EP1459074A2 - Testsystem zur suche oder pr fung von wirksubstanzen, welche das wachstum und/oder das berleben von nervenzel len beeinflussen - Google Patents

Testsystem zur suche oder pr fung von wirksubstanzen, welche das wachstum und/oder das berleben von nervenzel len beeinflussen

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EP1459074A2
EP1459074A2 EP02798293A EP02798293A EP1459074A2 EP 1459074 A2 EP1459074 A2 EP 1459074A2 EP 02798293 A EP02798293 A EP 02798293A EP 02798293 A EP02798293 A EP 02798293A EP 1459074 A2 EP1459074 A2 EP 1459074A2
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EP
European Patent Office
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hnrnp
cell
test system
growth
survival
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02798293A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Michael Sendtner
Wilfried Rossoll
Ann-Kathrin Zentrum für Molekulare TRANZISKA
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Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Original Assignee
Medinnova Gesellschaft fuer Medizinische Innovationen aus Akademischer Forschung mbH,
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease

Definitions

  • Test system for the search or testing of active substances that influence the growth and / or survival of nerve cells.
  • the invention relates to a test system for searching or testing active substances which influence the growth and / or survival of nerve cells, active substances obtainable therewith, uses of the test system and uses of the active substances.
  • RNP Ribonucleoproteins
  • the RNP includes the "small nuclear” ribonucleoproteins (snRNP) and the “heterogeneous nuclear” ribonucleoproteins (hnRNP).
  • snRNP small nuclear ribonucleoproteins
  • hnRNP heterogeneous nuclear ribonucleoproteins
  • snRNPs are known to be binding partners for the "survival motor neuron” (SMN) protein (Liu and Dreyfuss, 1996; Meister et al 2000).
  • SSN survival motor neuron
  • SMN is found in complex with some other proteins such as Gemin 2, Ge in 3, and Gemin 4, binds to U snRNAs (Fischer et al 1997, Buhler et al 1999; Selenko et al 2001) and is involved in the biogenesis and function of snRNPs, involved in the "splicing" process of the pre-mRNA and the processing and modification of rRNA (Pellizzoni et al Curr Biol 11: 1074-1088, 2001; Friesen et al Mol Cell 7: 1111-1117,2001).
  • SMA spinal muscular atrophy
  • the SMN protein does not appear to be a survival factor for motor neurons, since overexpression of the normal SMN protein does not protect motor neurons from cell death, e.g. caused by withdrawal of trophic factors (Cisterni et al Neurobiol Dis 8: 240-251, 2001). Furthermore, it is questionable whether the splicing process of mRNA in motor neurons is impaired in SMA (Jablonka et al 2000; Tucker et al 2001). Despite the progress in understanding the function of SMN in pre-mRNA splicing, little is known about the pathogenesis in SMA. An open question remains as to why reduced amounts of functional SMN protein in all tissues can lead to a specific death of motor neurons.
  • SMN fulfills additional motor neuron-specific tasks. This function could be based on the interaction with motor neuron-specific proteins. In addition to nuclear structures, SMN is also localized in the cytoplasm of motor neurons, including the dendrites and axons (Pagliardini et al., 2000).
  • SMA is one of the neurodegenerative diseases that are characterized by degeneration of nerve cells. These include Alzheimer's, diabetic neuropathy, multiple sclerosis and the complications of cerebral ischemia. Prophylaxis or therapy of these diseases is currently, if at all, only possible to a limited extent. New methods for the search for active substances as well as active substances for the prophylaxis or therapy of these diseases are urgently needed.
  • the invention is therefore based on the technical problem of specifying a test system with which active substances can be identified which are suitable for the prophylaxis and / or treatment of neurodegenerative diseases and / or nerve damage from injuries, and also such active substances. Findings on which the invention is based.
  • hnRNP-R and hnRNP-Q although ubiquitously found in cells in the organism, are most strongly expressed during spinal cord embryogenesis, 11) that hnRNP-R is essentially in the cytoplasm is localized by motor neurons, especially m their axons, less in axons of sensory neurons and m) that the overexpression of hnRNP-R or hnRNP-Q in nerve cells leads to a considerably increased growth of neurites.
  • the basis of the invention is therefore the surprising finding that the increased expression of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins R and Q (hnRNP-R and hnRNP-Q) significantly increases / demands the growth of neurites.
  • the invention teaches a test system for searching or testing active substances which influence the growth and / or survival of nerve cells, whereby a cell is brought into contact with at least one prospective active substance and subsequently in this cell at least one of the Ribonucleoproteins hnRNP-R and / or hnRNP-Q and / or a splicmg isoform of hnRNP-R and / or of hnRNP-Q are determined and the determined amount of this ribonucleoprotem is compared with the amount of this ribonucleoprotem in a cell which is not with the prospective active substance has been brought into contact, the use of the test system according to the invention for the search for active substances which stimulate the growth and / or survival of nerve cells or which stimulate the growth of neurites and / or axons, an active substance obtainable with a Test system according to the invention, the active ingredient in a cell, preferably a human cell, in particular
  • human hnRNP-R The sequence of human hnRNP-R is known under the accession number AF000364.1. A newer version is known under the accession number NM_005826 (see also SEQ.ID 33 for the protein [p] and SEQ.ID 34 for the nucleic acid [n] coding therefor). Sequences of human hnRNP-Q (3 splicing isoforms Q1, Q2 and Q3) are known under the accession numbers AY034483, AY034482 and AY034481, respectively (Ql [p]: SEQ.
  • mice hnRNP-R is known under the accession number AF441128 (p: SEQ.-ID 41, n: SEQ.-ID 42).
  • the sequence of mouse hnRNP-Q is known under the accession number AF093821 (p: SEQ. ID 43, n: SEQ. ID 44).
  • the cells and / or ribonucleoproteins used can originate from various organisms, for example be of murine origin or originate from rodents.
  • the ribonucleoprotein is a human ribonucleoprotein and / or the cell is a human nerve cell.
  • the cell can be mesodermal or endodermal, and preferably human.
  • the ribonucleoprotein can with a specific Antibodies or antibody fragments are detected.
  • Such antibodies can be obtained, for example, by immunizing rodents with the ribonucleoprotein or a partial sequence thereof.
  • a mimicrimolecule can also be used for this, ie a synthetic compound that binds with at least the same specificity at the same binding site as the binding site of the antibody.
  • the ribonucleoprotein can also be detected by the detection of its mRNA. This can be done with the aid of nucleotide sequences which hybridize specifically with all or part of the nucleotide sequence of hnRNP-R or of hnRNP-Q, for example using RT-PCR (reverse transcriptase poly-chain reaction). It is of independent importance in connection with the detection of hnRNP-R or hnRNP-Q that it can also be used to diagnose a neurodegenerative disease or to control its course. For this purpose, a tissue sample is taken from an organism and nerve cells from this are subjected to an analysis for one or both of the ribonucleoproteins mentioned, as described above. The amount of ribonucleoprotein determined can then be used to draw conclusions about the presence of the disease (low level). In this respect, the findings according to the invention are also suitable for examining the pathogenesis of the diseases using, for example, rodents.
  • An active ingredient according to the invention increases the amount of preferably human hnRNP-R and / or preferably human hnRNP-Q (including all splicing isoforms).
  • Such an active ingredient can encode a nucleic acid sequence for preferably human hnRNP-R or for preferably human hnRNP-Q or for a mimicripeptide therefor contain.
  • Such active substances can be introduced into the target cells, for example, by means of viral or non-viral vectors.
  • a mimicripeptide to one of the ribonucleoproteins mentioned is a peptide which leads to the same requirement for the growth of neurites and / or axons as the underlying ribonucleoprotein.
  • This can be a nuclear acid sequence coding for a partial sequence of the ribonucleoprotem, with mutations optionally being attached.
  • the active ingredient can also contain human hnRNP-R and / or hnRNP-Q or a facial expression compound.
  • a mimic compound can also be produced synthetically and can have non-natural amino acids or can be of a non-peptide chemical structure.
  • An active ingredient according to the invention can be used in particular for the production of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prophylaxis of neurodegenerative diseases or nerve damage from injuries or poisoning, in particular Alzheimer's, diabetic neuropathy, multiple sclerosis and / or damage after cerebral ischemia.
  • Example 1 Discovery of hnRNP-R and hnRNP-Q as binding partner for SMN protein.
  • a yeast (yeast) -2 hybrid screen was carried out to isolate potential SMN-interacting proteins.
  • a “cDNA” was used which encodes exon 2b-7 murine SMN (DiDonato et al., 1997).
  • the cDNA was isolated from the mouse brain RNA by RT-PCR (PCR primer: Smn2bBHlup TTA TGG ATC CAT GCT CTA AAG AAC GGT GAC ATT TG, SEQ.-ID 1, and SmnBHllow AGA AGG ATC CCC ATC TCC TGA GAC AGA GCT G, SEQ ID 2).
  • the N-termmale Part was not used to select against the interaction with SIP-1 / Gem ⁇ n2, which binds very strongly in this region and would otherwise have been isolated on the screen as an already known interaction partner.
  • the cDNA was cloned by linker PCR with the plasmid pAS2-1 (Clontech, Palo Alto, CA 94303) behind the DNA binding domain of GAL4 (PCR primer: Smn2bBHlup TTA TGG ATC CAT GCT CTA AAG AAC GGT GAC ATT TG, SEQ .-ID 3, and SmnBHllow AGA AGG ATC CCC ATC TCC TGA GAC AGA GCT G SEQ.-ID 4).
  • the screen was carried out with the yeast strains CG1945 and Y190 (reporter genes lacZ and HIS3, Clontech) according to the manufacturer's instructions.
  • SMN m pAS2-1 selection marker TRP1, Clontech
  • cDNA library from mouse brain, in pACT2, selection marker LEU2, Clontech
  • SC medium high density
  • 5mM 3-AT (3-Ammo-1,2,4-T ⁇ azol is a competitive inhibitor of the enzyme encoded by the HIS3 gene. 5-MM 3-AT (3-AT) is used as a metabolic inhibitor. The sensitivity of the screen can be regulated by adding 3-AT ) added.
  • hnRNP-R and hnRNP-Q / gry-rbp coding for the complete open reading frame was isolated by RT-PCR of RNA from mouse brain.
  • the primers for this are based on the sequence from the database (Genbank).
  • hnRNP-R the 5 'sequence was previously determined by 5' RACE (5 'RACE Kit, Clontech).
  • Example 3 Specific binding of the SMN protein with hnRNP-R and hnRNP-Q
  • Co-immunoprecipitations were carried out in order to detect a specific binding of the SMN-protein with hnRNP-R and hnRNP-Q m sucker cells.
  • a cell line namely the human embryonic kidney cell HEK293 (ATCC, Manassas, VA 20108, USA) with expression plasmids containing the cDNAs from fused with the FLAG tag. Smn and hnRNP-R or hnRNP-Q co-transfected.
  • the cells were washed with PBS and with lysis buffer (20mM Tris pH 7.4, 137mM NaCl, 10% Glycerol, 1% Triton X-100 2mM EDTA, 50mM Na-ß-Glycerophosphate, 20mM Na-Pyrophosphate , Protease inhibitors) lysed to produce protein extracts.
  • lysis buffer (20mM Tris pH 7.4, 137mM NaCl, 10% Glycerol, 1% Triton X-100 2mM EDTA, 50mM Na-ß-Glycerophosphate, 20mM Na-Pyrophosphate , Protease inhibitors
  • anti-hnRNP-R and anti-hnRNP-Q antiserum which are obtained by immunizing rabbits with the N-termmal peptides with the sequence: MANQVNGNAVQLKEEEEP, SEQ.-ID 9, and MA-TEHVNGNGTEEPMDTT, SEQ.-ID 10, were incubated with ProtemA agarose (Röche) in lysis buffer. This suspension was incubated with 100 ⁇ g protein extract overnight at 4 ° C. The immunoprecipitates were washed three times with lysis buffer and boiled in Laemmlipuffer (Laemmli, 1970).
  • the extracts were separated on 10% SDS polyacrylic amide gels and blotted onto nitrocellulose membranes. Unspecific binding parts were blocked by incubation with 5% milk powder in TBS-T (20 mM Tris-Cl, pH 7.6, 137 mM NaCl, 0.2% Tween20). The membranes were incubated with monoclonal anti-Smn antibody (Dianova, D-20148 Hamburg, Germany) or anti-FLAG-Tag antibody (Sigma, St. Louis, MO 63103). These were detected with specific HRP-coupled secondary antibodies using chemiluminescence (ECL, Amersham) according to the manufacturer's instructions. It was found that the Immunoprecipitation of hnRNP-R and hnRNP-Q the SMN protein was co-immunoprecipitated.
  • Example 4 Missing binding to hnRNP-R and to hnRNP-Q of mutant SMN proteins corresponding to the SMN proteins of SMA patients
  • the cDNA corresponding to exon 2b-exon 7 was cloned into the HindIII and BamHI sites of the plasmid Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA 92037-1073, USA). This cDNA was used as a template for further PCR amplifications with the mismatch primers. The lack of binding to hnRNP-R and to hnRNP-Q of mutant SMN proteins corresponding to the SMN proteins of SMA patients was shown by co-immunoprecipitation experiments.
  • HEK293 cells were transfected with expression vectors with the cDNAs of hnRNP-R or hnRNP-Q and expression vectors with the mutated SMN cDNAs.
  • the immunoprecipitates were cleaned and detected as described above. The result showed that only wild-type SMN, but not the mutated versions of this protein, could be coimmunoprecipitated by hnRNP-R and -Q.
  • Example 5 Detection of hnRNP-R and hnRNP-Q in nerve cell extracts with the help of specific antibodies or RT-PCR
  • the extracts were mixed with the same volumes of Laemmli buffer (125 mM Tris pH 6.8, 4% SDS, 10% ß-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.004% bromophenol blue), denatured by boiling and stored at -20 ° C ,
  • the extracts were on 10% polyacrylamide gels separated and transferred to nitrocellulose membranes. Unspecific binding sites were blocked by incubation with 5% milk powder in TBS-T (0.2% Tween20).
  • the rabbit antiserum against the N-terminal peptide of hnRNP-R or hnRNP-Q in a dilution of 1/1000 m 5% milk powder in TBS-T was used as the primary antibody. Pre-absorbed antibodies were used as controls.
  • the antisera were incubated with the peptides used to generate the antibodies and these complexes were removed.
  • the antisera was incubated with the membranes for 1 hour at room temperature and then washed three times for 15 minutes with TBS-T.
  • HRP-coupled goat anti-camel antibodies (Röche, Mannheim) diluted 1/10000 in TBS-T + 5% milk powder were used as secondary antibodies.
  • the membranes were washed three times and incubated with the detection reagent (ECL, Amersham) for 1 minute. Chemiluminescence was visualized by exposure to X-ray films.
  • HnRNP-R and hnRNP-Q are expressed in most neural and non-neural tissues.
  • HnRNP-R was detected especially in the brain, but also in the spinal cord, heart, lungs, liver and spleen.
  • HnRNP-Q showed the strongest expression of the brain, lungs and liver.
  • expression is regulated in a development-specific manner.
  • a comparison of the expression of embryonic (embryonic day 14 and 19) and born mice (postnatal day 2 and 15 and adult) showed the strongest expression in the late embryonic stage (E19) with rapid decrease after birth for both proteins.
  • RT-PCR was used to determine the amount of transcripts. Different tissues were removed from adult mice and the spinal cord from mice at different stages of development.
  • RT-PCR was carried out with specific primer pairs for hnRNP-R, hnRNP-Q and ß-actin (as a control), (ß-actin-s GTG GGC CGC CCT AGG CAC CAG, SEQ.-ID 27, ß-actm -as CTC TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC, SEQ.-ID 28, RNP1F ATG GCT AAT CAG GTG AAT GGT AAT G, SEQ.-ID 29, RNP282R AGTA CAG ACA GAG TCC CTT CCT C, SEQ.-ID 30, grylF ATG GCT ACA GAA CAT GTT AAT GG, SEQ.ID 31, gry273R AGC ACT GCC AAT GCG CCG TCT TC, SEQ.ID 32).
  • the result confirmed the results of Western
  • Example ⁇ Specific detection of hnRNP-R and hnRNP-Q and of SMN in the spinal cord with the help of antibodies.
  • an onoclonal antibody against mouse Smn (Dianova, D-20148 Hamburg, Germany) with a concentration of 1 ⁇ g / ml or a monoclonal antibody against phosphorylated Tau-1 (clone PC1C6 Boehrmger Mannheim) with a concentration of 10 ⁇ g / ml and Antiserum against hnRNP-R (1: 1000) added.
  • Example 7 Specific detection of hnRNP-R and hnRNP-Q and of SMN in axons of cultured motor neurons and in the axons of different nerves with the aid of antibodies.
  • cultured murine embryonic motor neurons were examined by immunohistochemistry , Pregnant mice (14 days pc) were killed by cervical dislocation. The embryos were removed from the uterus and decapitated. The ventro-lateral area of the lumbar spinal cord was isolated and transferred to HBSS + 10 ⁇ M b-mercaptoethanol.
  • the cultured motor neurons were fixed in acetone / methanol (1: 1) after 7 days and incubated with antibodies against phosphorylated tau protein in a concentration of 1 ⁇ g / ml and polyclonal antiserum against hnRNP-R (1: 1000), followed by three times washed with TBS-T, incubated with secondary antibody (Cy3TM-conjugated goat anti-rabbit IgG, Dianova, and Alexa488-conjugated goat anti-mouse IgG, Molecular Probes), washed again three times and embedded in Mowiol. Immunoreactivity was demonstrated with a confocal microscope (Leica).
  • a strong hnRNP-R-specific staining was found in axons, but not in the surrounding Schwann cells.
  • Example 8 Transfection of nerve cells with nucleotide sequences, coding for hnRNP-R or hnRNP-Q, increased growth of the axons PC-12 cells were transfected with expression constructs (see “Cloning hnRNP-R and hnRNP-Q and Expression of the Proteins") for hnRNP-R and hnRNP-Q.
  • Nucleotide sequences coding for hemagglutin (HA) are added to the corresponding genes.
  • the expression plasmids contain a neomycin resistance gene.
  • G418 ⁇ antibiotic for the selection of neomycin-resistant clones, Life Technologies, Rockville, MD 20849-6482, USA
  • stable cell lines were selected which had integrated the expression plasmid with the antibiotic resistance gene.
  • Western blot analysis with anti-HA-Tag antibodies identified clones which stably expressed hnRNP-R or hnRNP-Q. These stable cell lines were determined by growth in medium with a low serum content (2% fetal calf serum, 4% horse serum instead of 5% + 10%) and the addition of 10ng / ml nerve growth factor (NGF) to differentiate and outgrow neurites stimulated.
  • NGF nerve growth factor
  • the cells were fixed with acetone / methanol (1: 1) and by immunocytochemistry with Anti-Map2 (stains microtubule-associated protein 2 and thus dendrites and axons) and anti-phosphorylated tau antibody (stains above all) Axons) stained.
  • the length of the neurites in a comparison cell line and in the stable cell lines expressing hnRNP-R or -Q was measured and compared on scanned images using the Scionlmage program (Scion Corporation, Frederick, MD 21701, USA).
  • the cell lines expressing stable hnRNP-R and hnRNP-Q (2 each) showed a 5 or 4.5-fold increased outgrowth of the neurites compared to the control.
  • hnRNP R heterogeneous nuclear ribonucleoprotein R
  • autoimmune antibody immunological relationship with hnRNP P. Nucleic.Acids .Res. 26 (2): 439-445; Rodrigues, NR, Owen, N., Talbot, K., Ignatius, J., Dubowitz, V., and Davies, KE (1995) Delitions in the survival motor neuron gene on 5ql3 in autosomal recessive spinal muscular atrophy.

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Abstract

Die Erfindung lehrt ein Testsystem zur Suche oder Prüfung von Wirksubstanzen, welche das Wachstum und das Überleben von Nervenzellen beeinflussen, wobei eine Zelle in Kontakt gebracht wird mit mindestens einer prospektiven Wirksubstanz und nachfolgend in dieser Zelle zumindest eines der Ribonukleoproteine hnRNP-R und/oder hnRNP-Q und/oder eine Splicing-Isoform von hnRNP-R und/oder von hnRNP-Q bestimmt und die ermittelte Menge dieses Ribonukleotides verglichen wird mit der Menge an diesem Ribonukleoprotein in einer Zelle, welche nicht mit der prospektiven Wirksubstanz in Kontakt gebracht wurde, sowie mit einem solchen Testsystem erhältliche Wirksubstanzen.

Description

Testsystem zur Suche oder Prüfung von Wirksubstanzen, welche das Wachstum und/oder das Überleben von Nervenzellen beeinflussen.
Gebiet der Erfindung.
Die Erfindung betrifft ein Testsystem zur Suche oder Prüfung von Wirksubstanzen, welche das Wachstum und/oder das Überleben von Nervenzellen beeinflussen, damit erhältliche Wirkstoffe, Verwendungen des Testsystems sowie Ver- Wendungen der Wirkstoffe.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik.
Die Funktion von Nervenzellen ist abhangig von der Ausbildung und dem Erhalt funktionsfähiger Neuriten. Da eine Vielzahl neurodegenerativer Erkrankungen, (beispielsweise Alzheimer Erkrankung, diabetische Neuropathie, multiple Sklerose und die Schädigungen nach cerebraler Ischämie) einhergehen mit Degenerationen von Neuriten, besteht erheblicher Bedarf an Substanzen, welche das Neuπten- Wachstum fordern und die Degeneration von Neuriten hemmen. Ribonukleoproteine (RNP) sind RNA bindende Proteine, beteiligt an der Biogenese, dem Transport und der Funktion von mRNA und rRNA. Zu den RNP gehören die "small nuclear" Ribonukleoproteine (snRNP) und die "heterogeneous nuclear" Ribonukleoproteine (hnRNP) . hnRNPs spielen eine wichtige Rolle bei verschiedenen Aspekten des RNA-Stoffwechsels wie z.B. Splicmg, Transport, Poly-Adenylierung, Stabilisierung und Translation (Review: Krecic and Swanson, 1999; Literaturliste mit vollständiger Bibliographie siehe Ende der Beschreibung) .
Von einigen snRNP ist bekannt, dass sie Bindungspartner darstellen für das "Survival motor neuron" (SMN) Protein (Liu und Dreyfuss, 1996; Meister et al 2000). SMN ist im Komplex mit einigen anderen Proteinen wie Gemin 2, Ge in 3, und Gemin 4 anzutreffen, bindet an U snRNAs (Fischer et al 1997, Buhler et al 1999; Selenko et al 2001) und ist an der Biogenese und Funktion von snRNPs, dem "splicing" Prozess der pre-mRNA und der Prozessierung und Modifikation von rRNA beteiligt (Pellizzoni et al Curr Biol 11: 1074-1088, 2001; Friesen et al Mol Cell 7:1111-1117,2001) .
