EP1718657A1 - Bras espaceur moleculaire, procede de fabrication, et utilisations sur une puce d analyse a molecules ou biomolecules - Google Patents

Bras espaceur moleculaire, procede de fabrication, et utilisations sur une puce d analyse a molecules ou biomolecules

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Publication number
EP1718657A1
EP1718657A1 EP05728104A EP05728104A EP1718657A1 EP 1718657 A1 EP1718657 A1 EP 1718657A1 EP 05728104 A EP05728104 A EP 05728104A EP 05728104 A EP05728104 A EP 05728104A EP 1718657 A1 EP1718657 A1 EP 1718657A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
spacer arm
substituents
chosen
support
sup
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05728104A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Véronique PERETTI
Françoise Vinet
David Bonnaffe
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP1718657A1 publication Critical patent/EP1718657A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/02—Monosaccharides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • MOLECULAR SPACER ARM MANUFACTURING METHOD, AND USES ON AN ANALYSIS CHIP WITH MOLECULES OR BIOMOLECULES
  • the present invention relates to a molecular spacer arm, to a process for preparing the spacer arm connecting a molecular unit to a solid support, as well as to the use of this spacer arm on molecular analysis chips or biomolecules.
  • the references in square brackets [] refer to the list of references at the end of the description.
  • the analysis chips targeted by the present invention are more particularly, but not exclusively, biochips and microsystems dedicated to biological analysis. They fall into three categories: DNA chips, lab-on-chip ("Lab-On-Chip”) and cell chips (“Cell-On-Chip”).
  • Lab-On-Chip lab-on-chip
  • Cell-On-Chip cell chips
  • This biochip is either the result of a deposit of a natural or synthetic substance, or the result of a supported multi-parallel synthesis (combinatorial chemistry) of different oligosaccharide sequences, representative of the molecular diversity of certain large families of endogenous glycoconjugates, for example heparan sulfates.
  • the present invention is particularly well suited to this new type of biochip, in particular allowing the attachment of these molecules to biochip supports by an efficient and simplified chemistry process compared to the prior art.
  • the molecules or biomolecules, called in the present “molecular units”, which can be fixed on a solid support by means of the spacer arm of the present invention can be for example nucleic acids (DNA or RNA), sugars, glycoproteins, glycolipids, etc. Still other examples are given below.
  • a spacer makes the link between the solid support [2] and, for example, the probes of oligopeptides, of oligonucleotides [3] or of oligosaccharides [4].
  • This spacer can play several roles at the same time: binding molecule, spatial distance arm, place of cleavage of the probe, etc.
  • the proximity of the support to the target recognition sites by the probes can indeed hinder or even prevent the probe / target recognition, and therefore adversely affect the accuracy and the quality of analysis of the biochips. This is especially true when the probes are small, for example in the case of sugar fleas.
  • the equation of principle below indicates the general diagram of the formation then of the cleavage of
  • the present invention makes it possible precisely to solve the abovementioned problems of the prior art at a single time by providing a molecular spacer arm of formula (I) below:
  • [Gp] represents a protective group for the secondary amine -N- or a molecule participating in the functionality of the spacer arm;
  • n, m and p are whole numbers, each greater than or equal to 1 and chosen independently of one another, preferably so that 1 ⁇ n, m and p ⁇ 40;
  • X ° to X 4 are atoms forming the skeleton of the spacer arm of the present invention, radicals chosen for example from H, O, alkyl, aryl, and a heteroaryl each comprising from 2 to 20 carbon atoms which can be attached to these atoms.
  • This spacer arm (I) can be used, in general, to fix a molecular unit [mo] on a solid support [Sup], for example to make a biochip, or more advantageously a sugar chip, where [mo] is generally a molecule functionalizing said biochip.
  • the spacer arm [1] as defined above:
  • X ° and X 4 can each be chosen independently of the other substituents from C, 0, N, S, Si; and or
  • X 1 ; X 2 ; and X 3 may each be independently chosen from the other substituents from C, O, N, S, Si and from aryl and heteroaryl each comprising, for example, from 2 to 10 carbon atoms; and or
  • Z 1 and Z 2 may each be chosen independently of the other substituents from C, N, CR, Si-R, where R is an alkyl containing from 1 to 30 carbon atoms, preferably from 1 to 20 carbon atoms, preferably from 1 to 10 carbon atoms; and / or • R 1 ; R 2 ; and R 3 may each be independently chosen from the other substituents from H, an alkyl, an aryl and a heteroaryl each comprising from 2 to 10 carbon atoms.
  • n, m and p can also be chosen independently of each other so that 1 ⁇ n, m and p ⁇ 30, preferably so that
  • X ° and X 4 are C; X 1 ; X 2 ; and X 3 are C; Z 1 and Z 2 are C;
  • R 1 ; R 2 ; and R 3 are H. According to the invention, the protective group
  • [Gp] can be any of the protective groups of secondary amines known to those skilled in the art. It is preferably chosen so that it resists the synthetic chemistry of the spacer arm, of its attachment to the support and of its attachment with the molecular unit [mo]. It can be chosen for example from Ac, Bn (benzyl), an aryl group (R) in Ci at 40 ⁇ Troc, z, ICA, BOC, Fmoc, etc., to form with the secondary amine of the spacer arm (I) one of the following chemical groups (> N- indicates the protected secondary amine):> N-Ac: acetamide (> N-CO- e);
  • N-R C1 to 40 arylamide
  • N-TCA trichloroacetamidate (> N-C0-CC1 3 );
  • N-BOC t-butyl carbamate (> NC (O) OCMe 3 );
  • the protective group is chosen from Ac, BOC or a C1 to 40 aryl group.
  • the molecule [Gp] participating in the functionality of the spacer arm can be, for example, alkyl or a Ci to 40 aryl, for example in Ci to 30 for example in Ci to 20 or in Ci to 10 • It can be any substituent, not necessarily protective, which can participate in the functionality of the spacer arm when is used.
  • the solid support can for example be any support that can be silanized. They can be, for example, plates, beads or capillaries. It can for example be based on silica, glass, or other materials known to a person skilled in the art, for example for manufacturing the supports or surfaces of biochips. The silanization of the support can be carried out by any process known to those skilled in the art.
  • the molecular unit [mo] can be a natural or synthetic molecule.
  • [mo] can be any molecule which must be fixed on a support, for example for analytical reasons. It can be a small molecule, for example having a molecular weight ranging from approximately 180 to 400,000 g.mol -1 . In the case of a sugar, [mo] may for example have a molecular weight ranging from 180 to 10,000 g.mol -1 . When it is a protein or a peptide, [mo] can for example have a molecular weight ranging from 5500 to 400000 g.mol -1 , generally ranging from 5500 to 220 000 g.mol -1 (weight of most proteins).
  • This molecular unit [mo] can for example be chosen from monosaccharides, oligosaccharides, poly-oligosaccharides, glyco-conjugates, peptides, proteins, enzymes, glycoproteins, lipids, fatty acids, glycolipids, glycolipoproteins, etc.
  • glucose glucosamine
  • azidoglucosamine D-ribose
  • D— xylose L-arabinose
  • D-glucose D-galactose
  • D-mannose 2-deoxy-D-ribose
  • L-fucose N-acetyl-D-glucosamine
  • N-acetyl-D-galactosamine N-acetylneuraminic acid
  • D-glucuronic acid L-iduronic acid
  • D-sorbitol D-mannitol, etc.
  • oligosaccharides mention may be made of sucrose, lactose, fragments of heparan sulfates, saccharide fragments of heparin, of chondroitin, of dermatan sulfates, Lewis antigens, etc.
  • poly-oligosaccharides there may be mentioned saccharide parts of heparan sulfates, heparin, chondroitin, dermatan sulfates, etc.
  • glyco-conjugates there may be mentioned heparanes sulfates, heparin, chrondroitin, dermatans sulfates, etc.
  • chemokines cytokines
  • insulin fibrinogen
  • fibrinogen myosin
  • myosin myosin
  • hemoglobin etc.
  • enzymes there may be mentioned oxidoreductases, transferases, hydrolases, lyases, isomerases, ligases.
  • glycoproteins mention may be made of glycoproteins, mention may be made of immunoglobulin G, hyaluronic acid, etc.
  • hydrolysable lipids fats (glycerol + 3 fatty acids), waxes (fatty acid + fatty alcohols), sterol esters (sterol + fatty acids), phospholipids (phosphatidic acids (glycerol, 2 acids fatty + phosphate)), phosphalides (glycerol + 2 fatty acids
  • sphingolipids sphingosine + fatty acid + phosphate + amino alcohol
  • non hydrolyzable lipids alkanes, carotenoids, sterols
  • cholesterol cholesterol
  • steroids estradiol, testosterone
  • acids fatty acids
  • eicosanoids etc.
  • fatty acids there may be mentioned arachidonic acid, linoleic acid, linolenic acid, lauric acid, nervonic acid, palmitic acid, oleic acid, etc.
  • glycolipids there may be mentioned galactosyl-ceramic, glucosyl-ceramide, gangliosides, cerebrosides (fatty acid + sphingosine + 1 sugar), gangliosides (fatty acid + sphingosine + many sugars, neuraminic acid), etc.
  • the present invention also relates to a method of covalent attachment of a molecular unit [mo] to a solid support via a spacer arm, advantageously that of the present invention.
  • the process can comprise the following stages: (i) reduction of the nitrile function of a compound of formula:
  • the secondary amine can also be protected by a protective group.
  • the method of the invention can also comprise a step of fixing a protective group [Gp] on the secondary in innate function.
  • the protective group can be as defined above. Its attachment to the secondary amine can be done by any chemical process known to those skilled in the art, for example according to one of the processes described in document [7].
  • the conventional organic chemistry processes known to those skilled in the art can be used.
  • the method described in document [6] can be used for the nitrile reduction step.
  • the ozonolysis method described in document [5] can be used for the step of forming an aldehyde function from an allylated function of a biological molecule.
  • the reductive amination step followed by protection of the nitrogen between the reduced nitrile and said aldehyde function to obtain an activated biological molecule the process described in the document
  • the spacer arm of the present invention can therefore be created from three parts which are linked on the one hand by reductive amination followed by nitrogen protection on the side of the molecular unit, and on the other hand during a Grubbs metathesis reaction.
  • Grubbs methatesis is for example described in document [11].
  • the nitrogen atom which is inserted into the carbon chain has several advantages: obtained during the attachment of two links, it is in the form of a secondary amine which can be protected in different ways to give a reactivity particular to the spacer.
  • This advantageously modular function on a case-by-case basis by different protective groups or by a molecule participating in the functionality of the spacer arm makes it possible to vary and control the hydrophilicity or the hydrophobicity of the spacer arm and to control its steric bulk. It is also advantageously possible to modulate the electrophilic / nucleophilic or acid / basic character of this part of the spacer arm: the nature of the protective groups of the nitrogen atom is therefore preferably chosen with the aim of optimizing reaction conditions , interactions, characterization operations or analyzes, whether before or after cleavage of the spacer to release the molecular unit.
  • acetyl group due to its small size, a small steric bulk is obtained, which allows optimization of molecular recognition when using the spacer arm, for example on a molecule chip.
  • a hydrophobic carbon substituent is obtained which makes this part of the spacer arm hydrophobic, which allows for example a more specific, more selective recognition of hydrophilic proteins with respect to the hydrophilic parts of the spacer arm ([mo]).
  • the present invention therefore provides a modular spacer arm (or “spacer”), the various structures of which influence the reactivity of the arm, that is to say its chemical and / or electrochemical and / or steric behavior.
  • the present invention can be carried out in a simple and effective manner and the spacer advantageously has the following three properties, in particular when it is used for the manufacture of sugar chips: - first of all, the spacer does indeed have the function of arms making it possible to move the sweet chain away from the solid surface which supports this chain. - then the spacer is a cleavable arm: it is possible to easily and targetedly open the spacer to isolate the sugar from the supported phase.
  • the spacer due to its low level of chemical functionality, remains inert under many reaction conditions carried out during organic syntheses on sweet units for example and during the use of sugar chips.
  • the inventors noted the following during the various experiments of implementation of the present invention: -
  • the spacer arm makes it possible to overcome the steric problems due to the presence of the solid support. It makes it possible to study, under good steric conditions, the protein / sugar interactions on the sugar chips obtained. It solves the problems of steric hindrance which have arisen in the prior art when approaching the protein towards the sweet ligands and which hinder future potential interactions.
  • the length of the arm is flexible: a judicious choice of functional counterparts of different sizes, in particular by the choice of starting reagents, makes it possible to prepare spacers of different sizes.
  • the simplicity of the chemical structure of 1 "spacer gives it properties of chemical non-reactivity during the numerous organic reactions during its manufacture and during the use of the sugar chip.
  • the spacer due to its absence of interactive chemical functions has no influence on potential interactions with other molecules, when the system is used as part of a sugar chip or more generally a small molecule chip.
  • ozonolysis a metathesis of Grubbs (Grubbs catalyst), or a dihydroxylation followed by an oxidative cut of diolosmylation (Os0, NaI0)
  • Os0, NaI0 oxidative cut of diolosmylation
  • this spacer is advantageously compatible with many sweet molecules already synthesized and described in the literature, for example in documents [7], [12] and [13].
  • the present invention can for example be used for the manufacture of a sugar chip, for example a chip capable of identifying by screening oligosaccharide sequences recognizing a particular protein, for example according to the technique described in document [1] .
  • the present invention makes it possible to optimize the screening methods and therefore to have more efficiently and quickly molecules for therapeutic or biotechnological purposes. It can be expected that this capability will also exist in the other applications of the present invention.
  • the present invention can also be used on biochips where a spacer arm must make the link between the solid support and probes of oligopeptides, oligonucleotides and / or oligosaccharides.
  • the spacer arm of the present invention can be used on an oligopeptide chip such as that described in the document [3], on an oligosaccharide chip such as that described in document [4].
  • R represent substituents, identical or different from one another at different positions on the sugar-forming cycle, and possibly the substituents generally encountered on sugars.
  • the sugar used being N-acethylglucosamine
  • the skilled person has no difficulty in identifying the substituents "R” at the different positions of the compounds (1), (2), (5) and (10).
  • Example A Activation of the oligosaccharide (reaction A)
  • An ozonolysis reaction is used in this example. The process used is described in document [5] The allylated sugar in the anomeric position (1) (0.93 mmol) is dissolved in 5 ml of a mixture of dichloromethane and methanol (1/1): the medium is immersed in a cold bath at a temperature of -78 ° C (acetone + dry ice). Ozone O3 must then dabble in the solution: as soon as the blue color appears (characteristic of an excess of ozone), the ozone is replaced by argon (or nitrogen).
  • the medium is made reducing by adding diethylsulphide Me 2 S (4.65 mmol, 5 eq): dimethyl sulphoxide DMSO is then formed.
  • the medium slowly rises to room temperature overnight, then is evaporated under vacuum: the organic residue is taken up in diethyleter Et 2 0, and washed with water.
  • the organic phases are evaporated under vacuum, then co-evaporated with toluene.
  • the crude product is purified by chromatography on a column of silica gel (eluent: petroleum ether / ethyl acetate: 8/2).
  • the aldehyde (2) is obtained with a yield of 75%.
  • Example B Reduction of a nitrile (reaction B)
  • the chemical process used is described in document [6].
  • the lithium aluminum hydride LiAlH 4 (381 mg, 10.03 mmol, 1 eq) is introduced into the freshly distilled diethylether (20 ml).
  • 4-pentenenitrile (3) (814 mg, 1 ml,
  • Example C Reductive amination (reaction C)
  • the chemical process used is described in document [7].
  • the aldehyde (2) (20.87 mmol) is dissolved in dimethylformamide (1.2 ml) freshly distilled on calcium hydride (CaH 2 ): the medium is stirred and the amine (4) (31.30 mmol, 2 eq) is added. After about twenty minutes, sodium cyanoborohydride NaBH 3 CN (83.47 mmol, 4 eq) is added to the mixture, which is left to stir at ambient temperature overnight. If the reaction is not completed, it is possible to add NaBH 3 CN (1 eq).
