EP1573378A1 - Verfahren und anordnung zur optischen untersuchung und/oder bearbeitung einer probe - Google Patents

Verfahren und anordnung zur optischen untersuchung und/oder bearbeitung einer probe

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EP1573378A1
EP1573378A1 EP03767713A EP03767713A EP1573378A1 EP 1573378 A1 EP1573378 A1 EP 1573378A1 EP 03767713 A EP03767713 A EP 03767713A EP 03767713 A EP03767713 A EP 03767713A EP 1573378 A1 EP1573378 A1 EP 1573378A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sample
arrangement according
spectral components
pulse
light
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03767713A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ralf Wolleschensky
Michael Kempe
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Carl Zeiss Microscopy GmbH
Original Assignee
Carl Zeiss Jena GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss Jena GmbH filed Critical Carl Zeiss Jena GmbH
Publication of EP1573378A1 publication Critical patent/EP1573378A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
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    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers

Definitions

  • the invention advantageously makes it possible to use a feedback process to vary the amplitude and / or phase modulation of the light pulses in a Fourier plane in such a way that a corresponding measurement variable (e.g. the two-photon fluorescence signal) is optimized in a microscope. Furthermore, it is possible with the arrangements according to the invention to achieve high pulse peak powers at the location of the sample without thereby causing harmful effects in the microscope arrangement or in layers outside the focal area in which the measurement variable is to be excited. The arrangement can also be used to variably adapt the beam cross section to optimally fill the optics focusing in the sample.
  • Fig. 1 the basic principle of the invention is shown schematically.
  • a short-pulse light source LQ emits coherent (short-pulse laser) or temporally incoherent light (broadband or white light source) which, advantageously collimated, reaches a first dispersive element D1, for example a prism or grating.
  • the dispersive element spectrally decomposes the incoming radiation around its central wavelength, so that the spectral components, shown here as 11-15, each
  • Light pulse can be spatially separated.
  • a second dispersive element D2 has an essentially identical characteristic with regard to the spectral decomposition, but is arranged spatially opposite to the first element D1.
  • the light again runs in parallel (collimated), but still spatially separated and passes through an arrangement for scanning optical scanning a sample T (F ⁇ g.l), which is only indicated here with an X / Y scanner SC and an objective lens O.
  • the scanners X / Y are located in the vicinity of the rear pupil of the objective 0. This is indicated schematically by the designation of the focal length f of the objective.
  • the radiation is again focused in the direction of the sample T via the objective. This means that the spectral decomposition in the focus of the objective O is canceled again and the light pulse of the light source LQ is thereby reconstructed.
  • the length of the light pulses in the range between D1 and O depends on the spatial spectral resolution of the splitting of the light pulses.
  • One advantage of such an arrangement is that the optics traversed by the light pulses do not have to be protected from damage by very short pulses or by very high pulse peak powers, at least in area 3.
  • the high pulse peak powers only occur directly at the location of the sample interaction, i.e. in the focal area, in which, for example, a nonlinear sample interaction (e.g. two-photon fluorescence excitation) is carried out with a dye. This protects the samples from damage at least outside the area in which the sample interaction is to be carried out.
  • a better correction of the optical arrangement for imaging in the sample can be achieved, since there is a greater variety of materials and optical layers that can be used. This also saves costs.
  • phase plates PP can be inserted in the collimated beam path, for example in front of the scanner SC.
  • the phase plates have a different thickness along their cross section to change the optical refractive index, so that certain spectral components are delayed in time in relation to other spectral components. This allows the group speed dispersion GVD of the optics in the entire beam path of the light source LQ up to the sample T including additional gias materials OM.
  • phase plates of different shapes By using several such phase plates of different shapes, the shape of the light pulses can be influenced.
  • the phases of the spatially separated portions can also be adjusted flexibly, for example with a spatial light modulator SLM, which has individually controllable elements (advantageously in matrix form) and is arranged instead or additionally in the vicinity of PP in the beam path.
  • SLM spatial light modulator
  • elements D1 and D2 can be used for variable beam expansion.
  • the spacing of the elements D1 and D2 is changed, which results in a beam expansion depending on the spacing of the elements (see also FIGS. 3a, 4a, 6a - S1 and S2), depending on the design of the elements D1 and D2, at least in one spatial direction.
  • At least one further light source can be coupled in via a beam splitter, for example for the parallel detection of the reflection light of the sample by further detectors described below.
  • FIG. 2 shows an arrangement as shown in a laser scanning microscope, with pinhole optics PO, pinhole PH, detectors DE1 and DE2 and a first dichroic beam splitter (main color splitter) MDB 1 for coupling out the detection light from the illuminating beam path after the scanners SC ( descanned detection), a scanning optics SO, an intermediate image ZB, a tube lens and a further detection beam path for non-descanned detection DE3.
  • the non-scanned detection light is reflected here via a further dichroic beam splitter MDB2.
  • the additional division of the detection light into several detection channels can be carried out by using a further dichroic beam splitter, for example for two channels DE1 and DE2 with MDB3.
  • appropriate filters are advantageously pivoted in front of the detectors between the MDB and the DE.
  • P is the pupil of the microscope objective O. The pupils of the microscope arrangement are conjugated to this plane
  • Scanner SC for scanning the sample.
  • the unit for spectrally spatial splitting of the spectral components of the light source DISP consists of the elements D1 and D2 already explained above. It is advantageously located in the collimated beam path between the light source and the
  • the DISP unit generally also acts like a pre-chirp unit, i.e. it can be used to compensate for at least a portion of the GVD of the microscope optics.
  • the adjustability of the compensation is shown in Fig. 11.
  • the remaining GVD can be compensated for using the phase plate PP (see also above) in the collimated beam path, for example in front of the scanner SC, which has different thicknesses across its cross section, e.g. a
  • the curvature is set so that the remaining GVD of the optics in the
  • Beam path from light source LQ to sample T is compensated and thus bandwidth-limited pulse lengths due to individual time delays
  • Spectral components of the light pulses i.e. the shortest possible pulse lengths at the location of the
  • the shape of the pulse can be further influenced.
