EP1549751A2 - Vecteurs adenoviraux recombinants et leurs applications - Google Patents

Vecteurs adenoviraux recombinants et leurs applications

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Publication number
EP1549751A2
EP1549751A2 EP03775478A EP03775478A EP1549751A2 EP 1549751 A2 EP1549751 A2 EP 1549751A2 EP 03775478 A EP03775478 A EP 03775478A EP 03775478 A EP03775478 A EP 03775478A EP 1549751 A2 EP1549751 A2 EP 1549751A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
genome
adenovirus
plasmid
recombinant
canine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03775478A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Marc Eloit
Bernard Klonjkowski
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Ecole Nationale Veterinaire dAlfort
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Ecole Nationale Veterinaire dAlfort
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA, Ecole Nationale Veterinaire dAlfort filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of EP1549751A2 publication Critical patent/EP1549751A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Definitions

  • the present invention relates to new recombinant adenoviruses, and to their preparation process, as well as to their uses as vectors for expression and gene transfer, for vaccine purposes or for therapeutic purposes such as the treatment of cancer.
  • the late phase which begins twelve hours after infection is characterized by the extinction of the synthesis of cellular proteins in favor of late viral proteins which enter into the structural composition of the adenoviral particle, and participate in the assembly of the virion and in its release by affecting the structural integrity of the infected cell.
  • Adenoviruses are particularly attractive for the development of viral vectors, because of their characteristics and the amount of knowledge available on their genetic organization and biology.
  • a commonly used strategy consists in inserting a heterologous gene in the left part of the genome between the left ITR and the El region, in place of the promoter and the coding region of the ElA gene (partial deletion of El) and possibly of the gene. E1B (total deletion of the El region). Viruses deleted for ElA are unable to replicate in cells that do not complement the functions of ElA. However, they are able to express significant amounts of exogenous protein in infected cells.
  • adenoviral vectors Ad2 and Ad5 deleted from the El region and possibly from the E3 region have been constructed, essentially for the purpose of human gene therapy. In order to improve these vectors, mutations (E2 region) or additional deletions (E2 or E4 region) have been introduced. Canine non-replicative adenoviral vectors deleted from the entire E1 region have also been developed for human gene therapy applications [KLONJKOWSKI et al. , Human Gene Therapy, 8, 2103-2115, 1997, deletion of positions 411 to 2898 of Cav2; WO 95/14101 and US Patent 5837531 in the name of RHONE POULENC RORER; KREMER et al. , J. Virol., 74, 505-512, 2000, deletion of positions 412 to 2497 of Cav2).
  • non-replicating vectors have shown good gene transfer efficiency in numerous tissues. However, they have a certain number of drawbacks, in particular for the transfer of genes into cells in active division such as tumor cells. In these cells, a rapid extinction of the expression of the transferred gene linked to the loss of the extrachromosomal vector during successive divisions.
  • replicative adenoviral vectors have been developed essentially for vaccine applications. In general, they have demonstrated great efficiency in inducing imune responses, both with regard to the antibody response and the CTL response (for a review see ELOIT, Virologie, 2, 109-120, 1998 and KLONJKOWSKI et al., In "Adenoviruses: baslc biology to gene therapy", pp. 1 63-1 73, P. Seth, Ed., R. G. Landes Company, Austin Texas, USA).
  • replicative vectors have some drawbacks: - they pose biosecurity problems linked to the risk of the spread of such replicative viruses,
  • the region located between the end of the left ITR and the start of the sequence coding for ElA corresponds to that located between position 311 and position 499 in the genomic sequence GenBank J04368 of canine adenovirus type 2.
  • the subject of the present invention is a recombinant adenovirus capable of being obtained from a replicative adenovirus by deletion of all or part of the region of the genome of said replicative adenovirus corresponding to that located in the genome of the canine adenovirus of the type 2 (GenBank J04368), between positions 311 and 499, said deletion comprising all or part of the genome region of the original replicating adenovirus corresponding to that located between positions 311 and 401 in the genome of canine adenovirus type 2.
  • the deleted portion in these pseudo-replicative adenoviruses can further comprise: - all or part of the genome region of the original replicative adenovirus corresponding to that located between positions 311 and 319 in the genome of the canine adenovirus of type 2; and or
  • the recombinant adenoviruses in accordance with the invention retain the sequences of the left ITR essential for replication, for activation of transcription (4 repeating GGTCA motifs located between positions 62 and 99 in the genome of Cav2) as well as the packaging signals Ai of type 5'TTTGN 8 CG-3 ', and n to A IX of type 5'-TTTA / G-3' (located at positions 197-200, 206-209, 213-216, 226-232, 239-242 respectively , 250-253, 258-261, 272-275 and 306-309 in the Cav2 genome). They also conserve the entire coding sequence of ElA as well as regions of the El gene located downstream thereof (polyadenylation signal of ElA and ElB region).
  • a recombinant adenovirus in accordance with the invention, also comprises at least one heterologous sequence of interest inserted into its genome.
  • said heterologous sequence will, in the case of a replicative adenovirus, be inserted in the region of the genome corresponding to that located between positions 311 and 319 in the genome of l canine adenovirus type 2.
  • said heterologous sequence can also be inserted in this region, or in any other place in the region of the genome corresponding to that located between positions 311 and 499 in the genome of the canine adenovirus. type 2. Insertion into this region can be done in place of or near the deleted portion. It is also possible to insert a heterologous sequence into any of the sites which are usually used for this purpose for the construction of replicative adenoviruses. The insertion can for example be carried out in the region E3, or in the region located between the region E4 and the right ITR, as described in US Patent 6090393, or in the 3 'portion of the right ITR, as described in U.S. Patent 5,616,326.
  • Epo erythropoietin
  • VEGF vascular endothelioma growth factor
  • NT-3 neurotrophin 3
  • AMF atrial natriuretic factor
  • genes that can be used for the treatment of cancer for example that of IL-2, IFN ⁇ , etc.
  • recombinant adenoviruses in accordance with the present invention can be prepared by conventional techniques, well known in themselves to those skilled in the art
  • the inventors have now developed a method for inserting a heterologous sequence into an adenovirus, which does not require linearization of the adenovirus genome by cleavage at the insertion site.
  • the heterologous DNA fragment (donor molecule) to be inserted into the adenovirus genome (recipient molecule), comprises a selection marker making it possible to isolate the recombinant plasmids on their double resistance to ampicillin and kanamycin , and
  • said fragment is co-transformed with a recipient molecule, either in circular form or in linearized form by cleavage at a restriction site located outside the insertion site.
  • the subject of the present invention is also a process for the preparation of a recombinant adenovirus by homologous intermolecular recombination in a prokaryotic cell characterized in that it comprises the following steps: ⁇ ) introduction into said prokaryotic cell: (i) d 'a plasmid comprising the genome of an adenovirus and a first selection gene; and (ii) a previously linearized DNA fragment comprising a heterologous sequence to be inserted into said genome flanked by sequences homologous to those flanking the site of said plasmid where must be carried out insertion, and including a second selection gene, different from the first; and ⁇ ) culture of said prokaryotic cell under selective conditions, in order to allow the generation and selection of cells containing recombinant plasmids expressing the first and second selection gene, and ⁇ ) isolation of the genome of said recombinant adenovirus from the cells selected.
  • selective conditions is understood to mean culture conditions in which the first and second selection agents (for example antibiotics) are present at concentrations which do not allow the multiplication of untransformed cells but allow the multiplication of co cells. -transformed.
  • the plasmid used in ⁇ is in circular form.
  • the plasmid used in step ⁇ ) is previously linearized by cleavage at a restriction site located outside the insertion site.
  • the first and / or the second selection gene is a gene for resistance to an antibiotic, for example a gene for resistance to ampicillin or to kanamycin.
  • the second selection gene is surrounded by 2 restriction sites, identical or different, absent in the genome of the adenovirus used in step ⁇ ); such a selection gene can thus be excised from the genome sequence of the recombinant adenovirus by digestion at these sites.
  • the method according to the invention comprises, after the preparation of the recombinant genome according to steps ⁇ ) to ⁇ ) above, an additional step of transfection of the recombinant genome in an appropriate cell line allowing the amplification of said genome and its packaging into infectious viral particles.
  • said cell line is of canine origin.
  • the subject of the invention is also plasmids and nucleic acid molecules which can be used for the preparation of the genome of a recombinant adenovirus in accordance with the invention, in particular a canine adenovirus, as well as said recombinant genomes, which can be obtained. by the methods as defined above.
  • the subject of the invention is in particular the following nucleic acid molecules and plasmids:
  • any nucleic acid molecule selected from the group consisting of: a) a nucleic acid molecule representing the genome of a recombinant adenovirus according to the invention as defined above; b) a nucleic acid molecule constituted by a fragment of the molecule a) above, comprising between 10 and 1000 bp, preferably at least 300 bp, of the sequence of the original replicating adenovirus situated upstream of the deleted portion and between 10 and 5000 bp, preferably between 10 and 1000 bp, preferably at least 300 bp, of the sequence of the original replicating adenovirus situated downstream of the deleted portion; such a molecule may further comprise all or part of a heterologous sequence inserted in place of or near the deleted portion.
  • any nucleic acid vector in particular any plasmid, containing a nucleic acid molecule a) or b) as defined above.
  • the subject of the invention is also the recombinant adenoviruses in accordance with the invention for use as a medicament.
  • the subject of the invention is in particular the use of adenoviruses in accordance with the invention, for the preparation of immunogenic or vaccine compositions, or of medicaments intended for gene therapy or for the treatment of cancer, as well as for the production of recombinant proteins.
  • said medicament or said composition is intended to be administered to a domestic or wild Carnivore, in particular the cat, the dog or the fox, or else to humans.
  • the recombinant adenoviruses in accordance with the invention are particularly well suited to therapeutic uses, for example vaccines, in humans and animals.
  • the recombinant adenoviruses according to the invention replicative or pseudoreplicative, multiply significantly in the nucleus of transduced cells allowing efficient transduction of both quiescent cells and actively dividing cells such as tumor cells.
