EP1597562A1 - DISPOSITIF DE SUPPORT D’ELEMENTS CHROMOPHORES - Google Patents

DISPOSITIF DE SUPPORT D’ELEMENTS CHROMOPHORES

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Publication number
EP1597562A1
EP1597562A1 EP04702349A EP04702349A EP1597562A1 EP 1597562 A1 EP1597562 A1 EP 1597562A1 EP 04702349 A EP04702349 A EP 04702349A EP 04702349 A EP04702349 A EP 04702349A EP 1597562 A1 EP1597562 A1 EP 1597562A1
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EP
European Patent Office
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support
layer
face
intended
support according
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Withdrawn
Application number
EP04702349A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Claude Weisbuch
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genewave
Original Assignee
Genewave
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Filing date
Publication date
Application filed by Genewave filed Critical Genewave
Publication of EP1597562A1 publication Critical patent/EP1597562A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/7703—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator using reagent-clad optical fibres or optical waveguides

Definitions

  • the invention relates to a device for supporting chromophoric elements, this device being of the type of those commonly called “biochips”.
  • These devices comprise a support formed by a generally multilayer substrate, one face of which carries chromophoric elements which are chemical or biological molecules, or dyes added or grafted to chemical or biological molecules, or semiconductor nanostructures such as wires or quantum dots made integral with these molecules, these chromophoric elements emitting a fluorescence, the wavelength of which depends on their nature, when they are excited by appropriate light, the detection of this fluorescence making it possible to identify and to identify on the support the molecules which have reacted to given treatments.
  • Dichroic filters have a high rejection rate of excitation light, of the order of 50 to 90 dB, that is to say 1: 10 "5 to 1: 10 " 9 .
  • the intensity of the fluorescence emitted is low, and is 10 5 to 10 9 times weaker than that of the excitation light, the reflection of the excitation light by the support constitutes an important background which comes interfere with the detection of weak signals and does not allow a high signal-to-noise ratio to be obtained.
  • the reflection by an air / glass diopter is typically 4% for incidences of up to about 20 degrees relative to normal. Beyond that, it increases or decreases depending on the angle and polarization of the light.
  • the reflection of the excitation light by the face of the blade opposite to that carrying the chromophoric elements is of comparative intensity (4% of 96% or 3.84%) and is also bothersome.
  • the two reflected intensities are added and the reflection reaches approximately 8%, which is far from being negligible.
  • the support it is advantageous for the support to be reflective at the wavelength of the fluorescence emitted, because this makes it possible to multiply by approximately 2 (in geometric optics) or by approximately 4 (in wave optics) the intensity of the fluorescence emitted .
  • the object of the invention is in particular to provide a simple, effective and economical solution to this problem, making it possible to cancel or at least reduce the reflection of the excitation light by the support while retaining the advantage resulting from the reflection of the fluorescence emitted.
  • chromophoric elements these elements being intended to be illuminated by an excitation light to emit a fluorescence of wavelength different from that of the excitation light
  • this support being characterized in that that it comprises at least one internal layer of material reflecting the fluorescence emitted by the chromophoric elements and at least one means of canceling or at least substantially reducing the reflection of the excitation light, this means being chosen from the group including: a layer of material absorbing excitation light, this layer having a thickness such that the product of this thickness by its absorption coefficient ⁇ e at the excitation wavelength is much greater than 1 or has a known value and controlled between 0.1 and 10 approximately,
  • At least one layer of transparent and anti-reflecting material at the excitation wavelength formed on at least one face of the support and having a refractive index n 'close to the square root of the refractive index of support and a thickness equal to an odd multiple of ⁇ e / 4n'cos ⁇ , ⁇ e being the excitation wavelength and ⁇ the angle of the excitation rays in said anti-reflective layer,
  • the reflection of the excitation light in the direction of the means for collecting the fluorescence of the chromophoric elements is greatly reduced, or even canceled, and the intensity of the fluorescence is increased, which greatly facilitates detection. and measuring this fluorescence.
  • the above-mentioned absorbent layer and at least one anti-reflective layer are formed on the face of the support opposite to that carrying the chromophoric elements.
  • the absorbent layer and at least one aforementioned anti-reflective layer are formed on the face of the support intended to receive the chromophoric elements.
  • the support is made of material transparent to the excitation wavelength, the reflection of this wavelength is canceled by the face of the support which carries the chromophoric elements.
  • the absorbent layer is formed on the upper face of the support, and the anti-reflective layer is formed on the absorbent layer.
  • the internal layer of material reflecting the fluorescence emitted by the chromophoric elements is located at a distance d from the face of the support carrying the chromophoric elements which is much greater than the quantity ⁇ f.n / 2NA 2 , ⁇ f being the wavelength of the emitted fluorescence, n being the refractive index of the support, NA being the digital aperture of the optical means for collecting the emitted fluorescence, and the above-mentioned anti-reflective layer is formed on the face of the support intended to receive the chromophoric elements.
  • an absorbent layer of the aforementioned type can be formed in the support between the anti-reflecting layer and the internal layer reflecting the emitted fluorescence.
  • the internal reflecting layer can be formed by a plurality of dielectric layers and is formed to have a substantially zero reflection at the excitation wavelength for the angle of incidence of light. of excitement on the support.
  • the internal reflective layer can be formed by a stack of layers having an optical thickness equal to a quarter of the excitation wavelength and refractive indices which are alternately high and low, with a central layer of thickness. double or different. This stack of layers forms a symmetrical Fabry-Perot cavity also called a micro-cavity.
  • the wavelength of the minimum of reflection, the angle and the polarization used are determined by the thickness of the layer forming the cavity.
  • an absorbent layer of the aforementioned type is advantageously formed in the support between the internal reflecting layer and the face of the support opposite to that intended to carry the chromophoric elements.
  • the internal layer of material reflecting the emitted fluorescence is located at a distance from the face of the support carrying the chromophoric elements which is less than the quantity ⁇ f.n / 2NA 2 , and a layer Above-mentioned absorbent is formed between this reflecting internal layer and the face of the support intended to carry the chromophoric elements.
  • the inner layer of reflective material can be a metallic or dielectric layer or a plurality of dielectric layers.
  • the support comprises two layers of material reflecting the emitted fluorescence, these two layers forming an asymmetrical Fabry-Perot cavity and being located at a distance from the face of the support intended to carry the elements chromophores which is less than the quantity ⁇ f.n / 2NA 2 , and the abovementioned absorbent layer is located between these two reflecting layers and the support face opposite to that intended to carry the chromophoric elements.
  • the chromophoric elements can be carried by one of the layers of reflective material, outside the Fabry-Perot cavity.
