EP1563086A1 - Vorrichtung zur bestimmung der aktivität von enzymen - Google Patents

Vorrichtung zur bestimmung der aktivität von enzymen

Info

Publication number
EP1563086A1
EP1563086A1 EP03789039A EP03789039A EP1563086A1 EP 1563086 A1 EP1563086 A1 EP 1563086A1 EP 03789039 A EP03789039 A EP 03789039A EP 03789039 A EP03789039 A EP 03789039A EP 1563086 A1 EP1563086 A1 EP 1563086A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
activity
enzymes
electrode array
enzyme
substrate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03789039A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Uwe Trebbe
Nico KÖHLING
Uwe GLÄSEL
Frank HÜPPMEYER
Tilo Weiss
Michael Frank
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henkel AG and Co KGaA filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Publication of EP1563086A1 publication Critical patent/EP1563086A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes

Definitions

  • the invention relates to a device for determining the activity of enzymes.
  • Enzymes are used in technology for various purposes, for example in detergents or cleaning agents and in the food industry. Knowledge of the activity of the enzymes is essential, which is why the price for enzymes is not based on their weight or volume, but rather on their activity, i.e. their actual effectiveness. Knowledge of the activity of enzymes, e.g. in washing and cleaning liquors, and the resulting need-based dosing of other components can lead to increased product performance with reduced use of raw materials. Also in the food industry, knowledge of the actual effectiveness of the enzyme in manufacturing processes is a crucial factor in increasing the efficiency of production processes.
  • WO 00/75360 A2 discloses a method and an apparatus for enzyme detection in which the degradation of a biodegradable polymer by the enzyme to be detected is observed. The degradation is monitored by a quartz microbalance, surface plasmon resonance, ellipsometry, impedance spectroscopy or capacitive measurements. In all of these processes, the degradation of a biodegradable polymer is used as a signaling mechanism.
  • the object of the invention is to provide a solution with the simplest possible Enzyme activities can be determined quickly in solution without denvation or other sample preparation.
  • a device of the type mentioned at the outset by a support on which at least one electrode array is arranged, which is coated with a polymer film, self-assembled monolayers (SAM) or silanes, an enzyme to be determined on the coating being adsorptive degradable substrate is applied.
  • SAM self-assembled monolayers
  • silanes an enzyme to be determined on the coating being adsorptive degradable substrate is applied.
  • the surface of the transducer above the electrode array is modified so that a substrate can be bound by adsorption.
  • the modification can be achieved, inter alia, by chemical surface treatment, such as, for example, silanization, or by the deposition of a thin polymer membrane.
  • various potential substrates can be immobilized by adsorption. If a sensor manufactured in this way is immersed in a solution that contains an enzyme that is able to degrade the immobilized substrate, the impediometric properties of the membrane change, among other things. These can be easily converted into electrical signals and processed accordingly.
  • the degradation of preferably monomers or oligomers which are adsorptively bound to the sensor.
  • a special film must be immobilized on the transducer surface for each enzyme class whose activity is detected with a sensor based on the principle of substrate consumption. Since only the adsorbed substrates are adapted accordingly in the device according to the invention the effort to develop a new system is relatively low. Experimentally complex optical methods or other complex processes are not required.
  • the substrate consists of monomers or oligomers.
  • Adsorptively bound monomers can be used to detect the activity of enzymes that are reactive, e.g. Oxidases or reductases. The reactive conversion of the monomers changes their dielectric properties, which can also be demonstrated.
  • the electrode array is designed as an interdigital electrode array. With such comb-like electrode finger structures, impediometric effects can be determined with great sensitivity. This type of electrode arrangement is therefore particularly suitable for the devices.
  • the electrode fingers are preferably approximately 10 ⁇ m wide and are also arranged at a distance of approximately 10 ⁇ m from one another.
  • Polystyrene or polyvinyl chloride has been found to be particularly suitable as the material for the polymer film.
  • a suitable plasticizer is preferably added to these polymers.
  • the polymers are generally applied from solution, e.g. according to the established process of drop, dip or spin coating.
  • the thickness of the polymer layer is preferably 1-5 ⁇ m.
  • the layer thickness of the adsorptively bound monomers or oligomers is in the nanometer range.
  • the carrier of the sensor consists of glass
  • other materials can also be used for the carrier, for example plastic, SiO 2 on Si, Al 2 O 3 , SiC or SiN x .
  • Platinum is particularly suitable as the electrode material, but it is also all other electrical conductors, such as gold, silver, platinum-iridium or poly-silicon, which are established in thin-film technology, are possible.
  • a plurality of electrode arrays are arranged next to one another on the carrier, on the respective polymer film of which different substrates are applied to determine different enzymes. It is thus possible to determine the activity of different enzymes contained in a solution at the same time with only one device.