Neuere Befunde zeigen, dass auch spezielle hnRNPs (hnRNP-R und hnRNP-Qs) mit normalem SMN Proteinen intera- gieren, wahrend mutiertes SMN von Patienten mit spinaler muskulärer Atrophie (SMA) nicht an hnRNPs bindet (Mourela- tos et al. EMBO J 20:5443-5452,2001). Für diese speziellen hnRNPs wurde wiederum ihre Beteiligung an dem Splicing- Prozess der m-RNA belegt (Mourelatos et al EMBO J 20:5443-5452,2001) .
Mutationen oder Deletionen des Genes für SMN fuhren zur Reduktion von funktionellem SMN-Protein und somit zum Auftreten der spinalen muskulären Atrophie (SMA) , einer autosomalen rezessiven Muskelerkrankung, bei welcher durch eine progressive Degeneration der Motorneuronen eine fortschreitende Muskelschwache und Muskelatrophie entsteht. (Korinthenberg et al 1997 ; Melki, 1997) .
Die Kausalität ist in soweit belegt, als eine vermin- derte Expression von SMN zur Apoptose von Motoneuronen des Vorderhorns des Rückenmarkes und zur SMA (Crawford und Pardo 1996) fuhrt, und bei Mausen zur Degeneration von Motoneuronen fuhrt (Jablonka et al . , 2000).
Jedoch scheint trotz dieser Kausalität das SMN Protein kein Überlebensfaktor für Motoneurone zu sein, da eine Überexpression des normalen SMN Proteins Motoneuronen nicht vor Zelltod, beispielsweise verursacht durch Entzug von trophischen Faktoren, schützt (Cisterni et al Neurobiol Dis 8:240-251, 2001). Desweiteren ist es fraglich, ob bei der SMA der Splicing Prozess der mRNA in Motoneuronen beeinträchtigt ist (Jablonka et al 2000; Tucker et al 2001) . Trotz des Fortschritts im Verständnis der Funktion von SMN beim pre-mRNA-Splicing ist nur wenig über den Patho e- chanismus in der SMA bekannt. Es bleibt eine offene Frage, warum verringerte Mengen an funktionellem SMN-Protein in allen Geweben zu einem spezifischen Absterben von Motor- neuronen führen kann. Eine mögliche Erklärung könnte darin liegen, dass SMN zusätzliche Motorneuronen-spezifische Aufgaben erfüllt. Diese Funktion könnte auf der Interaktion mit Motorneuronen-spezifischen Proteinen basieren. SMN ist außer in nuklearen Strukturen auch im Zytoplasma von Motorneuronen, einschließlich der Dendriten und Axonen lokalisiert (Pagliardini et al . , 2000).
Die SMA gehört zu den neurodegenerativen Erkrankungen, die sich durch Degeneration von Nervenzellen auszeichnen. Hierzu zählen Alzheimer, diabetische Neuropathie, Multiple Sklerose und die Folgeerkrankungen der cerebralen Ischämie. Eine Prophylaxe oder Therapie dieser Erkrankungen ist derzeit, wenn überhaupt, nur eingeschränkt möglich. Neue Verfahren zur Suche nach Wirksubstanzen wie auch Wirksubstanzen zur Prophylaxe oder Therapie dieser Erkrankungen werden somit dringend benötigt.
Technisches Problem.
Der Erfindung liegt daher das technische Problem zu Grunde, ein Testsystem, mit welchem sich Wirkstoffe iden- tifizieren lassen, die sich zur Prophylaxe und/oder Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen und/oder Nervenschäden durch Verletzungen eignen, sowie solche Wirkstoffe anzugeben. Der Erfindung zu Grunde liegende Erkenntnisse.
Es wurde überraschend gefunden, 1) dass spezielle hnRNPs, genannt hnRNP-R und hnRNP-Q, obwohl sie im Organismus ubiquitar in Zellen anzutreffen sind, wahrend der Embryogenese im Ruckenmark am stärksten exprimiert werden, 11 ) dass hnRNP-R im wesentlichen im Zytoplasma von Motoneuronen lokalisiert ist, und zwar besonders m deren Axo- nen, geringer in Axonen von sensorischen Neuronen und m) dass die Überexpression von hnRNP-R oder von hnRNP-Q in Nervenzellen zu einem erheblich verstärkten Wachstum von Neuriten fuhrt.
Grundlage der Erfindung ist somit der überraschende Befund, dass die verstärkte Expression von heterogenen nuklearen Ribonukleoprotemen R und Q (hnRNP-R und hnRNP- Q) das Wachstum von Neuriten erheblich steigert/fordert.
Grundzuge der Erfindung und Ausfuhrungsbeispiele .
Zur Losung des o.g. technischen Problems lehrt die Erfindung ein Testsystem zur Suche oder Prüfung von Wirksubstanzen, welche das Wachstum und/oder das überleben von Nervenzellen beeinflussen, wobei eine Zelle m Kontakt gebracht wird mit mindestens einer prospektiven Wirksubstanz und nachfolgend in dieser Zelle zumindest eines der Ribonukleoproteine hnRNP-R und/oder hnRNP-Q und/oder eine Splicmg-Isoform von hnRNP-R und/oder von hnRNP-Q bestimmt und die ermittelte Menge dieses Ribonukleoprotems verglichen wird mit der Menge an diesem Ribonukleoprotem in einer Zelle, welche nicht mit der prospektiven Wirksubstanz in Kontakt gebracht wurde, die Verwendung des erfm- dungsgemaßen Testsystems für die Suche nach Wirkstoffen, welche das Wachstum und/oder Überleben von Nervenzellen anregen oder welche das Wachstum von Neuriten und/oder Axonen anregen, einen Wirkstoff erhaltlich mit einem erfindungsgemäßen Testsystem, wobei der Wirkstoff in einer Zelle, vorzugsweise einer humanen Zelle, insbesondere Nervenzelle, die Menge an vorzugsweise humanem hnRNP-R und/oder vorzugsweise humanem hnRNP-Q erhöht, die Verwendung des erfindungsgemäßen Testsystems für die Prüfung des Wachstums und/oder des Überlebens von Nervenzellen, sowie die Verwendung eines erfindungsgemäßen Wirkstoffes für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Förderung des Wachstums und/oder des Überlebens von Nervenzellen.