  • the pseudo-replicative adenoviruses according to the invention which do not produce any infectious particle have a high biosecurity and also allow to induce a strong immune response during booster injections.
  • Recombinant adenoviruses in accordance with the invention have applications for the vaccination and treatment of cancer in domestic or wild carnivores, in particular cats, dogs or foxes.
  • these canine adenoviruses can be used in human gene therapy, to target tissues different from those which can be transduced by human vectors, for example cells of the central nervous system.
  • fragment A the left and right ends of the genome of the Manhattan strain of Cav2 corresponding at the sequences of positions 1 to 1060 (fragment A) and 29323- 31323 (fragment B) are amplified separately by PCR from the genomic DNA of the Manhattan strain of Cav2 (APPEL et al., Am. J. Vet. Res ., 34, 543-550, 1973), using the following primers: Fragment A
  • the fragments A and B obtained are cloned separately in the plasmid pCR2.1 (TA Cloning System, INVITROGEN) to give the plasmids pCR2.1 / ITR left and pCR2.1 / ITR right, respectively.
  • the plasmid pCR2.1 / ITR left is digested with BamHI and Xbal and the fragment of 1111 bp thus generated is cloned between the BamHI and Xbal sites of the plasmid pPolylI Amp R (GenBank M18128, LATHE et al., Gene, 57, 193- 201, 1987) to give the plasmid called pPolylI / ITR left.
  • the right plasmid pCR2.1 / ITR is cleaved with BamHI, treated with Klenow polymerase, then cleaved with Xbal; the 2052 bp fragment thus generated is cloned between the Xbal and PvuII sites of the plasmid pPolylI / ITR left to give the plasmid pPolyII.ITRs.Cav2.
  • This plasmid contains the left and right ends of the genome of the Manhattan strain of Cav2 cloned in the form of an Ascl-Ascl fragment of 3073 bp comprising an Xbal site at position 1066 of said fragment, allowing the plasmid to be linearized at the site of DNA insertion.
  • the genomic DNA of the Manhattan strain of Cav2 and the DNA of pPolyII.ITRs.Cav2 linearized at the Xbal site are co-transformed into the strain of __. coli BJ5183 recBC s
  • pCav2 A recombinant plasmid of 33425 bp, called pCav2, is isolated from colonies resistant to ampicillin.
  • the plasmid pCav2 contains the complete genome of Cav2 (Manhattan strain) cloned as a fragment of 31331 bp flanked by two Ascl sites which are unique in this plasmid, these sites being absent in the genome of Cav2 (Manhattan and Toronto strains) as well as in that of the ovine adenovirus OAV strain.
  • Cav2 Manhattan strain
  • Ascl sites which are unique in this plasmid, these sites being absent in the genome of Cav2 (Manhattan and Toronto strains) as well as in that of the ovine adenovirus OAV strain.
  • Shuttle plasmids bi) pNavette / 311-439.CMVeGFP
  • This 6111 bp plasmid is derived from the pBluescript KS plasmid (STRATAGENE) by insertion of the sequences of
  • This plasmid is constructed according to the following steps:
  • the PCR amplification product is cloned into the plasmid pCR2.1 to give the plasmid pCR2.1 / UpRecSeq (1- 311).
  • the PCR amplification product is cloned into the plasmid pCR2.1 to give the plasmid pCR2.1 / DownRecSeq (439-1060).
  • the plasmid pEGFP-1 (CLONTECH) is cleaved with BamHI, treated with Klenow polymerase and then digested with
  • the 741 bp fragment thus obtained is cloned between the Xhol sites (previously repaired by treatment with the Klenow polymerase) and NotI of the pCI plamide (PROMEGA), to give the plasmid pCMVeGFP.
  • the plasmid pCMVeGFP is then cleaved with BglII, treated with Klenow polymerase and then digested with BamHI to generate a 2050 bp fragment (fragment E).
  • fragment E is inserted between the SmaI and BamHI sites of the plasmid pBLUESCRIPT KS to give the plasmid pKS / CMVeGFP.
  • the plasmid pCR2.1 / UpRecSeq (1-311) is cleaved by Kpnl and Sali and the fragment of 371 bp thus obtained (fragment C) is cloned between the Kpnl and Sali sites of the plasmid pKS / CMVeGFP, to give the plasmid pKS / CMVeGFP-C.
  • the plasmid pCR2.1 / DownRecSeq (439-1060) is cleaved by Xbal and the 650 bp fragment thus obtained (fragment D) is inserted at the Xbal site of the plasmid pKS / CMVeGFP-C, to give the plasmid called pNavette 311-439 / CMVeGFP.
  • the shuttle plasmid pNavette 311-401 / CMVeGFP is constructed from the plasmid pNavette 311-439 / CMVeGFP, according to the following steps:
  • the sequence 401-1060 (DownRecSeq) is amplified by PCR using the primers:
  • the PCR amplification product is cloned into the plasmid pCR2.1 to give the plasmid pCR2.1 / DownRecSeq (401-1060).
  • This plasmid pCR2.1 / DownRecSeq (401-1060) is digested with EcoRI then treated with Klenow polymerase and the fragment 401-1060 thus obtained is substituted for the fragment 439-1060 of the plasmid pNavette 311-439 / CMVeGFP previously digested with Xbal then treated with Klenow polymerase, to give the plasmid pNavette 311-401 / CMVeGFP.
  • the shuttle plasmid pNavette 311-319 / CMVeGFP is constructed from the plasmid pNavette 311-439 / CMVeGFP, according to the following steps:
  • the sequence 319-1060 (DownRecSeq) is amplified by PCR using the primers:
  • This plasmid pCR2.1 / DownRecSeq (319-1060) is digested with EcoRI then treated with Klenow polymerase and the fragment 319-1060 thus obtained is substituted for the fragment 439-1060 of the plasmid pNavette 311-439 / CMVeGFP previously digested with Xbal then treated with Klenow polymerase, to give the plasmid pNavette 311-319 / CMVeGFP.
  • the PCR amplification product is cloned into the plasmid pCR2.1 to give the plasmid pCR2.1-Kana / PmeI.
  • the plasmid pCR2.1-Kana / PmeI is cleaved by EcoRI, treated with Klenow polymerase and the fragment of approximately 959 bp containing the coding phase of the Kana gene is inserted at the EcoRV site of the plasmid pNavette 311-439 / CMVeGFP to give the plasmid pNavette 311-439 / CMVeGFP / Kana.
  • the Kana gene which is then excised from the recombinant plasmid by digestion at the 2 Pmel sites, is absent from the sequence of the recombinant adenovirus generated from this plasmid.
  • b 4 shuttle plasmid pPoly II 311-439 / CMVeGFP / Kana ( Figure 2)
  • This 6332 bp plasmid is obtained by cloning between the Kpnl (position 42) and PvuII (position 63) sites of the plasmid pPoly II, of the Kpnl-PvuII fragment of 4292 bp from pNavette 311-439 / CMVeGFP, as illustrated in FIG. 2 c) pCav 311-439 / CMVeGFP Plasmid
  • This plasmid is obtained by homologous recombination in the strain of E. coli BJ5183 according to the following 2 alternatives cl and c2, illustrated respectively in Figures 3 and 4: Ci) recombination of pNavette 311-439 / CMVeGFP. Kana with the plasmid pCav2 in circular form ( Figure 3)
  • the donor molecule containing the upstream (UpRecSeq 1-311) and downstream (DownRecSeq 439-1060) and the CMVeGFP and Kana cassettes sequences is prepared from the plasmid pNavette 311-439 / CMVeGFP. Kana by digestion with the restriction enzymes Kpnl and EcoRV,
  • the donor molecule is prepared from the plasmid pPolylI 311-439 / CMVeGFP. Kana by digestion with the restriction enzyme Swa I,
  • the recombinant plasmids are isolated on the criterion of double resistance to ampicillin and kanamycin.
  • the sequence of one of them, pCav 311-439 / CMVeGFP.Kana is confirmed by enzymatic restriction and by sequencing.
  • the plasmid pNavette 311-401 / CMVeGFP is digested with KpnI and SwaI and the fragment of 3167 bp thus obtained and the plasmid pCav 311-439 CMVeGFP linearized at the Pmel site are co-transformed into the strain of E. coli BJ5185.
  • the recombinant plasmid pCav 311-401 CMVeGFP, generated by homologous recombination, is selected on the criterion of double resistance to ampicillin and to kanamycin. d) pCav 311-319 / CMVeGFP Plasmid
  • the plasmid pNavette 311-319 / CMVeGFP is digested with KpnI and SwaI and the fragment of 3249 bp thus obtained and the plasmid pCav 311-439 CMVeGFP linearized at the Pmel site are co-transformed into the strain of E. coli BJ5185.
  • the recombinant plasmid pCav 311-319 CMVeGFP, generated by homologous recombination, is selected on the criterion of double resistance to ampicillin and to kanamycin. 2) Production of recombinant viruses
  • the plasmids pCav 311-439 / CMVeGFP, pCav 311-401 / CMVeGFP or pCav 311-319 / CMVeGFP are digested with the restriction enzyme Ascl in order to excise the genome sequences of the recombinant adenovirus.
  • the excised adenoviral genome is then transfected into the canine cell line DK / E1-28 which constitutively expresses the El region of Cav2 (KLONJKOWSKI et al., Human Gene Therapy, cited above), in the presence of Lipofectamine (GIBCO), according to the usual techniques. , well known in themselves to those skilled in the art (cf.
  • the virus is harvested from the transfected cells, then amplified in the same cell line DK / El-28 and purified by centrifugation on a cesium chloride gradient, according to a conventional protocol, as described for example in GRAHAM and PREVEC, supra.
  • the genomic sequence of the Cav 311- 439 / CMVeGFP, Cav 311-401 / CMVeGFP and Cav 311-319 / CMVeGFP viruses is confirmed by enzyme restriction and by partial sequencing of the viral DNA extracted from the infected DK / E1-28 cells. according to the HIRT technique (J. Mol. Biol., 26, 365-369, 1967).
