EP1603934A1 - Ethercarbonsäureester von sterolen bzw. stanolen - Google Patents

Ethercarbonsäureester von sterolen bzw. stanolen

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Publication number
EP1603934A1
EP1603934A1 EP04718956A EP04718956A EP1603934A1 EP 1603934 A1 EP1603934 A1 EP 1603934A1 EP 04718956 A EP04718956 A EP 04718956A EP 04718956 A EP04718956 A EP 04718956A EP 1603934 A1 EP1603934 A1 EP 1603934A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sterol
ether carboxylic
carboxylic acids
stanol
alcohol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04718956A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Alfred Westfechtel
Ansgar Behler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cognis IP Management GmbH
Original Assignee
Cognis IP Management GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cognis IP Management GmbH filed Critical Cognis IP Management GmbH
Publication of EP1603934A1 publication Critical patent/EP1603934A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J9/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics

Definitions

  • the present invention is in the field of esters of sterols and / or stanols and relates to new ether carboxylic acid esters, a process for their preparation and the use of these esters.
  • sterols especially phytosterols
  • steroid intermediates such as androstenedione
  • pharmaceutically active steroids such as testerone, estradiol, testolactone or cortisone
  • phytosterols have the advantageous property of lowering the cholesterol level in the blood of humans, which is why they and their fatty acid esters are used as a food additive.
  • aqueous dispersions One of the major problems with the use of the sterols and the stanols obtainable by hydrogenation has proven to be their extremely low solubility in water and only a low solubility in fats.
  • One way of producing aqueous dispersions is to reduce the particle size of the sterols using a wide variety of high-pressure homogenizers.
  • the international application WO 00/45648 discloses the production of microparticles of phytosterols, inter alia, in an aqueous medium by using equipment which generates high shear forces, such as colloid mills.
  • Sterol derivatives which have improved solubility in fats are known from European patent application EP-A-195311, which can be prepared by esterifying phytosterols and branched aliphatic alcohols with fatty acids or fatty acid esters in the presence of lipases.
  • the German patent application DE-A-2 035 069 discloses clear frying and salad oils containing carboxylic acid esters of phytosterols produced by acylation using perchloric acid as a catalyst.
  • ⁇ -sitostanol fatty acid esters are known which are produced by transesterification of ⁇ -sitostanol with fatty acid esters in the presence of transesterification catalysts.
  • the object of the present application was to provide sterol derivatives and / or stanol derivatives which can be dispersed in water in the highest possible amounts and, if possible, without complex high-pressure homogenizers, in order to open up a wide range of possible uses.
  • the derivatives should be self-dispersible, i.e. the presence of emulsifiers for the production of aqueous dispersions should not be necessary, but only optional.
  • the derivatives should preferably have a lower melting point than the sterols and / or stanols themselves, for example in order to facilitate subsequent fermentative reactions.
  • the invention relates to sterol and / or stanol esters of ether carboxylic acids of the general formula (I)
  • R represents an alcohol-derived alkyl, alkenyl and / or alkylphenyl radical having 1 to 50 carbon atoms
  • OAlk represents ring-opened ethylene oxide, propylene oxide and / or butylene oxide units
  • n stands for numbers from 0 to 100.
  • the present invention further relates to a process for the preparation of sterol and / or stanol esters of ether carboxylic acids, characterized in that sterols and / or stanols with ether carboxylic acids or their salts of the formula (II)
  • R for an alcohol-derived alkyl, alkenyl and / or alkylphenyl radical having 1 to 50 carbon atoms, Oalk for ring-opened ethylene oxide, propylene oxide and / or butylene oxide units, n for numbers from 0 to 100 and X for hydrogen or is an alkali metal, are esterified in the presence of an esterification catalyst.
  • the present invention further relates to the use of sterol and / or stanol esters of ether carboxylic acids of the formula (I) as a source of sterol and / or stanol, preferably as a raw material for the preparation of steroid precursors, in particular for the fermentative production of 4-androstene 3,17-dione (AD) and / or 4-androstadiene-3,17-dione (ADD), as emulsifiers, in particular in cosmetic compositions and in foods, as a cosmetic active ingredient and finally as a hypocholesterolene active ingredient, in particular in foods and / or Food supplements.
  • AD 4-androstene 3,17-dione
  • ADD 4-androstadiene-3,17-dione
  • Sterols which are often referred to as sterols, are steroids with 27 to 30 carbon atoms with a hydroxyl group on the third carbon atom. As a rule, sterols also have a double bond. Stanols are the corresponding saturated sterol compounds that have no double bond. The sterols are free in nature, very common as esters or glycosides. A distinction is made between animal sterols, so-called zoosterols, plant sterols, so-called phytosterols and sterols from fungi, so-called mycosterols. In principle, all sterols or stanols are suitable for the purposes of the present invention, preferably the phytosterols or their hydrogenated stanol compounds. Phytosterols which mainly contain one or more of the following compounds are preferred: ⁇ -sitosterol, campesterol, stigmasterol, brassicasterol, stigmastanol and campestanol.
  • sterols and / or stanols which contain at least two of the following compounds: ⁇ -sitosterol, campesterol, ⁇ -sitostanol and / or campestanol, which have the following formula, are particularly suitable for the purposes of the invention:
  • phytosterols are derivatized from vegetable oils, in particular from rapeseed oil.
  • the sterol mixtures sold under the trade names General TM 100 and General TM 122 by Cognis Corporation are particularly suitable.
  • General TM 100 is a mixture that is rich in beta-sitosterol, campesterol and stigmasterol (approx. 80% by weight) and additionally Brassicasterol (approx. 5% by weight), stigmastanol (approx. 12% by weight) and campestanol ( 100% by weight) contains.
  • General TM 122 is also a mixture that contains 40 to 55% by weight beta-sitosterol, 20 to 28% by weight campesterol, 14 to 23% by weight stigmasterol and, if necessary, additionally 0 to 8% by weight brassicasterol, 0 to 5% by weight % Stigmastanol and 0 to 2% by weight campestanol contains.
  • General R TM a mixture of 40-60% by weight beta-sitosterol, 30-45% by weight campesterol and 8-18% by weight brassicasterol, 0-, is also particularly suitable.
  • the sterols and / or stanols are esterified with ether carboxylic acids of the formula (I), i.e. the hydroxyl group of the sterols and / or stanols forms an ester group with the ether carboxylic acid.
  • ether carboxylic acids known per se is based on alcohols, which may be alkoxylated in the first process step and then carboxymethylated with a halocarboxylic acid or its salts. This method is described, for example, in German Patent DE-C-197 40 954.
  • the alcohols on which the later ether carboxylic acid is based can be aliphatic, cycloaliphatic or also aromatic in nature and both saturated and unsaturated. Have proven themselves linear aliphatic alcohols with 1 to 36 carbon atoms which optionally carry another functional group (ie R in formula (I) represents a linear alkyl radical with 1 to 36 carbon atoms which may be derived from an alcohol and optionally carry further functional groups).
