EP1407020A2 - Stress-assoziierte genprodukte aus ashbya gossypii - Google Patents

Stress-assoziierte genprodukte aus ashbya gossypii

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Publication number
EP1407020A2
EP1407020A2 EP02776911A EP02776911A EP1407020A2 EP 1407020 A2 EP1407020 A2 EP 1407020A2 EP 02776911 A EP02776911 A EP 02776911A EP 02776911 A EP02776911 A EP 02776911A EP 1407020 A2 EP1407020 A2 EP 1407020A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
vitamin
acid sequence
sequence
polynucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02776911A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Marvin Karos
Henning ALTHÖFER
Burkhard Kröger
Jose L. Revuelta Doval
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE2001133372 external-priority patent/DE10133372A1/de
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP1407020A2 publication Critical patent/EP1407020A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P25/00—Preparation of compounds containing alloxazine or isoalloxazine nucleus, e.g. riboflavin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Definitions

  • the present invention relates to novel polynucleotides from Ashbya gossypu; oligonucleotides hybridizing therewith; Expression cassettes and vectors containing these polynucleotides; microorganisms transformed therewith; polypeptides encoded by these polynucleotides; and the use of the new polypeptides and polynucleotides as targets to improve stress resistance and in particular to improve vitamin B2 production in microorganisms of the genus Ashbya.
  • Vitamin B2 (riboflavin, lactoflavin) is an alkali and light sensitive vitamin that fluoresces yellow-green in solution. Vitamin B2 deficiency can lead to ectoderm damage, in particular lens opacification, keratitis, corneal vascularization, neurovegetative and urogenital disorders. Vitamin B2 is the precursor for the biological hydrogen transfer molecules FAD and FMN, which are important in addition to NAD + and NADP *. These are formed from vitamin B2 by phosphorylation (FMN) and subsequent adenylation (FAD).
  • FMN biological hydrogen transfer molecules
  • Vitamin B2 is synthesized in plants, yeasts and many microorganisms from GTP and ribulose-5-phosphate.
  • the pathway begins with the opening of the imidazole ring from GTP and the cleavage of a phosphate residue.
  • 5-Amino-6-ribitylamino-2,4-pyrimidinone is formed by deamination, reduction and elimination of the remaining phosphate.
  • the reaction of this compound with 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate leads to the bicyclic molecule 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine.
  • This compound is converted into the tricyclic compound riboflavin by dismutation, in which a 4-carbon unit is transferred.
  • Vitamin B2 is found in many vegetables and meat, less in cereal products. An adult's daily vitamin B2 requirement is around 1.4 to 2 mg. The main breakdown product of the FMN and FAD coenzymes in humans is again riboflavin, which is excreted as such.
  • Vitamin B2 is therefore an important nutritional supplement for humans and animals. There is therefore a desire to make vitamin B2 accessible on a technical scale. It has therefore been proposed to synthesize vitamin B2 in a microbiological way.
  • Useful microorganisms for this are, for example, Bacillus subtilis, the Ascomycetes Eremothecium ashbyii, Ashbya gossypii and the yeasts Candida flareri and Saccharomyces cerevisiae.
  • the nutrient media used for this include molasses or vegetable oils as a carbon source, inorganic salts, amino acids, animal or vegetable peptones and proteins as well as vitamin additives.
  • vitamin B2 The microbiological production of vitamin B2 is described, for example, in WO-A-92/01060, EP-A-0 405 370 and EP-A-0 531 708.
  • vitamin B2 An overview of the meaning, occurrence, production, biosynthesis and use of vitamin B2 can be found, for example, in Ullmann's Encyclopaedia of Industrial Chemistry, volume A27, pages 521 ff.
  • Microorganisms are exposed to a number of stress factors. These factors can be categorized according to their impact types as follows:
  • the cells have systems of the stress response that are able to adapt the cell to the stress or to eliminate the cause of the stress.
  • the cell's response to stress includes processes of growth control, signal transduction, transcription and post-translational control.
  • ROI redox-active oxygen intermediates
  • ROI is also formed in the ß-oxidation of the fatty acids under the influence of ultraviolet or radioactive radiation, through metals and redox-active substances. Oxidative stress results from abnormally high levels of ROIs that disrupt cellular redox status and damage lipids, proteins, DNA and RNA (Godon, C. et al. The Journal of Biological Chemistry, 1998, 273, 22480-22489) ,
  • organisms continuously check their redox status and adapt to changes through the induction of genes or activation of gene products that are able to reset the cellular redox state to a value that is harmless to the cell.
  • genes or gene products are also activated that can recognize and repair DNA damaged by ROls or radiation.
  • the cell checks the osteostat and reacts to changes by activating genes and gene products that set safe osmolar conditions (Blomberg, A, Electrophoresis, 1997, 18, 1429 - 1440). The same applies to mechanical stress and stress due to nutrient limitation.
  • stress response genes to generate microorganisms, preferably of the Ashbya genus, in particular Ashbya gossypii strains, with a higher resistance to stress has not yet been described.
  • the object of the present invention is therefore to provide new targets for influencing the stress response in microorganisms of the genus Ashbya, in particular in Ashbya gossypii.
  • Another task is the improvement of vitamin B2 production by such microorganisms.
  • the above object is achieved by providing coding nucleic acid sequences which are up or down-regulated in Ashbya gossypu during vitamin B2 production (based on results determined using the MPSS analysis method described in more detail in the experimental part), in particular:
  • a DNA clone was isolated which codes for a characteristic partial sequence of the nucleic acid sequence according to the invention and which bears the internal name “Oligo 70”.
  • a DNA clone was isolated according to the invention which codes for the full sequence of the nucleic acid according to the invention and which bears the internal name “Oligo70 v”.
  • One object of the present invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 1.
  • Another object of the invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 3 or a fragment thereof.
  • the polynucleotides can preferably be isolated from a microorganism of the genus Ashbya, in particular A. gossypu.
  • the invention also relates to the complementary polynucleotides; and the sequences derived from these polynucleotides by degenerating the genetic code.
  • the inserts of "Oligo 70" and “Oligo 70v” have significant homologies with the MIPS tag "YII057c” from S. ceresiae.
  • the inserts have a nucleic acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, respectively
  • the corresponding counter strand to SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence derived from the coding strand of SEQ ID NO: 3 has significant sequence homology with a dioxygenase from S. cerevisiae.
  • a DNA clone was isolated which codes for a characteristic partial sequence of the nucleic acid sequence according to the invention and which bears the internal name “Oligo 74”.
  • One object of the present invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 5, which can preferably be isolated from a microorganism of the genus Ashbya, in particular A. gossypu.
  • the invention also relates to the complementary polynucleotide; and the sequences derived from these polynucleotides by degenerating the genetic code.
  • the insert of "Oligo 74" has significant homologies with the MIPS tag "HSP26” from S. cerevisiae.
  • the insert has a nucleic acid sequence as shown in SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence derived from the corresponding opposite strand has significant sequence homology with a heat shock protein (the HSP26) from S. cerevisiae.
  • a DNA clone was isolated which codes for a characteristic partial sequence of the nucleic acid sequence according to the invention and which bears the internal name “Oligo 113”.
  • a DNA clone was isolated according to the invention which codes for the full sequence of the nucleic acid according to the invention and which bears the internal name “Oligo 113v”.
  • One object of the present invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 8.
  • Another object of the invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 10 or fragments thereof.
  • the polynucleotides can preferably be isolated from a microorganism of the genus Ashbya, in particular A. gossypii.
  • the invention also relates to the complementary polynucleotides; and the sequences derived from these polynucleotides by degenerating the genetic code.
  • the inserts of "Oligo 113" and “Oligo 113v” have significant homologies with the MIPS tag "Mxr1" from S. cerevisiae.
  • the inserts have a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10, respectively, that of the corresponding opposite strand
  • the amino acid sequence or partial amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 8 or from SEQ ID NO: 10 has significant sequence homology with a methionine sulfoxide reductase, a protein from S. cerevisiae responsible for the reduction of methionine sulfoxide.
  • a DNA clone was isolated which codes for a characteristic partial sequence of the nucleic acid sequence according to the invention and which bears the internal name “Oligo 60”.
  • a DNA clone was isolated according to the invention which codes for the full sequence of the nucleic acid according to the invention and which bears the internal name “Oligo 60v”.
  • One object of the present invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 12.
  • Another object of the invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 14 or a fragment thereof.
  • the polynucleotides can preferably be isolated from a microorganism of the genus Ashbya, in particular A. gossypu.
  • the invention also relates to the complementary polynucleotides; and the sequences derived from these polynucleotides by degenerating the genetic code.
  • the inserts of "Oligo 60" and “Oligo 60v” have significant homologies with the MIPS tag "Xrs2" from S. cerevisiae.
  • the inserts have a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 14, respectively.
  • the one from the coding beach derived amino acid sequence or partial amino acid sequence has significant sequence homology with a DNA repair protein from S. cerevisiae.
  • e a, preferably down-regulated, nucleic acid sequence which codes for a protein with the function of a component of a chaperonin-containing T complex.
  • a DNA clone was isolated which codes for a characteristic partial sequence of the nucleic acid sequence according to the invention and which bears the internal name “Oligo 161”.
  • a DNA clone was isolated according to the invention which codes for the full sequence of the nucleic acid according to the invention and which bears the internal name “Oligo 161v”.
  • One object of the present invention relates to a polynucleotide comprising a nucleotide acid sequence according to SEQ ID NO: 16.
  • Another object of the invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 18 or a fragment thereof.
  • the polynucleotides can preferably be isolated from a microorganism of the genus Ashbya, in particular A. gossypu.
  • the invention also relates to the complementary polynucleotides; and the sequences derived from these polynucleotides by degenerating the genetic code.
  • the inserts of "Oligo 161" and “Oligo 161v” have significant homologies with the MIPS tag "Tcp1" from S. cerevisiae.
  • the inserts have a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 18, respectively, that of the corresponding opposite strand (for SEQ ID NO: 16) derived amino acid sequence or partial amino acid sequence has significant sequence homology with a protein component of a chaperonin-containing T complex from S. cerevisiae.
  • Another object of the invention relates to oligonucleotides which hybridize with one of the above polynucleotides, in particular under stringent conditions.
  • the invention furthermore relates to polynucleotides which hybridize with one of the oligonucleotides according to the invention and code for a gene product from microorganisms of the genus Ashbya or a functional equivalent of this gene product.
  • the invention further relates to polypeptides or proteins which are encoded by the polynucleotides described above; as well as peptide fragments thereof which have an amino acid sequence which comprises at least 10 contiguous amino acid residues according to SEQ ID NO: 2, 4, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17 or 19; and functional equivalents of the polypeptides or proteins according to the invention.
  • Functional equivalents differ from the products specifically disclosed according to the invention in their amino acid sequence by addition, insertion, substitution, deletion or inversion to at least one, such as 1 to 30 or 1 to 20 or 1 to 10, sequence positions without losing the protein function originally observed and which can be derived by comparing the sequence with other proteins. This means that equivalents can have essentially identical, higher or lower activities compared to the native protein.
  • prokaryotic or eukaryotic hosts are also provided which are transformed with at least one vector of the above type.
  • prokaryotic or eukaryotic hosts are provided in which the functional expression of at least one gene is modulated (eg inhibition or overexpression), which codes for a polypeptide according to the invention as defined above; or in which the biological activity of a polypeptide is reduced or increased as defined above.
  • Preferred hosts are selected from Ascomycetes (tubular mushrooms), in particular those of the genus Ashbya and preferably strains of A. gossypu.
  • Modulation of gene expression in the above sense includes both its inhibition, e.g. by blocking an expression level (in particular transcription or translation) or by deliberately overexpressing a gene (e.g. by modifying regulatory sequences or increasing the number of copies of the coding sequence).
  • the invention further relates to the use of an expression cassette according to the invention, a vector according to the invention or a host according to the invention for the microbiological production of vitamin B2 and / or precursors and / or derivatives thereof.
  • Another object of the invention relates to the use of an expression cassette according to the invention, a vector according to the invention or a host according to the invention for the recombinant production of a polypeptide according to the invention as defined above.
  • a method for detecting or validating an effector target for modulating the microbiological production of vitamin B2 and / or precursors and / or derivatives thereof is also provided.
  • a microorganism which is capable of microbiological production of vitamin B2 and / or precursors and / or derivatives thereof is treated with an effector which is linked to a target selected from a polypeptide according to the invention as defined above or a nucleic acid sequence coding therefor. interacts (such as non-covalently binds to them), validates the effect of the effector on the amount of microbiologically produced vitamin B2 and / or the precursor and / or a derivative thereof; and optionally isolating the target.
  • the validation is preferably carried out by direct comparison with the microbiological vitamin B2 production in the absence of the effector under otherwise identical conditions.
  • the invention further relates to a method for modulating (in terms of quantity and / or speed) the microbiological production of vitamin B2 and / or precursors and / or derivatives thereof, using a microorganism which is used for microbiological see production of vitamin B2 and / or precursors and / or derivatives thereof is capable of being treated with an effector which interacts with a target selected from a polypeptide according to the invention as defined above or a nucleic acid sequence coding therefor.
  • Preferred examples of the above-mentioned effectors are: a) antibodies or antigen-binding fragments thereof; b) polypeptide ligands which differ from a) and which interact with a polypeptide according to the invention; c) low molecular weight effectors, which the biological activity of an inventive
  • Modulate polypeptide d) antisense nucleic acid sequences which interact with a nucleic acid sequence according to the invention.
  • Another object of the invention relates to a method for the microbiological production of vitamin B2 and / or precursors and / or derivatives thereof, wherein a host is cultivated according to the above definition under conditions which favor the production of vitamin B2 and / or precursors and / or derivatives thereof and isolate the desired product (s) from the culture batch. It is preferred that the host is treated with an effector according to the above definition before and / or during cultivation.
  • a preferred host is selected from microorganisms of the genus Ashbya; in particular transformed, as described above.
  • a last subject of the invention relates to the use of a polynucleotide or polypeptide according to the invention as a target for modulating the production of vitamin B2 and / or precursors and / or derivatives thereof in a microorganism of the genus Ashbya.
  • FIG. 1 shows an alignment between an amino acid partial sequence according to the invention (corresponding to the counter strand to positions 115 to 2 in SEQ ID NO: 1) (upper sequence) and a partial sequence of the MIPS tag YII057c from S. cerevisiae (lower sequence). Identical sequence positions are indicated between the two sequences. Similar sequence positions are marked with "+”.
  • FIG. 2 shows an alignment between an amino acid partial sequence according to the invention (corresponding to the counter strand to positions 677 to 399 in SEQ ID NO: 5) (upper sequence) and a partial sequence of the MIPS tag HSP26 from S. cerevisiae (lower sequence). Identical sequence positions are indicated between the two sequences. Similar sequence positions are marked with "+”.
  • FIG. 3 shows an alignment between an amino acid partial sequence according to the invention (corresponding to the counter strand to positions 1259 to 828 in SEQ ID NO: 8) (upper sequence) and a partial sequence of the MIPS tag Mxr1 from S. cerevisiae (lower sequence). Identical sequence positions are given between the two sequences. Similar sequence positions are marked with "+”.