  • the invention also proposes a method for determining the activity of enzymes with a device described above, which is characterized in that the device is immersed in an enzyme solution and the change over time in the impediometric properties of the system is measured and evaluated.
  • the immobilized substrate is broken down more or less quickly by the enzymes contained in the solution, which changes the impediometric properties or the capacitive resistance of the system, which can easily be converted into electrical signals and evaluated accordingly.
  • the method can be carried out several times with one device without any problems. Experiments have shown that a system can be used ten times until the immobilized substrate layer is completely degraded. The device can then be used again by adsorbing the enzyme substrates again. A device according to the invention can thus be easily regenerated and then used again.
  • FIG. 1 is a schematic view of a construction according to the invention on a greatly enlarged scale
  • Fig. 2 shows an interdigital electrode array in an enlarged again compared to Figure 1 Scale
  • Fig. 3 four measurement curves recorded with four different devices.
  • a device for determining the activity of enzymes is generally designated 1 in FIG.
  • This device 1 initially has a carrier 2 which e.g. is made of glass.
  • An interdigital electrode array (IDA) is arranged on this carrier 2, for example applied photolithographically, the comb-like interdigitated electrode fingers are denoted by 3. These electrode fingers 3 are alternately connected to an (electrical) lead 4 or lead 5, as can be seen more clearly from FIG.
  • the sensitive area of the interdigital electrode array is labeled F.
  • the distance between the electrode fingers in the exemplary embodiment is 10 ⁇ m
  • the width of an electrode finger is of the same order of magnitude, i.e. likewise at 10 ⁇ m
  • the length of an electrode finger is 1 mm
  • the width of the lead 4 or lead 5, on the other hand is of the order of magnitude of 200 ⁇ m.
  • the periodicity in which the electrode arrangement repeats is preferably 25.
  • the interdigital electrode array thus formed on the carrier 2 is coated with a polymer film 6 which is circular in the exemplary embodiment and which, for example, has a diameter of 2 mm and preferably consists of polystyrene or polyvinyl chloride.
  • a substrate of monomers or oligomers that is degradable by the enzyme to be determined is bound adsorptively to this polymer film 6; the thickness of this substrate layer, not shown in the drawing, is in the nanometer range.
  • the interdigital electrode array is preferably produced on the carrier 2 using the photolithographic method.
  • a laminating film is preferably glued on, which leaves a circular cutout above the interdigital electrode array.
  • a solution of the polymer and preferably a plasticizer in THF or a mixture of THF-cyclohexanone (7: 3) is dripped onto this section and the polymer film 6 is formed after the solvent has evaporated.
  • a substrate which can be degraded by the enzyme to be determined is then applied adsorptively to the polymer film 6.
  • a protein for example, is used as such a degradation adduct.
  • a Bovine Serum Albuminum BSA was specifically used as the protein.
  • Eppendorf pipette 0.5 to 10 ⁇ l
  • 4 ⁇ l of the BSA solution were added to the area coated with the polymer film 6. Until such a protease-sensitive activity sensor is used, it is stored dust-free and dry.
  • the protein dried on the polymer layer 6 is water-soluble, but a separate washing step can be dispensed with if the sensor is immersed in the stirred background solution for about 10 minutes. Before the protease is added, however, it is also possible to store the device after rinsing off the excess protein solution until use and to use it only later.
  • the polymer layer 6 is preferably applied from a solution, specifically with the addition of a plasticizer, for example of 30% by weight TBTC.
  • the application is preferably carried out according to the established methods of drop, dip or spin coating.
  • FIG. 3 shows four different measurement curves from four different devices, the AC conductivity being reproduced over time at a frequency of 10 kHz. This frequency has proven to be particularly effective, the arrow on the uppermost measurement curve in FIG. 3 shows the point in time at which protease was added to the solution.
  • Such devices can in principle be used several times. Of course, they are not completely reversible since the absorbed enzyme substrates are consumed. However, studies have shown that devices can be used several times, for example up to 10 times, before the enzyme substrates have to be adsorptively bound again to the polymer layer. Such regeneration is possible without any problems.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Mit einer Vorrichtung zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen, soll eine Lösung geschaffen werden, mit der möglichst einfach und schnell Enzymaktivitäten direkt in Lösung ohne Derivatisierung oder andere Probenvorbereitung bestimmt werden können. Dies wird erreicht durch einen Träger (2), auf dem wenigstens ein Elektrodenarray (3) angeordnet ist, welches mit einem Polymerfilm (6), self-assembled monolayers (SAM) oder Silanen beschichtet ist, wobei auf die Beschichtung adsorptiv ein vom zu bestimmenden Enzym abbaubares Substrat aufgebracht ist.

Description

Vorrichtung zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen.
Enzyme werden in der Technik für verschiedene Zwecke eingesetzt, beispielsweise in Waschmitteln oder Reinigungsmitteln sowie in der Lebensmittelindustrie. Wesentlich ist dabei die Kenntnis der Aktivität der Enzyme, deshalb richtet sich der Preis für Enzyme auch nicht nach deren Gewicht bzw. Volumen, sondern nach deren Aktivität, d.h. ihrer tatsächlichen Wirksamkeit. Die Kenntnis der Aktivität von Enzymen, z.B. in Wasch- und Reinigungslaugen, und die daraus resultierende bedarfsgerechte Dosierung von anderen Komponenten können zu einer gesteigerten Leistungsfähigkeit des Produktes bei vermindertem Rohstoffeinsatz führen. Auch in der Lebensmittelindustrie macht die Kenntnis um die tatsächliche Wirksamkeit des Enzyms in Herstellungsprozessen einen entscheidenden Faktor zur Steigerung der Effizienz von Produktionsabläufen aus.
Es sind verschiedene Lösungen zur Bestimmung der Enzymaktivität bekannt geworden, die sich im großtechnischen Maßstab jedoch bisher nicht durchgesetzt haben.
So ist aus WO 00/75360 A2 ein Verfahren und eine Apparatur zur Enzymdetektion bekannt, bei welchem der Abbau eines bioabbaubaren Polymers durch das zu detektierende Enzym beobachtet wird. Der Abbau wird dabei durch eine Quarzmikrowaage, Oberflächenplasmonenresonanz, Ellipsometrie, Impedanzspektroskopie oder kapazitive Messungen verfolgt. Bei all diesen Verfahren wird der Abbau eines bioabbaubaren Polymers als signalgebender Mechanismus verwandt.
Die Verwendung solcher abbaubarer Biopolymere ist jedoch mit verschiedenen Nachteilen verbunden. Vor allem sind solche Sensoren aufgrund der aufwendigen Präparationen geeignet dünner Filme auf den entsprechenden Transducerstrukturen nicht praxistauglich.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Lösung zu schaffen, mit der möglichst einfach und schnell Enzymaktivitäten direkt in Lösung ohne Denvatisierung oder andere Probenvorbereitung bestimmt werden können.
Diese Aufgabe wird mit einer Vorrichtung der eingangs bezeichneten Art gelöst durch einen Träger, auf dem wenigstens ein Elektrodenarray angeordnet ist, welches mit einem Polymerfilm, self-assembled monolayers (SAM) oder Silanen beschichtet ist, wobei auf die Beschichtung adsorptiv ein vom zu bestimmenden Enzym abbaubares Substrat aufgebracht ist.
Mit einer derartigen Vorrichtung ist eine einfache und schnelle Bestimmung von Enzymaktivitäten direkt in Lösung ohne Denvatisierung oder andere Probenvorbereitung möglich, so dass bisher aufwendige Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität erheblich vereinfacht werden. Die Oberfläche des Transducers über dem Ektrodenarray wird so modifiziert, dass ein Substrat adsorptiv gebunden werden kann. Die Modifikation kann unter anderem durch chemische Oberflächenbehandlung, wie beispielsweise eine Silanisierung, oder durch die Abscheidung einer dünnen Polymermembran erreicht werden. Je nach Oberfläche des Transducers können verschiedene potentielle Substrate adsorptiv immobilisiert werden. Taucht ein so hergestellter Sensor in eine Lösung, die ein Enzym enthält, das in der Lage ist, das immobilisierte Substrat abzubauen, ändern sich unter anderem die impediometrischen Eigenschaften der Membran. Diese können sehr einfach in elektrische Signale umgewandelt und entsprechend verarbeitet werden.
Im Gegensatz zum Abbau eines Polymers wird erfindungsgemäß der Abbau von vorzugsweise Monomeren bzw. Oligomeren, die adsorptiv an den Sensor gebunden sind. Wesentliche Vorteile sind eine einfachere, sehr günstige und reproduzierbare Herstellung der Substratfilme auf den Transduceroberflächen und die Möglichkeit, die Vorrichtung in situ zu regenerieren.
Für jede Enzymklasse, deren Aktivität mit einem Sensor nach dem Prinzip des Substratverzehrs nachgewiesen wird, muss ein spezieller Film auf der Transduceroberfläche immobilisiert werden. Da bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung lediglich die adsorbierten Substrate entsprechend angepasst werden müssen, ist der Aufwand für die Entwicklung eines neuen Systems relativ gering. Experimentell aufwendige optische Methoden oder andere aufwendige Verfahren werden nicht benötigt.
In besonders vorteilhafter Ausgestaltung ist vorgesehen, dass das Substrat aus Monomeren oder Oligomeren besteht. Adsorptiv gebundene Monomere können zum Nachweis der Aktivität von Enzymen eingesetzt werden, die reaktiv wirken, wie z.B. Oxidasen oder Reduktasen. Durch die reaktive Umwandlung der Monomere ändern sich ihre dielektrischen Eigenschaften, die ebenfalls nachgewiesen werden können.