  • the support comprises a first layer of material reflecting the emitted fluorescence situated at a distance from the face of the support intended to carry the chromophoric elements which is less than the quantity ⁇ f.n / 2NA 2 , a second layer of reflective material covering the support face intended to carry the chromophoric elements and situated at a distance from the first reflecting layer less than the quantity ⁇ f.n / NA 2 , and an abovementioned absorbing layer situated between the first layer of reflecting material and the support face opposite to that intended for carry the chromophoric elements.
  • the chromophoric elements are between the two layers of reflective material and can be inserted between these two layers by known means, for example by passage, through porous materials or by means of microchannels opening into empty planar cavities formed by sacrificial etching of a stack of layers provided for this purpose.
  • the invention is also applicable to the case where the support is intended to carry chromophoric elements of different types which emit fluorescence on different wavelengths when they are excited by appropriate different wavelengths.
  • the abovementioned absorbent layer then has different absorption bands corresponding to the excitation wavelengths and can be formed for this purpose either from a single suitable component, or from a mixture of components having different absorption bands. .
  • the above-mentioned anti-reflective layer may be formed of a stack of layers having a low reflection for the different excitation wavelengths.
  • the invention makes it possible to appreciably increase the signal / noise ratio and to minimize the background signal in optical sensors for detecting and measuring the fluorescence emitted by chromophoric elements in a device of the biochip type.
  • FIGS. 1 to 3 are schematic sectional views, on a large scale, of various embodiments of a support according to the invention
  • FIG. 4 is a graph showing the variation of the reflection of light as a function of the wavelength in the case of the support of Figure 3;
  • the reference 10 generally designates a support according to the invention, which in this embodiment consists essentially of a blade of a material having a refractive index n, the upper face of which is intended to support elements chromophores 12 which are for example chemical or biological molecules as indicated above and which are fixed in a network on the upper face of the support 10.
  • chromophoric elements 12 are illuminated by an excitation light 14, generally monochromatic or of small spectral width, possibly polarized (case of lasers), the incidence of which is defined with precision and is often substantially perpendicular to the surface of the support 10 , and they emit in response a fluorescence 16 on a wavelength which depends on the nature of the chromophoric elements 12 and which is greater than the wavelength of the excitation light 14.
  • excitation light 14 generally monochromatic or of small spectral width, possibly polarized (case of lasers)
  • the intensity of the fluorescence emitted by chromophoric elements are illuminated by an excitation light 14, generally monochromatic or of small spectral width, possibly polarized (case of lasers), the incidence of which is defined with precision and is often substantially perpendicular to the surface of the support 10 , and they emit in response a fluorescence 16 on a wavelength which depends on the nature of the chromophoric elements 12 and which is greater than the wavelength of the excitation light 14.
  • the present invention therefore proposes to reduce and as far as possible cancel the reflection of the excitation light 14 by the support 10 to prevent this reflected light being added to the fluorescence emitted 16 in the light signal picked up by the detection means. and measurement, the percentage of the intensity of the excitation light reflected by the support 10 for substantially normal incidences being of the order of 4% for each diopter when the support 10 is made of glass having a refractive index of 1, 5 or around 25% for each diopter when the support 10 is made of silicon having a refractive index of 3.5 (the index of the medium above the support being equal to 1).
  • the invention proposes adding to the support 10 at least one of the following means:
  • an absorbent layer 18 made of a material having a refractive index close to that of the support 10, its thickness d being determined so that the product of this thickness by its absorption coefficient e the wavelength of the light excitation is much greater than 1 or alternatively, has a known and controlled value of between 0.1 and 10 approximately;
  • one or more transparent anti-reflective layers 20 for the excitation wavelength that is to say layers 20 made of a material having a refractive index n 'close to the square root of the index of refraction of the support 10 and having a thickness equal to ⁇ e / 4n'cos ⁇ or an odd multiple of this thickness, ⁇ being the angle with the normal excitation rays in the or each layer 20.
  • the absorbent layer 18 is inside the support.
  • one or more anti-reflective layers 20 can be formed on the upper surface of the support 10, and an absorbent layer 18 on the lower face of the support 10 or in the vicinity thereof, the chromophoric elements 12 being then deposited on the anti-reflective layer or layers 20.
  • the support. 10 is made of transparent material, forming on its underside one or more anti-reflective layers and an absorbent layer, to cancel the reflection of the excitation light 14 by the underside of the support.
  • magnesium fluoride MgF2 having a refractive index close to 1.38 can be used to form the anti-reflective layer 20. If the wavelength of the excitation light is 532 nm, the thickness of the layer 20 is then approximately
  • the absorbent layer 18 can be formed of organic molecules, optionally embedded in a matrix of the sol-gel type or in a polymer matrix or else of inorganic pigments embedded in the 2004/068124
  • the support 10 also preferably includes a mirror 22 formed by an internal layer of material reflecting light at the wavelength of the fluorescence emitted by the chromophoric elements 12, this mirror 22 being located at a distance from the chromophoric elements 12 which is much greater than the quantity ⁇ f.n / 2NA 2 , ⁇ f being the wavelength of the fluorescence emitted 16, n being the refractive index of the support 10, NA being the numerical aperture optical means for detecting and measuring the fluorescence emitted.
  • the reduction in the reflection of the excitation light 14 is obtained by means of an anti-reflective layer 20 formed on the upper face of the support 10 and an absorbent layer 18 interposed in the support 10 between the anti-reflective layer 20 and the mirror 22.
  • the distance between the mirror 22 and the upper face of the support 10 is relatively large, in particular greater than 5 ⁇ m, which makes it possible to install the absorbent layer 18 between the mirror 22 and the antireflective layer 20 without difficulty.
  • the reflective layer 22 forming the mirror can be formed of several dielectric layers having a zero reflection for the excitation wavelength at the angle of incidence used which is generally small and less than 10 °.
  • a symmetrical Fabry-Perot cavity or micro-cavity can be formed between two mirrors 22 formed by stacks of dielectric layers of the same reflectivity.
  • an absorbent layer 18 is in the vicinity of the underside of the support 10 while an anti-reflective layer 20 is formed on the upper face of the support and carries the chromophoric elements 12.
  • the reflection of the support 10 is zero for the excitation wavelength ⁇ e and is very high, preferably close to 100% for the wavelength ⁇ f of the fluorescence emitted by the chromophoric elements.
  • the reflection of the support 10 is zero for the excitation wavelength ⁇ e and is very high, preferably close to 100% for the wavelength ⁇ f of the fluorescence emitted by the chromophoric elements.
