CN113791059A - 一种低背景信号的毛细管荧光仪 - Google Patents

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黄辉
蔡伟成
李雪晶
李兆林
刘蓬勃
赵剑
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence

Abstract

本发明提供了一种低背景信号的毛细管荧光仪，包括光源、毛细管、滤光片和光电探测器；所述光源和光电探测器置于所述毛细管端面；所述毛细管内部设有“反光膜”与/或“降噪膜”，用于减少杂散激发光、并增加荧光信号；所述毛细管可以为Y型分叉结构，因此无需采用分光片，且待测物无需置于激发光的聚焦焦点处。本发明的荧光仪具有结构紧凑、高灵敏度、操作简便的特点。

Description

一种低背景信号的毛细管荧光仪
技术领域
本发明涉及一种低背景信号的毛细管荧光仪，通过抑制背景信号以提高检测灵敏度。
背景技术
荧光仪可用于检测微量物质含量(即痕量检测)，其检测原理是利用高能量光束(即激发光)激发待测物，使待测物辐射特征荧光(荧光波长大于激发光波长)，通过检测特征荧光可以获知待测物中微量物质的成分与含量。当利用激光作为激发光时，荧光仪称为“激光诱导荧光仪(LIF)”。由于激发光很强、荧光很弱，如何抑制激发光泄露所导致的背景信号与背景噪声，成为提高检测灵敏度的关键。注：背景噪声来自背景信号，通常背景噪声随背景信号而增大。
当前，荧光仪通常采用毛细管作为样品池。毛细管可以提供长的光程，从而提高激发效率、增强荧光信号，而且毛细管还具有样品需求量少的优点(Optics and Lasers inEngineering,2021,139,106488)。现有的毛细管样品池，主要有两类：透明毛细管(如石英毛细管)；不透明毛细管(如金属毛细管)。分别存在以下缺点：对于透明毛细管，激发光会透过毛细管的管壁(或在管壁内传输)，从而导致激发光泄露到管外，增加背景噪声；对于金属毛细管，由于金属管内壁的粗糙度较大，内壁会漫反射激发光和荧光，从而导致荧光信号损耗、以及激发光泄露。
综上，为了解决上述问题，探索新的荧光仪结构，是本发明的创研动机。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之不足，提供一种低背景信号的毛细管荧光仪。
本发明的技术方案：
一种低背景信号的毛细管荧光仪，在毛细管内部设置反光膜与/或降噪膜，且在毛细管两端均具有滤光片。
所述的反光膜用于反射激发光和荧光，直接贴敷于毛细管内壁面或通过支撑膜贴敷于毛细管内壁面。
所述的反光膜材质为高反射率材料(如光子晶体，金属)，金属优选材质为铝、银、钛、不锈钢、金属合金等。其中，所述光子晶体为折射率呈现周期性变化的材料，如介质膜反射镜等。
所述的反光膜厚度大于50nm。
所述的反光膜表面镀有保护膜(如Al2O3，SiO2)，以防止反光膜受损(如被氧化，或被溶液腐蚀)。
所述的降噪膜附着在支架表面，置于毛细管内，位于出光端。
所述的降噪膜材质为半导体材料，如GaN、InGaN、AlGaN、TiO2、SnO2、ZnO、Ga2O3、WO3等。所述半导体材料，其电子能带的带隙宽度(或称禁带宽度)介于激发光与荧光的光子能量之间，因此能够吸收杂散激发光，且不吸收荧光。其中，优选TiO2材料(金红石结构)，其禁带宽度约为3.2eV，能够吸收波长小于387.5nm(即光子能量大于3.2eV)的激发光，而且不吸收波长大于387.5nm(即光子能量小于3.2eV)的荧光。注：此处的数据(如禁带宽度和波长)仅用于原理性说明，与实际值可能存在偏差(如具体的禁带宽度与晶格结构、晶粒尺寸、以及制备方式等有关)。