  • the influence is necessary due to the effect of the following factors, whereby the pulse length is usually no longer bandwidth-limited due to the influence at the location of the sample, i.e. longer pulses occur:
  • an SLM is therefore particularly advantageous and, as already described above, the phases of the spatially separated portions can be adjusted flexibly to one another by individually controllable elements (advantageously in matrix form).
  • the elements are controlled depending on the above. Variables by the control advantageously in real time, for example a two-photon fluorescence signal, which is excited in the sample T, acts as the measurement variable. In most cases, the appropriate regulation optimizes the pulse length at the location of the sample interaction.
  • the cross sections of interaction of the dyes used are dependent on the temporal behavior of the light pulses. It is thus possible to optimize the fluorescence signal for individual dyes, the fluorescence of other dyes being suppressed at the same time. It is therefore possible to adjust the temporal behavior of the light pulses by phase or amplitude modulation by feedback of the measured variable (here the two-photon fluorescence signal) so that the corresponding measured variable is optimized.
  • FIGS. 3a and 4a arrangements for the unit for spectrally spatial splitting of the spectral components of the light source DISP, e.g. described for D1 and D2.
  • 3 shows two axicons A1, A2, A1 being illuminated, for example, from the tip.
  • the axicons are arranged and designed in such a way that the first axicon introduces an angular dispersion which is compensated for again by the second axicon, so that a parallel beam is again present in the beam direction after the second axicon.
  • D2 is constructed in such a way that it has a plane plate effect together with D1, in the specific case this means that D1 has a plane plate with a prismatic or axicon-shaped recess, into which D2 fits (theoretically) and forms a plane plate with D1 ,
  • the axicons can be made of prismatically ground glass plates (refractive elements) or, for example, ring-shaped elements to increase the angular dispersion of diffractive elements Lattice structures exist.
  • reffractive elements prismatically ground glass plates
  • ring-shaped elements to increase the angular dispersion of diffractive elements Lattice structures exist.
  • Fig. 4 shows an arrangement with two prisms P1, P2, P1 being, for example, from the. Illuminated at the tip, the first prism in turn introduces an angular dispersion which is compensated for by the second prism, so that a parallel beam is again present in the beam direction after the second prism.
  • the first prism in turn introduces an angular dispersion which is compensated for by the second prism, so that a parallel beam is again present in the beam direction after the second prism.
  • 3b, 4b each show the beam distribution before the first element and in 3c, 4c after the second element.
  • the spectral components 11, 12 ... are split next to one another in a row, when using axicons in a ring in several planes, each spectral component filling a specific ring.
  • Arrows S1, S2 indicate a possibly coupled movement of the two dispersive elements to one another or away from one another, which is controlled via a control unit (not shown).
  • this shift also causes a change in the pulse length at the location of the sample T (see, for example, DE 19744302A1, DE19930532A1, without removing the spatial separation).
  • the adjustment of the pulse shape described can also be carried out in connection with other control functions of the microscope, for example for changing the spectral composition of the illumination and / or the intensity (DE19829981 A1) during image acquisition for certain sample areas. It is controlled via the central control unit of the microscope. .
  • the elements D1 and D2 can be readjusted in relation to one another.
  • FIG. 5 shows a further embodiment of the DISP unit with straight view prisms GP, which are also called Amici prisms.
  • the straight view prism generates a fixed, non-adjustable spatial splitting of the spectral components of the light source and thus also a fixed beam expansion.
  • the spectral components of the light pulses are then again spatially aligned in parallel.
  • the advantage of this arrangement of the DISP is that a high transmission and a mechanically stable structure can be realized particularly easily.
  • 6 shows a further arrangement with two transmission grids.
  • the beam path is essentially equivalent to the arrangement in Fig. 4.
  • the angle dispersion can be increased by using the grating.
  • the zeroth diffraction order of the grating which is denoted by 0 in the figures, also results on the optical axis.
  • the first diffraction order after the first transmission grating enters into the negative diffraction order of the second grating. This eliminates the angular dispersion, but the beams remain spatially separated.
  • reflecting elements such as reflection gratings or elements which, in addition to the angular dispersion, also introduce a deflection (such as, for example, dispersion prisms - partial image A or reflection gratings - partial image B) can also be used (see also DE19744302A1).
  • Figure 11 shows such arrangements schematically.
  • the center wavelength changes not only the dispersive elements themselves D1 and D2 have to be moved relative to one another, but either the beam path from the light source LQ up to and including D1 or D2 up to and including the sample T.
  • the movement B takes place as indicated by arrows , here perpendicular to the optical axis, which is formed from the light source.
  • Figure 7 shows the lateral intensity distribution normalized to one in focus, i.e. at the location of the sample T.
  • the reference distribution (1) for an illumination according to the prior art is shown, with all spectral components of the light source uniformly illuminating the pupil of the optics focusing in the sample.
  • the intensity distribution for illuminating the pupil with an arrangement according to the invention according to FIG. 3 is shown (2). It can be seen that the curve (2) deviates only insignificantly from the reference curve (1) and thus a comparable optical resolution can be achieved in particular in multiphoton microscopy
  • FIG. 8 shows the intensity distribution normalized to one in focus and on the optical axis as a function of time (pulse distribution) as an example for the formation of elements D1 and D2 according to FIG. 3.
  • P1 represents the pulse distribution at the laser output.
  • P2 is the pulse length between the dispersive element D1 and the sample T.
  • the curve P3 shows the pulse distribution at the location of the sample T. It can be seen that between the element D1 and the sample T there is an almost constant laser intensity (in the time window shown) with a consequently low peak intensity. The peak pulse power is therefore low in this area. However, at the location of the sample, ie after the spatial overlay of the spectral components, a pulse distribution results that is almost identical to the pulse distribution at the laser output.
  • FIG. 9 schematically shows a further arrangement in a laser scanning microscope. It is essentially identical to the arrangement according to FIG. 2. However, a single-mode glass fiber (FIBER) with two optics for coupling into the glass fiber and an additional dispersive element D is provided between the light source LQ and the first dispersive element D1.