  • Example D Functionalization of the solid support (reactions D and E) The chemical process used is described in document [7]. Controlled Pore Glass beads (6) (CPG,
  • the CPG beads (7) are introduced into a mixture of toluene (45 ml), triethylamine Et 3 N (1.35 ml) and 7-octenyltrimethoxysilane (8) (CnH 2 4 ⁇ 3 Si, M 232.39, 100 ⁇ l ): the reaction medium is set at 80 ° C for 16 hours (oven).
  • the beads are extracted from the mixture by centrifugation, and are rinsed with ethanol several times and then dried (rotary evaporator). They are then subjected to a temperature of 110 ° C for 3 hours to carry out the crosslinking step (oven).
  • Example F Metathesis reaction (reaction F) The chemical process used is described in document [9].
  • the silanized CPG beads (9) (2 g, 30 ⁇ mol / g) are stirred in dichloromethane (20 ml), under a nitrogen atmosphere.
  • the sugar-spacer system (5) (300 ⁇ mol,> 5 eq) is then added, in the middle, with a Grubbs catalyst (6 ⁇ mol, 5 mg,
  • Example G Cleavage of the probe (reaction G)
  • the chemical process used is described in document [10].
  • system (10) solid support-spacer of the present invention-oligosaccharide chain
  • the experimental protocol is described in document [5].
  • the chemical equation is as follows:
  • the sweet CPG beads (10) are stirred slowly in a 1/1 dichloromethane / methanol mixture.
  • the medium is brought to a temperature of -78 ° C (acetone + liquid nitrogen).
  • ozone O3 is bubbled into the reaction medium until a blue color appears.
  • argon bubble for a few minutes in the mixture, before neutralizing the medium with dimethylsulfide and then the reaction medium is left to return to room temperature overnight.
  • the beads are taken up in diethylether, filtered, rinsed several times with diethylether and with water.
  • the beads (12) are then put aside, and the supernatant is extracted (diethyl ether / water), the organic phase is dried over magnesium sulfate MgSO 4 , evaporated in vacuo and co-evaporated with toluene.
  • the product (11) is then obtained.
  • Example I This example uses the same [mo] as in Example H, but attached to the spacer arm of the invention by its N-terminal end. Moreover,
  • [mo] is an RDG peptide hooked by the N-terminus
  • Example J In this example, [mo] is a “sialyl- is is”.
  • the support is the same as in the operating protocol described above.
  • the protective group is Boc. Its fixing chemistry is known to those skilled in the art. Beads on which the sialyl-lewis has been attached are thus obtained. They have the formula:
  • [mo] is a sulfated compound.
  • the support is the same as in the operating protocol described above. Beads on which the sulfated compound is attached are thus obtained. They have the formula:
  • [mo] is a sulphated compound, Z being a protective group (for example Gp defined in the part "description of the invention)
  • Example L In this example, [mo] is a protected sugar.
  • the support is the same as in the operating protocol described above. Beads on which the protected sugar is hung are thus obtained. They have the formula:
  • Example M In this example, [mo] is a sialic acid.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un bras espaceur moléculaire, à un procédé de fixation d'une unité moléculaire à un support solide, ainsi qu'à l'utilisation de ce bras espaceur sur des puces d'analyse à molécules ou biomolécules. Le bras espaceur est de formule (I) : dans laquelle X0, X4 = C, O, S, Se, N, P, As ; X1-3 = C, O, N, S, Se, P, As, ou aryle, hétéroaryle en C1-6 ; Z1-2 = C-R, Si-R, N, P et As, où R = alkyle en C1-6 ; R1-3 = H, ou alkyle, aryle, hétéroaryle en C1-6 ; [Gp] = groupement protecteur de >N ; n, m et n = nombres entiers ≥ 1 ; [Sup] = H ou un support solide silanisé ; et [mo] = H ou une unité moléculaire destinée à être fixée de manière covalente par l’intermédiaire dudit bras espaceur sur ledit support solide silanisé.

Description

BRAS ESPACEUR MOLECULAIRE, PROCEDE DE FABRICATION, ET UTILISATIONS SUR UNE PUCE D'ANALYSE A MOLECULES OU BIOMOLECULES
DESCRIPTION
Domaine technique La présente invention se rapporte à un bras espaceur moléculaire, à un procédé de préparation du bras espaceur reliant une unité moléculaire à un support solide, ainsi qu'à l'utilisation de ce bras espaceur sur des puces d'analyse à molécules ou biomolécules. Dans l'exposé qui suit, les références entre crochets [] renvoient à la liste de références à la fin de la description. Les puces d' analyse visées par la présente invention sont plus particulièrement, mais non exclusivement, les biopuces et microsystèmes dédiés à l'analyse biologique. Elles se répartissent en trois catégories : les puces à ADN, les laboratoires sur puce (« Lab-On-Chip ») et les puces à cellules (« Cell-On-Chip ») . Actuellement, un nouveau type de biopuce émerge : la puce à sucre (« Glycochip ») . Cette biopuce est soit le résultat d'un dépôt d'une substance naturelle ou synthétique, soit le résultat d'une synthèse multiparallèle supportée (chimie combinatoire) de différentes séquences oligosaccharidiques, représentatives de la diversité moléculaires de certaines grandes familles de glycoconjugués endogènes, par exemple les héparanes sulfates. La présente invention est particulièrement bien adaptée à ce nouveau type de biopuce en permettant notamment la fixation de ces molécules sur des supports de biopuces par un procédé de chimie efficace et simplifié par rapport à l'art antérieur. Les molécules ou biomolécules, appelées dans la présente « unités moléculaires », qui peuvent être fixées sur un support solide par l'intermédiaire du bras espaceur de la présente invention peuvent être par exemple des acides nucléiques (ADN ou ARN) , des sucres, des glycoprotéines, des glycolipides, etc. D'autres exemples encore sont donnés ci-dessous.
Art antérieur Dans la majorité des biopuces, un espaceur fait le lien entre le support solide [2] et, par exemple, les sondes d' oligopeptides, d' oligonucléotides [3] ou d' oligosaccharides [4]. Cet espaceur peut jouer plusieurs rôles à la fois : molécule liante, bras d'éloignement spatial, lieu de clivage de la sonde, etc. La proximité du support avec les sites de reconnaissance des cibles par les sondes peut en effet gêner, voire empêcher la reconnaissance sonde/cible, et donc nuire à la finesse et à la qualité d'analyse des biopuces . Ceci est particulièrement vrai lorsque les sondes sont petites, par exemple dans le cas des puces à sucres. L' équation de principe ci-dessous indique le schéma général de la formation puis du clivage de
1 ' espaceur, dans laquelle X' représente un support solide, et X' ' une unité moléculaire . Précurseu r du bras espaceu r Su pport activé ^ ^~ -N m olécule à fixer accrochage
Fixation de la m olécu le à fixer sur le support solide par l'interm édiaire d u bras espaceu r form é
Rupture du bras espaceur X' 1 I N-
; ιDe nombreux bras espaceurs ont été réalisés à ce jour, mais ceux-ci présentent un certain nombre d'inconvénients non résolus. En effet, leur structure implique une limitation sévère des procédés chimiques utilisables pour leur fixation sur le support solide et/ou ils ne permettent de fixer facilement tout type de molécule biologique et/ou ils sont si stables chimiquement qu'une fois fixés sur le support solide leur clivage pour récupérer la molécule biologique ne peut pas se faire facilement, et peut entraîner la détérioration de cette dernière ou du support . Le document [4] (US-A-6, 579, 725) décrit un bras espaceur fixant des oligosaccharides. Ce bras espaceur, bien que plus efficace que ceux de l'art encore plus antérieur, ne permet pas de résoudre en même temps tous les problèmes précités. On peut noter également, que sa longueur, sa fonctionnalité, sa réactivité et son encombrement ne peuvent pas toujours être générés à volonté.