  • the recombinant Cav virus preparations are titrated by limiting dilution in a 96-well plate, according to the method of SPEARMAN and KARBER (Virology Methods Manual, Brian WJ Mahy and Hillar 0 Kangro, 1996, Académie Press, Harcourt Brace & Company).
  • the titer in TCID 50 / ml obtained by this method is equivalent to the titer in ufp / ml obtained by the method of plaques on DK cells, according to the protocol described in KLONJKOWSKI et al. , supra.
  • the results obtained are as follows: the Cav 311-439 / CMVeGFP, Cav 311-401 / CMVeGFP, Cav 311-319 / CMVeGFP viruses isolated have a restriction profile and a sequence in accordance with those expected, the Cav 311-439 / viruses Purified CMVeGFP, Cav 311-401 / CMVeGFP and Cav 311-319 / CMVeGFP have a titre of approximately 10 9 ' 2 pfu / ml.
  • EXAMPLE 2 CHARACTERISA ION OF THE RECOMBINANT VIRUS CAV 311-439
  • Canine (DK / EI-28 and DK) or feline (CRFK) cell lines are infected with the Cav 311-439 CMVeGFP virus, at a multiplicity of infection of 10 pfu / cell. Uninfected cells and cells infected with wild-type Cav virus are used as controls.
  • the intracellular viral DNA is prepared according to the HIRT technique (J. Mol. Biol., 26, 365-369, 1967), digested with the enzyme EcoRI, then visualized on agarose gel after electrophoretic migration.
  • the level of replication is greater in canine cells than in feline cells, - the peak of replication is reached at 24 hours in DK / El-28 cells and at 48 hours in cells DK, presumably due to cellular expression of the E1 region in DK / E1-28 cells.
  • Canine DK cell lines are infected with the vector Cav 311-439 CMVeGFP, at a multiplicity of infection of 0.1, 1 and 10 pfu / cell respectively. Uninfected cells and cells infected with wild type Cav virus are used as a control.
  • the infected cells are harvested 2 hours and 6 days after infection, lysed by several cycles of freezing and thawing.
  • the cell lysate is titrated by the aforementioned limit dilution technique.
  • the amount of virus present in the cells is presented in Table III below.
  • Cav 311-439 virus does not produce infectious viral particles in canine cells which do not express the E1 region as DK cells: Cav 311-439's viral cycle is abortive in canine cells.
  • FIG. 6 Titers of anti-eGFP (Ac) serum antibodies in cats, on days D7, D14, D21 and D31 after the inoculation of different doses of the virus Cav 311- 439.
  • CMVeGFP -B- 9.6 10 7 pfu / ml (pfu: range forming units), - ⁇ - 9.6 10 7 pfu / ml, ••• D "- 9.6 10 6 pfu / ml, - O ••• 9.6 10 6 pfu / ml.
  • EXAMPLE 3 CONSTRUCTION OF A LINE OF CANINE ORIGIN CONSTITUTIVELY EXPRESSING THE El CAV2 REGION.
  • a new line expressing the E1 region is constructed from the DK line (immortalized dog kidney cell line; ATCC CRL 6247) by following the following steps:
  • the PCR amplification product is cloned into the plasmid pCR2.1 to give the plasmid pCR2.1 / E1.
  • the pTRE plasmid (CLONTECH) is digested with BamHI, treated with Klenow polymerase and recircularized to give the plasmid pTRE / d1 BamHI.
  • the plasmid pCR2.1 / El is digested with EcoRI, the fragment of 3187 bp thus obtained is cloned at the EcoRI site of the plasmid pTRE / dl BamHI to give the plasmid pTRE El Cav2.
  • This plasmid pTRE El Cav2 contains the coding sequence of the protein ElA under the control of a promoter
  • the DK cells are cotransfected using the plasmid pTRE El Cav2 linearized at the Aatll site and the plasmid pTK-Hyg (CLONTECH) linearized at the Asel site.
  • Clones are selected in the presence of hygromycin (150 ⁇ g / ml) and then analyzed by Southern blot, Northern blot, RT-PCR and Western blot. 4 clones expressing the El region (ElA and ElB), capable of efficiently producing the deleted vectors according to the invention were isolated.
  • mice divided into three groups were inoculated intramuscularly with the dose of 10 8 pfu of the following viruses:
  • the Cav 311-319 CONTROL virus is isogenic with the Cav 311-319 eGFP virus with the exception of the inserted heterologous gene (in place of the gene coding for GFP, a heterologous gene coding for a protein having no antigenic relationship with is inserted. GFP).
  • Cav 311-319 makes it possible to induce in the mouse an immune (humoral) response specific to the heterologous gene inserted in this adenovirus.

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Abstract

La présente invention est relative à de nouveaux adénovirus recombinants susceptibles d'être obtenus à partir d'un adénovirus réplicatif par délétion de tout ou partie de la région du génome dudit adénovirus réplicatif correspondant à celle située, dans le génome de l'adénovirus canin de type 2 (GenBank J04368), entre les positions 311 et 499, ladite délétion comprenant tout ou partie de la région du génome de l'adénovirus réplicatif d'origine correspondant à celle située entre les positions 311 et 401 dans le génome de l'adénovirus canin de type 2, ainsi qu'à leurs utilisations, notamment à des fins thérapeutiques.

Description

VECTEURS ADENOVIRAUX RECOMBINANTS ET LEURS APPLICATIONS.
La présente invention est relative à de nouveaux adenovirus recombinants, et à leur procédé de préparation, ainsi qu'à leurs utilisations comme vecteurs d'expression et de transfert de gène, à des fins vaccinales ou à des fins thérapeutiques comme le traitement du cancer.
Les adenovirus sont des virus nus possédant un génome linéaire à ADN double brin d'environ 30-40 pb, flanqué de courtes séquences inversées répétées (ITR) . Le génome de l'adénovirus est organisé en unités de transcriptions précoces (El à E4) et en une unité tardive (MLTU) composée de cinq familles de transcrits (Ll à L5) dont l'expression est séparée par l'initiation de la réplication de l'ADN viral. La phase précoce débute deux heures après l'infection par la transcription et l'expression séquentielle des régions ElA puis E4, presque simultanément E3 et E1B, puis E2A et enfin E2B. La région immédiatement précoce ElA code pour des transactivateurs des autres gènes précoces de l'adénovirus (E1B, E2, E3 et E4) ainsi que de gènes cellulaires. Huit heures après l'infection, la réplication de l'ADN viral débute. La phase tardive qui commence douze heures après l'infection est caractérisée par l'extinction de la synthèse des protéines cellulaires au profit des protéines virales tardives qui entrent dans la composition structurale de la particule adénovirale, et participent à l'assemblage du virion et à sa libération en affectant l'intégrité structurale de la cellule infectée.
Les adenovirus présentent un attrait particulier pour le développement de vecteurs viraux, du fait de leurs caractéristiques et de la quantité de connaissances disponibles sur leur organisation génétique et leur biologie.
Différentes stratégies de construction ont été envisagées selon que l'objectif est d'obtenir un virus réplicatif, capable de se multiplier chez l'hôte (humain ou animal) , ou un virus non-réplicatif incapable de se multiplier chez l'hôte. La construction d'un vecteur non-réplicatif implique de déléter une région essentielle à la réplication virale. Les virus résultants, qui sont incapables de se répliquer et par conséquent de produire des particules infectieuses dans des cellules permissives à l'infection par le virus sauvage correspondant, sont produits dans des lignées cellulaires modifiées capables de fournir en trans les produits des gènes délétés.
Une stratégie couramment utilisée consiste à insérer un gène hétérologue dans la partie gauche du génome entre l'ITR gauche et la région El, en lieu et place du promoteur et de la région codante du gène ElA (délétion partielle de El) et éventuellement du gène E1B (délétion totale de la région El) . Les virus délétés pour ElA sont incapables de se répliquer dans les cellules qui ne complémentent pas les fonctions de ElA. Ils sont cependant capables d' exprimer des quantités importantes de protéine exogène dans les cellules infectées.
De nombreux vecteurs adénoviraux humains (Ad2 et Ad5) délétés de la région El et éventuellement de la région E3 ont été construits, essentiellement à des fins de thérapie génique humaine. Afin d'améliorer ces vecteurs, des mutations (région E2) ou des délétions supplémentaires (région E2 ou E4) ont été introduites. Des vecteurs adénoviraux non-réplicatifs canins délétés de la totalité de la région El ont également été développés pour des applications de thérapie génique humaine [KLONJKOWSKI et al . , Human Gène Therapy, 8, 2103-2115, 1997, délétion des positions 411 à 2898 de Cav2 ; Demande WO 95/14101 et Brevet US 5837531 au nom de RHONE POULENC RORER ; KREMER et al . , J. Virol., 74, 505-512, 2000, délétion des positions 412 à 2497 de Cav2) .
Ces vecteurs non réplicatifs ont montré une bonne efficacité de transfert de gènes dans de nombreux tissus. Ils présentent cependant un certain nombre d'inconvénients, en particulier pour le transfert de gènes dans des cellules en division active comme les cellules tumorales. Dans ces cellules, on observe une extinction rapide de l'expression du gène transféré liée à la perte du vecteur extrachromosomique au cours des divisions successives.