所述降噪膜，优选间接带隙和/或晶体缺陷较多的半导体材料，从而减少降噪膜自身辐射的荧光。注：与直接带隙半导体相比，间接带隙半导体的发光效率极低；此外，晶体缺陷也会降低发光效率，从而减小背景荧光信号。
所述降噪膜，可附着在反光膜表面，即在毛细管内表面形成“反光膜-降噪膜”双层复合结构。其中，反光膜可以将激发光和荧光约束在毛细管内传输(无法泄露到管外)；降噪膜可以“吸收杂散激发光”且“不吸收荧光”。因此，该双层复合结构具有“减少杂散激发光”、“约束激发光”、以及“约束荧光”这三重功能。注：所述反光膜与毛细管可采用同一种材质；降噪膜与毛细管内壁呈平行排列，因此沿毛细管平行传输的激发光(非杂散光)不会入射到降噪膜(即不会被其吸收)。
所述降噪膜，可以附着在支架表面，并置于毛细管内部。其中，所述支架的形状包括管状、柱状、丝状、或薄片状等，支架的材质选自对荧光吸收小的物质(如金属、石英、以及金属氧化物等)。其中，薄片状的支架可以折叠成多边形或星形的管状结构(即降噪膜呈现多边形或星形)，从而增加杂散激发光与降噪膜的入射次数(即增加对杂散激发光的吸收)，并减小液体流动的阻力(即减少流动死区)。
所述降噪膜，优选与毛细管(或反光膜)同一种金属材料。例如，降噪膜为TiO2材料，对应的毛细管则选Ti材料，制备工艺为：将Ti毛细管进行氧化，其内表面可以氧化形成一层TiO2薄膜(即“Ti-TiO2”双层复合结构)。该制备工艺简单、结构稳定(TiO2薄膜与Ti管之间为一体化结构)，而且通过调节氧化的时间和温度，可以调节TiO2薄膜的厚度。
所述的降噪膜厚度大于20nm。
所述毛细管，其材质选自石英玻璃、蓝宝石、铝、银、钛、锡、钨、铁、锌、不锈钢、以及金属合金等材料，优选光学反射率高的金属材料(如Ag和Al)；其截面形状可以是圆形、矩形或多边形；在长度方向上，毛细管可以是直的、弯曲的、分叉的或螺旋状的。
所述的毛细管为Y型分叉结构，其中的一个分叉用于传输激发光，另一个分叉用于传输荧光，交汇处端口外部安放待测物。此时，待测物无需流经毛细管(放置在毛细管端口处)，因此更适合检测固态待测物(或不流动的液态待测物)。与传统共聚焦结构的LIF相比，所述Y型分叉结构毛细管无需采用分光片，且待测物无需置于激发光的聚焦焦点处。
所述支撑膜优选表面光滑的材质(如塑料，石英玻璃，蓝宝石等)，因此反光膜可以提高毛细管内壁的反射率，同时支撑膜可以降低内壁粗糙度，从而减少杂散激发光的产生。
所述的毛细管的端面与滤光片之间设置有带孔的吸光片或反射镜。
所述的滤光片表面附着一层降噪膜。
所述滤光片是线性渐变滤光片，以测试荧光光谱。
所述毛细管，其端面设置有带孔的吸光片(或反射镜)，使得激发光可以透过小孔进入毛细管，并使得激发光的光束直径小于毛细管内径，从而有效减少激发光与毛细管侧壁的接触(即减少杂散激发光)。其中，所述吸光片，用于吸收激发光，其材质选自降噪膜材质和黑色物质(如阳极氧化铝、无机纳米材料、绒布)等。其中，所述反射镜用于反射激发光。
所述光源，用于发射激发光，选自激光器、LED、等离子、以及灯丝等。
所述光电探测器，用于探测待测物所发射的荧光。
所述待测物置于毛细管内或毛细管端口处。
所述杂散激发光，是指当激发光入射到毛细管内壁时，毛细管内壁的粗糙表面导致漫反射(或散射)，从而使激发光的传播方向杂散化。因此，漫反射会增加了侧壁的反射次数与反射损耗(反射损耗随反射次数而增加)，从而降低激发光与荧光信号的强度；此外，杂散激发光能泄露通过滤光片，从而增加背景信号。注：金属毛细管的内壁难以抛光成镜面，因此内壁表面较为粗糙。
所述滤光片，位于毛细管端面。其中，毛细管出口处的滤光片，用于反射激发光、透过荧光(即长波通滤光片或带通滤光片)；所述滤光片可以选用线性渐变滤光片(linearvariablefilter)，以获得荧光光谱；所述滤光片表面附着一层降噪膜，用于吸收杂散激发光。
本发明的技术效果：