  • FIG. 4 shows an alignment between a partial amino acid sequence according to the invention (corresponding to the coding strand at positions 370 to 1608 in SEQ ID NO: 12) (upper sequence) and a partial sequence of the MIPS tag Xrs2 from S. cerevisiae (lower sequence) , Identical sequence positions are indicated between the two sequences. Similar sequence positions are marked with "+”.
  • FIG. 5 shows an alignment between an amino acid partial sequence according to the invention (corresponding to the counter strand to positions 558 to 193 in SEQ ID NO: 16) (upper sequence) and a partial sequence of the MIPS tag Tcp1 from S. cerevisiae (lower sequence). Identical sequence positions are indicated between the two sequences. Similar sequence positions are marked with "+”.
  • the nucleic acid molecules according to the invention encode proteins or proteins which are referred to here as proteins of the stress response (for example with activity relating to DNA repair or detoxification) or briefly as “SA proteins”. These SA proteins have a function in protecting the cell, for example harmful external influences (eg radical formation, osmotic stress etc.) as found in fermenters, especially in the cultivation of A. gossyp Due to the availability of cloning vectors which can be used in Ashbya gossyp, as disclosed for example in Wright and Philipsen (1991) Gene, 109, 99-105., And techniques for the genetic manipulation of A. gossypu and the related types of yeast, the nucleic acid molecules according to the invention can be used for the genetic manipulation of these organisms, in particular A.
  • proteins of the stress response for example with activity relating to DNA repair or detoxification
  • SA proteins have a function in protecting the cell, for example harmful external influences (eg radical formation, osmotic stress etc.) as found in fermenters, especially in the cultivation
  • gossypu in order to use them as producers of Vitamin B2 and / or precursors and / or derivatives thereof to make it better and more efficient ion or Efficiency can be based on a direct effect of the manipulation of a gene according to the invention or on an indirect effect of such a manipulation.
  • the present invention is based on the provision of new molecules, which are referred to here as SA nucleic acid and SA proteins, and which are involved in the stress response, in particular in Ashbya gossypu (e.g. in DNA repair or detoxification).
  • the activity of the SA molecules according to the invention in A. gossypu influences the vitamin B2 production by this organism.
  • the activity of the SA molecules according to the invention is preferably modulated such that the metabolic and / or energy pathways of A. gossypu, in which the SA proteins according to the invention participate, with regard to the yield, production and / or efficiency of vitamin B2 production be modulated, which directly or indirectly modulates the yield, production and / or efficiency of vitamin B2 production in A. gossypu.
  • nucleic acid sequences provided according to the invention can be isolated, for example, from the genome of an Ashbya gossyp // strain which is freely available from the American Type Culture Collection under the name ATCC 10895.
  • the cell With a more efficient stress response, the cell can be made more robust against external influences, so that the viability and thus the productivity in the fermenter is increased.
  • the mutagenesis of one or more SA proteins according to the invention can also lead to SA proteins with changed (increased or decreased) activities which indirectly influence the production of the desired product from A gossyp.
  • the SA proteins can be used to reduce the concentration of free radicals that attack and inactivate proteins and thus maintain the function of essential metabolic processes.
  • these processes also include the structure of the cell walls, transcription, translation, and the biosynthesis of compounds that are necessary for the growth and division of cells (e.g. nucleotides, amino acids, vitamins, lipids, etc.) (Lengeier et al. (1999) Biology of Procaryotes, Thieme Verlag, Stuttgart).
  • the invention relates to polypeptides which comprise the above-mentioned amino acid sequences or characteristic partial sequences thereof and / or are encoded by the nucleic acid sequences described herein.
  • “Functional equivalents” or analogs of the specifically disclosed polypeptides are, within the scope of the present invention, different polypeptides which furthermore have the desired biological activity (such as substrate specificity).
  • “functional equivalents” are understood to mean, in particular, mutants which, in at least one of the sequence positions mentioned above, have a different amino acid than the one specifically mentioned, but nevertheless have one of the above-mentioned biological activities. "Functional equivalents” thus encompass the mutants obtainable by one or more amino acid additions, substitutions, deletions and / or inversions, the changes mentioned being able to occur in any sequence position as long as they lead to a mutant with the property profile according to the invention. Functional equivalence is particularly given when the reactivity patterns between mutant and unchanged polypeptide match qualitatively, i.e. for example, the same substrates can be implemented at different speeds.
  • “Functional equivalents” in the above sense are also precursors of the polypeptides described and functional derivatives and salts of the polypeptides.
  • the term “salts” means both salts of carboxyl groups and acid addition salts of amino groups of the protein molecules according to the invention. Salts of carboxyl groups can be prepared in a manner known per se and include inorganic salts such as
  • Example sodium, calcium, ammonium, iron and zinc salts, and salts with organic bases such as amines, such as triethanolamine, arginine, lysine, piperidine and the like.
  • Acid addition salts such as, for example, salts with mineral acids, such as hydrochloric acid or The invention also relates to sulfuric acid and salts with organic acids, such as acetic acid and oxalic acid.
  • “Functional derivatives” of polypeptides according to the invention can also be prepared on functional amino acid side groups or on their N- or C-terminal end using known techniques.
  • Such derivatives include, for example, aliphatic esters of carboxylic acid groups, amides of carboxylic acid groups, obtainable by reaction with ammonia or with a primary or secondary amine; N-acyl derivatives of free amino groups, produced by reaction with acyl groups; or O-acyl derivatives of free hydroxyl groups, produced by reaction with acyl groups.
  • “Functional equivalents” naturally also include polypeptides that are accessible from other organisms, as well as naturally occurring variants. For example, regions of homologous sequence regions can be determined by sequence comparison and equivalent enzymes can be determined based on the specific requirements of the invention.
  • “Functional equivalents” also include fragments, preferably individual domains or sequence motifs, of the polypeptides according to the invention which, for example, have the desired biological function.
  • “Functional equivalents” are also fusion proteins which contain one of the abovementioned polypeptide sequences or functional equivalents derived therefrom and at least one further, functionally different, heterologous sequence in functional N- or C-terminal linkage (ie without mutual substantial functional impairment of the fusion protein).
  • heterologous sequences are, for example, signal peptides, enzymes, immunoglobulins, surface antigens, receptors or receptor ligands.
  • “Functional equivalents” encompassed according to the invention are homologs to the specifically disclosed proteins. These have at least 60%, preferably at least 75%, in particular at least 85%, such as 90%, 95% or 99%, homology to one of the specifically disclosed Sequences calculated according to the algorithm of Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad, Sei. (USA) 85 (8), 1988, 2444-2448.
  • equivalents according to the invention comprise proteins of the type described above in deglycosylated or glycosylated form and also modified forms obtainable by changing the glycosylation pattern.
  • Homologs of the proteins or polypeptides according to the invention can be generated by mutagenesis, for example by point mutation or truncation of the protein.
  • the term "homolog” as used here refers to a variant form of the protein which acts as an agonist or antagonist of protein activity.
  • Homologs of the proteins of the invention can be obtained by screening combinatorial libraries of mutants, e.g. Shortening mutants can be identified.
  • a varied library of protein variants can be generated by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level, e.g. by enzymatically ligating a mixture of synthetic oligonucleotides.
  • methods that can be used to generate banks of potential homologs from a degenerate oligonucleotide sequence. Chemical synthesis of a degenerate gene sequence can be performed in an automated DNA synthesizer, and the synthetic gene can then be ligated into an appropriate expression vector.
  • degenerate gene set makes it possible to provide all sequences in a mixture which code the desired set of potential protein sequences.
  • Methods for the synthesis of degenerate oligonucleotides are known to the person skilled in the art (for example Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakuraetal. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477).
  • banks of fragments of the protein codon can be used to generate a varied population of protein fragments for screening and for the subsequent selection of homologues of a protein according to the invention.
  • a bank of coding sequence fragments can be obtained by treating a double-stranded PCR fragment of a coding sequence with a nuclease under conditions under which nicking occurs only about once per molecule, denaturing the double-stranded DNA, renaturing the DNA to form double-stranded DNA Sense / antisense pairs of different nodded products can be removed, single-stranded sections removed from newly formed duplexes by treatment with S1 nuclease and ligating the resulting fragment library into an expression vector.
  • This method can be used to derive an expression bank which encodes N-terminal, C-terminal and internal fragments with different sizes of the protein according to the invention.
  • REM Recursive ensemble mutagenesis
  • polypeptides according to the invention can be produced recombinantly (cf. the following sections) or can be in native form using conventional biochemical procedures (cf. Cooper, TG, Biochemical Working Methods, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin) from microorganisms, in particular those of the genus Ashbya, can be isolated.
  • the invention also relates to nucleic acid sequences (single and double stranded DNA and RNA sequences, such as cDNA and mRNA) coding for one of the above polypeptides and their functional equivalents, which e.g. are accessible using artificial nucleotide analogs.
  • the invention relates both to isolated nucleic acid molecules which code for polypeptides or proteins or biologically active sections thereof, and to nucleic acid fragments which e.g. can be used for use as hybridization probes or primers for the identification or amplification of coding nucleic acids according to the invention.
  • nucleic acid molecules according to the invention can also contain untranslated sequences from the 3 'and / or 5' end of the coding gene region.
  • nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules that are present in the natural source of the nucleic acid and, moreover, can be substantially free of other cellular material or culture medium when produced by recombinant techniques, or free of chemical precursors or other chemicals be when it's chemically synthesized.
  • a nucleic acid molecule according to the invention can be isolated using standard molecular biological techniques and the sequence information provided according to the invention.
  • cDNA can be isolated from a suitable cDNA library by using one of the specifically disclosed complete sequences or a section thereof as a hybridization probe and standard hybridization techniques (as described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T.
  • nucleic acid molecule comprising one of the disclosed sequences or a portion thereof can be isolated by polymerase chain reaction using the oligonucleotide primers created based on this sequence.
  • the nucleic acid amplified in this way can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis.
  • the oligonucleotides according to the invention which correspond to an SA nucleotide sequence can also be produced by standard synthesis methods, for example using an automatic DNA synthesizer.
  • the invention further comprises the nucleic acid molecules complementary to the specifically described nucleotide sequences or a section thereof.
  • the nucleotide sequences according to the invention enable the generation of probes and primers which can be used for the identification and / or cloning of homologous sequences in other cell types and organisms.
  • probes or primers usually comprise a nucleotide sequence region which, under stringent conditions, can be attached to at least about 12, preferably at least about 25, e.g. about 40, 50 or 75 successive nucleotides of a sense strand of a nucleic acid sequence according to the invention or a corresponding antisense strand are hybridized.
  • nucleic acid sequences according to the invention are derived from the sequences according to SEQ ID NO: 1, 3, 5, 8, 10, 12, 14, 16 and 18 and differ from them by addition, substitution, insertion or deletion of individual or more nucleotides, but continue to code for polypeptides with the desired property profile.
  • nucleic acid sequences which comprise so-called silent mutations or which have been modified in accordance with the codon usage of a specific source or host organism, in comparison to a specifically named sequence, as well as naturally occurring variants thereof, such as splice variants or allele variants thereof.
  • the subject matter is likewise obtainable by conservative nucleotide substitutions (ie the amino acid in question is replaced by an amino acid of the same charge, size, polarity and / or solubility).
  • the invention also relates to the molecules derived from the specifically disclosed nucleic acids by sequence polymorphisms. These genetic polymorphisms can exist between individuals within a population due to natural variation. These natural variations usually cause a variance of 1 to 5% in the nucleotide sequence of a gene.
  • the invention also encompasses nucleic acid sequences which hybridize with the above-mentioned coding sequences or are complementary thereto.
  • These polynucleotides can be found when screening genomic or cDNA libraries and, if appropriate, can be multiplied therefrom using suitable primers by means of PCR and then isolated, for example, using suitable probes.
  • Another possibility is the transformation of suitable microorganisms with polynucleotides or vectors according to the invention, the multiplication of the microorganisms and thus the polynucleotides and their subsequent isolation.
  • polynucleotides according to the invention can also be synthesized chemically.
  • the property of being able to “hybridize” to polynucleotides is understood to mean the ability of a poly- or oligonucleotide to bind to an almost complementary sequence under stringent conditions, while under these conditions non-specific bonds between non-complementary partners are avoided.
  • the sequences should be closed 70-100%, preferably 90-100%, of complementary nature
  • the property of complementary sequences to be able to bind specifically to one another is demonstrated, for example, in the Northern or Southern blot technique or in primer binding in PCR or RT -PCR.
  • oligonucleotides with a length of 30 base pairs or longer are used for this purpose.
  • Another aspect of the invention relates to "antisense" nucleic acids.
  • This comprises a nucleotide sequence that is complementary to a coding "sense" nucleic acid.
  • the antisense nucleic acid can be complementary to the entire coding strand or only to a portion thereof
  • the antisense nucleic acid molecule is antisense to a non-coding region of the coding strand of a nucleotide sequence.
  • non-coding region relates to the sequence sections referred to as 5 'and 3' untranslated regions.
  • An antisense oligonucleotide can be, for example, about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 nucleotides long.
  • An antisense nucleic acid of the invention can be constructed by chemical synthesis and enzymatic ligation reactions using methods known in the art.
  • An antisense nucleic acid can be chemically synthesized using naturally occurring nucleotides or variously modified nucleotides that are designed to increase the biological stability of the molecules or to increase the physical stability of the duplex that is between the antisense and sense -Nucleic acid has arisen. For example, phosphorothioate derivatives and acridine substituted nucleotides can be used.
  • modified nucleotides that can be used to generate the antisense nucleic acid include 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-ioduracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxylmethyl) uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil -D-galactosylqueosine, inosine, N ⁇ -isopentenyladenine, 1-methylguanine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N6-adenine, 7-methylguanine, 5 -Methylaminomethyluracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-mannosylqueosine, 5'-meth
  • the antisense nucleic acid molecules according to the invention are usually administered to a cell or generated in situ so that they hybridize with or bind to the cellular mRNA and / or a coding DNA so that the expression of the protein, e.g. by inhibiting transcription and / or translation.
  • the antisense molecule can be modified to specifically bind to a receptor or to an antigen that is expressed on a selected cell surface, for example by linking the antisense nucleic acid molecule to a peptide or an antibody that is attached to a cell surface receptor or Antigen binds.
  • the antisense nucleic acid molecule can also be administered to cells using the vectors described herein. To achieve sufficient intracellular concentrations of the antisense molecules, vector concepts structs in which the antisense nucleic acid molecule is under the control of a strong bacterial, viral or eukaryotic promoter are preferred.
  • the antisense nucleic acid molecule according to the invention is an alpha-anomeric nucleic acid molecule.
  • An alpha-anomeric nucleic acid molecule forms specific double-stranded hybrids with complementary RNA, the strands running parallel to one another in contrast to conventional alpha units.
  • the antisense nucleic acid molecule can also be a 2'-O-methylribonucleotide (Inoue et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148) or a chimeric RNA-DNA analog (Inoue et al. (1987) FEBS Lett 215: 327-330).