Die Sequenz von human hnRNP-R ist unter der Accessionnummer AF000364.1 bekannt. Eine neuere Version ist unter der Accessionnummer NM_005826 bekannt (siehe auch SEQ.-ID 33 für das Protein [p] und SEQ.-ID 34 für die hierfür co- dierende Nukleinsäure [n] ) . Sequenzen von human hnRNP-Q (3 Splicing Isoformen Ql, Q2 und Q3) sind unter den Accessionnummern AY034483, AY034482 und AY034481, respektive, bekannt (Ql[p]: SEQ.-ID 35, Ql [n] : SEQ.-ID 36, Q2[p]: SEQ.-ID 37, Q2[n]: SEQ.-ID 38, Q3[p]: SEQ.-ID 39, Q3 [n] : SEQ.-ID 40) . Die Sequenz von Maus hnRNP-R ist unter der Accessionnummer AF441128 bekannt (p: SEQ.-ID 41, n: SEQ.-ID 42). Die Sequenz von Maus hnRNP-Q ist unter der Accessionnummer AF093821 bekannt (p: SEQ.-ID 43, n: SEQ.-ID 44) . Grundsätzlich können die eingesetzten Zellen und/oder Ribonukleoproteine aus diversen Organismen stammen, beispielsweise muriner Herkunft sein oder aus Rodenten stammen. Bevorzugt ist es im Rahmen von unmittelbar human-relevanten Anwendungen der Erfindung, wenn das Ribonukleo- protein ein humanes Ribonukleoprotein und/oder die Zelle eine humane Nervenzelle ist. Die Zelle kann mesodermalen oder endodermalen und vorzugsweise humanem Ursprungs sein. Das Ribonukleoprotein kann mit einem hierfür spezifischen Antikörper oder Antikörperfragment nachgewiesen werden. Solche Antikörper sind beispielsweise erhältlich durch Immunisierung von Rodenten mit dem Ribonukleoprotein oder einer Teilsequenz hieraus. Anstelle eines Antikörpers kann auch ein Mimikrimolekül hierzu verwendet werden, i.e. eine synthetische Verbindung, die mit zumindest gleicher Spezi- fität an der gleichen Bindungstelle, wie die Bindungsstelle des Antikörpers bindet. Das Ribonukleoprotein kann auch durch den Nachweis seiner mRNA nachgewiesen werden. Dies kann mit Hilfe von Nukleotidsequenzen, welche mit der gesamten oder mit Teilen der Nukleotidsequenz von hnRNP-R oder von hnRNP-Q spezifisch hybridisieren, beispielsweise unter Anwendung der RT-PCR (Reverse-Transcriptase-Poly- chain-Reaction) . Von selbstständiger Bedeutung im Zusammenhang mit dem Nachweis von hnRNP-R oder hnRNP-Q ist, daß sich damit auch eine neurodegenerative Erkrankung diagnostizieren oder deren Verlauf kontrollieren läßt. Hierzu wird einem Organismus eine Gewebeprobe entnommen und Nervenzellen hieraus werden einer Analyse auf eines oder beide der genannten Ribonukleoproteine unterworfen, wie vorstehend beschrieben. Aus der Menge an bestimmtem Ribonukleoprotein ist dann ein Rückschluß auf das Vorliegen der Erkrankung möglich (niedriger Pegel) . Insofern eignen sich die erfin- dungsgemäßen Erkenntnisse zudem für die Untersuchung der Pathenogenese der Erkrankungen anhand beispielsweise von Rodenten.
Ein erfindungsgemäßer Wirkstoff erhöht die Menge an vorzugsweise humanem hnRNP-R und/oder vorzugsweise humanem hnRNP-Q (einschließlich aller Splicing Isoformen) . Ein solcher Wirkstoff kann eine Nukleinsäuresequenz kodierend für vorzugsweise humanes hnRNP-R oder für vorzugsweise humanes hnRNP-Q oder für ein Mimikripeptid hierzu enthalten. Solche Wirkstoffe können beispielsweise mittels viraler oder nicht-viraler Vektoren in die Zielzellen eingeführt werden. Ein Mimikripeptid zu einem der genannten Ribonukleoproteine ist ein Peptid, welches zu der gleichen Forderung des Wachstums von Neuriten und/oder Axonen fuhrt, wie das zu Grunde liegende Ribonukleoprotein. Dabei kann es sich um eine Nuklemsauresequenz kodierend für eine Teilsequenz des Ribonukleoprotems handeln, wobei optional Mutationen angebracht sind. Der Wirkstoff kann auch humanes hnRNP-R und/oder hnRNP-Q oder eine Mimikri- verbmdung hierzu enthalten. Zur Mimikriverbindung gilt das Vorstehende analog mit der Erweiterung, daß eine Mimi- kπverbmdung auch synthetisch hergestellt und nicht-na- turliche Aminosäuren aufweisen oder von nicht-peptidischer chemischer Struktur sein kann.
Ein erfmdungsgemaßer Wirkstoff kann insbesondere für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prophylaxe von neurodegenerativen Erkrankungen oder Nervenschaden durch Verletzungen oder Ver- giftungen, insbesondere Alzheimer, diabetische Neuropathie, multiple Sklerose und/oder Schädigungen nach cere- braler Ischämie, verwendet werden.
Beispiel 1: Auffindung von hnRNP-R und hnRNP-Q als Bin- dungspartner für SMN Protein.
Zur Isolierung von potentiellen SMN mteragierenden Proteinen wurde ein Yeast (Hefe) -2-Hybrιd Screen durchgeführt. Als "Köder" wurde eine cDNA verwendet, die für mu- rmes SMN von Exon 2b-7 kodiert (DiDonato et al . , 1997). Die cDNA wurde durch RT-PCR aus der RNA von Maushirn isoliert (PCR-Primer: Smn2bBHlup TTA TGG ATC CAT GCT CTA AAG AAC GGT GAC ATT TG, SEQ.-ID 1, und SmnBHllow AGA AGG ATC CCC ATC TCC TGA GAC AGA GCT G, SEQ.-ID 2) . Der N-termmale Teil wurde nicht verwendet, um gegen die Interaktion mit SIP-l/Gemιn2 zu selektionieren, welches sehr stark in dieser Region bindet und sonst im Screen häufig als schon bekannter Interaktionspartner isoliert worden wäre. Die cDNA wurde durch Linker-PCR m das Plasmid pAS2-l (Clontech, Palo Alto, CA 94303) hinter die DNA-Bmdedomane von GAL4 kloniert (PCR-Primer: Smn2bBHlup TTA TGG ATC CAT GCT CTA AAG AAC GGT GAC ATT TG, SEQ.-ID 3, und SmnBHllow AGA AGG ATC CCC ATC TCC TGA GAC AGA GCT G SEQ.-ID 4) . Der Screen wurde mit den Hefestammen CG1945 und Y190 (Reportergene lacZ und HIS3, Clontech) gemäß den Instruktionen des Herstellers durchgeführt. Nach Transformation mit SMN m pAS2-l (Selektionsmarker TRP1, Clontech) und der cDNA- Bibliothek (aus Mausehirn, in pACT2, Selektionsmarker LEU2, Clontech) wurden die Transformanten in hoher Dichte auf synthetische Komplettmedium (SC-Medium, nach dem Protokoll von Clontech) ohne Tryptophan und Leucin plattiert, um auf das Vorhandensein beider Plasmide zu selektionieren. Danach wurden die Kolonien von den Platten geschabt und auf SC-Medium ohne Tryptophan, Leucin und Histidm plattiert, um auf d e Expression des HIS3 Reportergens zu selektionieren. Als metabolischer Inhibitor von niedriger HIS3 Expression Aktivität wurde 5mM 3-AT (3-Ammo-l, 2, 4- Tπazol ist ein kompetitiver Inhibitor des vom HIS3-Gen codierten Enzyms. Durch Zugabe von 3-AT kann die Empfindlichkeit des Screens reguliert werden) zugesetzt. Die Inserts der cDNA-Bibliothek wurden mit PCR aus frischen Kolonien a pliflziert, mit dem Restriktionsenzym BsuRI (=HaeIII) (MBI Fer entas, Vilnius 2028, Litauen) geschmt- ten und gemäß ihrem Restriktionsmuster in Gruppen sortiert. Aus jeder Gruppe wurden einzelne Plasmide ber Transformation in Escherichia coli und Aufreinigung daraus isoliert und sequenziert. Durch Re-Transformation in Hefe zusammen mit dem Smn-Konstrukt wurde die Aktivierung der HIS3 und LacZ Reportergene bestätigt. Unter den potentiellen Interaktionspartnern von S n befanden sich zwei Klone, welche für die C-terminale Region von hoch-homologen Pro- teinen kodierten. Beide Proteine (hnRNP-R und hnRNP-Q) gehören zur Klasse der heterogenen nuklearen Ribonukleo- proteinen (hnRNPs) . Homologe Sequenzen wurden zuvor in humanen Zellen als hnRNP-R (Hassfeld et al . , 1998) und (in Maus, Genbank Acc. Nr. AF093821) als gry-rbp (=hnRNP-Q) beschrieben.