(1)传统荧光仪所采用的毛细管，主要为石英毛细管和金属毛细管，其中只有金属毛细管可以起到“约束激发光和荧光”的双重功能。与此相比，本发明的毛细管由于引入“降噪膜”与/或“反光膜”，除了“约束激发光和荧光”之外，还能起到“减少杂散激发光”，从而更有效的抑制背景信号和噪声。
(2)本发明的毛细管，其内壁可以附着“反光膜”层或“支撑膜-反光膜”双层结构，从而提高毛细管内壁的光学反射率，同时降低内壁表面的粗糙度和相关漫反射。
(3)本发明的降噪膜，可以制成多边形或星形管状结构，从而增加对杂散激发光的吸收，并减小液体流动的阻力。
(4)本发明的Y型分叉结构毛细管，其中的一个分叉用于传输激发光，另一个分叉用于传输荧光，更适合检测固态待测物，并且操作简便。
附图说明
图1为毛细管荧光仪的结构示意图。
图2为Y型分叉结构毛细管荧光仪的结构示意图。
图3为内壁附着反光膜的毛细管结构示意图。
图4为内壁附着支撑膜和反光膜的毛细管结构示意图。
图5为内壁附着支撑膜、反光膜和保护膜的毛细管结构示意图。
图6为内壁附着降噪膜的毛细管结构示意图。
图7为内壁附着反光膜和降噪膜的毛细管结构示意图。
图8为内部放置支架与降噪膜的毛细管结构示意图。
图9为置于毛细管内三角形管状支架的截面图。
图10为置于毛细管内星形管状支架的截面图。
图11为带有降噪膜的滤光片截面图。
1、光源；2、激发光；3、第一滤光片(短波通或带通)；4、降噪膜；5、毛细管；6、荧光；7、吸光片或反射镜；8、第二滤光片(长波通或带通)；9、透镜；10、光电探测器；11、第一小孔；12、第二小孔；13、反光膜；14、支架；15、待测物；16、遮光罩；17、支撑膜；18、保护膜。
具体实施方式
下面结合附图和技术方案，对本发明进行详细的说明。
本发明提供一种荧光仪(图1和图2)，该荧光仪主要包括光源1、毛细管5、以及光电探测器10，所述光源1和光电探测器10设置于所述毛细管5的两端。其中，所述毛细管5的内径为10μm～10cm。
所述光源1发射的激发光2，进入毛细管5的入口(或图2所示的Y型毛细管的一个分支入口)，并沿着毛细管5的轴向传输。激发光2在毛细管内传输时，激发毛细管内部的待测物15(或图2所示的Y型毛细管端口外的待测物15)，使得待测物15发射荧光6。所述荧光6被约束在毛细管5内传输，并从毛细管5的出口输出(或图2所示的Y型毛细管的另一个分支出口)，经过透镜9汇聚后被光电探测器10接收。
所述Y型毛细管5(图2)，其三个端口分别用于引入激发光2、输出荧光6、放置待测物15，激发光2可以经毛细管的一个分支入射到待测物15，待测物15发射的荧光6可以经毛细管的另一分支传输到光电探测器10；因此，激发光2和荧光6在毛细管的不同分支内传输，无需分光片来分离激发光2和荧光6的传输光路。其中，遮光罩16用于防止环境光进入毛细管5内。所述Y型毛细管5，待测物15也可以进入毛细管5的内部，此时可以进一步提高荧光的收集效率。
注：现有的共聚焦LIF，其激发光和荧光的传输光路是相同的，因此需要45度分光片来分离二者的传输光路；而且，待测物需要精确放置在激发光的聚焦焦点处，因此难以测试位置不固定的待测物(如固态待测物)；与此相比，Y型毛细管的待测物则无需精确放置。
注：现有的光纤LIF，是通过光纤来传输激发光与荧光，由于光纤的数值孔径有限，光纤对荧光的收集效率较低，特别是表面不光滑的待测物会进一步降低荧光的收集效率；与此相比，由于毛细管的侧壁具有高反射率，毛细管的荧光收集效率要远高于光纤，而且毛细管内还能放置降噪膜以降低背景噪声(光纤内部难以放入降噪膜)。
所述光源1与毛细管5之间，设置有短波通滤光片(或带通滤光片)3，用以滤除激发光2中的长波成分。注：由于激发光通常不是严格的单色光(激发光的波长范围较宽)，为了避免激发光波长与荧光波长重叠(如果光波长重叠，则无法分离激发光与荧光，导致背景噪声增加)，需要把激发光的长波部分滤除。