In besonders vorteilhafter Ausgestaltung ist vorgesehen, dass das Elektrodenarray als Interdigitalelektrodenarray ausgebildet ist. Mit solchen, kammartige Elektrodenfinger aufweisenden Strukturen können impediometrische Effekte mit großer Empfindlichkeit bestimmt werden. Diese Art der Elektrodenanordnung ist deshalb für die Vorrichtungen besonders geeignet.
Bei Verwendung eines Interdigitalelektrodenarrays sind die Elektrodenfinger bevorzugt etwa 10 μm breit und in einem Abstand von ebenfalls etwa 10 μm zueinander angeordnet.
Als Material für den Polymerfilm hat sich als besonders geeignet Polystyrol oder Polyvinylchlorid herausgestellt. Zur Verbesserung der Filmbildung wird diesen Polymeren jeweils bevorzugt noch ein geeigneter Weichmacher zugesetzt. Die Polymere werden allgemein aus Lösung aufgebracht, z.B. nach dem etablierten Verfahren des Drop-, Dip- oder Spin-Coatings.
Die Dicke der Polymerschicht beträgt bevorzugt 1-5 μm. Die Schichtdicke der adsorptiv gebundenen Monomere oder Oligomere liegt im Nanometerbereich.
In weiterer vorteilhafter Ausgestaltung ist vorgesehen, dass der Träger des Sensors aus Glas besteht, alternativ können auch andere Materialien für den Träger eingesetzt werden, beispielsweise Kunststoff, SiO2 auf Si, AI2O3, SiC oder SiNx. Als Elektrodenmaterial ist Platin besonders gut geeignet, es sind aber auch alle anderen, in der Dünnschichttechnologie etablierten elektrischen Leiter, wie Gold, Silber, Platin-Iridium oder auch Poly-Silizium möglich.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausgestaltung ist vorgesehen, dass auf dem Träger nebeneinander mehrere Elektrodenarrays angeordnet sind, auf deren jeweiligen Polymerfilm zur Bestimmung unterschiedlicher Enzyme unterschiedliche Substrate aufgebracht sind. Es ist somit möglich, mit nur einer Vorrichtung gleichzeitig die Aktivität verschiedener in einer Lösung enthaltenen Enzyme zu bestimmen.
Die Erfindung schlägt auch ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen mit einer vorbeschriebenen Vorrichtung vor, das sich dadurch auszeichnet, dass die Vorrichtung in eine Enzymiösung eingetaucht und die zeitliche Änderung der impediometrischen Eigenschaften des Systems gemessen und ausgewertet wird.
Durch die in der Lösung enthaltenen Enzyme wird das immobilisierte Substrat mehr oder weniger schnell abgebaut, wodurch sich die impediometrischen Eigenschaften bzw. der kapazitive Widerstand des Systems verändert, was leicht in elektrische Signale umgewandelt und entsprechend ausgewertet werden kann. Das Verfahren kann mit einer Vorrichtung problemlos mehrfach ausgeführt werden, Versuche haben ergeben, dass durchaus ein System zehnmal eingesetzt werden kann, bis die immobilisierte Substratschicht vollständig abgebaut ist. Anschließend kann die Vorrichtung erneut eingesetzt werden, indem erneut die Enzymsubstrate adsorptiv angebunden werden. Eine erfindungsgemäße Vorrichtung kann so ohne weiteres regeneriert und dann erneut verwendet werden.
Die Erfindung ist nachstehend anhand der Zeichnung beispielhaft näher erläutert. Diese zeigt in:
Fig. 1 eine schematische Ansicht eines erfindungsgemäßen Aufbaus im stark vergrößerten Maßstab,
Fig. 2 ein Interdigitalelektrodenarray in gegenüber Figur 1 nochmals vergrößertem Maßstab und
Fig. 3 vier mit vier verschiedenen Vorrichtungen aufgenommenen Messkurven.
Eine Vorrichtung zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen ist in Figur 1 allgemein mit l bezeichnet. Diese Vorrichtung 1 weist zunächst einen Träger 2 auf, der z.B. aus Glas besteht. Auf diesem Träger 2 ist ein Interdigitalelektrodenarray (IDA) angeordnet, beispielsweise photolitographisch aufgebracht, die kammartig ineinandergreifenden Elektrodenfinger sind mit 3 bezeichnet. Diese Elektrodenfinger 3 sind abwechselnd mit einer (elektrischen) Zuleitung 4 oder Ableitung 5 verbunden, wie dies genauer aus Figur 2 zu erkennen ist. Die sensitive Fläche des Interdigitalelektrodenarrays ist mit F bezeichnet.
Der Abstand der Elektrodenfinger zueinander beträgt beim Ausführungsbeispiel 10 μm, die Breite eines Elektrodenfingers liegt in derselben Größenordnung, d.h. ebenfalls bei 10μm, die Länge eines Elektrodenfingers beträgt 1 mm, die Breite der Zuleitung 4 bzw. Ableitung 5 liegt demgegenüber in einer Größenordnung von 200 μm. Die Periodizität, in der sich die Elektrodenanordnung wiederholt, liegt vorzugsweise bei 25.
