EP1565175A1 - Utilisation d'un inhibiteur d'histone deacetylase pour le traitement des dystrophies musculaires - Google Patents

Utilisation d'un inhibiteur d'histone deacetylase pour le traitement des dystrophies musculaires

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EP1565175A1
EP1565175A1 EP03789530A EP03789530A EP1565175A1 EP 1565175 A1 EP1565175 A1 EP 1565175A1 EP 03789530 A EP03789530 A EP 03789530A EP 03789530 A EP03789530 A EP 03789530A EP 1565175 A1 EP1565175 A1 EP 1565175A1
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EP
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gene
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adult
histone deacetylase
deacetylase inhibitor
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03789530A
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German (de)
English (en)
Inventor
Sabine De La Porte
Maurice Israel
Vincent Voisin
Hafedh Haddad
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Publication date
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    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system

Definitions

  • the present invention relates to the treatment of disease resulting from the deficiency of an adult gene in an individual through the re-expression of the homologous fetal gene.
  • the invention is particularly interested in the long-term treatment of dystrophies and similar diseases comprising the administration, to a subject having a defective gene, of an adequate amount of a histone deacetylase inhibitor.
  • Fetal metabolism is glycolitic and ammonotelic while adult metabolism is oxidative and ureotelic.
  • One of the main compounds involved in fetal metabolism is butyrate which, combined with other products of glycolytic metabolism, inhibits in the nucleus, an essential enzyme: histone deacetylase.
  • histone deacetylase an essential enzyme that inhibits in the nucleus.
  • the relaxation of the DNA strand that follows allows transcription factors to reach the promoter and induce gene expression.
  • the stimulation of the oxidative metabolism associated with the stimulation of methylases induces the synthesis of new products which replace those which were expressed during fetal life.
  • fetal gene The transition between the expression of a fetal gene and that of the adult gene occurs because the metabolism becomes oxidative to adapt to air and gravity. This type of metabolism generates transmitters methylated and creatine phosphate which allow the muscles for example to adapt to life on earth (as opposed to fetal life which takes place in an aquatic environment).
  • the need to switch from fetal genes to adult genes probably corresponds to an adaptation of the body to new sources of protein.
  • fetal genes are extinguished in favor of their adult counterparts, or more generally that genes less adapted to the environment of the organism are extinguished in favor of homologs better adapted to this environment.
  • the latter then express regulated proteins which respond more adequately to this environment.
  • a new method of treating diseases in which the defective adult gene has a fetal counterpart has thus been described in the prior art.
  • This method is based on the reactivation of this fetal gene.
  • These include, for example, Duchenne and Becker's myopathies or thalassemia and sickle cell anemia.
  • French patent application published under No. 2,794,647 shows that the use of L-arginine and NO donors makes it possible to reactivate the expression of fetal genes in adult tissues so as to restore the presence and localization of proteins. fetal.
  • Spectacular effects have been obtained in the case of muscular dystrophy in mice, where re-expression of utrophin considerably improves the condition of the deficient muscles of the mdx mouse which is a mouse model of human disease.
  • the human fetus has a fetal hemoglobin of high affinity for oxygen, which will be replaced, in the newborn, by a hemoglobin of low affinity, which will, moreover, negatively regulated by 2-3diphosphoglycerate (DPD).
  • DPD 2-3diphosphoglycerate
  • the adult hemoglobin is defective due to a mutation (anemia sickle cell), its regulatory ligand increases (Abekile, 1998).
  • this ligand can then serve as an inducing signal for expressing fetal hemoglobin.
  • This extinction-substitution mechanism depends on a "double switch".
  • the first is general, non-specific and well known, it is linked to the state of histones, we know that their deacetylation for example decreases the expression of genes by "tightening the winding of the DNA strand”.
  • the second is specific and would result from the decrease of an inducer which is no longer available when the adult or best suited gene is expressed because this inducer is then linked to the product of the specific gene.
  • This specific switch is now highlighted by experiments showing that the same "general switch", histone deacetylase inhibitor, will "turn on” fetal hemoglobin in sickle cell anemia, and utrophin in dystrophy Duchenne or SMN2 in spinal muscular atrophy, etc.
  • products active on a general expression mechanism are made permissive for the expression of the silent gene in each case, by the availability of the selective inducer, NO or cGMP for utrophin, 2-3DPG or derivative for l hemoglobin, Ch3SM, Ch3SmRNP or derivative for SMN2.
  • This ligand no longer finding its specific target due to the mutation then authorizes the action of the general switch which preferentially turns on the silent gene corresponding to the mutation.
  • Histone deacetylase inhibitors that promote the expression of fetal genes are not specific. Under these conditions, the fetal gene corresponding to the mutated adult gene is specifically activated (fetal hemoglobin in the case of sickle cell anemia, or utrophin in the case of Duchenne dystrophy) thanks to the existence of a another specific switch for each couple of fetal-adult genes.
  • the mutation of the adult protein is reported and triggers the activation of the fetal protein.
  • the adult proteins adapted to the partial pressure of oxygen in the air and the gravity for muscle proteins are regulated by specific ligands.
  • a typical example is 2-3 DPG which regulates adult hemoglobin.
  • the adult protein is absent or mutated, then its specific ligand is found free in the cytoplasm and, therefore, induces, directly or indirectly, the activation of the corresponding fetal gene. This induction is possible only in the case where the histone deacetylase is inhibited, by butyrate for example, that is to say in the situation of a glycolitic metabolism, which is the case of juvenile cells.
  • histone slows down the expression of these genes.
  • histone deacetylase In the presence of butyrate or other inhibitors of histone deacetylase, this general inhibition is lifted and the selective inducer, activated by the mutation, is then allowed to trigger the silent gene.
  • Histone deacetylase inhibitors such as butyrate are used in the treatment of sickle cell anemia.
  • SMN1 being mutated, its ligand CH3-SmRNP (methyl, smallribonucleoprotein) would become inductive, if however the butyrate allows it to act by promoting the reacetylation of histones.
  • CH3-SmRNP methyl, smallribonucleoprotein
  • the expression of SMN2 was thus obtained by the butyrate (Chang et al., 2001). It would also be useful in this case to promote the methylation of SmRNP or to increase its expression. NO donors could be helpful as well as methyl donors.
  • the present invention also applies to myopathy of Miyoshi (MM) and to myopathy of the belt or form 2B of the "limbgirdle muscular dystrophy” (LGMD2B) (Bushby K., Acta Myologica, vol. 19, 2000, p. 209-13) which are characterized by the absence of dysferline, a homologous protein, myoferline, which can then serve as a substitute (Davis et al. Hum., Mol. Genêt., 2000, vol. 9, p. 217-226 ).
  • LGMD2B limbgirdle muscular dystrophy
  • gamma-AchR acetylcholine receptor
  • the general ligand is a histone deacetylase inhibitor (HDAC) and the specific ligand a phospholipid for MM and LGMD2B and choline for gamma-Achr syndrome.
  • HDAC histone deacetylase inhibitor
  • dysferline and myoferline are part of a family of C2 domain molecules which recognize and strongly bind phospholipids. It has been reported in the prior art (Perrine SP et al. EXPERIENTIA, BIRKHAUSER VERLAG. BASEL, CH, vol. 49, no. 2, February 15, 1993 (1993-02-15), pages 133-137) l ' use of a butyrate-based compound to treat beta hemoglobinopathies, sickle cell anemia and beta thalassemia syndromes. It should be noted that this document is not concerned with muscular dystrophies, such as Duchenne dystrophy and that it offers arginine butyrate as a derivative of butyrate to avoid sodium overload for the patient. Thus the active principle which these authors propose to use is butyrate and not arginine.
  • the present invention is based on the implementation of a double switch system for removing inhibition of the fetal gene: i) the general switch linked to histone acetylation, and ii) the selective switch, linked to product of the only missing gene (NO in the case of utrophin).
  • the histone deacetylase inhibitor opens the general switch and arginine (NO) opens the selective switch.
  • a histone deacetylase inhibitor could be used for the preparation of a medicament intended for the treatment or prevention of a disease resulting from the deficiency of an adult gene in an individual by re-expression of the homologous fetal gene.
  • This medicament according to the invention is intended to reactivate the expression of at least one fetal gene in adult tissues so as to restore the presence and / or the localization of at least one fetal protein.
  • the invention aims to reactivate the fetal gene encoding the embryonic form of the protein encoded by the defective adult gene.
  • the invention is particularly interested in the treatment of muscular dystrophies, such as Duchenne or Becker dystrophy where the defective adult gene is the dystrophin gene and the homologous fetal gene is the utrophin gene.
  • dystrophin is spatially very close to NOsynthase, and NO produced locally will undoubtedly have essential effects on this protein, the mutation of which is accompanied by a deficit of NOsynthase at the membrane.
  • NO then induces the expression of utrophin, the silent counterpart of dystrophin which predominates in fetal life, and which, moreover, only remains in adults in places where the NOsynthase is very high (plaque motor, vessels).
  • arginine, substrate of NOsynthase, and NO donors cause an over-expression of utrophin.
  • This effect was obtained without lifting the general switch linked to histyl acetylation, because NO also blocks essential stages of the Krebs cycle, which leads to an elevation of acetylCoA and ketone bodies (butyrate).
  • NO acts as an inducing ligand but also via butyrate on the histone deacetylase.
  • the use of a histone deacetylase inhibitor according to the invention also offers the advantage of having a medicament which can be administered orally.
  • the action of L-arginine and its derivatives on the reactivation of the fetal gene is obtained parenterally.
  • histone deacetylase inhibitors advantageously administered orally make it possible to maintain the effect during these periods.
  • histone deacetylase inhibitors make it possible to maintain during these periods "the general switch" linked to the acetylation of the open histones.
  • the main compound used to induce the expression of utrophin is the substrate of NOsynthase: L-arginine.
  • L-arginine The inventors have now shown (FIG. 4) that an arginine butyrate salt considerably increases the amount of utrophin in healthy muscles and in mdx mice.
  • the histone deacetylase inhibitor can thus be chosen from the group comprising butyrate, phenylbutyrate, isobutyramide, valproate, hydroxamate derivative of butyric acid, apicidin, CBHA (m-carboxycinnamic acid bishydoxyamide) , HC toxin, M344 (4-dimethylamino-N- (6-hydroxycarbamoyl-hexyl) -benzamide), Nullscript (4- (1, 3-dioxo-1H, 3H-benzo [de] isoquinolin-2 - yl) -N-hydroxybutanamide), SAHA (suberoylanil ide hydroxamic acid), Scriptaid (6 - (1.3 -dioxo- 1H, 3H- benzo [de] isoquinolin- 2 -yl) -N-hydroxyhexanamide), trichostatin (TSA; (R- (E, E) -7- [4
  • the aim of the present invention is therefore to reexpress this silent copy, using a whole series of combinations of compounds of the type described above.
  • these are bifunctional compounds in which the ligand of the absent or abnormal protein is covalently linked to a histone deacetylase inhibitor.
  • Such compounds have the capacity to treat the pathologies in which a gene is mutated, by inducing the expression of a homologous gene, mainly the fetal copy of this gene (in the cases where it exists) using a bifunctional compound ional cleavable which will release in the body i) the histone deacetylase inhibitor acting on the general switch, non-specific, linked to the acetylation of histones, and ii) ligand of the mutated protein, activating the specific switch.
  • this ligand is not available or is unusable, it is possible, as a replacement, to link its precursor or its product, or even a molecule promoting its action.
  • a very particular subject of the invention is therefore the use in combination of a histone deacetylase inhibitor and a compound regulating a protein encoded by an adult gene for the preparation of a medicament intended for the treatment or prevention of 'a disease resulting from the deficiency of said adult gene for which there is a silent homologous gene.
  • said compound is capable of binding and regulating the protein encoded by this adult gene.
  • said medicament contains the histone deacetylase inhibitor and the compound regulating a protein encoded by an adult gene, separately in the same package.
  • said medicament contains the histone deacetylase inhibitor and the compound regulating a protein encoded by an adult gene, in a single pharmaceutical form containing the two ingredients.
  • the histone deacetylase inhibitor and the compound regulating a protein encoded by an adult gene are covalently linked optionally via a spacer arm.
  • Said link or spacer arm is cleavable in the body so as to release the two active ingredients.
  • the histone deacetylase inhibitor is associated with at least one compound chosen from the group comprising NO, a NO donor compound or a compound capable of releasing, promoting or inducing NO formation in cells.
  • Said medicament is intended for the treatment or prevention of a disease resulting from the deficiency of the dystrophin gene by allowing the re-expression of the utrophin gene.
  • Said disease is Duchenne or Becker's dystrophy.
  • a drug comprising histone deacetylase is administered to an individual who has received concomitantly or prior to the administration of the said drug an appropriate amount of at least one compound chosen from the group comprising NO, a NO donor compound or a compound capable of releasing, promoting or inducing the formation of NO in cells.
  • the compound capable of inducing the formation of NO is for example L-arginine, or one of its derivatives constituting a substrate for NO-synthase or promoting the availability of the substrate.
  • L-arginine or one of its derivatives constituting a substrate for NO-synthase or promoting the availability of the substrate.
  • a preferred example of the first embodiment of the invention below relates to a pharmaceutical composition comprising arginine butyrate.
  • the NO donor compound is for example molsidomine or one of its derivatives capable, during its transformation in the organism, of releasing NO.
  • the invention relates to the treatment of spinal muscular atrophy, where the histone deacetylase inhibitor is combined with a methyl donor compound capable of activating the SmRNP (smallribonucleoprotein) endogenous in methylan.
  • CH3-SmRNP is capable of binding the proteins encoded by the SMN1 gene, and when the latter is deficient, it allows the re-expression of the homologous SMN2 gene by combining with the histone deacetylase inhibitor.
  • the histone deacetylase inhibitor is associated with one or more phospholipids capable of binding dysferline.
  • Said medicament is intended for the treatment or prevention of a disease resulting from the deficiency of the dysferline gene by allowing the re-expression of myoferline.
  • Said disease is Miyoshi myopathy (MM) or form 2B of belt myopathy (limb girdle muscular dystrophy) (LGMD2B).
  • the histone deacetylase inhibitor is associated with choline or a derivative thereof capable of binding the nicotinic receptor acetylcholine.
  • Said medicament is intended for the treatment or prevention of a disease resulting from the deficiency of the gene of the epsilon subunit of said adult receptor by allowing the re-expression of the homologous fetal gene encoding the gamma subunit of said receptor.
  • Said disease is a myasthenic syndrome called gamma-AchR.
  • the histone deacetylase inhibitor is associated with 2-3diphosphoglycerate, a derivative or precursor (inosine) thereof capable of binding to hemoglobin.
  • Said drug is intended for the treatment of sickle cell anemia by allowing the re-expression of fetal hemoglobin.
