EP1646726A1 - Auf replikation von gebundenen nukleinsäuren basierendes verfahren zum nachweis von biomolekülen - Google Patents

Auf replikation von gebundenen nukleinsäuren basierendes verfahren zum nachweis von biomolekülen

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Publication number
EP1646726A1
EP1646726A1 EP04740747A EP04740747A EP1646726A1 EP 1646726 A1 EP1646726 A1 EP 1646726A1 EP 04740747 A EP04740747 A EP 04740747A EP 04740747 A EP04740747 A EP 04740747A EP 1646726 A1 EP1646726 A1 EP 1646726A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
detection
biomolecules
substance
dna polymerase
nucleic acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04740747A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Sven Bülow
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eppendorf SE
Original Assignee
Eppendorf SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eppendorf SE filed Critical Eppendorf SE
Publication of EP1646726A1 publication Critical patent/EP1646726A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/10—Oligonucleotides as tagging agents for labelling antibodies

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of biomolecules.
  • the ELISA method Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
  • BEST ⁇ UGUNGSKOPIE the matrix is incubated with an antibody specific for the biomolecule sought, and the unbound antibodies are removed in a washing step.
  • the bound antibodies are labeled with a nucleic acid molecule that is amplified using the polymerase chain reaction (PCR) and whose amplification products first go into solution and are then detected by agarose gel electrophoresis.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the process benefits from the extraordinarily high specificity of the PCR and the good quantitative reproducibility.
  • the detection limit for biomolecules to be detected is therefore, under suitable conditions, between three and five orders of magnitude below that of the ELISA method.
  • the method however, there is no specificity between the protein to be detected and the amplified nucleic acid marker.
  • the method is therefore only suitable for the highly sensitive detection of a single type of biomolecule to be detected.
  • US Pat. No. 6,531,283 discloses a similar method in which the bound antibodies are labeled with a nucleic acid molecule which is multiplied using the polymerase chain reaction (RCA).
  • the amplification products are attached to the nucleic acid molecules in the sense of chain extension, so that a concatenate is formed which has multiple repetitions of the original marker sequence and can be detected in situ using suitable methods, for example by hybridizing fluorescence-labeled nucleic acid segments which are complementary to the repetitive sequence .
  • the disadvantage here is that only a limited selection of replication enzymes can be used, such as the DNA polymerase of the bacteriophage T7. For this reason, one is limited to the properties of the polymerases that can be used. This limitation is a major disadvantage, particularly when choosing the incubation temperature.
  • the method makes use of a circular primer (amplification target cycle), which must have sequence homologies with the nucleic acid molecules bound to the antibodies
  • the object of the present invention is to provide a method with which biomolecules can be detected in a sample with very high sensitivity and specificity while circumventing the disadvantages described above. Another object is to provide a method for producing a marker which can be used in such a method for the detection of biomolecules, and to produce such a marker itself.
  • biomolecules to be detected with a first substance which is part of a nucleic acid replicating apparatus, to bind the formed biomolecule-substance complexes to binding molecules specific to the respective biomolecules, solid phase-bound binding molecules, possibly the unbound biomolecule substance
  • a first substance which is part of a nucleic acid replicating apparatus
  • to bind the formed biomolecule-substance complexes to binding molecules specific to the respective biomolecules, solid phase-bound binding molecules, possibly the unbound biomolecule substance To remove complexes by washing, to bind the bound biomolecule-substance complexes with high-molecular nucleic acid molecules and mononucleotides of different species, of which at least the mononucleotides of one species are provided with a detectable label, and to incubate a second substance which binds to the biomolecules.
  • the method according to the invention can be used to provide each biomolecule to be detected with many more labels are provided, since a large number of labeled mononucleotides are incorporated into the replicated nucleic acid molecule, which serves as a detectable marker. This results in a much more amplified signal than conventional assays.
  • the labeled biomolecules are finally identified via the specific, solid-phase-bound binding molecules, the identity and position of which are known to the respective user.
  • the minimum detection limit of the method according to the invention is significantly lower than with immunoassays.
  • a high sensitivity requires a high specificity in the amplification.
  • this is ensured by the extraordinarily high specificity with which biological nucleic acid-replicating apparatuses replicate an existing high-molecular nucleic acid molecule.
  • the method is not limited to a few DNA polymerases, the very specific properties of which could be limited, for example, with regard to the reaction temperatures, since a large number of nucleic acid-replicating apparatus are used in the method according to the invention.
  • the method disclosed in claim 2 represents an equally advantageous variation of the method according to claim 1. Accordingly, it is provided to incubate immobilized biomolecules with compound complexes which consist of binding molecules specific for the respective biomolecules and a first substance which is part of a nucleic acid replicating apparatus, if necessary, to remove the unbound compound complexes by washing, the biomolecule-compound complexes formed with high molecular weight nucleic acid molecules and mononucleotides of different species, of which at least the mononucleotides of one species are provided with a detectable label, and to incubate a second substance which the first substance coupled to the biomolecules to form a functional replicating apparatus for high molecular nucleic acids, which binds the high molecular nucleic acid molecules and, with the incorporation of labeled mononucleotides, replicates of the high mo generated nucleic acid molecules that do not dissociate, if necessary to remove the high molecular weight nucleic acid molecules and mononucle
  • biomolecules In contrast to claim 1, it is not the biomolecules to be detected, but rather specific binding molecules that are first coupled with the first substance to form complexes which are then linked to those to be detected Biomolecules are incubated. The biomolecules in turn have previously been immobilized on a solid phase substrate.
  • Immobilization can e.g. by unspecific adsorption or covalent binding to a suitable substrate.
  • the biomolecules are immobilized by binding to specific binding molecules bound to the solid phase, after incubation of the biomolecules with the compound complexes the unbound compound complexes are removed, if necessary, by washing, and before detection of the labeled replicates that in solution located high molecular weight nucleic acid molecules and mononucleotides may be removed by washing.
  • mow is given a configuration known as a "sandwich”.
  • biomolecules to be detected are covalently coupled to the first substance or that in the compound complexes the binding molecules are covalently coupled to the first substance.
  • biomolecules to be detected are coupled to the first substance via linker systems or that the binding molecules in the connection complexes are coupled to the first substance via linker systems.
  • linker systems are the biotin-streptavidin system, the ULS-platinum linker system, the digoxigenin system or any antigen-antibody system.
  • it can also be any other specific binding System can be used.
  • all systems based on the presence of a hapten are suitable.
