EP1678546A1 - Laser-scanning-mikroskop mit einem non-descannten detektions- und/oder beobachtungsstrahlengang - Google Patents

Laser-scanning-mikroskop mit einem non-descannten detektions- und/oder beobachtungsstrahlengang

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Publication number
EP1678546A1
EP1678546A1 EP04790657A EP04790657A EP1678546A1 EP 1678546 A1 EP1678546 A1 EP 1678546A1 EP 04790657 A EP04790657 A EP 04790657A EP 04790657 A EP04790657 A EP 04790657A EP 1678546 A1 EP1678546 A1 EP 1678546A1
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EP
European Patent Office
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laser scanning
scanning microscope
detection
beam path
microscope according
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Ceased
Application number
EP04790657A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ralph Lange
Ralf Wolleschensky
Michael Goelles
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jenoptik AG
Carl Zeiss Jena GmbH
Original Assignee
VEB Carl Zeiss Jena GmbH
Carl Zeiss Jena GmbH
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Publication date
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Publication of EP1678546A1 publication Critical patent/EP1678546A1/de
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes

Definitions

  • the non-descanned detection method is often used to observe the fluorescence radiation. It is particularly important when samples with a high scatter are to be examined or large penetration depths are to be achieved and only closely adjacent mirrors with limited light conductance values are available for detection in the LSM scan head.
  • the excitation to be modulated is then detected, not descanned, externally in the vicinity of a pupil.
  • the excitation in the UV / VIS range is usually generated by a two-photon process with pulsed IR radiation [US 5034613].
  • the entire emitted fluorescence radiation is then assigned to the excitation in the confocal volume of the focus and can be detected in the incident or transmitted light channel after possibly multiple scattering in the sample. This requires a high light guide value in the detection channel.
  • a basic requirement of optimized structures is therefore the effective and near-sample detection of fluorescence radiation in order to maximize the effective field of view as a virtual source of scattered radiation.
  • accessibility in these rooms is often limited by the interfaces of the microscope stand itself and by the aids used, such as pipettes and electrodes.
  • An essential boundary condition is the detector itself, which has not only spectral, but also location and angle-dependent sensitivities.
  • the remaining microscope optics to be used are designed for the regular beam path and have limited free diameters.
  • excitation and emission should be separated in the incident light beam path.
  • Push &Click splitters are used as standard in the reflector level of the reflected light channel reflection in order to maintain the greatest possible flexibility.
  • the limitations of the following regularly designed optics have so far largely been accepted.
  • the location and size of such an interface determine essential boundary conditions for the scattered light transmission.
  • the aim of the claimed arrangement is to modify the beam path in relation to the regular beam path immediately after the separation of excitation and detection in such a way that the largest possible (bleed-free) field of view can be imaged on the detector, taking into account the following optics.
  • This is solved by the features of claim 1.
  • Preferred developments are the subject of the dependent claims.
  • An advantageous embodiment consists in the positioning of an additional optical system, preferably a converging lens in the reflector bracket of the reflected-light channel reflection. Their dimensioning is determined by the compromise between maximum main beam kinking and not too large resulting bundle diameters on the detector.
  • the optimization can be carried out so that the NDD module can be used on a TV port.
  • Figure 1 illustrates the effect of the arrangement using the beam path.
  • Part of the beam path of a laser scanning microscope see, for example, DE 197 02 753 A1
  • a scanning objective SO for transmitting the illuminating light beam
  • an illuminating tube lens 5 and a beam splitter 1 (main color splitter for separating Excitation and detection light) in the direction of the objective (here is only the objective pupil)
  • a non-descanned detection beam path extends over 1 and a mirror 2 as well as a detection tube lens 4 in the direction of the detection, wherein a further beam splitter ST 3 can be provided to mask out an observation beam path.
  • the regularly used diameter on the reflector (2) is reduced, thus allowing greater permeability to scattered light. It can be seen in particular that the regularly used diameters in front of the illumination tube lens (4) are significantly larger than those in front of the detection tube lens (5), which are each at the same distance from the
  • the aperture in the edge area can be increased by about 15%, which is good
  • the insertion of the converging lens directly on the reflector is advantageously implemented directly on the reflector housing, for example with an insertion point, and also existing ones
  • Insertion points for filters can be used.
  • the lens can advantageously also be exchangeable or can be pushed in and pushed out.
  • a second lens on the mirror 2 or integrated in the mirror housing can also be provided, individually or in combination with the lens on the beam splitter.
  • a deflecting mirror can also be formed in a deflecting element as a convex or concave mirror.

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Abstract

Laser-Scanning-Mikroskop mit einem non-descannten Detektions- und/ oder Beobachtungsstrahlengang, wobei ein Strahlteiler zur Trennung von Beleuchtungs- und Detektionstrahlengang vorgesehen ist und in Richtung der Detektion mindestens eine Optik zur regulären Übertragung des detektierten Lichtes vorgesehen ist, wobei zwischen dem Strahlteiler und der Optik eine Zusatzoptik zur Verringerung des Durchmessers des abbildenden Strahlenbündels vorgesehen ist.

Description

Laser-Scannin -Mikroskop mit einem non- escannten Detektions- und / oder Beobachtunqsstrahlenganq
In der Laser-Scanning-Mikroskopie wird zur Beobachtung der Fluoreszenzstrahlung häufig das nicht-descannte Detektionsverfahren (NDD) benutzt. Es ist insbesondere dann von Bedeutung, wenn stark streuende Proben untersucht oder große Eindringtiefen erreicht werden sollen und zur Detektion im LSM-Scan-Kopf nur eng benachbarte Spiegel mit begrenztem Lichtleitwert zur Verfügung stehen. Die Detektion der zu modulierenden Anregung erfolgt dann nicht-descannt extern in der Nähe einer Pupille. Meist wird die Anregung im UV / VIS-Bereich über einen Zwei-Photonen-Prozeß mit gepulster IR-Strahlung generiert [US 5034613]. Die gesamte emittierte Fluoreszenzstrahlung wird dann der Anregung im konfokalen Volumen des Fokus zugeordnet und kann nach eventuell mehrmaliger Streuung in der Probe im Auflicht- oder Durchlichtkanal detektiert werden. Dazu wird ein hoher Lichtleitwert im Detektionskanal benötigt.
Ein Grundanspruch optimierter Aufbauten besteht daher in der effektiven und probennahen Detektion der Fluoreszenzstrahlung, um das effektive Gesichtsfeld als virtuelle Quelle gestreuter Strahlung zu maximieren. Die Zugänglichkeit in diesen Räumen ist jedoch häufig durch die Schnittstellen des Mikroskopstatives selbst sowie durch die verwendeten Hilfsmittel, wie Pipetten und Elektroden, begrenzt. Eine wesentliche Randbedingung bildet der Detektor selbst, der nicht nur spektrale, sondern auch orts- und winkelabhängige Empfindlichkeiten aufweist.
Ferner muß davon ausgegangen werden, daß die zu benutzende übrige Mikroskopoptik für den regulären Strahlengang ausgelegt ist, und über begrenzte freie Durchmesser verfügt. Um dennoch Streulichtbeschnitt an Berandungen der nachfolgenden Optiken, wie Tubuslinse oder Beleuchtungsoptik im Auflichtkanal, zu vermeiden, sollten im Auflichtstrahlengang Anregung und Emission objektivnah getrennt werden. In der Regel werden dafür standardmäßig „Push-&-Click"-Teiler in der Reflektorebene der Auflichtkanaleinspiegelung eingesetzt, um größtmögliche Flexibilität zu wahren. Die Begrenzungen der nachfolgenden regulär ausgelegten Optik werden bisher weitgehend hingenommen. Insbesondere ist es vorteilhaft, definierte Schnittstellen, wie den TV-Port, zur Ankopplung für das Detektionsmodul zu nutzen. Mit Lage und Größe einer solchen Schnittstelle werden jedoch wesentliche Randbedingungen für die Streulichttransmission festgelegt.
Das Ziel der beanspruchten Anordnung besteht darin, unmittelbar nach der Trennung von Anregung und Detektion den Strahlengang derart gegenüber dem regulären Strahlengang zu modifizieren, daß ein größtmögliches (beschnittfreies) Sehfeld unter Berücksichtigung der nachfolgenden Optik auf den Detektor abgebildet werden kann. Dies wird durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst. Bevorzugte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche. Eine vorteilhafte Ausführung besteht in der Positionierung eines optischen Zusatzsystems, vorzugsweise einer Sammellinse im Reflektorböckchen der Auflichtkanaleinspiegelung. Ihre Dimensionierung wird durch den Kompromiß zwischen maximaler Hauptstrahlabknickung und nicht zu großen resultierenden Bündeldurchmessern auf dem Detektor bestimmt. Insbesondere kann die Optimierung so erfolgen, daß das NDD-Modul an einem TV-Port genutzt werden kann.
Abbildung 1 verdeutlicht anhand des Strahlengangs die Wirkung der Anordnung. Dargestellt ist ein Teil des Strahlenganges eines Laser- Scanning Mikroskopes (siehe z. B. DE 197 02 753 A1 ) dargestellt, von einer Scannerpupille SP über ein Scanobjektiv SO zur Übertragung des Beleuchtungslichtstrahls, eine Beleuchtungstubuslinse 5 und einen Strahlteiler 1 (Hauptfarbteiler zur Trennung von Anregungs-und Detektionslicht) in Richtung des Objektives (hier ist nur die Objektivpupille
3 dargestellt).
Ein non descannter Detektionsstrahlengang erstreckt sich über 1 und einen Spiegel 2 sowie eine Detektionstubuslinse 4 in Richtung der Detektion, wobei ein weiterer Strahlteiler ST 3 zur Ausblendung eines Beobachtungsstrahlenganges vorgesehen sein kann. Durch Einbringen einer Sammellinse (6) unmittelbar nach der Einspiegelung an
Reflektor (1 ) wird der regulär genutzte Durchmesser am Reflektor (2) verringert und damit eine größere Durchlässigkeit für Streulicht ermöglicht. Man erkennt insbesondere, daß die regulär genutzten Durchmesser vor der Beleuchtungstubuslinse (4) deutlich größer sind als die vor der Detektionstubuslinse (5), welche sich jeweils in gleichem Abstand zum
Objektiv befinden und damit den Gewinn direkt veranschaulichen. Im ausgeführten
Beispiel läßt sich die Apertur im Randbereich um etwa 15% erhöhen, was einem
Helligkeitsgewinn von etwa 30% entspricht.
Realisiert wird das Einbringen der Sammellinse unmittelbar am Reflektor vorteilhaft direkt am Reflektorgehäuse, beispielsweise mit einer Einschubstelle, wobei auch vorhandene
Einschubstellen für Filter genutzt werden können. Die Linse kann vorteilhaft auch auswechselbar bzw. ein- und ausschiebbar sein.
Sie kann auch in Detektionsrichtung vor dem Reflektor 2 an seinem Reflektorgehäuse angeordnet sein. Eine zweite Linse am Spiegel 2 oder in das Spiegelgehäuse integriert kann ebenfalls vorgesehen sein, einzeln oder in Kombination mit der Linse am Strahlteiler. Es kann auch ein Umlenkspiegel in einem Umlenkelement als konvexer oder konkaver Spiegel ausgebildet sein.