  • the support 10 is a strip of material having a refractive index n, which comprises a reflective layer 24 with high reflection which is metallic or formed by a stack of dielectric layers and which is located at a distance d from the upper face of the support carrying the chromophoric elements 12 less than the quantity ⁇ f.n / 2NA 2 where ⁇ f is the wavelength of the fluorescence emitted by the chromophoric elements 12 and NA is the numerical aperture of the optical means for detecting and measuring this fluorescence.
  • the cancellation or reduction of the reflection of the excitation light is obtained by forming an absorbent layer 18 of determined thickness between the reflective layer 24 and the chromophoric elements 12, this thickness being less than or equal at the distance between the reflective layer 24 and the chromophoric elements 12.
  • the layer 18 makes it possible to absorb as much as necessary the excitation wavelength without absorbing the wavelength of the fluorescence emitted.
  • the metallic reflecting layer 24 can be replaced by a non-symmetrical Fabry-Perot cavity formed between two different reflecting layers 22, one of which forms the upper face of the support 10 and carries the chromophoric elements 12 and the other of which is inside the support 10 and located at a distance from the chromophoric elements 12 which is less than the aforementioned quantity ⁇ f.n / 2NA 2 .
  • An absorbent layer 18 is then formed on the underside of the support 10 or in the vicinity of this underside, optionally in combination with an aforementioned anti-reflective layer 20.
  • Microcavity solutions make it possible to obtain a reflectivity contrast between excitation and emission wavelengths much higher compared to a solution with an anti-reflection layer produced on a reflective support, which reduces the noise associated with the excitation light.
  • a Bragg mirror formed by periodic stacks of layers of high index and low index materials, with a relatively narrow band, in order to have a high reflectivity at the wavelength of the fluorescence emitted. and a low reflectivity outside this band, by adding to this Bragg mirror an antireflective layer or an absorbent layer of the aforementioned type, but having a very small thickness to remain in the field of wave optics.
  • Two preferred modes of the invention are therefore the following:
  • the Bragg mirror is formed to present exactly the amplitude and the phase of the reflectivity at ⁇ e so that the combination of the reflection by the Bragg mirror with the reflection by the upper face of the support 10 cancels the overall reflection of ⁇ e by the support,
  • the Bragg mirror is not precisely adjusted in reflectivity and especially in amplitude and has a wide band and it is then an absorbent layer 18 interposed between this mirror and the upper face of the support 10 which allows by an appropriate choice of the product ( ⁇ e.d) as indicated above to cancel the overall reflection of the support at ⁇ e.
  • Known optical synthesis methods such as the "flip-flop” method can be used to form the layers of layers of Bragg mirrors.
  • the support according to the invention can be associated with lighting means providing a light excitation whose incidence and polarization are defined to reduce parasitic reflection by the support.
  • the embodiments of the invention using reflective multilayers also make it possible to ensure that the chromophoric elements are located in the vicinity of a belly of the emission field, as already described in the aforementioned international application of the same inventors.
  • the support 10 comprises a blade of material having a refractive index n and two mirrors 26, 28 separated from each other and between which are the chromophoric elements 12. More specifically, the chromophoric elements 12 are carried by a layer 30 of transparent material which covers the lower mirror 28 and the upper mirror 26 covers the layer 30 while being separated from the latter by a spacer layer 32 which is for example etched to form the cavities in which the chromophoric elements 12 are deposited.
  • the mirrors 26, 28 operate under the conditions of wave optics, that is to say that the mirror 28 is separated from the chromophoric elements 12 by a distance which is less than the quantity ⁇ f.n / 2NA 2 and that the distance between the two mirrors 26, 28 is less than the quantity ⁇ f.n / NA 2 .
  • the characteristics of the mirrors 26, 28 are determined so that the excitation wavelength is transmitted by the lower mirror 28 and that the wavelength of the emitted fluorescence is reflected by the mirror 28 and passes through the upper mirror 26 to be able to be picked up by the detection and measurement means.
  • An absorbent layer 18 of the aforementioned type is formed on or in the vicinity of the underside of the support 10 and is optionally associated with an aforementioned anti-reflective layer as already indicated for the previous embodiments.

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Abstract

Support d'éléments chromophores, ces éléments (12) étant destinés à être éclairés par une lumière d'excitation (14) pour émettre une fluorescence (16) à une longueur d'onde différente de celle de la lumière d'excitation, le support (10) comprenant une couche interne (22) réfléchissant la lumière émise par les éléments chromophores, une couche (18) de matière absorbant la longueur d'onde d'excitation et une couche (20) de matière anti-réfléchissante à cette longueur d'onde pour éviter la réflexion dé la lumière d'excitation par le support et son addition à la fluorescence émise par les éléments chromophores (12).

Description

DISPOSITIF DE SUPPORT D'ELEMENTS CHROMOPHORES
L'invention concerne un dispositif de support d'éléments chromophores, ce dispositif étant du type de ceux communément appelés "biopuces".
Ces dispositifs comprennent un support formé par un substrat en général multicouches, dont une face porte des éléments chromophores qui sont des molécules chimiques ou biologiques, ou des colorants ajoutés ou greffés à des molécules chimiques ou biologiques, ou des nano-structures semi-conductrices telles que des fils ou des boîtes quantiques rendues solidaires de ces molécules, ces éléments chromophores émettant une fluorescence, dont la longueur d'onde dépend de leur nature, quand ils sont excités par une lumière appropriée, la détection de cette fluorescence permettant d'identifier et de repérer sur le support les molécules qui ont réagi à des traitements donnés.
On a déjà proposé, notamment dans les demandes WO-A- 02516912, FR 0115140 et FR 0210285 des mêmes inventeurs, des moyens pour augmenter les efficacités de l'excitation lumineuse et de l'émission de la fluorescence, par exemple par des structurations verticales renforçant l'intensité d'excitation et/ou celle de la fluorescence émise par des effets d'interférence générés par des miroirs. Il reste cependant nécessaire de séparer la lumière d'excitation réfléchie par le support de la fluorescence émise, dans la lumière captée par des moyens de collecte et de mesure et on utilise pour cela des filtres dichroïques ou absorbants, mais cette séparation est délicate et la rejection de la lumière d'excitation n'est pas totale.
Les filtres dichroïques ont un taux de rejection de la lumière d'excitation qui est élevé, de l'ordre de 50 à 90 dB, c'est-à-dire 1 : 10 "5 à 1 : 10"9. Quand l'intensité de la fluorescence émise est faible, et est 105 à 109 fois plus faible que celle de la lumière d'excitation, la réflexion de la lumière d'excitation par le support constitue un fond important qui vient gêner la détection des signaux faibles et ne permet pas l'obtention d'un rapport signal/bruit élevé.