La construction d'un vecteur réplicatif impose de ne supprimer aucune séquence du génome viral essentielle à sa réplication, et à la production de particules virales infectieuses chez l'hôte (cycle viral productif). On ne connaît à l'heure actuelle, chez les adenovirus, qu'un petit nombre de sites d' insertion de séquences hétérologues permettant de satisfaire à ces exigences. Des vecteurs réplicatifs ont été obtenus par insertion de gènes hétérologues dans des régions non- essentielles comme la région E3 et la partie droite du génome entre l'ITR droite et les séquences de régulation transcriptionnelle du promoteur E4. Des vecteurs réplicatifs ont également été obtenus par insertion d'un gène hétérologue dans la partie gauche du génome entre l'ITR gauche et la région El, sous réserve de conserver des gènes El fonctionnels. De façon plus précise, l'insertion d'une séquence hétérologue entre les positions 455 et 917 de l'adénovirus humain (Ad5) qui inactive le gène ElA par délétion du promoteur et d'une partie de la région codante de ElA, est compensée par l'insertion d'une copie de ce gène en position ectopique dans le vecteur (ELOIT et al . , J. Gen. Virol., 76, 1583-1589, 1995). Des vecteurs réplicatifs ont été construits de la sorte à partir d' adenovirus humains (ELOIT et al . , précité), bovins (MITTAL et al . , J. Gen. Virol., 76, 93-102, 1995), ovins (XU et al . , Virology, 230, 62-71, 1997), aviaires
(MICHOU et al . , J. Virol., 73, 1399-1410, 1999 ; SHEPPARD et al . , Arch. Virol., 143, 915-930, 1998, canins (Cav2 ; Demande Internationale WO 98/00166 et Brevet US 6090393, au nom de RHONE MERIEUX ; Demande Internationale WO 91/11525 et Brevet US 5616326, au nom de l' UNIVERSITE de GLASGOW, MORRISON et al . , Virology, 293, 26-30, 2002) et porcins (REDDY et al., J. Gen. Virol., 80, 563-570, 1999 ; TUBOLY et al . , J. Gen. Virol., 82, 183-190, 2001).
Ces vecteurs adénoviraux réplicatifs ont été développés essentiellement pour des applications vaccinales. Ils ont de manière générale, démontré une grande efficacité lors de l'induction de réponses im unes, aussi bien pour ce qui concerne la réponse en anticorps que la réponse en CTL (pour une revue voir ELOIT, Virologie, 2, 109-120, 1998 et KLONJKOWSKI et al . , In « Adenoviruses : baslc biology to gène therapy », pp . 1 63-1 73, P. Seth , Ed. , R . G. Landes Company, Austin Texas, USA) .
Ces vecteurs réplicatifs présentent cependant quelques inconvénients : - ils posent des problèmes de biosécurité liés au risque de diffusion de tels virus réplicatifs,
- la quantité importante de particules virales produite par les cellules infectées entraîne l'induction d'une réponse immune élevée contre le vecteur et limite l'efficacité des injections de rappel,
- la neutralisation par les anticorps maternels de l'antigène vaccinal relargué à partir de cellules détruites par l'infection, diminue l'efficacité de ces vecteurs réplicatifs chez le jeune. II apparaît qu'on ne dispose à l'heure actuelle d' aucun adenovirus recombinant permettant de transduire efficacement des cellules, en particulier les cellules en division comme les cellules tumorales sans présenter de risques de dissémination dans l'environnement. En choisissant comme modèle expérimental l'adénovirus canin de type 2 (Cav2), les Inventeurs ont recherché s'il était possible d'identifier de nouveaux sites d' insertion permettant d' obtenir des adenovirus recombinants réplicatifs . Ils ont ainsi constaté que la délétion d'une petite portion du début de la région située entre la fin de l'ITR gauche et le début de la séquence codant pour ElA n' affectaient pas la capacité des adenovirus à répliquer leur génome et à se multiplier chez un hôte permissif ; l'emplacement de cette délétion peut donc constituer un nouveau site d'insertion de gènes hétérologues.
En outre, les Inventeurs ont constaté que, de manière surprenante, d'autres délétions dans la même région permettaient d'obtenir des adenovirus capables de répliquer leur génome chez un hôte permissif, mais incapables de se multiplier. Ces adenovirus seront dénommés ci-après « adenovirus pseudo-réplicatifs ». Dans ce qui suit, les positions des différentes régions du génome adénoviral sont définies par référence aux positions des régions correspondantes, (c'est à dire contenant des éléments de fonction similaire) du génome de l'adénovirus canin de type 2 dans la séquence GenBank J04368. Ainsi, la région située entre la fin de l'ITR gauche et le début de la séquence codant pour ElA, correspond à celle située entre la position 311 et la position 499 dans la séquence génomique GenBank J04368 de l'adénovirus canin de type 2. La présente invention a pour objet un adenovirus recombinant susceptible d'être obtenu à partir d'un adenovirus réplicatif par délétion de tout ou partie de la région du génome dudit adenovirus réplicatif correspondant à celle située, dans le génome de l'adénovirus canin de type 2 (GenBank J04368), entre les positions 311 et 499, ladite délétion comprenant tout ou partie de la région du génome de l'adénovirus réplicatif d'origine correspondant à celle située entre les positions 311 et 401 dans le génome de l'adénovirus canin de type 2. Selon un premier mode de réalisation d'un adenovirus recombinant conforme à l'invention, la portion délétée est constituée par tout ou partie de la région du génome de l'adénovirus réplicatif d'origine correspondant à celle située entre les positions 311 et 319 dans le génome de l'adénovirus canin de type 2 ; cette délétion permet d'obtenir un adenovirus recombinant réplicatif capable de se multiplier chez un hôte permissif à l'infection par l'adénovirus sauvage d'origine (cycle viral productif).
Selon un second mode de réalisation d'un adenovirus recombinant conforme à l'invention, la portion délétée comprend tout ou partie de la région du génome de l'adénovirus réplicatif d'origine correspondant à celle située entre les positions 318 et 401 dans le génome de l'adénovirus canin de type 2 ; cette délétion permet avantageusement d'obtenir des adenovirus pseudo-réplicatifs, c'est à dire capables de se répliquer mais incapables de produire des particules virales infectieuses et donc incapables de se multiplier (cycle abortif) chez un hôte permissif à l'infection par l'adénovirus sauvage d'origine.
L'obtention des adenovirus pseudo-réplicatifs conformes à l'invention implique notamment la suppression de tout ou partie des signaux d' encapsidation putatifs du type 5'-TTTA/G-3' Ax, AXI, et AII (situés respectivement en positions 341-344, 377-380, et 388-391, dans la séquence de Cav2 GenBank J04368) .
La portion délétée dans ces adenovirus pseudo- réplicatifs peut comprendre en outre : - tout ou partie de la région du génome de l'adénovirus réplicatif d'origine correspondant à celle située entre les positions 311 et 319 dans le génome de l'adénovirus canin de type 2 ; et/ou
- tout ou partie de la région du génome de l'adénovirus réplicatif d'origine correspondant à celle située entre les positions 400 et 439 dans le génome de l'adénovirus canin de type 2 ; cette délétion supprime notamment la boîte TATA du promoteur d' ElA (située en position 409 dans la séquence de Cav2 GenBank J04368) ; et/ou tout ou partie de la région du génome de l'adénovirus réplicatif d'origine correspondant à celle située entre les positions 438 et 499 dans le génome de l'adénovirus canin de type 2 ; cette délétion supprime notamment le site d'initiation de la transcription d'ElA (situé en position 439 dans la séquence de Cav2 GenBank J04368) .
Dans tous les cas, les adenovirus recombinants (réplicatifs ou pseudo-réplicatifs) conformes à l'invention conservent les séquences de l'ITR gauche indispensables à la réplication, à l'activation de la transcription (4 motifs GGTCA répétés situés entre les positions 62 et 99 dans le génome de Cav2) ainsi que les signaux d' encapsidation Ai de type 5'TTTGN8CG-3' , et n à AIX de type 5'-TTTA/G-3' (situés respectivement aux positions 197-200, 206-209, 213-216, 226- 232, 239-242, 250-253, 258-261, 272-275 et 306-309 dans le génome de Cav2) . Ils conservent également la totalité de la séquence codante d'ElA ainsi que des régions du gène El situées en aval de celle-ci (signal de polyadénylation d' ElA et région ElB) .
Selon un mode de réalisation préféré d'un adenovirus recombinant conforme à l'invention, il comprend en outre au moins une séquence hétérologue d'intérêt insérée dans son génome.
Pour la construction d'un adenovirus recombinant conforme à ce mode de réalisation, ladite séquence hétérologue sera, dans le cas d'un adenovirus réplicatif, insérée dans la région du génome correspondant à celle située entre les positions 311 et 319 dans le génome de l'adénovirus canin de type 2.
Dans le cas d'un adenovirus pseudo-réplicatif, ladite séquence hétérologue peut également être insérée dans cette région, ou à tout autre endroit de la région du génome correspondant à celle située entre les positions 311 et 499 dans le génome de l'adénovirus canin de type 2. L'insertion dans cette région peut s'effectuer en lieu et place de la portion délétée ou à proximité de celle-ci. On peut également insérer une séquence hétérologue dans un quelconque des sites qui sont habituellement utilisés à cet effet pour la construction d' adenovirus réplicatifs. L'insertion peut par exemple être effectuée dans la région E3, ou dans la région située entre la région E4 et l'ITR droite, comme décrit dans le Brevet US 6090393, ou dans la portion 3' de l'ITR droite, comme décrit dans le Brevet US 5616326.
On entend par « séquence hétérologue », toute séquence autre que celle comprise entre les positions 311 et 499 du génome dudit adenovirus sauvage.
A titre d'exemples non-limitatifs, on peut citer : - des gènes codant pour un antigène vaccinal, par exemple les gènes gag ou env du virus de l' immunodéficience féline (FIV) , la protéine S, M ou N du coronavirus félin, une protéine de capside de parvovirus canin ou félin, la glycoprotéine G du virus de la rage ou la protéine Hap-1 de Leptospira sp., etc.
- des gènes correcteurs utilisables en thérapie génique, par exemple celui de l' érythropoïétine (Epo) , du facteur de croissance de l' endothéliun vasculaire (VEGF) , de la neurotrophine 3 (NT-3) ou du facteur atrial natriuretique (ANF) , etc. ;
- des gènes utilisables pour le traitement du cancer, par exemple celui de l'IL-2, de l' IFNγ, etc.
Des adenovirus recombinants conformes à l'invention peuvent en particulier être issus d' adenovirus de mammifères, et notamment d' adenovirus canins, en particulier d' adenovirus canins de type 2.
