EP1392268A2 - Arzneimittel enthaltend ein polyamin als wirksubstanz - Google Patents

Arzneimittel enthaltend ein polyamin als wirksubstanz

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EP1392268A2
EP1392268A2 EP01985905A EP01985905A EP1392268A2 EP 1392268 A2 EP1392268 A2 EP 1392268A2 EP 01985905 A EP01985905 A EP 01985905A EP 01985905 A EP01985905 A EP 01985905A EP 1392268 A2 EP1392268 A2 EP 1392268A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polyamine
medicament
dependent
medicament according
polyethyleneimine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01985905A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tobias Schlapp
Sonja Maria Friederichs
Martin Vollmer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Covestro Deutschland AG
Original Assignee
Bayer Healthcare AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Healthcare AG filed Critical Bayer Healthcare AG
Publication of EP1392268A2 publication Critical patent/EP1392268A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K31/785—Polymers containing nitrogen
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    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents

Definitions

  • the present invention relates to medicaments containing a polyamine as active substance, and to the use of a polyamine for the production of immunostimulating medicaments or of medicaments for the treatment and / or prophylaxis of various diseases in humans and animals.
  • Immune stimulators exist e.g. B. from chemically inactivated Parapoxvirus ovis, strain D 1701 (DE-A 35 04 940). A product made on the basis of this virus is BAYPAMU ⁇ ® .
  • the inactivated parapoxvirus induces non-specific protection against infections with a wide variety of pathogens in animals. It is believed that this
  • immune stimulators such as unmethylated, CpG-containing oligonucleotides (WO 98/18810) can be used to activate the non-adaptive immune system and to strengthen the organism against the occurrence of pathogens.
  • CpG-containing oligonucleotides WO 98/18810
  • a single dose can activate the initial immune response and prevent infection with various pathogens.
  • the object of the present invention was to provide pharmaceuticals which are new
  • Contain immunostimulators which have a similar efficacy to Parapox ovis, but can be synthesized chemically and are therefore cheaper to produce and easier to combine with chemotherapeutic agents.
  • the task was solved by providing medicinal products that a
  • the polyamines classified as active substance contain at least 10 monomer units or at least 10 nitrogen atoms, preferably at least 45 monomer units or at least 45 nitrogen atoms.
  • the polyamine can have a linear or branched structure.
  • the polyamine is preferably soluble or dispersible in water; in aqueous media, partial protonation depends on the pH value.
  • Degree of protonation can be determined by physico-chemical measurement methods such as zeta potential measurements.
  • the polyamine further preferably has hydrophobic substituents.
  • the hydrophobic substituents can be arranged as side chains or at the end of the polymer.
  • the degree of substitution is preferably between 0.01 and 10 percent.
  • hydrophobic substituents are alkyl chains, acyl chains or steroid-like substituents.
  • Acyl chains are particularly suitable as hydrophobic substituents.
  • hydrophobic substituents which can be introduced by adding the nitrogen functions of the main polymer chain to isocyanates or to ⁇ , ⁇ -unsaturated carbonyl compounds.
  • the polyamine is particularly preferably a polyethyleneimine.
  • a polyethyleneimine which can preferably be used for pharmaceutical production has the following general formula:
  • R represents hydrogen, methyl or ethyl
  • R 2 is alkyl having 1 to 23 carbon atoms, preferably alkyl having 12 to 23 carbon atoms, particularly preferably alkyl having 17 carbon atoms,
  • R 3 and R 4 (end groups) independently of one another are hydrogen and alkyl having 1 to 24 carbon atoms, preferably alkyl having 13 to 24 carbon atoms, particularly preferably alkyl with 18 carbon atoms, or have a structure dependent on the initiator,
  • R 5 is a substituent dependent on the termination reaction, for example hydroxyl, NH 2 , NHR or NR, the radicals R being the end groups
  • R 3 and R 4 can correspond,
  • the units m and n are not block structures, but statistically distributed in the polymer.
  • Another polyethyleneimine which can preferably be used for pharmaceutical production has the following general formula:
  • R 1 is hydrogen, methyl or ethyl
  • R> 2 denotes alkyl having 1 to 22 carbon atoms, preferably alkyl having 11 to 22 carbon atoms, particularly preferably alkyl having 16 carbon atoms, and in what
  • R 3 and R 4 (end groups) independently of one another are hydrogen or acyl with 1 to 24 carbon atoms, preferably acyl with 13 to 24 carbon atoms, particularly preferably acyl with 18 carbon atoms, or have a structure dependent on the initiator,
  • R 5 is a substituent which is dependent on the termination reaction, for example hydroxyl, NH 2 , NHR or NR 2 , where the radicals R can correspond to the end groups R 3 and R 4 ,
  • the units m and n are not block structures, but statistically distributed in the polymer.
  • Another one that can preferably be used for drug production is Another one that can preferably be used for drug production
  • Polyethyleneimine has the following general formula:
  • R, R and R are hydrogen or hydroxy
  • R 4 and R 5 (end groups) independently of one another denote hydrogen or steroid base bodies such as, for example, bile acids, or have a structure which is dependent on the initiator,
  • R 6 (end group) is a substituent dependent on the termination reaction, for example hydroxyl, NH 2 , NHR or NR 2 , where the radicals R can correspond to the end groups R 4 and R 5 ,
  • the substituents R 1 , R 2 and R 3 can be arranged both in the ⁇ and in the ⁇ configuration.
  • the substituent can be in the 5-position in the ⁇ as well as the ⁇ configuration (nomenclature according to Römpp chemistry lexicon, 9th edition, Georg Thieme Verlag, 1992).
  • the units m and n are not block structures, but statistically distributed in the polymer.
  • Another polyethyleneimine which can preferably be used for pharmaceutical production has the following general formula:
  • R 1 means OR 4 or NR 4 R 5 ,
  • R 4 and R 5 independently of one another are hydrogen or alkyl having 1 to 24 carbon atoms, preferably alkyl having 13 to 24 carbon atoms, particularly preferably alkyl having 18 carbon atoms,
  • R 2 and R 3 (end groups) independently of one another correspond to the substituents of the nitrogen atoms of the main polymer chain or have a structure which is dependent on the initiator,
  • R 6 is a substituent dependent on the termination reaction, for example hydroxyl, NH 2 , NHR or NR 2 , the radicals R being the end groups
  • R 2 and R 3 can correspond to
  • the units m and n are not block structures, but statistically distributed in the polymer.
  • Another polyethyleneimine which can preferably be used for pharmaceutical production has the following general formula:
  • R 1 is alkyl with 1 to 24 carbon atoms, preferably alkyl with 13 to 24 carbon atoms, particularly preferably alkyl with 18 carbon atoms,
  • R 4 is a substituent which is dependent on the termination reaction, for example hydroxyl, NH 2 , NHR or NR 2 , where the radicals R can correspond to the end groups R 2 and R 3 ,
  • the units m and n are not block structures, but statistically distributed in the polymer.
  • Another polyethyleneimine which can preferably be used for pharmaceutical production has the following general formula:
  • radical R is either hydrogen or a radical of the formula
  • R x is either hydrogen or again a residue of
  • Type R can be
  • polyethyleneimines have a branched or crosslinked structure.
  • the polymer preferably has an average molecular weight below 220,000 g / mol, particularly preferably a molecular weight between 2000 and 100,000 g / mol, very particularly preferably a molecular weight between 20,000 and 100,000 g / mol.
  • hydrophobic groups are introduced in polymer-analogous reactions, for example by alkylation with haloalkanes, acylation with carboxylic acid chlorides, acylation with reactive esters, Michael addition to ⁇ , ⁇ -unsaturated carbonyl compounds (carboxylic acids, carboxamides, carboxylic acid esters) or by addition to isocyanates. These are reaction types known from the literature (March, 1992).
  • the linear polyethyleneimines are prepared, for example, by cationic ring-opening polymerization of 2-ethyloxazoline with cationic initiators, preferably according to a regulation by B.L. Rivas and S.I. Ananias (1992).
  • the poly (ethyloxazolines) thus obtained are quantitated by treatment with a mixture of concentrated hydrochloric acid and water, preferably a 1: 1
  • the reaction temperature is preferably between 80 and 100 ° C. particularly preferred at 100 ° C.
  • the reaction time is preferably between 12 and 30 hours, particularly preferably 24 hours.
  • the product is preferably purified by repeated recrystallization from ethanol.
  • the linear polyethyleneimines can be produced in the desired molecular weight range from 2000 to 220,000 g / mol.
  • the alkyl groups such as, for example, C18 alkyl groups, are introduced, for example, by reacting a 5% strength solution of the corresponding linear polyethyleneimine in absolute ethanol at a reaction temperature of 40 to 75 ° C. preferably 60 ° C, with octadecyl chloride.
  • the dosing amount of the alkyl chloride is based exactly on the desired degree of substitution (0.1 to 10%).
  • the reaction time is preferably between 10 and 24 hours, particularly preferably 17 hours.
  • acyl groups e.g. C18 acyl groups
  • reaction temperature 40 to 60 ° C, preferably 50 ° C
  • the dosing amount of the acid chloride is based exactly on the desired degree of substitution (0.1 to 10%).
  • the reaction time is preferably between 10 and 24 hours, particularly preferably 20 hours.
  • Acyl groups can also be introduced using a reactive ester method with activation of a carboxylic acid derivative with N-hydroxysuccinimide.
  • This method is preferably used in the case of polyethyleneimine functionalization with bile acids.
  • the bile acid derivative chenodeoxycholic acid (3 ⁇ , 7 ⁇ -dihydroxy-5ß-cholanic acid), hereinafter abbreviated as a substituent with CDC is reacted with N-hydroxysuccinimide in dimethoxyethane as solvent in the presence of dicyclohexylcarbodiimide.
  • the reaction takes place at room temperature, the reaction time is 16 hours.
  • the reactive ester thus produced is reacted with a 5% solution of the corresponding linear polyethyleneimine in absolute ethanol.
  • the dosing amount of the reactive ester is based exactly on the desired degree of substitution (0.1 to 10%).
  • the reaction temperature is between 20 and 60 ° C, preferably 50 ° C.
  • the reaction time is preferably between 10 and 24 hours, particularly preferably 20 hours.
  • chenodeoxycholic acid into oligoamines such as, for example, spermine or pentaethylene hexamine via the reactive ester method has been described in the literature (Walker et al., 1998).
  • the bile acid-substituted polymers according to the invention have hydrophobic substituents, the degree of hydrophobicity being able to be controlled by the number of hydroxyl groups, analogously to that described by S. Walker et al. described "cationic facial amphiphiles".
  • Highly purified samples are prepared by dissolving the polyamines and especially the hydrophobic polyethyleneimines in water at pH 7 in a concentration of 0.1 to 1 mg / ml, preferably 0.5 mg / ml, and purifying them by column chromatography on Sephadex and subsequent freeze-drying , The polymers are then again in water or preferably more physiological
  • the concentration of the polyamine or polyethyleneimine stock solutions is preferably between 0.1 and 1 mg / ml, particularly preferably 0.5 mg / ml.
  • the stock solutions are stable at room temperature, preferably at 4 ° C.
  • Standard methods such as 1H NMR spectroscopy, FT-IR spectroscopy and zeta potential measurements can be used to characterize the cationic polymers.
  • the polyamines that can be used for drug production can also be coupled to cell-specific ligands.
  • cell-specific ligands can, for example, be such that they bind to the outer membrane of a target cell, preferably an animal or human target cell.
  • the target cell can be, for example, an endothelial cell, a muscle cell, a macrophage
  • Lymphocyte a glial cell, a blood-forming cell, a tumor cell, for example a leukemia cell, a virus-infected cell, a bronchial epithelial cell or a liver cell, for example a sinusoidal cell of the liver.
  • a ligand that binds specifically to endothelial cells can, for example, be selected from the group consisting of monoclonal antibodies or their fragments which are specific for endothelial cells, glycoproteins carrying terminal mannose, glycolipids or polysaccharides, cytokines, growth factors, adhesion molecules or, in a particularly preferred one Embodiment, from glycoproteins from the envelope of viruses that have a tropism for endothelial cells.
  • a ligand that binds specifically to smooth muscle cells can, for example, be selected from the group comprising monoclonal antibodies or their fragments that are specific for Actin, cell membrane receptors and growth factors or, in a particularly preferred embodiment, glycoproteins from the envelope of viruses that have a tropism for smooth muscle cells.
  • a ligand that binds specifically to macrophages and / or lymphocytes can, for example, be selected from the group comprising monoclonal antibodies that are specific for
  • Membrane antigens on macrophages and / or lymphocytes intact immunoglobulins or Fc fragments of polyclonal or monoclonal antibodies which are specific for membrane antigens on macrophages and / or lymphocytes, cytokines, growth factors, peptides, proteins, lipids or polysaccharides carrying terminal mannose or, in one particularly preferred
  • Embodiment from glycoproteins from the envelope of viruses, in particular the HEF protein from the influenza C virus with mutation in the nucleotide position 872 or HEF cleavage products of the influenza C virus containing the catalytic triad serine-71, histidine-368 or -369 and aspartic acid 261st
  • a ligand that binds specifically to glial cells can, for example, be selected from the group comprising
  • Antibodies and antibody fragments that bind specifically to membrane structures of glial cells, adhesion molecules, peptides bearing terminal mannose, proteins, lipids or polysaccharides, growth factors or, in a particularly preferred embodiment, from glycoproteins from the envelope of viruses that have a tropism for glial cells.
  • Cells binds can be selected, for example, from the group comprising antibodies or antibody fragments which are specific for a receptor of the stem cell factors, IL-1 (in particular receptor type I or II), IL-3 (in particular receptor type ⁇ or ⁇ ), LL- 6 or GM-CSF, as well as intact immunoglobulins or Fc fragments which have this specificity and growth factors such as SCF, IL-1,
  • a ligand that binds specifically to leukemia cells can, for example, be selected from the group comprising antibodies, antibody fragments, immunoglobulins or Fc fragments that bind specifically to membrane structures on leukemia cells, such as CD13, CD14, CD15, CD33, CAMAL, sialosyl Le, CD5,
  • a ligand that binds specifically to virus-infected cells can, for example, be selected from the group comprising antibodies, antibody fragments, intact immunoglobulins or Fc fragments which are specific for a virus antigen which, after infection by the virus, is expressed on the cell membrane of the infected cell ,
  • a ligand that can bind specifically to bronchial epithelial cells, sinusoidal cells of the liver or liver cells can, for example, be selected from the group comprising transferrin, asialoglycoproteins, such as asialoorosomucoid, neoglycoprotein or galactose, insulin, peptides carrying terminal mannose, proteins, lipids or polysaccharides, intact Immunoglobulins or
  • Fc fragments that bind specifically to the target cells and, in a particularly preferred embodiment, from glycoproteins from the envelope of viruses that bind specifically to the target cells.
  • ligands are e.g. in EP-A 0 790 312 and EP-A 0 846 772.
  • the medicaments according to the invention generally contain between 0.5 and 500 mg of polyamine per dose as active substance, preferably between 20 and 100 mg per dose.
  • the medicaments according to the invention can contain further pharmaceutical active substances, such as e.g. Parapox ovis (for example in the form of BAYPAMUN®), fragments of Parapox ovis, CpG-containing oligonucleotides, antibiotics, cytostatics.
  • active substances such as e.g. Parapox ovis (for example in the form of BAYPAMUN®), fragments of Parapox ovis, CpG-containing oligonucleotides, antibiotics, cytostatics.
  • Polyamines or the medicaments according to the invention themselves are preferably in solid form after cleaning and lyophilization of the polyamines and can then be dissolved in a suitable aqueous medium, preferably physiological saline, immediately before application or applied directly in a suitable formulation with the addition of additives, if necessary after Dispersion in aqueous media, preferably in physiological saline.
  • a suitable aqueous medium preferably physiological saline
  • formulation auxiliaries include biocompatible and biodegradable polymers such as polylactide, polylactide co-glycolide, polyacrylates.
  • Polyorthoesters, polyanhydrides, polyamides, polyamino acids, cellulose derivatives, starch derivatives or chitosan derivatives come into question.
  • the drug based on polyamines is administered systemically (e.g. orally, intramuscularly, subcutaneously, intraperitoneally, intravenously) or locally (e.g. into the organ in question).
  • polyamines can be used to treat the following diseases / lesions or for prophylaxis / metaphylaxis before the following
  • HSV He ⁇ es simples virus
  • HPV human papilloma virus
  • HIN human immunodeficiency virus
  • HCMN human cytomegalovirus
  • Organ fibrosis especially liver fibrosis or cirrhosis as a result of viral hepatitis or ethanol-induced liver diseases, and cystic
  • the polyamines can also be used as adjuvants.
  • Linear polyethyleneimines were synthesized by cationic ring-opening polymerization of 2-ethyloxazoline to poly (ethyloxazoline) (analogous to Rivas & Ananias, 1992) and subsequent acidic hydrolysis by splitting off propanoic acid.
  • Certain precursor polymers are also commercially available (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Germany). The precursor polymers were characterized by gel permeation chromatography, 1H-NMR and FT-IR.
  • High-purity batches (milligram amounts) were obtained by column chromatography over Sephadex G25 (Pharmacia disposable PD-10 desalting column) of saturated aqueous solutions (pH 7) of the polyethyleneimine with Millipore water as eluent and subsequent
  • H-LPEI hydrophobically functionalized linear polyethyleneimines
  • Quantities were obtained by column chromatography on Sephadex G25 (Pharmacia disposable PD-10 desalting column) of saturated aqueous solutions (pH 7) of the polyethyleneimine with Millipore water as eluent and subsequent freeze drying.
  • the alkylated linear polyethyleneimines were characterized by 1H-NMR and FT-IR, which confirmed the desired degree of alkylation.
  • H-LPEI hydrophobically functionalized linear polyethyleneimines
  • acylated linear polyethyleneimines were characterized by 1H-NMR and FT-IR, whereby the desired degree of acylation could be confirmed.
  • linear polyethyleneimines acyl-functionalized using the reactive ester method were characterized by 1H-NMR and FT-IR, which confirmed the desired degree of acylation.
  • polyethyleneimines LPEI, H-LPEI
  • stock solutions were prepared in physiological saline at pH 7 with a concentration of 0.5 mg / ml.
  • 25 mg of the LPEI or the H-LPEI were dissolved in 30 ml of water or physiological saline solution with heating and brief ultrasound treatment, adjusted to pH 7 with 0.1 N HC1 and made up to an volume of 50 ml.
  • the stock solutions were sterile filtered (0.2 ⁇ m) and can be stored at 20 ° C for a long time.
  • the interferon- ⁇ stimulating effect of the polyamines and subsequently the proof of effectiveness in vivo was demonstrated.
  • the NMRI mice (breeding strain, female, weight 18-20 g) were obtained 8 days before the start of the experiments from Charles River (Sulzfeld, Germany). The animals had free access to food and water and were kept in an artificial day-night rhythm (lighting from 7 a.m. to 7 p.m., darkness from 7 p.m. to 7 a.m.).
  • the animals were sacrificed by cervical dislocation and then the spleens were removed.
  • the spleens were freed from attached connective tissue and processed according to the following rule:
  • the spleen is placed on a metal sieve (mesh size approx. 70 ⁇ m) (petri dish) and crushed with scissors. Then 5 ml of PBS are added and the tissue pieces are pressed through the sieve with a glass pestle. The sieve is rinsed several times with PBS, the cells are transferred to a Falcon tube in a total of 50 ml PBS and then centrifuged for 10 minutes at 300 x g.
  • a metal sieve mesh size approx. 70 ⁇ m
  • petri dish petri dish
  • the stimulations were carried out in a volume of 1 ml in 24-well plates at 37 ° C. and 5% CO 2 for 72 hours. In a total volume of 1 ml (0.8 ml medium: RPMI, 10% FCS, 1% penicillin / streptomycin), 2 x 10 6 spleen cells were stimulated. Depending on the number of stimulants, the following was combined per approach:
  • the supernatants were transferred to 1.5 ml reaction vessels, and the remaining cells were separated by centrifugation at 300 ⁇ g for 10 minutes. The cell-free supernatants were removed and stored at -20 ° C. until the measurement of IFN- ⁇ by ELISA.
  • the determination of the iFN- ⁇ concentrations in the stimulation supernatants was carried out using the "Mouse IFN- ⁇ OptEIA®-ELISA Set” (Pharmingen, Heidelberg, Germany) according to the manufacturer's instructions.
  • the tested polyethyleneimines show a significant IFN- ⁇ induction in the mouse
  • NMRI mice (outbred strain HdsWimNMRI, female, weight 18-20 g, obtained from Harlan / Winkelmann, Borchen, Germany) were placed in autoclavable polycarbonate boxes lined with sawdust, in the S2 isolation stall at 20-22 ° C (humidity 50-60% ) and held in an artificial day / night rhythm (lighting from 6:30 a.m. to 6:30 p.m., darkness from 3:1 p.m. to 3:1 a.m.). They had free access to food and water.
  • HdsWimNMRI female, weight 18-20 g, obtained from Harlan / Winkelmann, Borchen, Germany
  • the animals were randomized and divided into two groups of 6 animals each.
  • mice were initially kept in the animal stable for 3 days without further treatment.
  • the substances to be analyzed were administered intraperitoneally in a volume of 0.2 ml.
  • the following treatment regimen was used:
  • Group 2 polyethyleneimine, H-LPEI, M w : 87000, C18 acyl, 3 mol%, according to Example 3 (0.1 mg per mouse).
  • mice were sacrificed 9 hours after the treatment and the peritoneal cells obtained by abdominal irrigation with 5 ml of ice-cold PBS.
  • the cells were concentrated using a centrifugation step (30 seconds at 16,000 ⁇ g, room temperature), the supernatant decanted and the cellular Total RNA extracted using the NucleoSpin RNA II kit (Machery-Nagel, Düren, Germany).
  • the cell pellet was resuspended in 400 ⁇ l RA1 buffer (from the NucleoSpin RNA II kit) and frozen at -80 ° C. After thawing to 37 ° C the
  • DNase I Cleavage of the DNA by DNase I.
  • 90 ⁇ l DNase reaction buffer was mixed with 10 ⁇ l DNase I (both from the NucleoSpin RNA II Kit) and 95 ⁇ l of this solution were applied to the dry filter. After incubation for 15 minutes (room temperature), the filter was washed first with 500 ⁇ l RA2, then with 600 ⁇ l RA3 and then with 250 ⁇ l RA3 (from the NucleoSpin RNA II Kit).
  • the washing buffer was applied and the column was centrifuged for 30 seconds at 8,000 x g and after the last washing step for 2 minutes at 16,000 x g.
  • the RNA was then eluted in 60 ⁇ l RNase-free, distilled water (16,000 ⁇ g for 1 minute).
  • the quality of the RNA was checked by photometric measurement.
  • the cDNA was synthesized by reverse transcription of the RNA using "random hexamers" as primers for the polymerase reaction.
  • the TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems,
  • the mixture was incubated in the GeneAmp 2400 thermal cycler (Applied Biosystems, Rothstadt, Germany) first for 10 minutes at 25 ° C., then for 30 minutes at 48 ° C. and then cooled to + 4 ° C.
  • the cDNA synthesized in this way was stored at -20 ° C.
  • the amounts of the cDNAs were determined using a “housekeeping” gene (18S RNA), using the PDAR kit "Endogenous Control Ribosomal RNA Control
  • a calibrator cDNA was used for standardization and induction calculation. This consisted of a mixture of cDNA 11 from different mice, which were treated in accordance with group 1.
  • the amplifications were each carried out in a volume of 50 ⁇ l and were composed as follows: Endogenous 18S RNA control:
  • the Aujeszky mouse model is an in vivo exercise model for the detection of the effects of various immune stimulators (e.g. BAYPAMUN®, CpG oligonucleotides).
  • various immune stimulators e.g. BAYPAMUN®, CpG oligonucleotides.
  • mice (outbred strain HdsWimNMRI, female, weight 18-20 g, obtained from Harlan / Winkelmann, Borchen, Germany) were placed in autoclavable polycarbonate boxes lined with sawdust, in an S2 isolation stall at 20-22 ° C (humidity 50-60 %) and kept in an artificial day / night rhythm (lighting from 06:30 to 18:30, darkness from 18:30 to 06:30). They had free access to food and water.
  • HdsWimNMRI female, weight 18-20 g, obtained from Harlan / Winkelmann, Borchen, Germany
  • mice Maleted mice were formed for the investigations. The animals in a group received the same test substance.
  • mice were kept in the animal stall for 2-3 days after delivery.
  • the polyethyleneimines starting concentration 0.5 mg / ml
  • the polyethyleneimines were then diluted 1:10 and 1: 100 with physiological NaCl solution (pH 7.6). 0.2 ml of these solutions was administered intraperitoneally per mouse.
  • mice 24 hours after the treatment, the mice were challenged by intraperitoneal application of pseudorabies virus, strain Hannover H2.
  • the virus was diluted in PBS to a loading titer of 10 ⁇ -10 4 ' 1 TC ⁇ D 50 / ml and 0.2 ml of this suspension was applied.
  • a negative control a group of mice was treated with physiological NaCl solution and then exposed.
  • mice in this group died 3-8 days after exercise.
  • the mice treated with polyethylene imines survived to a large extent the pseudorabies virus
  • the strength of the induced immune stimulation resulted from the comparison of the dead mice in the NaCl control group and the test groups and was quantified by the action index. This gives the percentage number of
  • b indicates the percentage of dead mice in the control group
  • a indicates the percentage of dead mice in the test group.
  • the NMRI mice (breeding strain, female, weight 18-20 g) were obtained 8 days before the start of the experiments from Charles River (Sulzfeld, Germany). The animals had free access to food and water and were kept in an artificial day-night rhythm (lighting from 7 a.m. to 7 p.m., darkness from 7 p.m. to 7 a.m.).
  • the animals were randomized and divided into three groups of 4 animals each.
  • the substances to be analyzed were administered intraperitoneally in a volume of 0.2 ml.
  • the following treatment regimen was used:
  • Group 1 Placebo: Physiological NaCl solution.
  • Group 2 polyethyleneimine, H-LPEI, M: 87000, C18 acyl, 3 mol% (0.1 mg per
  • mice were sacrificed 6 hours after the treatment and the peritoneal cells were obtained by abdominal irrigation with 10 ml of medium (DMEM, 5% FCS).
  • medium DMEM, 5% FCS
  • the cells were then concentrated by centrifugation (10 minutes at 300 x g, room temperature) and then either used immediately in the RNA extraction or first subjected to erythrocyte lysis.
  • the pelleted peritoneal cells were resuspended in 1 ml PBS, with 10 ml lysis buffer (10 ml 0.17 M Tris, pH 7.2 + 90 ml 0.16 M
  • Total RNA was prepared from the peritoneal cells using the RNeasy Mini-Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) according to the manufacturer's instructions. Two approaches for a reprocessing were mixed.
  • the yields of total RNA from the peritoneal cells of four animals were between 10 and 20 ⁇ g RNA.
  • RNA is amplified from the total RNA preparation.
  • the cDNA of immunologically relevant genes (interleukins, differentiation clusters (CDs), transcription factors, receptors etc.) was applied to a chip.
  • the amplified RNA was used for the hybridization.
  • 2 ⁇ g of the amplified RNA were transcribed into cDNA and the fluorescence-labeled nucleotides were incorporated.
  • the controls were labeled with Cy3 and the samples with Cy5.
  • IL-lr II type II interleukin 1 receptor
  • monocytes a comparison to interleukin 1 beta (TL-1 beta) and interleukin 1 receptor antagonist (IL-lra).
  • TL-1 beta interleukin 1 beta
  • IL-lra interleukin 1 receptor antagonist
  • T cell-mediated viral clearance is dependent upon interferon-gamma (IFN-gamma). Virology, 202, 76-88.
  • hnmunostimulatory oligodeoxynucleotides promote protective immunity and provide systemic therapy for leishrnaniasis via IL- 12- and IFN-gamma-dependent mechanisms.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Arzneimittel enthaltend ein Polyamin als Wirksubstanz, sowie die Verwendung eines Polyamins zur Herstellung von immunstimulierenden Arzneimitteln bzw. von Arzneimitteln für die Behandlung und/oder Prophylaxe verschiedener Krankheiten bei Mensch und Tier.

Description

Arzneimittel enthaltend ein Polyamin als Wirksubstanz
Die vorliegende Erfindung betrifft Arzneimittel enthaltend ein Polyamin als Wirksubstanz, sowie die Nerwendung eines Polyamins zur Herstellung von immunstimulierenden Arzneimitteln bzw. von Arzneimitteln für die Behandlung und/oder Prophylaxe verschiedener Krankheiten bei Mensch und Tier.
In der tiermedizinischen Praxis wird seit längerer Zeit ein Produkt zur Induktion "paraspezifischer Immunität" - ein sogenannter Immunstimulator oder Paramunitäts- inducer - therapeutisch, meta- und prophylaktisch eingesetzt. Immunstimulatoren bestehen z. B. aus chemisch inaktiviertem Parapoxvirus ovis, Stamm D 1701 (DE-A 35 04 940). Ein auf der Basis dieses Virus hergestelltes Produkt ist BAYPAMUΝ®.
Das inaktivierte Parapoxvirus induziert im Tier einen unspezifischen Schutz gegenüber Infektionen mit den verschiedensten Erregern. Man nimmt an, dass dieser
Schutz über verschiedene Mechanismen des Organismus-eigenen Abwehrsystems vermittelt wird.
Zu diesen Mechanismen zählen die Induktion von Interferon, die Aktivierung der natürlichen Killerzellen, die Induktion der "Kolonien-stimulierenden Aktivität"
(CAS), sowie die Stimulierung der Lymphozytenproliferation. Frühere Untersuchungen zum Wirkmechanismus zeigten die Stimulation von Interleukin 2 und Interferon-α (Steinmassl & Wolf, 1990).
Darüber hinaus können Immunstimulatoren, wie beispielsweise unmethylierte, CpG- beinhaltende Oligonukleotide (WO 98/18810) zur Aktivierung des nicht-adaptiven Immunsystems und zur Stärkung des Organismus gegen das Auftreten von Krankheitserregern eingesetzt werden. In verschiedenen Mausmodellen konnte bereits experimentell gezeigt werden, dass durch einmalige Gabe die initiale Immunantwort aktiviert und eine Infektion mit verschiedenen Pathogenen verhindert werden kann, so z. B. die Infektion mit Listeria monocytogenes (Elkins et al., 1999; Krieg et al., 1998; Oxenius et al., 1999), Francisella tularensis (Elkins et al., 1999), Leishmania (Walker et al., 1999; Zimmermann et al., 1998), Anthrax, Ebola und Malaria (Krieg, 2000; Klinman et al., 1999).
In der Analyse des Wirkungsmechanismus konnte demonstriert werden, dass sowohl murine B-Zellen, Makrophagen, Dendritische Zellen und NK-Zellen durch die CpG- enthaltenden Oligonukleotide stimuliert werden. Ferner wurde die Induktion der Zytokine IL-18, IL-12 und Interferon-γ demonstriert (Krieg, 2000).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Arzneimittel bereitzustellen, die neue
Immunstimulatoren enthalten, welche eine ähnliche Wirksamkeit wie Parapox ovis aufweisen, jedoch chemisch synthetisierbar und daher billiger zu produzieren und leichter mit Chemotherapeutika zu kombinieren sind.
Die Aufgabe wurde gelöst durch die Bereitstellung von Arzneimitteln, die ein
Polyamin als Wirksubstanz enthalten.
Die als Wirksubstanz klassifizierten Polyamine enthalten mindestens 10 Monomereinheiten bzw. mindestens 10 Stickstoffatome, bevorzugt mindestens 45 Mono- mereinheiten bzw. mindestens 45 Stickstoffatome.
Das Polyamin kann eine lineare oder verzweigte Struktur aufweisen.
Bevorzugt ist das Polyamin in Wasser löslich oder dispergierbar; in wässrigen Medien erfolgt eine vom pH-Wert abhängige partielle Protonierung. Der
Protonierungsgrad lässt sich durch physikalisch-chemische Messmethoden wie beispielsweise Zetapotentialmessungen bestimmen.
Weiterhin bevorzugt weist das Polyamin hydrophobe Substituenten auf. Die hydrophoben Substituenten können als Seitenketten oder endständig an dem Polymer angeordnet sein. Der Substitutionsgrad (prozentualer Anteil funktionali- sierter N- Atome in der Polymerhauptkette) beträgt vorzugsweise zwischen 0,01 und 10 Prozent.
Als hydrophobe Substituenten kommen insbesondere Alkylketten, Acylketten oder Steroid-artige Substituenten in Frage. Besonders geeignet als hydrophobe Substituenten sind Acylketten. Des Weiteren kommen hydrophobe Substituenten in Frage, die durch Addition der Stickstofffunktionen der Polymerhauptkette an Isocyanate oder an α,ß -ungesättigte Carbonylverbindungen eingeführt werden können.
Besonders bevorzugt stellt das Polyamin ein Polyethylenimin dar.
Ein vorzugsweise für die Arzneimittelherstellung verwendbares Polyethylenimin weist die folgende allgemeine Formel auf:
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N] -Einheit
R Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet und
R2 Alkyl mit 1 bis 23 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Alkyl mit 12 bis 23 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt Alkyl mit 17 Kohlenstoffatomen, bedeutet,
und worin
R3 und R4 (Endgruppen) unabhängig voneinander Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Alkyl mit 13 bis 24 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt Alkyl mit 18 Kohlenstoffatomen, bedeuten, oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei R5 (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist, beispielsweise Hydroxyl, NH2, NHR oder NR , wobei die Reste R den Endgruppen
R3 und R4 entsprechen können,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250, bevorzugt im Bereich 250 bis 2250, besonders bevorzugt im Bereich 500 bis 2050, liegt und n = a x P mit 0,000 l<a<0,l, vorzugsweise 0,01<a<0,05 und besonders bevorzugt a=0,03.
Dabei sind die Einheiten m und n keine Blockstrukturen, sondern statistisch im Polymer verteilt.
Ein weiteres vorzugsweise für die Arzneimittelherstellung verwendbares Polyethylenimin weist die folgende allgemeine Formel auf:
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N]-Einheit
R1 Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet und
R >2 Alkyl mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Alkyl mit 11 bis 22 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt Alkyl mit 16 Kohlenstoffatomen, bedeutet, und worin
R3 und R4 (Endgruppen) unabhängig voneinander Wasserstoff oder Acyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Acyl mit 13 bis 24 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt Acyl mit 18 Kohlenstoffatomen, bedeuten, oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei R5 (Endgruppe) ein von- der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist, beispielsweise Hydroxyl, NH2, NHR oder NR2, wobei die Reste R den Endgruppen R3 und R4 entsprechen können,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250, bevorzugt im Bereich 250 bis 2250, besonders bevorzugt im Bereich 500 bis 2050, liegt und n = a x P mit 0,0001<a<0,l, vorzugsweise 0,01<a<0,05 und besonders bevorzugt a=0,03.
Dabei sind die Einheiten m und n keine Blockstrukturen, sondern statistisch im Polymer verteilt.
Ein weiteres vorzugsweise für die Arzneimittelherstellung verwendbares
Polyethylenimin weist die folgende allgemeine Formel auf:
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N]-Einheit
R , R und R Wasserstoff oder Hydroxy bedeuten,
und worin
R4 und R5 (Endgruppen) unabhängig voneinander Wasserstoff oder Steroid- Grundkörper wie beispielsweise Gallensäuren bedeuten, oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei R6 (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist, beispielsweise Hydroxyl, NH2, NHR oder NR2, wobei die Reste R den Endgruppen R4 und R5 entsprechen können,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250, bevorzugt im Bereich 250 bis 2250, besonders bevorzugt im Bereich 500 bis 2050, liegt und n = a P mit 0,000 l<a<0,l, vorzugsweise 0,01<a<0,05 und besonders bevorzugt a=0,03.
Dabei sind im Hinblick auf das Steroid-Grundgerüst alle Stereoisomeren mit um- fasst. Insbesondere können die Substituenten R1, R2 und R3 sowohl in der α- als auch in der ß-Konfiguration angeordnet sein. Ebenso kann der Substituent in der 5- Position in der α- als auch der ß-Konfiguration vorliegen (Nomenklutur gemäß Römpp-Chemielexikon, 9. Auflage, Georg Thieme Verlag, 1992).
Dabei sind die Einheiten m und n keine Blockstrukturen, sondern statistisch im Polymer verteilt.
Ein weiteres vorzugsweise für die Arzneimittelherstellung verwendbares Poly- ethylenimin weist die folgende allgemeine Formel auf:
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N] -Einheit
R1 OR4 oder NR4R5 bedeutet,
wobei
R4 und R5 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 24 Kohlen- stoffatomen, bevorzugt Alkyl mit 13 bis 24 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt Alkyl mit 18 Kohlenstoffatomen, bedeuten,
und worin
R2 und R3 (Endgruppen) unabhängig voneinander den Substituenten der Stickstoffatome der Polymerhauptkette entsprechen oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei R6 (Endgruppe) ein von der Abbruchreaktion abhängiger Substituent ist, beispielsweise Hydroxyl, NH2, NHR oder NR2, wobei die Reste R den Endgruppen
R2 und R3 entsprechen können,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250, bevorzugt im Bereich 250 bis 2250, besonders bevorzugt im Bereich 500 bis 2050, liegt und n = a P mit 0,0001<a<0,l, vorzugsweise 0,01<a<0,05 und besonders bevorzugt a=0,03. Dabei sind die Einheiten m und n keine Blockstrukturen, sondern statistisch im Polymer verteilt.
Ein weiteres vorzugsweise für die Arzneimittelherstellung verwendbares Poly- ethylenimin weist die folgende allgemeine Formel auf:
worin in jeder einzelnen [CH -CH2-N]-Einheit
R1 Alkyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Alkyl mit 13 bis 24 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt Alkyl mit 18 Kohlenstoffatomen, bedeutet,
und worin R >2 u „n_dJ R r 3 (Endgruppen) unabhängig voneinander den Substituenten der Stickstoffatome der Polymerhauptkette entsprechen oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei R4 (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist, bei- spielsweise Hydroxyl, NH2, NHR oder NR2, wobei die Reste R den Endgruppen R2 und R3 entsprechen können,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250, bevorzugt im Bereich 250 bis 2250, besonders bevorzugt im Bereich 500 bis 2050, liegt und n = a x P mit 0,0001<a<0,l, vorzugsweise 0,01<a<0,05 und besonders bevorzugt a=0,03. Dabei sind die Einheiten m und n keine Blockstrukturen, sondern statistisch im Polymer verteilt.
Ein weiteres vorzugsweise für die Arzneimittelherstellung verwendbares Polyethylenimin weist die folgende allgemeine Formel auf:
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N]-Einheit der Rest R entweder Wasserstoff oder ein Rest der Formel
sein kann und worin Rx entweder Wasserstoff oder ebenfalls wieder ein Rest des
Typs R sein kann,
und worin jede einzelne [CH2-CH2-N] -Einheit und die Endgruppen die vorstehend genannten Substituenten tragen können,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250, bevorzugt im Bereich 250 bis 2250, besonders bevorzugt im Bereich 500 bis 2050, liegt und n = a x P mit 0,0001<a<0,l, vorzugsweise 0,01<a<0,05 und besonders bevorzugt a=0,03. Diese Polyethylenimine weisen eine verzweigte bzw. vernetzte Struktur auf.
Vorzugsweise weist das Polymer ein mittleres Molekulargewicht unter 220000 g/mol, besonders bevorzugt ein Molekulargewicht zwischen 2000 und 100000 g/mol, ganz besonders bevorzugt ein Molekulargewicht zwischen 20000 und 100000 g/mol, auf.
Die hydrophoben Gruppen werden in polymeranalogen Reaktionen eingeführt, beispielsweise durch Alkylierung mit Halogenalkanen, Acylierung mit Carbonsäurechloriden, Acylierung mit Reaktivestern, Michael-Addition an α,ß-ungesättigte Carbonylverbindungen (Carbonsäuren, Carbonsäureamide, Carbonsäureester) oder durch Addition an Isocyanate. Es handelt sich hierbei um literaturbekannte Reaktionstypen (March, 1992).
Die Herstellung der linearen Polyethylenimine erfolgt beispielsweise durch kationische Ringöffhungspolymerisation von 2-Ethyloxazolin mit kationischen Initiatoren, vorzugsweise nach einer Vorschrift von B.L. Rivas und S.I. Ananias (1992). Die so erhaltenen Poly(ethyloxazoline) werden quantitativ durch Behandlung mit einer Mischung aus konzentrierter Salzsäure und Wasser, vorzugsweise einer 1:1
Mischung aus konzentrierter Salzsäure und Wasser, unter Abspaltung von Propansäure in die linearen Polyethylenimine überführt. Die Reaktionstemperatur liegt vorzugsweise zwischen 80 und 100°C. besonders bevorzugt bei 100°C. Die Reaktionszeit liegt vorzugsweise zwischen 12 und 30 Stunden, besonders bevorzugt bei 24 Stunden. Die Reinigung des Produkts erfolgt vorzugsweise durch mehrfache Um- kristallisation aus Ethanol.
Mit dem beschriebenen Verfahren lassen sich die linearen Polyethylenimine im gewünschten Molekulargewichtsbereich von 2000 bis 220000 g/mol herstellen.
Die Einführung der Alkylgruppen, wie z.B. C18-Alkylgruppen, erfolgt beispielsweise durch Reaktion einer 5 %-igen Lösung des entsprechenden linearen Poly- ethylenimins in absolutem Ethanol bei einer Reaktionstemperatur von 40 bis 75°C. vorzugsweise 60°C, mit Octadecylchlorid. Die Dosiermenge des Alkylchlorids orientiert sich exakt an dem gewünschten Substitutionsgrad (0,1 bis 10 %). Die Reaktionszeit beträgt vorzugsweise zwischen 10 und 24 Stunden, besonders bevorzugt 17 Stunden.
Die Einführung von Acylgruppen, wie z.B. C18-Acylgruppen, erfolgt beispielsweise durch Reaktion einer 5 %-igen Lösung des entsprechenden linearen Polyethylenimins in absolutem Ethanol bei einer Reaktionstemperatur von 40 bis 60°C, vorzugsweise 50°C, mit Octadecansäurechlorid. Die Dosiermenge des Säurechlorids orientiert sich exakt an dem gewünschten Substitutionsgrad (0,1 bis 10 %). Die Reaktionszeit beträgt vorzugsweise zwischen 10 und 24 Stunden, besonders bevorzugt 20 Stunden.
Die Einführung von Acylgruppen kann auch über eine Reaktivestermethode unter Aktivierung eines Carbonsäurederivates mit N-Hydroxysuccinimid erfolgen. Dieses Verfahren wird vorzugsweise im Fall der Polyethylenimin-Funktionalisierung mit Gallensäuren angewendet. Dazu wird beispielsweise das Gallensäure-Derivat Cheno- desoxycholsäure (3α,7α-Dihydroxy-5ß-cholansäure), im folgenden als Substituent mit CDC abgekürzt, mit N-Hydroxysuccinimid in Dimethoxyethan als Lösungsmittel in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid umgesetzt. Die Reaktion erfolgt bei Raumtemperatur, die Reaktionszeit beträgt 16 Stunden. Der so hergestellte Reaktivester wird mit einer 5 %-igen Lösung des entsprechenden linearen Polyethylenimins in absolutem Ethanol umgesetzt. Die Dosiermenge des Reaktivesters orientiert sich exakt an dem gewünschten Substitutionsgrad (0,1 bis 10 %). Die Reaktionstemperatur liegt zwischen 20 und 60°C, vorzugsweise bei 50°C. Die Reaktionszeit beträgt vorzugsweise zwischen 10 und 24 Stunden, besonders bevorzugt 20 Stunden.
Die Einführung von beispielsweise Chenodesoxycholsäure in Oligoamine wie beispielsweise Spermin oder Pentaethylenhexamin über die Reaktivestermethode ist in der Literatur beschrieben (Walker et al., 1998). Die erfindungsgemäßen Gallensäure- substituierten Polymere weisen hydrophobe Substituenten auf, wobei sich der Grad der Hydrophobizität durch die Anzahl der Hydroxygruppen steuern lässt, analog wie in den von S. Walker et al. beschriebenen "cationic facial amphiphiles". Hochgereinigte Proben werden hergestellt, indem die Polyamine und insbesondere die hydrophoben Polyethylenimine in Wasser bei pH 7 in einer Konzentration von 0,1 bis 1 mg/ml, vorzugsweise 0,5 mg/ml, gelöst und durch Säulenchromatographie über Sephadex und anschließende Gefriertrocknung gereinigt werden. Anschließend werden die Polymere erneut in Wasser oder vorzugsweise physiologischer
Kochsalzlösung unter kurzer Ultraschallbehandlung gelöst und auf pH 7 eingestellt. Die Konzentration der Polyamin- bzw. Polyethylenimin-Stammlösungen liegt vorzugsweise zwischen 0,1 und 1 mg/ml, besonders bevorzugt bei 0,5 mg/ml. Die Stammlösungen sind bei Raumtemperatur lagerstabil, die Lagerung erfolgt vorzugs- weise bei 4°C.
Zur Charakterisierung der kationischen Polymere können Standardmethoden wie 1H- NMR-Spektroskopie, FT-IR-Spektroskopie und Zetapotentialmessungen angewendet werden.
Die für die Arzneimittelherstellung verwendbaren Polyamine können auch an zellspezifische Liganden gekoppelt sein. Solche zellspezifischen Liganden können beispielsweise derart beschaffen sein, dass sie an die äußere Membran einer Zielzelle, vorzugsweise einer tierischen bzw. menschlichen Zielzelle binden. Die Ziel- zelle kann beispielsweise eine Endothelzelle, eine Muskelzelle, ein Makrophage, ein
Lymphozyt, eine Gliazelle, eine blutbildende Zelle, eine Tumorzelle, z.B. eine Leukämiezelle, eine virusinfizierte Zelle, eine Bronchialepithelzelle oder eine Leberzelle, z.B. eine sinusoidale Zelle der Leber sein. Ein Ligand, der spezifisch an Endothelzellen bindet, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus monoklonalen Antikörpern oder deren Fragmenten, die spezifisch sind für Endothelzellen, endständig Mannose tragende Glykoproteine, Glykolipide oder Polysaccharide, Zytokine, Wachstumsfaktoren, Adhäsionsmoleküle oder, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform, aus Glykoproteinen aus der Hülle von Viren, die einen Tropismus für Endothelzellen haben. Ein Ligand, der spezifisch an glatte Muskelzellen bindet, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend monoklonale Antikörper oder deren Fragmente, die spezifisch sind für Aktin, Zellmembranrezeptoren sowie Wachstumsfaktoren oder, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform, aus Glykoproteinen aus der Hülle von Viren, die einen Tropismus für glatte Muskelzellen haben. Ein Ligand, der spezifisch an Makrophagen und/oder Lymphozyten bindet, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend monoklonale Antiköφer, die spezifisch sind für
Membranantigene auf Makrophagen und/oder Lymphozyten, intakte Immunglobuline oder Fc-Fragmente von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die spezifisch sind für Membranantigene auf Makrophagen und/oder Lymphozyten, Zytokine, Wachstumsfaktoren, endständig Mannose tragende Peptide, Proteine, Lipide oder Polysaccharide oder, in einer besonders bevorzugten
Ausführungsform, aus Glykoproteinen aus der Hülle von Viren, insbesondere das HEF-Protein vom Influenza C- Virus mit Mutation in der Nukleotidposition 872 oder HEF-Spaltprodukte des Influenza C-Virus enthaltend die katalytische Triade Serin- 71, Histidin-368 oder -369 und Asparaginsäure-261. Ein Ligand, der spezifisch an Gliazellen bindet, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend
Antikörper und Antiköφerfragmente, die spezifisch an Membranstrukturen von Gliazellen binden, Adhäsionsmoleküle, endständig Mannose tragende Peptide, Proteine, Lipide oder Polysaccharide, Wachstumsfaktoren oder, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform, aus Glykoproteinen aus der Hülle von Viren, die einen Tropismus für Gliazellen haben. Ein Ligand, der spezifisch an blutbildende
Zellen bindet, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend Antiköφer oder Antiköφerfragmente, die spezifisch sind für einen Rezeptor des stem cell factors, IL-1 (insbesondere Rezeptortyp I oder II), IL-3 (insbesondere Rezeptortyp α oder ß), LL-6 oder GM-CSF, sowie intakte Immunglobuline oder Fc- Fragmente, die diese Spezifität aufweisen und Wachstumsfaktoren wie SCF, IL-1,
IL-3, IL-6 oder GM-CSF sowie deren Fragmente, die an die zugehörigen Rezeptoren binden. Ein Ligand, der spezifisch an Leukämiezellen bindet, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend Antiköφer, Antiköφerfragmente, Immunglobuline oder Fc-Fragmente, die spezifisch an Membranstrukturen auf Leuk- ämiezellen binden, wie CD13, CD14, CD15, CD33, CAMAL, Sialosyl-Le, CD5,
CDle, CD23, M38, IL-2-Rezeptoren, T-Zell-Rezeptoren, CALLA oder CD 19, sowie Wachstumsfaktoren oder davon abstammende Fragmente oder Retinoide. Ein Ligand, der spezifisch an virusinfizierte Zellen bindet, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend Antiköφer, Antiköφerfragmente, intakte Immunglobuline oder Fc-Fragmente, die spezifisch sind für ein Virusantigen, das nach Infektion durch das Virus auf der Zellmembran der infizierten Zelle exprimiert wird. Ein Ligand, der spezifisch an Bronchialepithelzellen, sinusoidale Zellen der Leber oder Leberzellen binden kann, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend Transferrin, Asialoglykoproteine, wie Asialoorosomucoid, Neoglykoprotein oder Galaktose, Insulin, endständig Mannose tragende Peptide, Proteine, Lipide oder Polysaccharide, intakte Immunglobuline oder
Fc-Fragmente, die spezifisch an die Zielzellen binden und, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform, aus Glykoproteinen aus der Hülle von Viren, die spezifisch an die Zielzellen binden. Weitere detaillierte Beispiele für Liganden sind z.B. in EP-A 0 790 312 und EP-A 0 846 772 offenbart.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel enthalten im allgemeinen zwischen 0,5 und 500 mg Polyamin pro Dosis als Wirksubstanz, vorzugsweise zwischen 20 und 100 mg pro Dosis.
Die erfindungsgemaßen Arzneimittel können neben dem Polyamin als Wirksubstanz weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten, wie z.B. Parapox ovis (beispielsweise in der Form von BAYPAMUN®), Fragmente von Parapox ovis, CpG-enthaltende Oligonukleotide, Antibiotika, Cytostatika.
Die für die Herstellung der erfindungsgemäßen Arzneimittel verwendbaren
Polyamine bzw. die erfindungsgemäßen Arzneimittel selbst liegen vorzugsweise nach Reinigung und Lyophilisierung der Polyamine in fester Form vor und können dann unmittelbar vor der Applikation in einem geeigneten wässrigen Medium, vorzugsweise physiologische Kochsalzlösung, gelöst oder direkt in einer geeigneten Formulierung unter Zusatz von Additiven appliziert werden, gegebenenfalls nach Dispergierung in wässrigen Medien, vorzugsweise in physiologischer Kochsalzlösung.
Als weitere Formulierungshilfsstoffe kommen biokompatible und bioabbaubare Polymere wie beispielsweise Polylactid, Polylactidcoglykolid, Poiyacrylate.
Polyorthoester, Polyanhydride, Polyamide, Polyaminosäuren, Cellulose-Derivate, Stärke-Derivate oder Chitosan-Derivate in Frage.
Je nach klinischer Fragestellung wird das Arzneimittel auf der Basis von Polyaminen systemisch (z. B. oral, intramuskulär, subkutan, intraperitoneal, intravenös) oder lokal (z.B. in das betreffende Organ) appliziert.
Mehrere Applikationen oder Langzeitbehandlung nach Zeitschemen, die den Erfordernissen der klinischen Fragestellung entsprechen, können dabei notwendig sein.
Insbesondere aufgrund ihrer immunstimulierenden, anti-inflammatorischen und anti- apoptotischen Wirkung (Zytokininduktion, Überexpression anti-inflammatorischer und anti-apoptotischer Faktoren) können Polyamine zur Behandlung der folgenden Krankheiten/Läsionen bzw. zur Prophylaxe/Metaphylaxe vor den folgenden
Krankheiten verwendet werden:
• Virale Infektionen
Unter Zugrundelegung der bekannten Zusammenhänge des Einflusses einer Thl-
Immunantwort auf latente, chronische, persistente Virusinfektionen (Lucin et al., 1994; Smith et al, 1994) und einer dem Immunstimulator Parapox ovis vergleichbaren Wirkung der Polyamine ist der Einsatz von Polyaminen als Monotherapie oder in Kombination mit biologisch aktiven, z. B. antiviralen, niedermolekularen Verbindungen an Mensch und Tier möglich und von therapeutischem Nutzen zur antiviralen Therapie von Infektionen mit dem Hepatitis- B-Nirus, dem Hepatitis-C-Nirus oder allen anderen Erregern aus der Gruppe der Hepatitis-verursachenden Viren sowie anderen viralen Infektionen der inneren Organe, sowie Infektionen, auch in Begleitung anderer Erkrankungen, mit den verschiedenen Typen des Heφes simples-Virus (HSV), den verschiedenen Typen von humanem Papillomviras (HPV), dem humanen Immundefizienzvirus (HIN), dem humanen Cytomegalievirus (HCMN), sowie den entsprechenden Virus- erkrankungen des Tieres.
• Akute oder chronische virale Infektionen des Respirationstraktes und der inneren Organe
• Infektionen durch Stress oder nach einer Operation oder zahnärztlichen Behandlung
• Bakterielle Infektionen, insbesondere Infektionen durch intrazelluläre Bakterien
• Krebs, Tumore
• Organfibrosen, insbesondere Leberfibrose bzw. Leberzirrhose im Gefolge von Virushepatitis oder Ethanol-induzierten Lebererkrankungen sowie zystische
Fibröse
• Erkrankungen, die mit erhöhter Kollagenablagerung einhergehen, wobei sowohl die inneren Organ, wie z.B. die Leber, als auch die Haut und ihre Anhangsgebilde betroffen sein können
• Entzündliche, degenerative und proliferative Erkrankungen der inneren Organe, der Haut, des Blutes, des Zentralnervensystems und seiner Anhangsgebilde einschließlich des Auges • Allergischer Formenkreis, insbesondere zur Verhinderung des Ausbruchs systemischer Allergien bzw. zur Verwendung bei topischen Allergien oder Asthma
Die Polyamine können auch als Adjuvantien verwendet werden.
Beispiele
Beispiel 1
Synthese der linearen Polyethylenimine (LPEI):
Lineare Polyethylenimine wurden durch kationische ringöffnende Polymerisation von 2-Ethyloxazolin zu Poly(ethyloxazolin) (analog Rivas & Ananias, 1992) und anschließender saurer Hydrolyse durch Abspaltung von Propansäure synthetisiert.
Bestimmte Vorläufer-Polymere (Poly(ethyloxazoline)) sind auch kommerziell erhältlich (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deutschland). Die Vorläufer-Polymere wurden durch Gelpermeationschromatographie, 1H-NMR und FT-IR charakterisiert.
Eine quantitative Hydrolyse gelang durch Umsetzung von beispielsweise 24,7 g
Poly(ethyloxazolin) (Mw 200000 g/mol) in einer Mischung aus 40 ml Wasser und 40 ml konzentrierter Salzsäure bei 100°C. Nach 24 Stunden wurde der gebildete voluminöse Niederschlag durch Zusatz von 250 ml Wasser gelöst. Nach Abkühlen auf 20°C wurde das Produkt unter Zusatz von 20 %-iger NaOH auf pH 11 eingestellt und gefällt. Nach Absaugen und Waschen des Niederschlags (Waschwasser pH 7) wurde im Hochvakuum über Phosphoφentoxid getrocknet. Das Rohprodukt wurde anschließend aus Ethanol umkristallisiert (Ausbeute 9,5 g/88 %). Hochreine Chargen (Milligramm-Mengen) wurden durch Säulenchromatographie über Sephadex G25 (Pharmacia disposable PD-10 desalting column) von gesättigten wässrigen Lösungen (pH 7) des Polyethylenimins mit Millipore- Wasser als Eluent und anschließender
Gefriertrocknung erhalten. Die linearen Polyethylenimine wurden durch 1H-NMR und FT-IR charakterisiert, wodurch die quantitative Hydrolyse bestätigt werden konnte.
Beispiel 2
Synthese der hydrophob funktionalisierten linearen Polyethylenimine (H-LPEI) am Beispiel der Einführung von 3 mol-% C18-Alkylgruppen in LPEI mit einem Mw von 87000 g/Mol:
Dazu wurden 0,5 g LPEI unter Argon in 10 ml Ethanol bei 60°C gelöst und nach langsamer Zugabe von 0,11 g (0,13 ml) Octadecylchlorid 17 Stunden gerührt. Das Reaktionsprodukt wurde bei 20°C durch Zusatz von 20 ml Wasser gefällt, abfiltriert, mit Wasser gewaschen (Waschwasser pH 7) und im Hochvakuum über Phosphor- pentoxid getrocknet (Ausbeute 0,48 g/96 %). Hochreine Chargen (Milligramm-
Mengen) wurden durch Säulenchromatographie über Sephadex G25 (Pharmacia disposable PD-10 desalting column) von gesättigten wässrigen Lösungen (pH 7) des Polyethylenimins mit Millipore-Wasser als Eluent und anschließender Gefriertrocknung erhalten.
Die alkylierten linearen Polyethylenimine wurden durch 1H-NMR und FT-IR charakterisiert, wodurch der gewünschte Alkylierungsgrad bestätigt werden konnte.
Beispiel 3
Synthese der hydrophob funktionalisierten linearen Polyethylenimine (H-LPEI) am Beispiel der Einführung von 3 mol-% C 18- Acylgruppen in LPEI mit einem Mw von 87000 g/Mol:
Dazu wurden 0,5 g LPEI unter Argon in 10 ml Ethanol bei 50°C gelöst und nach langsamer Zugabe von 0,11 g (0,12 ml) Octadecansäurechlorid 20 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde nach Filtration im Vakuum quantitativ eingeengt. Der Rückstand wurde in der Hitze in 4 ml Ethanol gelöst und das Produkt wurde bei 20°C durch Zusatz von 8 ml Wasser gefallt. Nach Filtration und Waschen mit Wasser (Waschwasser pH 7) wurde im Hochvakuum über Phosphoφentoxid getrocknet (Ausbeute 0,38 g/76 %). Hochreine Chargen (Milligramm-Mengen) wurden durch
Säulenchromatographie über Sephadex G25 (Pharmacia disposable PD-10 desalting column) von gesättigten wässrigen Lösungen (pH 7) des Polyethylenimins mit Millipore- Wasser als Eluent und anschließender Gefriertrocknung erhalten.
Die acylierten linearen Polyethylenimine wurden durch 1H-NMR und FT-IR charakterisiert, wodurch der gewünschte Acylierungsgrad bestätigt werden konnte.
Beispiel 4
Synthese der hydrophob funktionalisierten linearen Polyethylenimine (H-LPEI) am
Beispiel der Einführung von 3 mol-% Chenodesoxycholsäure (CDC)-Gruppen (3αJα-Dihydroxy-5ß-cholansäure in LPEI mit einem Mw von 87000 g/Mol:
Chenodesoxycholsäure (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) wurde dazu mit N-Hydroxy- succinimid in eine Reaktivester- Verbindung überführt. 1 g Chenodesoxycholsäure und 0,32 g N-Hydroxysuccinimid wurden in 5 ml Dimethoxyethan gelöst und bei 0- 5°C mit 0,63 g Dicyclohexylcarbodiimid umgesetzt. Die Reakionsmischung wurde 16 Stunden gerührt, der Niederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Reaktivester wurde im Hochvakuum getrocknet (stabiler Schaum) und durch 1H-NMR charakterisiert. Ohne weitere Reinigung wurden 179 mg des
Chenodesoxycholsäure-Reaktivesters bei Raumtemperatur unter Argon zu einer Lösung von 0,5 g LPEI in 10 ml Ethanol gegeben. Anschließend wurde die Reaktionsmischung 20 Stunden bei 50°C gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Produkt durch Zusatz von 25 ml Wasser gefällt. