EP1432732A2 - Composition pharmaceutique comprenant un agent modulateur de l'etat de polymerisation de l'actine - Google Patents

Composition pharmaceutique comprenant un agent modulateur de l'etat de polymerisation de l'actine

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Publication number
EP1432732A2
EP1432732A2 EP02745538A EP02745538A EP1432732A2 EP 1432732 A2 EP1432732 A2 EP 1432732A2 EP 02745538 A EP02745538 A EP 02745538A EP 02745538 A EP02745538 A EP 02745538A EP 1432732 A2 EP1432732 A2 EP 1432732A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
zyxin
cell
expression
cells
pharmaceutical composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02745538A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Christian Auclair
Valérie AMSELLEM
Martial Hervy
Frédéric SUBRA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Gustave Roussy (IGR)
Bioalliance Pharma SA
Ecole Normale Superieure de Cachan
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Gustave Roussy (IGR)
Bioalliance Pharma SA
Ecole Normale Superieure de Cachan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut Gustave Roussy (IGR), Bioalliance Pharma SA, Ecole Normale Superieure de Cachan filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1432732A2 publication Critical patent/EP1432732A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Definitions

  • the present invention relates to the field of oncology, it is based on observations of the modification of certain cellular phenotypic characteristics linked to the structure of the cytoskeleton, such as adhesion and motility, of cells when said cells evolve towards a phenotype. tumor.
  • the invention is based on the correlation observed by the applicant between the under-expression of genes involved in the stabilization of the actin network of the cytoskeleton of cells, such as for example the under-expression of the zyxin gene and the phenotypic transformation d 'a normal phenotype versus a tumor phenotype of said cells.
  • the invention is also based on the demonstration, thanks to the experimental work carried out, that the administration of a pharmaceutical composition capable of stabilizing the actin network of the cytoskeleton of the cell, such as for example compounds inducing the overexpression of the discomfort of zyxin in a cell comprising a tumor phenotype causes the phenotypic reversion of said cell to a normal phenotype.
  • the subject of the invention is the identification of compounds capable of modulating the state of polymerization of actin and the use of said compounds for the preparation of medicaments useful for the diagnosis, prevention and / or treatment of pathologies tumor.
  • Such compounds capable of stabilizing the actin network can for example be inhibitors of cofilin which is an enzyme known for its action on the depolymerization mechanism of actin F, in its active form (dephosphorylated cofilin) it induces rupture of propellers and promotes depolymerization of actin F.
  • the lines must have a well-characterized phenotype. They must have an immortal non-tumor phenotype and the malignant transformation of the immortal lines should be induced by a single genetic event. Finally, we must be able to easily obtain phenotypic revertants.
  • tumor phenotypes induced by oncogenic fusion proteins such as BCR-Abl, PML-RAR which lead to leukemic phenotypes as well as EWS-Fli-
  • Ewing's sarcoma is a neuroectodermal tumor which is characterized by a chromosomal translocation involving the ql2 band of chromosome 22 reworked with the q24 band of chromosome 11: t (ll; 22) (q24; ql2) (Turc-Carel et al., 1984) leading to the formation of a chimeric gene associating the protooncogene EWS with a member of the ETS family of genes.
  • the breakpoints associated with the majority translocation t (ll; 22) are located in a region of 7 kb belonging to the EWS gene for chromosome 22 and a region of 50 kb belonging to FLI-1 for chromosome 11 (Zucman et al. ., 1993).
  • the result of this chromosomal translocation generates a derivative of chromosome 22 where the 5 'part of the EWS gene is associated with the 3' part of the FLI-1 gene (Delattre et al., 1992).
  • the fusion gene expresses the chimeric protein
  • EWS-FLI-1 with oncogenic properties.
  • the chimeric protein EWS-Fli-1 is capable of. transform murine fibroblasts of NIH3T3 type in culture (Ohno et al., 1993) and induce tumors in "nude” mice.
  • the association of the N-terminal domains of EWS and C-terminal of FLI-1 is necessary for its transforming power (March et al., 1993).
  • a study model has been developed consisting on the one hand of normal murine NIH3T3 fibroblasts, non-tumor immortals and on the other hand of fibroblasts expressing the EWS-Fli-1 fusion protein in a constitutive way and presenting a tumor phenotype in nude mice.
  • This pair of cells makes it possible to carry out an evaluation of the differential expression characterizing the acquisition of the tumor phenotype.
  • phenotypic revertants were obtained by infecting the transformed cells with retroviral vectors coding for antisense RNAs directed against the oncogenic fusion gene.
  • a second pair of cells tumor cells / non-tumor revertant cells was thus obtained and could be the subject of a differential expression study.
  • the immunostaining of actin filaments on fibroblasts shows that the malignant transformation of said fibroblasts mediated by a chimeric protein EWS-Fli-1 results in a profound modification of the morphology of fibroblasts with in particular a reduction in focal points. This is accompanied by a reshaping of the cytoskeleton and in particular of the polymerized actin networks.
  • the tumor phenotype is influenced by the level of expression of zyxin and that the under-expression of the zyxin gene is a sufficient condition to transform a normal fibroblast into a tumorigenic ibroblast.
  • zyxin is a protein comprising LIM domains present in the focal adhesion plates of fibroblasts and the lamellipods of higher eukaryotic cells. These LIM motifs, in the form of a zinc finger, are involved in protein-protein interactions. (Scheimechel et al. 1994. "The LIM domain a new structural motif found in zinc-printer-like proteins”. Trends Genêt. 10: 315-320.
  • Zyxin is involved in regulating the polymerization of actin filaments and has structural and functional properties in common with ActA from Listeria (Golsteyn et al., 1997). Zyxin is supposed to act as an anchoring intermediary between the plasma membrane via ⁇ -actinin and the integrins and actin filaments. It is clearly involved in the architecture of the cytoskeleton, adhesion and cell motility (Crawford and Beckerle, 1991). Structurally, zyxin comprises an N-terminal region rich in proline, a nuclear export signal peptide (NES), as well as regions rich in amino acids Histidine and Cysteine forming the LIM motifs in the C-terminal part. (Sadler et al. 1992. "Zyxin and cCRP: Two interactive LIM domain proteins associated with the cytoskeleton". J.Cell.Biol. 119: 1573-1587).
  • NES nuclear export signal peptide
  • the mechanism of zyxin-dependent tumorigenesis involves changes in motility, adhesion and signaling related to cell-cell and cell-extracellular matrix interactions.
  • the object of the invention is to provide new pharmaceutical compositions for the treatment and prevention of cancers comprising compounds capable of stabilizing the actin network of the cytoskeleton of a cell for the preparation of a medicament intended for the treatment or cancer prevention.
  • a composition according to the invention is capable of restoring a non-tumor phenotype unlike most of the compositions of the prior art which destroy st cells are therefore capable of inducing side effects.
  • the present invention therefore relates to a pharmaceutical composition for the treatment, prevention or diagnosis of a tumor pathology, characterized in that it comprises an active agent capable of stabilizing the actin network of the cytoskeleton of a selected cell in the group comprising: - the protein zyxin
  • nucleic acid molecule comprising or consisting of the zyxin gene, a fragment thereof or their complementary sequence, or an antisense nucleic acid thereof, a cell or a set of cells overexpressing the gene zyxin or a protein encoded by a fragment thereof.
  • zyxin fragment is understood to mean any polypeptide fragment thereof capable of conserving the biological function of zyxin and in particular its function of stabilizing the actin network of the cytoskeleton.
  • fragment of the zyxin gene is intended to mean any fragment of the nucleic acid of zyxin and in particular the cDNAs of said gene coding for zyxin and / or the various functional domains thereof, such as those coding for:
  • zyxin gene any nucleic acid chemically modified, or by genetic recombination but retaining the function of said gene, in particular its capacity to code for a polypeptide, when it is expressed in an appropriate host, which retains biological functions of the protein zyxin and in particular its function of stabilizing the actin network of the cell cytoskeleton.
  • modifications include, for example, modification, addition or removal of bases, by fusion with other acids nucleic acids, such as, for example, regulatory elements, or chimeric molecules comprising heterologous cDNAs obtained by fusion of the corresponding cDNAs according to techniques known to those skilled in the art.
  • zyxin protein means any polypeptide modified, for example chemically by association with functional chemical groups, said functional chemical groups being chosen from groups capable of coupling said protein or a fragment thereof. to other molecules, such as, for example, markers, of carrier proteins for the production of an immunogen, enzymes, either on solid supports, such as mineral supports, or organic polymers.
  • a first embodiment of the invention relates to a pharmaceutical composition comprising the protein zyxin or a functional fragment thereof.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises the protein zyxin or functional fragments thereof associated with transport vectors chosen from the group comprising:
  • lipid systems such as anionic or neutral liposomes, and in particular liposomes based on phosphatidylcholoine (PC) or dioleylphosphatidylcoline (DPE), cationic liposomes, in particular liposomes based on dioctadecyldimethylam onium bromide (diodylylpropyl bromide) trimethylammonium (DOTMA), DOGS (Transfectam ® ), DDPPES etc., cationic emulsions such as emulsions based on soybean oil and 1,2 diolcoyl-glycero-3-trimethylammonium propane (DOTAP), etc.
  • DOTAP 1,2 diolcoyl-glycero-3-trimethylammonium propane
  • microparticles based on co-glycolide polydactide acid) PLAG, cetylmethylammonium bromide (PLG-CTAB), PLG-PEI, or microparticles based on PLG-poly-L -Lysine etc., i.e. nanoparticles based on chitosan, nanoparticles of PLG, gelatin, etc.
  • - cationic polyene antibiotics such as cationic derivatives of Amphotericin B.
  • zyxin is associated with said intracellular transport vectors by covalent or non-covalent chemical bonds.
  • the pharmaceutical composition comprises a nucleic acid comprising a cDNA of the zyxin gene, a fragment or a derivative thereof associated with a viral recombinant expression vector or with a non-viral transport vector of particulate type.
  • association between the active agent and the transport vector means either the fixing of said active agent to the transport vector, such as for example by non-covalent bonds, for example of hydrophobic type, or by covalent chemical bonds by means of coupling agents or not, according to techniques well known in the art.
  • person skilled in the art that is to say the insertion of said active compound into a viral or bacterial recombinant expression vector.
  • the active compound is brought to its target either by infection with viral particles expressing said active compound, or by transfection with recombinant expression vectors capable of expressing the active compound during their integration into said host cell.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises a recombinant viral expression vector comprising elements necessary for transcriptional control as well as for controlling the translation of the sequence of a cDNA of the zyxin gene when said expression vector is introduced into target cells.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises a recombinant viral expression vector comprising regulatory sequences, such as constitutive or inducible promoters, or even non-coding sequences of the zyxin gene, allowing the expression of zyxin in the cells of the host to which the composition of the invention is administered.
  • regulatory sequences such as constitutive or inducible promoters, or even non-coding sequences of the zyxin gene
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises a recombinant viral expression vector comprising regulatory sequences chosen from LTR sequences, such as for example the LTR sequences of the Moloney leukemia virus, under the dependence of a promoter of the LTR in 5 '.
  • LTR sequences such as for example the LTR sequences of the Moloney leukemia virus
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises as transport vector intracellular, any recombinant viral expression vector placed under the control of promoters of the host cell allowing the expression of zyxin in the host cell according to genetic recombination techniques well known to those skilled in the art.
  • expression vectors derived from recombinant Adenoviruses from viruses associated with recombinant Adenoviruses (AAV), from baculoviruses or from recombinant retroviruses, and most preferably a vector of the recombinant lentivirus type.
  • AAV recombinant Adenoviruses
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises a viral expression vector comprising promoter sequences, chosen for example and without limitation from the CMV promoter, the EF1 alpha promoter or the PGK promoter.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises as active agent a cell from a patient suffering from a tumor pathology genetically modified to express the discomfort of zyxin.
  • the pharmaceutical composition of the invention is useful for the preparation of a medicament intended for the treatment or prevention of tumor pathologies.
  • the pharmaceutical composition of the invention is useful for the preparation of a medicament intended for the treatment of pathologies such as malignant hemopathies associated with chromosomal abnormalities of the localization region of the zyxin 7q34 / q35 gene.
  • composition of the invention is useful for the preparation of a medicament intended for the treatment or prevention of hepatocarcinomas, neuroectodermal cancers, Ewing's sarcoma.
  • the invention also relates to the non-viral and viral intracellular transfer vectors associated with the active agent, capable of being used in the above pharmaceutical composition.
  • Another subject of the invention relates to a viral vector capable of being used in a pharmaceutical composition defined above.
  • the subject of the invention is therefore a viral vector comprising a cDNA coding for the zyxin gene or a functional fragment thereof.
  • the viral vector according to the invention is chosen from a recombinant vector derived from an Adenovirus, a virus associated with Adenoviruses (AAV) or a retrovirus.
  • a third embodiment of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising as active agent a cell characterized in that it is genetically modified to overexpress the gene for zyxin or a functional fragment thereof.
  • the overexpression of the zyxin gene in said cell is obtained either by transfection of a cell with expression vectors comprising a cDNA of the zyxin gene or by infection of a cell with viral particles expressing said gene for the zyxin.
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises, as active principle, a cell chosen from a stem cell, a cell of bone marrow, a hematopoietic cell or a hepatocarcinoma cell genetically engineered to overexpress the zyxin gene or a functional fragment thereof.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises as active agent a CD34 + cell genetically modified to overexpress the discomfort of zyxin or a functional fragment thereof.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises as active agent a cell originating from a patient suffering from a tumor pathology genetically modified to express the zyxin gene or a functional fragment thereof.
  • the invention also relates to a genetically modified cell overexpressing the zyxin gene.
  • the invention also relates to a genetically modified cell under-expressing the zyxin gene.
  • Such a cell can be obtained, for example, using an antisense RNA targeting the AUG of zyxin and introduced into the cells via a synthetic oligonucleotide cloned in the shuttle comprising the transport vector. .
  • the genetically modified cells according to the invention are chosen from a stem cell, a bone marrow cell, a hematopoietic cell or a hepatocarcinoma cell.
  • the genetically modified cells according to the invention are CD34 + cells.
  • the genetically modified cells according to the invention are from a patient with a tumor pathology.
  • Another embodiment of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising as active agent a compound binding the polymerized actin F with an affinity constant greater by at least two logs than the affinity constant with which said active agent binds unpolymerized actin G.
  • the active agents of the composition of the invention have an affinity constant of the order of 10 7 -10 8 M "1 for the polymerized actin F.
  • the active agent binding the polymerized actin is a cyclic peptide.
  • the invention also relates to a non-human transgenic mammal comprising at least one genetically modified cell sub-expressing the zyxin gene or a functional fragment thereof.
  • the subject of the invention is also a non-human transgenic mammal comprising at least one genetically modified cell sub-expressing the gene for zyxin or a functional fragment thereof.
  • the invention also relates to a method for identifying compounds capable of stabilizing the actin network of the cytoskeleton of a cell, comprising detecting a phenotypic reversion of the expression of zyxin induced by said compounds, characterized in that it comprises the following stages: a) bringing the compounds to be tested into contact with said cell, b) quantifying the expression of zyxin in said cell.
  • the quantification of the expression of zyxin is carried out by comparison of the expression of the messenger RNAs of zyxin in said cell in the presence and in the absence of said test compound.
  • the quantification of the expression of zyxin is carried out by comparison of the expression of the protein zyxin in said cell in the presence and in the absence of said compound to be tested
  • the invention also relates to a method for diagnosing a tumor pathology comprising the following steps: a) the removal of cells from a patient, b) the quantification of the expression of zyxin in the cells removed
  • the quantification of the expression of zyxin is carried out by measuring the expression of the messenger RNAs of zyxin.
  • the quantification of the expression of zyxin is carried out by comparison of the expression of the protein zyxin of the cells sampled at different intervals.
  • the subject of the invention is a method of analyzing a tumor phenotype of a patient, characterized in that it comprises the following stages: a) the removal of the cells from the patient at two different time intervals, b) the quantification of the expression of zyxin in the cells sampled at different intervals. c) comparing the two levels of expression in order to constitute a phenotypic differential profile of said patient.
  • the quantification of the expression of zyxin is carried out by comparison of the expression of the messenger RNAs of the cells sampled at different intervals.
  • the quantification of the expression of zyxin is carried out by comparison of the expression of the zyxin protein of the cells sampled at different intervals.
  • Another subject of the invention relates to a method of screening for an active compound in the treatment of cancers, comprising the following steps: a) incubation of tumor cells with said active compound, b) measuring the stabilization of the polymerization of the actin network of said cells.
  • the invention also relates to the use of a substance capable of restoring the actin networks of a cell for the preparation of a non-cytotoxic anti-tumor medicament.
  • Another subject of the invention is the use of such a substance for the preparation of a medicament intended for the treatment and / or prevention of a pathology resulting from a chromosomal abnormality in the long arm of chromosome 7, more particularly at the level of the region 7q34 / q35.
  • the invention also relates to the use of such a substance for the preparation of a medicament intended for the treatment of a malignant hemopathy associated with a chromosomal abnormality in the region of the gene of zyxin 7q34 / q35.
  • Another subject of the invention is the use of a substance for the preparation of a medicament intended for the treatment or prevention of hepatocarcinomas or neuroectodermal cancers.
  • Another subject of the invention is the use of a substance for the preparation of a medicament intended for the treatment or prevention of mesenchymal tumors, in particular sarcomas.
  • Another subject of the invention is the use of such a substance for the preparation of a medicament intended for the treatment or prevention of Ewing's sarcoma.
  • Figure 1 is a diagram of the interactions between zyxin and its cellular partners at the level of the plasma membrane.
  • Figure 2 shows a diagram of the construction of the viral transport vector associated with zyxin.
  • FIG. 3A shows actin filaments revealed by labeling the cells with a phalloidin probe coupled to the FITC.
  • FIG. 2B shows the location of the zyxin revealed by labeling the cells with an anti-zyxin antibody revealed with an anti-mouse IgG antibody coupled to TRITC.
  • FIG. 4A illustrates the results of the
  • FIG. 4B is a schematic representation of the retroviral shuttle containing the zyxin reading frame, mRNAs containing the open reading frame of human zyxin and of the neo / CMV and zyxin probes used for the revelation of the Northern blots.
  • FIG. 5 illustrates the results of the Northern blot with the detection of the mRNA originating from the 5 'LTR, from 10 ⁇ g of total RNA deposited on denaturing agarose gel, by the neo / CMV probe of 1081 bp.
  • FIG. 6 shows the Western blot and immunodetection images of the zyxin protein in the different cell lines from 60 ⁇ g of protein extracts from the different cell lines.
  • FIG. 7 illustrates the Western Blot images obtained after immunoprecipitation of the protein extracts the protein EWS-FLI-1 extracted from the clones E-F zyxin.
  • FIG 8A shows the sequence of
  • FIG. 8B is a diagram of the construction of the retroviral shuttle expressing the antisense against the AUG of zyxin.
  • FIG. 8C shows the detection by RTPCR of the antisense RNA directed against the AUG of zyxin.
  • FIG. 9 shows the Western blot and immunodetection images of the zyxin protein from 40 ⁇ g of protein extract from different cell lines.
  • FIG. 10 is a graphic representation of the comparative study of the variations in gene expression rates, carried out by macro-arrays, between the line NIH3T3 and the lines EWS-FLI, as zyxine 1 and as zyxine 2.
  • FIG. 11 illustrates the in vitro measurement of actin polymerization by fluorescence anisotropy.
  • FIGS. 12A to 12G show the results of the study of the morphological modification of the NIH3T3 and EWS-Fli cells in the presence of Dolastatin (DU: Untreated NIH3T3 cells (FIG. 12A); NIH3T3 cells transfected with EWS-Fli (Figs 12B , 12C); (NIH3T3 cells transfected with EWS-Fli incubated in the presence of 10 ⁇ M ( Figure 12D) or 100 ⁇ M ( Figure 12E) of Jasplakinolide or incubated with 10 ⁇ M ( Figure 12F) or 20 ⁇ M ( Figure 12G) of DU.
  • DU Untreated NIH3T3 cells
  • Figs 12B , 12C NIH3T3 cells transfected with EWS-Fli incubated in the presence of 10 ⁇ M
  • Figure 12E 100 ⁇ M
  • Jasplakinolide or incubated with 10 ⁇ M ( Figure 12F) or 20
  • FIG. 13 shows the results of the study of the toxicity of Dolastatin 11 (DU) on NIH3T3 and EWS / Fli cells.
  • FIG. 14 shows the results of the study of the development of tumors in nude mice in the presence of Dolastatin 11.
  • GEBCO newborn calf serum
  • antibiotics penicillin lOOUI / mL and streptomycin lOO ⁇ g / mL
  • the EWS-FLI line contains a cDNA encoding the EWS-FLI-1 fusion protein in its genome.
  • the expression of this protein is selected using 2.5 ⁇ g / ml of puromycin.
  • the AS-A line produced by M. Hervy et al. , produces a small antisense RNA directed against the mRNA encoding the protein EWS-Fli-1.
  • This line is selected, in addition to puromycin, lmg / ml of geneticin. Geneticin makes it possible to select the cells which produce the small antisense RNA directed against the mRNA coding for the protein EWS-FLI-1.
  • NIH3T3 AS zyxin lines are cells that produce a small antisense RNA directed against the AUG of mRNA encoding zyxin. They are cultivated in a medium supplemented with geneticin at 1 mg / ml in order to select the expression of the antisense.
  • GP + env Am12 cells are transcomplementing cells capable of providing in trans the proteins coded by the gag and pol genes, carried on a plasmid, and env carried by another plasmid.
  • This line is capable of producing amphotropic viral particles.
  • This line is cultivated in a medium containing DMEM and 10% fetal calf serum (GIBCO) supplemented with penicillin and streptomycin.
  • GEBCO fetal calf serum
  • These cells are selected using a mixture of three compounds (200 ⁇ g / ml of hygromycin B, 15 ⁇ g / ml of hypoxanthine, 250 ⁇ g / ml of mycophenolic acid) for two weeks before transfection with the retroviral shuttle.
  • the cells are seeded on glass slides until they adhere (from 24H to 48H).
  • the cells are fixed with a 3% paraformaldehyde solution rinsed with PBS and permeabilized with a PBS / 0.2% triton X100 solution.
  • the permeabilized cells are saturated with a PBS / 2% BSA solution.
  • the cells are incubated with the primary antibody (anti-zyxin from J. Wehland) diluted twice for 40 min, rinsed 3 times 5 min with PBS and then incubated with the secondary anti-mouse IgG antibody coupled to Texas Red (TRITC) for 40 min.
  • the cells are incubated directly with phalloidin coupled to FITC for 40 min.
  • the coverslips are observed under a fluorescence microscope.
  • the retroviral vector pLNCX contains, on the one hand, the LTR sequences and the psi sequence originating from the Moloney murine leukemia virus (MoMLV) and, on the other hand, the resistance gene to neomycin, conferring resistance to geneticin, under the dependence of the promoter of the LTR in 5 ′.
  • This vector also contains a multicloning site (MCS) directly dependent on the early promoter of the cytomegalovirus (pCMV).
  • MCS multicloning site
  • the vector pLNCX is digested with HindIII / ClaI at the level of the MCS in order to insert therein a sequence containing two adapters which are capable of self-associating in a complementary manner. Between these two adapters, this sequence contains other unique restriction sites including Nsil and Sali.
  • the plasmid pzyxine GFP contains the cDNA coding for human zyxin coupled in phase to the gene for the "green fluorescent protein" GFP (given by M. Beckerle). It is digested with Hind III and BamH I then cloned into the vector PLNCX at the level of the MCS (HindH I / BglII); BamHI and BglII are compatible sites. Digestion with Hind II / BglII eliminates one of the two adapters, this preventing self-association of the RNA coding for the zyxin produced by this vector.
  • the result of this construction is a retroviral vector named pLNCX ADA zyxin, coding for human zyxin under the direct influence of pCMV.
  • pLNCX ADA as zyxin
  • pLNCX ADA sa zyxin is a vector which has the capacity to produce a small RNA in rod-loop structure directed against the AUG of the mRNA coding for zyxin, directly dependent on the pCMV promoter.
  • the construction of the vector is carried out by inserting at the level of the Nsil and Sal I sites of the MCS a small sequence directed against the AUG of the mRNA of zyxin.
  • the vector retroviral shuttle is transformed into the corresponding virus by transfecting the retroviral vector into a transcomplementing cell line GP + envAM12 (GPA).
  • the GPA transcomplementing line is transfected by the retroviral shuttle (pLNCX zyxine or PLNCX ADA as zyxine) in the presence of Superfect (Qiagen) according to the supplier's recommendations.
  • the cells expressing the neo r gene are selected in a medium containing l ⁇ g / ml of G418. Resistant cells are collected, amplified and seeded in a 75cm 2 bottle at a rate of 2.10 6 cells. Two days later, the medium is replaced by a non-selective medium. The supernatant is collected every 24 hours for 3 days, pooled, aliquoted and frozen.
  • the retroviral titer is evaluated on NIH3T3 cells after selection of cells with geneticin (1 mg / ml). The viral supernatant of the GPA cells is then used to infect the desired cells with a multiplicity of infection of the order of 0.1. Three days after infection, the cells are selected with l ⁇ g / mL of G418. Only cells that have integrated the retroviral shuttle resist G418 and form clones that are isolated and amplified to produce permanent cell lines.
  • the adherent cells are trypsinized, pelletized and rinsed with PBS.
  • the cells are lysed with cold RIPA (10 mM Tris-HCL pH7.4, 100 mM NaCl, ImM EDTA, 1% Triton X100, 0.5% Na deoxycholate, 0.1% SDS) in the presence of a mixture of protease (Boehringer) .
  • RIPA cold RIPA
  • the samples are centrifuged for 15 min at 14,000 rpm.
  • the supernatants are recovered and the protein concentration is estimated by the Bradford test.
  • An aliquot containing 1.5 mg of total protein extract is incubated for 1 hour 30 minutes at 4 ° C. with 0.2 ⁇ g of antibody directed against terminal C dominor of Fli-1.
  • the analysis of the rate of production of the zyxin protein is carried out by Western blot on a total cell extract using as primary antibody, the anti-zyxin monoclonal mouse antibody given by J. Wehland directed against the region between the NES and the LIM domains. This membrane is revealed by a chemiluminescent reagent (Immunostar: Biorad).
  • RNAplus lysis solution Quantum Biotechnology
  • An aliquot of 10 ⁇ g of total RNA is denatured in a solution containing 0.04 M MOPS pH7, 0.01M of sodium acetate, 2.2 M formaldehyde and 50% formamide.
  • the samples are analyzed on agarose gel denatured with formaldehyde and transferred to a charged nylon membrane (Hybond N +: Amersham Pharmacia).
  • the membrane is hybridized with a cDNA probe radiolabeled with [ 32 P] dCTP by random priming (Prime-a-gene ® labeling System: Promega) in a prehybridization solution containing 5X SSC, 5X Denhart's, 0, 1 mg / mL of salmon sperm DNA, 0.1 mg / mL of yeast t-RNA, 0.1% SDS, 25 M pH7 KH 2 P0 4 and 50% formamide at 42 ° C overnight. The next day the membrane is rinsed three times with SSC2X / 0.1% SDS at room temperature and once or twice at 42 ° C with 0.5 X SSC / 0.1% SDS. The membrane signals are then observed at the phospholmager.
  • Total RNAs are produced by the same technique described above. The quality and cleanliness of the RNA is checked on denaturing gel. The retrotranscription is carried out using the Omniscript TM kit from Qiagen specifically using a 20-sea LTR primer. The conditions used are 10 ng of LTR primer, 2.5 mM dNTP, I ⁇ g of total RNA supplemented with 2OU of RNase inhibitor
  • RNAsin ® RNAsin ®
  • RT buffer 40U reverse transcriptase.
  • the mixture is incubated for one hour at 37 ° C and 5 min at 94 ° C.
  • the RT products of specific cDNAs which are amplified by PCR using two other primers named as 1 and as 2.
  • reaction conditions are 0.25 mM dNTP, lOOng of each of the primers and 1/20 is the product of RT, l.5mM
  • the cycles used are 4 min 94 ° C and 30cycles (30s 94 ° C, 45s 61 ° C, 1 min 72 ° C) and 10 min at 72 ° C.
  • the cells from the different clones to be tested are trypsinized, pelletized and resuspended in sterile PBS at the rate of 5.10 6 cells per ml.
  • An aliquot of 200 ⁇ L of cells is injected subcutaneously into nude mice aged 6 to 8 weeks, irradiated the day before at 5 Gray.
  • the mice are reared in a sterile, air-conditioned atmosphere. Observation of tumor development is carried out every week for 5 to 6 weeks.
  • the "Atlas cDNA expression Arrays" cDNA expression card (Clontech) is produced according to the supplier's recommendations. Two identical nylon membranes (No. 7741-1) on which are deposited 588 mouse cDNA samples, corresponding to 588 genes, makes it possible to hybridize cDNAs from two different cell lines in parallel. Information concerning the 588 genes is available on the Clontech site (http://www.clontech.com/atlas.genelist/search.htlm). The preparation of the radiolabelled cDNA probes is carried out by retrotranscription with [ 32 P] dATP using the Clontech kit. Hybridization is performed according to the instructions from the supplier. The signals are observed at the Phospholmager.
  • EWS-FLI EWS-Fli fusion protein
  • the production of virus is obtained by transfection of this plasmid into an amphotropic murine packaging line called GPA.
  • EWS-FLI cells are infected using the viral supernatant produced by GPA cells and selected in the presence of Geneticin.
  • the clones thus obtained are called E-F / Zyxin.
  • the study by fluorescence microscopy shows that the EWS-FLI cells have lost the bundles of actin microfilament and the ability to spread, characteristics typical of transformed fibroblasts (Pollack, R et al; 1975, Maness, P, E; 1981).
  • the cells of the EF / Zyxin clones partially recovered the structure of the actin microfilaments as well as the spreading capacity of the NIH3T3 cells (FIG. 4).
  • these cells no longer have the growth capacity in multilayers, typical of transformed cells.
  • a relocation of zyxin is observed at the level of the adhesion plates, in the intercellular junctions and along the stress cables (FIG. 3).
  • RNA coding for zyxin is more weakly expressed in the tumorigenic line EWS-FLI than in the line NIH3T3 (FIG. 4). This result confirms the difference in expression observed previously, by microarrays, between the NIH3T3 and EWS-FLI cells.
  • the expected size of the human zyxin mRNA from the retroviral shuttle and expressed from the CMV promoter (2.2 kb) (FIG. 4B) is identical to that of the endogenous zyxin mRNA. It is therefore very likely that the increase in the intensity of the band that is observed in the three E-F / zyxin clones is due to the expression of the zyxin RNA expressed from the retroviral shuttle.
  • RNA larger than 4.7 kb is represented only in the RNAs from the E-F / zyxin clones.
  • This RNA has a size between 5.5 and 6 kb compatible with an RNA which would be expressed from the promoter located in the U3 region of the 5 'LTR (5.7 kb) of the retroviral shuttle (FIG. 4B).
  • Northern blot was carried out using a 108lbp (neo / CMV) probe, corresponding to a restriction fragment derived from the plasmid pLNCX ADA zyxin, capable of detecting only the RNA derived from the 5 'LTR (FIG. 5).
  • the result presented in FIG. 5 reveals a hybridization only in the EF zyxin clones.
  • the detected band is positioned at the same level as the indeterminate band present in the Northern blot using the zyxin probe. It can therefore be concluded that the retroviral shuttle produces two RNAs containing the zyxin sequence, one from the CMV promoter and the other from the promoter present in the 5 'LTR.
  • the difference in intensity detected in the presence of two different amounts of protein extracts shows that the amount of antibody used is not limiting.
  • the amount of EWS-FLI-1 immunodetected by the amount of anti-Fli-1 antibody detected has been corrected.
  • the results presented in the form of a histogram (FIG. 7B) indicate the absence of the EWS-FLI-1 protein in the NIH3T3 line and an under expression in the AS-A line (expressing an antisense directed against the EWS-FLI junction sequence ) compared to the EWS-FLI line.
  • the amount of EWS-FLI-1 protein is clearly greater than the amount of protein detected in the non-tumorigenic AS-A line and remains comparable to the amount present in tumorigenic EWS-FLI cells.
  • NIH3T3 cells do not cause tumor development.
  • This line is used as a negative control since it is known to be non-tumorigenic.
  • EWS-FLI line known to be tumorigenic
  • all the mice developed tumors between the 2 nd and 3 rd week.
  • the tumorigenicity of the EF zyxin clone two cases may arise, either there is no tumor development (three out of five mice) or there is a delay in tumor development of about two to three weeks (two out of five mice). Analysis of these tumors shows that the DNA of the retroviral shuttle is still present, however, the exogenous RNA coding for zyxin could not be detected. It therefore appears that the development of delayed tumors in mice is due to a loss of expression of the exogenous protein zyxin.
  • the tumor development tests in nude mice corroborate the morphological changes and the growth modifications observed between the cells expressing the antisense directed against zyxin and the parental NIH3T3 cells (Table 2).
  • the rate of tumor development after the injection of EWS-FLI cells is also faster than that observed following the injection of the AS-Zyxin clones.
  • Table 2 Tumorigenicity test: study of the number of tumors developed after subcutaneous injection in nude mice of 10 6 cells from different cell lines for six weeks.
  • EGR1 and p53 tumor suppressors
  • ERCC-1 proteins involved in repair
  • ADAP proteins playing a role in cell differentiation and growth
  • ICE proteins playing a role in cell differentiation and growth
  • TIMP2 proteins involved in the cell matrix
  • PN-1 proteins involved in the cell matrix
  • urokinase plasminogen activator proteins involved in the cell matrix
  • Cell extracts of NIH3T3 cells or EWS-Fli are placed in the presence of actin Alexa 488 in a buffer G (4.3 ⁇ M Tris pH 8.1; 170 ⁇ M CaCl 2 ; 170 ⁇ M DTT; 170 ⁇ M ATP).
  • the polymerization reaction is triggered by the addition of a P buffer (51 mM KC1, 1 mM MgCl 2 and 0.5 mM ATP).
  • Dolastatin ( ⁇ M) is added to the cellular extracts of EWS-Fli cells at the same time as the buffer P.
  • the actin polymerization is followed by anisotopy of fluorecence on a Beacon 2000. The results obtained are illustrated in FIG. 11.
  • the cells are seeded (20% of confluence) on glass slides 20 mm in diameter. Three days after sowing, the glass slides are placed in airtight chambers, regulated in temperature (37 ° C) and in C0 2 (5%).
  • the motility measurement of the cells is carried out by taking a photograph by optical phase contrast microscopy every 4 minutes for 24 hours.
  • the motility analyzes, carried out using the “metamorph” program, are carried out for each cell type, on ten cells. The results are illustrated in Figure 15.
  • EWS-Fli cells with 10 or 20 nM of Dolastatin 11 not only makes it possible to restore the stress fibers of the cells, with a morphology which approximates that of NIH3T3 cells, but it also makes it possible to restore the contact structures between cells (Figure 12).
  • compositions of the invention require, for the phenotypic reversal of the tumor phenotype, doses much lower than those known from one prior art.
  • One of the families of cancers capable of being treated with the pharmaceutical compositions of the invention is the family of melanomas, in which the applicant has characterized the under-expression of the zyxin gene.
  • the Applicant has characterized the expression of several genes in a murine melanoma line, compared to the expression of these same genes in a non-tumor line.
  • B16 / F10 cells are a very aggressive murine melanoma line. They are compared to the non-tumorigenic NIH3T3 line. The total RNA of the two cell lines are amplified and radiolabeled by RT PCR. RT PCR products (cDNA) are incubated with Atlas ® Mouse cDNA Expression Array Clontech membranes (ref 7741-1). The membranes are then exposed and the image is analyzed with MicroArray ® software.
  • B16 / F10 cells are a melanoma line
  • zyxin is a very conserved protein (97% homology between man and mouse) the sequence difference between human and murine zyxin is very probably not at the origin of this phenomenon.

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Abstract

La présente invention concerne le domaine de la cancérologie, elle se rapporte à une composition pharmaceutique pour le traitement, la prévention ou le diagnostic d'une pathologie tumorale, ladite composition pharmaceutique comprenant un agent actif capable de stabiliser le réseau d'actine du cytosquelette cellulaire, notamment un AND codant pour le gène de la zyxine. Elle concerne aussi une méthode d'identification de composés capables de stabiliser le réseau d'actine du cytosquelette d'une cellule. L'invention se rapporte également à une méthode de diagnostic d'une pathologie tumoral et à une méthode d'analyse d'un phénotype tumoral d'un patient, basées sur quantification de l'expression de la zyxine par des cellules.

Description

COMPOSITION PHARMACEUTIQUE POUR LE DIAGNOSTIC, LA PREVENTION OU LE TRAITEMENT D'UNE PATHOLOGIE TUMORALE, COMPRENANT UN AGENT MODULATEUR DE L'ETAT DE POLYMERISATION DE L'ACTINE.
La présente invention concerne le domaine de la cancérologie, elle s'appuie sur les observations de la modification des certaines caractéristiques phénotypiques cellulaires liées à la structure du cytosquelette, telles que l'adhérence et la motilité, des cellules lorsque lesdites cellules évoluent vers un phenotype tumoral.
Ces caractéristiques phénotypiques sont liées à la structure du cytosquelette desdites cellules dont la stabilité est assurée par la polymérisation des réseaux d'actine qui le constituent.
L'invention est basée sur la corrélation observée par la demanderesse entre la sous-expression de gènes intervenant dans la stabilisation du réseau d'actine du cytosquelette des cellules, comme par exemple la sous- expression du gène de la zyxine et la transformation phénotypique d'un phenotype normal versus un phenotype tumoral desdites cellules.
L'invention est aussi basée sur la mise en évidence, grâce aux travaux expérimentaux réalisés, que l'administration d'une composition pharmaceutique capable de stabiliser le réseau d'actine du cytosquelette de la cellule, comme par exemple des composés induisant la surexpression du gêne de la zyxine dans une cellule comportant un phenotype tumoral provoque la reversion phénotypique de ladite cellule vers un phenotype normal.
Ces résultats ont permis de comprendre que la structuration du cytosquelette via la dynamique de la polymérisation de l'actine joue un rôle essentiel dans le maintien du phenotype tumoral invasif et que par conséquent une action pharmacologique ayant pour conséquence une augmentation de la quantité d'actine F à l'état stationnaire dans une cellule tumorale constitue un moyen de diminuer le caractère invasif de la cellule maligne, voire de rétablir un phenotype normal.
Ainsi, l'invention a pour objet l'identification de composés capables de moduler l'état de polymérisation de l'actine et l'utilisation desdits composés pour la préparation de médicaments utiles pour le diagnostic, la prévention et/ou le traitement de pathologies tumorales .
De tels composés capables de stabiliser le réseau d'actine peuvent être par exemple des inhibiteurs de la cofiline qui est une enzyme connue pour son action sur le mécanisme de dépolymérisation de l'actine F, sous sa forme active (cofiline déphosphorylée) elle induit la rupture d'hélices et favorise la dépolymérisation de l'actine F.
L'identification des gènes impliqués dans la transformation tumorale et dans le maintien du phenotype malin est un des éléments préalables à la conception de nouvelles approches thérapeutiques des pathologies tumorales . Les approches expérimentales pertinentes nécessitent la disponibilité de matériels biologiques constitués notamment de couples du type "lignée normale/lignée tumorale" ou " tissu normal/tissu tumoral" . Ces couples permettent la réalisation de mesures d'expression différentielle.
Cependant, ces approches présentent des inconvénients, car la relevance des résultats dépend du caractère significatif des couples utilisés. Les lignées doivent présenter un phenotype bien caractérisé. Elles doivent présenter un phenotype immortel non tumoral et la transformation maligne des lignées immortelles devrait être induite par un événement génétique unique. Enfin, on doit pouvoir obtenir aisément des révertants phénotypiques.
Les modèles les plus pertinents sont fournis par les phénotypes tumoraux induits par des protéines oncogènes de fusion telles que BCR-Abl, PML-RAR qui conduisent à des phénotypes leucémiques ainsi que EWS-Fli-
1, responsable du sarcome d'Ewing.
Le sarcome d'Ewing est une tumeur d'origine neuroectodermique qui se caractérise par une translocation chromosomique impliquant la bande ql2 du chromosome 22 remaniée avec la bande q24 du chromosome 11 : t(ll ; 22) (q24 ; ql2) (Turc-Carel et coll., 1984) conduisant à la formation d'un gène chimère associant le protooncogène EWS à un membre de la famille des gènes ETS . Les points de cassure associés à la translocation majoritaire t(ll ; 22) sont localisés dans une région de 7 kb appartenant au gêne EWS pour le chromosome 22 et une région de 50 kb appartenant à FLI-1 pour le chromosome 11 (Zucman et coll., 1993) . Le résultat de cette translocation chromosomique génère un dérivé du chromosome 22 où la partie 5 ' du gène EWS est associée à la partie 3 ' du gène FLI-1 (Delattre et coll., 1992) . Le gène de fusion exprime la protéine chimère
EWS-FLI-1 possédant des propriétés oncogèniques . Ainsi, la protéine chimère EWS-Fli-1 est capable de. transformer des fibroblastes murins de type NIH3T3 en culture (Ohno et coll., 1993) et d'induire des tumeurs chez la souris "nude". L'association des domaines N-terminal de EWS et C- terminal de FLI-1 est nécessaire à son pouvoir transformant (May et coll. , 1993) .
Dans le cadre de la présente invention, il a été développé un modèle d'étude constitué d'une part par des fibroblastes NIH3T3 murins normaux, immortels non tumoraux et d'autre part par des fibroblastes exprimant la protéine de fusion EWS-Fli-1 d'une manière constitutive et présentant un phenotype tumoral chez la souris nude. Ce couple de cellules permet d' effectuer une évaluation de l'expression différentielle caractérisant l'acquisition du phenotype tumoral .
Cette évaluation a été faite à l'aide du u cDNA micro-array " de Clontech permettant d'apprécier simultanément l'expression de 588 gènes.
Dans une deuxième étape, des révertants phénotypiques stables ont été obtenus en infectant les cellules transformées par des vecteurs rétroviraux codant pour des ARN antisens dirigés contre le gène de fusion oncogène. Un deuxième couple de cellules (cellules tumorales/cellules révertantes non tumorales) a été ainsi obtenu et a pu faire l'objet d'une étude d'expression différentielle .
Les expériences réalisées dans le cadre de la présente invention ont ainsi permis d' identifier des gènes dont la variation d'expression est liée à l'expression de la protéine oncogène et à la nature du phenotype, de façon à fournir de nouveaux moyens de traitement, de prévention ou de diagnostic, des cancers.
Parmi les expériences effectuées dans le cadre de la présente invention, l' immunocoloration des filaments d'actine sur des fibroblastes montre que la transformation maligne desdits fibroblastes médiée par une protéine chimère EWS-Fli-1 se traduit par une profonde modification de la morphologie des fibroblastes avec notamment une diminution des points focaux. Ceci s'accompagne d'un remodelage du cytosquelette et notamment des réseaux d'actine polymérisée.
En particulier il est démontré que le phenotype tumoral est influencé par le taux d'expression de la zyxine et que la sous-expression du gène de la zyxine est une condition suffisante pour transformer un fibroblaste normal en ibroblaste tumorigène .
On connaît que la zyxine est une protéine comprenant des domaines LIM présente dans les plaques d'adhérence focale des fibroblastes et les lamellipodes des cellules d'eucaryotes supérieurs. Ces motifs LIM, en forme de doigt de zinc sont impliqués dans les interactions de type protéine-protéine. (Scheimechel et al. 1994. " The LIM domain a new structural motif found in zinc-printer-like proteins ". Trends Genêt. 10: 315-320.
La zyxine est impliquée dans la régulation de la polymérisation des filaments d'actine et a des propriétés structurales et fonctionnelles en commun avec ActA de Listeria (Golsteyn et coll., 1997) . La zyxine est supposée agir comme intermédiaire d'ancrage entre la membrane plasmique via l'α-actinine et les intégrines et les filaments d'actine. Elle est clairement impliquée dans l'architecture du cytosquelette, l'adhérence et la motilité cellulaire (Crawford et Beckerle, 1991) . Structurellement la zyxine comprend une région N-terminal riche en proline, un peptide signal d'exportation nucléaire (NES), ainsi que des régions riches en acides aminés Histidine et Cystéine formant les motifs LIM dans la partie C-terminale. (Sadler et al . 1992. " Zyxin and cCRP : Two interactive LIM domain proteins associated with the cytoskeleton ". J.Cell.Biol. 119: 1573-1587) .
Le mécanisme de la tumorigènese zyxine- dépendante implique des modifications de la motilité, de l'adhérence et de la signalisation liée aux interactions cellules-cellules et cellules-matrice extracellulaire.
L'analyse de profils d'expression différentielle effectuée avec le modèle d'étude ci-dessus, a permis de vérifier que les modifications morphologiques dépendantes de l'expression d'une protéine chimère EWS-Fli- 1 sont corrélées aux variations d'expression du gène de la zyxine .
Il a été ainsi constaté que la diminution de l'expression du gène de la zyxine, impliqué dans la stabilisation du réseau d'actine intervenant dans l'organisation du cytosquelette cellulaire est directement liée à l'acquisition et le maintien du phenotype tumoral et que l'induction de la surexpression desdits gènes conduit à la reversion du phenotype tumoral .
Ainsi, l'invention a pour objet de fournir de nouvelles compositions pharmaceutiques pour le traitement et la prévention des cancers comprenant des composés capables de stabiliser le réseau d'actine du cytosquelette d'une cellule pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des cancers.
Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de l'invention ont permis de mettre au point une composition pharmaceutique non cytotoxique utile pour le traitement et/ou la prévention des cancers. En effet, une composition selon l'invention est capable de restaurer un phenotype non tumoral à la différence de la plupart des compositions de l'art antérieur qui détruisent les cellules st sont donc susceptibles d'induire des effets secondaires.
Ces travaux ont aussi conduit au développement d'une méthode d'identification de composés anti-tumoraux capables de stabiliser le réseau d'actine du cytosquelette d'une cellule, basée sur la détection de la reversion du phenotype tumoral lié à l'expression de la zyxine.
La présente invention a donc pour objet une composition pharmaceutique pour le traitement, la prévention ou le diagnostic d'une pathologie tumorale, caractérisée en ce qu'elle comprend un agent actif capable de stabiliser le réseau d'actine du cytosquelette d'une cellule choisi dans le groupe comprenant : - la protéine zyxine
- une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par le gène de la zyxine, un fragment de celui- ci ou leur séquence complémentaire, ou un acide nucléique anti-sens de ceux-ci, une cellule ou un ensemble de cellules surexprimant le gène de la zyxine ou une protéine codée par un fragment de celui ci .
- un inhibiteur de la cofiline.
Définitions
Dans le cadre de la présente invention on entend par fragment de la zyxine tout fragment polypeptidique de celle-ci capable de conserver la fonction biologique de la zyxine et en particulier sa fonction de stabilisation du réseau d'actine du cytosquelette.
On entend par fragment du gène de la zyxine, tout fragment d'acide nucléique de la zyxine et en particulier les ADNc dudit gène codant pour la zyxine et/ou les différents domaines fonctionnels de celle-ci, tels que ceux codant pour:
- la région N-terminal de la protéine riche en proline, - le signal d'exportation nucléaire (NES)
- les régions formant les motifs LIM dans la partie C-terminale.
On entend par dérivé du gène de la zyxine tout acide nucléique modifié chimiquement, ou par recombinaison génétique mais conservant la fonction dudit gène, notamment sa capacité à coder pour un polypeptide, lorsqu'il est exprimé dans un hôte approprié, qui conserve les fonctions biologiques de la protéine zyxine et en particulier sa fonction de stabilisation du réseau d'actine du cytosquelette cellulaire. Des telles modifications comprennent par exemple, la modification, addition ou suppression de bases, par fusion avec d'autres acides nucléiques, comme par exemple des éléments régulateurs, .ou des molécules chimères comprenant des ADNc hétérologues obtenues par fusion des ADNc correspondants selon des techniques connues de l'homme du métier.
On entend par dérivé de la protéine zyxine tout polypeptide modifié, par exemple chimiquement par association avec des groupement chimiques fonctionnels, lesdits groupements chimiques fonctionnels étant choisis parmi les groupements capables de réaliser le couplage de ladite protéine ou d'un fragment de celle-ci soit à d'autres molécules, comme par exemple des marqueurs, de protéines porteuses en vue de la fabrication d'un immunogène, des enzymes, soit sur des supports solides, tels que des supports minéraux, ou des polymères organiques .
Un premier mode de réalisation de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant la protéine zyxine ou un fragment fonctionnel de celle-ci.
Selon ce premier mode de réalisation, la composition pharmaceutique de l'invention comprend la protéine zyxine ou des fragments fonctionnels de celle-ci associés à des vecteurs de transport choisis parmi le groupe comprenant des :
- systèmes lipidiques tels que les liposomes anioniques ou neutres, et notamment le liposomes à base de phosphatidylcholoine (PC) ou dioleylphosphatidylcoline (DPE) , les liposomes cationiques, notamment les liposomes à base de bromure de dioctadecyldiméthylam onium (DODAB) le bromure de dioleyloxypropyl-triméthylammonium (DOTMA) , le DOGS (Transfectam®) , le DDPPES etc., des émulsions cationiques telles que les émulsions à base d'huile de soja et de 1,2 diolcoyl-glycéro-3-triméthylammonium propane (DOTAP) , etc.
- systèmes particulaires : à titre d'exemple et de manière non limitative, on peut citer soit des microparticules à base d'acide polydactide co-glycolide) (PLG, de bromure de cétylméthylammonium (PLG-CTAB) , de PLG- PEI,ou de microparticules à base de PLG-poly-L-Lysine etc., soit des nanoparticules à base de chitosan, de nanoparticules de PLG, de gélatine, etc.
systèmes polymères ou polyplex à base de poly-L-Lysine, de poly-éthylèneeimine (PEI) les dendrimères polyamidoamines, des polymères cationiques tels que le chitosan, le DEAE-dextrane, des copolymères de TMAEM
(triméthylammonium ethylmétacrylate) et de N-2- hydroxypropyl)méthacrylamide (HPMA) ,
- systèmes peptidiques comme le peptide RAWA
- antibiotiques polyèniques cationiques comme les dérivés cationiques de l'Amphotéricine B.
Avantageusement, dans la composition pharmaceutique de l'invention, la zyxine est associée audits vecteurs de transport intracellulaires par des liaisons chimiques covalentes ou non covalentes.
Un deuxième mode de réalisation de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant comme agent actif une molécule d'acide nucléique comprenant un
ADNc du gène de la zyxine, un fragment ou un dérivé de celui-ci .
Selon ce deuxième mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend un acide nucléique comprenant un ADNc du gène de la zyxine, un fragment ou un dérivé de celui-ci associé à un vecteur d'expression recombinant viral ou à un vecteur de transport non-viral de type particulaire.
Dans le cadre de l'invention on entend par association entre l'agent actif et le vecteur de transport, soit la fixation dudit agent actif sur le vecteur de transport, comme par exemple par des liaisons non covalentes, par exemple de type hydrophobes, ou par des liaisons chimiques covalentes au moyen d'agents de couplage ou non, selon des techniques bien connues de l'homme du métier, soit l'insertion dudit composé actif dans un vecteur d'expression recombinant viral ou bactérien. Dans ce dernier cas, le composé actif est amené jusqu'à sa cible soit par infection avec des particules virales exprimant ledit composé actif, soit par transfection avec des vecteurs d'expression recombinants capables d'exprimer le composé actif lors de leur intégration dans ladite cellule hôte.
Avantageusement, la composition pharmaceutique de l'invention comprend un vecteur d'expression viral recombinant comportant des éléments nécessaires au contrôle transcriptionnel ainsi qu'au contrôle de la traduction de la séquence d'un ADNc du gène de la zyxine lorsque ledit vecteur d'expression est introduit dans des cellules cible.
Avantageusement, la composition pharmaceutique de l'invention comprend un vecteur d'expression viral recombinant comportant des séquences de régulation, telles que des promoteurs constitutifs ou inductibles, voire des séquences non-codantes du gène de la zyxine, permettant l'expression de la zyxine dans les cellules de l'hôte auquel est administrée la composition de l'invention.
Avantageusement, la composition pharmaceutique de l'invention comprend un vecteur d'expression viral recombinant comportant des séquences de régulation choisies parmi des séquences LTRs, comme par exemple les séquences LTRs du virus de la leucémie de Moloney, sous la dépendance d'un promoteur du LTR en 5' .
De préférence, la composition pharmaceutique de l'invention comprend comme vecteur de transport intracellulaire, tout vecteur d'expression viral recombinant placé sous le contrôle de promoteurs de la cellule hôte permettant l'expression de la zyxine dans la cellule hôte selon des techniques de recombinaison génétique bien connues de l'homme du métier.
A titre d'exemple et de manière non limitative, on peut citer des vecteurs d'expression issus d'Adénovirus, de virus associés aux Adénovirus (AAV) recombinants, des baculovirus ou des rétrovirus recombinants, et tout préférentiellement un vecteur de type lentivirus recombinant .
De manière tout à fait préférentielle la composition pharmaceutique de l'invention comprend un vecteur d'expression viral comportant des séquences de promoteurs, choisis par exemple et de manière non limitative parmi le promoteur CMV, le promoteur EF1 alpha ou le promoteur PGK.
Selon un mode de mise en œuvre particulier, la composition pharmaceutique de l'invention comprend comme agent actif une cellule issue d'un patient atteint d'une pathologie tumoral génétiquement modifiée pour exprimer le gêne de la zyxine .
La composition pharmaceutique de l'invention est utile pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des pathologies tumorales.
La composition pharmaceutique de l'invention est utile pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies telles que des hémopathies malignes associées à des anomalies chromosomiques de la région de localisation du gène de la zyxine 7q34/q35.
Aussi, la composition pharmaceutique de l'invention est utile pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'hépatocarcinomes, de cancers neuroectodermiques , du sarcome de Ewing.
L'invention concerne aussi les vecteurs de transfert intracellulaire non-viraux et viraux associés à l'agent actif, susceptibles d'être utilisés dans la composition pharmaceutique ci-dessus.
Un autre objet de l'invention se rapporte à un vecteur viral susceptible d'être utilisé dans une composition pharmaceutique définie ci-dessus.
Ainsi l'invention a pour objet un vecteur viral comprenant un ADNc codant pour le gêne de la zyxine ou un fragment fonctionnel de celui-ci.
Plus particulièrement le vecteur viral selon l'invention est choisi parmi un vecteur recombinant issu d'un Adénovirus, un virus associé aux Adénovirus (AAV) ou un rétrovirus .
Un troisième mode de réalisation de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant comme agent actif une cellule caractérisée en ce qu'elle est génétiquement modifiée pour surexprimer le gène de la zyxine ou un fragment fonctionnel de celui-ci.
Avantageusement la surexpression du gène de la zyxine dans ladite cellule est obtenue soit par transfection d'une cellule avec des vecteurs d'expression comprenant un ADNc du gène de la zyxine soit par infection d'une cellule avez des particules virales exprimant ledit gêne de la zyxine.
De préférence, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend à titre de principe actif une cellule choisie parmi une cellules souche, une cellule de la moelle osseuse, une cellules hématopoïétique ou une cellule d'hépatocarcinome génétiquement modifiée pour surexprimer le gène de la zyxine ou un fragment fonctionnel de celui-ci.
Préférentiellement, la composition pharmaceutique de l'invention comprend comme agent actif une cellule CD34+ génétiquement modifiée pour surexprimer le gêne de la zyxine ou un fragment fonctionnel de celui- ci.
Tout préférentiellement, la composition pharmaceutique de l'invention comprend comme agent actif une cellule issue d'un patient atteint d'une pathologie tumoral génétiquement modifiée pour exprimer le gène de la zyxine ou un fragment fonctionnel de celui-ci.
L'invention a également pour objet une cellule génétiquement modifiée surexprimant le gène de la zyxine.
L'invention a également pour objet une cellule génétiquement modifiée sous-exprimant le gène de la zyxine.
Une telle cellule peut être obtenue, par exemple, à l'aide d'un ARN antisens ciblant l'AUG de la zyxine et introduit dans les cellules par l'intermédiaire d'un oligonucléotide de synthèse clone dans la navette comprenant le vecteur de transport.
De préférence les cellules génétiquement modifiées selon l'invention sont choisies parmi une cellule souche, une cellule de la moelle osseuse, une cellule hématopoïétique ou une cellule d'hépatocarcinome.
Avantageusement les cellules génétiquement modifiées selon l'invention sont des cellules CD34+.
Selon un mode de mise en œuvre préféré, les cellules génétiquement modifiées selon l'invention sont issues d'un patient atteint d'une pathologie tumoral.
Un autre mode de réalisation de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant comme agent actif un composé liant l'actine polymérisée F avec une constante d'affinité supérieure d'au moins deux logs à la constante d'affinité avec laquelle ledit agent actif lie l'actine non-polymérisée G.
Dé préférence, les agents actifs de la composition de l'invention ont une constante d'affinité de l'ordre de 107-108 M"1 pour l'actine polymérisée F.
Selon un mode particulier de mise en œuvre de l'invention, l'agent actif liant l'actine polymérisée est un peptide cyclique.
L'invention concerne également un mammifère transgénique non-humain comportant au moins une cellule génétiquement modifiée sous-exprimant le gène de la zyxine ou un fragment fonctionnel de celui-ci.
L'invention a également pour objet un mammifère transgénique non-humain comportant au moins une cellule génétiquement modifié sous-exprimant le gêne de la zyxine ou un fragment fonctionnel de celui-ci.
L'invention concerne également une méthode d'identification de composés capables de stabiliser le réseau d'actine du cytosquelette d'une cellule, consistant à détecter une réversion phénotypique de l'expression de la zyxine induite par lesdits composés, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact des composés à tester avec ladite cellule, b) la quantification de l'expression de la zyxine dans ladite cellule. Selon une mise en œuvre particulière de la méthode de l'invention, la quantification de l'expression de la zyxine est effectuée par comparaison de l'expression des ARN messagers de la zyxine dans ladite cellule en présence et en absence dudit composé à tester.
Selon un autre mise en œuvre particulière de la méthode de l'invention, la quantification de l'expression de la zyxine est effectuée par comparaison de l'expression de la protéine zyxine dans ladite cellule en présence et en absence dudit composé à tester
L'invention a également pour objet une méthode de diagnostic d'une pathologie tumoral comportant les étapes suivantes : a) le prélèvement des cellules d'un patient, b) la quantification de l'expression de la zyxine dans les cellules prélevées
Selon un mode de mise en œuvre préféré de la méthode de diagnostic de l'invention, la quantification de l'expression de la zyxine est effectué par mesure de l'expression des ARN messagers de la zyxine.
Selon une autre forme de mise en œuvre de la méthode de diagnostic selon l'invention, la quantification de l'expression de la zyxine est effectuée par comparaison de l'expression de la protéine zyxine des cellules prélevées audits intervalles différents .
L'invention a aussi pour objet l'utilisation de la méthode de détection d'une réversion phénotypique d'expression de la zyxine pour déterminer l'efficacité d'un traitement anti-tumoral chez un patient en mesurant l'expression du gène de la zyxine dans des cellules dudit patient obtenues à deux intervalles différents durant le traitement anti-tumoral de celui-ci. Ainsi l'invention a pour objet une méthode d'analyse d'un phenotype tumoral d'un patient caractérisé en ce qu'elle comporte les étapes suivantes: a) le prélèvement des cellules du patient à deux intervalles de temps différents, b) la quantification de l'expression de la zyxine dans les cellules prélevées audits intervalles différents . c) la comparaison des deux niveaux d'expression pour constituer un profil différentiel phénotypique dudit patient .
Selon un mode de réalisation de la méthode d'analyse de l'invention, la quantification de l'expression de la zyxine est effectué par comparaison de l'expression des ARN messagers des cellules prélevés audits intervalles différents .
Selon un mode de réalisation de la méthode d'analyse de l'invention la quantification de l'expression de la zyxine est effectuée par comparaison de l'expression de la protéine zyxine des cellules prélevées audits intervalles différents.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode de criblage d'un composé actif dans le traitement des cancers, comprenant les étapes suivantes : a) l'incubation de cellules tumorales avec ledit composé actif, b) la mesure de la stabilisation de la polymérisation du réseau d'actine desdites cellules.
L'invention concerne également l'utilisation d'une substance capable de rétablir les réseaux d'actine d'une cellule pour la préparation d'un médicament antitumoral non cytotoxique. L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une telle substance pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention d'une pathologie résultant d'une anomalie chromosomique au niveau du bras long du chromosome 7, plus particulièrement au niveau de la région 7q34/q35.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une telle substance pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une hémopathie maligne associées à une anomalie chromosomiques dans la région du gène de la zyxine 7q34/q35.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une substance pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des hépatocarcinomes ou des cancers neuroectodermiques .
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une substance pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des tumeurs mésenchymateuse, notamment les sarcomes.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une telle substance pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention du sarcome de Ewing .
D'autres avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des travaux expérimentaux effectués par la demanderesse décrits dans la section Matériel et méthodes ci-après et dans laquelle on fait référence aux figures en annexe dans lesquelles:
- La figure 1 est un schéma des interactions entre la zyxine et ses partenaires cellulaires au niveau de la membrane plasmique. la figure 2 représente un schéma de la construction du vecteur de transport viral associé à la zyxine .
- la figure 3 montre les images des structures cellulaires révélées spécifiquement. La figure 3A montre des filaments d'actine révélés par marquage des cellules avec une sonde phalloïdine couplée au FITC. La figure 2B montre la localisation de la zyxine révélée par marquage des cellules avec un anticorps anti-zyxine révélé avec un anticorps anti-IgG de souris couplé au TRITC. - La figure 4A illustre les résultats du
Northern blot avec la détection des ARNm zyxine, à partir de lOμg d'ARN total, par la sonde zyxine humaine de 250pb.
La figure 4B est une représentation schématique de la navette rétrovirale contenant le cadre de lecture de la zyxine, des ARNm contenant le cadre ouvert de lecture de la zyxine humaine et des sondes néo/CMV et zyxine utilisées pour la révélation des Northern blot.
La figure 5 illustre les résultats du Northern blot avec la détection de l'ARNm issu du LTR 5', à partir de lOμg d'ARN total déposé sur gel d'agarose dénaturant, par la sonde néo/CMV de 1081pb.
- La figure 6 montre les images du Western blot et d' immunodétection de la protéine zyxine dans les différentes lignées cellulaires à partir de 60μg d'extraits protéiques issus des différentes lignées cellulaires.
- La figure 7 illustre les images de Western Blot obtenues après immunoprécipitation des extraits protéiques la protéine EWS-FLI-1 extraite des clones E-F zyxin . - La figure 8A représente la séquence de
1' antisens .
- La figure 8B est un schéma de la construction de la navette rétrovirale exprimant l' antisens contre l'AUG de la zyxine . - La figure 8C montre la détection par RTPCR de l'ARN antisens dirigé contre l'AUG de la zyxine.
- La figure 9 montre les images de Western blot et de l' immunodétection de la protéine zyxine à partir de 40μg d'extrait protéiques issus des différentes lignées cellulaires .
- la figure 10 est une représentation graphique de l'étude comparative des variations des taux d'expression des gènes, réalisée par macro-arrays, entre la lignée NIH3T3 et les lignées EWS-FLI, as zyxine 1 et as zyxine 2.
- la figure 11 illustre la mesure in vitro de la polymérisation d'actine par anisotropie de fluorescence.
-les figures 12A à 12G montrent les résultats de l'étude de la modification morphologique des cellules NIH3T3 et EWS-Fli en présence de Dolastatine (DU : Cellules non traitées NIH3T3 (figure 12A) ; cellules NIH3T3 transfectées par EWS-Fli (Figues 12B, 12C) ; (cellules NIH3T3 transfectées par EWS-Fli incubées en présence de 10 μM (figure 12D) ou lOOμM (Figure 12E) de Jasplakinolide ou incubées avec lOμM (Figure 12F) ou 20μM (Figure 12G) de DU.
- la figure 13 montre les résultats de l'étude de la toxicité de la Dolastatine 11 (DU) sur les cellules NIH3T3 et EWS/Fli. - la figure 14 montre les résultats de l'étude du développement de tumeurs chez la souris nude en présence de Dolastatine 11.
- la figure 15 montre les résultats de l'étude de la vitesse de déplacement des cellules par microscopie en contraste de phase.
- la figure 16A montre la structure chimique de la Dolastatine 11
- la figure 16B montre la structure chimique du Jasplakinolide
Matériel et méthodes
I - Corrélation entre phenotype tumoral et sous-expression de zyxine.
1- Description et culture cellulaire L'ensemble des lignées cellulaires est cultivé à 37°C en atmosphère humide contenant 5% de C02. Mis à part les GP+envAml2, elles sont entretenues dans du milieu DMEM
(GIBCO) supplémenté par 10% de sérum de veau nouveau-né (GIBCO) et d'antibiotiques (pénicilline à lOOUI/mL et streptomycine à lOOμg/mL) .
La lignée EWS-FLI contient un ADNc codant pour la protéine de fusion EWS-FLI-ldans son génome. L'expression de cette protéine est sélectionnée à l'aide de 2 , 5μg/mL de puromycine .
La lignée AS-A, réalisée par M. Hervy et coll . , produit un petit ARN antisens dirigé contre l'ARNm codant pour la protéine EWS-Fli-1. Cette lignée est sélectionnée, en plus de la puromycine, de lmg/mL de généticine. La généticine permet de sélectionner les cellules qui produisent le petit ARN antisens dirigé contre l'ARNm codant pour la protéine EWS-FLI-1. Les lignées NIH3T3 AS zyxine sont des cellules qui produisent un petit ARN antisens dirigé contre l'AUG de l'ARNm codant pour la zyxine. Elles sont cultivées dans un milieu supplémenté de généticine à lmg/mL afin de sélectionner l'expression de 1' antisens. Les cellules GP+env Aml2, sont des cellules transcomplëmentantes capables de fournir en trans les protéines codés par les gènes gag et pol, portées sur un plasmide, et env porté par un autre plasmide. Cette lignée est capable de produire des particules virales amphotropes . Cette lignée est cultivée dans un milieu contenant du DMEM et 10% de sérum de veau fœtal (GIBCO) supplémenté de pénicilline et streptomycine. Ces cellules sont sélectionnées à l'aide d'un mélange de trois composés (200μg/mL d'hygromycine B, 15μg/mL d'hypoxanthine, 250μg/mL d'acide mycophénolique) pendant deux semaines avant transfection par la navette rétrovirale.
Immunofluorescence
Les cellules sont ensemencées sur des lames de verre jusqu'à ce qu' elles adhèrent (de 24H à 48H) . les cellules sont fixées avec une solution de paraformaldéhyde 3% rincées au PBS et perméabilisées avec une solution PBS/0,2% triton X100. Les cellules perméabilisées sont saturées avec une solution PBS/2%BSA. Dans le cas de 1 ' immunocoloration de la protéine zyxine, les cellules sont incubées avec l'anticorps primaire (anti-zyxine de J.Wehland) dilué deux fois pendant 40 min, rincées 3 fois 5 min au PBS et ensuite incubées avec l'anticorps secondaire anti IgG de souris couplé au Texas Red (TRITC) pendant 40 min. Pour 1 ' immunocoloration de l'actine les cellules sont incubées directement avec de la phalloïdine couplée au FITC pendant 40 min. Les lamelles sont observées au microscope à fluorescence .
3 - Construction :
3.1 - Génération du vecteur pLNCX ADA (adaptateur) à partir du pLNCX.
Le vecteur rétroviral pLNCX contient d'une part les séquences LTRs et la séquence psi issues du virus de la leucémie murine de Moloney (MoMLV) et d'autre part le gène de résistance à la néomycine, conférant la résistance à la généticine, sous la dépendance du promoteur du LTR en 5 ' . Ce vecteur contient aussi un site de multiclonage (MCS) directement sous la dépendance du promoteur précoce du cytomégalovirus (pCMV) . Le vecteur pLNCX est digéré par HindIIl/Clal au niveau du MCS pour y insérer une séquence contenant deux adaptateurs qui sont capables de s'autoassocier de façon complémentaire. Entre ces deux adaptateurs, cette séquence contient d'autres sites de restriction uniques dont Nsil et Sali.
3.2 - Génération d'un vecteur rétroviral codant pour la zyxine humaine.
Le plasmide pzyxine GFP contient l'ADNc codant pour la zyxine humaine couplé en phase au gène de la "green fluorescent protein" GFP (donné par M. Beckerle) . Il est digéré par Hind III et BamH I puis clone dans le vecteur PLNCX au niveau du MCS {HindH I/BglII) ; BamHI et BglII sont des sites compatibles . La digestion par Hind Il/BglII élimine l'un des deux adaptateurs, ceci empêchant une autoassociation de l'ARN codant pour la zyxine produit par ce vecteur.
Le résultat de cette construction est un vecteur rétroviral nommé pLNCX ADA zyxine, codant pour la zyxine humaine sous l'influence directe du pCMV.
3.3 - Génération d'un vecteur produisant un antisens dirigé contre la zyxine: pLNCX ADA as zyxine pLNCX ADA sa zyxine est un vecteur qui a la capacité de produire un petit ARN en structure tige boucle dirigée contre l'AUG de l'ARNm codant pour la zyxine, directement sous la dépendance du promoteur pCMV.
La construction du vecteur est réalisée en insérant au niveau des sites Nsil et Sal I du MCS une petite séquence dirigée contre l'AUG de l'ARNm de la zyxine .
4 - Transfection
La navette rétrovirale du vecteur est transformée en virus correspondant en transfectant le vecteur rétroviral dans une lignée de cellule transcomplémentante GP+envAM12 (GPA) . La lignée transcomplémentante GPA est transfectée par la navette rétrovirale (pLNCX zyxine ou PLNCX ADA as zyxine) en présence de Superfect (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur.
Les cellules exprimant le gène néor sont sélectionnées dans un milieu contenant lμg/mL de G418. Les cellules résistantes sont recueillies, amplifiées et ensemencées en flacon de 75cm2 à raison de 2.106 cellules. Deux jours après, le milieu est remplacé par un milieu non sélectif. Le surnageant est récolté toutes les 24 heures pendant 3 jours, regroupé, aliquote et congelé. Le titre rétroviral est évalué sur les cellules NIH3T3 après sélection des cellules à la généticine (1 mg/mL) . Le surnageant viral des cellules GPA est ensuite utilisé pour infecter les cellules voulues avec une multiplicité d'infection de l'ordre de 0,1. Trois jours après l'infection, les cellules sont sélectionnées avec lμg/mL de G418. Seules les cellules qui ont intégré la navette rétrovirale résistent au G418 et forment des clones qui sont isolés et amplifiées afin de produire des lignées de cellules permanentes.
5- Immunoprécipitation.
Les cellules adhérentes sont trypsinées, culotées et rincées au PBS. Les cellules sont lysées avec du RIPA froid (lOmM Tris-HCL pH7,4, lOOmM NaCl, ImM EDTA, 1% Triton X100, 0.5% Na déoxycholate, 0,1% SDS) en présence d'un mélange de protéase (Boehringer) . Après 20min d'incubation sur roue à 4°C, les échantillons sont centrifugés 15 min à 14000 rpm. Les surnageants sont récupérées et la concentration en protéine est estimée par le test de Bradford. Un aliquot contenant 1,5 mg d'extrait protéique total est incubé 1H30 à 4°C avec 0,2 μg d'anticorps dirigé contre de domine C terminal de Fli-1
(Santa Cruz SC-356) et ensuite 1 heure avec 20μL d'un mélange de billes d'agarose couplées à la protéine A et de billes couplées à la protéine G (Sigma) . Après trois lavages au RIPA froid, les billes sont remises en suspension dans 20μL de tampon Laemmli 2X et sont portées à ébullition pendant 10 min. Les échantillons sont ensuite analysés par un immunoblot classique utilisant pour incubation de l'anticorps primaire, une solution contenant lμg d'anti-Fli-1 dans 5mL de TBS- 0,1% (v/v) Tween. 6 - Western blot
L'analyse du taux de production de la protéine zyxine est réalisée par Western blot sur un extrait de cellule total en utilisant comme anticorps primaire, l'anticorps anti-zyxine monoclonal de souris donné par J. Wehland dirigé contre la région située entre le NES et les domaines LIM. Cette membrane est révélée par un réactif chimioluminescent (Immunostar : Biorad) .
7 - Analyse des ARN.
7.1 - Northern blot
L'extraction des ARN totaux des différentes lignées cellulaires est réalisée en utilisant la solution de lyse RNAplus (Quantum Biotechnologie) selon les recommandations du fournisseur. Un aliquot de lOμg d'ARN total est dénaturé dans une solution contenant 0,04 M MOPS pH7, 0,01M d'acétate de sodium, 2,2 M formaldéhyde et 50% formamide. Les échantillons sont analysés sur gel d'agarose dénaturé au formaldéhyde et transférés sur membrane de nylon chargé (Hybond N+ : Amersham Pharmacia). La membrane est hybridée avec une sonde d'ADNc radiomarquée au [32P] dCTP par amorçage aléatoire (random priming) (Prime-a-gene® labeling System: Promega) dans une solution de préhybridation contenant 5X SSC, 5X Denhart's, 0,lmg/mL d'ADN de sperme de saumon, 0,1 mg/mL d'ARN-t de levure, 0,1% SDS, 25 M pH7 KH2P04 et 50% formamide à 42°C toute la nuit. Le lendemain la membrane est rincée trois fois avec du SSC2X/ 0,1%SDS à température ambiante et une à deux fois à 42°C avec du 0,5 X SSC / 0,1% SDS. Les signaux de la membrane sont ensuite observés au phospholmager.
7.2 - RT-PCR
Les ARN totaux sont produits par la même technique décrite ci-dessus. La qualité et propreté des ARN est vérifiée sur gel dénaturant. La rétrotranscription est réalisée à l'aide du kit Omniscript™ de Qiagen de manière spécifique à l'aide d'une amorce 20 mers LTR. Les conditions utilisées sont 10 ng d'amorce LTR, 2,5 mM dNTP, Iμg d'ARN total supplémenté de 2OU d'inhibiteur de RNase
(RNAsin®) , tampon RT et 40U de transcriptase inverse. Le mélange est incubé une heure à 37°C et 5 min à 94°C. Les produits de RT des ADNc spécifiques qui sont amplifiés par PCR à 1 ' aide de deux autres amorces nommées as 1 et as 2.
Les conditions réactionnelles sont 0,25mM dNTP, lOOng de chacunes des amorces et l/20etne du produit de RT, l,5mM
MgCl2, tampon Taq pol et 1U d'enzyme Taq pol (Perkin Elmer
N801-0060) . Les cycles utilisés sont 4 min 94°C et 30cycles (30s 94°C, 45s 61°C, 1 min 72°C) et 10 min à 72°C.
LTR: AGATATCCTGTTTGGCCAT AS1 : GCCGTGCATCATCCTGACTG AS2 : CTGTTCCTGACCTTGATCTG
8 - Test de tumorigénicité
Les cellules provenant des différents clones à tester sont trypsinées, culotées et resuspendues dans du PBS stérile à raison de 5.106 cellules par mL. Un aliquot de 200μL de cellules est injecté par voie sous cutanée chez des souris nudes âgées de 6 à 8 semaines, irradiées la veille à 5 Gray. Les souris sont élevées dans une atmosphère stérile et climatisée. L'observation du développement des tumeurs est réalisée chaque semaine durant 5 à 6 semaines.
9 - Expérience de macro-array
La carte d'expression des ADNc "Atlas cDNA expression Arrays" (Clontech) est réalisée selon les recommandations du fournisseur. Deux membranes de nylon identiques (n°7741-l) sur lesquelles sont déposés 588 échantillons d'ADNc de souris, correspondant à 588 gènes permet d'hybrider en parallèle les ADNc des deux lignées cellulaires différentes. Des informations concernant les 588 gènes sont disponibles sur le site Clontech (http://www.clontech.com/atlas.genelist/search.htlm). La préparation des sondes ADNc radiomarquées est réalisée par rétrotranscription avec du [32P] dATP en utilisant le kit Clontech. L'hybridation est réalisée selon les instructions du fournisseur. Les signaux sont observés au Phospholmager.
RESULTATS
1 - Etude du rôle de la zyxine dans la transformation cellulaire induite par la protéine de fusion EWS-FLI.
1.1 - Etablissement de lignées EWS-FLI surexprimant la zyxine
La surexpression de la zyxine dans les cellules NIH3T3 exprimant la protéine de fusion EWS-Fli (EWS-FLI) a été réalisée par infection en utilisant la navette rétrovirale pLNCX. Le cadre de lecture ouvert correspondant à la zyxine, issu du plasmide pZyxine-GFP (figure 2) , est introduit dans le site de uticlonage du plasmide pLNCX situé en aval du promoteur CMV. Ainsi, il a été obtenu le plasmide dénommé pLNCX-zyxine qui contient les deux séquences LTR (5' et 3'), la séquence PSI+ nécessaire à
1' encapsidation de l'ARN rétroviral, le gène NéoR responsable de la résistance à la généticine sous la dépendance du LTR5'et le cadre de lecture de la zyxine humaine sous l'influence du promoteur CMV (figure 2) .
La production de virus est obtenue par transfection de ce plasmide dans une lignée d' encapsidation murine amphotrope dénommée GPA. Les cellules EWS-FLI sont infectées à l'aide du surnageant viral produit par les cellules GPA et sélectionnées en présence de Généticine.
Les clones ainsi obtenus sont dénommés E- F/Zyxine. L'étude par microscopie de fluorescence (figure 3) montre que les cellules EWS-FLI ont perdu les faisceaux de micro filament d'actine et la capacité à s'étaler, caractéristiques typiques des fibroblastes transformés (Pollack, R et coll ; 1975, Maness, P, E; 1981) . En revanche, les cellules des clones E-F/ Zyxine ont partiellement récupéré la structure des microfilaments d'actine ainsi que la capacité d'étalement des cellules NIH3T3 (figure 4) . De plus, ces cellules ne présentent plus la capacité de croissance en multicouches, typique des cellules transformées. En parallèle de ces modifications de structure, on observe une relocalisation de la zyxine au niveau des plaques d'adhérence, dans les jonctions intercellulaires et le long des cables de stress (figure 3) .
2 - Expression de l'ARNm de la zyxine dans les cellules E-F zyxine.
L'analyse par Northern Blot montre que l'ARN codant pour zyxine est plus faiblement exprimé dans la lignée tumorigène EWS-FLI que dans la lignée NIH3T3 (figure 4). Ce résultat confirme la différence d'expression observée précédemment, par microarrays, entre les cellules NIH3T3 et EWS-FLI. La taille attendue de l'ARNm zyxine humaine issu de la navette rétrovirale et exprimé à partir du promoteur CMV (2,2 kb) (figure 4B) est identique à celle de l'ARNm endogène de la zyxine. Il est donc très probable que l'augmentation de l'intensité de la bande que l'on observe, dans les trois clones E-F/zyxine, soit due à l'expression de l'ARN zyxine exprimé à partir de la navette rétrovirale. Par ailleurs un autre ARN de taille supérieure à 4,7kb est représenté uniquement dans les ARN issus des clones E-F/zyxine. Cet ARN a une taille comprise entre 5,5 et 6 kb compatible avec un ARN qui serait exprimé à partir du promoteur situé dans la région U3 du LTR 5' (5,7 kb) de la navette rétrovirale (figure 4B) .
Pour vérifier cette hypothèse, un second
Northern blot a été réalisé en utilisant une sonde (néo/CMV) de 108lpb, correspondant à un fragment de restriction issu du plasmide pLNCX ADA zyxine, capable de détecter uniquement l'ARN issu du LTR 5' (figure 5) .
Le résultat présenté sur la figure 5, révèle une hybridation uniquement dans les clones E-F zyxine. En se référant à la position de l'ARN 28S, observable aux UV, la bande détectée est positionnée au même niveau que la bande indéterminée présente dans le Northern blot utilisant la sonde zyxine . On peut donc en conclure que la navette rétrovirale produit deux ARN contenant la séquence zyxine, l'un issu du promoteur CMV et l'autre issu du promoteur présent dans le LTR 5' .
3 - Etude de la surexpression de la protéine zyxine exogène .
Pour déterminer si les clones E-F zyxine contenant l'ARN zyxine issu de la navette rétrovirale sont capables de produire la protéine correspondante, un Western blot immunorévélé par un anticorps anti-zyxine a été réalisé. Les résultats de cette expérience sont présentés sur la figure 6. Pour l'ensemble des lignées, on détecte une bande spécifique et unique d'une protéine de masse moléculaire légèrement supérieure à 80 kDa. Cette masse moléculaire est en accord avec la masse moléculaire apparente de la zyxine (82 kDa) décrite par Schmeichel et al . , 1998. La sous expression de l'ARNm de la zyxine dans la lignée EWS-Fli par rapport à la lignée NIH3T3 se traduit par une diminution de la protéine correspondante .
De la même façon, la surexpression de la zyxine au niveau ARN des clones E-F zyxine 1, 2 et 3 se traduit par une restauration du taux de la protéine zyxine proche de celui la lignée NIH3T3. Ces résultats montrent donc une corrélation entre le taux d'ARN produit par les cellules et le taux de protéine exprimée. En conclusion, l'introduction de l'ADNc codant pour la zyxine dans les cellules transformées EWS-FLI, permet de restaurer le taux d' expression de cette protéine à un niveau comparable voir supérieur à celui des cellules parentales NIH3T3. La surexpression de la protéine zyxine est très probablement due à l'ARN exprimé à partir du promoteur CMV. En effet, dans le cas de l'ARN minoritaire issu du LTR 5', le cadre de lecture de la phosphotransférase APH (3') II (Davies et Smith, 1978) , conférant aux cellules la résistance à la généticine est traduit. L'absence de séquence interne d'initiation de la traduction empêche donc le cadre ouvert de lecture de la zyxine humaine, en aval, d'être traduit.
4 - Etude de l'expression de EWS-FLI-1 dans les clones E-F zyxine
En parallèle, il a été vérifié que les clones E-F zyxine étudiés conservent l'expression de la protéine EWS-FLI-1, responsable du caractère tumorigène.
Pour ce faire, une étude de l'expression de la protéine EWS-FLI-1 est effectuée par Western blot après immunoprécipitation des extraits protéiques des clones E-F zyxine (figure 7) . Les résultats, présentés sur la figure 7, montrent une détection spécifique d'une protéine de masse moléculaire supérieure à 61 kDa. Cette masse est compatible avec la masse moléculaire apparente de la protéine EWS-FLI-1 attendue (68 kDa) . Sous cette bande, d'autres bandes apparaissent. Elles correspondent au produit de denaturation de l'anticorps utilisé pour 1' immunoprécipitation (chaînes lourdes (50 kDa) de l'anticorps anti Fli-1) .
La différence d'intensité détectée en présence de deux quantités différentes d'extraits protéiques montre que la quantité d'anticorps utilisé n'est pas limitante. Pour pouvoir comparer l'intensité des bandes correspondant à la protéine EWS-FLI-1, la quantité de EWS-FLI-1 immunodétectée par la quantité d'anticorps anti-Fli-1 détectée a été corrigée. Les résultats présentés sous forme d'histogramme (figure 7B) indiquent l'absence de protéine EWS-FLI-1 dans la lignée NIH3T3 et une sous expression dans la lignée AS-A (exprimant un antisens dirigé contre la séquence de jonction EWS-FLI) par rapport à la lignée EWS- FLI. Pour les clones E-F zyxine, la quantité de protéine EWS-FLI-1 est nettement supérieure à la quantité de protéine détectée dans la lignée AS-A non tumorigène et reste comparable à la quantité présente dans les cellules EWS-FLI tumorigènes.
On peut supposer que ces cellules conservent une quantité suffisante de protéine EWS-FLI-1 pour induire des tumeurs sous cutanées chez la souris nude. Ainsi, l'éventuelle perte de tumorigénicité des clones E-F zyxine ne sera pas due à une diminution de l'expression de la protéine EWS-FLI-1.
5 - Etude de tumorigénicité des clones E-F zyxine
La détermination de l'induction d'une perte une perte du phenotype malin chez la souris nude par la surexpression de la zyxine dans la lignée EWS-FLI est illustrée sur le tableau 1 ci-après.
Tableau 1
Ces résultats correspondent à l'étude du nombre de tumeurs développées chez la souris nude après injection sous cutanée de 106 cellules de différentes lignées cellulaires durant 5 semaines. Les cellules sont injectées 24 heures après l'irradiation des souris à 5 Gray
L'injection de cellules NIH3T3 n'entraîne pas de développement de tumeur. Cette lignée est utilisée en tant que contrôle négatif puisqu'elle est connue pour être non tumorigène. En revanche, pour la lignée EWS-FLI, connue pour être tumorigène, toutes les souris ont développé des tumeurs entre la 2eme et la 3eme semaine. En ce qui concerne l'étude de tumorigénicité du clone E-F zyxine deux cas de figure peuvent se présenter, soit il n'y a pas de développement de tumeurs (trois souris sur cinq) soit on observe un retard dans le développement des tumeurs d'environ deux à trois semaines (deux souris sur cinq). L'analyse de ces tumeurs montre que l'ADN de la navette rétrovirale est toujours présent, en revanche, l'ARN exogène codant pour la zyxine n'a pas pu être détecté. Il apparaît donc que le développement de tumeurs retardées, dans les souris, est dû à une perte de l'expression de la protéine zyxine exogène.
6 - Etude de la sous expression de la zyxine dans l'acquisition du phenotype tumoral.
6.1 - Etablissement de lignées NIH3T3 sous- exprimant la zyxine. Etant donné l'importance du taux d'expression de la zyxine dans le maintient du phenotype tumoral des cellules NIH3T3 transformées par la protéine de fusion EWS- FLI, la demanderesse a voulu déterminer les conséquences d'une diminution forcée de cette protéine dans des lignées cellulaires non tumorigenes. Pour ce faire, un petit ARN antisens ciblant l'AUG de la zyxine a été utilisé (figure 8 A) . Cet ARN antisens a été introduit dans les cellules par l'intermédiaire d'un oligonucléotide de synthèse clone dans la navette pLNCX au niveau des sites de restriction Nsil/ Sali (figure 8B)
Dans les trois clones sélectionnés (en présence de G418 1 mg/ml) et qui ont été dénommés AS-ZYX 1, 2 et 3 , l'expression de l' antisens (figure 8C) s'accompagne d'une diminution de la protéine Zyxine (figure 9) . Cette diminution d'expression est du même ordre que celle que l'on détectait dans les cellules NIH3T3 transformées par la protéine de fusion EWS-FLI.
Cette diminution du taux d'expression de la zyxine dans les cellules NIH3T3 se traduit par un changement morphologique important des cellules. On peut ainsi observer une perte importante des expansions cytoplasmiques et d'adhérence ainsi que des modifications notables de la structure des filaments d'actine (figure 3). Ces changements morphologiques, typiques de cellules transformées, s'accompagnent également de modifications dans les caractéristiques de multiplication de ces cellules. Ainsi, le temps de doublement de ces cellules (20-22 heures) est intermédiaire entre celui des cellules transformées EWS-FLI (17-18 heures) et celui des cellules parentales NIH3T3 (24-26 heures) . Ces données indiquent également que les cellules AS-zyxine, comme les cellules EWS-FLI, ont perdu l'inhibition de contact.
6.2 - Etude de tumorigénicité des clones AS- zyxine .
Les tests de développement de tumeurs chez la souris nude corroborent les changements morphologiques et les modifications de croissance observés entre les cellules exprimant l' antisens dirigé contre la zyxine et les cellules NIH3T3 parentales (tableau 2) . Il existe un léger retard dans l'apparition des tumeurs à partir des clones AS-zyxine par rapport à celui que l'on observe à partir de la lignée tumorale EWS-FLI, mais les trois clones développent des tumeurs . La vitesse de développement des tumeurs après l'injection de cellules EWS-FLI est également plus rapide que celle observée suite à l'injection des clones AS-Zyxine. Ces deux observations découlent vraisemblablement de la vitesse de multiplication intrinsèque des cellules.
Tableau 2
Tableau 2 : Test de tumorigénicité : étude du nombre de tumeurs développées après injection sous cutanée chez la souris nude de 106 cellules de différentes lignées cellulaires durant six semaines.
7 - Comparaison du profil d'expression des gènes entre la lignée NIH3T3, et AS-zyxine. L'étude comparative de l'expression des gènes, par la technique de " cDNA expression Arrays " , entre les cellules NIH3T3 et les clones AS-zyxine 1 ou 2, montre que l'inhibition de la zyxine perturbe l'expression génique. Dix et treize gènes respectivement ont été identifiés dans les clones AS-zyxine 1 et 2 dont l'expression est modifiée par rapport au cellules NIH3T3 (figure 10) . Parmi ces différents gènes, neuf sont communs aux deux clones.
Ces gènes peuvent être regroupés en quatre familles : les suppresseurs de tumeurs (EGR1 et p53) , les protéines impliquées dans la réparation (ERCC-1) , les protéines jouant un rôle dans la différenciation et la croissance cellulaire (ADAP, IGFBP-4, ICE) et les protéines intervenant sur la matrice cellulaire (TIMP2, PN-1 et urokinase plasminogen activator) . De plus, neuf de ces gènes avaient été identifiés lors de l'analyse des profils d'expression entre la lignée NIH3T3 parentale et la lignée transformée par EWS-FLI (figure 10) . Ces résultats montrent très clairement que le taux d'expression de la zyxine, dans les cellules utilisées, influence le processus de régulation génétique.
8. Approche pharmacologique du traitement de cancers par stabilisation du réseau d'actine.
8.1 Mesure in vitro de la polymérisation d'actine par anisotropie de fluorescence.
Des extraits cellulaires des cellules NIH3T3 ou EWS-Fli sont mis en présence d'actine Alexa 488 dans un tampon G (4,3 μM Tris pH 8,1 ; 170 μM CaCl2 ; 170 μM DTT ; 170 μM ATP) . La réaction de polymérisation est déclenchée par l'ajout d'un tampon P (KC1 51 mM, MgCl2 1 mM et ATP 0,5 mM) . La dolastatine (μM) est ajoutée aux extraits cellulaires des cellules EWS-Fli en même temps que le tampon P. La polymérisation de l'actine est suivie par anisotopie de fluorecence sur un Beacon 2000. Les résultats obtenus sont illustrés figure 11.
8.2 Etude de la modification morphologique des cellules NIH3T3 et EWS-Fli en présence de Dolastatine (DU) . Les cellules (5xl03 ) sont ensemencées sur des lames de verre de 10 mm de diamètre et mis en culture pendant 24 heures. Après fixation (paraformaldéhyde 3%) et perméabilisation (TritonXlOO 0,2%) les filaments d'actine des cellules sont immunocolorés par l'intermédiaire de phalloidine couplée au FITC. Cellules non traitées NIH3T3 ; NIH3T3 transfectées par EWS-Fli (EF) ; (EF) incubées en présence de 10 μM ou lOOμM de Jasplakinolide ; EF, incubées avec lOμM ou 20μM de DU. (Figure 12)
Ces résultats montrent que l'effet de ces deux agents actifs, la Jasplakinolide ou de la Dolastatine-11 sur le cytosquelette.
8 3 Etude de la toxicité de la Dolastatine 11 (DU) sur les cellules NIH3T3 et EWS/Fli .
Des cellules (104 par puits) sont ensemencées dans des plaques 96 puits en présence de différentes concentrations de DU. Le suivi de la toxicité de la DU en fonction du temps a été réalisé par l'intermédiaire d'un test MTT sur les cellules NIH3T3 (A) et EWS-Fli (B) . Les résultats sont ilustrés figure 13.
8.4 Etude du développement de tumeurs chez la souris nude en présence de Dolastatine 11. Vingt quatre heures après irradiation (5 Gy) des souris, les cellules EWS-Fli (106) sont ensemencées par voie sous-cutanée. Les souris sont alors séparées en deux lots, le premier lot correspond aux souris non traitées et le deuxième lot aux souris ayant reçu, par voie intraveineuse, trois injection de Dolastatine 11 (10 μg/kg) au 5, 8 et neme jour après l'injection des cellules EWS- Fli . Les mesures du développement des tumeurs ont été effectuées au 28eme jour, ils sont ilustrés figure 14.
8.5 Etude de la vitesse de déplacement des cellules par microscopie en contraste de phase.
Les cellules sont ensemencées (20 % de la confluence) sur des lames de verre de 20 mm de diamètre. Trois jours après ensemencement, les lames de verre sont placées dans des chambres hermétiques, régulées en température (37°C) et en C02 (5%) . La mesure de motilité des cellules est effectuée par prise de photographie en microscopie optique de contraste de phase toutes les 4 minutes pendant 24 heures. Les analyses de motilité, réalisées à l'aide du programme « metamorph », sont effectuées pour chaque type cellulaire, sur dix cellules. Les résultats sont ilustrés figure 15.
8.6 Analyse des résultats
Les études de polymérisation de l'actine , par anisotropie de fluorescence (figure 11) , réalisées par la demanderesse à partir d'extraits soit de cellules non tumorales (NIH3T3) soit de cellules tumorales EWS-Fli montrent que les extraits des cellules NIH3T3 ont une capacité à polymériser l'actine bien plus importante que les extraits des cellules EWS-Fli. Cependant, l'ajout de Dolastatine 11 (R Bai et coll ; Molecular " Pharmacology :2001) dans le tampon de polymérisation des extraits des cellules EWS-Fli permet de compenser en partie ce déficit des cellules EWS-Fli (figure 11) .
En fonction de ces résultats obtenus sur les extraits, la Demanderesse a analysé si cette capacité de la Dolastatine 11 (DU) à stabiliser l'actine polymérisée pouvait conduire à une réversion morphologique identique à celle qui a été observée lorsque le taux d'expression de la protéine zyxine a été rétabli dans ces cellules tumorales EWS-Fli.
Le traitement des cellules EWS-Fli par 10 ou 20 nM de Dolastatine 11 permet non seulement de restaurer les fibres de stress des cellules, avec une morphologie qui se rapproche de celle des cellules NIH3T3, mais elle permet également de rétablir les structures de contacte entre les cellules (figure 12) .
En revanche, les mêmes concentrations de Dolastatine 11 ne modifient aucunement la morphologie des cellules NIH3T3 (figure 12) . De plus, de manière tout à fait surprenante, pour ces faibles concentrations en Dolastatine 11, aucun effet de cytotoxicité ou de cytostaticité n'est observé sur les deux lignées cellulaires (figure 13) . Les expériences réalisées sur les souris nudes confirment les résultats obtenus in vitro. Le développement des tumeurs dû à l'injection par voie sous- cutanée de cellules EWS-Fli est nettement retardé par l'injection par voie intra-veineuse de la Dolastatine 11 (figure 14). Ces expériences son d'autant plus intéressantes qu'elles ont été réalisées avec une concentration de Dolastatine 11 (10 μg/kg) cinq fois plus faibles que la dose n'affectant pas la survie des souris.
Bien que d'autres composés de la famille des dolastatines, comme D10 et D15 qui ciblent les filaments de la tubuline, aient été l'objet de plusieurs études, où ils sont utilisés à titre de composés actifs pour des traitements antitumoraux, ils ont toujours été utilisés en tant qu'agent cytotoxiques visant à tuer la cellule tumorale. Les doses nécessaires entraînant, de ce fait, des nombreux effets secondaires indésirables.
En revanche, les compositions pharmaceutiques de l'invention nécessitent, pour la reversion phénotypique du phenotype tumoral, des doses bien inférieures à celles connues de 1 ' art antérieur .
Lx ensemble de ces résultats montrent qu'il est possible d'utiliser une approche pharmacologique, non cytotoxique, permettant de rétablir le cytosquelette d'actine des cellules tumorales, dans le cadre de tumeurs induites, notamment par une sous expression de la zyxine.
Une des familles des cancers susceptibles d'être traités par les compositions pharmaceutiques de l'invention est la famille des mélanomes, dans laquelle la demanderesse a caractérise la sous-expression du gène de la zyxine .
Pour obtenir ces résultas, la demanderesse a caractérisé l'expression de plusieurs gênes dans une lignée de melanome murin, par rapport à l'expression de ces mêmes gènes dans une lignée non-tumorale.
Les cellules B16/F10 sont une lignée de melanome murin très agressive. Elles sont comparée à la lignée NIH3T3, non tumorigène. Les ARN totaux des deux lignées cellulaires sont amplifiés et radiomarqués par RT PCR. Les produits de RT PCR (ADNc) sont incubés avec des membranes Atlas® Mouse cDNA Expression Array Clontech (réf 7741-1) . Les membranes sont ensuite exposées et l'image est analysée avec le logiciel MicroArray®.
Les résultats de cette caractérisation sont illustrés dans le tableau 3 ci-dessous.
TABLEAU 3
Les cellules B16/F10 sont une lignée de melanome
Ces résultats montrent que le gène de la zyxine est sous-exprimé dans les mélanomes.
Discusion
Les travaux expérimentaux accomplis dans le cadre de la présente invention ont permis d'établir une relation entre le taux d'expression de la zyxine dans les cellules et l'acquisition ou le maintient du phenotype tumoral. L'étude du rôle de la zyxine dans la transformation néoplasique a été réalisée à la suite de plusieurs observations indirectes :
A) l'acquisition du phenotype tumoral des cellules NIH3T3, suite à l'expression de la protéine de fusion EWS-FLI dans ces cellules, ainsi que la perte de tumorigénicité, du fait de l'extinction de cette protéine oncogène, s'accompagne de modifications morphologiques importantes (figure 3) .
B) Le fait que la transformation maligne se traduit généralement par des modifications des capacités d'adhérence et de motilité. Ces modifications sont toujours reliées à une déstructuration des filaments d'actine. C) Parmi la dizaine de gênes identifiés comme étant directement sous la dépendance de la protéine oncogène EWS- FLI, la zyxine est le seul qui joue un rôle dans la structuration du cytosquelette, l'adhérence et la motilité cellulaire.
Afin d'établir un lien direct entre la zyxine et la transformation maligne, d'une part un vecteur permettant de rétablir l'expression de la zyxine a été introduit dans une lignée tumorale (EWS-FLI) et d'autre part un vecteur exprimant un antisens dirigé contre l'AUG de la zyxine a été introduit dans une lignée non tumorigène (NIH3T3) . Les résultats obtenus montrent que la restauration de l'expression de la zyxine dans les lignées tumorales (figure 6) permet de diminuer considérablement le pouvoir tumorigène de ces cellules . Etant donné que la zyxine est une protéine très conservée (97% d'homologie entre l'homme et la souris) la différence de séquence entre la zyxine humaine et murine n'est très probablement pas à 1 ' origine de ce phénomène .
De plus, l'inhibition sélective de l'expression de la zyxine dans les fibroblastes NIH3T3, non tumorigenes
(figure 9) , conduit à la transformation maligne de ces cellules. Plusieurs autres données indiquent qu'il existe un lien direct entre l'effet observé sur la transformation maligne et le taux d.' expression de la zyxine. Certaines souris à qui l'on a injecté les cellules EWS-FLI surexprimant la zyxine humaine ont développé des tumeurs . L'analyse de ces tumeurs montre que le vecteur permettant d'exprimer la zyxine est toujours présent, en revanche l'ARN codant pour la zyxine humaine n'est plus détecté (expérience non présentée). L'analyse comparative des microarrays entre la lignée parentale NIH3T3 et les clones qui en dérivent et qui sous expriment la zyxine ne permet pas de détecter de modifications d'expression d'autres protéines du microfilament telles que l' α-actinine, la tropomyosine, l'actine ou la vinculine ou des protéines du cytosquelette comme la tubuline ou la vimentine (figure 10) .
Les résultats obtenus montrent clairement qu'il existe un lien directe entre le taux d' expression de la zyxine et la transformation maligne, bien que le mécanisme ne soit pas établi. Le cytosquelette d'actine, en association avec la membrane plasmique, s'organise en domaines spécialisés capables d'assurer des fonctions spécifiques dans la motilité (lamélipode) , l'adhérence
(plaque d'adhésion) ou l'interaction entre les celulles
(plaque de jonction) . Les études de microscopie de fluorescence (figure 3) montrent que la diminution d'expression de la zyxine dans les cellules se traduit par la mise en place d'un domaine du type lamélipode au détriment des plaques d'adhésions et de jonctions. Les filaments d'actine jouent un rôle essentiel dans la formation et le maintien de ces différents domaines, particulièrement dynamiques, qui nécessitent la formation et le désassemblage concomitant de différentes structures. Dans ces conditions, il est évident que la dérégulation d'un des éléments intervenants dans ces structures est suffisant pour perturber tout le système. La zyxine est un composant structural essentiel des microfilaments et des plaques d'adhésion et elle influence l'organisation de ces microfilaments (Crawford, A. W et coll.; 1992) ainsi que les propriétés d'adhésion (Macalma. T et coll.; 1996) et de motilité (Drees . B. E, et coll.; 1999) des cellules. Il est donc possible que les modifications de structure des cellules, observées lorsque la zyxine est sous exprimée, suffisent à rendre ces cellules tumorigenes. Les modifications des paramètres d'adhérence des cellules se traduisent par une modification des interactions cellules/environnement avec pour conséquence une reprogrammation de l'expression de gènes clés responsables de modifications phénotypiques. Il a été ainsi observé que l'acquisition du phenotype tumoral induite, dans les cellules NIH3T3, par une diminution de la protéine zyxine, conduit à une modification de l'expression de gènes caractérisant le phenotype invasif, notamment une sous expression des gènes TIMP2 et TIMP3 et Protease nexin-1 (PN-1) et une surexpression de l'urokinase activateur du plasminogène (figure 10) . En conséquence, ces gènes et leur produit d'expression peuvent être utilisés, comme décrit précédemment à propos de la zyxine, pour la préparation de compositions pharmaceutiques utiles pour le diagnostic, la prévention ou le traitement de cancers, ou encore pour le criblage de composés .

Claims

REVENDICATIONS
1) Composition pharmaceutique pour le traitement, la prévention ou le diagnostic d'une pathologie tumorale, caractérisée en ce qu'elle comprend un agent actif capable de stabiliser le réseau d'actine du cytosquelette cellulaire.
2) Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend un agent actif choisi dans le groupe comprenant : la protéine zyxine ou un fragment polypeptidique de celle-ci
- une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par l'ADNc du gène de la zyxine, un fragment de celui-ci ou leur séquence complémentaire, ou un acide nucléique anti-sens de ceux-ci, une cellule ou un ensemble de cellules surexprimant le gène de la zyxine ou un fragment fonctionnel de celui ci.
- un inhibiteur de la cofiline.
3) Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit agent actif lie l'actine polymérisée F avec une constante d'affinité supérieure d'au moins deux logs à la constante d'affinité avec laquelle ledit agent actif lie l'actine non- polymérisée G.
4) Composition pharmaceutique selon la revendication 3 caractérisée en ce que ledit agent actif liant l'actine est un peptide cyclique.
5) Composition pharmaceutique selon les revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend comme agent actif la protéine zyxine ou un fragment polypeptidique de celle-ci 6) Composition pharmaceutique selon les revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend comme agent actif une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par l'ADNc du gène de la zyxine, un fragment de celui-ci ou leur séquence complémentaire.
7) Composition pharmaceutique selon les revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend comme agent actif une cellule ou un ensemble de cellules surexprimant le gène de la zyxine ou un fragment fonctionnel de celui ci.
8) Composition pharmaceutique selon les revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend comme agent actif un inhibiteur de la cofiline.
9) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que l'agent actif est associé à un vecteur de transport intracellulaire.
10) Composition pharmaceutique selon la revendication 9, caractérisée en ce que le vecteur de transport intracellulaire est choisi parmi un vecteur d'expression recombinant viral ou un vecteur de transport non-viral .
11) Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce que le vecteur de transport intracellulaire non-viral est choisi parmi un vecteur lipidique, particulaire, micro ou nanoparticulaire, polymère ou polyplex, ou antibiotique cationique.
12) Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisée en ce que l'association entre l'agent actif et le vecteur de transport intracellulaire est effectué au moyen de liaisons non covalentes . 13) Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisée en ce que l'association entre l'agent actif et le vecteur de transport intracellulaire est effectué au moyen de liaisons chimiques covalentes .
14) Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce que le vecteur de transport intracellulaire est un vecteur d'expression recombinant viral et en ce que l'association entre l'agent actif et ledit vecteur de transport intracellulaire est une intégration dudit composé actif dans ledit vecteur d'expression viral.
15) Composition pharmaceutique selon la revendication 14, caractérisée en ce que le vecteur d'expression recombinant viral est choisi parmi un Adénovirus, un virus associé aux Adénovirus (AAV) ou un rétrovirus .
16) Composition pharmaceutique selon les revendication 14 ou 15, caractérisée en ce que le vecteur d'expression recombinant viral est un lentivirus ou un oncovirus .
17) Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 7 caractérisé en ce la cellule génétiquement modifiés pour surexprimer le gène de la zyxine ou un fragment fonctionnel de celui-ci est choisie parmi une cellule souche, une cellule de la moelle osseuse, une cellules hématopoïétique, une cellule d' hépatocarcinome .
18) Composition pharmaceutique selon la revendication 1, 2, 7 ou 17, caractérisée en la cellule génétiquement modifiée pour surexprimer le gène de la zyxine ou un fragment fonctionnel de celui-ci est une cellule CD34+.
19) Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 7, 17 ou 18, caractérisée en ce qu'elle la cellule génétiquement modifiée pour surexprimer le gène de la zyxine ou un fragment fonctionnel de celui-ci est issue d'un patient atteint d'une pathologie tumoral.
20) Un vecteur de transport intracellulaire non-viral caractérisé en ce qu'il est associé à un agent actif défini à l'une quelconque des revendication 9 à 13.
21) Un vecteur de transport intracellulaire selon la revendication 20 caractérisé en ce l'agent actif est associé audit vecteur de transport au moyen de liaisons non covalentes .
22) Un vecteur de transport intracellulaire caractérisé en ce qu'il est constitué par un vecteur d'expression recombinant viral comprenant un ADNc codant pour le gène de la zyxine ou un fragment fonctionnel de celui-ci .
23) Un vecteur de transport intracellulaire selon la revendication 22 caractérisé en ce que le vecteur d'expression recombinant viral est choisi parmi un Adénovirus, un virus associé aux Adénovirus (AAV) ou un rétrovirus .
24) Une cellule caractérisée en ce qu'elle est génétiquement modifiée pour surexprimer le gène de la zyxine .
25) Une cellule caractérisée en ce qu'elle est génétiquement modifiée pour sous-expri er le gène de la zyxine . 26) Une cellule selon les revendications 24 ou 25, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi une cellule souche, une cellule de la moelle osseuse, une cellule hématopoïétique ou une cellule d'hépatocarcinome.
27) Une cellule selon l'une quelconque des revendications 2r ou 26, caractérisée en ce qu'elle est une cellule CD34+.
28) Une cellule selon l'une quelconque des revendications 25 à 27 caractérisée en ce qu'elle est issue d'un patient atteint d'une pathologie tumoral.
29) Un mammifère transgénique non-humain caractérisé en ce qu'il comporte au moins une cellule génétiquement modifié sous-exprimant le gène de la zyxine ou un fragment fonctionnel de celui-ci.
30) Méthode d'identification de composés capables de stabiliser le réseau d'actine du cytosquelette d'une cellule, consistant à détecter une réversion phénotypique d'expression de la zyxine induite par lesdits composés, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact des composés à tester avec ladite cellule, b) la quantification de l'expression de la zyxine dans ladite cellule.
31) Méthode d'identification selon la revendication 30 caractérisée en ce que la quantification de l'expression de la zyxine est effectué par comparaison de l'expression des ARN messagers de la zyxine dans ladite cellule en présence et en absence dudit composé à tester.
32) Méthode d'identification selon la revendication 30, caractérisée en ce que la quantification de l'expression de la zyxine est effectuée par comparaison de l'expression de la protéine zyxine dans ladite cellule en présence et en absence dudit composé à tester
33) Méthode de diagnostic d'une pathologie tumoral caractérisée en ce qu'elle comporte les étapes suivantes : a) le prélèvement des cellules d'un patient, b) la quantification de l'expression de la zyxine dans les cellules prélevées
34) Méthode de diagnostic selon la revendication 31, caractérisée en ce que la quantification de l'expression de la zyxine est effectué par mesure de l'expression des ARN messagers de la zyxine.
35) Méthode de diagnostic selon la revendication 33, caractérisée en ce que la quantification de l'expression de la zyxine est effectuée par comparaison de l'expression de la protéine zyxine des cellules prélevées audits intervalles différents.
36) Méthode d'analyse d'un phenotype tumoral d'un patient, caractérisée en ce qu'elle comporte les étapes suivantes : a) le prélèvement des cellules du patient à deux intervalles différents, b) la quantification de l'expression de la zyxine dans les cellules prélevés audits intervalles différents . c) la comparaison des deux niveaux d'expression pour constituer un profil différentiel phénotypique dudit patient .
37) Méthode d'analyse selon la revendication 36, caractérisée en ce que les intervalles correspondent à deux périodes différentes durant le traitement anti-tumoral d'un patient. 38) Méthode d'analyse selon la revendication 37, caractérisée en ce que la quantification de l'expression de la zyxine est effectué par comparaison de l'expression des ARN messagers des cellules prélevés audits intervalles différents.
39) Méthode selon la revendication 35, caractérisée en ce que la quantification de l'expression de la zyxine est effectuée par comparaison de l'expression de la protéine zyxine des cellules prélevées audits intervalles différents.
40) Méthode de criblage d'un composé actif dans le traitement des cancers, caractérisé en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) l'incubation de cellules tumorales avec ledit composé actif, b) la mesure de la stabilisation de la polymérisation du réseau d'actine desdites cellules.
41) Utilisation d'un composé capable de rétablir la structure des réseaux d'actine d'une cellule pour la préparation d'un médicament anti-tumoral non cytotoxique .
42) Utilisation d'un composé capable de rétablir la structure des réseaux d'actine d'une cellule pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention d'une pathologie résultant d'une anomalie chromosomique au niveau du bras long du chromosome 7, plus particulièrement au niveau de la région 7q34/q35.
43) Utilisation selon la revendication 42 caractérisée en ce que la pathologie résultant d'une anomalie chromosomique au niveau du bras long du chromosome 7 est une hémopathie maligne associées à une anomalie chromosomiques dans la région du gêne de la zyxine 7q34/q35. 44) Utilisation selon la revendication 41, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'hépatocarcinomes .
45) Utilisation selon la revendication 41, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des tumeurs mésenchymateuse, notamment les sarcomes .
46) Utilisation selon la revendication 41 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention de cancers neuroectodermiques .
47) Utilisation selon la revendication 38 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention du sarcome de Ewing.
EP02745538A 2001-06-18 2002-06-18 Composition pharmaceutique comprenant un agent modulateur de l'etat de polymerisation de l'actine Withdrawn EP1432732A2 (fr)

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