Les adenovirus recombinants conformes à la présente invention peuvent être préparés par des techniques usuelles, bien connues en elles-mêmes de l'homme de l'art
(cf. par exemple GRAHAM et PREVEC (Manipulation of Adenovirus
Vectors, Methods Mol. Biol., 7, 109-128, 1991), notamment par des techniques comprenant : (i) la génération de génomes recombinants chez E. coll par des techniques classiques de double recombinaison homologue et (ii) la transfection des génomes recombinants ainsi obtenus dans des lignées cellulaires appropriées permettant l'amplification desdits génomes et leur encapsidation dans des particules virales infectieuses. On pourra par exemple utiliser des techniques de recombinaison homologue chez E. coli , telles que celles décrites par CHARTIER et al . , (J. Virol., 70, 7, 4805-4840, 1996) et dans le Brevet US 6110735 au nom de TRANSGENE ou bien celles décrites par CROUZET et al . (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 94, 1414-1419, 1997) . Ces procédés sont basés sur une recombinaison homologue intermoléculaire entre une molécule d'ADN « receveuse » contenant le génome complet d'un adenovirus, et une molécule d'ADN « donneuse » comprenant une séquence hétérologue à insérer dans ledit génome, flanquée de séquences homologues à celles de la région du génome adénoviral où l'on souhaite effectuer l'insertion. La molécule receveuse est linéarisée par clivage à un site de restriction unique dans le génome de l'adénovirus, situé au niveau du site d'insertion. La sélection des génomes recombinants repose ensuite sur la circularisation de la molécule receveuse.
Ces procédés présentent donc l'inconvénient de ne pouvoir insérer ladite séquence hétérologue que dans une région comprenant un site de restriction unique dans le génome de l'adénovirus.
Les Inventeurs ont maintenant mis au point un procédé d'insertion d'une séquence hétérologue dans un adenovirus, qui ne nécessite pas la linéarisation du génome de l'adénovirus par clivage au niveau du site d'insertion
Ce procédé diffère de celui décrit par CHARTIER et al . en ce que :
1) le fragment d'ADN hétérologue (molécule donneuse) à insérer dans le génome de l'adénovirus (molécule receveuse) , comprend un marqueur de sélection permettant d'isoler les plasmides recombinants sur leur double résistance à l' ampicilline et à la kanamycine, et
2) ledit fragment est co-transforme avec une molécule receveuse, soit sous forme circulaire, soit sous forme linéarisée par clivage au niveau d'un site de restriction situé en dehors du site d'insertion.
En conséquence, la présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un adenovirus recombinant par recombinaison intermoléculaire homologue dans une cellule procaryote caractérisé en ce qu' il comprend les étapes suivantes : α) introduction dans ladite cellule procaryote: (i) d'un plasmide comprenant le génome d'un adenovirus et un premier gène de sélection ; et (ii) d'un fragment d'ADN préalablement linéarisé comprenant une séquence hétérologue à insérer dans ledit génome flanquée de séquences homologues à celles flanquant le site dudit plasmide où doit s'effectuer l'insertion, et incluant un second gène de sélection, différent du premier ; et β) culture de ladite cellule procaryote dans des conditions sélectives, afin de permettre la génération et la sélection de cellules contenant des plasmides recombinants exprimant le premier et le second gène de sélection, et γ) isolement du génome dudit adenovirus recombinant à partir des cellules sélectionnées.
On entend par : « conditions sélectives », des conditions de culture dans lesquelles le premier et le second agent de sélection (par exemple antibiotique) sont présents à des concentrations ne permettant pas la multiplication des cellules non-transformées mais permettant la multiplication des cellules co-transformées . Selon un premier mode de réalisation de l'invention, le plasmide utilisé en α) est sous forme circulaire.
Selon un second mode de réalisation de l'invention, le plasmide utilisé à l'étape α) est préalablement linéarisé par clivage au niveau d'un site de restriction situé à l'extérieur du site d'insertion.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le premier et/ou le second gène de sélection est un gène de résistance à un antibiotique, par exemple un gène de résistance à l' ampicilline ou à la kanamycine.
Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, le second gène de sélection est entouré de 2 sites de restriction, identiques ou différents, absents dans le génome de l'adénovirus utilisé à l'étape α) ; un tel gène de sélection peut ainsi être excisé de la séquence du génome de l'adénovirus recombinant par digestion au niveau de ces sites.
Avantageusement, le procédé conforme à l'invention comprend, après la préparation du génome recombinant selon les étapes α) à γ) ci-dessus, une étape additionnelle de transfection du génome recombinant dans une lignée cellulaire appropriée permettant l'amplification dudit génome et son encapsidation dans des particules virales infectieuses .
Pour préparer des adenovirus recombinants conformes à l'invention, on peut utiliser des lignées cellulaires connues en elles-mêmes de l'homme de l'art (cf. par exemple GRAHAM et PREVEC, précité), exprimant la région El de l'adénovirus, et éventuellement la région E4 de l'adénovirus, lorsque cette dernière a été altérée par insertion d'une séquence hétérologue d'intérêt. Parmi les lignées utilisables, on peut citer notamment des lignées humaines telles que la lignée 293 (GRAHAM et al . , J. Gen. Virol., 36, 59-74, 1977) et des lignées canines telle que la lignée DK/E1-28 (KLONJKOWSKI et al . , Human Gène Therapy, précité) . Avantageusement, on pourra utiliser une nouvelle lignée construite par les Inventeurs, qui est modifiée par l'insertion d'un fragment constitué par la séquence correspondant à celle qui s'étend des positions 439 à 3595 du génome de l'adénovirus canin de type 2 (GenBank J04368) ; une telle lignée ne comprend pas les séquences situées en amont de la position 439, qui sont présentes dans les lignées de l'art antérieur mentionnées ci-dessus.
De manière préférée, ladite lignée cellulaire est d'origine canine.
L'invention a en outre pour objet des plasmides et des molécules d'acide nucléiques utilisables pour la préparation du génome d'un adenovirus recombinant conforme à l'invention, notamment un adenovirus canin, ainsi que lesdits génomes recombinants, susceptibles d'être obtenus par les procédés tels que définis ci-dessus. L'invention a en particulier pour objet les molécules d'acide nucléique et les plasmides suivants :
- toute molécule d' acide nucléique sélectionnée dans le groupe constitué par : a) une molécule d'acide nucléique représentant le génome d'un adenovirus recombinant conforme à l'invention tel que défini ci-dessus ; b) une molécule d'acide nucléique constituée par un fragment de la molécule a) ci-dessus, comprenant entre 10 et 1000 pb, de préférence au moins 300 pb, de la séquence de l'adénovirus réplicatif d'origine située en amont de la portion délétée et entre 10 et 5000 pb, de préférence entre 10 et 1000 pb, de manière préférée au moins 300 pb, de la séquence de l'adénovirus réplicatif d'origine située en aval de la portion délétée ; une telle molécule peut comprendre en outre tout ou partie d'une séquence hétérologue insérée en lieu et place de la portion délétée ou à proximité de celle- ci. - tout vecteur d'acide nucléique, notamment tout plasmide, contenant une molécule d'acide nucléique a) ou b) telle que définie ci-dessus.
L'invention a en outre pour objet les adenovirus recombinants conformes à l'invention pour une utilisation comme médicament.
L'invention a notamment pour objet l'utilisation des adenovirus conformes à l'invention, pour la préparation de compositions immunogènes ou vaccinales, ou de médicaments destinés à la thérapie génique ou au traitement du cancer, ainsi que pour la production de protéines recombinantes.
De manière préférée, ledit médicament ou ladite composition sont destinés a être administrés chez un Carnivore domestique ou sauvage, notamment le chat, le chien ou le renard, ou bien chez l'Homme. Les adenovirus recombinants conformes à l'invention sont particulièrement bien adaptés aux utilisations thérapeutiques, par exemple vaccinales, chez l'homme et l'animal. En effet, contrairement aux adenovirus recombinants non-réplicatifs dont le génome est présent en faible nombre de copies par cellule et rapidement éliminé dans les cellules en division active, les adenovirus recombinants conformes à l'invention, réplicatifs ou pseudoréplicatifs, se multiplient de façon importante dans le noyau des cellules transduites permettant de transduire efficacement aussi bien des cellules quiescentes que des cellules en division active comme les cellules tumorales. En outre, les adenovirus pseudo-réplicatifs conformes à l'invention qui ne produisent aucune particule infectieuse présentent une grande biosécurité et permettent en outre d'induire une forte réponse immune lors d'injections de rappel.
Des adenovirus recombinants conformes à l'invention , par exemple ceux dérivés de l'adénovirus canin, ont des applications pour la vaccination et le traitement du cancer chez les carnivores domestiques ou sauvages, notamment le chat, le chien ou le renard. En outre, du fait d'un tropisme d'hôte propre, ces adenovirus canins peuvent être utilisés en thérapie génique humaine, pour cibler des tissus différents de ceux qui peuvent être transduits par les vecteurs humains, par exemple des cellules du système nerveux central.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de Description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant la construction et la préparation d'un adenovirus recombinant conforme à l'invention, et son utilisation pour l'expression de gènes d'intérêt, notamment pour la vaccination. EXEMPLE 1: CONSTRUCTION DES ADENOVIRUS CAV 311-319, CAV 311- 439 ET CAV 311-401
1) Construction des plasmides recombinants
Les plasmides suivants ont été construits en utilisant les protocoles classiques de préparation, de clonage et d'analyse de l'ADN tels que ceux décrits dans
Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL,
2000, Niley and son Inc, Library of Congress, USA) a) Plasmide pCav2 contenant la séquence complète du génome de l'adénovirus canin de type 2 (Cav2) Ce plasmide est construit par recombinaison homologue dans E. coli, de manière analogue au procédé de préparation d' adenovirus humains, décrit dans CHARTIER et al . , précité.
Les principales étapes de construction de ce plasmide sont présentées à la Figure 1.