  • the dispersive element can be a block with a highly dispersive glass material or crystal such as Te02. In this case, however, appropriate compensation of the total dispersion GVD of the optical arrangement between the light source LQ and sample T is to be provided, for example, at the location PP.
  • the dispersive unit D can also be configured to be adjustable in accordance with DE19744302A1, DE19930532A1.
  • the phase plate or flexible unit at location PP can then be omitted, since unit D can then carry out the entire compensation of the GVD.
  • the GVD inserted by the elements D1 and D2 can accordingly be used to compensate for the self-phase modulation SPM, which can occur at high intensities in the glass fiber.
  • the dispersion caused by the elements D1 and D2 can be chosen to be significantly higher. This increases the mean power that can be coupled by the glass fiber and thus the peak intensity that can be achieved at the location of the sample T.
  • FIG. 10 shows a further structure of a laser scanning microscope with an optical fiber.
  • a glass fiber bundle FB between the elements D1 and D2.
  • the light is coupled into and out of the glass fibers with the help of 2 lenses L1 and L2.
  • the glass bevels are located in one focal point of the lenses L1 and L2 and the dispersive elements D1 are in the remaining one and D2.
  • the focal lengths of the lenses do not have to be identical. However, if the focal length is chosen differently, the grating D2 must be adapted accordingly.
  • the geometry of the fiber bundle results from the choice of the dispersive elements D1 and D2. If, for example, an element according to FIG. 3 is used, then the fiber bundle must have a circular cross section corresponding to 10a.
  • the individual fibers When using elements corresponding to FIGS. 4 to 6, the individual fibers must be arranged in a row in the fiber bundle.
  • 10a / b schematically shows fiber bundles, individual fibers being shown in black by way of example.
  • Microlenses can also be arranged in front of the individual fibers for more efficient coupling into the fiber.
  • D1 Due to the effect of D1, only certain spectral ranges are coupled into each fiber, so that the fiber sees no or only very long pulses and thus only low pulse peak powers or pulse peak intensities, which can otherwise lead to harmful effects, particularly in the glass fibers. This means that the fibers can conduct significantly higher average powers without changing the pulse shape.
  • the spectral components decoupled from the glass fiber bundle are collimated with L2, the individual spectral components intersecting as parallel bundles. The remaining angular dispersion is canceled again with D2, the spectral components still being spatially separated.
  • the following optics correspond to the components already explained with reference to FIG. 2. With the aid of the shift S2 along the optical axis, the illumination of the optics focusing in the sample can in turn be adjusted.
  • the time differences of the individual spectral components and the group velocity dispersion GVD of the light pulses are compensated for using PP, preferably with a flexible unit (SLM) with controllable elements in a linear or matrix arrangement.
  • SLM flexible unit
  • the arrangement of a glass fiber bundle described creates a novel advantageous arrangement with a module consisting of the light source, the spectral splitting D1 and the coupling into the fibers and behind the fiber bundle the microscope module with the second dispersive element D2, which are decoupled from one another in this way and can be designed individually interchangeable.

Abstract

Verfahren und Anordnung zur optischen Untersuchung und/ oder Bearbeitung einer Probe, mit Mitteln zur Erzeugung eines Beleuchtungslichtes, diesen nachgeordneten Mitteln zur spektralen Aufspaltung des Beleuchtungslichtes zur Erzeugung räumlich getrennter Spektralkomponenten, Mitteln zur Parallelisierung des aufgespaltenen Beleuchtungslichtes, Mitteln zur Fokussierung des Beleuchtungslichtes auf oder in die Probe, wobei die Spektralkomponenten überlagert werden sowie Mitteln zur Detektion des Probenlichtes, vorteilhaft mit Mitteln zur Erzeugung eines kurzpulsigen Beleuchtungslichtes, diesen nachgeordneten Mitteln zur spektralen Aufspaltung des Beleuchtungslichtes zur Erzeugung räumlich getrennter Spektralkomponenten mit Pulslängen, die grösser sind als die Pulslänge der Beleuchtungslichtquelle, wobei diese in der Probe wieder vereinigt werden.

Description

Verfahren und Anordnung zur optischen Untersuchung und /oder Bearbeitung einer Probe
Stand der Technik:
In der Mikroskopie zur Untersuchung von z.B. biologischen Präparaten werden heutzutage immer häufiger nichtlineare Kontraste, wie die Multi-Photonen Absorption oder die Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) eingesetzt. Um die zur Anregung von nichtlinearen Effekten nötige Energie bereitzustellen, ist es vorteilhaft Kurzpulslaser einzusetzen. Dabei sollte die Pulsspitzenleistung möglichst groß und damit die Pulslänge am Ort der Probe möglichst klein sein, um eine gleichzeitige Schädigung der Präparate zu verhindern. Kurzpulslaser liefern beispielsweise Lichtimpulse mit einer Pulslänge von einigen 10fs bei einer Repetitionsrate von mehreren 10 MHz. Sie haben dadurch den Vorteil äußerst hohe Pulsspitzenenergien bei gleichzeitig geringer mittlerer Leistung zu emittieren. Nachteilig ist, dass sich die kurzen Pulse auf dem Weg durch das Mikroskop zur Probe durch die Gruppengeschwindigkeitsdispersion (GVD) verändern -- im Normalfall werden sie länger.
Zur Kompensation der Pulsverlängerung wurden in entsprechende Anordnungen vorgeschlagen (DE19827139A1 , DE19744302A1 , DE19930532A1). Die beschriebenen Vorrichtungen sind im wesentlichen nur zur Kompensation der Dispersion 2. Ordnung geeignet. Somit sind sie nicht ausreichend falls auch
Dispersionen höherer Ordnungen auftreten, d.h. die Pulsverlängerung kann dann nicht komplett kompensiert werden. In den z.B. biologischen Präparaten ist jedoch mit nicht vorher bestimmbaren Dispersionen höherer Ordnungen zu rechnen. Weiterhin treten in den optischen Komponenten in einem Mikroskop Dispersionen höherer Ordnung auf. Somit ist es mit den herkömmlichen Techniken nicht möglich, optimale Bedingungen zur Anregung der nichtlinearen Kontraste schaffen. Ein weiterer Nachteil ist, dass durch die hohen Pulsspitzenleistungen bzw. Pulsspitzenintensitäten die Proben außerhalb des Bereichs in dem eine Probenwechselwirkung gewünscht ist geschädigt bzw. die Optiken der Mikroskopanordnung beschädigt werden können.
In konventionellen Fluoreszenzmikroskopie werden verschiedene Farbstoffe zur spezifischen Markierung von biologischen Präparaten eingesetzt. Diese Farbstoffe . werden anschließend mit unterschiedlichen Lichtwellenlängen angeregt. Durch den Einsatz der Muftiphotonen-Anregung erfolgt bei solchen Präparaten meist eine simultane Anregung der verschiedenen Farbstoffe. Dies ist einerseits ein Vorteil, da man nur noch eine Lichtweilenlänge zur Anregung benötigt. Andererseits ist es von Nachteil, wenn sich die Emissionswellenlängenbänder der einzelnen Farbstoffe überlagern, da die Farbstoffe dann nicht mehr spektral getrennt werden können.
Die Nachteile sollen durch die Erfindung behoben werden.
Dies erfolgt durch die in den unabhängigen Ansprüchen angegebenen Mittel und
Verfahrensschritte.
Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche. Durch die Erfindung ist es vorteilhaft möglich, über einen Rückkopplungsprozess die Amplituden- und/oder Phasenmodulation der Lichtpulse in einer Fourierebene so zu variieren, dass eine entsprechende Messgröße (z.B. das Zweiphotonen- Fluoreszenzsignal) in einem Mikroskop optimiert wird. Weiterhin ist es mit den erfindungsgemäßen Anordnungen möglich, hohe Pulsspitzenleistungen am Ort der Probe zu erzielen ohne hierdurch schädliche Effekte, in der Mikroskopanordnung bzw. in Schichten außerhalb des Fokalbereiches in dem die Messgröße angeregt werden soll, verursacht werden. Durch die Anordnung kann auch eine variable Anpassung des Strahlquerschnitts zur optimalen Füllung der in die Probe fokussierenden Optik erfolgen.
Beschreibung der Erfindung
In Fig. 1 ist das Grundprinzip der Erfindung schematisch dargestellt.
Eine Kurzpulslichtquelle LQ sendet kohärentes (Kurzpulslaser) oder zeitlich inkohärentes Licht (Breitband oder Weißlichtquelle) aus, das, vorteilhaft kollimiert, auf ein erstes dispersives Element D1 , beispielsweise ein Prisma oder Gitter gelangt.
Das dispersive Element zerlegt die ankommende Strahlung um ihre Mittenwellenlänge spektral, so dass die spektralen Komponenten, hier als 11-15 dargestellt, jedes
Lichtpulses räumlich getrennt werden.
Ein zweites dispersives Element D2 weist eine im wesentlichen gleiche Charakteristik bezüglich der spektralen Zerlegung auf, ist aber zum ersten Element D1 räumlich entgegengesetzt angeordnet.
Hierdurch verläuft das Licht wieder parallel (kollimiert), jedoch immer noch spektral räumlich zerlegt und durchläuft eine Anordnung zur scannenden optischen Abtastung einer Probe T (Fϊg.l) , die hier nur scherrwsch mit einem X/Y Scanner SC und einer Objektivlinse O angedeutet ist. Die Scanner X/Y liegen hierbei in der Nähe der rückwärtigen Pupille des Objektivs 0. Dies ist durch die Bezeichnung der Brennweite f der Objektivs schematisch angedeutet.
Über das Objektiv wird die Strahlung wieder in Richtung der Probe T gebündelt. Das heißt, dass die spektrale Zerlegung im Fokus des Objektives O wieder aufgehoben wird und der Lichtpuls der Lichtquelle LQ dadurch rekonstruiert wird.
Zwischen dem Element D1 und dem Objekt T liegen somit keine kurzen Pulse vor, da die Spektralkomponenten nicht räumlich überlappen. Die Länge der Lichtpulse im Bereich zwischen D1 und O hängt von der räumlich spektralen Auflösung der Aufspaltung der Lichtpulse ab.
Ein Vorteil einer derartigen Anordnung ist es, dass die von den Lichtpulsen durchlaufene Optik zumindest im Bereich 3 nicht vor Beschädigung durch sehr kurze Pulse bzw. durch sehr hohe Pulsspitzenleistungen geschützt werden muss Es treten die hohen Pulsspitzenleistungen erst unmittelbar am Ort der Probenwechselwirkung, d.h. im Fokalbereich, in dem auch beispielsweise eine nichtlineare Probenwechselwirkung (z.B. Zweiphotonen-Fluoreszenzanregung) mit einem Farbstoff durchgeführt wird, auf. Hierdurch werden die Proben vor Schädigung zumindest außerhalb des Bereich in dem die Probenwechselwirkung durchgeführt werden soll geschützt. Zum anderen kann eine bessere Korrektur der optischen Anordnung zur Abbildung in die Probe erzielt werden, da eine größere Vielfalt der verwendbaren Materialien und optischen Schichten vorhanden ist. Somit können auch Kosten gespart werden.
Ein weiterer Vorteil ist, dass Mittel zur räumlich unterschiedlichen Beeinflussung der Lichtpulse wie beispielsweise Phasenplatten PP im kollimierten Strahlengang, beispielsweise vor dem Scanner SC eingefügt werden können. Die Phasenplatten weisen in bestimmten Bereichen eine unterschiedliche Dicke entlang ihres Querschnitts zur Änderung der optischen Brechzahl auf, so dass bestimmte Spektralkomponenten in Bezug zu anderen Spektralkomponenten zeitlich verzögert werden. Hierdurch können die Gruppengeschwindigkeitsdispersion GVD der Optiken im gesamten Strahlgang von der Lichtquelle LQ bis zur Probe T einschließlich zusätzlicher Giasmaterialen OM kompensiert werden.