  • the invention also relates to ribozymes.
  • ribozymes are catalytic RNA molecules with ribonuclease activity that can cleave a single-stranded nucleic acid, such as an mRNA, to which they have a complementary region.
  • ribozymes e.g. Hammerhead ribozymes (described in Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334: 585-591)
  • a ribozyme with specificity for a coding nucleic acid according to the invention can e.g. on the basis of a cDNA specifically disclosed herein.
  • a derivative of a Tetrahymena L-19 IVS RNA can be constructed, the nucleotide sequence of the active site being complementary to the nucleotide sequence which is to be cleaved in a coding mRNA according to the invention.
  • mRNA can be used to select a catalytic RNA with specific ribonuclease activity from a pool of RNA molecules (see e.g. Bartel, D., and Szostak, J.W. (1993) Science 261: 1411-1418).
  • sequences according to the invention can alternatively be inhibited by directing nucleotide sequences which are complementary to the regulatory region of a nucleotide sequence according to the invention (for example to a promoter and / or enhancer of a coding sequence) in such a way that triple helix structures are formed which correspond to the transcription of the prevent the gene in target cells (Helene, C. (1991) Anticancer Drug Res. 6 (6) 569-584; Helene, C. et al., (1992) Ann. NY Acad. Sci. 660: 27- 36; and Mower. LJ (1992) Bioassays 14 (12): 807-815).
  • the invention also relates to expression constructs containing, under the genetic control of regulatory nucleic acid sequences, a nucleic acid sequence coding for a polypeptide according to the invention; and vectors comprising at least one of these expresses sion constructs.
  • Such constructs according to the invention preferably comprise a promoter 5'-upstream of the respective coding sequence and 3'-downstream a terminator sequence and, if appropriate, further customary regulatory elements, in each case operatively linked to the coding sequence.
  • An “operative linkage” is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and, if appropriate, further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can perform its function as intended when expressing the coding sequence.
  • sequences which can be linked operatively are targeting Sequences and enhancers, polyadenylation signals and the like.
  • Further regulatory elements include selectable markers, amplification signals, origins of replication and the like. Suitable regulatory sequences are described, for example, in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA. (1990).
  • the natural regulatory sequence can still be present before the actual structural gene. This natural regulation can possibly be switched off by genetic modification and the expression of the genes increased or decreased.
  • the gene construct can also have a simpler structure, ie no additional regulation signals are inserted in front of the structural gene and the natural promoter with its regulation is not removed. Instead, the natural regulatory sequence is mutated so that regulation no longer takes place and gene expression is increased or decreased.
  • the nucleic acid sequences can be contained in one or more copies in the gene construct.
  • Examples of useful promoters are: cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc -, ara, SP6, lambda-PR or in the lambda-PL promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria; as well as the gram-positive promoters amy and SP02, the yeast promoters ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH or the plant promoters CaMV / 35S, SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, not or the ubiquitin - or phaseolin promoter.
  • inducible promoters such as, for example, light-inducible and in particular temperature-inducible promoters, such as the P r P r promoter
  • inducible promoters such as, for example, light-inducible and in particular temperature-inducible promoters, such as the P r P r promoter
  • all natural promoters with their regulatory sequences can be used.
  • synthetic promoters can also be used advantageously.
  • the regulatory sequences mentioned are intended to enable the targeted expression of the nucleic acid sequences. Depending on the host organism, this can mean, for example, that the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • the regulatory sequences or factors can preferably have a positive influence on the expression and thereby increase or decrease it.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as promoters and / or "enhancers".
  • an increase in translation is also possible, for example, by improving the stability of the mRNA.
  • An expression cassette is produced by fusing a suitable promoter with a suitable monooxygenase nucleotide sequence and a terminator or polyadenylation signal.
  • Common recombination and cloning techniques such as those described in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982) and in T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).
  • the recombinant nucleic acid construct or gene construct is advantageously inserted into a host-specific vector which enables optimal expression of the genes in the host.
  • Vectors are well known to those skilled in the art and can be found, for example, in "Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., Ed., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).
  • vectors are also understood to mean all other vectors known to the person skilled in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, baculovirus and adenovirus, transposons, IS elements, phasmids, cosmids, and linear or circular DNA. These vectors can be replicated autonomously in the host organism or can be replicated chromosomally.
  • fusion expression vectors such as pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, DB and Johnson, KS (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) , in which glutathione-S-transferase (GST), maltose E-binding protein or protein A is fused to the recombinant target protein.
  • GST glutathione-S-transferase
  • Non-fusion protein expression vectors such as pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) and pET 11d (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California ( 1990) 60-89).
  • Yeast expression vector for expression in the yeast S. cerevisiae such as pYepSed (Baldari et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al.
  • Vectors and methods of constructing vectors suitable for use in other fungi such as filamentous fungi include those described in detail in: van den Hondel, CAMJJ & Punt, PJ (1991) "Gene transfer Systems and vector develop - mentforfilamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, JF Peberdyetal., ed., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
  • Baculovirus vectors available for expression of proteins in cultured insect cells include the pAc series (Smith et al., (1983) Mol. Cell BioL 3: 2156-2165) and the pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
  • Plant expression vectors such as those described in detail in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border” , Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; and Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721.
  • Mammalian expression vectors such as pCDM ⁇ (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) and pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195).
  • recombinant microorganisms can be produced which, for example, are transformed with at least one vector according to the invention and can be used to produce the polypeptides according to the invention.
  • the recombinant constructs according to the invention described above are advantageously introduced and expressed in a suitable host system.
  • Common cloning and transfection methods known to the person skilled in the art such as, for example, co-precipitation, protoplast fusion, electroporation, retroviral transfection and the like, are preferably used to bring the nucleic acids mentioned into expression in the respective expression system. Suitable systems are described, for example, in Current Protocols in Molecular Biology, F.
  • homologously recombined microorganisms can also be produced.
  • a vector is produced which contains at least a section of a gene or a coding sequence according to the invention, in which at least one amino acid deletion, addition or substitution has optionally been introduced in order to change the sequence according to the invention, e.g. functionally to disrupt ("knockouf vector).
  • the sequence introduced can, for example, also be a homologue from a related microorganism or be derived from a mammal, yeast or insect source.
  • the vector used for homologous recombination can alternatively be designed such that that the endogenous gene is mutated or otherwise altered in homologous recombination, but still encodes the functional protein (for example, the upstream regulatory region can be altered in such a way that this changes the expression of the endogenous protein).
  • the altered section of the SA gene is The construction of suitable vectors for homologous recombination is described, for example, in Thomas, KR and Capecchi, MR (1987) Cell 51: 503.
  • Host organisms are, for example, bacteria, fungi, yeasts, plant or animal cells.
  • Preferred organisms are bacteria, such as those of the genera Escherichia, such as. B. Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus or Pseudomonas, eukaryotic microorganisms such as Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, higher eukaryotic cells from animals or plants, for example Sf9 or CHO cells.
  • Preferred organisms are selected from the Ashbya genus, in particular from A. gossypii strains.
  • Successfully transformed organisms can be selected using marker genes which are also contained in the vector or in the expression cassette.
  • marker genes are genes for antibiotic resistance and for enzymes which catalyze a coloring reaction which stains the transformed cell. These can then be selected using automatic cell sorting.
  • Microorganisms successfully transformed with a vector and carrying an appropriate antibiotic resistance gene e.g. G418 or hygromycin
  • an appropriate antibiotic resistance gene e.g. G418 or hygromycin
  • Marker proteins that are presented on the cell surface can be used for selection by means of affinity chromatography.
  • the combination of the host organisms and the vectors which match the organisms, such as plasmids, viruses or phages, such as, for example, plasmids with the RNA Polymerase / promoter system, the phage ⁇ or ⁇ or other temperate phages or transposons and / or further advantageous regulatory sequences forms an expression system.
  • expression system means the combination of mammalian cells, such as CHO cells, and vectors, such as pcDNA3neo vector, which are suitable for mammalian cells.
  • the gene product can also be expressed in transgenic organisms such as transgenic animals, such as in particular mice, sheep or transgenic plants.
  • the invention furthermore relates to processes for the recombinant production of a polypeptide according to the invention or functional, biologically active fragments thereof, wherein a polypeptide-producing microorganism is cultivated, where appropriate the expression of the polypeptides is induced and these are isolated from the culture.
  • the polypeptides can thus also be produced on an industrial scale, if this is desired.
  • the recombinant microorganism can be cultivated and fermented by known methods. Bacteria can be propagated, for example, in TB or LB medium and at a temperature of 20 to 40 ° C and a pH of 6 to 9. Suitable cultivation conditions are described in detail, for example, in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).
  • the cells are then disrupted and the product is obtained from the lysate by known protein isolation methods.
  • the cells can optionally be operated by high-frequency ultrasound, by high pressure, e.g. in a French pressure cell, by osmolysis, by the action of detergents, lyric enzymes or organic solvents, by homogenizers or by a combination of several of the processes listed.
  • Purification of the polypeptides can be achieved with known chromatographic methods, such as molecular sieve chromatography (gel filtration), such as Q-Sepharose chromatography, ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, and with other customary methods such as ultrafiltration, crystallization, salting out, dialysis and native gel electrophoresis. Suitable methods are described, for example, in Cooper, TG, Biochemical Working Methods, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.
  • vector systems or oligonucleotides which extend the cDNA by certain nucleotide sequences and thus code for modified polypeptides or fusion proteins, which are used, for example, for easier purification.
  • suitable modifications are, for example, so-called “tags” which act as anchors, such as, for example, the modification known as hexa-histidine anchors or epitopes which can be recognized as antigens of antibodies (described for example in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (NY) Press).
  • These anchors can be used to attach the proteins to a solid support, such as a polymer matrix, for example, which can be filled in a chromatography column, or can be used on a microtiter plate or on another support.
  • these anchors can also be used to recognize the proteins.
  • customary markers such as fluorescent dyes, enzyme markers, which form a detectable reaction product after reaction with a substrate, or radioactive markers, alone or in combination with the anchors, can be used to derivatize the proteins.
  • the invention also relates to a method for the microbiological production of vitamin B2 and / or precursors and / or derivatives thereof.
  • the microorganisms are preferably first cultivated in the presence of oxygen and in a complex medium, such as e.g. at a cultivation temperature of about 20 ° C or more, and a pH of about 6 to 9 until a sufficient cell density is reached.
  • a complex medium such as e.g. at a cultivation temperature of about 20 ° C or more, and a pH of about 6 to 9 until a sufficient cell density is reached.
  • an inducible promoter is preferred.
  • the cultivation is continued for 12 hours to 3 days after the induction of vitamin B2 production in the presence of oxygen.
  • cloning steps carried out in the context of the present invention such as, for example, restriction cleavages, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, Transformation of E. coli cells, cultivation of bacteria, multiplication of phages and sequence analysis of recombinant DNA were carried out as in Sambrook et al. (1989) described above.
  • the cultivation of recombinant E. coli strains DH5 ⁇ was carried out in LB-Amp medium (trypton 10.0 g, NaCl 5.0 g, yeast extract 5.0 g, ampicillin 100 g / ml H 2 O ad 1000 ml) at 37 ° C cultured.
  • LB-Amp medium trypton 10.0 g, NaCl 5.0 g, yeast extract 5.0 g, ampicillin 100 g / ml H 2 O ad 1000 ml
  • one colony was transferred from an agar plate into 5 ml LB-Amp using an inoculation loop. After culturing for about 18 hours at a shaking frequency of 220 rpm, 400 ml of medium were inoculated with 4 ml of culture in a 2 l flask.
  • P450 expression was induced in E. coli after an OD578 value between 0.8 and 1.0 was reached by inducing heat shock at 42 ° C. for three to four
  • the desired product can be obtained from the microorganism or from the culture supernatant by various methods known in the art. If the desired product is not secreted by the cells, the cells can be harvested from the culture by slow centrifugation, the cells can be lysed by standard techniques such as mechanical force or ultrasound treatment.
  • the cell debris is removed by centrifugation and the supernatant fraction containing the soluble proteins is obtained for further purification of the desired compound. If the product is secreted from the cells, the cells are removed from the culture by slow centrifugation and the supernatant fraction is retained for further purification.
  • the supernatant fraction from both purification processes is subjected to chromatography with a suitable resin, with the desired molecule either being retained on the chromatography resin or with higher selectivity than the impurities happens. These chromatography steps can be repeated if necessary using the same or different chromatography resins.
  • the person skilled in the art is skilled in the selection of the suitable chromatography resins and their most effective application for a particular molecule to be purified.
  • the purified product can be concentrated by filtration or ultrafiltration and kept at a temperature at which the stability of the product is maximum.
  • the identity and purity of the isolated compounds can be determined by prior art techniques. These include high-performance liquid chromatography (HPLC), spectroscopic methods, staining methods, thin-layer chromatography, NIRS, enzyme test or microbiological tests. These analysis methods are summarized in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol.60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; and Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • NIRS enzyme test or microbiological tests.
  • MPSS technology massive parallel signature sequencing as described by Brenner et al, Nat.Biotechnol. (2000) 18, 630-634; to which express reference is made
  • the mRNA of the organism is isolated at a specific point in time X, transcribed into cDNA using the enzyme reverse transcriptase and then cloned into special vectors which have a specific tag sequence.
  • the number of vectors with different tag sequences is chosen so high (about 1000 times higher) that, statistically speaking, each DNA molecule is cloned into a vector that is unique due to its tag sequence.
  • the vector inserts are cut out together with the tag.
  • the DNA molecules thus obtained are then incubated with microspheres that have the molecular counterparts of the tags mentioned. After incubation it can be assumed that each microsphere is loaded with only one type of DNA molecule via the specific tags or counterparts.
  • the beads are transferred to a special flow cell and fixed there, so that it is possible to carry out a mass sequencing of all beads using an adapted sequencing method based on fluorescent dyes and using a digital color camera. With this method, a numerically high evaluation is possible, but is limited by a reading range of approximately 16 to 20 base pairs. However, the sequence length is sufficient to allow a clear assignment between sequence and gene in most organisms (20 bp have a sequence frequency of -1x10 12 , the human genome has "only" a size of -3x10 9 bp in comparison).
  • the data obtained in this way are evaluated by counting the number of the same sequences and comparing their frequencies with one another. Frequently occurring sequences reflect a high level of expression, occasionally occurring sequences reflect a low level of expression. If the mRNA isolation took place at two different times (X and Y), it is possible to set up a temporal expression pattern of individual genes.
  • Ashbya gossypu was cultivated in a manner known per se (nutrient medium: 27.5 g / l yeast extract; 0.5 g / l magnesium sulfate; 50 ml / l soybean oil; pH 7). Ashbya gossypu mycelium samples are taken at different times during the fermentation (24h, 48h and 72h) and the corresponding RNA or mRNA is prepared according to the protocol of Sambrook et al. (1989) isolated from it.
  • Isolated mRNA from A gossypu is then subjected to MPSS analysis as explained above.
  • the determined data sets are subjected to a statistical evaluation and classified according to the significance of the expression differences. Both the increase and decrease in the level of expression were examined.
  • the expression change is classified into a) monotonous change, b) change after 24h, and c) change after 48h.