  • the first substance is the ⁇ -subunit of a DNA polymerase III and the second substance contains the remaining required subunits of a DNA polymerase III, so the above-mentioned nucleic acid replicating apparatus is made up of these two components composed.
  • the first substance is one or more subunits of a DNA polymerase III and the second substance contains ⁇ -subunits of a DNA polymerase III and possibly further necessary subunits of a DNA polymerase III.
  • the first substance contains ⁇ -subunits of a DNA polymerase III and the second substance contains a DNA polymerase I, the Klenow fragment of a DNA polymerase I, the Taq DNA polymerase or another DNA Is polymerase.
  • the first substance is a DNA polymerase I, the Klenow fragment of a DNA polymerase I, the Taq DNA polymerase or another DNA polymerase and the second substance is a ⁇ -subunit Contains DNA polymerase III.
  • the actual replication of the high molecular nucleic acid molecule by the remaining subunits of a DNA polymerase III, a DNA polymerase I, the Klenow fragment or the Taq DNA polymerase takes place while the .beta -Subunit or the ß-subunits for the required high Spe- replication is ensured by clipping the remaining subunits or the respective enzyme to the high-molecular nucleic acid molecule to be replicated.
  • any DNA polymerase III or its subunits known in the art In particular, it is also conceivable to use subunits of different DNA polymerases III in combination with one another.
  • biomolecule-substance complexes or the biomolecule-compound complexes are incubated in addition to the second substance with further ⁇ -subunits of a DNA polymerase III.
  • the high molecular weight nucleic acid molecules to be replicated have a circular shape. This ensures that neither these nor the generated and labeled, also circular replicates dissociate from the nucleic acid-replicating apparatus, since the ⁇ -subunits are circular nucleic acids. hold remolecules while they are unable to hold linear nucleic acid molecules.
  • the high molecular weight nucleic acid molecules to be replicated each have an origin of replication sequence on which the nucleic acid replicating apparatus can start.
  • the high molecular weight nucleic acid molecules to be replicated have a length of at least 10 kB. In this way it is ensured that a large number of labeled mononucleotides are incorporated into the replicates "and a strong signal amplification can thus be achieved. Compared to a molecule amplified with PCR, about 20 times more detectable markers are incorporated.
  • these markings consist of fluorescent, luminescent, radioactive or enzymatic markers.
  • all other suitable markers can also be used.
  • the binding molecules bound to the solid phase are arranged on a biochip.
  • the labeled replicas are particularly preferably detected using biochip scanners.
  • the binding molecules bound to the solid phase are arranged on beads.
  • the labeled replicas are particularly preferably detected using flow detectors.
  • the binding molecules bound to the solid phase or the immobilized biomolecules are arranged in a biological preparation.
  • Such a biological preparation can e.g. a histological section, a freeze fracture preparation or a Western blot, but also any other preparation which has binding molecules bound to the solid phase or immobilized biomolecules.
  • the biomolecules to be detected are preferably amino acids, proteins, sugars, nucleic acids, antibodies, lectins, lipids or receptors, while the binding molecules are preferably proteins, sugars, nucleic acids, antibodies, lectins, receptors or others are specifically binding molecules.
  • a method for producing a marker for the detection of biomolecules in which a first substance, which is part of a nucleic acid replicating apparatus and has a coupling element, with high molecular weight nucleic acid molecules and mononucleotides of different species, at least the mononucleotides of one species are provided with a detectable label, and a second substance is incubated, which supplements the first substance to form a functional replicating apparatus for high-molecular nucleic acids, in such a way that the apparatus thus formed binds the high-molecular nucleic acid molecules and produces replicates of the high-molecular nucleic acid molecules with the incorporation of labeled mononucleotides, that don't dissociate.
  • a marker produced in this way has many more detectable markings. This results in a much more amplified signal than conventional assays. Consequently, the minimum detection limit for biomolecules when using a marker produced using the method according to the invention is significantly lower than with conventional Elisa or sandwich assays.
  • the coupling element is a functional group which can form a covalent bond with molecules to be bound.
  • the coupling element is part of a linker system, via which the molecules to be bound can be bound.
  • linker systems are the biotin-streptavidin system, the ULS platinum linker system, the digoxigenin system or any antigen-antibody system.
  • any other specific binding system can also be used. Suitable are e.g. all systems based on the presence of a hapten.
  • the first substance is connected via the coupling element to a binding molecule which is capable of specifically binding a biomolecule. It can also be advantageously provided that the first substance is connected to a biomolecule via the coupling element, that is to say a molecule that is actually to be detected. It is provided that the biomolecules to be detected are preferably amino acids, proteins, sugars, nucleic acids, antibodies, lectins, lipids or receptors, while the binding molecules are preferably proteins, sugars, nucleic acids, antibodies, lectins, receptors or other specifically binding molecules.
  • the first substance is the ⁇ -subunit of a DNA polymerase III and the second substance contains the remaining required subunits of a DNA polymerase III, so the above-mentioned nucleic acid replicating apparatus is composed of these two components ,
  • the first substance is one or more subunits of a DNA polymerase III and the second substance contains ⁇ -subunits of a DNA polymerase III and possibly further necessary subunits of a DNA polymerase III.
  • the first substance contains ⁇ -subunits of a DNA polymerase III and the second substance contains a DNA polymerase I, the Klenow fragment of a DNA polymerase I, the Taq DNA polymerase or another DNA Is polymerase.
  • the first substance is a DNA polymerase I, the Klenow fragment of a DNA polymerase I, the Taq DNA polymerase or another DNA polymerase and the second substance is a ⁇ -subunit Contains DNA polymerase III.
  • the actual replication of the high molecular weight nucleic acid molecule applies by the remaining subunits of a DNA polymerase III, a DNA polymerase I, the Klenow fragment or the Taq DNA polymerase, while the ⁇ -subunit or the ⁇ -subunits ensure the required high specificity and processivity of the replication by clinging the remaining subunits or the respective enzyme to the high-molecular nucleic acid molecule to be replicated.
  • biomolecule-substance complexes or the biomolecule-compound complexes are incubated with further ⁇ -subunits of a DNA polymerase III in addition to the second substance.
  • the high molecular weight nucleic acid molecules to be replicated have a circular shape. This ensures that neither these nor the generated and labeled, also circular replicates dissociate from the nucleic acid replicating apparatus, since the ⁇ -subunits hold circular nucleic acid molecules while they are unable to hold linear nucleic acid molecules.
  • the high molecular weight nucleic acid molecules to be replicated each have an origin of replication sequence on which the nucleic acid replicating apparatus can start.