De manière plus précise, les extrémités gauche et droite du génome de la souche Manhattan de Cav2 correspondant aux séquences des positions 1 à 1060 (fragment A) et 29323- 31323 (fragment B) sont amplifiées séparément par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche Manhattan de Cav2 (APPEL et al . , Am. J. Vet . Res., 34, 543-550, 1973), à l'aide des amorces suivantes : Fragment A
5'-TTGGCGCGCCCATCATCAATAATATACAGGAC-3' (SEQ ID NO: 1) 5'-GCTCTAGACCTGCCCAAACATTTAACC-3' (SEQ ID NO: 2) Fragment B 5'-TTGGCGCGCCCATCATCAATAATATACAGGAC-3' (SEQ ID NO: 1) 5'-GCTCTAGAGGGTGATTATTAACAACGTC-3' (SEQ ID NO: 3)
Les fragments A et B obtenus sont clones séparément dans le plasmide pCR2.1 (TA Cloning System, INVITROGEN) pour donner respectivement les plasmides pCR2.1/ITR gauche et pCR2.1/ITR droit. Le plasmide pCR2.1/ITR gauche est digéré par BamHI et Xbal et le fragment de 1111 pb ainsi généré est clone entre les sites BamHI et Xbal du plasmide pPolylI AmpR (GenBank M18128, LATHE et al . , Gène, 57, 193-201, 1987) pour donner le plasmide dénommé pPolylI/ITR gauche. Le plasmide pCR2.1/ITR droit est clivé par BamHI, traité par la polymérase de Klenow, puis clivé par Xbal ; le fragment de 2052 pb ainsi généré est clone entre les sites Xbal et PvuII du plasmide pPolylI/ITR gauche pour donner le plasmide pPolyII.ITRs.Cav2. Ce plasmide contient les extrémités gauche et droite du génome de la souche Manhattan de Cav2 clonées sous forme d'un fragment Ascl-Ascl de 3073 pb comprenant un site Xbal en position 1066 dudit fragment, permettant de linéariser le plasmide au niveau du site d'insertion de l'ADN. L'ADN génomique de la souche Manhattan de Cav2 et l'ADN de pPolyII.ITRs.Cav2 linéarisé au site Xbal sont co- transformés dans la souche d'__. coli BJ5183 recBC sbcBC
(HANAHAN et al . , J. Mol. Biol., 166, 557-580, 1983). Un plasmide recombinant de 33425 pb, dénommé pCav2, est isolé à partir des colonies résistantes à l' ampicilline.
Le plasmide pCav2 contient le génome complet de Cav2 (souche Manhattan) clone sous forme d'un fragment de 31331 pb flanqué de deux sites Ascl qui sont uniques dans ce plasmide, ces sites étant absents dans le génome de Cav2 (souches Manhattan et Toronto) ainsi que dans celui de la souche d' adenovirus ovin OAV. b) Plasmides navettes bi) pNavette/311-439.CMVeGFP
Ce plasmide de 6111 pb dérive du plasmide pBluescript KS (STRATAGENE) par insertion des séquences de
Cav2 en amont et en aval de la délétion 312-438 (UpRecSeq 1-
311 et DownRecSeq 439-1060), de part et d'autre d'une cassette d'expression du gène rapporteur GFP.
Ce plasmide est construit selon les étapes suivantes :
1°) un fragment C correspondant à la séquence des positions 1 à 311 (UpRecSeq) de Cav2, est amplifié par PCR à l'aide des amorces :
5'-TTGGCGCCCATCATCAATAATATACAGGAC-3' (SEQ ID NO: 1) 5'-CCGACGTCGACCATAAACTTTGACATTAGCCG-3 (SEQ ID NO: 4).
Le produit d'amplification PCR est clone dans le plasmide pCR2.1 pour donner le plasmide pCR2.1/UpRecSeq (1- 311) .
2°) un fragment D correspondant à la séquence des positions 439 à 1060 (DownRecSeq) de Cav2, est amplifié par PCR à l'aide des amorces :
5'-GCTCTAGAGCGAAGATCTCCAACAGCAATACACTCTTG-3' (SEQ ID NO: 5) 5'-GCTCTAGACCTGCCCAAACATTTAACC-3' (SEQ ID NO: 2).
Le produit d'amplification PCR est clone dans le plasmide pCR2.1 pour donner le plasmide pCR2.1/DownRecSeq (439-1060) .
3°) un fragment E d'environ 2050 pb contenant le promoteur précoce du cytomegalovirus, un intron, la séquence codante de l'eGFP { enhanced Green Fluorescent Protein) et un signal de polyadénylation, est obtenu selon les étapes suivantes :
Le plasmide pEGFP-1 (CLONTECH) est clivé par BamHI, traité avec la polymerase de Klenow puis digéré par
Notl ; le fragment de 741 pb ainsi obtenu est clone entre les sites Xhol (prélablement réparé par traitement avec la polymerase de Klenow) et Notl du plamide pCI (PROMEGA) , pour donner le plasmide pCMVeGFP.
Le plasmide pCMVeGFP est ensuite clivé par BglII, traité avec la polymerase de Klenow puis digéré par BamHI pour générer un fragment de 2050 pb (fragment E) .
4°) Le fragment E est inséré entre les sites Smal et BamHI du plasmide pBLUESCRIPT KS pour donner le plasmide pKS/CMVeGFP. Le plasmide pCR2.1/UpRecSeq (1-311) est clivé par Kpnl et Sali et le fragment de 371 pb ainsi obtenu (fragment C) est clone entre les sites Kpnl et Sali du plasmide pKS/CMVeGFP, pour donner le plasmide pKS/CMVeGFP-C. Le plasmide pCR2.1/DownRecSeq (439-1060) est clivé par Xbal et le fragment de 650 pb ainsi obtenu (fragment D) est inséré au site Xbal du plasmide pKS/CMVeGFP-C, pour donner le plasmide dénommé pNavette 311-439/CMVeGFP. b2) pNavette 311-401/CMVeGFP
Le plasmide navette pNavette 311-401/CMVeGFP est construit à partir du plasmide pNavette 311-439/CMVeGFP, selon les étapes suivantes : La séquence 401-1060 (DownRecSeq) est amplifiée par PCR à l'aide des amorces :
5'-GATAAGGATCACGCGGCCTTAAATTCTCAG-3' (SEQ ID NO: 6)
5'-GCTCTAGACCTGCCCAAACATTTAACC-3' (SEQ ID NO: 2).
Le produit d'amplification PCR est clone dans le plasmide pCR2.1 pour donner le plasmide pCR2.1/DownRecSeq (401-1060) .
Ce plasmide pCR2.1/DownRecSeq (401-1060) est digéré par EcoRI puis traité par la polymerase de Klenow et le fragment 401-1060 ainsi obtenu est substitué au fragment 439-1060 du plasmide pNavette 311-439/CMVeGFP préalablement digéré par Xbal puis traité par la polymerase de Klenow, pour donner le plasmide pNavette 311-401/CMVeGFP.
B3) pNavette 311-319/CMVeGFP
Le plasmide navette pNavette 311-319/CMVeGFP est construit à partir du plasmide pNavette 311-439/CMVeGFP, selon les étapes suivantes : La séquence 319-1060 (DownRecSeq) est amplifiée par PCR à l'aide des amorces :
5'-GATAAGGATCAACAGAAACACTCTGTTCTCTG-3' (SEQ ID NO: 7) 5'-GCTCTAGACCTGCCCAAACATTTAACC-3' (SEQ ID O: 2). Le produit d'amplification PCR est clone dans le plasmide pCR2.1 pour -donner le plasmide pCR2.1/DownRecSeq (319-1060) .
Ce plasmide pCR2.1/DownRecSeq (319-1060) est digéré par EcoRI puis traité par la polymerase de Klenow et le fragment 319-1060 ainsi obtenu est substitué au fragment 439-1060 du plasmide pNavette 311-439/CMVeGFP préalablement digéré par Xbal puis traité par la polymerase de Klenow, pour donner le plasmide pNavette 311-319/CMVeGFP. b4) Plasmide navette pNavette 311-439/CMVeGFP/Kana Ce plasmide de 7027 pb dérivé du plasmide pNavette 311-439/CMVeGFP par clonage au site Pmel d'une cassette d'expression d'un gène de résistance à la kanamycine en orientation opposée à celle de la cassette de la GFP, est obtenu selon les étapes suivantes : La phase codante du gène Kana est amplifiée par
PCR à partir du plasmide pET-29a(+) (NOVAGEN) à l'aide des amorces :
5'-AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGGGATTTTGGTCATGAAC-3' (SEQ ID NO: 8) 5'-CCGGCGCGCCGTTTAAACAAAGCTATCCGCTCATGAA-3' (SEQ ID NO: 9). Le produit d'amplification PCR est clone dans le plasmide pCR2.1 pour donner le plasmide pCR2.1-Kana/PmeI. Le plasmide pCR2.1-Kana/PmeI est clivé par EcoRI, traité par la polymerase de Klenow et le fragment d'environ 959 pb contenant la phase codante du gène Kana est inséré au site EcoRV du plasmide pNavette 311-439/CMVeGFP pour donner le plasmide pNavette 311-439/CMVeGFP/Kana.