  • the 20bp sequences which represent an expression change and are determined by MPSS analysis are then used as probes and against a gene bank from Ashbya gossypii, with an average insert size of approximately 1 kb.
  • the hydriding temperature was in the range from about 30 to 57 ° C.
  • chromosomal DNA is first isolated using the method of Wright and Philippsen (Gene (1991) 109: 99-105) and Mohr (1995, PhD thesis, Biotechnik University Basel, Switzerland).
  • the DNA is partially digested with Sau3A.
  • Sau3A 6 ⁇ g genomic DNA is subjected to Sau3A digestion with different amounts of enzyme (0.1 to 1 U).
  • the fragments are fractionated in a sucrose density gradient.
  • the 1kb region is isolated and subjected to QiaEx extraction.
  • the largest fragments are ligated with the BamHI cut vector pRS416 (Sikorski and Hieter, Genetics (1988) 122; 19-27) (90 ng BamHI cut, dephosphorylated vector; 198 ng insert DNA; 5 ml water; 2 ⁇ l 10x ligation buffer; 1U ligase) , With this ligation approach, E. coli laboratory strain XL-1 blue is transformed and the resulting clones are used to identify the insert.
  • amino acid sequence derived from the corresponding counter-strand to SEQ ID NO: 1 has significant sequence homology with a dioxygenase from S. cerevisiae.
  • An amino acid partial sequence derived therefrom (corresponding to nucleotides 115 to 2 from SEQ ID NO: 1) with a partial sequence of the S. cerevisiae enzyme is shown in FIG. 1.
  • SEQ ID NO: 2 shows an N-terminally extended amino acid partial sequence.
  • the A. gossypu nucleic acid sequence determined could thus be assigned the function of a dioxygenase.
  • amino acid sequence derived from the corresponding opposite strand to SEQ ID NO: 5 has significant sequence homology with a heat shock protein from S. cerevisiae.
  • An amino acid partial sequence derived therefrom (corresponding to nucleotides 677 to 399 from SEQ ID NO: 5) with a partial sequence of the S. cerevisiae enzyme is shown in FIG. 2.
  • SEQ ID NO: 6 shows an N-terminally extended amino acid partial sequence.
  • SEQ ID NO: 7 shows a further partial sequence.
  • amino acid sequence derived from the corresponding counter-strand to SEQ ID NO: 8 has significant sequence homology with a methionine sulfoxide reductase from S. cerevisiae.
  • An amino acid partial sequence derived therefrom (corresponding to nucleotides 1259 to 828 from SEQ ID NO: 8) with a partial sequence of the S. cerevisiae enzyme is shown in FIG. 3.
  • SEQ ID NO: 9 shows an N-terminally extended amino acid partial sequence.
  • the A. gossypu nucleic acid sequence determined could thus be assigned the function of a methionine sulfoxide reductase.
  • the amino acid sequence derived from the coding strand to SEQ ID NO: 12 has significant sequence homology with a DNA repair protein from S. cerevisiae.
  • An amino acid partial sequence derived therefrom (corresponding to nucleotides 370 to 1608 from SEQ ID NO: 12) with a partial sequence of the S. cerevisiae enzyme is shown in FIG. 4.
  • SEQ ID NO: 13 shows an N-terminally extended amino acid partial sequence.
  • the A. gossypu nucleic acid sequence determined could thus be assigned the function of a DNA repair protein.
  • the amino acid sequence derived from the corresponding counter-strand to SEQ ID NO: 16 has significant sequence homology with a chaperonin-containing T complex from S. cerevisiae.
  • An amino acid partial sequence derived therefrom (corresponding to nucleotides 558 to 193 from SEQ ID NO: 16) with a partial sequence of the S. cerevisiae enzyme is shown in FIG. 5.
  • SEQ ID NO: 17 shows an N-terminally extended amino acid partial sequence.
  • the A. gossypu nucleic acid sequence determined could thus be assigned the function of a chaperonin-containing T complex.
  • a gossypu total high molecular weight cellular DNA was prepared from a 2 day old 100 ml culture grown in a liquid MA2 medium (10 g glucose, 10 g peptone, 1 g yeast extract, 0.3 g Myo-Inositad 1000 ml). The mycelium was filtered off, twice with H 2 O dest. washed, suspended in 10 ml of 1M sorbitol, 20 mM EDTA, containing 20 mg of zymolyase-20T, and incubated at 27 ° C. for 30 to 60 min with gentle shaking.
  • the protoplast suspension was adjusted to 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 100 mM EDTA and 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS) and incubated at 65 ° C. for 20 min. After two extractions with phenol-chloroform (1: 1 vol / vol), the DNA was precipitated with isopropanol, suspended in TE buffer, treated with RNase, precipitated again with isopropanol and resuspended in TE.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • An A. gossyp // cosmid library was made by binding genomic DNA selected in size, partially digested with Sau3A, to the dephosphorylated arms of the cosmid vector Super-Cos1 (Stratagene).
  • the Super Cos1 vector was separated between the two cos sites by digestion with X £ »a / and dephosphorylation with alkaline calf intestine phosphatase (Boeh- ringer) opened, followed by opening the cloning site with ßamHI. The ligations were carried out overnight at 15 ° C.
  • coli NM554 (recA13, araD139, ⁇ (ara, leu) 7696, ⁇ (lac) 17A, galil, galK, hsrR, rpsfstf), mcrA, mcrB) and on ampicillin (50 ⁇ g / ml) containing LB plates.
  • Transformants were obtained which contained an agoss type // insert with an average length of 30-45 kb.
  • a total of 4 ⁇ 10 4 fresh individual colonies were individually in wells of 96-well microtiter plates (Falcon, No. 3072) in 100 ⁇ l LB medium, supplemented with the freezing medium (36 mM K 2 HP ⁇ 4 / 13.2 mM KH 2 PO 4 , 1.7 mM sodium citrate, 0.4 mM MgSO 4 , 6.8 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 4.4% (wt vol) glycerol) and ampicillin (50 ⁇ g / ml), inoculated, overnight at Let grow at 37 ° C while shaking and freeze at -70 ° C.
  • freezing medium 36 mM K 2 HP ⁇ 4 / 13.2 mM KH 2 PO 4 , 1.7 mM sodium citrate, 0.4 mM MgSO 4 , 6.8 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 4.4% (wt vol) glycerol
  • ampicillin 50 ⁇ g / ml
  • the plates were quickly thawed and then duplicated in fresh medium using a 96 series replicator which had been sterilized in an ethanol bath followed by evaporation of the ethanol on a hot plate. Before freezing and after thawing (before any other measures), the plates were briefly shaken in a microtiter shaker (Infors) to ensure a homogeneous cell suspension. Individual clones were placed on nylon membranes by means of a robot system (bio-robotics), with which small amounts of liquid can be transferred from 96 wells of a microtiter plate to nylon membrane (GeneScreen Plus, New England Nuclear).
  • the membranes were placed on the surface of LB agar with ampicillin (50 ⁇ g / ml) in 22 ⁇ 22 cm culture dishes (Nunc) and overnight at 37 ° C. incubated. Before cell confluence was reached, the membranes were processed as described by Herrmann, BG, Barlow, DP and Lehrach, H. (1987) in Cell 48, pp. 813-825, with an additional treatment after the first denaturation step being a 5- minutes of steaming the filters on a pad soaked in denaturing solution is added over a boiling water bath.
  • the membranes were prehybridized and 6 to 12 h at 42 ° C in 50% (vol / vol) formamide, 600 mM sodium phosphate, pH 7.2, 1 mM EDTA, 10% dextran sulfate, 1% SDS, and 10x Denhardt's solution, containing salmon sperm DNA (50 ug / ml) hybridized with 32 P-labeled probes (0.5-1 x 10 6 cpm / ml). Typically Washing steps were carried out for about 1 hour at 55 to 65 ° C. in 13 to 30 mM NaCl, 1.5 to 3 mM sodium citrate, pH 6.3, 0.1% SDS and the filters were used for 12 to 24 hours at -70 ° C.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Polynukleotide aus Ashbya gossypii; damit hybridisierende Oligonukleotide; Expressionskassetten and Vektoren, welche diese Polynukleotide enthalten; damit transformierte Mikroorganismen; von diesen Polynukleotiden kodierte Polypeptide; and die Anwendung der Polypeptide and Polynukleotide als Targets zur Verbesserung der Stressresistenz and insbesondere der Verbesserung der Vitamin B2-Produktion in Mikroorganismen der Gattung Ashbya.

Description

Beschreibung
Neue Stress-assoziierte Genprodukte aus Ashbya gossypu
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Polynukleotide aus Ashbya gossypu; damit hybridisierende Oligonukleotide; Expressionskassetten und Vektoren, welche diese Polynukleotide enthalten; damit transformierte Mikroorganismen; von diesen Polynukleotiden kodierte Polypeptide; und die Anwendung der neuen Polypeptide und Polynukleotide als Targets zur Verbesserung der Stressresistenz und insbesondere der Verbesserung der Vitamin B2-Produktion in Mik- roorganismen der Gattung Ashbya.
Vitamin B2 (Riboflavin, Lactoflavin) ist ein alkali- und lichtempfindliches, in Lösung gelbgrün fluoreszierendes Vitamin. Vitamin B2-Mangel kann zu Ektodermschäden, insbesondere Linsentrübung, Keratitis, Korneavaskularisation, zu neurovegetativen und urogenitalen Störungen führen. Vitamin B2 ist Vorläufer für die neben NAD+ und NADP* wichtigen biologischen Wasserstoffüberträger-Moleküle FAD und FMN. Diese werden aus Vitamin B2 durch Phosphorylierung (FMN) und anschließende Adenylierung (FAD) gebildet.
Vitamin B2 wird in Pflanzen, Hefen und vielen Mikroorganismen aus GTP und Ribulose-5- phosphat synthetisiert. Der Reaktionsweg beginnt mit dem Öffnen des Imidazolrings von GTP und Abspaltung eines Phosphatrestes. Durch Desaminierung, Reduktion und Abspaltung des verbleibenden Phosphats entsteht 5-Amino-6-ribitylamino-2,4-pyrimidinon. Die Reaktion dieser Verbindung mit 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat führt zum bicyclischen Molekül 6,7- Dimethyl-8-ribityllumazin. Diese Verbindung wird durch Dismutation, bei der eine 4-Kohlenstoff- Einheit übertragen wird, in die tricyclische Verbindung Riboflavin umgesetzt.
Vitamin B2 kommt in vielen Gemüsen und in Fleisch vor, weniger in Getreideprodukten. Der tägliche Vitamin B2-Bedarf eines Erwachsenen liegt bei etwa 1 ,4 bis 2 mg. Hauptabbauprodukt der Coenzyme FMN und FAD beim Menschen ist wiederum Riboflavin, welches als solches ausge- schieden wird.
Vitamin B2 stellt damit ein wichtiges Nahrungsergänzungsmittel für Mensch und Tier dar. Es besteht daher das Bestreben, Vitamin B2 in technischem Maßstab zugänglich zu machen. Es wurde daher vorgeschlagen, Vitamin B2 auf mikrobiologischem Weg zu synthetisieren. Brauch- bare Mikroorganismen hierfür sind beispielsweise Bacillus subtilis, die Ascomyceten Eremothe- ciυm ashbyii, Ashbya gossypii sowie die Hefen Candida flareri und Saccharomyces cerevisiae. Die hierzu verwendeten Nährmedien umfassen Melasse oder Pflanzenöle als Kohlenstoffquelle, anorganische Salze, Aminosäuren, tierische oder pflanzliche Peptone und Proteine sowie Vitaminzusätze. In sterilen aeroben submersen Verfahren erhält man pro Liter Kulturbrühe Ausbeuten von mehr als 10 g Vitamin B2 innerhalb weniger Tage. Voraussetzung sind gute Belüftung der Kultur, sorgfältiges Rühren und Einstellung von Temperaturen unter etwa 30°C. Nach Abtrennen der Biomasse, Eindampfen und Trocknen des Konzentrates erhält man ein mit Vitamin B2 angereichertes Produkt.
Die mikrobiologische Produktion von Vitamin B2 ist beispielsweise beschrieben in der WO-A- 92/01060, der EP-A-0 405 370 und EP-A-0 531 708.
Eine Übersicht über Bedeutung, Vorkommen, Herstellung, Biosynthese und Verwendung von Vitamin B2 ist beispielsweise in Ullmann's Encyclopaedia of Industrial Chemistry, Band A27, Seiten 521 ff. zu finden.
Mikroorganismen sind einer Reihe von Stressfaktoren ausgesetzt. Diese Faktoren lassen sich nach Ihrer Wirkung wie folgt nach Stresstypen einteilen:
Nicht optimale Temperatur
Oxidativer Stress
Hyperosmolarität • Hypoosmolarität
Mechanischer Stress
Nicht optimales Nährstoffangebot
Kontakt mit Stoffen, die Giftcharakter aufweisen
Alle diese Stresstypen sind in der Lage, die Zelle zu schädigen oder sogar abzutöten. Um einen Schutz gegen diese Gefährdung aufzubauen, besitzen die Zellen Systeme der Stressantwort, die in der Lage sind, die Zelle an den Stress zu adaptieren, oder die Stressursache zu beseitigen.
Die Antwort der Zelle auf Stress beinhaltet Prozesse der Wachstumskontrolle, der Signaltrans- duktion, der Transkription und der posttranslationalen Kontrolle.
Die Nutzung von Mikroorganismen in Fermentern führt ebenfalls zu einer Reihe von Stresstypen (Attfield, P.V., Nature Biotechnology, 1997, 15, 1351 - 1357). So ist hier mit oxidativem Stress, einer nicht optimalen Osmolarität, mechanischen Stress (Scherstress hervorgerufen durch Rühren), einem nicht optimalen Nährstoffangebot und Kontakt mit giftigen Stoffwechselprodukten zu rechnen. Aerob lebende Organismen haben eine reduzierte, zelluläre Redox-Umgebung aufrecht zu erhalten, parallel zu den prooxidativen Verhältnissen, die ein aerobes Leben mit sich bringt. Die unvollständige Reduktion von Sauerstoff zu Wasser führt zu der Bildung von Redox-aktiven Sauerstoffintermediaten (ROI), wie Superoxidradiakalanionen, Hydrogenperoxid und Hydroxyl- radikale. ROI werden ebenfalls bei der ß-Oxidation der Fettsäuren, bei Einfluß von ultravioletter oder radioaktiver Strahlung, durch Metalle und Redox-aktiven Substanzen gebildet. Oxidativer Stress resultiert aus abnormal hohen Mengen an ROls, die den zellulären Redox-Status stören und zur Schädigung von Lipiden, Proteinen, DNA und RNA führen (Godon, C. etal. The Journal of Biological Chemistry, 1998, 273, 22480- 22489).
Aus diesem Grund prüfen Organismen ununterbrochen ihren Redoxstatus und adaptieren auf Änderungen durch die Induktion von Genen oder Aktivierung von Genprodukten, die in der Lage sind den zellulären Redox-Zustand wieder auf einen für die Zelle ungefährlichen Wert einzustel- len. Gleichzeitig werden aber auch Gene oder Genprodukte aktiviert, die durch ROls oder Strahlung geschädigte DNA erkennen und wieder reparieren können.
Gleiches gilt für die Adaption an veränderte Osmolarität. Auch hier prüft die Zelle den Osmosta- tus und reagiert auf Änderung durch Aktivierung von Genen und Genprodukten, die ungefährli- ehe osmolarische Bedingungen einstellen (Blomberg, A, Electrophoresis, 1997, 18, 1429 - 1440). Entsprechendes gilt für mechanischen Stress und Stress durch Nährstofflimitierung.
Werden Organismen mit Giften konfrontiert, dann werden Gene oder Genprodukte aktiviert, die entweder das Gift durch Modifizierung unschädlich machen, oder Transportsysteme aktivieren, die in der Lage sind, die Gifte aus der Zelle zu schaffen (Baumeister, W, Critical Reviews in Mic- robiology, 1997, 23, 1 - 46).
Die Nutzung von Genen der Stressantwort zur Generierung von Mikroorganismen, vorzugsweise der Gattung Ashbya, insbesondere von Ashbya gossypii Stämmen, mit einer höheren Resistenz gegen Stress ist noch nicht beschrieben.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung neuer Targets zur Beeinflussung der Stressantwort in Mikroorganismen der Gattung Ashbya, insbesondere in Ashbya gossypii. Insbesondere besteht die Aufgabe, die Streßresistenz in derartigen Mikroorganismen zu erhöhen. Eine weitere Aufgabe ist die Verbesserung der Vitamin B2-Produktion durch derartige Mikroorganismen. Gelöst wird obige Aufgabe durch Bereitstellung kodierenden Nukleinsäuresequenz, welche in Ashbya gossypu während der Vitamin B2-Produktion hoch- bzw. niederreguliert (basierend auf Ergebnissen, ermittelt mit Hilfe der im experimentellen Teil näher beschriebenen MPSS- Analysenmethode) sind, und zwar insbesondere:
a) eine, vorzugsweise hochregulierte, Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der Funktion einer Dioxygenase kodiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 70" trägt.
Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erlϊndungsgemäß ein DNA-Klon isoliert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Be- Zeichnung „Oligo70 v" trägt.
*
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 oder ein Fragment da- von. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypu isolierbar. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu komplementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.
Die Inserts von „Oligo 70 " und „Oligo 70v" besitzen mit dem MIPS Tag „YII057c" aus S. cere - siae signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 3. Eine vom korrespondierenden Gegenstrang zur SEQ ID NO: 1 bzw. vom kodierenden Strang der SEQ ID NO: 3 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einer Dioxygenase aus S. cerevisiae.
b) eine, vorzugsweise hochregulierte, Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der Funktion eines Hitzeschock-Proteins (insbesondere HSP26) kodiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 74" trägt. Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 5, welche vorzugsweise aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypu isolierbar ist. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung das dazu komplementäre Polynukleotid; und die von diesen Polynukleotiden durch Entar- tung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.
Das Insert von „Oligo 74" besitzt mit dem MIPS Tag „HSP26" aus S. cerevisiae signifikante Homologien. Das Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 5. Die vom korrespondierenden Gegenstrang abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomo- logie mit einem Hitzeschock-Protein (dem HSP26) aus S. cerevisiae.
c) eine, vorzugsweise hochregulierte, Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der Funktion einer Methioninsulfoxid-Reduktase kodiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 113" trägt.
Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon iso- liert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 113v" trägt.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Poly- nukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 10 oder Fragmente davon. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypii isolierbar. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu komplementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.
Die Inserts von „Oligo 113" und „Oligo 113v" besitzen mit dem MIPS Tag „Mxr1" aus S. cerevisiae signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8 bzw. SEQ ID NO: 10. Die vom korrespondierenden Gegenstrang von SEQ ID NO: 8 bzw. von SEQ ID NO: 10 abgeleitete Aminosäuresequenz bzw. Aminosäureteilsequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einer Methioninsulfoxid-Reduktase, einem für die Reduktion von Methio- ninsulfoxid verantwortlichen Protein aus S. cerevisiae. d) eine, vorzugsweise hochregulierte, Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der Funktion eines DNA-Reparatur-Proteins kodiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform diese Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 60" trägt.
Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon isoliert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Be- Zeichnung „Oligo 60v" trägt.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 12. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 14 oder ein Fragment da- von. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypu isolierbar. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu komplementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.
Die Inserts von „Oligo 60" und „Oligo 60v" besitzen mit dem MIPS Tag „Xrs2" aus S. cerevisiae signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 12 bzw. SEQ ID NO: 14. Die vom kodierenden Strand abgeleitete Aminosäuresequenz bzw. Aminosäureteilsequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem DNA-Reparatur-Protein aus S. cerevisiae.
e) eine, vorzugsweise niederregulierte, Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der Funktion einer Komponente eines Chaperonin-haltigen T-Komplexes kodiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 161" trägt.
Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon isoliert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Be- Zeichnung „Oligo 161v" trägt.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nuklein- säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 16. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 18 oder ein Fragment davon. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypu isolierbar. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu kom- plementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.
Die Inserts von „Oligo 161" und „Oligo 161v" besitzen mit dem MIPS Tag „Tcp1" aus S. cerevisiae signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 16 bzw. SEQ ID NO: 18. Die vom korrespondierenden Gegenstrang (zu SEQ ID NO:16) abgeleitete Aminosäuresequenz bzw. Aminosäureteilsequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einer Protein-Komponente eines Chaperonin-haltigen T-Komplexes aus S. cerevisiae.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Oligonukleotide, welche mit einem der obigen Polynukleotide, insbesondere unter stringenten Bedingungen, hybridisieren.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Polynukleotide, welche mit einem der erfindungsgemäßen Oligonukleotide hybridisieren und für ein Genprodukt aus Mikroorganismen der Gattung Ashbya oder ein funktionales Äquivalent dieses Genproduktes kodieren.
Die Erfindung betrifft weiterhin Polypeptide bzw. Proteine, welche von den oben beschriebenen Polynukleotiden kodiert werden; sowie Peptidfragmente davon, welche eine Aminosäuresequenz aufweisen, die wenigstens 10 zusammenhängende Aminosäurereste gemäß SEQ ID NO: 2, 4, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17 oder 19 umfasst; sowie funktionale Äquivalente der erfindungsgemäßen Polypeptide bzw. Proteine.
Funktionale Äquivalente unterscheiden sich dabei von den erfindungsgemäß konkret offenbarten Produkten in ihrer Aminosäuresequenz durch Addition, Insertion, Substitution, Deletion oder Inversion an wenigstens einer, wie z.B. 1 bis 30 oder 1 bis 20 oder 1 bis 10, Sequenzpositionen ohne die ursprünglich beobachtete und durch Sequenzvergleich mit anderen Proteinen ableitbare Proteinfunktion zu verlieren. Damit können Äquivalente im wesentlichen identische, höhere oder niedrigere Aktivitäten im Vergleich zum nativen Protein besitzen.
Weitere Gegenstände der Erfindung betreffen Expressionskassetten zur rekombinanten Produk- tion erfindungsgemäßer Proteine, umfassend in operativer Verknüpfung mit wenigstens einer regulativen Nukleinsäuresequenz eine der oben definierten Nukleinsäuresequenzen; sowie re- kombinante Vektoren, umfassend wenigstens eine solche erfindungsgemäße Expressionskassette. Erfindungsgemäß bereitgestellt werden außerdem prokaryotische oder eukaryotische Wirte, welche mit wenigstens einem Vektor obigen Typs transformiert sind. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden solche prokaryotischen oder eukaryotischen Wirte bereitgestellt, in welchen die funktionale Expression wenigstens eines Gens moduliert (z.B. Inhibition oder Überexpression) ist, das für ein erfindungsgemäßes Polypeptid nach obiger Definition kodiert; oder in welchen die biologische Aktivität eines Polypeptids nach obiger Definition erniedrigt oder erhöht ist. Bevorzugte Wirte sind ausgewählt unter Ascomyceten (Schlauchpilzen), insbesondere solchen der Gattung Ashbya und vorzugsweise Stämmen von A. gossypu.
Eine Modulation der Genexpression im obigen Sinn umfasst sowohl deren Inhibition, z.B. durch Blockade einer Expressionsstufe (insbesondere Transkription oder Translation) oder eine gezielte Überexpression eines Gens (z.B. durch Modifikation regulativer Sequenzen oder Erhöhung der Kopienzahl der kodierenden Sequenz).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette, eines erfindungsgemäßen Vektors oder eines erfindungsgemäßen Wirts zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette, eines erfindungsgemäßen Vektors oder eines erfindungsgemäßen Wirts zur rekombinanten Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids nach obiger Definition.
Erfindungsgemäß wird weiterhin ein Verfahren zur Nachweis bzw. zur Validierung eines Effektor- targets für die Modulation der mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon bereitgestellt. Dabei behandelt man einen Mikroorganismus, der zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon befähigt ist, mit einem Effektor, welcher mit einem Target, ausgewählt unter einem erfindungsgemäßen Polypeptid nach obiger Definition oder einer dafür kodierenden Nukleinsäurese- quenz, wechselwirkt ( wie z.B. an diese nicht-kovalent bindet), den Einfluß des Effektors auf die Menge des mikrobiologisch produzierten Vitamins B2 und/oder des Präkursors und/oder eines Derivats davon validiert; und das Target gegebenenfalls isoliert. Die Validierung erfolgt dabei bevorzugt durch direkten Vergleich mit der mikrobiologischen Vitamin B2-Produktion in Abwesenheit des Effektors unter ansonsten gleichen Bedingungen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Modulation (in Bezug auf Menge und/oder Geschwindigkeit) der mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon, wobei man einen Mikroorganismus, der zur mikrobiologi- sehen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon befähigt ist, mit einem Effektor behandelt, welcher mit einem Target, ausgewählt unter einem erfindungsgemäßen Polypeptid nach obiger Definition oder einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz, wechselwirkt.
Als bevorzugte Beispiele für oben genannte Effektoren sind zu nennen: a) Antikörper oder antigenbindene Fragmenten davon; b) von a) verschiedenen Polypeptid-Liganden, welche mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid wechselwirken; c) niedermolekulare Effektoren, welche die biologische Aktivität eines erfindungsgemäßen
Polypeptids modulieren; d) Antisense-Nukleinsäuresequenzen, welche mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz wechselwirken.
Oben genannte Effektoren mit Spezifität für wenigstens eines der oben definierten erfindungsgemäßen Tragets sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon, wobei man einen Wirt gemäß obiger Definition unter die Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon begünstigenden Bedingungen kultiviert und das(die) gewünschte(n) Produkte) aus dem Kulturansatz isoliert. Bevorzugt ist dabei, dass man den Wirt vor und/oder während der Kultivierung mit einem Effektor nach obiger Definition behandelt. Ein bevorzugter Wirt ist dabei ausgewählt unter Mikroorganismen der Gattung Ashbya; insbesondere transformiert, wie oben be- schrieben.
Ein letzter Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Poly- nukleotids oder Polypeptids als Target zur Modulation der Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon in einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya.
Fiqurenbeschreibunα:
Figur 1 zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem Gegenstrang zu Position 115 bis 2 in SEQ ID NO:1) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags YII057c aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenzpositionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet. Figur 2 zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem Gegenstrang zu Position 677 bis 399 in SEQ ID NO:5) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags HSP26 aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenzpositionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.
Figur 3 zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem Gegenstrang zu Position 1259 bis 828 in SEQ ID NO:8) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags Mxr1 aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Se- quenzpositionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.
Figur 4 zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem kodierenden Strang zu Position 370 bis 1608 in SEQ ID NO: 12) (obere Se- quenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags Xrs2 aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenzpositionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.
Figur 5 zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (ent- sprechend dem Gegenstrang zu Position 558 bis 193 in SEQ ID NO: 16) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags Tcp1 aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenzpositionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung:
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle kodieren Proteine bzw. Proteine, die hier als Proteine der Stressantwort (z.B. mit Aktivität bezüglich DNA-Reparatur oder Entgiftung) oder kurz als „SA-Proteine" bezeichnet werden. Diese SA-Proteine haben z.B. eine Funktion beim Schutz der Zelle vor schädlichen, äußeren Einflüssen (z.B. Radikalbildung, osmotischer Stress usw.) wie sie in Fermentern zu finden sind, insbesondere bei der Kultivierung von A. gossyp . Aufgrund der Verfügbarkeit von in Ashbya gossyp verwendbaren Klonierungsvektoren, wie z.B. offenbart in Wright und Philipsen (1991) Gene, 109, 99-105., und von Techniken zur genetischen Manipulation von A. gossypu und den verwandten Hefe-Arten lassen sich die erfindungs- gemäßen Nukleinsäuremoleküle zur genetischen Manipulation dieser Organismen, insbesondere von A. gossypu verwenden, um sie als Produzenten von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivate davon besser und effizienter zu machen. Diese verbesserte Produktion oder Effizienz kann aufgrund einer direkten Wirkung der Manipulation eines erfindungsgemäßen Gens oder auf einer indirekten Wirkung einer solchen Manipulation erfolgen.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Bereitstellung neuer Molekülen, die hier als SA- Nukleinsäure und SA-Proteine bezeichnet werden und an der Stressantwort, insbesondere in Ashbya gossypu, (z.B. bei DNA-Reparatur oder Entgiftung ) beteiligt sind. Die Aktivität der erfindungsgemäßen SA-Moleküle in A. gossypu beeinflußt die Vitamin B2-Produktion durch diesen Organismus. Vorzugsweise wird die Aktivität der erfindungsgemäßen SA-Moleküle so moduliert, dass die Stoffwechsel- und/oder Energiewege von A. gossypu, an denen die erfindungsgemä- ßen SA-Proteine teilnehmen, hinsichtlich der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Vitamin B2-Produktion moduliert werden, was entweder direkt oder indirekt die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Vitamin B2-Produktion in A. gossypu moduliert.
Die erfindungsgemäß bereitgestellten Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise aus dem Genom eines Ashbya gossyp//-Stammes isolierbar, der von der American Type Culture Collecti- on unter der Bezeichnung ATCC 10895 frei erhältlich ist.
Verbesserung der Vitamin B2-Produktion:
Es gibt eine Reihe von möglichen Mechanismen, über welche man durch Veränderung von Menge und/oder Aktivität eines erfindungsgemäßen SA-Proteins die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von Vitamin B2 durch einem A. gossypii-Stamm direkt beeinflussen kann.
So kann durch eine effizientere Stressantwort, die Zelle robuster gegen äußere Einflüsse gemacht werden, so dass die Lebensfähigkeit und damit die Produktivität im Fermenter erhöht wird.
Die Mutagenese von einem oder mehreren erfindungsgemäßen SA-Proteinen kann auch zu SA- Proteinen mit geänderten (erhöhten oder verminderten) Aktivitäten führen, die indirekt die Produktion des gewünschten Produkts aus A gossyp beeinflussen. Beispielsweise kann man mit Hilfe der SA-Proteine die Konzentration an freien Radikalen, welche Proteine angreifen und inaktivieren, verringern und so die Funktion von essentiellen Stoffwechselprozessen aufrecht erhalten. Zu diesen Prozessen gehört neben der Biosynthese des Produkts auch der Aufbau der Zellwände, die Transkription, Translation, die Biosynthese von Verbindungen, die für das Wachstum und die Teilung von Zellen nötig sind (z.B. Nukleotide, Aminosäuren, Vitamine, Lipide usw.) (Lengeier et al. (1999) Biology of Procaryotes, Thieme Verlag, Stuttgart). Durch Verbesserung von Wachstum und Vermehrung dieser veränderten Zellen ist es möglich, die Lebensfähig- keit der Zellen in Kulturen im Großmaßstab zu steigern und auch ihre Teilungsrate so zu verbessern, dass eine vergleichsweise größere Anzahl von produzierenden Zellen in der Fermenterkul- tur überleben kann. Die Ausbeute, Produktion oder Effizienz der Produktion kann zumindest aufgrund der Anwesenheit einer größeren Anzahl lebensfähiger Zellen, die jeweils das ge- wünschte Produkt produzieren, erhöht werden.
Polypeptide:
Gegenstand der Erfindung sind Polypeptide, welche die oben genannten Aminosäuresequenzen oder charakteristische Teilsequenzen davon umfassen und/odervon den hierin beschriebenen Nukleinsäuresequenzen kodiert werden.
Erfindungsgemäß mit umfasst sind ebenfalls „funktionale Äquivalente" der konkret offenbarten neuen Polypeptide.
„Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Polypeptide sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, (wie z.B. Substratspezifität) besitzen.
Unter "funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere Mutanten, welche in wenigstens einer der oben genannten Sequenzpositionen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der oben genannten biologische Aktivität besitzen. "Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure- Additionen, -Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden.
„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch Präkursoren der beschriebenen Polypeptide sowie funktionale Derivate und Salze der Polypeptide. Unter dem Ausdruck „Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Ami- nogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum
Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktioneilen Aminosäure- Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen.
"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Organismen, zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln.
„Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen o- der Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen.
„Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche ein der oben genannten Po- lypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funktioneile Beeinträchtigung der Fusionsprote- inteile) aufweisen. Nichtlimitiernde Beispiele für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Sig- nalpeptide, Enzyme, Immunoglobuline, Oberflächenantigene, Rezeptoren oder Rezeptorliganden.
Erfindungsgemäß mit umfasste „funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den konkret offen- barten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 75% ins besondere wenigsten 85 %, wie z.B. 90%, 95% oder 99%, Homologie zu einer der konkret offenbarten Sequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sei. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448.
Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße Äquivalente Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glykosylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen. Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Mutagenese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation oder Verkürzung des Proteins. Der Begriff "Homolog", wie er hier verwendet wird, betrifft eine Variante Form des Proteins, die als Agonist o- der Antagonist der Protein-Aktivität wirkt.
Homologe der erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäure- ebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstel- lung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen codieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (Z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakuraetal. (1984) Annu. Rev. Bio- chem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11 :477).
Zusätzlich können Banken von Fragmenten des Protein-Codons verwendet werden, um eine variegierte Population von Protein-Fragmenten zum Screening und zur anschließenden Selektion von Homologen eines erfindungsgemäßen Proteins zu erzeugen. Bei einer Ausführungsform kann eine Bank von kodierenden Sequenzfragmenten durch Behandeln eines doppelsträngigen PCR-Fragmentes einer kodierenden Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen, unter denen ein Nicking nur etwa einmal pro Molekül erfolgt, Denaturieren der doppelsträngigen DNA, Renaturieren der DNA unter Bildung doppelsträngiger DNA, die Sense-/Antisense-Paare von verschiedenen genickten Produkten umfassen kann, Entfernen einzelsträngiger Abschnitte aus neu gebildeten Duplices durch Behandlung mit S1-Nuclease und Ligieren der resultierenden Fragmentbank in einen Expressionsvektor erzeugt werden. Durch dieses Verfahren kann eine Expressionsbank hergeleitet werden, die N-terminale, C-terminale und interne Fragmente mit verschiedenen Größen des erfindungsgemäßen Proteins kodiert.
Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatori- scher Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese von erfindungsgemäßer Homologen erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen , unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen codiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:7811- 7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können rekombinant hergestellt werden (vgl. folgende Abschnitte) oder können in nativer Form unter Anwendung klassischer biochemischer Arbeitsweisen (vgl. Cooper, T. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin) aus Mikroorganismen, insbesondere solchen der Gattung Ashbya, isoliert werden.
Nukleinsäureseguenzen:
Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA), kodierend für eines der obigen Polypeptide und deren funktionalen Äquivalenten, welche z.B. unter Verwendung künstlicher Nukleo- tidanaloga zugänglich sind.
Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungsgemäße Po- lypeptide bzw. Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren, sowie Nukleinsäure- fragmente, die z.B. zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßen kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden können.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem untranslatierte Sequenzen vom 3'- und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthalten.
Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird. Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels molekularbiologischer Standard- Techniken und der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise kann cDNA aus einer geeigneten cDNA-Bank isoliert werden, indem eine der konkret offenbarten vollständigen Sequenzen oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies läßt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine der offenbarten Sequenzen oder einen Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor Moniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide, die einer SA-Nukleotidsequenz entsprechen, können ferner durch Standard-Syntheseverfahren, z.B. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.
Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequenzen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Pri- mern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung homologer Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z.B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.
Weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen sind abgeleitet von den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 8, 10, 12, 14, 16 und 18 und unterscheiden sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide, kodieren aber weiterhin für Polypeptide mit dem gewünschten Eigenschaftsprofil.
Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eines speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z.B. Spleißvarianten oder Allelvarianten, davon. Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstutionen (d.h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequenzen. Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den konkret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Polymorphismen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Variation existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidse- quenz eines Gens.
Weiterhin umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuresequenzen, welchen mit oben genannten kodierenden Sequenzen hybridisieren oder dazu komplementär sind. Diese Polynukleotide las- sen sich bei Durchmusterung von genomischen odercDNA-Banken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschließend beispielsweise mit geeigneten Sonden isolieren. Eine weitere Möglichkeit bietet die Transformation geeigneter Mikroorganismen mit erfindungsgemäßen Polynukleotiden oder Vektoren, die Vermehrung der Mikroorganismen und damit der Polynukleotide und deren anschließende Isolierung. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Polynukleotide auch auf chemischem Wege synthetisiert werden.
Unter der Eigenschaft, an Polynukleotide „hybridisieren" zu können, versteht man die Fähigkeit eines Poly- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen zu 70-100%, vorzugsweise zu 90-100%, komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Sou- thern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicherweise werden dazu Oligonukleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt. Unterstringenten Bedingungen versteht man beispielsweise in der Northern-Blot-Technik die Verwendung einer 50 -70 °C, vorzugsweise 60-65 °C warmen Waschlösung, beispielsweise 0,1xSSC-Puffermit 0,1% SDS (20x SSC: 3M NaCI, 0.3M Na-Citrat, pH 7,0) zur Elution unspezifisch hybridisierter cDNA-Sonden oder Oligonukleotide. Dabei bleiben, wie oben erwähnt, nur in hohem Maße komplementäre Nukleinsäuren aneinander gebunden. Die Einstellung stringenter Bedingungen ist dem Fachmann bekannt und ist z.B. in Ausubel etal., Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft "Antisense-'Nukleinsäuren. Diese umfaßt eine Nukleo- tidsequenz, die zu einer kodierenden "Sense-"Nukleinsäure, komplementär ist. Die Antisense- Nukleinsäure kann zum gesamten kodierenden Strang oder nur zu einem Abschnitt davon komplementärsein. Bei einerweiteren Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül an- tisense zu einem nicht-kodierenden Bereich des kodierenden Stranges einer Nukleotidsequenz. Der Begriff "nicht-kodierender Bereich" betrifft die als 5'- und 3'-untranslatierte Bereiche bezeichneten Sequenzabschnitte.
Ein Antisense-Oligonukleotid kann bspw. etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleoti- de lang sein. Eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure kann durch chemische Synthese und enzymatische Ligationsreaktionen mittels im Fachgebiet bekannter Verfahren konstruiert werden. Eine Antisense-Nukleinsäure kann chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschieden modifizierte Nukleotide verwendet werden, die so gestaltet sind, daß sie die biologische Stabilität der Moleküle erhöhen, oder die physikalische Stabili- tat des Duplexes erhöhen, der zwischen derAntisense-und Sense-Nukleinsäure entstanden ist. Beispielsweise können Phosphorthioat-Derivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele modifizierter Nukleotide, die zur Erzeugung der Antisense-Nukleinsäure verwendet werden können, sind u.a. 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-loduracil, Hypo- xanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5- Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Be- ta-D-Galactosylqueosin, Inosin, Nδ-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2- Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, Beta-D- Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6- isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2- Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5- oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2- carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin. Die Antisense-Nukleinsäure kann auch biologisch hergestellt werden, indem ein Expressionsvektor verwendet wird, in den ei- ne Nukleinsäure in Antisense-Richtung subkloniert worden ist.
Die erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäuremoleküle werden üblicherweise an eine Zelle verabreicht oder in situ erzeugt, so daß sie mit der zellulären mRNA und/oder einer kodierenden DNA hybridisieren oder daran binden, so daß die Expression des Proteins, z.B. durch Hemmung der Transkription und/oder Translation, gehemmt wird.
Das Antisense-Molekül kann so modifiziert werden, daß es spezifisch an einen Rezeptor oder an ein Antigen bindet, das auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert wird, z.B. durch Verknüpfen des Antisense-Nukleinsäuremoleküls mit einem Peptid oder einem Antikörper, das/der an einen Zelloberflächenrezeptor oder Antigen bindet. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch unter Verwendung der hier beschriebenen Vektoren an Zellen verabreicht werden. Zur Erzielung hinreichender intrazellulärer Konzentrationen der Antisense-Moleküle sind Vektorkon- strukte, in denen sich das Antisense-Nukleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines starken bakteriellen, viralen oder eukaryotischen Promotors befindet, bevorzugt.
In einerweiteren Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuremolekül ein alpha-anomeres Nukleinsäuremolekül. Ein alpha-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, wobei die Stränge im Gegensatz zu gewöhnlichen alpha-Einheiten parallel zueinander verlaufen. (Gaultier et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641). Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann zudem ein 2'-O- Methylribonukleotid (Inoue et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330) umfassen.
Gegenstand der Erfindung sind auch Ribozyme. Dies sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribo- nukleaseaktivität, die eine einzelsträngige Nukleinsäure, wie eine mRNA, zu der sie einen komplementären Bereich haben, spalten können. Somit können Ribozyme (z.B. Hammerhead- Ribozyme (beschrieben in Haselhoffund Gerlach (1988) Nature 334:585-591)) zur katalytischen Spaltung von erfindungsgemäßen Transkripten verwendet werden, um dadurch die Translation der entsprechenden Nukleinsäure zu hemmen. Ein Ribozym mit Spezifität für eine erfindungsgemäße kodierende Nukleinsäure kann z.B. auf der Basis einer hierin konkret offenbarten cDNA gebildet werden. Beispielsweise kann ein Derivat einer Tetrahymena-L-19-IVS-RNA konstruiert werden, wobei die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle komplementär zur Nukleotidsequenz ist, die in einer erfindungsgemäßen kodierenden mRNA gespalten werden soll. (vgl. z.B. US-A-4 987071 und US-A-5 116742). Alternativ kann mRNA zur Selektion einer katalytischen RNA mit spezifischer Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen verwendet werden (siehe z.B. Bartel, D., und Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418).
Die Genexpression erfindungsgemäßer Sequenzen läßt sich alternativ hemmen, indem Nukleotidsequenzen, die komplementär zum regulatorischen Bereich einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz sind (z.B. zu einem Promotor und/oder Enhancer einer kodierenden Sequenz) so dirigiert werden, daß Triple-Helixstrukturen gebildet werden, die die Transkription des entspre- chenden Gens in Ziel-Zellen verhindern (Helene, C. (1991 ) Anticancer Drug Res.6(6) 569-584; Helene, C. et al., (1992) Ann. N. Y. Acad. Sei. 660:27-36; und Mäher. L.J. (1992) Bioassays 14(12):807-815).
Expressionskonstrukte und Vektoren:
Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz; sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expres- sionskonstrukte. Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-strom- aufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz. Unter einer „operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Enhancer, Polyadenylie- rungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymo- logy 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Zusätzlich zu den artifiziellen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulationssequenz vor dem eigentlichen Strukturgen noch vorhanden sein. Durch genetische Veränderung kann diese natürliche Regulation gegebenenfalls ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht oder erniedrigt werden. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor das Strukturgen insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wird nicht entfernt. Statt dessen wird die natürliche Regulati- onssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert oder verringert wird. Die Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Beispiele für brauchbare Promotoren sind: cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, lambda-PR- oder im lambda-PL-Promotor, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden; sowie die gram-positiven Promotoren amy und SP02, die Hefepromotoren ADC1 , MFalpha , AC, P-60, CYC1 , GAPDH oder die Pflan- zenpromotoren CaMV/35S, SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, not oder der Ubiquitin- oder Pha- seolin-Promotor. Besonders bevorzugt ist die Verwendung induzierbarer Promotoren, wie z.B. licht- und insbesondere temperaturinduztierbarer Promotoren, wie der PrPrPromotor. Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Die genannten regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsäurese- quenzen ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten Monooxygenase-Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadeny- lierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biolo- gy, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.
Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, dereine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amster- dam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden.
Als Beispiele für geeignete Expressionsvektoren können genannt werden:
Übliche Fusionsexpressionsvektoren, wie pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. und John- son, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), bei denen Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusioniert wird.
Nicht-Fusionsprotein-Expressionsvektoren wie pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) und pET 11d (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Aca- demic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89). Hefe-Expressionsvektor zur Expression in der Hefe S. cerevisiae , wie pYepSed (Baldari et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie filamentösen Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector develop- mentforfilamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdyetal., Hrsg., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (bspw. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith etal., (1983) Mol. Cell BioL 3:2156- 2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170:31-39).
Pflanzen-Expressionsvektoren, wie solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol.20:1195-1197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12:8711-8721.
Säugetier-Expressionsvektoren, wie pCDMδ (Seed, B. (1987) Nature 329:840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195).
Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryontische und eukaryotische Zellen sind in Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.
Rekombinante Mikroorganismen:
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, wel- ehe beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.
Erfindungsgemäß sind auch homolog rekombinierten Mikroorganismen herstellbar. Dazu wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines erfindungsgemäßen Gens oder einer kodierenden Sequenz enthält, worin gegebenenfalls wenigstens eine Aminosäure-Deletion, - Addition oder -Substitution eingebracht worden ist, um die erfindungsgemäße Sequenz zu verändern, z.B. funktioneil zu disrumpieren ("Knockouf-Vektor). Die eingebrachte Sequenz kann z.B. auch ein Homologes aus einem Verwandten Mikroorganismus sein oder aus einer Säuge- tier-, Hefe- oder Insektenquelle abgeleitet sein. Der zur homologen Rekombination verwendete Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, daß das endogene Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktionelle Protein codiert (z.B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, daß dadurch die Expression des endogenen Proteins verändert wird). Der veränderte Abschnitt des SA-Gens ist im homologen Rekombinationsvektor. Die Konstruktion geeigneter Vektoren zur homologen Rekombination ist z.B. beschrieben in Thomas, K.R. und Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503.
Als Wirtsorganismen sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfin- dungsgemäßen Nukleinsäuren, ihrer Allelvarianten, ihrer funktioneilen Äquivalente oder Derivate ermöglichen. Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Bevorzugte Organismen sind Bakterien, wie solche der Gattungen Escherichia, wie z. B. Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, euka- ryotische Mikroorganismen, wie Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryotische Zellen aus Tieren oder Pflanzen, beispielsweise Sf9 oder CHO-Zellen. Bevorzugte Organismen sind aus der Gattung Ashbya, insbesondere aus A. gossypii-Stämmen ausgewählt.
Die Selektion erfolgreich transformierter Organismen kann durch Markergene erfolgen, die ebenfalls im Vektor oder in der Expressionskassette enthalten sind. Beispiele für solche Markergene sind Gene für Antibiotikaresistenz und für Enzyme, die eine farbgebende Reaktion katalysieren, die ein Anfärben der transformierten Zelle bewirkt. Diese können dann mittels automatischer Zellsortierung selektiert werden. Erfolgreich mit einem Vektor transformierte Mikroorganismen, die ein entsprechendes Antibiotikaresistenzgen (z.B. G418 oder Hygromycin) tragen, lassen sich durch entsprechende Antibiotika-enthaltende Medien oder Nährböden selektieren. Markerproteine, die an der Zelloberfläche präsentiert werden, können zur Selektion mittels Affinitätschroma- tographie genutzt werden.
Die Kombination aus den Wirtsorganismen und den zu den Organismen passenden Vektoren, wie Plasmide, Viren oder Phagen, wie beispielsweise Plasmide mit dem RNA- Polymerase/Promoter-System, die Phagen λ oder μ oder andere temperente Phagen oder Transposons und/oder weiteren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen bildet ein Expressionssystem. Beispielsweise ist unter dem Begriff "Expressionssystem" die Kombination aus Säugetierzellen, wie CHO-Zellen, und Vektoren, wie pcDNA3neo-Vektor, die für Säugetierzellen geeig- net sind, zu verstehen.
Gewünschtenfalls kann das Genprodukt auch in transgenen Organismen wie transgenen Tieren, wie insbesondere Mäusen, Schafen oder transgenen Pflanzen zur Expression gebracht werden.
Rekombinante Herstellung der Polypeptide:
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur rekombinanten Herstellung einer erfindungsgemäßen Polypeptide oder funktioneller, biologisch aktiver Fragmente davon, wobei man einen Polypeptide-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Polypeptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.
Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.
Die Zellen werden dann, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z.B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lyrischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombi- nation mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.
Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose-Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen übli- chen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, T. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben. Besonders vorteilhaft ist es, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nucleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die z.B. einer einfacheren Rei- nigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie z.B. die als Hexa-Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.
Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem übliche Marker, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Enzymmar- ker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon.
Wird die Umsetzung mit einem rekombinanten Mikroorganismus durchgeführt, so erfolgt vorzugsweise zunächst die Kultivierung der Mikroorganismen in Gegenwart von Sauerstoff und in einem Komplexmedium, wie z.B. bei einer Kultivierungstemperatur von etwa 20 °C oder mehr, und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9, bis eine ausreichende Zelldichte erreicht ist. Um die Reaktion besser steuern zu können, bevorzugt man die Verwendung eines induzierbaren Promotors. Die Kultivierung wird nach Induktion der Vitamin B2-Produktion in Gegenwart von Sauerstoff 12 Stunden bis 3 Tage fortgesetzt.
Folgende nichtlimitierende Beispiele beschreiben spezielle Ausführungsformen der Erfindung.
Allgemeine experimentelle Angaben
a) Allgemeine Klonierungsverfahren
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) a.a.O. beschrieben durchgeführt.
b) Polymerasekettenreaktion (PCR)
PCR wurde nach Standardprotokoll mit folgendem Standardansatz durchgeführt:
8 μl dNTP-Mix (200μM), 10 μl Taq-Polymerase-Puffer (10 x) ohne MgCI2, 8μl MgCI2 (25mM), je 1 μl Primer (0,1 μM), 1 μl zu amplifizierende DNA, 2,5 U Taq-Polymerase (MBI Fermentas, Vilnius, Litauen), ad 100 μl demineralisiertes Wasser.
c) Kultivierung von E.coli
Die Kultivierung von rekombinanten E. coli-Stämme DH5α wurde in LB-Amp Medium (Trypton 10,0g, NaCI 5,0 g, Hefeextrakt 5,0 g, Ampicillin 100 g/ml H20 ad 1000 ml) bei 37 °C kultiviert. Dazu wurde jeweils eine Kolonie mittels Impföse von einer Agarplatte in 5 ml LB-Amp überführt. Nach ca. 18 h Stunden Kultivierung bei einer Schüttelfrequenz von 220 Upm wurden 400 ml Medium in einem 2-l-Kolben mit 4 ml Kultur inokuliert. Die Induktion der P450-Expression in E. coli erfolgte nach Erreichen eines OD578-Wert.es zwischen 0,8 und 1 ,0 durch eine drei- bis vierstündige Hitzeschockinduktion bei 42 °C.
d) Reinigung des gewünschten Produktes aus der Kultur
Die Gewinnung des gewünschten Produktes aus dem Mikroorganismus oder aus dem Kulturüberstand kann durch verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen. Wird das gewünschte Produkt von den Zellen nicht sezerniert, können die Zellen aus der Kultur durch langsame Zentrifugation geerntet werden, die Zellen können durch Standard-Techniken, wie mechanische Kraft oder Ultraschallbehandlung, lysiert werden.
Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt, und die Überstandsfraktion, die die löslichen Proteine enthält, wird zur weiteren Reinigung der gewünschten Verbindung erhalten. Wird das Produkt von den Zellen sezerniert, werden die Zellen durch langsame Zentrifugation aus der Kultur entfernt, und die Überstandsfraktion wird zur weiteren Reinigung behalten.
Die Überstandsfraktion aus beiden Reinigungsverfahren wird einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das gewünschte Molekül mit höherer Selektivität als die Verunreinigungen entweder auf dem Chromatographieharz zurückgehalten wird oder dieses passiert. Diese Chromatographieschritte können nötigenfalls wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chromatographieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und ihrer wirksamsten Anwendung für ein bestimmtes zu reinigendes Molekül bewandert. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes maximal ist.
Im Stand der Technik sind viele Reinigungsverfahren bekannt. Diese Reinigungstechniken sind z.B. beschrieben in Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw- Hill: New York (1986).
Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindungen kann durch Techniken des Standes der Technik bestimmt werden. Diese umfassen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, NIRS, Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren sind zusammengefaßt in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol.60:133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; und Schmidt etal. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S.559-566, 575- 581 und S.581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Mo- lecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. etal. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.
e) Allgemeine Beschreibung der MPSS-Methode, Klonidentifizierung und Homologiesuche
Die MPSS Technologie (Massive Parallele Signatur Sequenzierung, wie von Brenner et al, Nat. Biotechnol.(2000) 18, 630-634 beschrieben; worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird) wurde an dem filamentösen, Vitamin B2 produzierenden P \z Ashbya gossypu angewendet. Mit Hilfe dieser Technologie ist es möglich, mit hoher Genauigkeit quantitative Aussagen über die Expressionsstärke einer Vielzahl von Genen in einem eukaryotischen Organismus zu erhalten. Dabei wird die mRNA des Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt X isoliert, mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben und anschließend in spezielle Vektoren kloniert, die eine spezifische Tag-Sequenz besitzen. Die Anzahl von Vektoren mit unterschiedlicher Tagsequenz wird dabei so hoch gewählt (etwa 1000-fach höher), dass statistisch gesehen, jedes DNA-Molekül in einen, durch seine Tag-Sequenz einzigartigen, Vektor kloniert wird.
Anschließend werden die Vektorinserts zusammen mit dem Tag herausgeschnitten. Die so erhaltenen DNA-Moleküle werden dann mit Mikrokügelchen inkubiert, die die molekularen Gegenstücke zu den erwähnten Tags besitzen. Nach Inkubation kann davon ausgegangen werden, daß jedes Mikrokügelchen über die spezifischen Tags bzw. Gegenstücke mit nur einer Sorte von DNA Molekülen beladen ist. Die Kügelchen werden in eine spezielle Flußzelle überführt und dort fixiert, so dass es möglich ist, mit Hilfe eines adaptierten Sequenzierverfahrens, auf Basis von Fluoreszensfarbstoffen und mit Hilfe einer digitalen Farbkamera, eine Massensequenzierung aller Kügelchen vorzunehmen. Mit dieser Methode ist zwar eine zahlenmäßig hohe Auswertung möglich, die allerdings durch eine Leseweite von etwa 16 bis 20 Basenpaaren limitiert ist. Die Sequenzlänge reicht dennoch aus, um bei den meisten Organismen eine eindeutige Zuordnung zwischen Sequenz und Gen zu ermöglichen (20bp besitzen eine Sequenzhäufigkeit von -1x1012, das menschliche Genom besitzt im Vergleich dazu "nur" eine Größe von -3x109 bp).
Die auf diese Weise erhaltenen Daten werden ausgewertet, indem die Anzahl der gleichen Sequenzen gezählt und ihre Häufigkeiten miteinander verglichen werden. Häufig auftretende Sequenzen spiegeln eine hohe Expressionsstärke, vereinzelt auftretende Sequenzen eine niedrige Expressionsstärke wider. Erfolgte die mRNA-lsolation zu zwei Unterschiedlichen Zeitpunkten (X und Y), so ist es möglich ein zeitliches Expressionsmuster einzelner Gene aufzustellen.
Beispiel 1 :
Isolation von mRNA aus Ashbya gossypu
Ashbya gossypu wurde in an sich bekannter Weise kultiviert (Nährmedium: 27,5 g/l Hefeextrakt; 0,5 g/l Magnesiumsulfat; 50ml/l Sojaöl; pH 7). Myzelproben von Ashbya gossypu werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Fermentation (24h, 48h und 72h) entnommen und die entsprechende RNA bzw. mRNA wird nach dem Protokoll von Sambrook et al. (1989) daraus isoliert.
Beispiel 2:
Anwendung der MPSS
Isolierte mRNA von A gossypu wird dann einer MPSS-Analyse, wie oben erläutert, unterzogen.
Die ermittelten Datensätze werden einer statistischen Auswertung unterzogen und nach Signifikanz der Expressionsunterschiede gegliedert. Dabei wurde sowohl hinsichtlich Erhöhung bzw. Erniedrigung der Expressionsstärke untersucht. Eine Einteilung erfolgt über eine Einstufung der Expressionsveränderung in a) monotone Veränderung, b) Veränderung nach 24h, und c) Veränderung nach 48h.
Die eine Expressionsveränderung repräsentierenden durch MPSS-Analyse ermittelten 20bp- Sequenzen werden dann als Sonden verwendet und gegen eine Genbank von Ashbya gossypii, mit einer durchschnittlichen Insertgröße von etwa 1kb, hybridisiert. Die Hydridisierungstempera- tur lag dabei im Bereich von etwa 30 bis 57°C.
Beispiel 3: Erstellung einer genomischen Genbank aus Ashbya gossypu
Zur Erstellung einer genomischen DNA-Bank wird zunächst chromosomale DNA nach der Methode von Wright und Philippsen (Gene (1991 ) 109: 99-105) und Mohr (1995, PhD Thesis, Biozentrum Universität Basel, Schweiz) isoliert.
Die DNA wird partiell mit Sau3A verdaut. Dazu werden 6μg genomische DNA einem Sau3A Verdau mit unterschiedlichen Enzymmengen (0,1 bis 1 U) unterzogen. Die Fragmente werden in einem Saccharose-Dichtegradienten fraktioniert. Die 1kb Region wird isoliert und einer QiaEx- Extraktion unterzogen. Die größten Fragmente werden mit dem BamHI geschnittenen Vektor pRS416 (Sikorski und Hieter, Genetics (1988) 122; 19-27) ligiert (90 ng BamHI geschnittener, dephosphorylierter Vektor; 198 ng Insert DNA; 5ml Wasser; 2 μl 10xLigationspuffer; 1U Ligase). Mit diesem Ligationsansatz wird E. coli Laborstamm XL-1 blue transformiert und die resultierenden Klone werden zur Identifizierung des Inserts eingesetzt.
Beispiel 4:
Herstellung einer geordneten Genbank (CHIP-Technologie)
Etwa 25,000 Kolonien der Ashbya gossypu Genbank (dies entspricht einer etwa 3-fachen Genomabdeckung) wurden gordnet auf eine Nylonmembran transferiert und anschließend nach der Methode der Koloniehybridisierung wie in Sambrook et al. (1989) beschrieben, behandelt. Von den durch MPSS-Analyse ermittelten 20bp-Sequenzen wurden Oligonukleotide synthetisiert und mit Hilfe von 32P radioaktiv markiert. Jeweils 10 markierte Oligonukleotide mit ähnlichem Schmelzpunkt werden vereinigt und gemeinsam gegen die Nylonmembranen hybridisiert. Nach Hybridisierungs- und Waschschritten werden positive Klone durch Autoradiographie identifiziert, und mit Hilfe von PCR-Sequenzierung direkt analysiert.
Auf diese Weise wurde ein Klon identifiziert, der ein Insert mit der internen Bezeichnung „Oligo 70" trägt und mit dem MIPS Tag „YII057c" aus S. cerevisiae signifikante Homologien besitzt. Das Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1.
Beispiel 5:
Auswertung der Sequenzdaten mit Hilfe einer BLASTX Suche Eine Auswertung der erhaltenen Nukleinsäure-Sequenzen, d.h. deren funktionale Zuordnung zu einer funktionalen Aminosäuresequenz, erfolgte mittels einer BLASTX-Suche in Sequenz- Datenbanken. Fast alle der aufgefundenen Aminosäuresequenz-Homologien betrafen Saccha- romyces cerevisiae (Bäckerhefe). Da dieser Organismus bereits vollständig sequenziert worden ist, konnten genauere Informationen bezüglich dieser Gene unter: http://www.mips.gsf.de/proi/veast search/code search.htm nachgeschlagen werden.
So wurden folgende Homologien mit einem Aminosäurefragment aus S. cerevisiae ermittelt. Die entsprechenden Alignments sind in beiliegenden Figuren 1 bis 5 gezeigt.
a) Die vom korrespondierenden Gegenstrang zu SEQ ID NO: 1 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einer Dioxygenase aus S. cerevisiae. Eine davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 115 bis 2 aus SEQ ID NO:1 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Enzyms ist in Figur 1 dargestellt. SEQ ID NO: 2 zeigt eine N-terminal verlängerte Aminosäure-Teilsequenz.