  • the invention aims to offer new bifunctional products in which the histone deacetylase inhibitor and the compound capable of binding to a protein encoded by an adult gene, are covalently linked optionally via a spacer arm.
  • the two ingredients are advantageously linked by ester or amide bonds.
  • the chemical groups ensuring the covalent bond are, for example, carboxylic ester, carboxylic amide, thiocarboxylic ester or thiocarboxylic amide groups.
  • the bifunctional product binds, by an ester or amide bond, a histone deacetylase inhibitor (valproate, butyrate or others) to the allosteric ligand of adult hemoglobin, such as 2-3 diphospho glycerate ( DPG). It is also possible to replace 2-3-DPG with its precursor, 1 inosine.
  • a histone deacetylase inhibitor valproate, butyrate or others
  • 2-3-DPG with its precursor, 1 inosine.
  • the compound Once administered to the patient, the compound will be cleaved by esterases or amidases at the ester or amide link (these enzymes are abundant in cells and blood).
  • the released histone deacetylase inhibitor will act nonspecifically on the histone-dependent general switch, while 2-3-DPG, or its precursor, will specifically activate the fetal hemoglobin switch.
  • the histones being acetylated in principle any gene should be activated, but 2-3-DPG will activate the fetal hemoglob
  • FIG. 6 shows a covalent amide bond binding valproic or butyric acid to the amine of arginine (which is different from a salt obtained by neutralization). Cleavage of the amide bond by amidase in the cells will release the histone deacetylase inhibitor, and the NO precursor.
  • Another possibility, described in FIG. 6a, is to form an ester bond between the 30H butyrate or the OH valproate and the carboxyl group of arginine. In each case, the main histone dependent switch is turned on, while the NO signal that is generated will specifically induce the expression of utrophin.
  • L-arginine precursor of NO
  • cGMP linked to butyrate or valproate by an amino or ester bond
  • LGMD2B the compound to be synthesized binds the histone deacetylase inhibitor (butyrate or valproate or others) by an ester bond, to the dysferline ligand.
  • the dysferline ligand is probably a phospholipid because dysferline includes a C2 domain, common to other proteins, domain which binds phospholipids.
  • FIG. 7 shows an example, again the ester link could be changed to an amino link.
  • Another example concerns the congenital syndromes of Myasthenia due to a mutation of the adult ⁇ subunit of the receptor for which it would be necessary to reactivate the expression of the ⁇ subunit which confers its fetal form on the nicotinic receptor.
  • the bifunctional compound proposed in this case would associate, via an ester bond, for example, the histone deacetylase inhibitor (butyrate or valproate or others) with a specific ligand of the receptor such as choline (FIG. 8), the cleavage of the bond. ester by esterases releasing butyrate or valproate opening the general switch, and also releasing the specific inducer of the fetal form of the nicotinic receptor, choline.
  • the ligand of the SMN1 protein could be directly or indirectly snRNPs which is involved in the splicing of mRNAs. Methylation of the snRNP complex seems necessary for its functioning. It would be dangerous to use snRNPs as a specific inducer (antibodies to snRNPs cause Lupus erythematosus). In this situation, it is only possible to help the functioning of snRNPs by promoting its methylation.
  • a methyl donor can be linked by an ester or amino link to a histone deacetylase inhibitor (butyrate, valproate) as we have previously described.
  • the objective is to induce the expression of SMN2, the silent copy of the SMN1 gene, including its exon 7.
  • the subject of the invention is also pharmaceutical compositions comprising, as active agent, at least one product as defined above.
  • FIG. 1 illustrates the possibility of inducing an increase in utrophin in the muscle under the effect of histone deacetylase inhibitors, using butyrate, leader of these inhibitors on mouse myotube cultures
  • FIG. 2 represents the immunofluorescence analysis of the utrophin present in the muscles of dystrophic mice dx, the animal model of Duchenne muscular dystrophy, into which were injected butyrate and by way of comparison of L-arginine as NO donor
  • FIG. 3 represents the immunofluorescence analysis of the utrophin after application of the same molecules as for FIG. 2 to human myotubes in culture
  • FIG. 4 represents the increase in utrophin in healthy mice treated with arginine butyrate.
  • FIG. 5 shows examples of bifunctional products that can be used in the case of sickle cell anemia.
  • FIG. 6 shows examples of bifunctional products that can be used in the case of Duchenne muscular dystrophy.
  • FIG. 7 shows examples of bifunctional products that can be used in the case of Miyoshi myopathy and LGMD2B.
  • - Figure 8 shows examples of bifunctional products that can be used in the case of congenital myasthenic syndrome (mutation of the epsilon subunit of the nicotinic receptor).
  • - Figure 9 shows examples of bifunctional products that can be used in the case of spinal muscular atrophy.
  • Example 1 Increase in the utrophin in myotubes of mdx mice treated with butyrate ( Figurel).
  • Myotubes of dystrophic mdx mice (xlt line) are treated with 5 ⁇ l of butyrate for 48 h.
  • the increase in utrophin is then quantified in Western Blot.
  • the measurement of the intensity of the bands shows an increase in expression of utrophin by a factor of 2 after treatment of the myotubes with butyrate.
  • Example 2 Increase in utrophin in mdx mice treated with butyrate ( Figure 2).
  • M dx mice are injected daily, ip and for 6 weeks with 200 mg / kg / day either of butyrate, or of L-arginine, or of physiological saline. It is observed that the utrophin is poorly expressed in the muscle of mdx mice injected with physiological saline used as a control. In contrast, in mice injected with butyrate or L-arginine, utrophin appears under the muscle membrane. It should be noted that the increase in utrophin is greater in the case of mice injected with butyrate. The increase in utrophin was quantified in Western Blot. The measurement of the intensity of the bands shows an increase in expression of utrophin by a factor of 2 in the mdx mice treated with butyrate.
  • Example 3 Increase in utrophin in human myotubes treated with butyrate ( Figure 3).
  • Example 4 Increase in Utrophin in Healthy Mice Treated with Arginine Butyrate (Figure 4).
  • OF 1 mice are injected daily, ip and for 6 weeks with 100, 200 or 300 mg / kg / day either of arginine butyrate or of physiological saline.
  • mice injected with arginine butyrate utrophin appears very clearly under the muscle membrane. This increase is dose-dependent.
  • the induction of utrophin under the muscular membrane is important probably due to an additive effect of arginine via NO and of butyrate via activation of the transcription of the gene for utrophin.
  • Patent N ° 99/07442
  • Pharmaceutical composition comprising NO or at least one compound capable of releasing or inducing the formation of NO in cells.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur d'histone déacétylase pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie résultant de la déficience d'un gène adulte chez un individu par la ré-expression du gène foetal homologue. L'invention s'intéresse tout particulièrement au traitement des dystrophies comme la dystrophie de Duchenne ou la dystrophie de Becker où le gène adulte défectueux est le gène de la dystrophine et le gène foetal homologue est le gène de l'utrophine.

Description

UTILISATION D'UN INHIBITEUR D'HISTONE DEACETYLASE POUR LE TRAITEMENT DES DYSTROPHIES MUSCULAIRES.
La présente invention concerne le traitement de maladie résultant de la déficience d'un gène adulte chez un individu grâce à la ré-expression du gène foetale homologue. L'invention s'intéresse tout particulièrement au traitement au long cours des dystrophies et des maladies semblables comprenant l'administration, à un sujet présentant un gène défectueux, d'une quantité adéquate d'un inhibiteur d'histone déacétylase.