  • the high molecular weight nucleic acid molecules to be replicated have a length of at least 10 kB. This ensures that a large number of labeled mononucleotides are incorporated into the replicates and thus strong signal amplification can be achieved. Compared to a molecule amplified with PCR, about 20 x more detectable markers are incorporated.
  • these markings consist of fluorescent, luminescent, radioactive or enzymatic markers.
  • all other suitable markers can also be used.

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Abstract

Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen, bei dem die nachzuweisenden Biomoleküle mit einer ersten Substanz gekoppelt werden, die Teil eines nukleinsäurereplizierenden Apparates ist, die gebildeten Biomolekül-Substanz­Komplexe an für die jeweiligen Biomoleküle spezifische, festphasengebundene Bindungsmoleküle gebunden werden, ggf. die nicht gebundenen Biomolekül-SubstanzKomplexe durch Waschen entfernt werden, die gebundenen BiomolekülSubstanz-Komplexe mit hochmolekularen Nukleinsäuremolekülen und Mononukleotiden verschiedener Spezies, von deh en mindestens die Mononukleotide einer Spezies mit einer detektierbaren Markierung versehen sind, sowie einer zweiten Substanz inkubiert werden, die die an die Biomoleküle gekoppelte erste Substanz zu einem funktionsfähigen replizierenden Apparat für hochmolekulare Nukleinsäuren ergänzt, der die hochmolekularen Nukleinsäuremoleküle bindet und unter Einbau markierter Mononukleotide Replikate der hochmolekularen Nukleinsäuremoleküle erzeugt, die nicht abdissoziieren, ggf die in Lösung befindlichen hochmolekularen Nukleinsäuremoleküle und Mononukleotide durch Waschen entfernt werden, und über den Nachweis der markierten Replikate die zu detektierenden Biomoleküle bestimmt werden.

Description

AUF REPLIKATION VON GEBUNDENEN NUKLEINSÄUREN BASIERENDES VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON BIOMOLEKÜLEN
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen.
Um Biomoleküle in einer biomedizinischen Probe mit einer hohen Empfindlichkeit nachzuweisen, wird in bioanalytischen Labors sehr häufig das ELISA- Verfahren (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) angewandt. Dieses Verfahren ermöglicht die Detektion von Biomolekülen bis zu einer Mindestnachweis- grenze von 100.000 Molekülen (10"18 Mol).
Für die Serumanalytik oder die Genexpressionsforschung ist diese Methode zu unempfindlich, da die hier nachzuweisenden Proteine oder Peptide häufig in sehr viel geringeren Mengen vorliegen.
Im Stand der Technik sind Methoden bekannt, die eine wesentlich gesteigerte Nachweisempfmdlichkeit bieten. Ein solches Verfahren ist z.B. in der US 5,665,539 für den Nachweis jeweils eines bestimmten Biomoleküls offenbart ("Immuno-PCR"). Bei diesem Verfahren wird das Biomolekül ortsspezifisch, z.B. über vorgelegte Antikörper, an eine Trägermatrix gebunden. Anschließend
BESTÄUGUNGSKOPIE wird die Matrix mit einem für das gesuchte Biomolekül spezifischen -Antikörper inkubiert, und die nicht gebundenen Antikörper in einem Waschschritt entfernt.
Die gebundenen Antikörper sind mit einem Nukleinsäuremolekül markiert, das mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt wird und dessen Amplifikationsprodukte zunächst in Lösung gehen und dann mit Agarosegelek- trophorese nachgewiesen werden.
Das Verfahren profitiert dabei von der außerordentlich hohen Spezifität der PCR und der guten quantitativen Reproduzierbarkeit. Die Nachweisgrenze für zu de- tektierende Biomoleküle liegt daher unter geeigneten Bedingungen zwischen drei und fünf Größenordnungen unter der von ELISA- Verfahren.
Bei dem Verfahren besteht jedoch keine Spezifität zwischen dem zu detektieren- den Protein und dem amplifizierten Nukleinsäuremarker. Das Verfahren eignet sich daher nur zur hochempfindlichen Detektion eines einzigen, zu detektieren- den Biomolekültyps.
In der US 6,531,283 ist ein ähnliches Verfahren offenbart, bei dem die gebundenen Antikörper mit einem Nukleinsäuremolekül markiert sind, das mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (RCA) vervielfältigt wird. Dabei werden die Amplifikationsprodukte im Sinne einer Kettenverlängerung an die Nukleinsauremolekule angehängt, so daß ein Konkatenat entsteht, das vielfache Repetitionen der urspünglichen Markersequenz aufweist, und in situ mit geeigneten Methoden nachgewiesen werden kann, z.B. durch Anhybridisierung fluoreszenzmarkierter Nukleinsäureabschnitte, die zu der repetitiven Sequenz komplementär sind. Nachteilig ist hier, daß nur eine begrenzte Auswahl an Replikationsenzymen verwendet werden kann, wie z.B. die DNA-Polymerase des Bakteriophagen T7. Aus diesem Grund ist man auf die Eigenschaften der verwendbaren Polymerasen beschränkt. Insbesondere bei der Wahl der Inkubationstemperatur ist diese Einschränkung ein großer Nachteil. Überdies macht die Methode die Verwendung eines zirkulären Primers (Amplification Target Cycle), der Sequenzhomologien mit den an die Antikörper gebundenen Nukleinsäuremolekülen aufweisten muß
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren bereit zu stellen, mit dem Biomoleküle unter Umgehung der zuvor geschilderten Nachteile in einer Probe mit sehr hoher Empfindlichkeit und Spezifität nachgewiesen werden können. Weitere Aufgabe ist, ein Verfahren zur Herstellung eines Markers bereitzustellen, der in einem solchen Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen verwendet werden kann, sowie einen solchen Marker selbst herzustellen.
Diese Aufgaben werden mit den Merkmalen des Anspruches 1 oder 2, mit den Merkmalen des -Anspruchs 26 und mit den Merkmalen des Anspruchs 43 gelöst.