Beispiel 2: Klonierung von hnRNP-R und hnRNP-Q und Expression der Proteine
Die für den vollständigen offenen Leserahmen kodieren- de cDNA von hnRNP-R und hnRNP-Q/gry-rbp wurde durch RT-PCR von RNA aus Maushirn isoliert. Die Primer dafür basieren auf der Sequenz aus der Datenbank (Genbank) . Für hnRNP-R wurde zuvor die 5' Sequenz durch 5' RACE (5' RACE Kit, Clontech) bestimmt. hnRNP-R und -Q wurden durch Linker-PCR (=PCR mit in den Primern kodierten Restriktionsschnitt- stellen) amplifiziert und in den Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, California 92008, USA) kloniert (PCR-Primer: hnrnpr-HA-up AGA GGT ACC ACC ATG GGC TAC CCC TAC GAC GTG CCC, SEQ.-ID 5, rnp-Xba-low ATA TCT AGA CTA CTT CCA CTG CCC ATA AGT ATC, SEQ.-ID 6, gry-rbp-HA-up AGA GGT ACC ATG TAC CCC TAC GAC GTG CCC GAC TAC GCC ATG GCT ACA GAA CAT GTT, SEQ.-ID 7, gry-Eco-low ATA GAA TTC TAC TTC CAC TGC CCA AAA G, SEQ.-ID 8) . Die Expression der Proteine wurde durch Westernblot-Analyse mit spezifischen Antiseren und Antikörpern gegen das N-terminal angefügte Haemagglutinin (HA)-Epitoρ (HA-Tag) nachgewiesen. Beispiel 3: Spezifische Bindung des SMN-Protems mit hnRNP-R und hnRNP-Q
Um eine spezifische Bindung des SMN-Protems mit hnRNP-R und hnRNP-Q m Saugerzellen nachzuweisen, wurden Co-Immunprezipitationen durchgeführt. Dazu wurden eine Zelllinie, und zwar die humane embryonale Nierenzelle HEK293 (ATCC, Manassas, VA 20108, USA) mit Expressions- plasmiden enthaltend die cDNAs von mit dem FLAG-Tag fusionierten. Smn und hnRNP-R bzw. hnRNP-Q co-transflziert . 48h nach der Transfektion wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit Lysepuffer (20mM Tris pH 7.4, 137mM NaCl, 10% Gly- cerol, 1% Triton X-100 2mM EDTA, 50mM Na-ß-Glycerophos- phat, 20mM Na-Pyrophosphate, Proteasemhibitoren) lysiert, um Proteinextrakte herzustellen. lOOμl Anti-hnRNP-R und Anti-hnRNP-Q Antiserum (Antiseren, welche durch Immunisierung von Kaninchen mit den N-termmalen Peptiden mit der Sequenz: MANQVNGNAVQLKEEEEP, SEQ.-ID 9, und MA- TEHVNGNGTEEPMDTT, SEQ.-ID 10, hergestellt wurden) wurde mit ProtemA Agarose (Röche) in Lysepuffer inkubiert. Die- se Suspension wurde mit lOOμg Proteinextrakt über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Immunprazipitate wurden dreimal mit Lysepuffer gewaschen und in Laemmlipuffer (Laemmli, 1970) aufgekocht. Die Extrakte wurden auf 10%ιgen SDS-Polyacry- lamidgelen aufgetrennt und auf Nitrozellulose-Membrane geblottet. Unspezifische Bindungssteilen wurden durch Inkubation mit 5% Milchpulver in TBS-T (20 mM Tris-Cl, pH 7.6, 137 mM NaCl, 0,2% Tween20) blockiert. Die Membrane wurden mit monoklonalem Anti-Smn Antikörper (Dianova, D-20148 Hamburg, Deutschland) oder Anti-FLAG-Tag Antikor- per (Sigma, St. Louis , MO 63103) inkubiert. Diese wurden mit spezifischen HRP-gekoppelten Sekundarantikorpern mittels Chemilummeszenz (ECL, Amersham) nach den Angaben des Herstellers detektiert. Dabei zeigte sich, dass bei der Immunpräzipitation von hnRNP-R und hnRNP-Q das SMN-Protein Co-Immunpräzipitiert wurde.
Beispiel 4: Fehlende Bindung an hnRNP-R und an hnRNP-Q von mutierten SMN-Proteinen entsprechend den SMN-Proteinen von SMA-Patienten
In SMA-Patienten ist eine Reihe von Mutationen im SMN- Gen identifiziert worden, welche die Funktion von SMN beeinträchtigen (E134K, S262I, T274I, Y272C, G279V, Dexon7, Dexon5, Dexon5 und 7, ; Rodrigues et al., 1995; Hahnen et al. 1997; Lefebvre S. et al., 1995; Talbot et al. 1997; Bussaglia et al. 1995; DiDonato et al . 1997; Wirth et al . 1999) . Im Rahmen der Erfindung wurden Konstrukte hergestellt, welche die entsprechenden Mutationen in der muri- nen SMN cDNA Sequenz enthalten. Deletions- und Punktmutationen wurden in SMN durch die auf PCR basierende "spli- cing by overlap extension" Methode (Lefebvre B. et al . , 1995) durch verschiedene Mismatch-Primer eingefügt (PCR- Pri er: Smn 5' GGA AGC TTA TGA TAA AGC TGT GGC TTC, SEQ.-ID 11, Smn 3' CGC GGA TCC TTT TAT TTA ATT CTA AAG GCA TTA ATA AAA ATC TTG, SEQ.-ID 12, Ex6msmnf272 GAG TGG CTG CCA CAC TGG CTA C, SEQ.-ID 13 Ex6msmnr272 AGT AGC CAG TGT GGC AGC CAC TC, SEQ.-ID 14, Ex6/8msmnf CCA CAC TGG CTA CTA TAT GGT TCA GCT CTG TCT CAG G, SEQ.-ID 15, Ex6/8msmnr CCT GAG ACA GAG CTG AAC CAT ATA GTA GCC AGT GTG, SEQ.-ID 16, E134Kf GGA TAT GGA AAC AGA AAG GAG CAA AAC TT, SEQ.-ID 17, E134Kr AAG TTT TGC TCC TTT CTG TTT CCA TAT CC, SEQ.-ID 18, s262if TAG CAT AAT GCC CAG GGC ATC, SEQ.-ID 19, s262ir GAT GCC CTG GGC ATT ATG CT , SEQ.-ID 20, t274if GAG TGG CTA CCA CAT TGG CTA C, SEQ.-ID 21, t274ir AGT AGC CAG TGT GGC AGC CAC TC, SEQ.-ID 22, Ex7msmnf279 GGC TAC TAT ATG GGT TTC AG, SEQ.-ID 23, Ex7msmnr279 CTG AAA ACC ATA TAG TAG CC, SEQ.-ID 24, Ex4/6msmnf AGG ATT AGG ACC AGG AAA GAT AAT CCC GCC ACC CCC TCC, SEQ.-ID 25, Ex4/6msmnr AGG GGG TGG CGG GAT TAT CTT TCC TGG TCC TAA TCC TG, SEQ.-ID 26) . Dazu wurde die cDNA entsprechend dem Exon 2b- Exon 7 in die Hindlll und BamHI Schnittstellen des Plasmids Bluescript (Stratagene, La Jolla , CA 92037-1073, USA) kloniert. Diese cDNA wurde als Matrize für weitere PCR-Amplifikationen mit den Mismatch-Primern verwendet. Die fehlende Bindung an hnRNP-R und an hnRNP-Q von mutierten SMN-Proteinen entsprechend den SMN-Proteinen von SMA-Patienten wurde durch Co-Immunpräzipitationsexperimente gezeigt. HEK293-Zellen wurden mit Expressionsvektoren mit den cDNAs von hnRNP-R bzw. hnRNP-Q und Expressionsvektoren mit den mutierten SMN cDNAs transfiziert . Die Reinigung und Detektion der Immun- präzipitate erfolgte wie oben beschrieben. Das Resultat zeigte, dass nur Wildtyp-SMN, nicht jedoch die mutierten Versionen dieses Proteins durch hnRNP-R und -Q coimmunprä- zipitiert werden konnte.