Exposé de l' invention La présente invention permet précisément de résoudre en une seule fois les problèmes précités de l'art antérieur en fournissant un bras espaceur moléculaire de formule (I) suivante :
(D - dans laquelle les substituants X° ; X1 ; X2 ; X3 X" Z1 ; Z2 ; R1 ; R2 ; et R3 sont tels que : X° et X4 sont chacun choisis indépendamment des autres substituants parmi C, O, N, S, Se, P, As, Si ; X1 ; X2 ; et X3 sont chacun choisis indépendamment des autres substituants parmi C, O, N, S, Se, P, As, Si et parmi un aryle et un hétéroaryle comprenant par exemple chacun de 2 à 20 atomes de carbone ; • Z1 et Z2 sont chacun choisis indépendamment des autres substituants parmi C-R, Si-R, C, N, P et As, où R est un alkyle comportant par exemple de 1 à 40 atomes de carbone ; • R1 ; R2 ; et R3 sont chacun choisis indépendamment des autres substituants parmi H, un alkyle, un aryle et un hétéroaryle comprenant chacun de 2 à 20 atomes de carbone ;
• [Gp] représente un groupement protecteur de l'aminé secondaire -N- ou une molécule participant à la fonctionnalité du bras espaceur ;
- dans laquelle n, m et p sont des nombres entiers, chacun supérieur ou égal à 1 et choisi indépendamment l'un de l'autre, de préférence de façon à ce que 1 ≤ n, m et p ≤ 40 ;
- dans laquelle [Sup] représente H ou un support solide silanisé sur lequel ledit bras espaceur peut être fixé de manière covalente ; et
- dans laquelle [mo] représente H ou une unité moléculaire destinée à être fixée de manière covalente par l'intermédiaire dudit bras espaceur sur ledit support solide silanisé. Bien entendu, X° à X4 sont des atomes formant le squelette du bras espaceur de la présente invention, des radicaux choisis par exemple parmi H, O, alkyle, aryle, et un hétéroaryle comprenant chacun de 2 à 20 atomes de carbone pouvant être fixés sur ces atomes. Ce bras espaceur (I) est utilisable, de manière générale, pour fixer sur un support solide [Sup] une unité moléculaire [mo] , par exemple pour fabriquer une biopuce, ou plus avantageusement une puce à sucre, où [mo] est généralement une molécule fonctionnalisant ladite biopuce. Selon l'invention, de préférence, dans le bras espaceur [1] tel que défini ci-dessus :
• X° et X4 peuvent être chacun choisis indépendamment des autres substituants parmi C, 0, N, S, Si ; et/ou
• X1 ; X2 ; et X3 peuvent être chacun choisis indépendamment des autres substituants parmi C, O, N, S, Si et parmi un aryle et un hétéroaryle comprenant par exemple chacun de 2 à 10 atomes de carbone ; et/ou
• Z1 et Z2 peuvent être chacun choisis indépendamment des autres substituants parmi C, N, C-R, Si-R, où R est un alkyle comportant de 1 à 30 atomes de carbone, de préférence de 1 à 20 atomes de carbone, de préférence de 1 à 10 atomes de carbone ; et/ou • R1 ; R2 ; et R3 peuvent être chacun choisis indépendamment des autres substituants parmi H, un alkyle, un aryle et un hétéroaryle comprenant chacun de 2 à 10 atomes de carbone. Selon l'invention, n, m et p peuvent aussi être choisis indépendamment l'un de l'autre de façon à ce que 1 ≤ n, m et p ≤ 30, de préférence de façon à ce que
1 ≤ n, m et p ≤ 20, et de préférence encore façon à ce que 1 ≤ n, m et p ≤ 10. A titre d' exemple, selon l' invention, dans le bras espaceur [1] tel que défini ci-dessus, X° et X4 sont C ; X1 ; X2 ; et X3 sont C ; Z1 et Z2 sont C ;
R1 ; R2 ; et R3 sont H . Selon l'invention, le groupement protecteur
[Gp] peut être l'un quelconque des groupements protecteurs d'aminés secondaires connus de l'homme du métier. Il est choisi de préférence de manière à ce qu'il résiste à la chimie de synthèse du bras espaceur, de sa fixation sur le support et de sa fixation avec l'unité moléculaire [mo] . Il peut être choisi par exemple parmi Ac, Bn (benzyle) , un groupement aryle (R) en Ci à 40Λ Troc, z, ICA, BOC, Fmoc, etc., pour former avec l'aminé secondaire du bras espaceur (I) un des groupes chimiques suivants (>N- indique l'aminé secondaire protégée) : >N-Ac : acétamide (>N-CO- e) ;
>N-Bn : benzylamide;
>N-R : arylamide en Ci à 40 ;
>N-Troc : 2, 2, 2-trichloroéthyl carbamate (>N-
C(0)0CH2CC13) ; >N-z : benzyl carbamate (>N-C (O) OCH2Ph) ;
>N-TCA : trichloroacétamidate (>N-C0-CC13) ;
>N-BOC : t-butyl carbamate (>N-C (O) OCMe3) ;
>N-Fmoc : 9-fluorènylméthyl carbamate :
(Ph = phényle et Me = méthyle) De préférence, selon l'invention, le groupement protecteur est choisi parmi Ac, BOC ou un groupement aryle en Ci à 40- Selon l'invention, la molécule [Gp] participant à la fonctionnalité du bras espaceur peut être par exemple un alkyle ou un aryle en Ci à 40, par exemple en Ci à 30 par exemple en Ci à 20 ou en Ci à 10 • Il peut s'agir de tout substituant, pas forcément protecteur, qui peut participer à la fonctionnalité du bras espaceur lorsqu'il est utilisé. Il peut s'agir par exemple d'un groupement hydrophobe, permettant de rendre le bras espaceur plus spécifique et/ou plus sélectif vis-à-vis de la molécule [mo] à fixer, et/ou de son rôle lors de l'utilisation du bras espaceur, par exemple sur une puce à sucre ou à protéine. Selon l'invention, le support solide peut être par exemple tout support pouvant être silanisé. Il peut s'agir par exemple de plaques, de billes ou de capillaires. Il peut être par exemple à base de silice, de verre, ou d'autres matériaux connus de l'homme du métier, par exemple pour fabriquer les supports ou surfaces de biopuces. La silanisation du support peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier. Selon l'invention, l'unité moléculaire [mo] peut être une molécule naturelle ou synthétique. Il peut s'agir de toute molécule qui doit être fixée sur un support, par exemple pour des raisons analytiques. Il peut s'agir d'une petite molécule, par exemple ayant un poids moléculaire allant d'environ 180 à 400000 g.mol-1. Lorsqu'il s'agit d'un sucre, [mo] peut avoir par exemple un poids moléculaire allant de 180 à 10000 g.mol-1. Lorsqu'il s'agit d'une protéine ou d'un peptide, [mo] peut avoir par exemple un poids moléculaire allant de 5500 à 400000 g.mol-1, généralement allant de 5500 à 220000 g.mol-1 (poids moléculaire de la plupart des protéines) . Cette unité moléculaire [mo] peut être par exemple choisie parmi les monosaccharides, les oligosaccharides, les poly-oligosaccharides, les glyco- conjugués, les peptides, les protéines, les enzymes, les glycoprotéines, les lipides, les acides gras, les glycolipides, les glycolipoprotéines, etc. Parmi les monosaccharides, on peut citer le glucose, la glucosamine, azidoglucosamine, D-ribose, D— xylose, L-arabinose, D-glucose, D-galactose, D-mannose, 2-désoxy-D-ribose, L-fucose, N-acétyl-D-glucosamine, N- acétyl-D-galactosamine, acide N-acétylneuraminique, acide D-glucuronique, acide