Durch Verwendung mehrerer derartiger Phasenplatten unterschiedlicher Form, können die Lichtpulse bezüglich ihrer Form beeinflusst werden. Die Einstellung der Phasen der räumlich separierten Anteile zueinander kann auch flexibel beispielsweise mit einem Spatial Light Modulator SLM erfolgen, der einzeln ansteuerbare Elemente (vorteilhaft in Matrixform) aufweist und anstatt oder zusätzlich in der Nähe von PP im Strahlengang angeordnet wird.
Ein weiterer Vorteil ist, dass die Elemente D1 und D2 zur variablen Strahlaufweitung verwendet werden können. Hierzu wird der Abstand der Elemente D1 und D2 verändert, wodurch sich eine vom Abstand der Elemente (siehe auch Fig. 3a, 4a, 6a - S1 und S2) je nach Ausführung der Elemente D1 und D2 zumindest in einer Raumrichtung abhängige Strahlaufweitung ergibt.
Vorzugsweise im parallelen Strahlengang , vorteilhaft zwischen D2 und Scanner SC Kann über einen Strahlteiler mindestens eine weitere Lichtquelle, beispielsweise zur parallelen Erfassung des Reflektionslichtes der Probe durch unten beschriebene weitere Detektoren, eingekoppelt werden.
In Fig.2 ist eine Anordnung wie in einem Laser- Scanning- Mikroskop dargestellt, mit Pinholeoptik PO, Pinhole PH, Detektoren DE1 und DE2 sowie einem ersten dichroitischen Strahlteiler (Hauptfarbteiler) MDB 1 zur Auskopplung des Detektionslichts aus dem Beleuchtungsstrahlengang nach den Scannern SC (descannte Detektion), einer Scanoptik SO, einem Zwischenbild ZB, einer Tubuslinse sowie einem weiteren Detektionsstrahlengang zur nicht- descannten Detektion DE3. Die Ausspiegelung des nicht descannten Detektionslichts erfolgt hierbei über einen weiteren dichroitischen Strahlteiler MDB2. Die zusätzliche Aufteilung des Detektionslichts in mehrere Detektionskanäle kann durch die Verwendung eines weiteren dichroitischen Strahlteilers beispielsweise für zwei Kanäle DE1 und DE2 mit MDB3 erfolgen. Vor den Detektoren werden zur Messung eines Fluoreszenzsignais entsprechende Filter vorteilhaft zwischen den MDB und den DE eingeschwenkt. P ist hierbei die Pupille des Mikroskopobje tivs O. In einer zu dieser Ebene konjugierten weiteren Pupillenebene der Mikroskopanordnung befinden sich die
Scanner SC zum Abrastern der Probe.
Die Einheit zur spektral räumlichen Aufspaltung der Spektralkomponenten der Lichtquelle DISP besteht aus den bereits oben erläuterten Elementen D1 und D2. Sie befindet sich im kollimierten Strahlengang vorteilhaft zwischen Lichtquelle und dem
MDB1 und bewirkt neben der spektral räumlichen Aufspaltung der
Spektralkomponenten der Lichtpulse eine Strahlaufweitung der Lichtquelle zur optimalen Füllung der Pupille P. Die Einheit DISP wirkt im allgemeinen zusätzlich wie eine Prechirpeinheit, d.h. sie kann zur Kompensation zumindest eines Anteils der GVD der Mikroskopoptik eingesetzt werden. Die Einstellbarkeit der Kompensation ist anhand von Fig.11 dargestellt.
Eine Kompensation der verbleibenden GVD kann mit Hilfe der Phasenplatte PP ( siehe auch weiter oben) im kollimierten Strahlengang, beispielsweise vor dem Scanner SC, erfolgen, die unterschiedliche Dicke über ihren Querschnitt aufweist, z.B. eine
Krümmung mindestens einer Seitenfläche der Platte oder beider Seitenflächen oder eine Keilform aufweist.
Die Krümmung ist so eingestellt, dass die verbleibende GVD der Optiken im
Strahlengang von Lichtquelle LQ bis Probe T kompensiert wird und somit bandbreitenbegrenzte Pulslängen durch zeitliche Verzögerung einzelner
Spektralkomponenten der Lichtpulse, d.h. die kürzest möglichen Pulslängen am Ort der
Probe auftreten.
Durch Verwendung mehrerer derartiger Phasenplatten, mit unterschiedlichen
Krümmungen, kann der Puls bezüglich seiner Form weiter beeinflusst werden. In einem Mikroskop ist die Beeinflussung aufgrund der Wirkung der folgenden Faktoren nötig, wodurch die Pulslänge durch der Einfluss am Ort der Probe meist nicht mehr bandbreitenbegrenzt ist, d.h. längere Pulse auftreten:
• Durch die Glasmaterialien aus denen die optischen Elemente im Mikroskop gefertigt sind. Eine Kompensation kann hier stationär erfolgen. • Durch das Präparat an sich. Die Pulsverlängerung ist hier abhängig von der Eindringtiefe in das Präparat. Weiterhin wird die Pulsverbreiterung durch Dispersionen höherer Ordnung erzeugt. Deshalb muss hier die Kompensation für jede spektrale Komponente einzeln und in Echtzeit erfolgen. • Durch die Änderung der Wellenlänge
• Durch die Änderung der mittleren Leistung, falls zusätzliche nichtlineare Prozesse wie Selbstphasen Modulation in Glasfasern auftreten.
Die Verwendung eines SLM ist deshalb besonders vorteilhaft und es kann wie bereits oben beschrieben die Einstellung der Phasen der räumlich separierten Anteile zueinander flexibel durch einzeln ansteuerbare Elemente (vorteilhaft in Matrixform) erfolgen. Die Ansteuerung der Elemente erfolgt in Abhängigkeit von den o.g. Größen durch die Regelung vorteilhaft in Echtzeit, wobei als Messgröße beispielsweise ein Zweiphotonen-Fluoreszenzsignal, das in der Probe T angeregt wird, fungiert. Durch die entsprechende Regelung wird in den meisten Fällen eine Optimierung der Pulslänge am Ort der Probenwechselwirkung erreicht.