Beispiel 5: Nachweis von hnRNP-R und hnRNP-Q in Nerven- zellextrakten mit Hilfe von spezifischen Antikörpern oder RT-PCR
Zum Nachweis von hnRNP-R und hnRNP-Q in Zellextrakten wurden verschiedene Gewebe aus adulten Mäusen und das Rük- kenmark aus Mäusen verschiedener Entwicklungsstadien iso- liert und in RIPA-Puffer (50mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.5% NA-Deoxycholat, 0.1% SDS) homogenisiert. Die Proteinkonzentration wurde mittels Bio-Rad Protein Assay Kit (Bio-Rad, Hercules , CA 94547, USA) bestimmt. Die Extrakte wurden mit den gleichen Volumina Laemmli-Puffer (125 mM Tris pH 6.8, 4% SDS, 10% ß-mercap- toethanol, 20% glycerol, 0.004% bromophenol blue) vermischt, durch Aufkochen denaturiert und bei-20°C gelagert. Die Extrakte wurden auf 10%igen Polyacrylamid-Gelen aufgetrennt, und auf Nitrozellulose-Membranen transferiert. Unspezifische Bindungsstellen wurden durch Inkubation mit 5% Milchpulver in TBS-T (0,2% Tween20) blockiert. Als Primarantikorper wurde das Kaninchen Antiserum gegen das N-terminale Peptid von hnRNP-R bzw. hnRNP-Q in einer Verdünnung von 1/1000 m 5% Milchpulver in TBS-T verwendet. Als Kontrolle wurden pra-absorbierte Antikörper verwendet. Dazu wurden die Antiseren mit den für die Generierung der Antikörper verwendeten Peptiden inkubiert und und diese Komplexe abzentπfugiert . Die Antiseren wurde mit den Membranen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und danach dreimal 15 Minuten mit TBS-T gewaschen. Als Sekundarantikorper wurden HRP-gekoppelte Ziegen-Anti-Ka- nmchen Antikörper (Röche, Mannheim) einer Verdünnung von 1/10000 in TBS-T +5% Milchpulver verwendet. Nach 1 Stunde Inkubation wurden die Membranen dreimal gewaschen und mit dem Detektionsreagens (ECL, Amersham) für 1 Minute inkubiert. Chemilumineszenz wurde durch Exponierung mit Rontgen-Filmen sichtbar gemacht. Es zeigte sich, dass hnRNP-R und hnRNP-Q den meisten neuralen und nicht- neuralen Geweben exprimiert wird. HnRNP-R wurde insbesondere in Hirn, aber auch im Ruckenmark, Herz, Lunge, Leber und Milz detektiert. HnRNP-Q zeigte die stärkste Expression Hirn, Lunge und Leber. Im Ruckenmark ist die Expres- sion entwicklungsspezifisch reguliert. Der Vergleich der Expression embryonalen (embryonaler Tag 14 und 19) und geborenen Mäusen (postnataler Tag 2 und 15 und adult) zeigte für beide Proteine die stärkste Expression im spaten Embryonalstadium (E19) mit rapider Abnahme nach der Geburt. Um auch die Transkriptmengen zu bestimmen, wurde RT-PCR verwendet. Aus adulten Mausen wurden verschiedene Gewebe und aus Mausen verschiedener Entwicklungsstadien das Ruckenmark entnommen. Die RNA wurde mit dem TRIZOL- Reagens (LifeTechnologies, Rockville , MD 20849-6482, USA) isoliert. RT-PCR wurde mit spezifischen Primer-Paaren für hnRNP-R, hnRNP-Q und ß-Aktin (als Kontrolle) durchgeführt, (ß-actin-s GTG GGC CGC CCT AGG CAC CAG, SEQ.-ID 27, ß- actm-as CTC TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC, SEQ.-ID 28, RNP1F ATG GCT AAT CAG GTG AAT GGT AAT G, SEQ.-ID 29, RNP282R AGTA CAG ACA GAG TCC CTT CCT C, SEQ.-ID 30, grylF ATG GCT ACA GAA CAT GTT AAT GG, SEQ.-ID 31, gry273R AGC ACT GCC AAT GCG CCG TCT TC, SEQ.-ID 32) . Das Resultat be- statigte die Ergebnisse der Westernblotanalyse zur Expression verschiedenen Geweben. Jedoch lassen ähnliche Transkriptmengen im embryonalen und postnatalen Ruckenmark darauf schließen, dass auch posttranslationale Mechanismen der Regulation vorliegen.
Beispiel β: Spezifischer Nachweis von hnRNP-R und hnRNP-Q und von SMN im Ruckenmark mit Hilfe von Antikörpern.
Um die mögliche funktionelle Beziehung zwischen hnRNP- R bzw. -Q mit SMN naher zu untersuchen, wurde die Lokali- sation der Proteine im Ruckenmark untersucht. Histologi- sche Schnitte des Ruckenmarks adulter Mause wurde mit Antiserum gegen hnRNP-R und Anti-SMN Antikörpern gefärbt. Das lumbale Ruckenmark von 1 Jahr alten C57Bl/6-Mausen wurde isoliert, das L4-Segment wurde identifiziert und in Tissuetec (Sakura, Torrance , CA 90504, USA) eingefroren. Gefrierschnitte (10 μm) wurden mit TBS-T mit 10% BSA 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde ein onoklonaler Antikörper gegen Maus Smn (Dianova, D-20148 Hamburg, Deutschland) einer Konzentration von 1 μg/ml oder ein monoklonaler Antikörper gegen phosphoryliertes- Tau-1 (Klon PC1C6 Boehrmger Mannheim) in einer Konzentration von 10 μg/ml und Antiserum gegen hnRNP-R (1:1000) zugegeben. Die Schnitte wurden dreimal mit TBS-T gewaschen, mit Sekundärantikörper inkubiert (Cy3TM-konjug- ierten Ziege Anti-Kaninchen IgGs, Dianova, D-20148 Hamburg, Deutschland und Alexa488-konjugiertem Ziege AntiMaus IgG, Molecular Probes, Eugene , OR 97405-9165), noch- mals dreimal gewaschen und in Mowiol (Hoechst, D-6320 Frankfurt, Deutschland) eingebettet. Immunoreaktivität wurde mit einem Konfokalmicroskop (Leica, Wetzlar, Deutschland) nachgewiesen. Im Cytoplasma und in Neuriten von Motorneuronen war eine Co-Lokalisation von hnRNP-R und SMN feststellbar.