La réflexion par un dioptre air/verre est typiquement de 4% pour des incidences allant jusqu'à 20 degrés environ par rapport à la normale. Au- delà, elle augmente ou elle diminue en fonction de l'angle et de la polarisation de la lumière. Lorsque le support est une lame mince transparente à faces parallèles, la réflexion de la lumière d'excitation par la face de la lame opposée à celle portant les éléments chromophores est d'intensité comparaole (4% de 96% soit 3,84%) et est également gênante. Dans le cas d'une imagerie directe sur une relativement grande surface du support, les deux intensités réfléchies s'ajoutent et la réflexion atteint environ 8%, ce qui est loin d'être négligeable.
Lorsqu'on utilise des supports qui sont très réfléchissants à la longueur d'onde d'excitation, la réflexion est maximaie et est proche de 100%.
Il est avantageux cependant que le support soit réfléchissant à la longueur d'onde de la fluorescence émise, car cela permet de multiplier par environ 2 (en optique géométrique) ou par environ 4 (en optique ondulatoire) l'intensité captable de la fluorescence émise. L'invention a notamment pour but d'apporter à ce problème une solution simple, efficace et économique, permettant d'annuler ou au moins de réduire la réflexion de la lumière d'excitation par le support tout en conservant l'avantage résultant de la réflexion de la fluorescence émise. Elle propose à cet effet un support d'éléments chromophores, ces éléments étant destinés à être éclairés par une lumière d'excitation pour émettre une fluorescence de longueur d'onde différente de celle de la lumière d'excitation, ce support étant caractérisé en ce qu'il comprend au moins une couche interne de matière réfléchissant la fluorescence émise par les éléments chromophores et au moins un moyen d'annulation ou au moins de réduction sensible de la réflexion de la lumière d'excitation, ce moyen étant choisi dans le groupe comprenant : - une couche de matière absorbant la lumière d'excitation, cette couche ayant une épaisseur telle que le produit de cette épaisseur par son coefficient d'absorption αe à la longueur d'onde d'excitation soit très supérieur à 1 ou ait une valeur connue et contrôlée comprise entre 0,1 et 10 environ,
- au moins une couche de matière transparente et anti-réfléchissante à la longueur d'onde d'excitation, formée sur au moins une face du support et ayant un indice de réfraction n' voisin de la racine carrée de l'indice de réfraction du support et une épaisseur égale à un multiple impair de λe/4n'cosθ, λe étant la longueur d'onde d'excitation et θ l'angle des rayons d'excitation dans ladite couche anti-réfléchissante,
- des couches diélectriques et/ou métalliques délimitant une microcavité dont le mode de cavité est défini pour annuler la réflexion de la lumière d'excitation. Dans le support selon l'invention, la réflexion de la lumière d'excitation en direction des moyens de collecte de la fluorescence des éléments chromophores est fortement diminuée, voire annulée, et l'intensité de la fluorescence est augmentée ce qui facilite beaucoup la détection et la mesure de cette fluorescence. Selon une autre caractéristique de l'invention, la couche absorbante et au moins une couche anti-réfléchissante précitées sont formées sur la face du support opposée à celle portant les éléments chromophores.
Cela permet, dans le cas où le support est transparent à la longueur d'onde d'excitation, d'annuler la réflexion de cette longueur d'onde par la face du support opposée à celle qui porte les éléments chromophores.
Selon une autre caractéristique de l'invention, la couche absorbante et au moins une couche anti-réfléchissante précitées sont formées sur la face du support destinée à recevoir les éléments chromophores. Ainsi, lorsque le support est en matériau transparent à la longueur d'onde d'excitation, on annule la réflexion de cette longueur d'onde par la face du support qui porte les éléments chromophores. Dans ce cas, la couche absorbante est formée sur la face supérieure du support, et la couche anti-réfléchissante est formée sur la couche absorbante.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la couche interne de matière réfléchissant la fluorescence émise par les éléments chromophores, est située à une distance d de la face du support portant les éléments chromophores qui est très supérieure à la quantité λf.n/2NA2, λf étant la longueur d'onde de la fluorescence émise, n étant l'indice de réfraction du support, NA étant l'ouverture numérique des moyens optiques de collecte de la fluorescence émise, et la couche anti-réfléchissante précitée est formée sur la face du support destinée à recevoir les éléments chromophores.
Dans ce mode de réalisation très simple, on bénéficie des avantages résultant de la réflexion de la fluorescence émise (doublement de l'intensité captée) tout en évitant les inconvénients de la réflexion de la lumière d'excitation par la couche réfléchissante intégrée dans le support.
Avantageusement, une couche absorbante du type précité peut être formée dans le support entre la couche anti-réfléchissante et la couche interne réfléchissant la fluorescence émise. Selon une autre caractéristique de l'invention, la couche interne réfléchissante peut être formée par une pluralité de couches diélectriques et est constituée pour avoir une réflexion sensiblement nulle à la longueur d'onde d'excitation pour l'angle d'incidence de la lumière d'excitation sur le support. Pour cela, la couche interne réfléchissante peut être formée par un empilement de couches ayant une épaisseur optique égale au quart de la longueur d'onde d'excitation et des indices de réfraction qui sont alternativement élevés et faibles, avec une couche centrale d'épaisseur double ou différente. Cet empilement de couches forme une cavité de Fabry-Perot symétrique appelée aussi micro-cavité.
Dans cet empilement, la longueur d'onde du minimum de réflexion, l'angle et la polarisation utilisés sont déterminés par l'épaisseur de la couche formant cavité.
Dans ce mode de réalisation, une couche absorbante du type précité est avantageusement formée dans le support entre la couche interne réfléchissante et la face du support opposée à celle destinée à porter les éléments chromophores.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la couche interne de matière réfléchissant la fluorescence émise est située à une distance de la face du support portant les éléments chromophores qui est inférieure à la quantité λf.n/2NA2, et une couche absorbante précitée est formée entre cette couche interne réfléchissante et la face du support destinée à porter les éléments chromophores.
Dans ce mode de réalisation, la couche interne de matière réfléchissante peut être une couche métallique ou diélectrique ou une pluralité de couches diélectriques.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le support comprend deux couches de matière réfléchissant la fluorescence émise, ces deux couches formant une cavité de Fabry-Perot dissymétrique et étant située à une distance de la face du support destinée à porter les éléments chromophores qui est inférieure à la quantité λf.n/2NA2, et la couche absorbante précitée est située entre ces deux couches réfléchissantes et la face de support opposée à celle destinée à porter les éléments chromophores.