L-iduronique, D-sorbitol, D-mannitol, etc. Parmi les oligosaccharides, on peut citer saccharose, lactose, fragments d'héparanes sulfates, fragments saccharidiques d'héparine, de chondroïtine, de dermatanes sulfates, antigènes Lewis, etc. Parmi les poly-oligosaccharides, on peut citer parties saccharidiques des héparanes sulfates, de l'héparine, de la chondroïtine, les dermatanes sulfates, etc. Parmi les glyco-conjugués, on peut citer heparanes sulfates, héparine, chrondroïtine, dermatanes sulfates, etc. Parmi les peptides et les protéines, on peut citer chimiokines, cytokines, insuline, fibrinogène, myosine, hémoglobine, etc. Parmi les enzymes, on peut citer oxydo- réductases, transférases, hydrolases, lyases, isomérases, ligases. Parmi les glycoprotéines, on peut citer glycoprotéines, on peut citer immunoglobuline G, acide hyaluronique, etc. Parmi les lipides, on peut citer lipides hydrolysables : les graisses (glycerol + 3 acides gras) , les cires (acide gras + alcools gras) , les esters de sterol (sterol + acides gras) , phospholipides (acides phosphatidiques (glycerol, 2 acides gras + phosphate) ) , les phosphalides (glycerol + 2 acides gras
+ phosphate) , les sphingolipides (sphingosine + acide gras + phosphate + aminoalcool) ; lipides non hydrolysables : alcanes, caroténoïdes, stérols
(cholestérol) , stéroïdes (estradiol, testostérone) , acides (acides gras), eicosanoïdes, etc. Parmi les acides gras, on peut citer acide arachidonique, acide linoléique, acide linolénique, acide laurique, acide nervonique, acide palmitique, acide oléique, etc. Parmi les glycolipides, on peut citer galactosyl-céramique, glucosyl-céramide, gangliosides, les cérébrosides (acide gras + sphingosine + 1 sucre) , les gangliosides (acide gras + sphingosine + nombreux sucres, de l'acide neuraminique) , etc. Parmi les glycolipoprotéines, on peut citer MPB83 (marque de commerce) , GLP19 (marque de commerce) et IRBP (marque de commerce) . La présente invention se rapporte également à un procédé de fixation covalente d'une unité moléculaire [mo] sur un support solide par l'intermédiaire d'un bras espaceur, avantageusement celui de la présente invention. Le procédé peut comprendre les étapes suivantes : (i) réduction de la fonction nitrile d'un composé de formule :
(ii) formation d'une fonction aldéhyde à partir d'une fonction allyle d'une molécule biologique de formule :
(iii) amination réductrice entre ladite fonction nitrile réduite suivie d'une protection de l'aminé secondaire formée et ladite fonction aldéhyde pour obtenir une molécule biologique activée pour sa fixation sur le support, ladite molécule biologique activée étant de formule :
(iv) silanisation d' un support solide, et fonctionnalisation du support solide silanisé avec une molécule de formule :
(v) réaction de métathèse entre la molécule fonctionnalisant le support et la molécule biologique activée pour former un bras espaceur selon l'invention reliant la molécule biologique et le support. Dans ce procédé, les substituants X° ; X1 ; X2 ;
X3 ; X4 ; Z1 ; Z2 ; R1 ; R2 ; R3 ; et [mo] sont tels que définis ci-dessus. Selon l'invention, le composé de formule
peut être par exemple un sucre allylé, [mo] étant ledit sucre. Ce sucre allylé peut être obtenu par tout procédé connu de l'homme du métier qui n'altère pas le sucre. Il peut s'agir par exemple du procédé décrit dans le document [5] . Selon l'invention, l'aminé secondaire peut en outre être protégée par un groupement protecteur. Ainsi, le procédé de l'invention peut comprendre en outre une étape de fixation d'un groupement protecteur [Gp] sur la fonction a iné secondaire. Le groupement protecteur peut être tel que défini ci-dessus. Sa fixation sur l'aminé secondaire peut se faire par tout procédé chimique connu de l'homme du métier, par exemple suivant un des procédés décrits dans le document [7] . Pour mettre en œuvre les différentes étapes de ce procédé de l'invention, les procédés classiques de chimie organique connus de l'homme du métier peuvent être utilisés. Ainsi, à titre d'exemple, pour l'étape de réduction du nitrile, le procédé décrit dans le document [6] peut être utilisé. Pour l'étape de formation d'une fonction aldéhyde à partir d'une fonction allylé d'une molécule biologique, le procédé d'ozonolyse décrit dans le document [5] peut être utilisé. Pour l'étape d' amination réductrice suivie d'une protection de l'azote entre le nitrile réduit et ladite fonction aldéhyde pour obtenir une molécule biologique activée, le procédé décrit dans le document
[7] peut être utilisé. Pour l'étape de silanisation du support solide et de sa fonctionnalisation, le procédé décrit dans le document [8] peut être utilisé. Pour la réaction de métathèse, le procédé décrit dans le document [10] peut être utilisé. Le bras espaceur de la présente invention peut donc être créé à partir de trois parties qui sont liées d'une part par amination réductrice suivie d'une protection de l'azote du côté de l'unité moléculaire, et d'autre part lors d'une réaction de métathèse de Grubbs. La méthatèse de Grubbs est par exemple décrite dans le document [11] . L'atome d'azote qui est inséré dans la chaîne carbonée présente plusieurs avantages : obtenu lors de l'accrochage de deux chaînons, il se trouve sous la forme d'une aminé secondaire que l'on peut protéger de différentes manières pour conférer une réactivité particulière à l' espaceur. Cette fonction avantageusement modulable au cas par cas par différents groupements protecteurs ou par une molécule participant à la fonctionnalité du bras espaceur, permet de faire varier et de maîtriser 1 'hydrophilie ou 1 'hydrophobie du bras espaceur et de contrôler son encombrement stérique. Il est aussi avantageusement possible de moduler le caractère électrophile/nucléophile ou acide/basique de cette partie du bras espaceur : la nature des groupements protecteurs de l'atome d'azote est donc de préférence choisie dans le but d'optimiser des conditions de réactions, d'interactions, d'opérations de caractérisâtions ou d'analyses, et ce, que ce soit avant ou après clivage de l' espaceur pour libérer l'unité moléculaire. Par exemple avec un groupement acétyle on obtient du fait de sa petite taille un faible encombrement stérique, ce qui permet une optimisation de la reconnaissance moléculaire lors de l'utilisation du bras espaceur, par exemple sur une puce à molécules. Par exemple aussi, avec un groupement butyle, on obtient un substituant carboné hydrophobe qui rend cette partie du bras espaceur hydrophobe, ce qui permet par exemple une reconnaissance de protéines hydrophiles plus spécifique, plus sélective, vis-à-vis des parties hydrophiles du bras espaceur ( [mo] ) .