Beispiel 7: Spezifischer Nachweis von hnRNP-R und hnRNP-Q und von SMN in Axonen kultivierter Motorneuronen und in den Axonen verschiedener Nerven mit Hilfe von Antikörpern Um die spezifische Färbung in den Neuriten der Motorneuronen zu untersuchen, wurden kultivierte murine embryonale Motorneuronen durch Immunohistσchemie untersucht. Trächtige Mäuse (14 Tage p.c.) wurden durch cervikale Dislokation getötet. Die Embryos wurden aus dem Uterus ent- nommen und dekapitiert. Der ventro-laterale Bereich des lumbalen Rückenmarks wurde isoliert und in HBSS + lOμM b-Mercaptoethanol transferiert. Nach Behandlung mit Tryp- sin (0.05%, 10 min.), wurde das Gewebe zerkleinert und die Zellsuspension durch eine Nylonmembran (lOOμm Porengröße) gefiltert. Spinale Motorneuronen wurden auf, mit Antikörpern gegen den p75 Neurotrophinrezeptor beschichteten Kulturschalen isoliert. Die Zellen wurden in einer Dichte von 3000 Zellen/cm2 in 4-Well Kulturschalen (Greiner, Lake Mary , FL 32795, USA) ausplattiert, welche mit Polyor- nithin und Laminin beschichtet worden waren. Die Zellen wurden in Neurobasalmediu (Life Technologies, Rockville , MD 20849-6482, USA) mit Serum, 500uM Glutamax und 50μg/ml Apotransferrin bei 37 °C in einem Inkubator bei 5% C02 kultiviert. 50% des Mediums wurde jeden zweiten Tag durch frisches ersetzt. Die kultivierten Motorneuronen wurden nach 7 Tagen in Azeton/Methanol (1:1) fixiert und mit Antikörpern gegen phosphoryliertes Tau-Protein in einer Kon- zentration von lμg/ml und polyklonalem Antiserum gegen hnRNP-R (1:1000) inkubiert, nachfolgend dreimal mit TBS-T gewaschen, mit Sekundärantikörper inkubiert (Cy3TM-konjug- ierter Ziege Anti-Kaninchen IgG, Dianova, und Alexa488- konjugiertem Ziege Anti-Maus IgG, Molecular Probes) , noch- mals dreimal gewaschen und in Mowiol eingebettet. Immunoreaktivität wurde mit einem Konfokalmikroskop (Leica) nachgewiesen. Interessanterweise zeigte sich, dass ein Neurit jedes Motorneurons stärker angefärbt war, als die anderen. Um zwischen Axonen und Dendriten unterscheiden zu können wurden die fixierten Motorneuronen mit einem Axon- spezifischen Marker angefärbt, und zwar einem monoklonalem Antikörper spezifisch für phosphoryl- iertes-Tau-1 (Klon PC1C6) . Dabei zeigte sich, dass überwiegend die Axone gefärbt waren. Um die axonale Lokalisation von hnRNP-R in vivo nachzuweisen, wurden Sektionen des Ischiasnervs mit Anti-hnRNP-R Antiserum und monoklonalem Anti-Smn Antikörper analog zu den Färbungen des Rückenmarks angefärbt. Eine starke hnRNP-R spezifische Färbung konnte in Axonen, nicht jedoch den umliegenden Schwannzellen gefunden wer- den. Die Färbung von anderen Nerven, wie dem Nervus phre- nicus, Nervus facialis und Nervus perinealis bestätigten die axonale Lokalisation. Die stärkere Färbung in N. phre- nicus und N. facialis lässt auf eine Expression vorwiegend in motorischen Nerven schließen.
Beispiel 8: Transfektion von Nervenzellen mit Nukleotidsequenzen, kodierend für hnRNP-R oder hnRNP-Q, verstärktes Wachstum der Axone PC-12 Zellen wurden mit Expressionskonstrukten (siehe "Klonierung von hnRNP-R und hnRNP-Q und Expression der Proteine") für hnRNP-R und hnRNP-Q transfiziert . Den entsprechenden Genen sind Nukleotidsequenzen kodierend für Häemagglutin (HA) angefügt. Die Expressionsplasmide enthalten ein Neomycin-Resistenzgen. Durch Zugabe von G418 (^Antibiotikum zur Selektion Neomycin-resistenter Klone, Life Technologies, Rockville , MD 20849-6482, USA) wurden stabile Zelllinien selektioniert, welche das Expressions- plasmid mit dem Antibiotikaresistenzgen integriert hatten. Durch Westernblotanalyse mit Anti-HA-Tag Antikörpern wurden Klone identifiziert, welche stabil hnRNP-R bzw. hnRNP- Q exprimierten. Diese stabilen Zelllinien wurden durch Wachstum in Medium mit geringem Serum-Gehalt (2% fetales Kälberserum, 4% Pferdeserum statt 5%+10%) und die Zugabe von lOng/ml Nerve-Growth Faktor (NGF) zur Differenzierung und dem Auswachsen von Neuriten angeregt. 7 Tagen nach Differenzierung wurden die Zellen mit Azeton/Methanol (1:1) fixiert und durch Immunzytochemie mit Anti-Map2 (färbt das Microtubuli-assoziierte Protein 2 und damit Dendriten und Axone an) und Anti-phosphoryliertes-Tau Antikörper (färbt vor allem Axone) angefärbt. Die Länge der Neuriten in einer Vergleichszellinie und in den stabilen hnRNP-R oder -Q exprimierenden Zelllinien wurde an einge- scannten Bildern mittels des Programms Scionlmage (Firma- Scion Corporation, Frederick , MD 21701, USA) gemessen und verglichen. Die stabil hnRNP-R und hnRNP-Q exprimierenden Zelllinien (je 2) zeigten im Vergleich zur Kontrolle ein 5 bzw. 4,5-fach verstärktes Auswachsen der Neuriten.
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Claims

Patentansprüche
1. Testsystem zur Suche oder Prüfung von Wirksubstanzen, welche das Wachstum und/oder das Überleben von Ner- venzellen beeinflussen, wobei eine Zelle in Kontakt gebracht wird mit mindestens einer prospektiven Wirksubstanz und nachfolgend in dieser Zelle zumindest eines der Ribonukleoproteine hnRNP-R und/oder hnRNP-Q und/oder eine Splicing-Isoform von hnRNP-R und/oder von hnRNP-Q bestimmt und die ermittelte Menge dieses Ribonukleoproteins verglichen wird mit der Menge an diesem Ribonukleoprotein in einer Zelle, welche nicht mit der prospektiven Wirksubstanz in Kontakt gebracht wurde.
2. Testsystem nach Anspruch 1, wobei das Ribonukleopro- tein ein humanes Ribonukleoprotein ist.
3. Testsystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Ribonukleoprotein mit einem Antikörper oder Antikörperfragment nachgewiesen wird.
4. Testsystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Ribonu- kleoprotein durch den Nachweis seiner mRNA nachgewiesen wird.
5. Testsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zelle eine Nervenzelle, vorzugsweise eine humane Nervenzelle, ist.
6. Testsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welchem die Zelle mesodermalen oder endoder alen und vorzugsweise humanem Ursprungs ist.
7. Verwendung des Testsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Suche nach Wirkstoffen, welche das Wachs- turn und/oder Überleben von Nervenzellen anregen.
8. Verwendung des Testsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Suche nach Wirkstoffen, welche das Wachstum von Neuriten und/oder Axonen anregen.
9. Wirkstoff erhältlich mit einem Testsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Wirkstoff in einer Zelle, vorzugsweise einer humanen Zelle, insbesondere Nervenzelle, die Menge an vorzugsweise humanem hnRNP-R und/oder vorzugsweise humanem hnRNP-Q erhöht.
10. Wirkstoff nach Anspruch 9, enthaltend eine Nukle - sauresequenz kodierend für vorzugsweise humanes hnRNP-R oder für vorzugsweise humanes hnRNP-Q oder einem Mimikri- peptid hierzu.
11. Wirkstoff nach Anspruch 9, enthaltend vorzugsweise humanes hnRNP-R und/oder hnRNP-Q oder eine Mimikπverbm- dung hierzu.
12. Verwendung des Testsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Prüfung des Wachstums und/oder des Uberle- bens von Nervenzellen.
13. Verwendung eines Wirkstoffes nach einem der Ansprüche 9 bis 11 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Forderung des Wachstums und/oder des Überlebens von Nervenzellen.
14. Verwendung eines Wirkstoffes nach einem der -Ansprü¬ che 9 bis 11 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Diagnose und/oder Behandlung und/oder Prophylaxe von neurodegenerativen Erkrankungen oder Nervenschaden durch Verletzungen oder Vergiftungen, msbeson- dere Alzheimer, diabetische Neuropathie, multiple Sklerose und/oder Schädigungen nach cerebraler Ischämie.
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