Die ermittelte A. gossypu Nukleinsäuresequenz konnte damit die Funktion einer Dioxygenase zugeordnet werden.
b) Die vom korrespondierenden Gegenstrang zu SEQ ID NO: 5 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem Hitzeschock-Protein aus S. cerevisiae. Eine davon abgeleitete Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 677 bis 399 aus SEQ ID NO:5) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Enzyms ist in Figur 2 darge- stellt. SEQ ID NO: 6 zeigt eine N-terminal verlängerte Aminosäure-Teilsequenz. SEQ ID NO: 7 zeigt eine weitere Teilsequenz.
Der ermittelten A. gossypu Nukleinsäuresequenz konnte damit die Funktion eines Hitzeschock- Proteins zugeordnet werden.
c) Die vom korrespondierenden Gegenstrang zu SEQ ID NO:8 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einer Methioninsulfoxid-Reduktase aus S. cerevisiae. Eine davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 1259 bis 828 aus SEQ ID NO:8 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Enzyms ist in Figur 3 darge- stellt. SEQ ID NO: 9 zeigt eine N-terminal verlängerte Aminosäure-Teilsequenz .
Der ermittelten A. gossypu Nukleinsäuresequenz konnte damit die Funktion einer Methioninsulfoxid-Reduktase zugeordnet werden. d) Die vom kodierenden Strang zu SEQ ID NO:12 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem DNA-Reparatur-Protein aus S. cerevisiae. Eine davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 370 bis 1608 aus SEQ ID NO:12 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Enzyms ist in Figur 4 dargestellt. SEQ ID NO: 13 zeigt eine N-terminal verlängerte Aminosäure-Teilsequenz .
Der ermittelten A. gossypu Nukleinsäuresequenz konnte damit die Funktion eines DNA- Reparatur-Proteins zugeordnet werden.
e) Die vom korrespondierenden Gegenstrang zu SEQ ID NO:16 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit eines Chaperonin-haltigen T-Komplexes aus S. cerevisiae. Eine davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 558 bis 193 aus SEQ ID NO: 16 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Enzyms ist in Figur 5 dargestellt. SEQ ID NO: 17 zeigt eine N-terminal verlängerte Aminosäure-Teilsequenz .
Die ermittelte A. gossypu Nukleinsäuresequenz konnte damit die Funktion eines Chaperonin- haltigen T-Komplexes zugeordnet werden.
Beispiel 6:
Isolierung der Full-Lenqth-DNA
a) Konstruktion einer A gossypw-Genbank
Hochmolekulare zelluläre Gesamt-DNA von A gossypu wurde aus einer 2 Tage alten, in einem flüssigen MA2-Medium (10g Glucose, 10g Pepton, 1g Hefeextrakt, 0,3g Myo-Inositad 1000 ml) gewachsenen 100 ml Kultur hergestellt. Das Myzel wurde abfiltriert, zweimal mit H2O dest. gewaschen, in 10 ml 1M Sorbitol, 20 mM EDTA, enthaltend 20 mg Zymolyase-20T, suspendiert und 30 bis 60 min unter leichtem Schütteln bei 27 °C inkubiert. Die Protoplasten-Suspension wurde auf 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCI, 100 mM EDTA und 0,5-%igem Natriumdode- cylsulfat (SDS) eingestellt und 20 min bei 65 °C inkubiert. Nach zwei Extraktionen mit Phenol- Chloroform (1:1 vol/vol) wurde die DNA mit Isopropanol gefällt, in TE-Puffer suspendiert, mit RNase behandelt, erneut mit Isopropanol gefällt und in TE resuspendiert.
Eine A. gossyp//-Kosmid-Genbank wurde hergestellt, indem man nach der Größe ausgewählte, mit Sau3A teilverdaute genomische DNA an die dephosphorylierten Arme des Cosmidvektors Super-Cos1 (Stratagene) band. Der Super-Cos1 -Vektor wurde zwischen den beiden cos-Stellen durch Verdau mitX£»a/und Dephosphorylierung mit alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase (Boeh- ringer) geöffnet, gefolgt von einem Öffnen der Klonierungsstelle mit ßamHI. Die Ligationen wurden über Nacht bei 15 °C in 20 μl, enthaltend 2,5 μg teilverdauter chromosomaler DNA, 1 μg Super-Cos1 -Vektorenarme, 40 mM Tris-HCI, pH 7,5, 10 mM MgCI2, 1mM Dithiothreitol, 0,5 mM ATP und 2 Weiss-Einheiten T4-DNA-Ligase (Boehringer) durchgeführt. Die Ligationsprodukte wurden unter Verwendung der Extrakte und des Protokolls von Stratagene (Gigapack II Packa- ging Extract) in vitro verpackt. Das verpackte Material wurde zur Infizierung von E. coli NM554 (recA13, araD139, Δ(ara,leu)7696, Δ(lac)17A, galil, galK, hsrR, rpsfstf), mcrA, mcrB) verwendet und auf Ampicillin (50 μg/ml) enthaltende LB-Platten verteilt. Man erhielt Transformanten, welche ein A gossyp//-lnsert einer durchschnittlichen Länge von 30-45 kb enthielten.
b) Lagerung und Screening der Cosmid-Genbank
Insgesamt 4 x 104 frische Einzelkolonien wurden einzeln in Vertiefungen von 96-er Microtiterplatten (Falcon, Nr. 3072) in 100 μl LB-Medium, ergänzt mit dem Gefriermedium (36 mM K2HPθ4/13,2 mM KH2PO4, 1 ,7 mM Natriumeitrat, 0,4 mM MgSO4, 6,8 mM (NH4)2SO4, 4,4% (wt vol) Glycerin) und Ampicillin (50 μg/ml), inokuliert, über Nacht bei 37 °C unter Schütteln wachsen gelassen und bei -70 °C eingefroren. Die Platten wurden rasch aufgetaut und danach unter Verwendung eines 96-er-Replikators, der in einem Ethanolbad unter anschließender Verdunstung des Ethanols auf einer heißen Platte sterilisiert worden war, in frisches Medium dupli- ziert. Vor dem Einfrieren und nach dem Auftauen (vor irgendwelchen anderen Maßnahmen) wurden die Platten kurz in einem Mikrotiterschüttler (Infors) geschüttelt, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten. Mittels eines Robotersystems (Bio-Robotics), mit dem geringe Mengen an Flüssigkeit aus 96 Vertiefungen einer Mikrotiterplatte auf Nylonmembran (GeneSc- reen Plus, New England Nuclear) transferiert werden können, wurden einzelne Klone auf Ny- lonmembranen platziert. Nach dem Transfer der Kultur aus den 96-er Mikrotiterplatten (1920 Klone) wurden die Membranen auf die Oberfläche von LB-Agar mit Ampicillin (50 μg/ml) in 22 x 22 cm Kulturschalen (Nunc) platziert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Vor Erreichen derZell- konfluenz wurden die Membranen, wie von Herrmann, B. G., Barlow, D. P. und Lehrach, H. (1987) in Cell 48, S. 813-825 beschrieben, prozessiert, wobei als zusätzliche Behandlung nach dem ersten Denaturierungsschritt ein 5-minütiges Bedampfen der Filter auf einem in Denaturie- rungslösung getränkten Pad über einem kochenden Wasserbad hinzukommt.
Hit Hilfe des Random-Hexamer-Primer-Verfahrens (Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. (1983), Anal. Biochem. 132, S. 6-13) wurden doppelsträngige Sonden durch Aufnahme von [alpha- 32P]dCTP mit hoher spezifischer Aktivität markiert. Die Membranen wurden prähybridisiert und 6 bis 12 h bei 42 °C in 50% (vol/vol) Formamid, 600 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 1 mM EDTA, 10% Dextransulfat, 1% SDS, und 10x Denhardt-Lösung, enthaltend Lachssperma-DNA (50 μg/ml) mit 32P-markierten Sonden (0,5-1 x 106cpm/ml) hybridisiert. Typischerweise wurden Waschschritte etwa 1 h bei 55 bis 65 °C in 13 bis 30 mM NaCI, 1,5 bis 3 mM Natriumeitrat, pH 6,3, 0,1 % SDS durchgeführt und die Filter wurden 12 bis 24 h bei -70 °C mit Kodak- Verstärkerplatten autoradiographiert. Bislang wurden einzelne Membrane mehr als 20 mal erfolgreich wiederverwendet. Zwischen den Autoradiographien wurden die Filter durch Inkubation bei 95 °C für 2 x 20 min in 2 mM Tris-HCI, pH 8,0, 0,2 mM EDTA, 0,1 % SDS gestrippt.
c) Zurückgewinnung positiver Kolonien aus der aufbewahrten Genbank
Gefrorene Bakterienkulturen in Microtiter-Wells wurden unter Verwendung steriler Einweg- Lanzetten abgekratzt und das Material wurde auf LB-Agar-Petrischalen enthaltend Ampicillin (50 μg/ml) ausgestrichen. Einzelne Kolonien wurden danach zur Inokulierung von Flüssigkulturen für Herstellung von DNA mittels Alkali-Lyse-Verfahren (Bimboim, H. C. und Doly, J. (1979), Nucleic Acids Res. 7, S. 1513-1523) verwendet.
d) Full-Length DNA
Auf die oben beschriebenen Weise konnten die im folgendenden genannten Klone identifiziert werden, der ein Insert mit der Vollsequenz zu den gemäß Beispiel 5 erhaltenen Teilsequenzen tragen. Diese Klon tragen die internen Bezeichnungen „Oligo 70v", „Oligo 113v", „Oligo 60v" und „Oligo 161v". Eine Übersicht über sämtliche erfindungsgemäße Teil- und Vollsequenzen ist in folgender Tabelle 1 zu finden:
Tabelle 1 :Sequenzübersicht

Claims

Patentansprüche
1. Polynukleotid, welches für ein Protein der Stressantwort kodiert und aus Ashbya gossypu isolierbar ist.
2. Polynukleotid nach Anspruch 1 , welches für ein Protein der Stressantwort kodiert, das ausgewählt ist unter Proteinen mit der biologischen Aktivität einer Dioxygenase, eines Hitzeschockproteins, einer Methioninsulfoxid Reduktase, eines DNA-Repair-Proteins und eines Proteins des Chaperonin-haltigen T-Komplexes.
3. Polynukleotid, nach Anspruch 1 oder 2, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , 5, 8, 12 oder 16, welche vorzugsweise aus Ashbya gossypii isolierbar ist, oder Fragmente davon; das dazu komplementäre Polynukleotid; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.
4. Polynukleotid nach Anspruch 3, welches eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, 10, 14 oder 18 oder ein Fragment davon umfasst.
5. Oligonukleotid, welches mit einem Polynukleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere unter stringenten Bedingungen, hybridisiert.
6. Polynukleotid, welches mit einem Oligonukleotid nach Anspruch 5, insbesondere unter stringenten Bedingungen, hybridisiert und für ein Genprodukt aus Mikroorganismen der Gattung Ashbya oder ein funktionales Äquivalent dieses
Genproduktes kodiert.
7. Polypeptid, welches von einem Polynukleotid kodiert wird, das eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder ein Fragment davon umfasst, oder von einem Polynukleotid nach Anspruch 6 kodiert wird; oder welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die wenigstens 10 zusammenhängende Aminosäurereste gemäß SEQ ID NO: 2, 4, 6, 7, 9, 11 , 13, 15, 17 oder 19 umfasst; sowie funktionale Äquivalente davon, insbesondere solche welche eine der in Anspruch 2 definierten Aktivitäten besitzen.
8. Expressionskassette, umfassend in operativer Verknüpfung mit wenigstens einer regulativen Nukleinsäuresequenz eine Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
9. Rekombinanter Vektor, umfassend wenigstens eine Expressionskassette nach Anspruch 8.
10. Prokaryotischer oder eukaryotischer Wirt, transformiert mit wenigstens einem Vektor nach Anspruch 9.
11. Prokaryotischer oder eukaryotischer Wirt, in welchem die funktionale Expression wenigstens eines Gens moduliert ist, das für ein Polypeptid nach Anspruch 7 kodiert; oder in welchem die biologische Aktivität eines Polypeptids nach Anspruch 7 erniedrigt oder erhöht ist.
12. Wirt nach Anspruch 10 oder 11 aus der Gattung Ashbya.
13. Verwendung einer Expressionskassette nach Anspruch 8, eines Vektors nach Anspruch 7 oder eines Wirts nach einem der Ansprüche 10 bis 12 zur mikro- biologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon.
14. Verwendung einer Expressionskassette nach Anspruch 8, eines Vektors nach Anspruch 9 oder eines Wirts nach einem der Ansprüche 10 bis 12 zur rekombinanten Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 7.
15. Verfahren zum Nachweis eines Effektortargets für die Modulation der mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon, wobei man einen Mikroorganismus, der zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon befähigt ist, mit einem
Effektor behandelt, welcher mit einem Target, ausgewählt unter einem Polypeptid nach Anspruch 7 oder einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz, wechselwirkt, insbesondere bindet, den Einfluss des Effektors auf die Menge des mikrobiologisch produzierten Vitamins B2, und/oder des Präkursors und/oder eines Derivats davon validiert; und das Target gegebenenfalls isoliert.
16. Verfahren zur Modulation der mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon, wobei man einen Mikroorganismus, der zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon befähigt ist, mit einem Effektor behandelt, welcher mit einem Target, ausgewählt unter einem Polypeptid nach Anspruch 7 oder einer dafür kodierenden
Nukleinsäuresequenz, wechselwirkt.
17. Effektor für ein Target, ausgewählt unter einem Polypeptid nach Anspruch 7 oder einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz, wobei der Effektor ausgewählt ist unter: a) Antikörpern oder antigenbindenden Fragmenten davon; b) von a) verschiedenen Polypeptid-Liganden, welche mit dem Polypeptid gemäß Anspruch 7 wechselwirken; c) niedermolekularen Effektoren, welche die biologische Aktivität eines Polypeptids nach Anspruch 7 modulieren; d) Antisense-Nukleinsäuresequenzen.
18. Verfahren zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon, wobei man einen Wirt nach einem der Ansprüche 10 bis 12 unter die Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon begünstigenden Bedingungen kultiviert und das(die) gewünschte(n) Produkt(e) aus dem Kulturansatz isoliert.
19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei man vor und/oder während der Kultivierung des Wirts diesen mit einem Effektor nach Anspruch 17 behandelt.
20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei der Wirt ausgewählt ist unter Mikroorganismen der Gattung Ashbya.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei der Mikroorganismus ein Wirt nach einem der Ansprüche 10 bis 12 ist.
22. Verwendung eines Polynukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 6 oder eines Polypeptids nach Anspruch 7 als Target zur Modulation der Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon in einem
Mikroorganismus der Gattung Ashbya.
23. Verwendung eines Polynukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 6 oder eines Polypeptids nach Anspruch 7 als Target zur Modulation der Stressantwort oder eines stressbedingten Folgezustandes in einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya während der Kultivierung zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon.
24. Wirt nach Anspruch 12 mit verbesserter Resistenz gegen insbesondere fermentativen Stress.
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