Dans ce mode de réalisation, les éléments chromophores peuvent être portés par l'une des couches de matière réfléchissante, à l'extérieur de la cavité de Fabry-Perot.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le support comprend une première couche de matière réfléchissant la fluorescence émise située à une distance de la face du support destinée à porter les éléments chromophores qui est inférieure à la quantité λf.n/2NA2, une seconde couche de matière réfléchissante recouvrant la face de support destinée à porter les éléments chromophores et située à une distance de la première couche réfléchissante inférieure à la quantité λf.n/NA2, et une couche absorbante précitée située entre la première couche de matière réfléchissante et la face de support opposée à celle destinée à porter les éléments chromophores.
Dans ce mode de réalisation, les éléments chromophores sont entre les deux couches de matière réfléchissante et peuvent être insérés entre ces deux couches par des moyens connus, par exemple par passage, à travers des matériaux poreux ou au moyen de micro-canaux débouchant dans des cavités planaires vides formées par gravure sacrificielle d'un empilement de couches prévues à cet effet.
L'invention est également applicable au cas où le support est destiné à porter des éléments chromophores de types différents qui émettent une fluorescence sur des longueurs d'onde différentes quand ils sont excités par des longueurs d'onde différentes appropriées.
La couche absorbante précitée présente alors des bandes d'absorption différentes correspondant aux longueurs d'onde d'excitation et peut être formée à cet effet soit d'un seul constituant approprié, soit d'un mélange de constituants ayant des bandes d'absorption différentes. De même, la couche anti-réfléchissante précitée peut être formée d'un empilement de couches ayant une faible réflexion pour les différentes longueurs d'onde d'excitation. On peut également utiliser une seule couche anti-réfléchissante ayant un indice de réfraction voisin de la racine carrée de l'indice du matériau du support et une épaisseur déterminée pour obtenir une réflexion minimale à une longueur d'onde comprise entre deux longueurs d'onde d'excitation relativement proches l'une de l'autre, la largeur spectrale du minimum de réflexion étant typiquement de plus de 100 mm dans le spectre visible, ce qui permet par exemple de déterminer une épaisseur de couche correspondant à un minimum de réflexion centré sur 580 mm quand on utilise des longueurs d'onde d'excitation de 532 mm et de 633 mm. De façon générale, l'invention permet d'augmenter de façon sensible le rapport signal/bruit et de minimiser le signal de fond dans des capteurs optiques de détection et de mesure de la fluorescence émise par des éléments chromophores dans un dispositif du type biopuce. L'invention sera mieux comprise et d'autres caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de la description qui suit, faite à titre d'exemple en référence aux dessins annexés dans lesquels :
- les figures 1 à 3 sont des vues schématiques en coupe, à grande échelle, de divers modes de réalisation d'un support selon l'invention ;
- la figure 4 est un graphe représentant la variation de la réflexion de la lumière en fonction de la longueur d'onde dans le cas du support de la figure 3 ;
- les figures 5, 6 et 7 sont des vues schématiques en coupe illustrant d'autres variantes de réalisation de l'invention ;
En figure 1 , la référence 10 désigne globalement un support selon l'invention, qui dans cet exemple de réalisation est constitué essentiellement d'une lame d'un matériau ayant un indice de réfraction n, dont la face supérieure est destinée à supporter des éléments chromophores 12 qui sont par exemple des molécules chimiques ou biologiques comme indiqué plus haut et qui sont fixées en réseau sur la face supérieure du support 10.
Ces éléments chromophores 12 sont éclairés par une lumière d'excitation 14, en général monochromatique ou de faible largeur spectrale, éventuellement polarisée (cas des lasers), dont l'incidence est définie avec précision et est souvent sensiblement perpendiculaire à la surface du support 10, et ils émettent en réponse une fluorescence 16 sur une longueur d'onde qui dépend de la nature des éléments chromophores 12 et qui est supérieure à la longueur d'onde de la lumière d'excitation 14. L'intensité de la fluorescence émise par les éléments chromophores
12 est très faible par rapport à celle de la lumière d'excitation 14. II faut en pratique éclairer un nombre relativement élevé d'éléments chromophores pour obtenir un signal lumineux 16 qui soit exploitable. Il est donc particulièrement intéressant de privilégier la récupération de la fluorescence 16 émise par les éléments chromophores 12 et de diminuer le bruit et le signal d'excitation dans le signal capté par les moyens de détection et de mesure qui sont en général placés au-dessus des éléments chromophores 12 et dont l'axe optique est orienté perpendiculairement à la surface supérieure du support 10.
La présente invention propose pour cela de réduire et autant que possible annuler la réflexion de la lumière d'excitation 14 par le support 10 pour éviter que cette lumière réfléchie s'ajoute à la fluorescence émise 16 dans le signal lumineux capté par les moyens de détection et de mesure, le pourcentage de l'intensité de la lumière d'excitation réfléchie par le support 10 pour des incidences sensiblement normales étant de l'ordre de 4% pour chaque dioptre quand le support 10 est en verre ayant un indice de réfraction de 1 ,5 ou d'environ 25% pour chaque dioptre quand le support 10 est en silicium ayant un indice de réfraction de 3,5 (l'indice du milieu au- dessus du support étant égal à 1 ).
L'invention propose d'ajouter au support 10 au moins l'un des moyens suivants :
- une couche absorbante 18 réalisée en une matière ayant un indice de réfraction voisin de celui du support 10, son épaisseur d étant déterminée pour que le produit de cette épaisseur par son coefficient d'absorption e la longueur d'onde de la lumière d'excitation soit très supérieur à 1 ou en variante, ait une valeur connue et contrôlée comprise entre 0,1 et 10 environ ;
- une ou plusieurs couches 20 transparentes anti-réfléchissantes pour la longueur d'onde d'excitation, c'est-à-dire des couches 20 réalisées en une matière ayant un indice de réfraction n' voisin de la racine carrée de l'indice de réfraction du support 10 et ayant une épaisseur égale à λe/4n'cosθ ou un multiple impair de cette épaisseur, θ étant l'angle avec la normale des rayons d'excitation dans la ou chaque couche 20.
Lorsque l'incidence est supérieure à environ 55° et que la lumière d'excitation a une polarisation p (champ électrique dans le plan d'incidence), on peut annuler la réflexion de l'excitation lumineuse par le support en réglant l'incidence i à l'angle de Brewster donné par la relation i=arctg(n), n étant l'indice de réfraction du matériau du support. Dans ce cas, la couche absorbante 18 est à l'intérieur du support.
Comme représenté en figure 1 , on peut former une ou plusieurs couches anti-réfléchissantes 20 sur la surface supérieure du support 10, et une couche absorbante 18 sur la face inférieure du support 10 ou au voisinage de celle-ci, les éléments chromophores 12 étant alors déposés sur la ou les couches anti-réfléchissantes 20.
