODIFIEE PAR UN COPOLYMERE DE N,NDIMETHYLACRYLAMIDE ET DE BIOTINE ET SON UTILISATION POUR L'IMMOBILISATION DE MOLECULES CIBLES BIOTINYLEES PAR L'INTERMEDIAIRE DE LA STREPTAVIDINE Le copolymère purifié tel que préparé ci-dessus à l'exemple 3, est dissous dans un tampon à la concentration désirée, c'est-à-dire généralement entre 0,1 et 1 % en poids, puis adsorbé à la surface d'un capillaire. De l'avidine ou de la streptavidine peut alors ensuite être couplée au copolymère fixé à la surface du capillaire. Le complexe copolymère-avidine ou copolymère-streptavidine résultant peut ensuite être utilisé pour capturer des molécules biotinylées en solution telles que par exemple des protéines, des peptides, des oligonucléotides, des anticorps, etc.
Claims (22)
- 2. Polymère selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les protéines sont choisies parmi les enzymes, les anticorps, les antigènes et les peptides et que les acides nucléiques sont choisis parmi les oligonucléotides, l'ADN et I'ARN.
- 3. Polymère selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que les petites molécules organiques sont des molécules organiques présentant un poids moléculaire inférieur ou égale à 1000 g/mole.
- 4. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il a une masse moléculaire supérieure ou égale à ].]o' g/mole.
- 5. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les groupes alkyle en Cj-C4 des monomères A de N,N-[dialkyl(Cj-C4)acrylamide] sont choisis parmi les groupes méthyle, éthyle, n-propyle et n-butyle.
- 6. Polymère selon la revendication 5, caractérisé par le fait que le monomère A de N,N-[dialkyl(CI-C4)acrylamide] est un monomère de N,Ndiméthylacrylamide.
- 7. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, 5 caractérisé par le fait que les monomères B sont choisis parmi les monomères vinyliques et acrylamides.
- 8. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les molécules sondes sont choisies parmi les enzymes.
- 9. Polymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le taux d'incorporation des molécules sondes est compris entre l et 20 % en nombre par rapport au nombre total d'unités monomériques de monomère A de N,N-[dialkyl(CI-C4)acrylamide].
- 10. Utilisation d'au moins un polymère tel que défini à l'une quelconque des revendications l à 9, pour la préparation d'un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par des molécules sondes.
- 11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisé par le fait que le support solide est une puce à protéines ou à acides nucléiques.
- 12. Procédé de préparation d'un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par une couche de polymères, caractérisé par le fait qu'il 20 comprend les étapes suivantes - la mise en contact d'un support solide comportant au moins une surface à fonctionnaliser. avec une solution dans un solvant compatible d'au moins un polymère tel que défini ci-dessus à l'une quelconque des revendications l à 9, - l'incubation de ladite surface avec ladite solution de polymère pendant un temps suffisant à l'adsorption du polymère sur la surface du support solide, - le rinçage du support solide à l'aide d'un solvant exempt de polymère pour obtenir un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par une couche adsorbée de polymères.
- 16. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que les 30 supports solides sont choisis parmi les supports comportant au moins une surface de type silice et ses dérivés.
- 17. Procédé selon la revendication 13, caractérisé par le fait que les dérivés de la silice sont le verre et le quartz.
- 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé par le fait que la durée de l'incubation du support solide avec les polymères en solution est comprise entre l et 60 minutes.
- 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisé par le fait que la quantité de polymères en solution est comprise entre 0,001 % et 5 % en poids par rapport au volume de la solution de polymères.
- 17. Support solide obtenu en mettant en oeuvre le procédé de préparation tel que défini à l'une quelconque des revendications 12 à 16, caractérisé IO par le fait qu'il comporte au moins une surface fonctionnalisée par une couche adsorbée de polymères porteurs de molécules sondes à titre de substituants latéraux.
- 18. Support solide selon la revendication 17, caractérisé par le fait qu'il se présente sous la forme de plot, de canal, de capillaire, de réacteur ou de chambre réactionnelle.
- 19. Support solide selon la revendication 17 ou 18, caractérisé par le fait que l'épaisseur de la couche de polymère est comprise entre 1 et 100 nm.
- 20. Utilisation d'un support solide tel que défini à l'une quelconque des revendications 17 à 19, pour l'immobilisation et le criblage de molécules cibles complémentaires en solution ou la réalisation de réactions biochimiques, chimiques ou biologiques sur support solide.
- 21. Procédé d'immobilisation de molécules cibles et de criblage de molécules cibles complémentaires en solution ou de réalisation de réactions biochimiques, chimiques ou biologiques sur support solide, caractérisé par le fait qu'il comprend au moins les étapes suivantes: a) la mise en contact d'un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par une couche adsorbée de polymères porteurs de molécules sondes à titre de substituants latéraux tel que défini à l'une quelconque des revendications 17 à 19, avec un échantillon liquide susceptible de renfermer des molécules cibles, pendant un temps suffisant à la réalisation de ladite immobilisation ou de ladite réaction, b) la désorption de la couche de polymère de la surface du support par rinçage du support avec une solution alcaline ou un solvant, et c) éventuellement, la répétition des étapes a) et b) ci-dessus.
- 22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé par le fait que la solution alcaline utilisée pour effectuer l'étape de régénération du support est choisie parmi l'hydroxyde de sodium, de potassium ou d'ammonium.
- 23. Procédé selon la revendication 21, caractérisé par le fait que le solvant utilisé pour effectuer l'étape de régénération du support est choisi parmi les solvants organiques qui sont miscibles à l'eau.
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| US6692914B1 (en) * | 1999-07-02 | 2004-02-17 | Symyx Technologies, Inc. | Polymer brushes for immobilizing molecules to a surface or substrate, where the polymers have water-soluble or water-dispersible segments and probes bonded thereto |
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| US6692914B1 (en) * | 1999-07-02 | 2004-02-17 | Symyx Technologies, Inc. | Polymer brushes for immobilizing molecules to a surface or substrate, where the polymers have water-soluble or water-dispersible segments and probes bonded thereto |
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