所述光源1与毛细管5之间，设置有带孔11的吸光片(或反射镜)7，用于吸光(或反射)激发光。因此通过小孔11进入毛细管5内部的激发光2，其光束直径受限于小孔11的孔径。当小孔11的孔径小于毛细管5的内径时，进入毛细管的激发光光束直径能够小于毛细管内径，从而有效避免激发光2与毛细管侧壁接触，减少侧壁漫反射导致的杂散激发光。注：滤光片通常由介质膜构成，其滤光效果与光束入射角度有关(垂直入射时滤波效果最好)；由于杂散激发光的入射角是杂乱的，滤光片8无法有效阻挡杂散激发光，从而导致背景信号增大。
所述毛细管5(图3)，其内壁可以镀一层反光膜13，从而提高对激发光2和荧光6的反射率。
所述毛细管5(图4和图5)，还可以在其内壁贴一层支撑膜17和反光膜13。所述反光膜13是镀在支撑膜17的表面，用以提高对激发光2和荧光6的反射率。由于支撑膜17可以选用表面光滑的材料，因此能降低毛细管内表面的粗糙度和相关漫反射。为了避免反光膜13的氧化和腐蚀，在其表面镀一层保护膜18。注：由于毛细管5的内壁抛光比较困难，特别是金属毛细管难以抛光成镜面(即内壁较粗糙)，因此存在漫反射所导致的光损耗和光泄露。
所述毛细管5(图6)，其内壁可覆盖一层降噪膜4，从而减小毛细管内壁对激发光2的漫反射，实现减小背景信号。
所述毛细管6(图7)，其内壁可覆盖“反光膜13-降噪膜4”双层复合结构，其中降噪膜4镀在反光膜13的表面。其中，反光膜13用于反射激发光2和荧光6，从而将激发光2和荧光6约束在毛细管内传输(无法泄露到管外)；并且，降噪膜4可以“吸收激发光2”且“不吸收荧光6”。因此，该双层复合结构具有“吸收激发光”、“约束激发光”、以及“约束荧光”这三重功能。
所述降噪膜4(图8)，是镀在支架14的表面，其中降噪膜4选用TiO2膜，支架14选用石英柱。然后将镀了TiO2膜4的石英柱14放入毛细管5内，其中石英柱的直径和长度，分别小于毛细管5的内径和长度。
所述支架14，除了可选用石英柱，还可选用石英管，膜片等。其中，膜片支架14(图9和图10)的形状为三角形管或星形管(即管的截面为三角形或星形)。在三角形管(或星形管)14的表面镀了降噪膜4之后，置于毛细管5内。此时待测液体可以同时从管内和管外流过，因此对流体的阻力和死区都会降低(管壁越薄，流动的阻力和死区越小)。
所述吸光片(或反射镜)7，设置于滤光片3的左侧或右侧，优选右侧(如图1所述)。所述吸光片(或反射镜)7，选自吸光片、反射镜、或二者的组合。其中，组合是指将吸光片与反射镜叠在一起的双层结构。
所述长波通滤光片(或带通滤光片)8，设置于毛细管5的出口端。由于激发光2的波长小于荧光6的波长，因此滤光片8可以透过荧光6、并反射激发光2(即阻挡激发光)，从而降低背景信号。所述滤光片8(图11)，其正对毛细管一侧的表面还可镀一层降噪膜4，用于吸收激发光2，特别是杂散激发光。
所述吸光片7，设置于毛细管5出口与滤光片8之间，用于进一步减少激发光2的泄露。由于被滤光片8反射的激发光2有可能从“端口缝隙”泄露(毛细管出口与滤光片8之间的缝隙)。因此引入吸光片7，可以吸收从缝隙泄露的激发光(吸光片7位于缝隙内)，从而防止激发光2从端口缝隙泄露出去。这种“反射”与“吸收”功能的有机结合(滤光片8与吸光片7相结合)，能更有效的避免激发光2泄露到毛细管5之外，进一步抑制背景噪声。类似情况，吸光片7也能减少激发光从毛细管入口处的端口缝隙泄露出去(该缝隙位于毛细管入口与滤光片3之间)。
所述吸光片7，其中部具有第二小孔12。该小孔的孔径小于毛细管外径，从而有效吸收经过端口缝隙泄露的激发光；同时，该小孔使得荧光可以通过小孔和滤光片8，并被光电探测器10接收。
所述端口缝隙，位于毛细管两端(毛细管端口与滤光片之间的缝隙)，是用来流通待测样品，因此该缝隙无法消除。所述端口缝隙的宽度，介于1微米至1厘米之间，优选0.01至2毫米之间。