La présente invention fournit donc un bras espaceur (ou « espaceur ») modulable, dont les différentes structures influencent la réactivité du bras, c'est-à-dire son comportement chimique et/ou électrochimique et/ou stérique. La présente invention est réalisable de manière simple et efficace et l' espaceur présente avantageusement les trois propriétés suivantes, notamment lorsqu' il est mis en œuvre pour la fabrication de puces à sucres : - tout d'abord, l' espaceur occupe bien la fonction de bras permettant d'éloigner la chaîne sucrée de la surface solide qui supporte cette chaîne. - ensuite l' espaceur est un bras clivable : il est possible d'ouvrir facilement et de manière ciblée l' espaceur pour isoler le sucre de la phase supportée . - enfin, l' espaceur, de par son faible taux de fonctionnalité chimique, reste inerte dans de nombreuses conditions de réactions réalisées lors de synthèses organiques sur des unités sucrées par exemple et lors de l'utilisation des puces à sucres. Outre les avantages précités, les inventeurs ont noté les suivants lors des différentes expérimentations de mise en œuvre de la présente invention : - Le bras espaceur permet de pallier les problèmes stériques dus à la présence du support solide. Il permet d'étudier dans de bonnes conditions stériques les interactions protéines/sucres sur les puces à sucre obtenues. Il résout les problèmes d'encombrement stérique qui se présentaient dans l'art antérieur lors de l'approche de la protéine vers les ligands sucrés et nuisaient aux futures interactions potentielles . - La longueur du bras est modulable : un choix judicieux d'homologues fonctionnels de tailles différentes, en particulier par le choix des réactifs de départ, permet de préparer des espaceurs de tailles différentes . - Il est non seulement possible de choisir la distance entre la chaîne sucrée et le support solide mais aussi de contrôler le caractère hydrophile ou hydrophobe de cette partie de l'espace au moyen du groupement protecteur. - La simplicité de la structure chimique de 1" espaceur lui confère des propriétés de non réactivité chimique lors des nombreuses réactions organiques lors de sa fabrication et lors de l'utilisation de la puce à sucre. - L' espaceur, de par son absence de fonctions chimiques interactives n'a pas d'influence sur des interactions potentielles avec d'autres molécules, lorsque le système est utilisé dans le cadre d'une puce à sucre ou plus généralement d'une puce à petites molécules . - L' espaceur est clivable de manière précise et sélective au niveau de sa double liaison C=C, dans des conditions de réactions qui n'altèrent pas la molécule biologique, par exemple oligosaccharidique . En effet, on peut utiliser commodément pour le clivage par exemple une ozonolyse (03) , une métathèse de Grubbs (catalyseur de Grubbs) , ou une dihydroxylation suivie d'une coupure oxydative de diolosmylation (Os0 , NaI0 ) , et d'autres réactions chimiques douces connues de l'homme du métier. - Le fait que l' espaceur soit aisément clivable, et que cette coupure ne modifie pas la structure du sucre, permet de réaliser des contrôles analytiques structuraux et conformationnels de la chaîne oligosaccharidique isolée. Il est en outre aisé de calculer la quantité de sondes sucrées accrochées (« loading ») sur le support solide pendant la synthèse sucrée. Un des intérêts de cet espaceur, en comparaison avec celui décrit dans le document [1] (1 ' octenediol par exemple) réside dans 1 ' adaptabilité de sa longueur, de sa fonctionnalité, de sa réactivité et de l'encombrement stérique qui peuvent être générés à volonté. Les inventeurs notent également que l' espaceur de la présente invention permet la liaison avec une très grande gamme de saccharides, d' oligosaccharides ou polysaccharides qui sont très souvent présynthétisés et protégés en position anomérique de leur partie réductrice par un groupement allylé. En une étape, ces unités sucrées peuvent en effet être transformées pour se lier directement sur l' espaceur. Ainsi, cet espaceur est avantageusement compatible avec de nombreuses molécules sucrées déjà synthétisées et décrites dans la littérature, par exemple dans les documents [7] , [12] et [13] . La présente invention peut par exemple être utilisée pour la fabrication d'une puce à sucres, par exemple d'une puce susceptible d'identifier par criblage des séquences oligosaccharidiques reconnaissant une protéine particulière, par exemple suivant la technique décrite dans le document [1] . Dans cette application, la présente invention permet d' optimiser les procédés de criblage et donc de disposer plus efficacement et plus rapidement de molécules à visée thérapeutique ou biotechnologique. On peut s'attendre à ce que cette capacité existe également dans les autres applications de la présente invention. La présente invention peut également être utilisée sur les biopuces où un bras espaceur doit faire le lien entre le support solide et des sondes d' oligopeptides, d' oligonucléotides et/ou d'oligosaccharides . En particulier, le bras espaceur de la présente invention peut être utilisé sur une puce à oligopeptides telle que celle décrite dans le document [3] , sur une puce à oligosaccharides telle que celle décrite dans le document [4] . D'autres caractéristiques et avantages apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples qui suivent donnés à titre illustratif .
Exemples
1) A titre d'exemple, la synthèse d'un espaceur de longueur correspondant à une chaîne de quatorze carbones est exposée ci-dessous, en utilisant des protocoles opératoires choisis parmi ceux accessibles à l'homme du métier. Les références en caractères gras renvoient au schéma réactionnel ci-dessous. Les composés choisis sont : un monosaccharide (1) du type glucose (1) (N-acéthylglucosamine (GlcNac) : sucre allylé en position 1) constituant l'unité moléculaire [mo] ; le 4-pentènenitrile (3) portant la fonction nitrile à réduire ; et le 7- octényltriméthoxysilane (8) pour la fonctionnalisation du support. Le support solide est constitué par des billes (6) Controlled Pore Glass (CPG) (marque de commerce) à base de silice. Le schéma réactionnel ci-dessous résume 1' ensemble des réactions chimiques entreprises dans ces exemples pour la fixation d'un oligosaccharide (1) sur un support (6) au moyen d'un bras espaceur conforme à la présente invention. Ces réactions chimiques sont indiquées par les lettres A à F. Un exemple d'une réaction de clivage du bras espaceur est présenté dans l'exemple G ci-dessous. Sur ce schéma réactionnel, les groupements
« R » indiqués sur le sucre n'ont pas été différenciés volontairement pour simplifier la représentation. Ces
« R » représentent des substituants, identiques ou différents entre eux aux différentes positions sur le cycle formant le sucre, et pouvant les substituants rencontrés généralement sur les sucres. Dans l'exemple particulier présenté ici, le sucre utilisé étant le N- acéthylglucosamine, l'homme du métier n'a aucune difficulté pour identifier les substituants « R » aux différentes positions des composés (1) , (2) , (5) et (10) .
Exemple A : Activation de l' oligosaccharide (réaction A) Une réaction d'ozonolyse est utilisée dans cet exemple. Le procédé utilisé est décrit dans le document [5] Le sucre allylé en position anomérique (1) (0,93 mmol) est dissous dans 5 ml d'un mélange de dichlorométhane et de méthanol (1/1) : le milieu est plongé dans un bain froid à une température de -78 °C (acétone + carboglace) . L'ozone O3 doit alors barboter dans la solution : dès l'apparition de la couleur bleue (caractéristique d'un excès d'ozone), l'ozone est remplacée par l'argon (ou l'azote). La réaction étant terminée, le milieu est rendu réducteur par ajout de di éthylsulfure Me2S (4, 65 mmol, 5 éq) : il se forme alors du diméhtylsulfoxyde DMSO. Le milieu remonte lentement à température ambiante pendant une nuit, puis est évaporé sous vide : le résidu organique est repris au diéthyléter Et20, et lavé à l'eau. Les phases organiques sont évaporées sous vide, puis co-évaporées au toluène. Le produit brut est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : éther de pétrole/acétate d'éthyle : 8/2). Ainsi, l'aldéhyde (2) est obtenu avec un rendement de 75%.
Exemple B : Réduction d'un nitrile (réaction B) Le procédé chimique utilisé est décrit dans le document [6] . L'hydrure de lithium aluminium LiAlH4 (381 mg, 10,03 mmol, 1 éq) est introduit dans le diethylether fraîchement distillé (20 ml) . Le 4-pentènenitrile (3) (814 mg, 1 ml,
10,03 mmol) est ajouté lentement au milieu réactionnel agité sous atmosphère d'azote, à une température de 0°C
(bain de glace). L'agitation doit continuer environ 20 minutes à température ambiante. Ensuite de l'eau (0,4 ml), puis une solution de soude à 20% dans l'eau (0,3 ml), et enfin une autre quantité d'eau (1,4 ml) sont additionnées : ces ajouts doivent être réalisés avec beaucoup de précaution car la neutralisation peut être violente. Lorsque la solution de diethylether est décantée du résidu blanc inorganique, le surnageant est extrait. Le solide (résidu) blanc est lavé à deux reprises au diethylether, et les phases organiques sont réunies. Une solution d'acide chlorhydrique HC1 3 M est ajoutée à cette phase organique pour obtenir un pH acide (pH<7) : le 4-pentènenitrile n'ayant pas réagi reste dans la phase éthérée, alors que l'aminé passe en phase aqueuse. Après extraction, la phase aqueuse est donc conservée et se voit ajouter une solution de soude NaOH 3 M pour passer à un pH basique (pH>7) : le produit aminé va alors passer dans la phase éthérée pendant cette nouvelle extraction. La phase éthérée ainsi extraite est séchée sur sulfate de magnésium (MgS04) , puis évaporée sous vide (évaporateur rotatif) . L'aminé brute (4) est alors purifiée par distillation fractionnée (four à boules, T≈96°C±9°C) . Analyse XE RMN (Brùcker AM 250) : 5,82 (ddt, 3Jtrans=18 Hz, 3Jcis=13 Hz,
3J(HI)=6,5 Hz, 1H, CH=) , 5,00 (m, 2H, CH2=) , 2,70 (t,
3Jn)=6,5 Hz, 2H, CHin) , 2,10 (ttd, 3J(Hn)=6,5 Hz,
3J(HC)=6,5 Hz, 3J(H2C-)=1,5 Hz, 2H, CHi) , 1,70 (s, 2H, NH2) , 1,56 (quint., 3J (Hπ) =3J (Hm) =6, 5 Hz, 2H, CHIT.) .