  • the other functional groups are preferably hydroxyl groups, in particular terminal hydroxyl groups.
  • the alcohols on which the ether carboxylic acids are based can be diols, ie difunctional alcohols, which preferably have 2 to 36 carbon atoms.
  • R stands for an alkyl radical having 2 to 36 carbon atoms and derived from a difunctional alcohol and bearing a terminal hydroxyl group and having a terminal hydroxyl group.
  • difunctional alcohols are ethylene glycol, propylene glycol, 1, 5-pentanediol, 1, 8-octanediol, 1, 6-hexanediol, 1, 10-decanediol, 1, 12 dodecanediol or the dimer and / or trimer alcohols known to the person skilled in the art.
  • Dimer diol / trimer triols are technical mixtures which are obtained by oligomerizing unsaturated fatty acids having 12 to 22, preferably 16 to 18 carbon atoms or their methyl esters and subsequent high-pressure hydrogenation.
  • the ether carboxylic acids of the general formula (I) are preferably derived from monofunctional aliphatic alcohols.
  • suitable primary monofunctional straight-chain alcohols are hexanol, heptanol, octanol, nonanol, decanol, undecanol, dodecanol, tridecanol, tetradecanol, pentadecanol, hexadecanol, heptadecanol, octadecanol, nonadecanol, eicosanol, docosanol, tetracosanol, 10-undecanol ol, oleyl alcohol, elaidyl alcohol, ricinol alcohol, linoleyl alcohol, linolenyl alcohol, gadoleyl alcohol, arachidone alcohol, eruca alcohol, brassidyl alcohol.
  • Suitable primary monofunctional branched alcohols are isononyl alcohol, isotridecyl alcohol or Guerbet alcohols, which are known to be obtainable by dimerizing fatty alcohols and are structurally characterized in that they have a longer alkyl radical, preferably with 2 to 12 carbon atoms, in the ⁇ -position to the terminal CH2 ⁇ H group.
  • Suitable Guerbet alcohols are 2-hexyldecanol, 2-octyldodecanol and 2-hexyldecylpalmitate / stearate, 2-ethylhexanol and propylhepanol.
  • ether carboxylic acids which are derived from monofunctional saturated linear alcohols having 1 to 18 carbon atoms, i.e. in the general formula (I), R represents a linear alkyl radical having 1 to 18 carbon atoms and derived from a monofunctional alcohol.
  • R represents a linear alkyl radical having 1 to 18 carbon atoms and derived from a monofunctional alcohol.
  • Particularly suitable are ether carboxylic acids derived from methanol, ethanol, propanol, butanol, capron alcohol, caprylic alcohol, capric alcohol, lauryl alcohol, myristyl alcohol, cetyl alcohol uride / or stearyl alcohol, and their technical mixtures, e.g. derived from the high pressure hydrogenation of technical methyl esters based on fats and oils.
  • Ether carboxylic acids of linear alcohols having 1 to 6 carbon atoms are particularly preferred.
  • the ether carboxylic acids of the general formula (I) optionally contain ring-opened ethylene oxide, propylene oxide and / or butylene oxide units (OAlk), OAlk preferably stands for the ethylene oxide unit OCH2CH2.
  • the degree of alkoxylation of the ether carboxylic acids of the general formula (I) is through "N" reproduced, which is of course a purely statistical measure.
  • E preferably stands for a number from 1 to 20, preferably from 3 to 15.
  • ether carboxylic acids are commercially available, for example from Firm a Kao under the trade name Akypo TM, such as Akypo LF 1 TM (ether carboxylic acid based on octanol, ethoxylated with 5 mol of ethylene oxide) Akypo LF 2 TM (ether carboxylic acid based on octanol, ethoxylated with 8 Moles of ethylene oxide), Akypo RLM 100 TM (ether carboxylic acid based on C12 / 14 alcohol, ethoxylated with 10 moles of ethylene oxide).
  • Akypo TM such as Akypo LF 1 TM (ether carboxylic acid based on octanol, ethoxylated with 5 mol of ethylene oxide)
  • Akypo LF 2 TM ether carboxylic acid based on octanol, ethoxylated with 8 Moles of ethylene oxide
  • the sterol and / or stanol esters according to the invention are prepared by esterification of the sterols and / or stanols with ether carboxylic acids or their salts of the formula (II) in the presence of an esterification catalyst.
  • the sterols and / or stanols and ether carboxylic acids are used in molar amounts from 2: 1 to 1: 2, preferably from 1.5: 1 to 1: 1, 5 and in particular from 1.3: 1 to 1: 1, 3 used.
  • the esterification is carried out in the presence of known esterification catalysts such as zinc oxalate, zinc oxide or calcium oxide. Reaction temperatures above the melting point and below the decomposition point of the sterols and / or stanols, preferably between 190 and 230 ° C., are recommended.
  • the degree of esterification can be read from the acid number according to DIN 53402, the esterification being able to be regarded as practically complete if the residual acid number (SZ) is below 10, preferably below 5. If there is an excess of acid component, the procedure can be analogous.
  • the reaction time is about 4 to 6 hours, the amount of catalyst, reaction temperature and residual hydroxyl number being parameters which also determine.
  • the esterification can be carried out in vacuo. It may also be advantageous to dry the starting materials before the actual esterification.
  • the ether carboxylic acid esters of sterols and / or stanols according to the invention are liquid or waxy products which are easy to melt. Furthermore, the compounds according to the invention can be easily emulsified in water without the need to add emulsifiers, ie they are self-emulsifiable in water. Because of these advantageous properties compared to the sterols and / or stanols, the ether carboxylic acid esters of the sterols and / or stanols according to the invention are a source of sterol and / or stanol, ie they can be used in the same fields of application as the sterols and / or stanols.
  • the ether carboxylic acid esters of sterols and / or stanols as raw material in the fermentative production of 4-androstene-3,17-dione (AD) and / or 4-androstadiene-3, 17-dione (ADD), which in turn is further used to produce the Various steroid derivatives such as testosterone, estradiol, ethyltradiol, testolactone, progesterone, cortisone, cortisol, prednisone or even prednisolone can be used.
  • AD 4-androstene-3,17-dione
  • ADD 4-androstadiene-3, 17-dione
  • Various steroid derivatives such as testosterone, estradiol, ethyltradiol, testolactone, progesterone, cortisone, cortisol, prednisone or even prednisolone can be used.