Weiterhin sind die Wechselwirkungsquerschnitte der verwendeten Farbstoffe abhängig von dem zeitlichen Verhalten der Lichtpulse. Somit ist es möglich das Fluoreszenzsignal für einzelne Farbstoffe zu optimieren, wobei die Fluoreszenz anderer Farbstoffe gleichzeitig unterdrückt wird. Es besteht also die Möglichkeit durch die Rückkopplung der Messgröße (hier das Zweiphotonen-Fluoreszenzsignal) das zeitliche Verhalten der Lichtpulse durch Phasen- oder Amplitudenmodulation so einzustellen, dass die entsprechende Messgröße optimiert wird.
In Fig.3a und 4a sind beispielhaft Anordnungen für die Einheit zur spektral räumlichen Aufspaltung der Spektralkomponenten der Lichtquelle DISP, d.h. für D1 und D2 beschrieben. Fig. 3 zeigt zwei Axicons A1 , A2, wobei A1 beispielsweise von der Spitze her beleuchtet wird. Die Axicons sind so angeordnet und ausgebildet, dass das erste Axicon eine Winkeldispersion einführt, die vom zweiten Axicon wieder kompensiert wird, so dass in Strahlrichtung nach dem zweiten Axicon wieder ein Parallelstrahl vorliegt.
Das heißt vorzugsweise, daß D2 so aufgebaut ist, daß es mit D1 zusammen eine Planplattenwirkung hat, im konkreten Fall heißt das, daß D1 eine Planplatte mit einer prismatischen oder axiconförmigen Ausnehmung aufweist, in die D2 (theoretisch) hineinpaßt und mit D1 eine Planplatte bildet.
Die Axicons können aus prismatisch geschliffenen Glasplatten (refraktive Elemente) oder zur Erhöhung der Winkeldispersion aus diffraktiven Elementen z.B. ringförmigen Gitterstrukturen bestehen. Zur Definition des Axicon wird insbesondere auf http://www.sciner.com/Opticsland/axicon.htm verwiesen.
Fig. 4 zeigt eine Anordnung mit zwei Prismen P1 , P2, wobei P1 beispielsweise von der . Spitze her beleuchtet wird, ausgebildet, dass das erste Prisma wiederum eine Winkeldispersion einführt, die vom zweiten Prisma kompensiert wird, so dass in Strahlrichtung nach dem zweiten Prisma wieder ein Parallelstrahl vorliegt. Zum Aufbau siehe Bemerkungen zu Fig.3.
In Fig. 3b, 4b ist jeweils die Strahlverteilung vor dem ersten Element und in 3c, 4c nach dem zweiten Element dargestellt. Bei Verwendung von Prismen liegen die Spektralanteile 11 ,12.... aufgespaltet nebeneinander in einer Zeile, bei Verwendung von Axicons ringförmig in mehreren Ebenen, wobei jede Spektralkomponente einen bestimmten Ring ausfüllt.
Mit den Pfeilen S1 , S2 ist eine über eine nicht dargestellte Steuereinheit angesteuerte ggf. auch gekoppelte Bewegung der beiden dispersiven Elemente zueinander bzw. voneinander weg angedeutet. Diese Verschiebung bewirkt neben der bereits erläuterten Anpassung der Strahlaufweitung zusätzlich eine Änderung der Pulslänge am Ort der Probe T (siehe z.B. DE 19744302A1, DE19930532A1, ohne Aufhebung der räumlichen Separierung). Erfindungsgemäß kann die beschriebene Einstellung der Pulsform zusätzlich auch in Verbindung mit anderen Steuerfunktionen des Mikroskops, beispielsweise zur Veränderung der spektralen Zusammensetzung der Beleuchtung und/ oder der Intensität (DE19829981 A1) während der Bildaufnahme für bestimmte Probenbereiche, erfolgen. Die Steuerung erfolgt über die zentrale Ansteuereinheit des Mikroskops. ,
Bei einer Änderung der Mittenwellenlänge der Lichtquelle kann eine vorgespeicherte Neueinstellung der Elemente D1 und D2 zueinander erfolgen.
In Fig. 5 ist eine weitere Ausbildung der Einheit DISP mit Geradsichtprismen GP, die auch Amici-Prismen genannt werden, dargestellt. Das Geradsichtprisma erzeugt hierbei eine feste nicht einstellbare räumliche Aufspaltung der Spektralkomponenten der Lichtquelle und damit auch eine feste Strahlauf Weitung. Die Spektralkomponenten der Lichtpulse sind im Anschluss wieder räumlich parallel ausgerichtet. Vorteilhaft bei dieser Anordnung der DISP ist, dass eine hohe Transmission und ein mechanisch stabiler Aufbau besonders einfach realisiert werden kann. Fig.6 zeigt einer weitere Anordnung mit zwei Transmissionsgittern. Der Strahlverlauf ist im wesentlichen äquivalent der Anordnung aus Abb. 4. Durch den Einsatz der Gitter kann jedoch die Winkeldispersion erhöht werden. Bei Verwendung von Gittern ergibt sich zusätzlich auf der optischen Achse die nullte Beugungsordnung des Gitters, die in der Abbildungen mit 0 bezeichnet ist.
Die erste Beugungsordnung nach dem ersten Transmissionsgitter geht in die negative Beugungsordnung des zweiten Gitters ein. Die Winkeldispersion wird dadurch aufgehoben, die Strahlen bleiben aber räumlich getrennt.
Neben den in den Figuren 3 bis 6 gezeigten Anordnungen zur beispielhaften Ausbildung der Elemente D1 und D2 können prinzipiell auch reflektierende Elemente wie Reflexionsgitter oder Elemente die neben der Winkeldispersion auch eine Ablenkung einführen (wie z.B. Dispersionsprismen - Teilbild A oder Reflexionsgitter - Teilbild B) eingesetzt werden (siehe auch DE19744302A1 ).
Figur 11 zeigt solche Anordnungen schematisch. Bei diesen Anordnungen muss, bei einer Änderung der Mittenwellenlänge nicht nur die dispersiven Elemente selbst D1 und D2 relativ zueinander bewegt werden sondern entweder der Strahlengang ab der Lichtquelle LQ bis einschließlich D1 oder D2 bis einschließlich der Probe T. Die Bewegung B erfolgt wie durch Pfeile angedeutet, hierbei senkrecht zur optischen Achse, die ausgehend von der Lichtquelle gebildet wird.