Das so auf dem Träger 2 gebildete Interdigitalelektrodenarray ist mit einem beim Ausführungsbeispiel kreisförmigen Polymerfilm 6 beschichtet, welcher beispielsweise einen Durchmesser von 2 mm aufweist und vorzugsweise aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid besteht. Außenseitig ist an diesen Polymerfilm 6 adsorptiv ein vom zu bestimmenden Enzym abbaubares Substrat aus Monomeren oder Oligomeren gebunden, die Dicke dieser zeichnerisch nicht dargestellten Substratschicht liegt im Nanometerbereich.
Anders als in Figur 1 dargestellt, kann auf einem Träger 2 nicht nur ein einziger Transducer realisiert werden, sondern es können nebeneinander auf dem gleichen Träger mehrere Transducer verwirklicht werden, in dem dementsprechend nebeneinander mehrere Interdigitalelektrodenarrays mit Filmbeschichtung vorgesehen werden. Zur Herstellung eines solchen Transducers 1 wird das Interdigitalelektrodenarray bevorzugt im photolitographischen Verfahren auf dem Träger 2 hergestellt. Anschließend wird vorzugsweise eine Laminierfolie aufgeklebt, die über dem Interdigitalelektrodenarray einen kreisrunden Ausschnitt freiläßt. In diesen Ausschnitt wird eine Lösung des Polymers und vorzugsweise eines Weichmachers in THF bzw. einer Mischung aus THF-Cyclohexanon (7:3) aufgetropft und der Polymerfilm 6 bildet sich nach der Verdunstung des Lösungsmittels aus. Anschließend wird adsorptiv an den Polymerfilm 6 ein vom zu bestimmenden Enzym abbaubares Substrat aufgebracht.
Als ein solches Abbauedukt wird beispielsweise ein Protein eingesetzt. So wurde z.B. speziell ein Bovines Serum Albuminum BSA als Protein verwendet. Dazu wurde eine 1 Gew.%-ige Lösung von BSA in 60 mM TRIS, 0,5 mM MgCI2, pH-Wert = 6,7 hergestellt und die einsetzende Schaumbildung abgewartet. Mittels einer Eppendorfpipette (0,5 bis 10 μl) wurden je 4 μl der BSA-Lösung in den mit dem Polymerfilm 6 beschichteten Bereich gegeben. Bis zum Einsatz eines derartig Protease-sensitiven Aktivitätssensors wird dieser staubfrei und trocken gelagert. Das auf der Polymerschicht 6 eingetrocknete Protein ist wasserlöslich, auf einen separaten Abwaschschritt kann aber verzichtet werden, wenn der Sensor in der gerührten Hintergrundlösung für ca. 10 min eintaucht. Bevor die Proteasezugabe erfolgt, ist es aber auch möglich, die Vorrichtung nach dem Abspülen der überstehenden Proteinlösung bis zum Einsatz zu lagern und erst später einzusetzen.
Die Polymerschicht 6 wird bevorzugt aus einer Lösung aufgebracht, und zwar unter Zugabe eines Weichmachers, beispielsweise von 30 Gew.% TBTC, das Aufbringen erfolgt vorzugsweise nach den etablierten Verfahren des Drop-, Dip- oder Spin- Coatings.
Taucht man eine vorbeschriebene Vorrichtung 1 in eine Lösung, die ein Enzym enthält, das in der Lage ist, das immobilisierte Substrat abzubauen, ändern sich die impediometrischen Eigenschaften des Systems, was sehr einfach in elektrische Signale umgewandelt und entsprechend verarbeitet werden kann. Figur 3 zeigt vier verschiedene Messkurven von vier verschiedenen Vorrichtungen, wobei die Wechselstromleitfähigkeit über der Zeit bei einer Frequenz von 10 kHz wiedergegeben ist. Diese Frequenz hat sich als besonders effektiv herausgestellt, der Pfeil an der obersten Messkurve in Figur 3 zeigt den Zeitpunkt, zu dem der Lösung Protease zugegeben wurde.
Derartige Vorrichtungen können grundsätzlich mehrfach verwandt werden. Sie sind selbstverständlich nicht vollständig reversibel, da die absorbierten Enzymsubstrate verbraucht werden. In Untersuchungen hat sich jedoch gezeigt, dass Vorrichtungen durchaus mehrere Male, beispielsweise bis zu 10 Male, verwendet werden können, bevor die Enzymsubstrate erneut adsorptiv an die Polymerschicht gebunden werden müssen. Eine solche Regeneration ist problemlos möglich.
Mit einer derartigen Vorrichtung ist grundsätzlich eine Online-Bestimmung der Enzymaktivität möglich. Somit kann beispielsweise die bedarfsgerechte Zugabe von oberflächenaktiven Substanzen in Geschirr- und Waschmaschinen gewährleistet werden. Einerseits kann man somit die notwendige Menge an Enzymiösung genau dosieren, andererseits können Substanzen, die das Enzym in seiner Funktionsweise beeinträchtigen (z.B. aufgrund ihrer Basizität), erst nach dem enzymatischen Reaktionsschritt zudosiert werden.