  • the ether carboxylic acid esters of sterols and / or stanols can be used as emulsifiers, in particular in cosmetic compositions and in foods. They are suitable as emulsifiers for O / W and for W / O emulsions. The amount used depends on the intended use and is generally 0.1 to 10% by weight, preferably 0.5 to 5% by weight, based on the agent. Combinations with other emulsifiers known from the prior art are particularly preferably used. Other suitable emulsifiers are, for example, nonionic surfactants from at least one of the following groups:
  • Partial esters of polyglycerol (average degree of self-condensation 2 to 8), polyethylene glycol (molecular weight 400 to 5000), trimethylolpropane, pentaerythritol, sugar alcohols (e.g. sorbitol), alkyl glucosides (e.g. methyl glucoside, butyl glucoside, lauryl glucoside) and polyglucose (e.g.
  • polyglucose saturated and / or unsaturated, linear or branched fatty acids with 12 to 22 carbon atoms and / or hydroxycarboxylic acids with 3 to 18 carbon atoms and their adducts with 1 to 30 moles of ethylene oxide; > Mixed esters of pentaerythritol, fatty acids, citric acid and fatty alcohol and / or mixed esters of fatty acids with 6 to 22 carbon atoms, methyl glucose and polyols, preferably glycerol or polyglycerol.
  • Block copolymers e.g. Polyethylene glycol 30 dipolyhydroxystearate;
  • Polymer emulsifiers e.g. Pemulen types (TR-1, TR-2) from Goodrich;
  • Another use of the sterol and / or stanol esters of ether carboxylic acids relates to their use as a cosmetic active ingredient.
  • the sterol and / or stanol esters of ether carboxylic acids according to claim 1 can be used as a hypocholesterolene active ingredient, in particular in foods and / or food supplements.
  • the compounds in foods such as margarine, salad oils and frying oils can be added according to the abovementioned documents, preferably in amounts of 0.1 to 10% by weight, based on the agent.
  • a reduction in the cholesterol level in the blood of humans and animals is achieved by the addition of the esters mentioned and the cleavage of the esters caused by lipases in the body and the release of the sterol thus achieved.
  • Generol R TM from Cognis Deutschland GmbH & Co. KG is a mixture of phytosterols based on 40-60% by weight ß-sitosterol, 30-45% by weight campesterol and 8-18% by weight brassicasterol, 0-5 % By weight stigmasterol, 0-5% stigmastanol, 0-5% by weight ergostanol and a total content of 90-100% by weight. Melting range 130-145 ° C.
  • the remaining acid number can be explained by incomplete conversion.
  • a wax-like ether carboxylic acid ester with a melting range of 30 to 40 ° C. and the characteristics given in Table 1 were obtained.
  • the following table 1 shows the characteristic data of the ether carboxylic acid esters obtained for the sterol mixture used.
  • the saponification number (VZ) was determined according to DGF C-V 3.
  • the hydroxyl number (OHZ) was determined according to DGF C-V 17a.
  • the acid number (SZ) was determined according to DIN 53402
  • O / W emulsions were produced by a conventional hot process, in which the oil phase containing emulsifiers, fatty alcohols and an emollient was heated to 80 ° C. and homogenized using a stirrer. At this temperature, a glycerol / water pi was likewise heated to 80 ° C. with stirring Phase introduced. The mixture was cooled with stirring, formalin being added for preservation.
  • the emulsions were examined with regard to viscosity (Brookfield RVF, spindle 5 at 10 rpm) and stability (optical scale from 1 to 5, 1 being the best grade; after storage for 1 week at -5 or 40 ° C.).
  • compositions of the O / W emulsions (quantities in g) and their evaluation can be found in Table 2 below:
  • Mycobacterium sp. NRRL B-3805 cells were kept in potato dextrose agar in a slant agar tube (42 gM). inoculum; Mycobacterium sp. NRRL B-3805 cells were incubated for three days at 30 ° C in complex medium A from yeast extract (10 gM), glycerin (10 gM), sterol ester (1, 0 gM, unless otherwise stated), Tween 20 ( 0.8 gM) in a potassium phosphate buffer solution with a pH of 7 (20 mM).
  • the cells were then placed in 20 ml or 160 ml of the same medium A. After growth for 24 hours, medium A was used to inoculate 1.4 l (2 l fermenter tank (B Braun Biostat MD). During the fermentation, air was gassed (gassing rate 0.5 vvm), and the pH of the fermentation medium was adjusted adjusted to pH 7 by adding NaOH (2 N) or H2SO4 (2 N). Samples were taken to check the AD concentration formed.
  • a sample of the ester from Example 1 was saponified according to the following procedure: approx. 1 g of each ester was added to 25 ml of a 0.5 M ethanolic solution of KOH and incubated at 28 ° C. overnight. 25 ml of a NaCl (5% by weight) solution was then added and the whole was extracted with 25 ml of diethyl ether. The organic phase was evaporated and the dry residue was obtained. NEN. About 6 mg of the saponified sample was dissolved in the internal standard solution and quantitatively examined for sterols by means of HPLC.
  • Samples were taken and saponified during the fermentation experiment as follows: 2.5 ml of a 0.5 M ethanolic KOH solution were added to 500 ml of a fermentation sample and incubated at 28 ° C. overnight. 25 ml of a 5% strength by weight NaCl solution were then added and the whole was extracted with 25 ml of diethyl ether. The organic phase was evaporated; the dry residue obtained was dissolved in 1 ml of internal standard solution and examined quantitatively for sterols by means of HPLC.
  • HPLC analysis (Lichrospher Si-60 column, 10 Om particle size) was carried out at 1 ml min- 1 flow rate in order to determine the substrate and product concentration (UV detection at 215 and 254 nm).
  • the mobile phase consisted of (v / v) n-heptanes (96): ethanol (4).

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Abstract

Vorgeschlagen werden neue Sterol- und/oder Stanolester von ethercarbonsäuren der allgemeinen Formel (I): R(OAlk)nOCH2COOH, in der R für einen von einem Alkohol abgeleiteten Alkyl-, Alkenyl- und/oder Alkylphenylrest mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen, OAlk für ringgeöffnete Ethylen-, Propylen- und/oder Butylenoxid-Einheiten und n für Zahlen von 0 bis 100 steht.

Description

"Ethercarbonsäureester von Sterolen bzw. Stanolen"
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung befindet sich auf dem Gebiet der Ester von Sterolen und/oder Stanolen und betrifft neue Ethercarbonsäureester, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie die Verwendung dieser Ester.
Stand der Technik
In den letzten Jahren wurde den Sterolen, insbesondere den Phytosterolen, verstärkte Aufmerksamkeit zu teil. So werden diese in hohem Maße bei der Fermentation zu Steroid-Zwischenstufen wie Androstendion eingesetzt, das wiederum durch meist chemische Modifikationen in pharmazeutisch wirksame Steroide wie Testeron, Estradiol, Testolacton oder Cortison überführt wird. Weiterhin haben Phytosterole die vorteilhafte Eigenschaft, den Cholesterinspiegel im Blut des Menschen zu senken, weshalb sie und ihre Fettsäureester als Nahrungsmittelzusatzstoff zur Anwendung kommen.
Als eines der wesentlichen Probleme bei der Verwendung der Sterole und der durch Hydrierung erhältlichen Stanole hat sich deren äußerst geringe Löslichkeit in Wasser und nur geringe Löslichkeit in Fetten erwiesen. Ein Weg zur Herstellung wässriger Dispersionen sieht die Partikelgrößenreduzierung der Sterole mittels verschiedenster Hochdruckhomogenisatoren vor. So ist aus der internationalen Anmeldung WO 00/45648 die Herstellung von Mikropartikeln von Phytosterolen unter anderem auch in einem wässrigen Medium durch Einsatz starker Scherkräfte erzeugender Apparaturen wie Kolloidmühlen bekannt.
Eine andere Möglichkeit wässrige Dispersionen von Sterolen herzustellen, ist der Einsatz von Emulga- to en mit meist anschließender Homogenisierung, beispielsweise gemäß dem Europäischen Patent EP- B- 897 671.
Sterolderivate, die eine verbesserte Löslichkeit in Fetten aufweisen, sind aus der Europäischen Patentanmeldung EP-A- 195311 bekannt, die durch eine Veresterung von Phytosterolen und verzweigten aliphatischen Alkoholen mit Fettsäuren oder Fettsäureestern in Gegenwart von Lipasen hergestellt werden können. Die Deutsche Patentanmeldung DE-A- 2 035 069 offenbart klare Brat- und Salatöle, enthaltend Carbonsäureester von Phytosterolen hergestellt durch Acylation mittels Perchlorsäure als Katalysator.
Aus der internationalen Patentanmeldung WO 92/19640 wiederum sind ß-Sitostanolfettsäureester bekannt, die durch Umesterung von ß-Sitostanol mit Fettsäureester in Gegenwart von Umesterungskata- lysatoren hergestellt werden.
Aufgabe der vorliegenden Anmeldung war es, Sterolderivate und/oder Stanolderivate bereitzustellen, die in Wasser in möglichst hohen Mengen und möglichst ohne aufwendige Hochdruckhomogenisierungsapparate dispergierbar sind, um breite Anwendungsmöglichkeiten zu erschließen. Gleichzeitig sollten die Derivate selbstdispergierbar sein, d.h. die Anwesenheit von Emulgatoren zur Herstellung wässriger Dispersionen sollte nicht notwendig, sondern lediglich fakultativ sein. Weiterhin sollten die Derivate möglichst einen niedrigeren Schmelzpunkt als die Sterole und/oder Stanole selber aufweisen, beispielsweise um fermentative Folgereaktionen zu erleichtern. Schließlich galt es Derivate zur Verfügung zu stellen, die in wässrigen Medien bei Bedarf unter kontrollierten Bedingungen die Sterole und/oder Stanole wieder freizusetzen vermögen.
Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung sind Sterol- und/oder Stanolester von Ethercarbonsäuren der allgemeinen Formel (I)
R(OAIk)nOCH2COOH (I),
in der R für einen von einem Alkohol abgeleiteten Alkyl-, Alkenyl- und/oder Alkylphenylrest mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen, OAlk für ringgeöffnete Ethylenoxid-, Propylenoxid- und/oder Butylenoxid-Einheiten, und n für Zahlen von 0 bis 100 steht.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Sterol- und/oder Stanolestern von Ethercarbonsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass Sterole und/oder Stanole mit Ethercarbonsäuren bzw. deren Salze der Formel (II)
R(OAIk)nOCH COOX (II),
in der R für einen von einem Alkohol abgeleiteten Alkyl-, Alkenyl- und/oder Alkylphenylrest mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen, Oalk für ringgeöffnete Ethylenoxid-, Propylenoxid und/oder Butylenoxid-Einheiten, n für Zahlen von 0 bis 100 und X für Wasserstoff oder ein Alkalimetall steht, in Anwesenheit eines Veresterungskatalysators verestert werden. Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung betreffen die Verwendung von Sterol- und/oder Stanolester von Ethercarbonsäuren nach Formel (I) als Sterol- und/oder Stanol-Quelle, vorzugsweise als Rohstoff zur Herstellung von Steroid Vorstufen, insbesondere zur fermentativen Herstellung von 4- Androsten- 3,17-dion (AD) und/oder 4-Androstadien-3,17-dion (ADD), als Emulgatoren, insbesondere in kosmetischen Zusammensetzungen und in Nahrungsmitteln, als kosmetischer Wirkstoff und schließlich als hypocholesterinänischer Wirkstoff, insbesondere in Nahrungsmitteln und/oder Nahrungsergän- zungsmitteln.
Sterole und Stanole
Sterole, die auch häufig als Sterine bezeichnet werden, sind Steroide mit 27 bis 30 Kohlenstoffatomen mit einer Hydroxylgruppe am dritten Kohlenstoffatom. In der Regel weisen Sterole auch eine Doppelbindung auf. Stanole sind die entsprechenden gesättigten Sterolverbindungen, die keine Doppelbindung aufweisen. Die Sterole sind in der Natur frei, als Ester oder Glykoside sehr verbreitet. Dabei werden tierische Sterole, sogenannte Zoosterine, pflanzliche Sterole, sogenannte Phytosterole und Sterole von Pilzen, sogenannte Mykosterine, unterschieden. Im Sinne der vorliegenden Erfindung sind prinzipiell alle Sterole bzw. Stanole geeignet, vorzugsweise die Phytosterole bzw. deren hydrierte Stanolver- bindungen. Bevorzugt werden Phytosterole, die hauptsächlich eine oder mehrere der folgenden Verbindungen enthalten: ß-Sitosterol, Campesterol, Stigmasterol, Brassicasterol, Stigmastanol und Cam- pestanol.
Insbesondere geeignet sind im Sinne der Erfindung Mischungen von Sterolen und/oder Stanolen, die mindestens zwei der folgenden Verbindungen: ß-Sitosterol, Campesterol, ß-Sitostanol und/oder Cam- pestanol enthalten, die folgende Formel aufweisen:
ß-Sitosterol
Campesterol
Campestanol
Sitostanol
Ganz besonders bevorzugt im Sinne der vorliegenden Erfindung werden Phytosterole derivatisiert von pflanzlichen Ölen, insbesondere von Rapsöl. Insbesondere geeignet sind die unter dem Handelsnamen General ™100 und General ™122 von der Cognis Corporation vertriebenen Sterolmischungen. General ™ 100 ist eine Mischung, die reich an Beta-Sitosterol, Campesterol und Stigmasterol ist (ca. 80 Gew.%) und zusätzlich Brassicasterol (ca. 5 Gew.%), Stigmastanol (ca. 12 Gew.%) and Campestanol (Rest zu 100 Gew.%) enthält. General ™122 ist ebenfalls eine Mischung, die 40 bis 55 Gew.% beta-Sitosterol, 20 bis 28 Gew.% Campesterol, 14 bis 23 Gew.% Stigmasterol und ggf. zusätzlich 0 bis 8 Gew.% Brassicasterol, 0 bis 5 Gew.% Stigmastanol und 0 bis 2 Gew.% Campestanol enthält. Weiterhin insbesondere geeignet ist das von der Cognis Deutschland GmbH & Co. KG vertriebene General R™, eine Mischung aus 40-60 Gew.% beta-Sitosterol, 30-45 Gew.% Campesterol und 8-18 Gew.% Brassicasterol, 0-5 Gew.% Stigmasterol, 0-5 % Stigmastanol, 0-5 Gew.% Ergostanol und einem Gesamtgehalt von 90- 100 Gew.%.