Le métabolisme foetal est glycolitique et ammonotélique alors que le métabolisme adulte est oxydatif et uréotélique. Un des principaux composé impliqué dans le métabolisme de type foetal est le butyrate qui, associé à d'autres produits du métabolisme glycolytique, inhibe au niveau du noyau, une enzyme essentielle : l'histone deacetylase. Le relâchement du brin d'ADN qui s'en suit permet aux facteurs de transcription d'atteindre le promoteur et d'induire l'expression du gène. A l'inverse, la stimulation du métabolisme oxydatif associé à la stimulation de méthylases, induit la synthèse de nouveaux produits qui remplacent ceux qui étaient exprimés pendant la vie fœtale. C'est ainsi que la diminution du butyrate et du lactate, en induisant la deacétylation des histones, éteint l'expression des gènes foetaux, alors que la méthylation de métabolites, créatine phosphate, choline et autres entraîne l'activation de l'expression du gène adulte. Le déplacement des méthylations vers le cytoplasme, semble être d'une certaine manière, associé à l'expression d'un gène adulte.
La transition entre l'expression d'un gène fœtal et celle du gène adulte se produit parce que le métabolisme devient oxydatif pour s'adapter à l'air et à la pesanteur. Ce type de métabolisme génère des transmetteurs méthylés et de la créatine phosphate qui permettent aux muscles par exemple, de s'adapter à la vie sur terre (par opposition à la vie fœtale qui se déroule en milieu aquatique) . La nécessité de permuter des gènes fœtaux vers les gènes adultes correspond probablement à une adaptation de l'organisme à de nouvelles sources de protéines.
Les inventeurs ont ainsi observé que des gènes fœtaux s'éteignent au profit de leurs homologues adultes, ou plus généralement que des gènes moins adaptés à l'environnement de l'organisme s'éteignent au profit d'homologues mieux adaptés à cet environnement. Ces derniers expriment alors des protéines régulées qui répondent de manière plus adéquate à cet environnement.
On a ainsi décrit dans l'art antérieur une nouvelle méthode de traitement des maladies où le gène adulte défectueux a un homologue fœtal. Cette méthode est basée sur la réactivation de ce gène fœtal. Il s'agit par exemple des myopathies de Duchenne et de Becker ou de la thalassémie et de la drépanocytose . La demande de brevet français publiée sous le No. 2 794 647 montre que l'utilisation de L-arginine et de donneurs NO permet de réactiver l'expression de gènes fœtaux dans des tissus adultes de façon à restaurer la présence et la localisation de protéines fœtales. Des effets spectaculaires ont été obtenus dans le cas de dystrophie musculaire chez la souris, où la réexpression d'utrophine améliore considérablement l'état des muscles déficients de la souris mdx qui est un modèle murin de la maladie humaine.
Il a été par ailleurs rapporté que lors de son développement, le fœtus humain possède une hémoglobine fœtale de forte affinité pour l'oxygène, qui sera remplacée, chez le nouveau-né, par une hémoglobine de basse affinité, laquelle sera, de surcroît, régulée négativement par le 2-3diphosphoglycerate (DPD) . Lorsque l'hémoglobine adulte est défectueuse du fait d'une mutation (anémie falciforme) , son ligand régulateur augmente (Abekile, 1998) .
Les Inventeurs ont maintenant considéré que ce ligand peut alors servir de signal inducteur pour exprimer l'hémoglobine fœtale.
Ce mécanisme d'extinction-substitution dépend d'un « double interrupteur ». Le premier est général, non spécifique et bien connu, il est lié à l'état des histones, on sait que leur désacétylation par exemple diminue l'expression des gènes en « resserrant l'enroulement du brin d'ADN ». Le second est spécifique et résulterait de la décroissance d'un inducteur qui n'est plus disponible lorsque le gène adulte ou le mieux adapté s'exprime car cet inducteur est alors lié au produit du gène spécifique. L'existence de cet interrupteur spécifique est maintenant mise en évidence par les expériences montrant que le même « interrupteur général », inhibiteur d'histone déacétylase, va « allumer » l'hémoglobine fœtale dans l'anémie falciforme, l'utrophine dans la dystrophie de Duchenne ou SMN2 dans 1 ' amyotrophie spinale, etc.
Ainsi des produits actifs sur un mécanisme général d'expression sont rendus permissifs pour l'expression du gène silencieux dans chaque cas, par la disponibilité de l'inducteur sélectif, le NO ou le cGMP pour utrophine, le 2-3DPG ou dérivé pour l'hémoglobine fœtale, Ch3SM, Ch3SmRNP ou dérivé pour SMN2. Ce ligand ne trouvant plus sa cible spécifique du fait de la mutation, autorise alors l'action de l'interrupteur général qui allume préférentiellement le gène silencieux correspondant à la mutation.
Il suffit alors que la mutation rende disponible le ligand d'un produit du gène muté sélectif dans chaque cas, pour que l'inhibiteur d'histone déacétylase puisse assurer préférentiellement l'expression du gène homologue du gène muté. Ceci a des applications multiples car chaque fois qu'un produit a été actif dans une mutation donnée, en agissant sur l'interrupteur général, et a permis l'expression du gène silencieux, il est à prévoir qu'il sera actif dans toute les autres pathologies.
Les travaux de recherche effectués dans le cadre de l'invention ont confirmé que cette régulation n'est déclenchée que si l'on lève une inhibition générale des gènes silencieux, qui est liée à l'état d' acetylation des histones (Zang and Reinberg, 2001) .
Les inhibiteurs d'histone déacétylase qui favorisent l'expression des gènes fœtaux ne sont pas spécifiques. Dans ces conditions, le gène fœtal correspondant au gène adulte muté est spécifiquement activé (l'hémoglobine fœtale dans les cas de l'anémie falciforme, ou l'utrophine dans le cas de la dystrophie de Duchenne) grâce à l'existence d'un autre interrupteur spécifique pour chaque couple de gènes fœtal-adulte.
La mutation de la protéine adulte est signalée et déclenche l'activation de la protéine fœtale. Les protéines adultes adaptées a la pression partielle de l'oxygène dans l'air et à la pesanteur pour les protéines musculaires sont régulées par des ligands spécifiques. Un exemple typique est le 2-3 DPG qui régule l'hémoglobine adulte. Lorsque la protéine adulte est absente ou mutée, alors son ligand spécifique se trouve libre dans le cytoplasme et de ce fait, induit, directement ou indirectement, l'activation du gène fœtal correspondant. Cette induction est possible seulement dans le cas ou l'histone déacétylase est inhibée, par le butyrate par exemple, c'est-à-dire dans la situation d'un métabolisme glycolitique, ce qui est le cas des cellules juvéniles.
Il est en effet établi que dans sa forme hypoacétylée, l'histone freine l'expression de ces gènes. En présence de butyrate ou d'autres inhibiteurs d'histone déacétylase, on lève cette inhibition générale et l'on permet alors à l'inducteur sélectif, activé du fait de la mutation, de déclencher le gène silencieux. Les inhibiteurs d' histones déacétylase, comme le butyrate sont, du reste, utilisés dans le traitement de l'anémie falciforme.