实施例1
如图1所示，光源1发出的激发光2，透过短波通滤光片3和吸光片7的小孔11，然后从毛细管5的入口进入毛细管5，并激发管内待测物15以产生荧光6，最后被毛细管出口端的吸光片7吸收和滤光片8反射回去。
由于不锈钢毛细管5内壁附着peek塑料支撑膜17和铝反光膜13(图4)，反光膜13可以作为管壁来反射荧光6，并使得荧光6在毛细管5内传输。荧光6通过吸光片小孔12和滤光片9，经透镜9汇聚后，进入光电探测器10。
由于光源1发射的激发光2，具有一定的光束发散角，因此即便有小孔11的限制(入口端的激发光5的光束直径小于毛细管内径)，激发光2在毛细管内传输时仍会发散、并入射到毛细管内壁，从而导致杂散激发光的产生。
与不锈钢毛细管5自身的内壁相比，支撑膜17和反光膜13的表面更为光滑，因此可以有效减少内壁粗糙度导致的杂散激发光，降低了背景噪声。而且，光滑的管壁，可以降低漫反射所导致的激发光2和荧光6在管内的传输损耗，从而增强荧光信号。
实施例2
如图2，光源1发出的激发光2，通过Y型分叉毛细管5的一个分支，入射到毛细管5端口处的待测物15。待测物被激发所产生的荧光6，沿着Y型分叉毛细管5的另一个分支传输，并被毛细管5另一端口处的光电探测器10接收。
此时，荧光6和激发光2是沿着不同的毛细管分支传输，因此无需45度分光片(减小仪器体积)；待测物15无需进入毛细管内，更适合测试固态待测物；而且，与共聚焦LIF相比，激发光2是直接入射到待测物15(即激发光2无需聚焦到待测物15)，因此无需将待测物15放置在激发光2的聚焦焦点上(无需精确对准)，操作简便；此外，与光纤LIF相比，石英毛细管5内壁带有银反光膜13(图3)，其数值孔径更大，能更有效的收集荧光6。
毛细管5内部可以放入三角形管状石英支架14。支架14的制备过程如下：在截面为三角形的石英管14的外表面镀200nm的TiO2膜4(TiO2膜作为降噪膜)。该TiO2膜可以吸收波长310nm的激发光2，对波长500nm的荧光6则不吸收，因此可以吸收杂散激发光，从而减小背景信号。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种低背景信号的毛细管荧光仪，其特征在于，在毛细管内部设置反光膜与/或降噪膜，且在毛细管两端均具有滤光片。
2.根据权利要求1所述的毛细管荧光仪，其特征在于，所述的反光膜直接贴敷于毛细管内壁面或通过支撑膜贴敷于毛细管内壁面，其材质为高反射率材料，厚度大于50nm。
3.根据权利要求2所述的毛细管荧光仪，其特征在于，所述的反光膜的材质为铝、银、钛、不锈钢、金属合金或光子晶体。
4.根据权利要求3所述的毛细管荧光仪，其特征在于，所述的反光膜表面镀有保护膜。
5.根据权利要求1-4任一所述的毛细管荧光仪，其特征在于，所述的降噪膜附着在反光膜表面，即在毛细管内表面形成“反光膜-降噪膜”双层复合结构；或所述的降噪膜附着在支架表面，置于毛细管内，位于出光端，其材质为半导体材料，厚度大于20nm。
6.根据权利要求5所述的毛细管荧光仪，其特征在于，所述的降噪膜的材质为GaN、InGaN、AlGaN、TiO2、SnO2、ZnO、Ga2O3或WO3。
7.根据权利要求1-4、6任一所述的毛细管荧光仪，其特征在于，所述的毛细管为Y型分叉结构，其中的一个分叉用于传输激发光，另一个分叉用于传输荧光，端口外部安放待测物。
8.根据权利要求7所述的毛细管荧光仪，其特征在于，所述的毛细管的端面与滤光片之间设置有带孔的吸光片或反射镜。
9.根据权利要求8所述的毛细管荧光仪，其特征在于，所述的滤光片表面附着一层降噪膜。
10.根据权利要求9所述的毛细管荧光仪，其特征在于，所述滤光片是线性渐变滤光片，以测试荧光光谱。
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