Ethercarbonsäuren
Im Sinne der Erfindung sind die Sterole und/oder Stanole verestert mit Ethercarbonsäuren der Formel (I), d.h. die Hydroxylgruppe der Sterole und/oder Stanole bildet mit der Ethercarbonsäure eine Estergruppe.
Zur Herstellung der an und für sich bekannten Ethercarbonsäuren geht man von Alkoholen aus, die im ersten Verfahrensschritt ggf. alkoxyliert, und anschließend mit einer Halogencarbonsäure oder deren Salze carboxymethyliert werden. Dieses Verfahren wird beispielsweise in der deutschen Patentschrift DE-C-197 40 954 beschrieben.
Die Alkohole, die der späteren Ethercarbonsäure zugrunde liegen, können aliphatischer, cycloaliphati- scher oder auch aromatischer Natur und sowohl gesättigt oder ungesättigt sein. Bewährt haben sich lineare aliphatische Alkohole mit 1 bis 36 Kohlenstoffatomen, die ggf. eine weitere funktionelle Gruppe tragen (d.h. R in Formel (I) steht für einen von einem Alkohol abgeleiteten linearen ggf. weitere funktionelle Gruppen tragenden Alkylrest mit 1 bis 36 Kohlenstoffatomen). Bei den weiteren funktioneilen Gruppen handelt es sich vorzugsweise um Hydroxylgruppen, insbesondere um endständige Hydroxylgruppen. Mit anderen Worten kann es sich bei den Ethercarbonsäuren zugrunde liegenden Alkoholen um Diole, also difunktionelle Alkohole handeln, die vorzugsweise 2 bis 36 Kohlenstoffatome aufweisen. Für diesen Fall steht in der allgemeinen Formel (I) R für einen von einem difunktionellen Alkohol abgeleiteten linearen endständig Hydroxylgruppe tragenden Alkylrest mit 2 bis 36 Kohlenstoffatomen. Beispiele für derartige difunktionelle Alkohole sind Ethylenglykol, Propylenglykol, 1 ,5- Pentandiol, 1 ,8- Octandiol, 1 ,6-Hexandiol,1 ,10-Decandiol, 1 ,12 Dodecandiol oder die dem Fachmann bekannten Dimer- und/oder Trimeralkohole. Unter Dimerdiol/Trimertriolen sind technische Gemische zu verstehen, die durch Oligomerisierung von ungesättigten Fettsäuren mit 12 bis 22, vorzugsweise 16 bis 18 Kohlenstoffatomen oder deren Methylester und nachfolgende Hochdruckhydrierung erhalten werden.
Bevorzugt im Sinne der Erfindung leiten sich die Ethercarbonsäuren der allgemeinen Formel (I) ab von monofunktionellen aliphatischen Alkoholen. Beispiele für geeignete primäre monofunktionelle geradket- tige Alkohole sind Hexanol, Heptanol, Octanol, Nonanol, Decanol, Undecanol, Dodecanol, Tridecanol, Tetradecanol, Pentadecanol, Hexadecanol, Heptadecanol, Octadecanol, Nonadecanol, Eicosanol, Docosanol, Tetracosanol, 10-Undecen-1-ol, Oleylalkohol, Elaidylalkohol, Ricinolalkohol, Linoleylalkohol, Linolenylalkohol, Gadoleylalkohol, Arachidonalkohol, Erucaalkohol, Brassidylalkohol. Beispiele für geeignete primäre monofunktionelle verzweigte Alkohole sind Isononylalkohol, Isotridecylalkohol oder Guerbetalkohole, die bekanntlich durch Dimerisierung von Fettalkoholen zugänglich sind und sich strukturell dadurch auszeichnen, dass sie in α-Stellung zur endständigen CH2θH-Gruppe einen längeren Alkylrest vorzugsweise mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen aufweisen. Geeignete Guerbetalkohole sind 2-Hexyldecanol, 2-Octyldodecanol und 2-Hexyldecylpalmitat/stearat, 2-Ethylhexanol und Propylhepta- nol.
Bevorzugt im Sinne der Erfindung werden Ethercarbonsäuren, die sich von monofunktionellen gesättigten linearen Alkoholen mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen ableiten, d.h. in der allgemeinen Formel (I) steht R für einen von einem monofunktionellen Alkohol abgeleiteten linearen Alkylrest mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen. Insbesondere geeignet sind Ethercarbonsäuren, die sich von Methanol, Ethanol, Propa- nol, Butanol, Capronalkohol, Caprylalkohol, Caprinalkohol, Laurylalkohol, Myristylalkohol, Cetylalkohol urid/oder Stearylalkohol, sowie deren technische Mischungen, die z.B. bei der Hochdruckhydrierung von technischen Methylestern auf Basis von Fetten und Ölen anfallen ableiten. Insbesondere bevorzugt sind Ethercarbonsäuren von linearen Alkoholen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
Die Ethercarbonsäuren der allgemeinen Formel (I) enthalten gegebenenfalls ringgeöffnete Ethylenoxid-, Propylenoxid- und/oder Butylenoxid-Einheiten (OAlk), vorzugsweise steht OAlk für die Ethylenoxid- Einheit OCH2CH2. Der Alkoxylierungsgrad der Ethercarbonsäuren der allgemeinen Formel (I) ist durch „n" wiedergegeben, wobei es sich selbstverständlich um ein reines statistisches Maß handelt. evorzugt steht n für eine Zahl von 1 bis 20, vorzugsweise von 3 bis 15.
Besonders geeignete Ethercarbonsäuren sind kommerziell erhältlich beispielsweise von der Firm a Kao unter dem Handelsnamen Akypo™, wie Akypo LF 1 ™ (Ethercarbonsäure auf Basis von Octanol, ethoxyliert mit 5 Mol Ethylenoxid) Akypo LF 2 ™ (Ethercarbonsäure auf Basis von Octanol, ethoxyliert mit 8 Mol Ethylenoxid), Akypo RLM 100 ™ (Ethercarbonsäure auf Basis von C12/14-Alkohol, ethoxyliert mit 10 Mol Ethylenoxid).