Figur 7 zeigt die auf eins normierte laterale Intensitätsverteilung im Fokus, d.h. am Ort der Probe T. Eingezeichnet ist die Referenzverteilung (1) für eine Beleuchtung nach dem Stand der Technik, wobei alle Spektralkomponenten der Lichtquelle die Pupille der in die Probe fokussierenden Optik gleichmäßig ausleuchten.
Zum Vergleich ist die Intensitätsverteilung für eine Beleuchtung der Pupille mit einer erfindungsgemäßen Anordnung nach Fig. 3 eingezeichnet (2). Zu erkennen ist, dass die Kurve (2) nur unwesentlich von der Referenzkurve (1) abweicht und somit insbesondere in einem Multiphotonenmikroskopie eine vergleichbare optische Auflösung erzielbar ist
Figur 8 zeigt die auf eins normierte Intensitätsverteilung im Fokus und auf der optischen Achse in Abhängigkeit von der Zeit (Pulsverteilung) beispielhaft für die Ausbildung der Elemente D1 und D2 nach Fig. 3. P1 stellt die Pulsverteilung am Laserausgang dar. P2 ist die Pulslänge zwischen dem dispersiven Element D1 und der Probe T. In der Kurve P3 ist die Pulsverteilung am Ort der Probe T dargestellt. Man erkennt, dass zwischen dem Element D1 und der Probe T eine (im gezeigten Zeitfenster) nahezu konstante Laserintensität mit folglich geringer Spitzenintensität vorliegt. Somit sind in diesem Bereich die Pulsspitzenleistungen gering. Jedoch am Ort der Probe, d.h. nach der räumlichen Überlagerung der Spektralkomponenten ergibt sich eine Pulsverteilung, die nahezu identisch der Pulsverteilung am Laserausgang ist.
Figur 9 zeigt schematisch eine weitere Anordnung in einem Laser Scanning Mikroskop. Sie ist im wesentlichen identisch zur Anordnung gemäß Figur 2. Jedoch ist zwischen der Lichtquelle LQ und dem ersten dispersiven Element D1 eine Single mode Glasfaser (FIBER) mit zwei Optiken zur Einkopplung in die Glasfaser und ein zusätzliches dispersives Element D vorgesehen. Das dispersive Element kann im einfachsten Falle ein Block mit einem hoch dispersiven Glasmaterial oder Kristall wie Te02 sein. In diesem Falle ist jedoch beispielsweise am Ort PP eine entsprechende Kompensation der Gesamtdispersioή GVD der optischen Anordnung zwischen Lichtquelle LQ und Probe T vorzusehen. Die dispersive Einheit D kann auch einstellbar gemäß DE19744302A1, DE19930532A1, ausgebildet werden. Hierbei kann dann die Phasenplatte bzw. flexible Einheit am Ort PP entfallen, da dann die Einheit D die gesamte Kompensation der GVD vornehmen kann. Vorteilhaft bei den Anordnungen gemäß Fig. 9 ist, dass die durch die Elemente D1 und D2 eingefügte GVD entsprechend zur Kompensation der Selbstphasenmodulation SPM, die bei hohen Intensitäten in der Glasfaser auftreten kann, genutzt werden kann. Besonders vorteilhaft bei der hier beschriebenen Anordnung ist, dass die Dispersion verursacht durch die Elemente D1 und D2 wesentlich höher gewählt werden kann. Hierdurch erhöht sich die durch die Glasfaser koppelbare mittlere Leistung und damit die am Ort der Probe T erzielbare Spitzenintensität. Für eine Beschreibung des Zusammenspiels der Wirkungen von D, FIBER und D1/D2 wird auf DE19827239A1 verwiesen.
Figur 10 zeigt einen weiteren Aufbau eines Laser Scanning Mikroskops mit einer Glasfaser. Hierbei befindet sich im Gegensatz zu Fig. 9 ein Glasfaserbündel FB zwischen den Elementen D1 und D2. In die Glasfasern wird das Licht mit Hilfe von 2 Linsen L1 und L2 ein- bzw. ausgekoppelt. Im einem Brennpunkt der Linsen L1 und L2 befinden sich jeweils die Glasfasen und im verbleibenden die dispersiven Elemente D1 und D2. Die Brennweiten der Linsen müssen nicht identisch sein. Jedoch muss bei ungleicher Wahl der Brennweite das Gitter D2 entsprechend angepasst werden. Die Geometrie des Faserbündels ergibt sich aus der Wahl der dispersiven Elemente D1 und D2. Wird beispielsweise ein Element entsprechend Fig. 3 verwendet, dann muss das Faserbündel einen kreisförmigen Querschnitt entsprechend 10a ausweisen. Bei Verwendung von Elementen entsprechend Fig. 4 bis 6 müssen die einzelnen Fasern in einer Reihe im Faserbündel angeordnet werden. Fig. 10a/b zeigt schematisch Faserbündel, wobei beispielhaft einzelne Fasern schwarz eingezeichnet sind. Vor den einzelnen Fasern können auch Mikrolinsen zu effizienteren Einkopplung in die Faser angeordnet werden.
Aufgrund der Wirkung von D1 werden in jede Faser nur bestimmte Spektralbereiche eingekoppelt, so dass die Faser keine oder nur sehr lange Pulse und damit nur geringe Pulsspitzenleistungen bzw. Pulsspitzenintensitäten sieht, die sonst zu schädlichen Effekten insbesondere in den Glasfasern führen können. Somit können durch die Fasern wesentlich höhere mittlere Leistungen ohne Veränderung der Pulsform geleitet werden.