Ce plasmide pNavette 311-439/CMVeGFP/Kana représenté à la Figure 2, qui contient un gène de résistance à un antibiotique, clone entre les séquences adénovirales cibles de la recombinaison, en amont de la séquence hétérologue à insérer, permet avantageusement de sélectionner les recombinants qui sont résistants à la fois à l' ampicilline et à la kanamycine. En outre, le gène Kana qui est ensuite excisé du plasmide recombinant par digestion au niveau des 2 sites Pmel, est absent de la séquence de l'adénovirus recombinant généré à partir de ce plasmide. b4) Plasmide navette pPoly II 311-439/CMVeGFP/Kana (Figure 2)
Ce plasmide de 6332 pb est obtenu par clonage entre les sites Kpnl (position 42) et PvuII (position 63) du plasmide pPoly II, du fragment Kpnl- PvuII de 4292 pb du pNavette 311-439/CMVeGFP, comme illustré à la Figure 2. c) Plasmide pCav 311-439/CMVeGFP
Ce plasmide est obtenu par recombinaison homologue dans la souche d 'E. coli BJ5183 selon les 2 alternatives cl et c2 suivantes, illustrées respectivement par les Figures 3 et 4 : Ci) recombinaison de pNavette 311-439/CMVeGFP. Kana avec le plasmide pCav2 sous forme circulaire (Figure 3)
1) la molécule donneuse contenant les séquences de recombinaison amont (UpRecSeq 1-311) et aval (DownRecSeq 439-1060) et les cassettes CMVeGFP et Kana est préparée à partir du plasmide pNavette 311-439/CMVeGFP. Kana par digestion avec les enzymes de restriction Kpnl et EcoRV,
2) le fragment obtenu en 1) et le plasmide pCav2 (AmpR) sous forme circulaire sont co-transformés dans la souche d' E. coli BJ5183, et 3) les plasmides recombinants sont isolés sur le critère de la double résistance' à l' ampicilline et à la kanamycine. La séquence de l'un d'entre eux, pCav 311- 439/CMVeGFP.Kana est confirmée par restriction enzymatique et par séquençage. 4) la cassette Kana est ensuite excisée par digestion avec l'enzyme de restriction Pmel, de façon à obtenir le plasmide pCav 311-439/CMVeGFP contenant le génome de Cav2 délété de la séquence 312-438 qui est substituée par une cassette d'expression de la GFP. c2) recombinaison de pPolylI 311-439/CMVeGFP.Kana avec le plasmide pCav2 préalablement linéarisé en dehors du site d'insertion (Figure 4).
1) la molécule donneuse est préparée à partir du plasmide pPolylI 311-439/CMVeGFP. Kana par digestion avec l'enzyme de restriction Swa I,
2) le plasmide pCav2 est linéarisé par clivage au site Pvul,
3) le fragment obtenu en 1) et le plasmide pCav2 linéarisé obtenu en 2' ) sont co-transformés dans la souche d'E. coli BJ5183, et
4) les plasmides recombinants sont isolés sur le critère de la double résistance à l' ampicilline et à la kanamycine. La séquence de l'un d'entre eux, pCav 311- 439/CMVeGFP.Kana est confirmée par restriction enzymatique et par séquençage.
5) la cassette Kana est ensuite excisée par digestion avec l'enzyme de restriction Pmel, de façon à obtenir le plasmide pCav 311-439/CMVeGFP contenant le génome de Cav2 délété de la séquence des positions 312-438 qui est substituée par une cassette d'expression de la GFP. d) Plasmide pCav 311-401/CMVeGFP
Le plasmide pNavette 311-401/CMVeGFP est digéré par Kpnl et SwaI et le fragment de 3167 pb ainsi obtenu et le plasmide pCav 311-439 CMVeGFP linéarisé au site Pmel sont co- transformés dans la souche d' E. coli BJ5185. Le plasmide recombinant pCav 311-401 CMVeGFP généré par recombinaison homologue, est sélectionné sur le critère de la double résistance à l' ampicilline et à la kanamycine. d) Plasmide pCav 311-319/CMVeGFP
Le plasmide pNavette 311-319/CMVeGFP est digéré par Kpnl et SwaI et le fragment de 3249 pb ainsi obtenu et le plasmide pCav 311-439 CMVeGFP linéarisé au site Pmel sont co- transformés dans la souche d' E. coli BJ5185. Le plasmide recombinant pCav 311-319 CMVeGFP généré par recombinaison homologue, est sélectionné sur le critère de la double résistance à l' ampicilline et à la kanamycine. 2) Production des virus recombinants
Les plasmides pCav 311-439/CMVeGFP, pCav 311- 401/CMVeGFP ou pCav 311-319/CMVeGFP sont digérés par l'enzyme de restriction Ascl afin d' exciser les séquences du génome de l'adénovirus recombinant. Le génome adénoviral excisé est ensuite transfecté dans la lignée cellulaire canine DK/E1-28 qui exprime constitutivement la région El de Cav2 (KLONJKOWSKI et al . , Human Gène Therapy, précité), en présence de Lipofectamine (GIBCO) , selon les techniques usuelles , bien connues en elles mêmes de l'homme de l'art (cf. par exemple GRAHAM et PREVEC, précité). Lorsqu'un effet cytopathique est observé, le virus est récolté à partir des cellules transfectées, puis amplifié dans la même lignée cellulaire DK/El-28 et purifié par centrifugation sur un gradient de chlorure de césium, selon un protocole classique, tel que décrit par exemple dans GRAHAM et PREVEC, précité.
La séquence génomique des virus Cav 311- 439/CMVeGFP, Cav 311-401/CMVeGFP et Cav 311-319/CMVeGFP est confirmée par restriction enzymatique et par séquençage partiel de l'ADN viral extrait des cellules DK/E1-28 infectées, préparé selon la technique de HIRT (J. Mol. Biol., 26, 365-369, 1967). Les préparations de virus Cav recombinants sont titrées par dilution limite en plaque à 96 puits, selon la méthode de SPEARMAN et KARBER [ Virology Methods Manual , Brian W J Mahy and Hillar 0 Kangro, 1996, Académie Press, Harcourt Brace & Company) . Le titre en TCID50/ml obtenu par cette méthode est équivalent au titre en ufp/ml obtenu par la méthode des plages sur cellules DK, selon le protocole décrit dans KLONJKOWSKI et al . , précité. Les résultats obtenus sont les suivants : les virus Cav 311-439/CMVeGFP, Cav 311- 401/CMVeGFP, Cav 311-319/CMVeGFP isolés présentent un profil de restriction et une séquence conformes à ceux attendus, les virus Cav 311-439/CMVeGFP, Cav 311- 401/CMVeGFP et Cav 311-319/CMVeGFP purifiés présentent un titre d'environ 109'2 ufp/ml. EXEMPLE 2 : CARACTERISA ION DU VIRUS RECOMBINANT CAV 311-439
1) Analyse de l'efficacité de transduction et de l'effet cytopathique de Cav 311-439 CMVeGFP dans les cellules félines et canines Des lignées de cellules canines (DK/El-28 et DK) ou félines (CRFK) sont infectées par le virus Cav 311-439 CMVeGFP, à une multiplicité d'infection de 10 ufp/cellule. Des cellules non-infectées et des cellules infectées par le virus Cav de type sauvage (Cav2) sont utilisées comme témoin. 3 et 5 jours après l'infection, la présence d'un effet cytopathique (ECP) est analysée par observation des cellules infectées au microscope optique. En outre, l'expression du transgène dans les cellules infectées par le virus Cav 311-439 CMVeGFP est confirmée par détection de la GFP en microscopie de fluorescence.
Les résultats de cette expérience sont présentés dans les Tableaux I et II ci-dessous :
TABLEAU II
Ces résultats montrent que :
- un niveau d'expression élevé du transgène est observé dans les cellules infectées par le virus Cav 311-439 CMVeGFP, et
- aucun effet cytopathique n'est observé dans les cellules canines non modifiées (cellules DK) ou félines infectées par ce virus Cav 311-439 CMVeGFP ; un effet cytopathique important est observé uniquement dans les cellules canines exprimant la région El infectées par ce virus Cav311-439 CMVeGFP, dans les contrôles, un effet cytopathique important est observé dans les cellules canines (DK et DK/E1- 28) infectées par le Cav de type sauvage (Cav2) , et aucun effet cytopathique n' est observé dans les cellules félines infectées par le Cav2.
Les résultats de ces expériences montrent que les virus Cav 311-439 sont capables de transduire très efficacement les cellules sans induire d'effet cytopathique dans les cellules canines qui sont permissives à la réplication des adenovirus canins de type sauvage, ainsi que dans les cellules félines.
2) Analyse de la réplication de Cav 311-439 CMVeGFP dans les cellules félines et canines
Des lignées de cellules canines (DK/El-28 et DK) ou félines (CRFK) sont infectées par le virus Cav 311-439 CMVeGFP, à une multiplicité d'infection de 10 ufp/cellule. Des cellules non-infectées et des cellules infectées par le virus Cav de type sauvage sont utilisées comme témoins.
2, 24, 48 et 72 heures après l'infection, les cellules sont récoltées et centrifugées. L'ADN viral intracellulaire est préparé selon la technique de HIRT (J. Mol. Biol., 26, 365-369, 1967), digéré par l'enzyme EcoRI, puis visualisé sur gel d'agarose après migration électrophorétique .
Les résultats sont présentés à la Figure 5 : Légende de la Figure 5 : l'ADN viral extrait de cellules félines (CRFK) ou canines (DK, DK/E1-28) à différents temps après l'infection (2, 24, 48 et 72 heures) par l'adénovirus Cav 311-439. CMVeGFP est digéré par EcoRI et analysé en gel d'agarose. La lignée DK/E1-28 qui exprime la région El de l'adénovirus est utilisée comme témoin positif de la réplication. Ces résultats montrent que :
- le virus Cav 311-439 CMVeGFP réplique son génome dans les lignées canines et félines testées,
- le niveau de réplication est plus important dans les cellules canines que dans les cellules félines, - le pic de réplication est atteint à 24 heures dans les cellules DK/El-28 et à 48 heures dans les cellules DK, vraisemblablement en raison de l'expression cellulaire de la région El dans les cellules DK/E1-28.
Par comparaison, dans les cellules témoins infectées par le virus Cav de type sauvage, on observe une quantité similaire d'ADN génomique dans les 3 lignées cellulaires .
Les résultats de cette expérience démontrent que la délétion 311-439 n'affecte pas la réplication de l'adénovirus canin: les vecteurs portant cette délétion (Cav 311-439 CMVeGFP) se comportent comme les adenovirus sauvages en ce qui concerne la réplication de leur génome dans des cellules canines ou félines.
3) Analyse de la production de particules virales dans les cellules canines infectées par le virus Cav 311-439.CMVeGFP
Des lignées de cellules canines DK sont infectées par le vecteur Cav 311-439 CMVeGFP, à une multiplicité d'infection de respectivement 0,1, 1 et 10 ufp/cellule. Des cellules non-infectées et des cellules infectées par le virus Cav de type sauvage sont utilisées comme témoin.