Verfahren zur Herstellung von Sterol- und/oder Stanolestern von Ethercarbonsäuren
Die erfindungsgemäßen Sterol- und/oder Stanolester werden durch Veresterung der Sterole und/oder Stanole mit Ethercarbonsäuren bzw. deren Salze der Formel (II) in Anwesenheit eines Veresterungskatalysators hergestellt.
In der Regel werden die Sterole und/oder Stanole und Ethercarbonsäuren in molaren Mengen von 2: 1 bis 1 : 2, vorzugsweise von 1 ,5: 1 bis 1 : 1 ,5 und insbesondere von 1 ,3 : 1 bis 1: 1 ,3 eingesetzt. Um eine möglichst vollständige Veresterung zu erhalten, empfiehlt es sich die Ethercarbonsäure in leichtem Überschuß einzusetzen. Die Veresterung wird in Anwesenheit bekannter Veresterungskatalysatoren wie Zinkoxalat, Zinkoxid oder Calciumoxid durchgeführt. Es empfehlen sich Reaktionstemperaturen über den Schmelzpunkt und unterhalb des Zersetzungspunktes der Sterole und/oder Stanole, vorzugsweise zwischen 190 und 230 °C. Bei einem Überschuss an Alkoholkomponente kann anhand der Säurezahl nach DIN 53402 der Grad der Veresterung abgelesen werden, wobei die Veresterung bei einer Restsäurezahl (SZ) unter 10, vorzugsweise unter 5, als praktisch vollständig angesehen werden kann. Bei einem Überschuss an Säurekomponente kann analog verfahren werden.
In der Regel beträgt die Reaktionszeit in etwa 4 bis 6 Stunden, wobei die Einsatzmenge an Katalysator, Reaktionstemperatur und Resthydroxylzahl mitbestimmende Parameter sind. Falls gewünscht kann die Veresterung im Vakuum durchgeführt werden. Weiterhin kann es vorteilhaft sein, vor der eigentlichen Veresterung die Ausgangsstoffe zu trocknen.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Die erfindungsgemäßen Ethercarbonsäureester der Sterole und/oder Stanole sind flüssige oder wachsartige Produkte, die leicht zu schmelzen sind. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Verbindungen leicht in Wasser emulgiert werden, ohne dass es eines Zusatzes von Emulgatoren bedarf, d.h. sie sind in Wasser selbstemulgierbar. Aufgrund dieser gegenüber den Sterolen und/oder Stanolen vorteilhaften Eigenschaften sind die erfindungsgemäßen Ethercarbonsäureester der Sterole und/oder Stanole eine Sterol- und/oder Stanolquelle, d.h. sie können in den gleichen Anwendungsgebieten wie die Sterole und/oder Stanole eingesetzt werden. Bevorzugt im Sinne der Erfindung werden die Ether- carbonsäureester der Sterole und/oder Stanole einerseits als Rohstoff bei der fermentativen Herstellung von 4-Androsten-3,17-dion (AD) und/oder 4-Androstadien-3, 17-dion (ADD) verwendet, welche wiederum weiter zur Herstellung der verschiedensten Steroidderivate wie Testosteron, Estradiol, Ethi- nylestradiol, Testolactone, Progesterone, Cortison, Cortisol, Prednison oder auch Prednisolon eingesetzt werden können. Bei der fermentativen Herstellung von AD und ADD werden die Ethercarbonsäureester der Sterole und/oder Stanole analog den Bedingungen aus der Deutschen Offenlegungsschrift DE 3147834-A, die die Fermentation von Cholesterin unter Zusatz von ethoxylierten Sterolen beschreibt, umgesetzt und aufgearbeitet. Weitergehende Informationen sind dem Fachmann aus dem Artikel von P. Fernandez et al., „Microbial conversion of steroid compounds: recent developments", aus Enzyme and Microbial Techn. 32 (2003), 688-705 zugänglich. Zur Nutzung der genannten Substanzen als Sterinquelle ist auf die Anwesenheit von Lipasen zur Esterspaltung zu achten.
Aufgrund seiner selbstemulgierenden Eigenschaften können die Ethercarbonsäureester der Sterole und/oder Stanole als Emulgatoren, insbesondere in kosmetischen Zusammensetzungen und in Nahrungsmitteln verwendet werden. Dabei sind sie als Emulgatoren für O/W- und für W/O-Emulsionen geeignet. Die Einsatzmenge richtet sich nach dem Anwendungszweck und liegt in der Regel bei 0,1 bis 10 Gew.%, vorzugsweise 0,5 bis 5 Gew.%, bezogen auf Mittel. Besonders bevorzugt werden Kombinationen mit weiteren aus dem Stand der Technik bekannten Emulgatoren verwendet. Als weitere Emulgatoren eignen sich beispielsweise nichtionogene Tenside aus mindestens einer der folgenden Gruppen:
> Anlagerungsprodukte von 2 bis 30 Mol Ethylenoxid und/ oder 0 bis 5 Mol Propylenoxid an lineare Fettalkohole mit 8 bis 22 C-Atomen, an Fettsäuren mit 12 bis 22 C-Atomen, an Alkylphenole mit 8 bis 15 C-Atomen in der Alkylgruppe sowie Alkylamine mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen im Alkylrest; Alkyl- und/oder Alkenyloligoglykoside mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen im Alk(en)ylrest und deren ethoxylierte Analoga; Anlagerungsprodukte von 1 bis 15 Mol Ethylenoxid an Ricinusöl und/oder gehärtetes Ricinusöl;
> Anlagerungsprodukte von 15 bis 60 Mol Ethylenoxid an Ricinusöl und/oder gehärtetes Ricinusöl; Partialester von Glycerin und/oder Sorbitan mit ungesättigten, linearen oder gesättigten, verzweigten Fettsäuren mit 12 bis 22 Kohlenstoffatomen und/oder Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 18 Kohlenstoffatomen sowie deren Addukte mit 1 bis 30 Mol Ethylenoxid;
> Partialester von Polyglycerin (durchschnittlicher Eigenkondensationsgrad 2 bis 8), Polyethy- lenglycol (Molekulargewicht 400 bis 5000), Trimethylolpropan, Pentaerythrit, Zuckeralkoholen (z.B. Sorbit), Alkylglucosiden (z.B. Methylglucosid, Butylglucosid, Laurylglucosid) sowie Polyglu- cosiden (z.B. Cellulose) mit gesättigten und/oder ungesättigten, linearen oder verzweigten Fettsäuren mit 12 bis 22 Kohlenstoffatomen und/oder Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 18 Kohlenstoffatomen sowie deren Addukte mit 1 bis 30 Mol Ethylenoxid; > Mischester aus Pentaerythrit, Fettsäuren, Citronensäure und Fettalkohol und/oder Mischester von Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, Methylglucose und Polyolen, vorzugsweise Gly- cerin oder Polyglycerin.