Ce même principe peut aussi s'appliquer à 1 ' amyotrophie spinale, SMN1 étant muté, son ligand CH3- SmRNP (méthyl, smallribonucléoprotéine ) deviendrait inducteur, si toutefois le butyrate lui permet d'agir en favorisant la réacétylation des histones. L'expression de SMN2 a été ainsi obtenue par le butyrate (Chang et al., 2001) . Il serait aussi dans ce cas utile de favoriser la méthylation de SmRNP ou d'en augmenter l'expression. Les donneurs de NO pourraient être utiles ainsi que les donneurs de méthyle. La présente invention s'applique aussi à la myopathie de Miyoshi (MM) et à la myopathie de ceinture ou forme 2B de la « limbgirdle muscular dystrophy » (LGMD2B) (Bushby K. , Acta Myologica, vol. 19, 2000, p. 209-13) qui sont caractérisées par l'absence de dysferline, une protéine homologue, la myoferline, pouvant alors servir de substitut (Davis et al. Hum., Mol. Genêt., 2000, vol. 9, p. 217-226). Elle peut encore concerner un syndrome myasthénique dénommé gamma-AchR (récepteur de 1 ' acétylcholine) dans lequel la sous-unité gamma (forme fœtale) du récepteur à 1 ' acétylcholine n'est pas remplacée par la sous-unité epsilon (forme adulte) (Engel et al., Ann. Neurol . 1996, vol. 40, p. 810-817) Pour ces deux types de pathologies, conformément à l'invention, le ligand général est un inhibiteur d'histone déacétylase (HDAC) et le ligand spécifique un phospholipide pour la MM et la LGMD2B et la choline pour le syndrome gamma-Achr. En effet, la dysferline et myoferline font partie d'une famille de molécules à domaine C2 qui reconnaît et lie fortement les phospholipides . Il a été rapporté dans l'art antérieur (Perrine S P et al. EXPERIENTIA, BIRKHAUSER VERLAG. BASEL, CH, vol. 49, no.2, 15 février 1993 (1993-02-15), pages 133-137) l'utilisation d'un composé à base de butyrate « butyrate- based compounds » pour traiter les bêta hémoglobinopathies, l'anémie falciforme et les syndromes de bêta thalassemie. Il convient de remarquer que ce document ne s'intéresse pas aux dystrophies musculaires, comme la dystrophie de Duchenne et qu'il propose le butyrate d'arginine en tant que dérivé du butyrate pour éviter une surcharge sodique au patient. Ainsi le principe actif que ces auteurs proposent d'utiliser est le butyrate et non 1 ' arginine .
Il a également été envisagé dans l'art antérieur (Olivieri NF et al., HUMAN MOLECULAR GENETICS 1998 UNITED KINGDOM, Vol. 7, no. 10, 1998, pages 1655-1658, XP002249547, ISSN: 0964-6906) d'étendre un principe utilisé pour traiter l'anémie falciforme et la bêta thalassemie à une autre pathologie monogénique, la Dystrophie musculaire de Duchenne. Cet article est basé sur l'hypothèse d'un principe commun à ces deux types de pathologies, la stimulation pharmacologique d'un gène fœtal pour remplacer un gène adulte (hémoglobine fœtale dans un cas et utrophine, qui est l'homologue fœtal de la dystrophine absente chez les patients dystrophiques, dans l'autre cas). Or, la présente invention est basée sur la mise en œuvre d'un système de double commutateur pour lever l'inhibition du gène fœtal : i) le commutateur général lié à 1 ' acetylation des histones, et ii) le commutateur sélectif, lié au produit du seul gène manquant (le NO dans le cas de l'utrophine). Ainsi, l'inhibiteur d'histone déacétylase ouvre l'interrupteur général et l' arginine (NO) ouvre l'interrupteur sélectif.
Les Inventeurs ont donc maintenant mis en évidence qu'un inhibiteur d'histone déacétylase pouvait être utilisé pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie résultant de la déficience d'un gène adulte chez un individu par la réexpression du gène fœtale homologue. Ce médicament selon l'invention est destiné à réactiver l'expression d'au moins un gène fœtal dans des tissus adultes de façon à restaurer la présence et/ou la localisation d'au moins une protéine fœtale. Ainsi l'invention vise à réactiver le gène fœtal codant la forme embryonnaire de la protéine codée par le gène adulte défectueux.
L'invention s'intéresse tout particulièrement au traitement des dystrophies musculaires, comme la dystrophie de Duchenne ou de Becker où le gène adulte défectueux est le gène de la dystrophine et le gène fœtal homologue est le gène de l'utrophine.
Il a en effet été observé que la dystrophine est spatialement très proche de la NOsynthase, et le NO produit localement va sans doute avoir des effets essentiels sur cette protéine, dont la mutation s'accompagne d'un déficit de NOsynthase à la membrane.
Le NO permet alors d'induire l'expression de l'utrophine, homologue silencieux de la dystrophine qui prédomine dans la vie fœtale, et qui du reste ne subsiste chez l'adulte qu'en des lieux ou la NOsynthase est très élevée (plaque motrice, vaisseaux) .
Ainsi, les Inventeurs ont démontré que 1' arginine, substrat de la NOsynthase, et les donneurs de NO, entraînent une sur-expression d'utrophine. Cet effet a été obtenu sans lever l'interrupteur général lié à 1 ' acetylation des histones, car le NO bloque aussi des étapes essentielles du cycle de Krebs, ce qui entraîne une élévation de l'acétylCoA et des corps cétoniques (butyrate) . Ainsi le NO agit comme ligand inducteur mais aussi via le butyrate sur l'histone déacétylase. La mise en œuvre d'un inhibiteur d'histone déacétylase selon l'invention offre en outre l'avantage de disposer d'un médicament qui peut être administré par voie orale . L'action de la L-arginine et de ses dérivées sur la réactivation du gène fœtale est obtenue par voie parentéale. Or il est difficile d'appliquer une telle thérapie sur le long terme et il est nécessaire de prévoir des périodes de repos. Les inhibiteurs d' histones déacétylases avantageusement administrés par voie orale permettent de maintenir l'effet pendant ces périodes. En effet, les inhibiteurs d' histones déacétylases permettent de maintenir durant ces périodes « 1 ' interrupteur général » lié à 1 ' acetylation des histones ouvert. II existe de nombreux inhibiteurs d'histone déacétylase : le valproate, la trichostatine etc., qui maintiennent les histones acétylées, le plus classique est le butyrate. Du fait que la dystrophine et l'utrophine sont associées à la NOsynthase, les Inventeurs ont démontré que le NO favorise l'expression de l'utrophine, selon le même principe que le 2-3-DPG dans le cas de l'hémoglobine. Le principal composé utilisé pour induire l'expression de l'utrophine, est le substrat de la NOsynthase : la L- arginine . Les inventeurs ont maintenant montré (Figure 4) qu'un sel de butyrate d' arginine augmente considérablement la quantité d'utrophine dans les muscles sains et chez la souris mdx.
L'inhibiteur d'histone déacétylase peut ainsi être choisi dans le groupe comprenant le butyrate, le phénylbutyrate, 1 ' isobutyramide, le valproate, le dérivé hydroxamate de l'acide butyrique, l'apicidin, le CBHA (m- carboxycinnamic acid bishydoxyamide) , 1 ' HC toxin, le M344 (4-diméthylamino-N- (6-hydroxycarbamoyl-hexyl) -benzamide) , le Nullscript (4- (1 , 3-dioxo-lH, 3H-benzo [de] isoquinolin-2 - yl ) -N-hydroxybutanamide) , le SAHA ( suberoylanil ide hydroxamic acid) , le Scriptaid ( 6 - ( 1.3 -dioxo- 1H, 3H- benzo [de] isoquinolin- 2 -yl ) -N-hydroxyhexanamide ) , la trichostatine (TSA ; (R- (E, E) -7- [4- (diméthylamino) -phényl] - N-hydoxy-4 , 6-diméthyl-7-oxo-2 , 4-heptadienamide) .
De nombreuses maladies génétiques ont pour origine une mutation sur un gène qui possède une copie silencieuse, le but de la présente invention est donc de réexprimer cette copie silencieuse, en utilisant toute une série de combinaison de composés du type décrit précédemment .
Dans une forme de réalisation particulière de l'invention, il s'agit de composés bifonctionnels dans lesquels le ligand de la protéine absente ou anormale est lié par covalence à un inhibiteur d'histone déacétylase. De tels composés ont la capacité de traiter les pathologies dans lesquelles un gène est muté, en induisant l'expression d'un gène homologue, principalement la copie fœtale de ce gène (dans les cas où celui-ci existe) en utilisant un composé bifonct ionnel clivable qui libérera dans 1 ' organime i) l'inhibiteur d'histone déacétylase agissant sur l'interrupteur général, non spécifique, lié à 1' acetylation des histones, et ii) ligand de la protéine mutée, activant l'interrupteur spécifique. Dans le cas ou ce ligand ne serait pas disponible ou serait inutilisable, il est possible, en remplacement, de lier son précurseur ou son produit, ou encore une molécule favorisant son action.
L'invention a donc tout particulièrement pour objet l'utilisation en association d'un inhibiteur d'histone déacétylase et d'un composé régulant une protéine codée par un gène adulte pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie résultant de la déficience dudit gène adulte pour lequel il existe un gène homologue silencieux. Dans une forme particulière de réalisation, ledit composé est apte à se lier et à réguler la protéine codée par ce gène adulte. Il s'agit par exemple de protéines allostériques .
Selon une première forme de mise en œuvre de l'invention, ledit médicament contient l'inhibiteur d'histone déacétylase et le composé régulant une protéine codée par un gène adulte, de façon séparée dans le même emballage.
Selon une deuxième forme de mise en œuvre de l'invention, ledit médicament contient l'inhibiteur d'histone déacétylase et le composé régulant une protéine codée par un gène adulte, sous une forme pharmaceutique unique contenant les deux ingrédients.
Selon une troisième forme de mise en œuvre de l'invention, l'inhibiteur d'histone déacétylase et le composé régulant une protéine codée par un gène adulte, sont liés par covalence éventuellement par l'intermédiaire d'un bras espaceur. Ladite liaison ou bras espaceur est clivable dans l'organisme de façon à libérer les deux ingrédients actifs.
Selon une première application spécifique de l'invention, l'inhibiteur d'histone déacétylase est associé à au moins un composé choisi dans le groupe comprenant le NO, un composé donneur de NO ou un composé capable de libérer, de favoriser ou d'induire la formation de NO dans les cellules. Ledit médicament est destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie résultant de la déficience du gène de la dystrophine en permettant la ré-expression du gène de l'utrophine. Ladite maladie est la dystrophie de Duchenne ou de Becker.
Un médicament comprenant l'histone déacétylase est administré à un individu ayant reçu concomitamment ou préalablement à l'administration dudit médicament une quantité appropriée d'au moins un composé choisi dans le groupe comprenant le NO, un composé donneur de NO ou un composé capable de libérer, de favoriser ou d'induire la formation de NO dans les cellules.
Le composé capable d'induire la formation de NO est par exemple la L-arginine, ou un de ses dérivés constituant un substrat de la NO-synthase ou favorisant la disponibilité du substrat. Ainsi, un exemple préféré de la première forme de mise en œuvre de l'invention ci-dessous, concerne une composition pharmaceutique comprenant du butyrate d' arginine.
Le composé donneur de NO est par exemple la molsidomine ou de l'un de ses dérivés capable lors de sa transformation dans l'organisme de libérer du NO.
Selon une deuxième application spécifique, l'invention concerne le traitement de 1 ' amyotrophie spinale, où l'inhibiteur d'histone déacétylase est associé à un composé donneur de méthyle apte à activer le SmRNP (smallribonucléoprotéine) endogène en le méthylan . Le CH3- SmRNP est capable de lier les protéines codées par le gène SMN1, et lorsque celui-ci est déficient, il permet la réexpression du gène homologue SMN2 en associant avec l'inhibiteur d'histone déacétylase.
Selon une troisième application spécifique de l'invention, l'inhibiteur d'histone déacétylase est associé à un ou plusieurs phospholipides capables de lier la dysferline. Ledit médicament est destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie résultant de la déficience du gène de la dysferline en permettant la ré-expression de la myoferline. Ladite maladie est la myopathie de Miyoshi (MM) ou la forme 2B de la myopathie de ceinture (limb girdle muscular dystrophy) (LGMD2B) . Selon une quatrième application spécifique de l'invention, l'inhibiteur d'histone déacétylase est associé à la choline ou un dérivé de celle-ci capable de lier le récepteur nicotinique l' acétylcholine . Ledit médicament est destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie résultant de la déficience du gène de la sous-unité epsilon dudit récepteur adulte en permettant la ré-expression du gène fœtal homologue codant la sous -unité gamma dudit récepteur. Ladite maladie est un syndrome myasthénique dénommé gamma-AchR.
Selon une cinquième application spécifique de l'invention, l'inhibiteur d'histone déacétylase est associé au 2-3diphosphoglycerate, un dérivé ou précurseur (inosine) de celui-ci capable de se fixer sur l'hémoglobine. Le dit médicament est destiné au traitement de l'anémie falciforme en permettant la ré-expression de l'hémoglobine fœtale.
Comme indiqué précédemment, l'invention vise à offrir de nouveaux produits bifonctionnels où l'inhibiteur d'histone déacétylase et le composé apte à se lier à une protéine codée par un gène adulte, sont liés par covalence éventuellement par l'intermédiaire d'un bras espaceur.
Les deux ingrédients sont avantageusement liés par des liaisons ester ou amide. Les groupes chimiques assurant la liaison covalente sont par exemple des groupes ester carboxylique , amide carboxyl ique , ester thiocarboxylique ou amide thiocarboxylique.
Dans le cas de l'anémie falciforme, le produit bifonctionnel lie par une liaison ester ou amide, un inhibiteur d'histone déacétylase (valproate, butyrate ou autres) au ligand allostérique de l'hémoglobine adulte, comme le 2-3 diphospho glycérate (DPG) . Il est possible également de remplacer le 2-3-DPG par son précurseur, 1' inosine. Une fois administré au patient, le composé sera clivé par les estérases ou les amidases au niveau de la liaison ester ou amide (ces enzymes sont abondantes dans les cellules et le sang) . L'inhibiteur d'histone déacétylase libéré agira de manière non spécifique sur l'interrupteur général, dépendant des histones, alors que le 2-3- DPG, ou son précurseur, activera spécifiquement l'interrupteur hémoglobine fœtale. En d'autre terme, les histones étant acétylées, en principe n'importe quel gène devrait être activé, mais le 2-3-DPG activera spécifique le gène de l'hémoglobine fœtale parce qu'il n'aura pas trouvé sa cible, l'hémoglobine adulte.