Les cellules infectées sont récoltées 2 heures et 6 jours après l'infection, lysées par plusieurs cycles de congélation et de décongélation. Le lysat cellulaire est titré par la technique des dilutions limites précitée.
La quantité de virus présente dans les cellules, exprimée en ufp/ml, est présentée dans le Tableau III ci- dessous .
TABLEAU III
Ces résultats montrent que le virus Cav 311-439 ne produit pas de particules virales infectieuses dans les cellules canines n'exprimant pas la région El comme les cellules DK : le cycle viral de Cav 311-439 est abortif dans les cellules canines.
4) Vaccination de chats conventionnels avec le virus Cav 311-
439 Des groupes de chats sont inoculés par voie intramusculaire avec les doses suivantes de Cav 311-439 : groupe 1 (n=2) : 9,6 107 pfu groupe 2 (n=2) : 9,6 106 pfu groupe 3 (n =2 ) : témoin. A J14, J21 et J31, les anticorps sériques anti- eGFP sont titrés par ELISA.
Les résultats sont présentés à la Figure 6. Légende de la Figure 6 : Titres en anticorps sériques anti-eGFP (Ac) chez le chat, aux jours J7, J14, J21 et J31 après l'inoculation de différentes doses du virus Cav 311-439. CMVeGFP: -B- 9,6 107 ufp/ml (ufp: unités formant plage), -^- 9,6 107 ufp/ml, •••D"- 9,6 106 ufp/ml, - O••• 9,6 106 ufp/ml.
Ces résultats montrent qu'une seule injection de Cav 311-439 permet d'induire chez le chat une réponse immune (humorale) spécifique du gène d'intérêt.
EXEMPLE 3: CONSTRUCTION D'UNE LIGNEE D'ORIGINE CANINE EXPRIMANT CONSTITUTIVEMENT LA REGION El DE CAV2.
Une nouvelle lignée exprimant la région El est construite à partir de la lignée DK (lignée immortalisée de cellules de rein de chien; ATCC CRL 6247) en suivant les étapes suivantes :
La séquence des positions 439 à 3595 de Cav2 (souche Manhattan) est amplifiée par PCR à l'aide des amorces suivantes:
5'-CGGCCGACTCTTGAGTGCGCAGCGAGA-3' (SEQ ID NO: 10) 5'-GGCGCGCCGAGAGACAACGCTGGACACGG-3' (SEQ ID NO: 11)
Le produit d'amplification PCR est clone dans le plasmide pCR2.1 pour donner le plasmide pCR2.1/El. Le plasmide pTRE (CLONTECH) est digéré par BamHI, traité par la polymerase de Klenow et recircularisé pour donner le plasmide pTRE/dl BamHI. Le plasmide pCR2.1/El est digéré par EcoRI, le fragment de 3187 pb ainsi obtenu est clone au site EcoRI du plasmide pTRE/dl BamHI pour donner le plasmide pTRE El Cav2.
Ce plasmide pTRE El Cav2 contient la séquence codante de le protéine ElA sous le contrôle d'un promoteur
CMV minimum et d'éléments de réponse de l'opéron Tet ( Tet-
Responsive Elément ou TRE) , les séquences codantes des protéines ElB (133R et 438R ; SHIBATA et al . , Virology, 172,
460-467, 1989) sous le contrôle de leur propre promoteur et les propre signaux de polyadénylation de ces séquences.
A partir du pTRE El Cav2, une lignée exprimant la région El est obtenue de manière analogue à la lignée DK/E1- 28 (KLONJKOWSKI et al . , précité).
De manière plus précise, les cellules DK sont co- transfectees à l'aide du plasmide pTRE El Cav2 linéarisé au site Aatll et du plasmide pTK-Hyg (CLONTECH) linéarisé au site Asel. Des clones sont sélectionnés en présence d' hygromycine (150 μg/ml) puis analysés par Southern blot, Northern blot, RT-PCR et Western blot. 4 clones exprimant la région El (ElA et ElB) , capables de produire efficacement les vecteurs délétés selon l'invention ont été isolés.
EXEMPLE 4 : IMMUNISATION DE SOURIS AVEC LE VIRUS CAV 311-319
Des souris réparties en trois groupes ont été inoculées par voie intramusculaire avec la dose de 108 pfu des virus suivants :
Groupe 1 (n=4) Cav 311-319 eGFP Groupe 2 (n=4) Cav 311-319 CONTROL Groupe 3 (n=l) témoin non inoculé. Le virus Cav 311-319 CONTROL est isogénique au virus Cav 311-319 eGFP à l'exception du gène hétérologue inséré (à la place du gène codant pour la GFP est inséré un gène hétérologue codant pour une protéine ne présentant pas de parenté antigénique avec la GFP) .
A J7, les anticorps sériques anti eGFP produits par les souris inoculées ont été titrés par Elisa.
Les résultats sont présentés à la figure 7. Légende de la figure 7 : DO à 405 nm aux différentes dilutions (de 1 à 8, respectivement 1/5, 1/15, 1/45, 1/135, 1/405, 1/1215, 1/3645 et 1/10935) des sérums de souris des groupes : eGFP ( ) , CONTROL (") et témoin (A). Ces résultats montrent qu'une seule injection de
Cav 311-319 permet d'induire chez la souris une réponse immune (humorale) spécifique du gène hétérologue inséré dans cet adenovirus.

Claims

REVENDICATIONS
1) Adenovirus recombinant susceptible d'être obtenu à partir d'un adenovirus réplicatif par délétion de tout ou partie de la région du génome dudit adenovirus réplicatif correspondant à celle située, dans le génome de l'adénovirus canin de type 2 (GenBank J04368), entre les positions 311 et 499, ladite délétion comprenant tout ou partie de la région du génome de l'adénovirus réplicatif d'origine correspondant à celle située entre les positions 311 et 401 dans le génome de l'adénovirus canin de type 2.
2) Adenovirus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que la portion délétée est constituée par tout ou partie de la région du génome de l'adénovirus réplicatif d' origine correspondant à celle située entre les positions 311 et 319 dans le génome de l'adénovirus canin de type 2.
3) Adenovirus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que la portion délétée comprend tout ou partie de la région du génome de l'adénovirus réplicatif d'origine correspondant à celle située entre les positions 318 et 401 dans le génome de l'adénovirus canin de type 2.
4) Adenovirus recombinant, selon la revendication 3, caractérisé en ce que la portion délétée comprend en outre : - tout ou partie de la région du génome de l'adénovirus réplicatif d'origine correspondant à celle située entre les positions 311 et 319 dans le génome de l'adénovirus canin de type 2 ; et/ou tout ou partie de la région du génome de l'adénovirus réplicatif d'origine correspondant à celle située entre les positions 400 et 439 dans le génome de l'adénovirus canin de type 2 ; et/ou
- tout ou partie de la région du génome de l'adénovirus réplicatif d'origine correspondant à celle située entre les positions 438 et 499 dans le génome de l'adénovirus canin de type 2. 5) Adenovirus recombinant selon une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une séquence hétérologue d'intérêt insérée dans son génome . 6) Adenovirus recombinant selon la revendication
5, caractérisé en ce que ladite séquence hétérologue est insérée dans la région du génome correspondant à celle située entre les positions 311 et 319 dans le génome de l'adénovirus canin de type 2. 7) Adenovirus recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est issu d'un adenovirus canin de type 2.
8) Molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu' elle est sélectionnée dans le groupe constitué par : a) une molécule d'acide nucléique représentant le génome d'un adenovirus recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, et b) une molécule d'acide nucléique constituée par un fragment de la molécule a) ci-dessus, comprenant entre 10 et 1000 pb, de préférence au moins 300 pb, de la séquence de l'adénovirus réplicatif d'origine située en amont de la portion délétée et entre 10 et 5000 pb, de préférence entre 10 et 1000 pb, de manière préférée au moins 300 pb, de la séquence de l'adénovirus réplicatif d'origine située en aval de la portion délétée.
9) Plasmide, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'acide nucléique selon la revendication 8.
10) Adenovirus recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour une utilisation comme médicament.
11) Utilisation d'un adenovirus recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour la préparation d'un médicament destiné à la thérapie génique.
12) Utilisation d'un adenovirus recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du cancer. 13) Utilisation d'un adenovirus recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour la préparation d'une composition immunogène ou vaccinale.
14) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisée en ce que ledit médicament ou ladite composition sont destinés a être administrés chez un Carnivore domestique ou sauvage.
15) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisée en ce que ledit médicament ou ladite composition sont destinés à être administrés chez l'homme.
16) Procédé de préparation d'un adenovirus recombinant par recombinaison intermoléculaire homologue dans une cellule procaryote, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : α) introduction dans ladite cellule procaryote : (i) d'un plasmide comprenant le génome d'un adenovirus et un premier gène de sélection ; et (ii) d'un fragment d'ADN préalablement linéarisé comprenant une séquence hétérologue flanquée de séquences homologues à celles flanquant le site dudit plasmide où doit s'effectuer l'insertion, et incluant un second gène de sélection, différent du premier, β) culture de ladite cellule procaryote dans des conditions sélectives, afin de permettre la génération et la sélection de cellules contenant des plasmides recombinants exprimant le premier et le second gène de sélection, et γ) isolement du génome dudit adenovirus recombinant à partir des cellules procaryotes sélectionnées.
17) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le plasmide utilisé à l'étape α) est sous forme circulaire.
18) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le plasmide utilisé à l'étape α) est préalablement linéarisé par clivage au niveau d'un site de restriction situé à l'extérieur du site d'insertion.
19) Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, caractérisé en ce que ledit second gène de sélection est entouré de 2 sites de restriction, identiques ou différents, absents dans le génome de l'adénovirus inclus dans le plasmide utilisé à l'étape α) .
20) Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 19, caractérisé en ce qu'il comprend une étape additionnelle de transfection dudit génome recorαbinant dans une lignée cellulaire permettant l'amplification dudit génomes et son encapsidation dans des particules virales infectieuses .
21°) Utilisation d'un adenovirus recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour la production de protéines recombinantes.
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