> Mono-, Di- und Trialkylphosphate sowie Mono-, Di- und/oder Tri-PEG-alkylphosphate und deren Salze;
> Wollwachsalkohole;
> Polysiloxan-Polyalkyl-Polyether-Copolymere bzw. entsprechende Derivate;
> Block-Copolymere z.B. Polyethylenglycol-30 Dipolyhydroxystearate;
> Polymeremulgatoren, z.B. Pemulen-Typen (TR-1 ,TR-2) von Goodrich;
> Polyalkylenglycole sowie
> Glycerincarbonat.
Eine weitere Verwendung der Sterol- und/oder Stanolester von Ethercarbonsäuren betrifft die Verwendung als kosmetischer Wirkstoff.
Weiterhin können die Sterol- und/oder Stanolester der Ethercarbonsäuren nach Anspruch 1 als hypo- cholesterinänischer Wirkstoff, insbesondere in Nahrungsmitteln und/oder Nahrungsergänzungsmitteln verwendet werden. So können beispielsweise die Verbindungen in Nahrungsmitteln wie Margarine, Salatöle und Bratöle gemäß den o.g. Schriften, vorzugsweise in Mengen von 0,1 bis 10 Gew.% bezogen auf Mittel zugesetzt werden. Durch die Zugabe der genannten Ester und die durch Lipasen im Körper bewirkte Spaltung der Ester und die somit erwirkte Freisetzung des Sterins wird eine Reduzierung des Cholesterinspiegels im Blut von Mensch und Tier erzielt.
Beispiele
Generol R™ der Fa. Cognis Deutschland GmbH & Co. KG ist eine Mischung von Phytosterolen auf Basis von 40-60 Gew.% ß-Sitosterol, 30-45 Gew.% Campesterol und 8-18 Gew.% Brassicasterol, 0-5 Gew.% Stigmasterol, 0-5 % Stigmastanol, 0-5 Gew.% Ergostanol und einem Gesamtgehalt von 9O-100 Gew.%. Schmelzbereich 130-145 °C.
Beispiel 1
In einem Reaktionskolben wurden 0,5 mol (212,3 g) Generol R™ der Fa. Cognis Deutschland GmbH & Co. KG (Kenndaten: OHZ 132; mittleres Molekulargewicht berechnet aus der OHZ = 425,1 g /mol) und 0,65 mol (308,1 g) der Ethercarbonsäure Akypo™ LF 1 von Kao (Ethercarbonsäure auf Basis von n- Octanol, ethoxyliert mit 5 Mol Ethylenoxid; Säurezahl 118 und mittleres Molekulargewicht 474,4 g/mol) bei 140°C eine Stunde getrocknet. Anschließend wurden 0,8 g (0,15 Gew.%) Calciumoxid als Veresterungskatalysator zugesetzt und im Wasserstrahlvakuum 5 Stunden bei 200° C umgesetzt. Nach dem Abkühlen auf ca. 60 °C wurde das Produkt über eine Nutsche abfiltriert.
Man erhielt einen bei Raumtemperatur flüssigen Ethercarbonsäureester mit den in Tabelle 1 wiedergegebenen Kenndaten. Aus der Differenz der Verseifungs- und Säurezahl ist klar erkennbar, dass eine Veresterung erfolgte.
Die restliche Säurezahl erklärt sich durch nicht vollständige Umsetzung.
Beispiel 2
Analog Beispiel 1 wurden 0,5 mol Generol R™ der Fa. Cognis Deutschland GmbH & Co. KG und 0,65 mol Akypo LF 2™ (Ethercarbonsäure auf Basis eines Octanols ethoxyliert mit 8 Mol Ethylenoxid; Säurezahl 96,4) umgesetzt.
Man erhielt einen wachsartigen Ethercarbonsäureester mit einem Schmelzbereich von 30 bis 40 °C und den in Tabelle 1 angegebenen Kenndaten.
Beispiel 3
Analog Beispiel 1 wurden 0,5 mol Generol R™ der Fa. Cognis Deutschland GmbH & Co. KG und 0,65 mol Akypo RLM 100™ (Ethercarbonsäure auf Basis eines C12/C14 Alkohols ethoxyliert mit 10 Mol Ethylenoxid; Aktivsubstanzgehalt 85 Gew.%, Säurezahl 74) umgesetzt.
Man erhielt einen wachsartigen Ethercarbonsäureester mit einem Schmelzbereich von 30 bis 40 °C und den in Tabelle 1 angegebenen Kenndaten.
Beispiel 4
10 g der in den Beispielen 1 bis 3 hergestellten Ethercarbonsäureester wurden mit 90 g Wasser versetzt und umgerührt. In allen Fällen erhielt man wässrige beige-farbene Emulsionen mit geringem Bodensatz. Da keine weiteren Emulgatoren zugegeben werden mussten, sind die Ester selbstemulgierend in Wasser.
In der folgenden Tabelle 1 sind die Kenndaten der erhaltenen Ethercarbonsäureester der eingesetzten Sterolmischung angegeben.
Die Verseifungszahl (VZ) wurde bestimmt gemäß DGF C-V 3 Die Hydroxylzahl (OHZ) wurde bestimmt gemäß DGF C-V 17a Die Säurezahl (SZ) wurde bestimmt gemäß DIN 53402
Tabelle 1: Kenndaten
Beispiel 5
Herstellung von O/W- Emulsionen
Es wurden nach einem üblichen Heißprozess O/W- Emulsionen hergestellt, in dem die Ölphase enthaltend Emulgatoren, Fettalkohole und ein Emollient auf 80 °C erhitzt und mittels Rührer homogenisiert wurde. Bei dieser Temperatur wurde unter Rühren eine ebenfalls auf 80°C erhitzte Glycerin/Wasser- π Phase eingebracht. Unter Rühren wurde die Mischung abgekühlt, wobei Formalin zur Konservierung beigegeben wurde.
Die Emulsionen wurden hinsichtlich der Viskosität (Brookfield RVF, Spindel 5 mit 10 Upm) und Stabilität (optische Skala von 1 bis 5, wobei 1 die beste Note darstellt; nach 1-wöchiger Lagerung bei -5 bzw. 40°C) untersucht.