Claims

Patentansprüche:
1. Vorrichtung zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen, gekennzeichnet durch einen Träger (2), auf dem wenigstens ein Elektrodenarray (3) angeordnet ist, welches mit einem Polymerfilm (6), self-assembled monolayers (SAM) oder Silanen beschichtet ist, wobei auf die Beschichtung adsorptiv ein vom zu bestimmenden Enzym abbaubares Substrat aufgebracht ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat aus Monomeren oder Oligomeren besteht.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Elektrodenarray als Interdigitalelektrodenarray (3) ausgebildet ist.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektrodenfinger (3) des Interdigitalelektrodenarrays etwa 10 μm breit sind und in einem Abstand von etwa 10 μm zueinander angeordnet sind.
5. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, dass der Polymerfilm (6) aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid besteht.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerschicht (6) eine Dicke von 1-5 μm aufweist.
7. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (2) aus Glas besteht.
8. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Träger (2) nebeneinander mehrere Mikroelektrodenarrays angeordnet sind, auf deren Polymerfilm zur Bestimmung unterschiedlicher Enzyme unterschiedliche Substrate aufgebracht sind . erfahren zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen mit einer Vorrichtung nach einem oder mehreren der Patentansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung in eine Enzymiösung eingetaucht und die zeitliche Änderung der impediometrischen Eigenschaften des Systems gemessen und ausgewertet wird.
EP03789039A 2002-11-23 2003-11-14 Vorrichtung zur bestimmung der aktivität von enzymen Withdrawn EP1563086A1 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10254703 2002-11-23
DE2002154703 DE10254703A1 (de) 2002-11-23 2002-11-23 Vorrichtung zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen
PCT/EP2003/012718 WO2004048602A1 (de) 2002-11-23 2003-11-14 Vorrichtung zur bestimmung der aktivität von enzymen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1563086A1 true EP1563086A1 (de) 2005-08-17