On peut également, quand le support. 10 est en matériau transparent, former sur sa face inférieure une ou plusieurs couches anti- réfléchissantes et une couche absorbante, pour annuler la réflexion de la lumière d'excitation 14 par la face inférieure du support.
On peut également traiter la surface supérieure du support 10 de la même façon, c'est-à-dire la recouvrir par une couche absorbante 18 elle- même recouverte par une ou plusieurs couches anti-réfléchissantes 20. Dans ce dernier cas, la lumière d'excitation 14 est absorbée sans traverser le support 10, ce qui supprime toute émission parasite du support 10 à la longueur d'onde de la fluorescence 16 émise par les éléments chromophores 12.
Lorsque le support 10 est en verre, on peut utiliser pour former la couche anti-réfléchissante 20 du fluorure de magnésium MgF2 ayant un indice de réfraction voisin de 1 ,38. Si la longueur d'onde de la lumière d'excitation est de 532 nm, l'épaisseur de la couche 20 est alors d'environ
100 nm.
La couche absorbante 18 peut être formée de molécules organiques, éventuellement noyées dans une matrice du type sol-gel ou dans une matrice polymère ou bien de pigments inorganiques noyés dans les 2004/068124
10
matrices précitées, ou encore de boîtes quantiques du type CdS ou CdSe par exemple, qui sont dispersées dans une matrice et traitées pour annuler leur luminescence propre.
Comme représenté en figure 2, le support 10 comprend également, de préférence, un miroir 22 formé par une couche interne de matière réfléchissant la lumière à la longueur d'onde de la fluorescence émise par les éléments chromophores 12, ce miroir 22 étant situé à une distance des éléments chromophores 12 qui est très supérieure à la quantité λf.n/2NA2, λf étant la longueur d'onde de la fluorescence émise 16, n étant l'indice de réfraction du support 10, NA étant l'ouverture numérique des moyens optiques de détection et de mesure de la fluorescence émise.
La diminution de la réflexion de la lumière d'excitation 14 est obtenue au moyen d'une couche anti-réfléchissante 20 formée sur la face supérieure du support 10 et d'une couche absorbante 18 intercalée dans le support 10 entre la couche anti-réfléchissante 20 et le miroir 22.
La distance entre le miroir 22 et la face supérieure du support 10 est relativement importante, notamment supérieure à 5 μm, ce qui permet d'installer la couche absorbante 18 entre le miroir 22 et la couche antiréfléchissante 20 sans difficulté. La couche réfléchissante 22 formant le miroir peut être formée de plusieurs couches diélectriques ayant une réflexion nulle pour la longueur d'onde d'excitation à l'angle d'incidence utilisé qui est en général faible et inférieur à 10°.
Comme représenté schématiquement en figure 3, on peut former une cavité ou micro-cavité symétrique de Fabry-Perot entre deux miroirs 22 formés d'empilements de couches diélectriques de même réflectivité.
Pour cela, on peut par exemple réaliser un empilement de couches de matériaux ayant alternativement un indice de réfraction haut H et bas L tels respectivement que T1O2 et SiO2, chaque couche ayant une épaisseur optique égale à λe/4, l'empilement étant par exemple tel que HLHLHLHL - X - LHLHLHLH, où L et H désignent les couches d'indice haut et d'indice bas respectivement et X désigne une couche du type H par exemple formant cavité dont l'épaisseur permet d'ajuster la longueur d'onde du ou des modes des cavités pour laquelle la réflexion est nulle.
On peut bien entendu limiter la réflexion de la lumière d'excitation sur la face inférieure du support 10 par un dépôt d'une couche antiréfléchissante 20 et d'une couche absorbante 18.
Dans l'exemple de réalisation de la figure 3, une couche absorbante 18 est au voisinage de la face inférieure du support 10 tandis qu'une couche anti-réfléchissante 20 est formée sur la face supérieure du support et porte les éléments chromophores 12.
Dans ce cas, et comme représenté schématiquement en figure 4, la réflexion du support 10 est nulle pour la longueur d'onde d'excitation λe et est très élevée, de préférence voisine de 100% pour la longueur d'onde λf de la fluorescence émise par les éléments chromophores. Dans l'exemple de réalisation de la figure 5, le support 10 est une lame de matériau ayant un indice de réfraction n, qui comporte une couche réfléchissante 24 à réflexion élevée qui est métallique ou formée par un empilement de couches diélectriques et qui est située à une distance d de la face supérieure du support portant les éléments chromophores 12 inférieure à la quantité λf.n/2NA2 où λf est la longueur d'onde de la fluorescence émise par les éléments chromophores 12 et NA est l'ouverture numérique des moyens optiques de détection et de mesure de cette fluorescence.
Cela permet de générer un effet d'interférence améliorant la collecte de la fluorescence émise en application des lois de l'optique ondulatoire. On sait, par les demandes antérieures précitées des mêmes inventeurs, que l'on peut ainsi générer une double résonance de la lumière d'excitation et de la fluorescence émise en faisant coïncider les ventres de champs électriques pour ces deux longueurs d'onde sur les éléments chromophores 12 portés par la face supérieure du support 10. On peut aussi ne générer qu'une résonance de la fluorescence émise, avec un état d'interférence quelconque de la lumière d'excitation sur les éléments chromophores.
Dans cet exemple de réalisation, l'annulation ou la diminution de la réflexion de la lumière d'excitation est obtenue en formant une couche absorbante 18 d'épaisseur déterminée entre la couche réfléchissante 24 et les éléments chromophores 12, cette épaisseur étant inférieure ou égale à la distance entre la couche réfléchissante 24 et les éléments chromophores 12.
La couche 18 permet d'absorber autant que nécessaire la longueur d'onde d'excitation sans absorber la longueur d'onde de la fluorescence émise.
On peut en effet déterminer une valeur du produit (αe.d), αe étant le coefficient d'absorption de la couche 18 à λe et d étant l'épaisseur de cette couche, et une distance D entre la couche réfléchissante 24 et la face du support destinée à porter les éléments chromophores, qui sont telles que la réflexion globale du support soit nulle à λe. Si r1 est la réflectivité en amplitude à λe à l'interface support-air pour une incidence et une polarisation données, et si r2 est la réflexion en amplitude à λe de la couche 24, on peut annuler la première réflexion par la seconde si, en amplitude : r2 exp (-αe.d) = r1 ou αe.d = Ln (r2/r1 ) et si 2n.Dcosθ est un multiple impair de λe/2, θ étant l'angle d'incidence du rayon d'excitation sur la couche 24, pour que les rayons générés par les deux réflexions aient sensiblement la même amplitude et soient en opposition de phase.
Cette condition sur les phases est la même que celle assurant un renforcement de l'excitation au niveau des éléments chromophores 12, comme indiqué dans les demandes antérieures précitées des inventeurs. On peut ainsi utiliser une couche 18 moins absorbante et donc moins épaisse et réduire les contraintes sur la réflectivité de la couche 24 à λe, puisque l'on peut annuler par la couche 18 l'effet combiné des réflexions de l'excitation lumineuse sur la face supérieure du support 10 et sur la couche 24.
En variante et comme représenté en figure 6, on peut remplacer la couche réfléchissante métallique 24 par une cavité de Fabry-Perot non symétrique formée entre deux couches réfléchissantes 22 différentes, dont l'une forme la face supérieure du support 10 et porte les éléments chromophores 12 et dont l'autre est à l'intérieur du support 10 et située à une distance des éléments chromophores 12 qui est inférieure à la quantité précitée λf.n/2NA2.
Une couche absorbante 18 est alors formée sur la face inférieure du support 10 ou au voisinage de cette face inférieure, éventuellement en combinaison avec une couche anti-réfléchissante 20 précitée.
Il est aussi possible de former dans le support une microcavité à miroirs métalliques qui assurent l'annulation de la réflexion de la lumière d'excitation (le mode de cavité correspondant à la longueur d'onde d'excitation à l'angle d'incidence utilisé).
Les solutions à microcavités (à miroirs diélectriques ou métalliques) permettent d'obtenir un contraste de réflectivité entre longueurs d'onde d'excitation et d'émission beaucoup plus élevé par rapport à une solution à couche anti-reflet réalisée sur un support réfléchissant, ce qui diminue le bruit lié à la lumière d'excitation.
On peut également, en variante, utiliser un miroir de Bragg formé par des empilements périodiques de couches de matériaux d'indice élevé et d'indice bas, à bande relativement étroite pour avoir une réflectivité forte à la longueur d'onde de la fluorescence émise et une réflectivité faible en dehors de cette bande, en ajoutant à ce miroir de Bragg une couche antiréfléchissante ou une couche absorbante du type précité, mais ayant une épaisseur très faible pour rester dans le domaine de l'optique ondulatoire. Deux modes préférés de l'invention sont alors les suivants :
- le miroir de Bragg est formé pour présenter exactement l'amplitude et la phase de la réflectivité à λe pour que la combinaison de la réflexion par le miroir de Bragg avec la réflexion par la face supérieure du support 10 annule la réflexion globale de λe par le support,
- le miroir de Bragg n'est pas ajusté avec précision en réflectivité et surtout en amplitude et a une bande large et c'est alors une couche absorbante 18 interposée entre ce miroir et la face supérieure du support 10 qui permet par un choix approprié du produit (αe.d) comme indiqué ci- dessus d'annuler la réflexion globale du support à λe.
On peut utiliser des procédés connus de synthèse optique tels que le procédé "flip-flop" pour former les empilements de couches des miroirs de Bragg.
De façon très générale, on peut jouer sur l'incidence et la polarisation de la lumière d'excitation pour obtenir l'annulation de la réflexion globale par le support tout en simplifiant autant que possible la synthèse des couches empilées, afin de respecter les autres contraintes qui favorisent l'obtention d'un bon signal de fluorescence. Selon un autre aspect, on peut associer le support selon l'invention à des moyens d'éclairage fournissant une excitation lumineuse dont l'incidence et la polarisation sont définies pour réduire la réflexion parasite par le support. Dans les conditions de l'optique ondulatoire, les modes de réalisation de l'invention utilisant des multicouches réfléchissantes (microcavité, miroirs de Bragg, ...) permettent d'assurer également que les éléments chromophores se trouvent au voisinage d'un ventre du champ d'émission, comme déjà décrit dans la demande internationale précitée des mêmes inventeurs.
Dans l'exemple de réalisation de la figure 7, le support 10 comprend une lame de matériau ayant un indice de réfraction n et deux miroirs 26, 28 séparés l'un de l'autre et entre lesquels se trouvent les éléments chromophores 12. Plus précisément, les éléments chromophores 12 sont portés par une couche 30 de matière transparente qui recouvre le miroir inférieur 28 et le miroir supérieur 26 recouvre la couche 30 en étant séparé de celle-ci par une couche entretoise 32 qui est par exemple gravée pour former les cavités dans lesquelles sont déposés les éléments chromophores 12.
Les miroirs 26, 28 fonctionnent dans les conditions de l'optique ondulatoire, c'est-à-dire que le miroir 28 est séparé des éléments chromophores 12 d'une distance qui est inférieure à la quantité λf.n/2NA2 et que la distance entre les deux miroirs 26, 28 est inférieure à la quantité λf.n/NA2.
Les caractéristiques des miroirs 26, 28 sont déterminées pour que la longueur d'onde d'excitation soit transmise par le miroir inférieur 28 et que la longueur d'onde de la fluorescence émise soit réfléchie par le miroir 28 et traverse le miroir supérieur 26 pour pouvoir être captée par les moyens de détection et de mesure.
Une couche absorbante 18 du type précité est formée sur ou au voisinage de la face inférieure du support 10 et est éventuellement associée à une couche anti-réfléchissante précitée comme déjà indiqué pour les modes de réalisation précédents.

Claims

REVENDICATIONS
1. Support d'éléments chromophores, ces éléments (12) étant destinés à être éclairés par une lumière d'excitation (14) pour émettre une fluorescence (16) de longueur d'onde différente de celle de la lumière d'excitation, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une couche interne de matière réfléchissant la fluorescence émise par les éléments chromophores (12) et au moins un moyen d'annulation ou au moins de réduction sensible de la réflexion de la lumière d'excitation, ce moyen étant choisi dans le groupe comprenant :
- une couche (18) de matière absorbant la lumière d'excitation,
- au moins une couche (20) de matière transparente et antiréfléchissante à la longueur d'onde d'excitation formée sur au moins une face du support et ayant un indice de réfraction n' voisin de la racine carrée de l'indice de réfraction du support (10) et une épaisseur égale à un multiple impair de λe/4n'cosθ, étant l'angle des rayons lumineux d'excitation dans ladite couche anti-réfléchissante (20),
- des couches diélectriques et/ou métalliques définissant une microcavité dont le mode de cavité est défini pour annuler la réflexion de la lumière d'excitation.
2. Support selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la couche absorbante (18) a une épaisseur telle que le produit de cette épaisseur par son coefficient d'absorption αe la largeur d'onde d'excitation soit très supérieur à 1 ou ait une valeur connue et contrôlée comprise entre 0,1 et 10 environ.
3. Support selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'une couche absorbante (18) et au moins une couche anti-réfléchissante (20) précitée sont formées sur la face du support opposée à celle portant les éléments chromophores (12).
4. Support selon la revendication 1 , 2 ou 3, caractérisé en ce qu'une couche absorbante (18) et au moins une couche anti-réfléchissante (20) précitées sont formées sur la face du support (10) destinée à recevoir les éléments chromophores.
5. Support selon la revendication 4, caractérisé en ce que la couche anti-réfléchissante (20) est formée sur la couche absorbante (18).
6. Support selon la revendication 1 , 2, ou 3, destiné à être utilisé avec des moyens optiques de collecte de la fluorescence émise ayant une ouverture numérique NA, caractérisé en ce que la couche interne (22) de matière réfléchissant la fluorescence émise par les éléments chromophores (12) est située à une distance d de la face du support destinée à porter les éléments chromophores qui est très supérieure à la quantité λf.n/2NA2, et au moins une couche anti-réfléchissante (20) précitée est formée sur la face du support destinée à recevoir les éléments chromophores.
7. Support selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend également une couche absorbante (18) précitée formée entre la couche anti-réfléchissante (20) et la couche interne réfléchissante (22).
8. Support selon la revendication 6, caractérisé en ce que la couche interne réfléchissante (22) comprend une pluralité de couches diélectriques et a une réflexion sensiblement nulle à la longueur d'onde d'excitation pour l'angle d'incidence de la lumière d'excitation sur le support (10).
9. Support selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite couche interne réfléchissante comprend un empilement de couches ayant une épaisseur égale à λe/4 et des indices de réfraction alternativement élevés et faibles et délimitant une cavité de Fabry-Perot symétrique.
10. Support selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'épaisseur de la cavité est déterminée pour une réflexion nulle à la longueur d'onde d'excitation.
11. Support selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend une couche absorbante (18) précitée entre la couche interne réfléchissante (22) et la face de support opposée à celle destinée à porter les éléments chromophores.
12. Support selon des revendications 1 à 5, destiné à être utilisé avec des moyens optiques de collecte de la fluorescence émise ayant une ouverture numérique NA, caractérisé en ce que la couche interne (24) de matière réfléchissant la fluorescence émise est située à une distance de la face destinée à porter les éléments chromophores (12) qui est inférieure à la quantité λf.n/2NA2.
13. Support selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'une couche absorbante (18) précitée est formée entre la couche interne réfléchissante (24) et la face du support destinée à porter les éléments chromophores.
14. Support selon la revendication 12 ou 13, caractérisée en ce que la couche interne (24) de matière réfléchissante est une couche métallique ou un empilement de couches diélectriques.
15. Support selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que l'épaisseur de la couche absorbante (18) et son coefficient d'absorption à la longueur d'onde d'excitation ainsi que la distance de la couche réfléchissante (24) à la face du support destinée à porter les éléments chromophores sont déterminés pour annuler la réflexion globale de la lumière d'excitation par le support, le produit de l'épaisseur et du coefficient d'absorption de la couche absorbante étant déterminé pour que les amplitudes de la lumière d'excitation réfléchie d'une part par ladite face du support (10) et d'autre part par la couche réfléchissante (24) soient sensiblement égales et la distance de cette face à la couche réfléchissante (24) étant déterminée pour que les phases soient en opposition sur ladite face du support (10).
16. Support selon la revendication 15, caractérisé en ce que la distance D de la couche réfléchissante (24) à ladite face du support est telle que la quantité 2n.Dcosθ est un multiple impair de la demi-longueur d'onde d'excitation.
17. Support selon la revendication 12, caractérisé en ce que la couche interne réfléchissante est formée par un miroir de Bragg réfléchissant la lumière d'excitation avec une amplitude et une phase telles que, par combinaison avec la lumière d'excitation réfléchie par la face du support destiné à porter les éléments chromophores, la réflexion globale de la lumière d'excitation par le support (10) est sensiblement nulle.
18. Support selon la revendication 1 , 2, ou 3, destiné à être utilisé avec des moyens optiques de collecte de la fluorescence émise ayant une ouverture numérique NA, caractérisé en ce qu'il comprend deux couches (22) de matière réfléchissant la fluorescence émise, ces deux couches (22) formant une cavité de Fabry-Perot dissymétrique et étant situées à une distance de la face de support destinée à porter les éléments chromophores qui est inférieure à λf.n/2NA2, et une couche absorbante (18) précitée située entre ces couches réfléchissantes (22) et la face de support opposée à celle destinée à porter les éléments chromophores.
19. Support selon la revendication 1 , 2 ou 3, destiné à être utilisé avec des moyens optiques de collecte de la fluorescence émise ayant une ouverture numérique NA, caractérisé en qu'il comprend deux couches de matière réfléchissant la fluorescence émise, l'une (28) de ces couches étant située à l'intérieur du support à une distance de la face destinée à porter les éléments chromophores qui est inférieure à la quantité λf.n/2NA2, l'autre (26) de ces couches recouvrant la face du support destinée à porter les éléments chromophores et étant située à une distance de la première couche réfléchissante (28) inférieure à la quantité λf.n/NA2, et une couche absorbante (18) précitée formée dans le support entre la première couche de matière réfléchissante (28) et la face du support opposée à celle destinée à porter les éléments chromophores.
20. Support selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la couche absorbante (18) précitée est formée de molécules organiques, éventuellement noyées dans une matrice du type sol-gel ou polymère, ou de pigments inorganiques noyés dans une matrice du type sol-gel ou de boîtes quantiques par exemple du type CdS ou Cd Se dispersées dans une matrice et n'ayant pas de luminescence propre.
21. Support selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est destiné à être éclairé par une lumière d'excitation à polarisation p dont l'incidence est à l'angle de Brewster correspondant au matériau du support et comprend une couche absorbante précitée située à l'intérieur du support.
22. Support selon l'une des revendications précédentes, destiné à porter des éléments chromophores d'au moins deux types différents, émettant une fluorescence à des longueurs d'onde différentes, caractérisé en ce que ladite couche anti-réfléchissante (20) a une faible réflexion pour au moins deux longueurs d'onde d'excitation précitées.
23. Support selon la revendication 22, caractérisé en ce que ladite couche anti-réfléchissante comprend un empilement de couches à faible réflexion pour plusieurs longueurs d'onde d'excitation.
24. Support selon la revendication 22 ou 23, caractérisé en ce que ladite couche absorbante (18) comprend des composants absorbant des longueurs d'onde d'excitation différentes.
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