Die Zusammensetzungen der O/W- Emulsionen (Mengenangaben in g) und deren Bewertung sind der folgenden Tabelle 2 zu entnehmen:
Tabelle 2: O/W-Emulsionen
Aus Tabelle 2 ist erkennbar, dass die erfindungsgemäßen Ethercarbonsäureester der Sterole alleine Emulgatoreigenschaften aufweisen (Beispiel 5a) und auch in Mischung mit Co-Emulgatoren (Beispiel 5b). Beispiel 6
Biotransformation des Sterol-EO-Ester gemäß Beispiel 1 zu Steroid-Vorstufen
Eingesetzt wurden Hefeextrakt und Kartoffel-Dextrose-Agar der Fa. Difco (USA), Glycerin mit Reinheitsgrad p.a. der Fa. Riedel-de Haen (Deutschland), Tween 20 (Polyethylenglycol-sorbitan- monolaurat) und 4-Androsten-3,17-dion (AD) und 1 ,4-Androstadien-3, 17-dion (ADD) der Fa. Sigma (USA)
Zellkultur: Mycobacterium sp. NRRL B-3805-Zellen wurden in Kartoffel-Dextrose-Agar in einem Schrä- gagarröhrchen (42 gM) gehalten. Inoculum; Mycobacterium sp. NRRL B-3805-Zellen wurden drei Tage lang bei 30°C in einem komplexen Medium A aus Hefeextrakt (10 gM), Glycerin (10 gM), Sterin-Ester (1 ,0 gM, außer wenn anders angegeben), Tween 20 (0,8 gM) in einer Kaliumphosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7 (20 mM) gezüchtet.
Anschließend wurden die Zellen in 20 ml oder 160 ml des selben Mediums A gegeben. Nach einem Wachstum von 24 Stunden wurde das Medium A zur Beimpfung von 1 ,4 I (2 I Fermenterbehälter (B Braun Biostat MD) eingesetzt. Während der Fermentation wurde mit Luft begast (Begasungsrate 0.5 vvm), und der pH-Wert des Fermentationsmediums wurde durch Zugabe von NaOH (2 N) oder H2SO4 (2 N) auf pH 7 geregelt. Es wurden Proben entnommen, um die gebildete AD-konzentration zu überprüfen.
Analytische Methoden
Routinemäßig wurden periodisch Proben des Fermentationsmediums entnommen und mit dem zweifachen Volumen einer Lösung von Progesteron (0,2 gM ) in n-Heptan als interner Standard extrahiert. Die organische Phase wurde auf ihren Sterol-/Steroidgehalt mittels HPLC analysiert.
Eine Probe des Esters aus Beispiel 1 wurde gemäß der folgenden Prozedur verseift: ca. 1 g jedes Esters wurde zu 25 ml einer 0,5 M ethanolischen Lösung von KOH gegeben und über Nacht bei 28°C inkubiert. 25 ml einer NaCI (5 Gew.%) Lösung wurde danach zugegeben und das Ganze mit 25 ml Diethylether extrahiert. Die organische Phase wurde eingedampft und der trockene Rückstand gewon- nen. Ungefähr 6 mg der verseiften Probe wurde n m er internen tandard-Lösung gelöst unq mittels HPLC quantitativ auf Sterine untersucht.
Während des Fermentationsversuchs wurden wie folgt Proben entnommen und verseift: 2,5 ml einer 0,5 M ethanolischen KOH-Lösung wurden zu 500 ml einer Fermentationsprobe zugegeben und über Nacht bei 28°C inkubiert. Danach wurden 25 ml einer 5 Gew.%-igen NaCI-Lösung zugegeben und das Ganze mit 25 ml Diethylether extrahiert. Die organische Phase wurde eingedampft; der gewon nene trockene Rückstand wurde in 1 ml interner Standard-Lösung gelöst und mittels HPLC quantitativ auf Sterine untersucht.
Die HPLC-Analyse (Lichrospher Si-60 Säule, 10 Om Teilchengröße) wurde mit 1 ml min-1 Flussrate durchgeführt, um die Substrat- und Produktkonzentration zu bestimmen (UV-Detektion bei 215 und 254 nm). Die mobile Phase bestand aus (v/v) n-Heptane (96):Ethanol (4).
Nach 130 Std. Fermentationszeit wurden ungefähr 0,6 mM 4-Androsten-3,17-Dion produziert. Dieses Ergebnis zeigt, dass Mycobacterium sp. NRRL B-3805-Zellen in der Lage sind, die Ester erfindungsgemäß in AD zu konvertieren.

Claims

Patentansprüche
1. Sterol- und/oder Stanolester von Ethercarbonsäuren der allgemeinen Formel (I)
R(OAIk)nOCH2COOH (I),
in der R für einen von einem Alkohol abgeleiteten Alkyl-, Alkenyl- und/oder Alkylphenylrest mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen, OAlk steht für ringgeöffnete Ethylen-, Propylen- und/oder Butenyloxid- Einheiten und n für Zahlen von 0 bis 100 steht.
2. Sterol- und/oder Stanolester nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass R für einen von einem Alkohol abgeleiteten linearen ggf. weitere funktioneile Gruppen tragenden Alkylrest mit 1 bis 36 Kohlenstoffatomen steht.
3. Sterol- und/oder Stanolester nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass R für einen von einem monofunktionellen Alkohol abgeleiteten linearen Alkylrest mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen steht.
4. Sterol- und/oder Stanolester nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass R für einen von einem difunktionellen Alkohol abgeleiteten linearen endständig Hydroxylgruppe tragenden Alkylrest mit 2 bis 36 Kohlenstoffatomen steht.
5. Sterol- und/oder Stanolester nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass OAlk für die ringgeöffnete Ethylenoxid-Einheit OCH2CH2 steht.
6. Sterol- und/oder Stanolester nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass n für eine Zahl von 1 bis 20, vorzugsweise von 3 bis 15, steht.
7. Verfahren zur Herstellung von Sterol- und/oder Stanolestern von Ethercarbonsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass Sterole und/oder Stanole mit Ethercarbonsäuren bzw. deren Salze der Formel (II)
R(OAIk)nOCH COOX (II),
in der R für einen von einem Alkohol abgeleiteten Alkyl-, Alkenyl- und/oder Alkylphenylrest mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen, OAlk für ringgeöffnete Ethylen-, Propylen- und/oder Butylenoxid- Einheiten, n für Zahlen von 0 bis 100 und X für Wasserstoff oder ein Alkalimetall steht, in Anwesenheit eines Veresterungskatalysators verestert werden.
8. Verwendung von Sterol- und/oder Stanolester von Ethercarbonsäuren nach Anspruch 1 als Sterol- und/oder Stanol-Quelle, vorzugsweise als Rohstoff zur Herstellung von Steroid Vorstufen, insbesondere zur fermentativen Herstellung von 4-Androsten-3,17-dion (AD) und/oder 4-Androsta ien- 3,17-dion (ADD).
9. Verwendung von Sterol- und/oder Stanolestern von Ethercarbonsäuren nach Anspruch 1 als E- mulgatoren, insbesondere in kosmetischen Zusammensetzungen und in Nahrungsmitteln,
10. Verwendung von Sterol- und/oder Stanolestern von Ethercarbonsäuren nach Anspruch 1 als kosmetischer Wirkstoff.
11. Verwendung von Sterol- und/oder Stanolestern von Ethercarbonsäuren nach Anspruch 1 als hy- pocholesterinänischer Wirkstoff, insbesondere in Nahrungsmitteln und/oder Nahrungsergänzungsmitteln.
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