Die aus dem Glasfaserbündel ausgekoppelten Spektralkomponenten werden mit L2 kollimiert, wobei sich die einzelnen Spektralanteile als Parallelbündel schneiden. Die verbleibende Winkeldispersion wird mit D2 wieder aufgehoben, wobei die Spektralkomponenten noch räumlich separiert bleiben. Die folgenden Optiken entsprechen den bereits anhand von Fig. 2 erläuterten Komponenten. Mit Hilfe der Verschiebung S2 entlang der optischen Achse kann wiederum die Ausleuchtung der in die Probe fokussierenden Optik angepasst werden. Die Kompensation der Laufzeitunterschiede der einzelnen Spektralkomponenten und der Gruppengeschwindigkeitsdispersion GVD der Lichtpulse erfolgt mit Hilfe von PP vorzugsweise mit einer flexiblen Einheit (SLM) mit ansteuerbaren Elementen in linienförmiger oder matrixförmiger Anordnung.
Durch die beschriebene Anordnung eines Glasfaserbündels entsteht eine neuartige vorteilhafte Anordnung mit einem Modul, bestehend aus der Lichtquelle, der spektralen Aufspaltung D1 und der Einkopplung in die Fasern und hinter dem Faserbündel dem Mikroskopmodul mit dem zweiten dispersiven Element D2, die auf diese Weise voneinander entkoppelt sind und einzeln austauschbar gestaltet werden können.

Claims

Patentansprüche 1.
Verfahren zur optischen Untersuchung und/ oder Bearbeitung einer Probe, mit einer Erzeugung eines kurzpulsigen Beleuchtungslichtes, einer spektralen Aufspaltung des Beleuchtungslichtes zur Erzeugung räumlich getrennter Spektralkomponenten mit Pulslängen, die größer sind als die Pulslänge der
Beieuchtungslichtquelle, dem Durchlaufen der Spektralkompomenten durch eine Übertragungsoptik in Richtung der Probe, der Fokussierung des Beleuchtungslichtes auf oder in die Probe, wobei die
Spektralkomponenten überlagert werden sowie der Detektion des Probenlichtes
2.
Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die räumlich getrennten Spektralkomponenten in ein Parallelstrahlbündel überführt werden.
3.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Pulslänge der auf oder in die Probe fokussierten Spektralkomponenten kleiner ist als die Pulslänge der räumlich separierten Spektralkomponenten.
4.
Anordnung zur optischen Untersuchung und/ oder Bearbeitung einer Probe bestehend aus:
Mitteln zur Erzeugung eines Beleuchtungslichtes , diesen nachgeordnete Mittel zur spektralen Aufspaltung des Beleuchtungslichtes zur
Erzeugung räumlich getrennter Spektralkomponenten ,
Mittel zur Parallelisierung des aufgespaltenen Beleuchtungslichtes,
Mittel zur Fokussierung des Beleuchtungslichtes auf oder in die Probe, wobei die
Spektralkomponenten überlagert werden sowie Mitteln zur Detektion des Probenlichtes.
5.
Anordnung zur optischen Untersuchung und / oder Bearbeitung einer Probe. bestehend aus:
Mitteln zur Erzeugung eines kurzpulsigen Beleuchtungslichtes, diesen nachgeordneten Mitteln zur spektralen Aufspaltung des Beleuchtungslichtes zur
Erzeugung räumlich getrennter Spektralkomponenten mit Pulslängen, die größer sind als die Pülsiänge der Beleuchtungsiichtquelle, einer Übertragungsoptik zur Übertragung der Spektralkomponenten in Richtung der
Probe, Mitteln zur Fokussierung des Beleuchtungslichtes auf oder in die Probe, wobei die
Spektralkomponenten überlagert werden.
Mitteln zur Detektion des Probenlichtes.
6.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei Mittel zur Überführung der räumlich getrennten Spektralkomponenten in ein Parallelstrahlbündel vorgesehen sin .
7.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Pulslänge der auf oder in die Probe fokussierten Spektralkomponenten kleiner ist als die Pulslänge der räumlich separierten Spektraikomponenten.
8.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zwischen der Lichtquelle und den Mitteln zur spektralen Aufspaltung vorzugsweise einstellbare Dispersionsmittel vorgesehen sind.
9.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Ein- und Auskopplung der Parallelstrahlbündel in ein Giasfaserbündel erfolgt.
10. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine die spektrale Aufspaltung durch mindestens ein Prisma und/ oder Axicon und/ oder Transmissionsgitter und / oder Reflektionsgitter erfolgt.
11.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Überführung in ein Parallelstrahlbündel durch ein weiteres Prisma, oder ein weiteres Axicon oder ein weiteres Gitter erfolgt.
12.
Anordnung nach Anspruch 11 , wobei wobei ein erstes und zweites Prisma oder Axicon so aufgebaut sind, daß sie gemeinsam eine Planplattenwirkung aufweisen.
13. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein Geradsichtprisma zur Aufspaltung und Parallelisierung vorgesehen ist
14.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei vorzugsweise im parallelen Strahlengang ein Kompensationselement zur Beeinflussung der Komponenten vorgesehen ist
15.
Anordnung nach Anspruch 14,wobei eine einstellbare Beeinflussung der Komponenten durch wechselbare optische Elemente mit unterschiedlichem Querschnittsverlauf und/ oder einen Spatial Light Modulator ( SLM) erfolgt.
16.
Verwendung einer Anordnung gemäß mindestens einem der vorangehenden
Ansprüche in einem Fluoreszenzmikroskop.
17. Verwendung einer Anordnung gemäß mindestens einem der vorangehenden
Ansprüche in einem Multiphotonenmikroskop.
18.
Verwendung einer Anordnung gemäß mindestens einem der vorangehenden
Ansprüche in einem Laser Scanning Mikroskop.
19.
Verwendung einer Anordnung gemäß mindestens einem der vorangehenden Ansprüche in der nichtlinearen Laserrastermikroskopie..
20.
Verwendung einer Anordnung gemäß mindestens einem der vorangehenden
Ansprüche bei der Materialbearbeitung.
21.
Verwendung einer Anordnung gemäß mindestens einem der vorangehenden
Ansprüche bei der Bearbeitung biologischen Gewebes.
22.
Verwendung einer Anordnung gemäß mindestens einem der vorangehenden
Ansprüche bei der Bearbeitung der Augenhornhaut.
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