Gemäß Anspruch 1 ist vorgesehen, die nachzuweisenden Biomolekule mit einer ersten Substanz zu koppeln, die Teil eines nukleinsäurereplizierenden Apparates ist, die gebildeten Biomolekül-Substanz-Komplexe an für die jeweiligen Biomoleküle spezifische, festphasengebundene Bindungsmoleküle zu binden, ggf. die nicht gebundenen Biomolekül-Substanz-Komplexe durch Waschen zu entfernen, die gebundenen Biomolekül- Substanz-Komplexe mit hochmolekularen Nukleinsäuremolekülen und Mononukleotiden verschiedener Spezies, von denen mindestens die Mononukleotide einer Spezies mit einer detektierbaren Markierung versehen sind, sowie einer zweiten Substanz zu inkubieren, die die an die Biomole- küle gekoppelte erste Substanz zu einem funktionsfähigen replizierenden Apparat für hochmolekulare Nukleinsäuren ergänzt, der die hochmolekularen Nukleinsauremolekule bindet und unter Einbau markierter Mononukleotide Replikate der hochmolekularen Nukleinsauremolekule erzeugt, die nicht abdissoziieren, ggf. die in Lösung befindlichen hochmolekularen Nukleinsauremolekule und Mononukleotide durch Waschen zu entfernen und über den Nachweis der markierten Replikate die zu detektierenden Biomoleküle zu bestimmen.
Während bei herkömmlichen Immunoassays, bei denen die immobilisierten Biomoleküle mit einem markierten -Antikörper oder einer Antikörperkaskade inkubiert werden und daher jedes zu detektierende Biomolekül nur mit einer oder wenigen Markierungen versehen werden kann, kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren jedes zu detektierende Biomolekül mit sehr viel mehr Markierungen versehen werden, da in das replizierte Nukleinsäuremolekül, das als detektierba- rer Marker dient, eine Vielzahl von markierten Mononukleotiden eingebaut wird. Es entsteht also im Vergleich zu herkömmlichens Assays ein sehr viel stärker amplifiziertes Signal. Die Identifizierung der markierten Biomoleküle erfolgt schließlich über die spezifischen, festphasengebundenen Bindungsmoleküle, deren Identität und Position dem jeweiligen Anwender bekannt ist.
Aufgrund des sehr viel stärker amplifizierten Signals liegt die Mindestnachweis- grenze der erfindungsgemäßen Verfahrens wesentlich niedriger als bei Immuno- Assays. Eine solch hohe Empfindlichkeit macht jedoch eine hohe Spezifität bei der Amplifikation erforderlich. Diese wird im erfindungsgemäßen Verfahren durch die außerordentlich hohe Spezifität, mit der biologische nukleinsäurerepli- zierende Apparate ein vorhandenes hochmolekulares Nukleinsäuremolekül replizieren, gewährleistet. Dabei ist das Verfahren nicht auf einige wenige DNA-Polymerasen beschränkt, durch deren ganz spezifische Eigenschaften es z.B. in Bezug auf die Reaktionstemperaturen limitiert sein könnte, da bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Vielzahl von nukleinsäurereplizierenden Apparaten zur Verwendung kommen.
Die in Anspruch 2 offenbarte Methode stellt eine ebenso vorteilhafte Variation der Methode gemäß Anspruch 1 dar. Demnach ist vorgesehen, immobilisierte Biomoleküle mit Verbindungskomplexen zu inkubieren, die aus für die jeweiligen Biomoleküle spezifischen Bindungsmolekülen sowie einer ersten Substanz bestehen, die Teil eines nukleinsäurereplizierenden Apparates ist, ggf. die nicht gebundenen Verbindungsk mplexe durch Waschen zu entfernen, die gebildeten Biomolekül- Verbindungskomplexe mit hochmolekularen Nuklein- säuremolekülen und Mononukleotiden verschiedener Spezies, von denen mindestens die Mononukleotide einer Spezies mit einer detektierbaren Markierung versehen sind, sowie einer zweiten Substanz zu inkubieren, die die an die Biomoleküle gekoppelte erste Substanz zu einem funktionsfähigen replizierenden Apparat für hochmolekulare Nukleinsäuren ergänzt, der die hochmolekularen Nukleinsauremolekule bindet und unter Einbau markierter Mononukleotide Replikate der hochmolekularen Nukleinsauremolekule erzeugt, die nicht abdissoziieren, ggf. die in Lösung befindlichen hochmolekularen Nukleinsauremolekule und Mononukleotide durch Waschen zu entfernen, und über den Nachweis der markierten Replikate die zu detektierenden Biomoleküle zu bestimmten.
Im Unterschied zu -Anspruch 1 werden hier also nicht die nachzuweisenden Biomoleküle, sondern spezifische Bindungsmoleküle zunächst mit der ersten Substanz zu Verbindungskomplexen gekoppelt, die dann mit den nachzuweisenden Biomolekülen inkubiert werden. Dabei sind die Biomoleküle ihrerseits zuvor auf einem Festphasensubstrat immobilisert worden.
Die Immobilisierung kann z.B. durch unspezifische Adsorption oder kovalente Bindung an ein geeignetes Substrat erfolgen. In einer bevorzugten Ausgestaltung ist jedoch vorgesehen, daß die Biomoleküle durch Bindung an festphasengebun- dene spezifische Bindungsmoleküle immobilisiert werden, nach Inkubation der Biomoleküle mit den Verbindungskomplexen die nicht gebundenen Verbindungskomplexe ggf. durch Waschen entfernt werden, und vor dem Nachweis der markierten Replikate die in Lösung befindlichen hochmolekularen Nukleinsauremolekule und Mononukleotide ggf. durch Waschen entfernt werden. Dabei erhält mäh bei der Inkubation der durch die Bindungsmoleküle immobilisierten Biomoleküle mit den Verbindungskomplexen eine als "Sandwich" bekannte Konfiguration.
In vorteilhaften Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, daß die nachzuweisenden Biomoleküle kovalent mit der ersten Substanz gekoppelt werden bzw. daß in den Verbindungskomplexen die Bindungsmoleküle kovalent mit der ersten Substanz gekoppelt werden.
In weiteren vorteilhaften Ausgestaltungen ist vorgesehen, daß die nachzuweisenden Biomoleküle über Linkersysteme mit der ersten Substanz gekoppelt werden bzw. daß in den Verbindungskomplexen die Bindungsmoleküle über Linkersysteme mit der ersten Substanz gekoppelt werden.
Besonders bevorzugte Linkersysteme sind dabei das Biotin-Streptavidin-System, das ULS-Platin-Linkersystem, das Digoxigenin-System oder ein beliebiges Anti- gen-Antikörper-System. Es kann jedoch auch jedes andere spezifisch bindende System verwendet werden. Geeignet sind z.B. alle Systeme, die auf dem Vorhandensein eines Haptens beruhen.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, daß die erste Substanz die ß-Untereinheit einer DNA-Polymerase III ist und die zweite Substanz die restlichen erforderlichen Untereinheiten einer DNA- Polymerase III enthält, sich der zuoberst erwähnte nukleinsäurereplizierende Apparat also aus diesen beiden Komponenten zusammensetzt.
Alternativ kann vorgesehen sein, daß die erste Substanz eine oder mehrere Untereinheiten einer DNA-Polymerase III ist und die zweite Substanz ß-Untereinheiten einer DNA-Polymerase III sowie eventuell weitere erforderliche Untereinheiten einer DNA-Polymerase III enthält.
Ebenso vorteilhaft kann vorgesehen sein, daß die erste Substanz ß-Untereinheiten einer DNA-Polymerase III enthält und die zweite Substanz eine DNA- Polymerase I, das Klenow-Fragment einer DNA-Polymerase I, die Taq-DNA- Polymerase oder eine andere DNA-Polymerase ist.
In einer nochmals anderen Ausgestaltung kann vorgesehen sein, daß die erste Substanz eine DNA-Polymerase I, das Klenow-Fragment einer DNA-Polymerase I, die Taq-DNA-Polymerase oder eine andere DNA-Polymerase ist und die zweite Substanz ß-Untereinheiten einer DNA-Polymerase III enthält.
Für jede der zuvor genannten Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Verfahren gilt, daß die eigentliche Replikation des hochmolekularen Nukleinsäuremoleküls durch die restlichen Untereinheiten einer DNA-Polymerase III, eine DNA- Polymerase I, das Klenow-Fragment oder die Taq-DNA-Polymerase erfolgt, während die ß-Untereinheit bzw. die ß-Untereinheiten für die erforderliche hohe Spe- zifität und Prozessivität der Replikation sorgt, indem sie die restlichen Untereinheiten bzw. das jeweilige Enzym an das zu replizierende hochmolekulare Nukleinsäuremolekül klammert. Dabei ist die Verwendung jeder in der, Technik bekannten DNA-Polymerase III bzw. ihrer Untereinheiten denkbar. Insbesondere ist auch denkbar, Untereinheiten verschiedener DNA-Polymerasen III in Kombination miteinander zu verwenden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist für eine weitere Erhöhung der Spezifität und Prozessivität vorgesehen, daß die Biomolekül-Substanz-Komplexe bzw. die Biomolekül- Verbindungskomplexe zusätzlich zu der zweiten Substanz mit weiteren ß-Untereinheiten einer DNA-Polymerase III inkubiert werden.
Der im Zusammenspiel mit einer DNA-Polymerase die Spezifität und die Prozessivität der DNA-Replikation erhöhende Effekt der ß-Untereinheit einer DNA- Polymerase III ist z.B. aus der US 6,555,349 bekannt, in der eine Methode zur isothermen Amplifikation von Nukleinsäuremolekülen offenbart wird, bei der eine Drei-Komponenten-Polymerase verwendet wird, die aus einer DNA- Polymerase (z.B. DNA-Polymerase III), einem Klammer-Komplex (z.B. ß- Untereinheiten) und einem Hilfskomplex (z.B. γ-Komplex) besteht. Dabei ist jedoch lediglich die Verwendung zur -Amplifikation von Nukleinsäuremolekülen offenbart. Eine Anwendung im Zusammenhang mit Immunoassays oder zum Nachweis von Biomolekülen aus einer Probe ist in der US 6,555,349 nicht beschrieben.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, daß die zu replizierenden hochmolekularen Nukleinsauremolekule eine zirkuläre Form aufweisen. Dadurch wird sichergestellt, daß weder diese noch die erzeugten und markierten, ebenfalls zirkulären Replikate vom nukleinsäurereplizierenden Apparat abdissoziieren, da die ß-Untereinheiten zirkuläre Nukleinsäu- remoleküle festhalten, während sie lineare Nukleinsauremolekule nicht festzuhalten imstande sind.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, daß die zu replizierenden hochmolekularen Nukleinsauremolekule jeweils eine Replikationsorigin-Sequenz aufweisen, an der der nukleinsäurereplizierenden Apparat ansetzen kann.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung weisen die zu replizierenden hochmolekularen Nukleinsauremolekule eine Länge von mindestens 10 kB auf. Auf diese Weise ist sichergestellt, daß eine große Anzahl von markierten Mono- nukleotiden in die Replikate eingebaut" und so eine starke Signalamplifikation erzielt werden kann. Im Vergleich zu einem mit PCR amplifizierten Molekül werden dabei etwa 20 x mehr detektierbare Marker eingebaut.
Dabei ist in besonders vorteilhaften Ausgestaltungen vorgesehen, daß diese Markierungen aus fluoreszierenden, lumineszierenden, radioaktiven oder enzymati- schen Markern bestehen. Es können jedoch auch alle anderen geeigneten Marker verwendet werden.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, daß die festphasengebundenen Bindungsmoleküle auf einem Biochip angeordnet sind. In diesem Falle werden die markierten Replikate besonders bevorzugt mit Biochip-Scannern nachgewiesen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, daß die festphasengebundenen Bindungsmoleküle auf Beads angeordnet sind. In diesem Falle werden die markierten Replikate besonders bevorzugt mit Durchflußdetektoren nachgewiesen. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, daß die festphasengebundenen Bindungsmoleküle oder die immobilisierten Biomoleküle in einem biologischen Präparat angeordnet sind.
Ein solches biologisches Präparat kann z.B. ein histologischer Schnitt, ein Gefrierbruchpräparat oder ein Western-Blot sein, aber auch jedes andere Präparat, das festphasengebundene Bindungsmoleküle oder immobilisierte Biomoleküle aufweist.
In vorteilhaften Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, daß die nachzuweisenden Biomoleküle bevorzugt Aminosäuren, Proteine, Zucker, Nukleinsäuren, -Antikörper, Lektine, Lipide oder Rezeptoren sind, während die Bindungsmoleküle bevorzugt Proteine, Zucker, Nukleinsäuren, -Antikörper, Lektine, Rezeptoren oder andere spezifisch bindende Moleküle sind.
Gemäß Anspruch 26 ist vorgesehen, ein Verfahren zur Herstellung eines Markers zum Nachweis von Biomolekülen bereitzustellen, bei dem eine erste Substanz, die Teil eines nukleinsäurereplizierenden Apparates ist und ein Kupplungselement aufweist, mit hochmolekularen Nukleinsäuremolekülen und Mononukleotiden verschiedener Spezies, von denen mindestens die Mononukleotide einer Spezies mit einer detektierbaren Markierung versehen sind, sowie einer zweiten Substanz inkubiert wird, die die erste Substanz zu einem funktionsfähigen replizierenden Apparat für hochmolekulare Nukleinsäuren ergänzt, dergestalt, daß der so gebildete Apparat die hochmolekularen Nukleinsauremolekule bindet und unter Einbau markierter Mononukleotide Replikate der hochmolekularen Nukleinsauremolekule erzeugt, die nicht abdissoziieren. Ein solchermaßen hergestellter Marker weist im Gegensatz zu den bei herkömmlichen ELISA- oder Sandwich-Assays verwendeten Markern sehr viel mehr de- tektierbare Markierungen auf. Es entsteht also im Vergleich zu herkömmlichens Assays ein sehr viel stärker amplifiziertes Signal. Folglich liegt die Mindest- nachweisgrenze für Biomoleküle bei Verwendung eines mit dem erfmdungsge- mäßen Verfahren hergestellten Markers wesentlich niedriger als bei herkömmlichen Elisa- oder Sandwich-Assays.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung dieses Verfahrens ist vorgesehen, daß das Kupplungselement eine funktioneile Gruppe ist, die mit zu bindenden Molekülen eine kovalente Bindung eingehen kann.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung ist vorgesehen, daß das Kupplungselement Bestandteil eines Linkersystems ist, über das die zu bindenden Moleküle gebunden werden können.
Besonders bevorzugte Linkersysteme sind dabei das Biotin-Streptavidin-System, das ULS-Platin-Linkersystem, das Digoxigenin- System oder ein beliebiges Anti- gen- Antikörper- System. Es kann jedoch auch jedes andere spezifisch bindende System verwendet werden. Geeignet sind z.B. alle Systeme, die auf dem Vorhandensein eines Haptens beruhen.
In einer bevorzugten Ausgestaltung dieses Verfahrens ist vorgesehen, daß die erste Substanz über das Kupplungselement mit einem Bindungsmolekül verbunden wird, das in der Lage ist, ein Biomolekül spezifisch zu binden. Es kann ebenso vorteilhaft vorgesehen sein, daß die erste Substanz über das Kupplungselement mit einem Biomolekül verbunden wird, also einem Molekül, das eigentlich nachgewiesen werden soll. Dabei ist vorgesehen, daß die nachzuweisenden Biomoleküle bevorzugt Aminosäuren, Proteine, Zucker, Nukleinsäuren, Antiköφer, Lektine, Lipide oder Rezeptoren sind, während die Bindungsmoleküle bevorzugt Proteine, Zucker, Nukleinsäuren, Antiköφer, Lektine, Rezeptoren oder andere spezifisch bindende Moleküle sind.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens ist vorgesehen, daß die erste Substanz die ß-Untereinheit einer DNA-Polymerase III ist und die zweite Substanz die restlichen erforderlichen Untereinheiten einer DNA-Polymerase III enthält, sich der zuoberst erwähnte nukleinsäurereplizierende Apparat also aus diesen beiden Komponenten zusammensetzt.
Alternativ kann vorgesehen sein, daß die erste Substanz eine oder mehrere Untereinheiten einer DNA-Polymerase III ist und die zweite Substanz ß- Untereinheiten einer DNA-Polymerase III sowie eventuell weitere erforderliche Untereinheiten einer DNA-Polymerase III enthält.
Ebenso vorteilhaft kann vorgesehen sein, daß die erste Substanz ß-Untereinheiten einer DNA-Polymerase III enthält und die zweite Substanz eine DNA- Polymerase I, das Klenow-Fragment einer DNA-Polymerase I, die Taq-DNA- Polymerase oder eine andere DNA-Polymerase ist.
In einer nochmals anderen Ausgestaltung kann vorgesehen sein, daß die erste Substanz eine DNA-Polymerase I, das Klenow-Fragment einer DNA-Polymerase I, die Taq-DNA-Polymerase oder eine andere DNA-Polymerase ist und die zweite Substanz ß-Untereinheiten einer DNA-Polymerase III enthält.
Für jede der zuvor genannten Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Verfahren gilt, daß die eigentliche Replikation des hochmolekularen Nukleinsäuremoleküls durch die restlichen Untereinheiten einer DNA-Polymerase III, eine DNA- Polymerase I, das Klenow-Fragment oder die Taq-DNA-Polymerase erfolgt, während die ß-Untereinheit bzw. die ß-Untereinheiten für die erforderliche hohe Spezifität und Prozessivität der Replikation sorgt, indem sie die restlichen Untereinheiten bzw. das jeweilige Enzym an das zu replizierende hochmolekulare Nukleinsäuremolekül klammert.
Dabei kann für eine weitere Erhöhung der Spezifität und Prozessivität vorgesehen sein, daß die Biomolekül-Substanz-Komplexe bzw. die Biomolekül- Verbindungskomplexe zusätzlich zu der zweiten Substanz mit weiteren ß- Untereinheiten einer DNA-Polymerase III inkubiert werden.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens ist vorgesehen, daß die zu replizierenden hochmolekularen Nukleinsauremolekule eine zirkuläre Form aufweisen. Dadurch wird sichergestellt, daß weder diese noch die erzeugten und markierten, ebenfalls zirkulären Replikate vom nukleinsäurereplizierenden Apparat abdissoziieren, da die ß-Untereinheiten zirkuläre Nukleinsauremolekule festhalten, während sie lineare Nukleinsauremolekule nicht festzuhalten imstande sind.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens ist vorgesehen, daß die zu replizierenden hochmolekularen Nukleinsauremolekule jeweils eine Repli- kationsorigin-Sequenz aufweisen, an der der nukleinsäurereplizierenden Apparat ansetzen kann.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung weisen die zu replizierenden hochmolekularen Nukleinsauremolekule eine Länge von mindestens 10 kB auf. Auf diese Weise ist sichergestellt, daß eine große -Anzahl von markierten Mono- nukleotiden in die Replikate eingebaut und so eine starke Signalamplifikation erzielt werden kann. Im Vergleich zu einem mit PCR amplifizierten Molekül werden dabei etwa 20 x mehr detektierbare Marker eingebaut.
Dabei ist in besonders vorteilhaften Ausgestaltungen vorgesehen, daß diese Markierungen aus fluoreszierenden, lumineszierenden, radioaktiven oder enzymati- schen Markem bestehen. Es können jedoch auch alle anderen geeigneten Marker verwendet werden.
Gemäß Anspruch 43 ist vorgesehen, einen Marker zum Nachweis von Biomolekülen bereitzustellen, der mit einem der zuvor geschilderten Verfahren hergestellt wurde.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen, bei dem a) die nachzuweisenden Biomoleküle mit einer ersten Substanz gekoppelt werden, die Teil eines nukleinsäurereplizierenden Apparates ist, b) die gebildeten Biomolekül-Substanz-Komplexe an für die jeweiligen Biomoleküle spezifische, festphasengebundene Bindungsmoleküle gebunden werden, c) ggf. die nicht gebundenen Biomolekül-Substanz-Komplexe durch Waschen entfernt werden, •. d) die gebundenen Biomolekül-Substanz-Komplexe mit hochmolekularen Nukleinsäuremolekülen und Mononukleotiden verschiedener Spezies, von denen mindestens die Mononukleotide einer Spezies mit einer detektierbaren Markierung versehen sind, sowie einer zweiten Substanz inkubiert werden, die die an die Biomoleküle gekoppelte erste Substanz zu einem funktionsfähigen replizierenden Apparat für hochmolekulare Nukleinsäuren ergänzt, der die hochmolekularen Nukleinsauremolekule bindet und unter Einbau markierter Mononukleotide Replikate der hochmolekularen Nukleinsauremolekule erzeugt, die nicht abdissoziieren, e) ggf. die in Lösung befindlichen hochmolekularen Nukleinsauremolekule und Mononukleotide durch Waschen entfernt werden, f) und über den Nachweis der markierten Replikate die zu detektie- renden Biomoleküle bestimmt werden.
2. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen, bei dem a) immobilisierte Biomoleküle mit Verbindungskomplexen inkubiert werden, die aus für die jeweiligen Biomoleküle spezifischen Bindungsmolekülen und einer ersten Substanz bestehen, die Teil eines nukleinsäurereplizierenden Apparates ist, b) ggf. die nicht gebundenen Verbindungskomplexe durch Waschen entfernt werden, c) die gebildeten Biomolekül- Verbindungskomplexe mit hochmolekularen Nukleinsäuremolekülen und Mononukleotiden verschiedener Spezies, von denen mindestens die Mononukleotide einer Spezies mit einer detektierbaren Markierung versehen sind, sowie einer zweiten Substanz inkubiert werden, die die an die Biomoleküle gekoppelte erste Substanz zu einem funktionsfähigen replizierenden Apparat für hochmolekulare Nukleinsäuren ergänzt, der die hochmolekularen Nukleinsauremolekule bindet und unter Einbau markierter Mononukleotide Replikate der hochmolekularen Nukleinsauremolekule erzeugt, die nicht abdissoziieren, d) ggf. die in Lösung befindlichen hochmolekularen Nukleinsauremolekule und Mononukleotide durch Waschen entfernt werden, e) und über den Nachweis der markierten Replikate die zu detektie- renden Biomoleküle bestimmt werden.
3. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß a) die Biomoleküle vor Inkubation mit den Verbindungskomplexen immobilisiert werden, indem sie an festphasengebundene spezifische Bindungsmoleküle gebunden werden, b) nach Inkubation der Biomoleküle mit den Verbindungskomplexen die nicht gebundenen Verbindungskomplexe ggf. durch Waschen entfernt werden, c) vor dem Nachweis der markierten Replikate die in Lösung befindlichen hochmolekularen Nukleinsauremolekule und Mononukleotide ggf. durch Waschen entfernt werden.
4. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisenden Biomoleküle kovalent mit der ersten Substanz gekoppelt werden.
5. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen gemäß -Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß in den Verbindungskomplexen die Bindungsmoleküle kovalent mit der ersten Substanz gekoppelt werden.
6. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen gemäß -Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisenden Biomoleküle über Linkersysteme mit der ersten Substanz gekoppelt werden.
7. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen gemäß -Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß in den Verbindungskomplexen die Bindungsmoleküle über Linkersysteme mit der ersten Substanz gekoppelt werden.
8. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen gemäß Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Linkersystem aus der Gruppe gewählt ist, die das Biotin-Streptavidin- System, das ULS-Platin-Linkersystem, das Digoxigenin- System, ein Antigen- Antiköφer- System oder ein anderes spezifisch bindendes System umfaßt.
9. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen gemäß einem der Ansprüche 1 - 8, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Substanz die ß-Untereinheit einer DNA-Polymerase III ist und die zweite Substanz die restlichen erforderlichen Untereinheiten einer DNA-Polymerase III enthält.
10. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen gemäß einem. der Ansprüche 1 - 8, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Substanz eine oder mehrere Untereinheiten einer DNA-Polymerase III ist und die zweite Substanz ß- Untereinheiten einer DNA-Polymerase III sowie eventuell weitere erforderliche Untereinheiten einer DNA-Polymerase III enthält.
11. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen gemäß einem der Ansprüche 1 - 8, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Substanz ß-Untereinheiten einer DNA-Polymerase III enthalt und die zweite Substanz eine DNA- Polymerase I, das Klenow-Fragment einer DNA-Polymerase I, die Taq- DNA-Polymerase oder eine andere DNA-Polymerase ist.
12. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen gemäß einem der Ansprüche 1 - 8, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Substanz eine DNA- Polymerase I, das Klenow-Fragment einer DNA-Polymerase I, die Taq- DNA-Polymerase oder eine andere DNA-Polymerase ist und die zweite Substanz ß-Untereinheiten einer DNA-Polymerase III enthält.
13. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Biomolekül-Substanz- Komplexe bzw. die Biomolekül- Verbindungskomplexe zusätzlich zu der zweiten Substanz mit weiteren ß-Untereinheiten einer DNA-Polymerase III inkubiert werden.
14. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zu replizierenden hochmolekularen Nukleinsauremolekule eine zirkuläre Form aufweisen.
15. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zu replizierenden hochmolekularen Nukleinsauremolekule jeweils eine Replikationsorigin- Sequenz aufweisen.
16. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen nach einem der vorhergehenden -Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zu replizierenden hochmolekularen Nukleinsauremolekule eine Länge von mindestens 10 kB aufweisen.
17. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die detektierbare Markierung mindestens einer der zugefügten Mononukleotidspezies aus einer fluoreszierenden, lumineszierenden, radioaktiven oder enzymatischen Markierung besteht.
18. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die festphasengebundenen Bindungsmoleküle auf einem Biochip angeordnet sind.
19. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die markierten Replikate mit Biochip-Scannern nachgewiesen werden.
20. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen nach einem der Ansprüche 1 - 17, dadurch gekennzeichnet, daß die festphasengebundenen Bindungsmoleküle auf Beads angeordnet sind.
21. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die markierten Replikate mit Durchflußdetektoren nachgewiesen werden.
22. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen nach einem der Ansprüche 1 - 17, dadurch gekennzeichnet, daß die festphasengebundenen Bindungsmoleküle oder die immobilisierten Biomoleküle in einem biologischen Präparat angeordnet sind.
23. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Präparat ein histologischer Schnitt, ein Gefrierbruchpräparat oder ein Western-Blot ist.
24. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisenden Biomoleküle Aminosäuren, Proteine, Zucker, Nukleinsäuren, Antiköφer, Lektine, Lipide oder Rezeptoren sind.
25. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsmoleküle Proteine, Zucker, Nukleinsäuren, -Antiköφer, Lektine, Rezeptoren oder andere spezifisch bindende Moleküle sind.
26. Verfahren zur Herstellung eines Markers zum Nachweis von Biomolekülen, bei dem eine erste Substanz, die Teil eines nukleinsäurereplizierenden Apparates ist und ein Kupplungselement aufweist, mit hochmolekularen Nukleinsäuremolekülen und Mononukleotiden verschiedener Spezies, von denen mindestens die Mononukleotide einer Spezies mit einer detektierbaren Markierung versehen sind, sowie einer zweiten Substanz inkubiert wird, die die erste Substanz zu einem funktionsfähigen replizierenden Apparat für hochmolekulare Nukleinsäuren ergänzt, dergestalt, daß der so gebildete Apparat die hochmolekularen Nukleinsauremolekule bindet und unter Einbau markierter Mononukleotide Replikate der hochmolekularen Nukleinsauremolekule erzeugt, die nicht abdissoziieren.
27. Verfahren zur Herstellung eines Markers zum Nachweis von Biomolekülen gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Kupplungselement eine funktionelle Gruppe ist, die mit zu bindenden Molekülen eine kovalente Bindung eingehen kann.
28. Verfahren zur Herstellung eines Markers zum Nachweis von Biomolekülen gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Kupplungselement Bestandteil eines Linkersystems ist, über das die zu bindenden Moleküle gebunden werden können.
29. Verfahren zur Herstellung eines Markers zum Nachweis von Biomolekülen gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Linkersystem aus der Gruppe gewählt ist, die das Biotin-Streptavidin-System, das ULS- Platin-Linkersystem, das Digoxigenin- System, ein Antigen-Antiköφer- System oder ein anderes spezifisch bindendes System umfaßt.
30. Verfahren zur Herstellung eines Markers zum Nachweis von Biomolekülen gemäß einem der Ansprüche 26 - 29, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Substanz über das Kupplungselement mit einem Bindύngsmole- kül verbunden wird, das in der Lage ist, ein Biomolekül spezifisch zu binden.
31. Verfahren zur Herstellung eines Markers zum Nachweis von Biomolekülen gemäß einem der Ansprüche 26 - 29, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Substanz über das Kupplungselement mit einem Biomolekül verbunden wird.
32. Verfahren zur Herstellung eines Markers zum Nachweis von Biomolekülen gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsmoleküle Proteine, Zucker, Nukleinsäuren, Antiköφer, Lektine, Rezeptoren oder andere spezifisch bindende Moleküle sind.
33. Verfahren zur Herstellung eines Markers zum Nachweis von Biomolekülen gemäß einem der Ansprüche 30 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisenden Biomoleküle -Aminosäuren, Proteine, Zucker, Nukleinsäuren, Antiköφer, Lektine, Lipide oder Rezeptoren sind.
34. Verfahren zur Herstellung eines Markers zum Nachweis von Biomolekülen gemäß einem der Ansprüche 26 - 33, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Substanz die ß-Untereinheit einer DNA-Polymerase III ist und die zweite Substanz die restlichen erforderlichen Untereinheiten einer DNA-Polymerase III enthält.
35. Verfahren zur Herstellung eines Markers zum Nachweis von Biomolekülen gemäß einem der -Ansprüche 26 - 34, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Substanz eine oder mehrere Untereinheiten einer DNA- Polymerase III ist und die zweite Substanz ß-Untereinheiten einer DNA- Polymerase III sowie eventuell weitere erforderliche Untereinheiten einer DNA-Polymerase III enthält.
36. Verfahren zur Herstellung eines Markers zum Nachweis von Biomolekülen gemäß einem der -Ansprüche 26 - 34, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Substanz ß-Untereinheiten einer DNA-Polymerase III enthält und die zweite Substanz eine DNA-Polymerase I, das Klenow-Fragment einer DNA-Polymerase I, die Taq-DNA-Polymerase oder eine andere DNA-Polymerase ist.
37. Verfahren zur Herstellung eines Markers zum Nachweis von Biomolekülen gemäß einem der Ansprüche 26 - 34, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Substanz eine DNA-Polymerase I, das Klenow-Fragment einer DNA-Polymerase I, die Taq-DNA-Polymerase oder eine andere DNA- Polymerase ist und die zweite Substanz ß-Untereinheiten einer DNA- Polymerase III enthält.
38. Verfahren zur Herstellung eines Markers zum Nachweis von Biomolekülen gemäß einem der Ansprüche 26 - 34, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Substanz zusätzlich der jeweils eingesetzten zweiten Substanz mit weiteren ß-Untereinheiten einer DNA-Polymerase III inkubiert wird.
39. Verfahren zur Herstellung eines Markers zum Nachweis von Biomolekülen gemäß einem der Ansprüche 26 - 38, dadurch gekennzeichnet, daß die zu replizierenden hochmolekularen Nukleinsauremolekule eine zirkuläre Form aufweisen.
40. Verfahren zur Herstellung eines Markers zum Nachweis von Biomolekülen gemäß einem der Ansprüche 26 - 39, dadurch gekennzeichnet, daß die zu replizierenden hochmolekularen Nukleinsauremolekule jeweils eine Replikationsorigin-Sequenz aufweisen.
41. Verfahren zur Herstellung eines Markers zum Nachweis von Biomolekülen gemäß einem der Ansprüche 26 - 40, dadurch gekennzeichnet, daß die zu replizierenden hochmolekularen Nukleinsauremolekule eine Länge von mindestens 10 kB aufweisen.
42. Verfahren zur Herstellung eines Markers zum Nachweis von Biomolekülen gemäß einem der Ansprüchen - 41, dadurch gekennzeichnet, daß die detektierbare Markierung mindestens einer der zugefügten Mononu- kleotidspezies aus einer fluoreszierenden, lumineszierenden, radioaktiven, oder enzymatischen Markierung besteht.
43. Marker zum Nachweis von Biomolekülen, dadurch gekennzeichnet, daß er mit einem Verfahren gemäß der Ansprüche 26 - 42 hergestellt wurde.
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