Claims

Patentansprüche
1.
Laser-Scanning-Mikroskop mit einem non-descannten Detektions und / oder Beobachtungsstrahlengang, wobei ein Strahlteiler zur Trennung von Beleuchtungs- und
Detektionstrahlengang vorgesehen ist und in Richtung der Detektion mindestens eine
Optik zur regulären Übertragung des detektierten Lichtes vorgesehen ist, wobei zwischen dem Strahlteiler und der Optik eine Zusatzoptik zur Verringerung des
Durchmessers des abbildenden Strahlenbündels vorgesehen ist.
2.
Laser-Scanning-Mikroskop nach Anspruch 1 , wobei die
Zusatzoptik eine Sammellinse ist.
3.
Laser-Scanning-Mikroskop nach Anspruch 1 , wobei die Zusatzoptik als diffraktiv optisches Element (DOE) ausgebildet ist.
4.
Laser-Scanning-Mikroskop nach Anspruch 1 , 2 oder 3, wobei die
Zusatzoptik unmittelbar am Strahlteilergehäuse in Richtung der Detektion angebracht ist.
5.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1-4, wobei
Zusatzoptik ins Strahlteilergehäuse integriert ist.
6.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1-5, wobei die Zusatzoptik auswechselbar oder einschiebbar ist.
7.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1-6, wobei eine zweite Linse an einem weiteren Umlenkelement oder in dieses integriert vorgesehen ist, einzeln oder in Kombination mit dem Zusatzelement am Strahlteiler.
8.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1-7, mit einer Ausführung eines Umlenkspiegels in einem Umlenkelement als konvexer oder konkaver Spiegel.
EP04790657A 2003-10-30 2004-10-20 Laser-scanning-mikroskop mit einem non-descannten detektions- und/oder beobachtungsstrahlengang Ceased EP1678546A1 (de)

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DE10351414A DE10351414A1 (de) 2003-10-30 2003-10-30 Laser-Scanning-Mikroskop mit einem non-descannten Detektions- und/oder Beobachtungsstrahlengang
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EP (1) EP1678546A1 (de)
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DE (1) DE10351414A1 (de)
WO (1) WO2005043212A1 (de)

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