Le même principe peut-être appliqué pour induire l'utrophine. La figure 6 montre une liaison amide covalente liant l'acide valproïque ou butyrique à l'aminé de l' arginine (ce qui est différent d'un sel obtenu par neutralisation) . Le clivage de la liaison amide par 1 ' amidase dans les cellules, libérera l'inhibiteur d'histone déacétylase, et le précurseur de NO. Une autre possibilité, décrite dans la figure 6a, est de former une liaison ester entre le 30H butyrate ou le OH valproate et le groupement carboxyl de l' arginine. Dans chaque cas, l'interrupteur principal dépendant de l'histone est activé, alors que le signal NO qui est généré induira spécifiquement l'expression d'utrophine. A la place de la L-arginine, précurseur de NO, il est possible d'utiliser le cGMP lié au butyrate ou au valproate par une liaison aminé ou ester (Figure 6) . Dans le cas de la myopathie de Miyoshi ou de la forme de myopathie des ceintures où la dysferline est mutée (LGMD2B) , celle-ci pourra être remplacée par la myoferline. Dans ce cas, le composé à synthétiser lie l'inhibiteur d'histone déacétylase (butyrate ou valproate ou autres) par une liaison ester, au ligand de la dysferline. Le ligand de la dysferline est probablement un phospholipide car la dysferline comprend un domaine C2 , commun à d'autres protéines, domaine qui lie les phospholipides . La Figure 7 présente un exemple, là encore la liaison ester pourrait être changée pour une liaison aminé. Un autre exemple concerne les syndromes congénitaux de Myasthénie dus à une mutation de la sous-unité ε adulte du récepteur pour lesquels il serait nécessaire de réactiver l'expression la sous-unité γ qui confère sa forme fœtale au récepteur nicotinique. Le composé bifonctionnel proposé dans ce cas associerait, via une liaison ester par exemple, l'inhibiteur d'histone déacétylase (butyrate ou valproate ou autres) à un ligand spécifique du récepteur tel que la choline (Figure 8) , la coupure de la liaison ester par les estérases libérant le butyrate ou le valproate ouvrant l'interrupteur général, et libérant aussi l'inducteur spécifique de la forme fœtale du récepteur nicotinique, la choline.
Un autre cas est celui de 1 ' amyotrophie spinale, le ligand de la protéine SMN1 protein pourrait être directement ou indirectement snRNPs qui est impliqué dans l'épissage des ARNm. La méthylation du complexe snRNP semble nécessaire à son fonctionnement. Il serait dangereux d'utiliser snRNPs comme inducteur spécifique (les anticorps dirigés contre snRNPs provoquent du Lupus érythémateux) . Dans cette situation, il est seulement possible d'aider le fonctionnement de snRNPs en favorisant sa méthylation. Un donneur de méthyl pourra être lié par une liaison ester ou aminé à un inhibiteur d'histone déacétylase (butyrate, valproate) comme nous l'avons décrits précédemment. Ce composé (Figure 9) , après coupure, serait actif sur l'interrupteur général et sur l'induction spécifique du ligand formé par la méthylation de snRNPs. L'objectif étant d'induire l'expression de SMN2 , la copie silencieuse du gène SMN1, y compris son exon 7. L'invention a aussi pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant à titre d'agent actif au moins un produit comme défini précédemment.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent et dans lesquels il sera fait référence aux dessins en annexe où :
- la figure 1 illustre la possibilité d' induire une augmentation de l'utrophine dans le muscle sous l'effet d'inhibiteurs d'histone déacétylase, en utilisant le butyrate, chef de file de ces inhibiteurs sur des cultures de myotubes de souris ; la figure 2 représente l'analyse par immunofluorescence de l'utrophine présente dans les muscles de souris dystrophiques dx, le modèle animal de la myopathie de Duchenne, auxquelles ont été injectés du butyrate et à titre de comparaison de la L-arginine en tant que donneur de NO la figure 3 représente l'analyse par immunofluorescence de l'utrophine après application des mêmes molécules que pour la figure 2 à des myotubes humains en culture ; la figure 4 représente l'augmentation de l'utrophine dans des souris saines traitées par le butyrate d' arginine.
- La figure 5 présente des exemples de produits bifonctionnels pouvant être utilisés dans le cas de l'anémie falciforme.
- La figure 6 présente des exemples de produits bifonctionnels pouvant être utilisés dans le cas de la dystrophye musculaire de Duchenne.
- La figure 7 présente des exemples de produits bifonctionnels pouvant être utilisés dans le cas de la myopathie de Miyoshi et de la LGMD2B. - La figure 8 présente des exemples de produits bifonctionnels pouvant être utilisés dans le cas du syndrome myasthénique congénital (mutation de la sous-unité epsilon du récepteur nicotinique) . - La figure 9 présente des exemples de produits bifonctionnels pouvant être utilisés dans le cas de 1' amyotrophie spinale.
Exemple 1 : Augmentation de l'utrophine dans des myotubes de souris mdx traitées par le butyrate (Figurel) .
Des myotubes de souris mdx dystrophiques (lignée xlt) sont traités par 5 ni de butyrate pendant 48h. L'augmentation de l'utrophine est ensuite quantifiée en Western Blot . La mesure de l'intensité des bandes montre une augmentation d'expression d'utrophine d'un facteur 2 après traitement des myotubes par le butyrate.
Exemple 2 : Augmentation de l'utrophine dans des souris mdx traitées par le butyrate (Figure 2) .
Des souris m dx sont été injectées quotidiennement, en i.p. et pendant 6 semaines avec 200 mg/kg/jour soit de butyrate, soit de L-arginine, soit de sérum physiologique. On observe que l'utrophine est peu exprimée dans le muscle des souris mdx injectées avec du sérum physiologique utilisé comme contrôle. Par contre dans les souris injectées avec le butyrate ou la L-arginine, l'utrophine apparaît sous la membrane musculaire. Il faut noter que l'augmentation d'utrophine est supérieure dans le cas des souris injectées avec le butyrate. L'augmentation de l'utrophine a été quantifiée en Western Blot. La mesure de l'intensité des bandes montre une augmentation d'expression d'utrophine d'un facteur 2 dans les souris mdx traitées par le butyrate. Exemple 3 : Augmentation de l'utrophine dans des myotubes humains traités par le butyrate (Figure 3) .
Des myotubes humains ont été obtenus après mise en culture de résidus opératoires fournis par la BTR (Banque de Tissu pour la Recherche) . Ces myotubes, une fois différenciés ont été traités avec du butyrate ou de la L- arginine . Comme dans le cas des souris injectées, l'augmentation d'utrophine visualisée par immunofluorescence est particulièrement importante après traitement par 0,5 mM de butyrate.
Exemple 4 : Augmentation de l'utrophine dans des souris saines traitées par le butyrate d' arginine. (Figure 4) . Des souris O F 1 sont été injectées quotidiennement, en i.p. et pendant 6 semaines avec 100, 200 ou 300 mg/kg/jour soit de butyrate d' arginine, soit de sérum physiologique. On n'observe pas d'utrophine à la membrane dans le muscle des souris injectées avec du sérum physiologique utilisé comme contrôle (« non traité») . Par contre dans les souris injectées avec le butyrate d' arginine, l'utrophine apparaît très nettement sous la membrane musculaire. Cette augmentation est dose- dépendante. L'induction d'utrophine sous la membrane musculaire est importante probablement en raison d'un effet additif de l' arginine via le NO et du butyrate via l'activation de la transcription du gène de l'utrophine. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Claims

REVENDICATIONS
1) Utilisation d'un inhibiteur d'histone déacétylase pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie résultant de la déficience d'un gène adulte pour lequel il existe un gène homologue silencieux, ledit médicament permettant la réexpression par la ré-expression dudit gène homologue.
2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le gène homologue est le gène fœtal .
3) Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné à réactiver l'expression d'au moins un gène fœtal dans des tissus adultes de façon à restaurer la présence et/ou la localisation d'au moins une protéine fœtale.
4) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le gène fœtal code la forme embryonnaire de la protéine codée par le gène adulte défectueux.
5) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'inhibiteur d'histone déacétylase est choisi dans le groupe comprenant le butyrate, le phénylbutyrate , 1 ' isobutyramide , le valproate, le dérivé hydroxamate de l'acide butyrique, l'apicidin, le CBHA (m- carboxycinnamic acid bishydoxyamide) , 1 ' HC toxin, le M344 (4 -diméthylamino-N- (6-hydroxycarbamoyl-héxyl) -benzamide) , le Nullscript (4- (1 , 3-dioxo-lH, 3H-benzo [de] isoquinolin-2- yl ) -N-hydroxybutanamide) , le SAHA ( suberoylanil ide hydroxamic acid), le Scriptaid ( 6 - ( 1.3 -dioxo- 1H, 3H-benzo [de] isoquinolin-2 -yl) -N-hydroxyhexanamide) , la trichostatine (TSA ; (R- (E, E) -7- [4- (diméthylamino) -phényl] - N-hydoxy-4 , 6-diméthyl-7-oxo-2 , 4-heptadienamide) .
6) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit médicament est pour une administration par voie orale.
7) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite maladie est choisie dans le groupe comprenant les dystrophies comme les dystrophies de Duchenne ou de Becker, l'anémie faclciforme, les myopathies comme la myopathie de Miyoshi et la LGMD2B, le syndrome myasthénique congénital, l'amyotropie spinale.
8) Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite maladie est la dystrophie de Duchenne ou la dystrophie de Becker et en ce que le gène adulte défectueux est le gène de la dystrophine et le gène fœtal homologue est le gène de l'utrophine.
9) Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite maladie est 1 ' amyotrophie spinale, et en ce que le gène adulte défectueux est le gène SMN1 et le gène homologue est le gène SMN2.
10) Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite maladie est la myopathie de Miyoshi ou la forme 2B de la myopathie de ceinture, et en ce que le gène adulte défectueux est le gêne de la dysferline et le gène homologue est le gène de la myoferline.
11) Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite maladie est un syndrome myasthenique dénommé gamma-AchR, et en ce que le gène adulte défectueux est le gène de la sous-unité epsilon du récepteur nicotinique à 1 ' acétylcholine et le gène homologue est le gène de la sous-unité gamma dudit récepteur.
12) Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite maladie est l'anémie falciforme, et en ce que le gène adulte défectueux est le gène l'hémoglobine et le gène homologue fœtal est le gène de l'hémoglobine fœtale.
13) Utilisation en association d'un inhibiteur d'histone déacétylase et d'un composé régulant une protéine codée par un gène adulte pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie résultant de la déficience dudit gène adulte pour lequel il existe un gène homologue silencieux.
14) Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que ledit composé est apte à se lier et à réguler la protéine codée par ce gène adulte.
15) Utilisation selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisée en ce que ledit médicament contient l'inhibiteur d'histone déacétylase et le composé régulant une protéine codée par un gène adulte, de façon séparée dans le même emballage.
16) Utilisation selon l'une des revendications
13 ou 14, caractérisée en ce que ledit médicament contient l'inhibiteur d'histone déacétylase et le composé régulant une protéine codée par un gène adulte, sous une forme pharmaceutique unique contenant les deux ingrédients actifs. 17) Utilisation selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisée en ce que l'inhibiteur d'histone déacétylase et le composé régulant une protéine codée par un gène adulte, sont liés par covalence éventuellement par l'intermédiaire d'un bras espaceur et en ce que ladite liaison ou bras espaceur est clivable dans l'organisme de façon à libérer les deux ingrédients actifs.
18) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné au traitement ou à la prévention d'une dystrophie résultant de la déficience du gène de la dystrophine en permettant la ré-expression du gène de l'utrophine, et en ce que l'inhibiteur d'histone déacétylase est associé dans ledit médicament à au moins un composé choisi dans le groupe comprenant le NO, un composé donneur de NO ou un composé capable de libérer, de favoriser ou d'induire la formation de NO dans les cellules .
19) Utilisation selon la revendication 18, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie résultant de la déficience d'un gène adulte chez un individu par la ré- expression du gène fœtal homologue, ledit individu ayant reçu concomitamment ou préalablement à l'administration d'un inhibiteur d'histone déacétylase une quantité appropriée d'au moins un composé choisi dans le groupe comprenant le NO, un composé donneur de NO ou un composé capable de libérer, de favoriser ou d'induire la formation de NO dans les cellules.
20) Utilisation selon l'une des revendications 18 ou 19, caractérisée en ce que le composé capable d'induire la formation de NO est la L-arginine, ou un de ses dérivés constituant un substrat de la NO-synthase ou favorisant la disponibilité du substrat.
21) Utilisation selon l'une des revendications 18 ou 19, caractérisée en ce que le composé donneur de NO est la molsidomine ou de l'un de ses dérivés capable lors de sa transformation dans l'organisme de libérer du NO.
22) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné au traitement de 1 ' amyotrophie spinale, et en ce que l'inhibiteur d'histone déacétylase est associé à un composé donneur de méthyle apte à activer le SmRNP endogène en le méthylant, et en ce que le CH3- SmRNP est capable de lier la protéine codée par le gène SMN1, et lorsque celui-ci est déficient, de permettre la ré-expression du gène homologue SMN2.
23) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné au traitement de la myopathie de Miyoshi ou la forme 2B de la myopathie de ceinture et en ce que l'inhibiteur d'histone déacétylase est associé à un ou plusieurs phospholipides capables de lier la dysferline, et lorsque celui-ci est déficient de permettre la réexpression de la myoferline.
24) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné au traitement d'un syndrome myasthenique dénommé gamma-AchR et en ce que l'inhibiteur d'histone déacétylase est associé à la choline ou un dérivé de celle-ci capable de lier le récepteur nicotinique à 1 ' acétylcholine, et lorsque le gène de la sous-unité epsilon dudit récepteur adulte est déficient de permettre la ré-expression du gène fœtal homologue codant la sous- unité gamma dudit récepteur.
25) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné au traitement de l'anémie falciforme et en ce que l'inhibiteur d'histone déacétylase est associé au 2-3diphosphoglycerate, un dérivé ou précurseur de celui- ci capable de se fixer sur l'hémoglobine, et en ce que lorsque celui-ci est déficient de permettre la réexpression de l'hémoglobine fœtale.
26) Un produit dans lequel un inhibiteur d'histone déacétylase et un composé régulant une protéine codée par un gène adulte sont liés par covalence éventuellement par l'intermédiaire d'un bras espaceur, et en ce que ladite liaison ou bras espaceur est clivable dans l'organisme de façon à libérer les deux ingrédients actifs.
27) Un produit selon la revendication 26, caractérisé en ce que ledit composé est apte à se lier et à réguler la protéine codée par ce gène adulte.
28) Un produit selon l'une des revendications 26 ou 27, caractérisé en ce que les deux ingrédients sont liés par des liaisons ester ou amide.
29) Un produit selon l'une quelconque des revendications 26 à 28, caractérisé en ce que les groupes chimiques assurant la liaison covalente sont des groupes ester carboxyl ique , amide carboxyl ique , ester thiocarboxylique ou amide thiocarboxylique.
30) Un produit selon l'une quelconque des revendications 26 à 29, caractérisé en ce que l'inhibiteur d'histone déacétylase et le composé régulant une protéine codée par un gène adulte sont tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 25.
31) Une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un produit selon l'une quelconque des revendications 26 à 30.
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