Family

ID=32318636

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP03789039A Withdrawn EP1563086A1 (de) 2002-11-23 2003-11-14 Vorrichtung zur bestimmung der aktivität von enzymen

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1563086A1 (de)
AU (1) AU2003293686A1 (de)
DE (1) DE10254703A1 (de)
WO (1) WO2004048602A1 (de)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102721723B (zh) * 2012-07-04 2014-08-20 中南林业科技大学 一种基于挥发性物组的潲水油鉴别方法
WO2020178217A1 (en) * 2019-03-07 2020-09-10 Henkel Ag & Co. Kgaa Electrode comprising a conductive acrylate based pressure sensitive adhesive

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE407115B (sv) * 1975-10-06 1979-03-12 Kabi Ab Forfarande och metelektroder for studium av enzymatiska och andra biokemiska reaktioner

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2004048602A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE10254703A1 (de) 2004-06-17
AU2003293686A1 (en) 2004-06-18
WO2004048602A1 (de) 2004-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0054679B1 (de) Verwendung von Reagenzstreifen zur Herstellung von Reagenzlösungen
EP2252410B1 (de) Oberflächenmodifikation
EP1379862B1 (de) Messelektrodenpaar, biosensor mit einem solchen messelektrodenpaar und verfahren zur herstellung
EP1786927B1 (de) Vorrichtung und verfahren zum nachweis von geladenen makromolekülen
DE19916921A1 (de) Elektrisches Sensorarray
ATE268735T1 (de) Herstellung von kombinatorischen arrays von materialen durch methoden der synthese in lösung
DE10049901C2 (de) Vorrichtung und Verfahren zur elektrisch beschleunigten Immobilisierung und zur Detektion von Molekülen
EP1032826A1 (de) Verfahren zur bildung lateral organisierter strukturen auf trägeroberflächen
EP1563086A1 (de) Vorrichtung zur bestimmung der aktivität von enzymen
DE4027728A1 (de) Immobilisierung von organischen makromolekuelen oder biopolymeren in einer polymermembran
EP1188042B1 (de) Verfahren und sonde zur identifizierung eines polymers
DE4132441A1 (de) Dickschicht-leitfaehigkeitselektroden als biosensor
DE10064146A1 (de) Biosensor und verfahren zu seiner Herstellung
DE4212910C2 (de) Verfahren zur Beschichtung von Sensoren mit selektiv durchlässigen Polymermembranen
DE19745668A1 (de) Definierte Kopplung von biotechnologischen Funktionseinheiten
WO2002031482A2 (de) Vorrichtung und verfahren zur elektrisch beschleunigten immobilisierung von molekülen
DE102011056381A1 (de) Mehrschichtige Elektrode und ihre Anwendung
DE10222979B4 (de) Verfahren zur Verstärkung eines Signals
DE19826617C1 (de) Verfahren zur Herstellung von Immunosensoren
DE10015547C2 (de) Verfahren zur Detektion von Molekülen mittels Impedanzspektroskopie und Vorrichtung zur Durchführung dieser Verfahren
EP2189793A1 (de) Verfahren zum Regenerieren eines Biosensors
WO2011039069A1 (de) Vorrichtung umfassend einen resonator zum detektieren mindestens einer substanz eines fluids, verfahren zur herstellung dieser vorrichtung und verfahren zum detektieren mindestens einer substanz eines weiteren fluids
EP1071951B1 (de) Modifizierte oberfläche für die durchführung oder den nachweis von affinitätsreaktionen
DE19753056A1 (de) Künstliche Oberfläche mit vorbestimmter Affinität
DE10340429A1 (de) Hydrophober Gegenstand mit Raster hydrophiler Bereiche, dessen Herstellung und Verwendung

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20050430

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LI LU MC NL PT RO SE SI SK TR

GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20060907