Analyse 13C RMN (Brùcker AM 250) : 138,6 (CH=) , 114,6 (CH2=) , 42,0 (CH2-N) , 33,1 (CH2, 31,4 (CH2) .
Exemple C : Amination réductrice (réaction C) Le procédé chimique utilisé est décrit dans le document [7] . L'aldéhyde (2) (20,87 mmol) est mis en solution dans le diméthylformamide (1,2 ml) fraîchement distillé sur hydrure de calcium (CaH2) : le milieu est mis sous agitation et l'aminé (4) (31,30 mmol, 2 éq) est additionnée. Après une vingtaine de minutes, le cyanoborohydrure de sodium NaBH3CN (83,47 mmol, 4 éq) est ajouté au mélange, qui est laissé sous agitation à température ambiante pendant une nuit . Si la réaction n'est pas terminée, il est possible de rajouter du NaBH3CN (1 éq) . Ensuite, lorsque la réaction est terminée, la pyridine (2,4 ml) et l'anhydride acétique Ac20 (83,47 mmol, 2 éq/aminé) sont ajoutés au mélange. Lorsque la réaction est terminée (environ 1 heure après l'addition), le composé brut est extrait au diethylether et à l'eau. Les phases organiques réunies sont séchées sur sulfate de magnésium (MgS04) , puis filtrées, évaporées sous vide puis co-évaporées au toluène. Le composé (5) est alors purifié par chromatographie sur gel de silice (gradient d'éluant cyclohexane/acétate d'éthyle de 7/3 à 5/5).
Exemple D : Fonctionnalisation du support solide (réactions D et E) Le procédé chimique utilisé est décrit dans le document [7] . Les billes Controlled Pore Glass (6) (CPG,
500 A , 2 g) sont agitées de manière très douce pendant
2 heures à température ambiante dans une solution de soude NaOH (700 mg) dans l'eau désionisée EDI (6 ml) et l'éthanol EtOH à 99% (8 ml). Puis les billes sont centrifugées, le surnageant est extrait, les billes sont lavées abondamment à l'EDI pour atteindre un pH neutre. Les billes sont ensuite séchées sous vide (évaporateur rotatif) , et restent 1 heure à température ambiante dans une solution d'acide chlorhydrique (HC1 0,2 N) avant d'être lavées à l'eau, centrifugées, séchées puis mises à l'étuve pendant 15 minutes à 80 °C. Elles sont alors lavées à l'ethanol, puis au toluène (centrifugeuse) . Elles sont ensuite séchées avant de participer à l'étape suivante de silanisation dont le mélange réactionnel aura été préparé juste avant l'emploi. Les billes CPG (7) sont introduites dans un mélange de toluène (45 ml) , triéthylamine Et3N (1,35 ml) et de 7-octényltriméthoxysilane (8) (CnH24θ3Si, M 232,39, 100 μl) : le milieu réactionnel est mis à 80 °C pendant 16 heures (étuve) . Les billes sont extraites du mélange par centrifugation, et sont rincées à l'ethanol à plusieurs reprises puis séchées (évaporateur rotatif) . Elles sont alors soumises à une température de 110 °C pendant 3 heures pour réaliser l'étape de réticulation (étuve). Les étapes de silanisation et de réticulation étant ainsi réalisées, il est nécessaire de neutraliser l'acidité et l 'hydrophilie résiduelles des silanols de surface n'ayant pas réagi au cours de l'étape de silanisation (« end-capping ») . Une solution de chlorure de triméthylsilyle IMSC1 (109 mg, 130 μl) et de triéthylamine Et3N (506 mg, 700 μl) dans le dichloromethane DCM (10 ml) est ajoutée aux billes CPG silanisées, et le mélange est laissé sous agitation douce pendant 2 heures à 25°C. Les billes sont alors rincées abondamment au dichloromethane (centrifugeuse), puis à 1 ' acétonitrile (centrifugeuse) . Elles sont ensuite séchées sous vide
(évaporateur rotatif), et mises à l'étuve (80°C) pour parfaire le séchage. Les billes silanisées (9) sont ainsi obtenues.
Exemple F : Réaction de métathèse (réaction F) Le procédé chimique utilisé est décrit dans le document [9] . Les billes CPG silanisées (9) (2 g, 30 μmol/g) sont mises sous agitation dans le dichloromethane (20 ml), sous atmosphère d'azote. Le système sucre- espaceur (5) (300 μmol, >5 éq) est alors additionné, au milieu, avec un catalyseur de Grubbs (6 μmol, 5 mg,
0,1 éq) . Le milieu réactionnel est alors porté à reflux, soit une température de 44 °C. Après 6 heures, une autre portion de catalyseur de Grubbs (6 μmol, 5 mg, 0,1 éq) est ajoutée. Le mélange est maintenu à 44°C pendant encore 6 heures, puis est ramené à température ambiante. Les billes sont filtrées, et lavées abondamment au dichloromethane et à l'ethanol (centrifugeuse). Les billes sont ensuite évaporées sous vide pour être séchées . Les billes sucrées (10) sont ainsi obtenues. Schéma réactionnel des exemples A à F
Exemple G : Clivage de la sonde (réaction G) Le procédé chimique utilisé est décrit dans le document [10] . Lorsque le système (10) (support solide- espaceur de la présente invention-chaîne oligosaccharidique) a été obtenu, il est possible de cliver l' espaceur, sans dénaturer la chaîne sucrée. Le protocole expérimental est décrit dans le document [5]. L'équation chimique est la suivante :
Les billes CPG sucrées (10) sont mises sous agitation lente dans un mélange dichlorométhane/méthanol 1/1. Le milieu est amené à une température de -78°C (acétone+azote liquide) . Ensuite, on fait buller l'ozone O3 dans le milieu réactionnel jusqu'à ce qu'une couleur bleue apparaisse. Ensuite, de l'argon bulle quelques minutes dans le mélange, avant de neutraliser le milieu avec du diméthylsulfure puis le milieu réactionnel est laissé pour remonter vers la température ambiante pendant une nuit . Les billes sont reprises au diethylether, filtrées, rincées à plusieurs reprises au diethylether et à l'eau. Les billes (12) sont alors mises de côté, et le surnageant est extrait (diéthyléther/eau) , la phase organique est séchée sur sulfate de magnésium MgS04, évaporée sous vide et co-évaporée au toluène. Le produit (11) est alors obtenu.
2) D'autres molécules selon l'invention ont été fabriquées en utilisant les protocoles opératoires exposés ci-dessus (exemples A à F) . Ces molécules sont détaillées dans les exemples suivants.
Exemple H : Dans cet exemple, [mo] est un peptide RGD (Arg-
Gly-Asp) accroché au bras espaceur de l'invention par son extrémité C-terminale. Le support est le même que dans le protocole opératoire exposé ci-dessus. Ainsi, dans cet exemple, la molécule (1) du schéma réactionnel des exemples A à F est remplacée par RGD. Des billes sur lesquelles le peptide RGD est accroché sont ainsi obtenues . Elles sont de formule :
[mo] : peptide RGD accroché par C-terminal (Arg-Gly-Asp)
Exemple I : Cet exemple utilise la même [mo] que dans l'exemple H, mais accroché au bras espaceur de l'invention par son extrémité N-terminale. De plus,
dans du bras espaceur de l' invention, X1 est C et n = 20 . Par C, on entend bien entendu un carbone hydrogéné . Les billes obtenues sont de formule :
[mo] est un peptide RDG accroché par l'extrémité N-terminale Exemple J : Dans cet exemple, [mo] est un « sialyl- le is a ». Le support est le même que dans le protocole opératoire exposé ci-dessus. Le groupement protecteur est Boc. Sa chimie de fixation est connue de l'homme du métier. Des billes sur lesquelles le sialyl-lewis a est accroché sont ainsi obtenues. Elles sont de formule :
[mo] est un sialyl-lewis a , avec"1" = H ou CH3
Exemple K :
Dans cet exemple, [mo] est un composé sulfaté. Le support est le même que dans le protocole opératoire exposé ci-dessus. Des billes sur lesquelles le composé sulfaté est accroché sont ainsi obtenues. Elles sont de formule :
[mo] est un composé sulfaté, Z étant un groupe protecteur (par exemple Gp défini dans la partie "exposé de l'invention)
Dans un autre protocole, le carbone X4 a été remplacé par un atome de soufre. Les billes correspondantes ont été obtenues .
Exemple L : Dans cet exemple, [mo] est un sucre protégé. Le support est le même que dans le protocole opératoire exposé ci-dessus. Des billes sur lesquelles le sucre protégé est accroché sont ainsi obtenues. Elles sont de formule :
sucre protégé
Exemple M : Dans cet exemple, [mo] est un acide sialique.
Le support est le même que dans le protocole opératoire exposé ci-dessus. Des billes sur lesquelles l'acide sialique est accroché sont ainsi obtenues. Elles sont de formule :
Acx sialique
Références bibliographiques
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Claims

REVENDICATIONS
1. Bras espaceur moléculaire de formule (I) suivante
- dans laquelle X° et X4 sont des substituants modulables de façon à permettre une liaison de [mo] et
[Sup] via ledit bras espaceur, X° et X4 étant différents de H et chacun choisis indépendamment des autres substituants du bras espaceur parmi C, O, N, S, Se, P, As, Si ; et - dans laquelle les substituants X1 ; X2 ; X3 ; Z1 ; Z2 ; R1 ; R2 ; et R3 sont tels que :
• X1 ; X2 ; et X3 sont chacun choisis indépendamment des autres substituants parmi C, O, N, S, Se, P, As, Si et parmi un aryle et un hétéroaryle comprenant chacun de 2 à 20 atomes de carbone ;
• Z1 et Z2 sont chacun choisis indépendamment des autres substituants parmi C-R, Si-R, C, N, P et As, où R est un alkyle comprenant de 1 à 40 atomes de carbone ;
• R1 ; R2 ; et R3 sont chacun choisis indépendamment des autres substituants parmi H, un alkyle, un aryle et un hétéroaryle comprenant chacun de 2 à 20 atomes de carbone ;
• [Gp] représente un groupement protecteur de l'aminé secondaire -N- ou une molécule participant à la fonctionnalité du bras espaceur ;
- dans laquelle n, m et p sont des nombres entiers, chacun supérieur ou égal à 1 et choisi indépendamment l'un de l'autre, de préférence de façon à ce que 1 ≤ n, m et p ≤ 40 ; - dans laquelle [Sup] représente H ou un support solide silanisé sur lequel ledit bras espaceur peut être fixé de manière covalente ; et
- dans laquelle [mo] représente H ou une unité moléculaire destinée à être fixée de manière covalente par l'intermédiaire dudit bras espaceur sur ledit support solide silanisé.
2. Bras espaceur selon la revendication 1, dans lequel • X° et X4 sont choisis indépendamment des autres substituants parmi C, O, N, S, Si ; et/ou
• X1 ; X2 ; et X3 sont choisis indépendamment des autres substituants parmi C, O, N, S, Si et parmi un aryle et un hétéroaryle comprenant chacun de 2 à 10 atomes de carbone ; et/ou Z1 et Z2 sont choisis indépendamment des autres substituants parmi C, N, C-R, Si-R, où R est un alkyle comprenant de 1 à 30 atomes de carbone ; et/ou • R1 ; R2 ; et R3 sont choisis indépendamment des autres substituants parmi H, un alkyle, un aryle et un hétéroaryle comprenant chacun de 2 à 10 atomes de carbone.
3 Bras espaceur selon la revendication 1, dans lequel le groupement protecteur [Gp] est. choisi parmi Ac, Benzyle, un groupement aryle en Ci à C40r Troc, z, TCA, BOC, F oc.
4. Bras espaceur selon la revendication 1, dans lequel le support solide [Sup], lorsqu'il est présent, est choisi parmi une plaque, une bille ou un capillaire.
5. Bras espaceur selon la revendication 1 ou 4, dans lequel [Sup] est à base de silice ou de verre.
6. Bras espaceur selon la revendication 1, dans lequel [mo] , lorsqu'il est présent, est une molécule ayant un poids moléculaire allant de 180 à 400000 g.mol-1.
7. Bras espaceur selon la revendication 1, dans lequel [mo] , lorsqu'il est présent, est choisi parmi les monosaccharides, les oligosaccharides, les poly-oligosaccharides, les glyco-conjugués, les peptides, les protéines, les enzymes, les glycoprotéines, les lipides, les acides gras, les glycolipides, les glycolipoprotéines .
8. Bras espaceur selon la revendication 1, dans lequel [mo] , lorsqu'il est présent, est un sucre.
9. Utilisation d'un bras espaceur selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour fixer sur un support solide silanisé [Sup] une unité moléculaire [mo] .
10. Utilisation selon la revendication 9, dans laquelle [mo] est une molécule ayant un poids moléculaire allant de 180 à 400000 g.mol-1.
11. Utilisation selon la revendication 9, dans laquelle [mo] est choisi parmi les monosaccharides, les oligosaccharides, les poly-oligosaccharides, les glyco- conjugués, les petites molécules naturelles ou synthétiques ; et [Sup] représente un support solide silanisé auquel le bras espaceur est susceptible d'être fixé.
12. Utilisation selon la revendication 9, dans laquelle [Sup] est choisi parmi une plaque, des billes ou un capillaire.
13. Utilisation selon la revendication 12, dans laquelle [Sup] est à base de silice ou de verre.
14. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 9 à 13 pour la fabrication d'une biopuce.
15. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 9 à 13 pour la fabrication d'une puce à sucre.
16. Procédé de fixation covalente d'une unité moléculaire [mo] sur un support par l'intermédiaire d'un bras espaceur, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : (i) réduction de la fonction nitrile d'un composé de formule :
(ii) formation d'une fonction aldéhyde à partir d'une fonction allylé d'une molécule biologique de formule :
(iii) amination réductrice entre ladite fonction nitrile réduite suivie d'une protection de l'aminé secondaire formée et ladite fonction aldéhyde pour obtenir une molécule biologique activée pour sa fixation sur le support, ladite molécule biologique activée étant de formule :
(iv) silanisation d' un support solide, et fonctionnalisation du support solide silanisé avec une molécule de formule :
(v) réaction de métathèse entre la molécule fonctionnalisant le support et la molécule biologique activée pour former un bras espaceur selon l'invention reliant la molécule biologique et le support ; procédé dans lequel les substituants X° ; X1 ; X2 ; X3 ; X4 ; Z1 ; Z2 ; R1 ; R2 ; R3 ; et [mo] sont tels que définis dans la revendication 1.
17. Procédé selon la revendication 16, dans lequel le composé de formule
est un sucre allylé, [mo] étant ledit sucre.
18. Procédé selon la revendication 16, dans lequel [Sup] est choisi parmi une plaque, une bille ou un capillaire.
19. Procédé selon la revendication 16 ou 18, dans lequel [Sup] est à base de silice ou de verre.
20. Procédé selon la revendication 16, dans lequel [mo] est une molécule ayant un poids moléculaire allant de 180 à 400000 g. ol-1.
21. Procédé selon la revendication 16, dans lequel [mo] est choisi parmi les monosaccharides, les oligosaccharides, les poly-oligosaccharides, les glyco- conjugués, les peptides, les protéines, les enzymes, les glycoprotéines, les lipides, les acides gras, les glycolipides, les glycolipoprotéines .
22. Procédé selon la revendication 16, dans lequel [mo] est un sucre.
23. Procédé selon la revendication 16, comprenant en outre une étape de fixation d' un groupement protecteur [Gp] sur la fonction aminé secondaire.
24. Procédé selon la revendication 23, dans lequel [Gp] est choisi parmi Ac, benzyle, un groupement aryle en Ci à 4o, Troc, z, TCA, BOC, Fmoc.
25. Utilisation d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 24 pour la fabrication d'une biopuce.
26. Utilisation d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 24 pour la fabrication d'une puce à sucre.
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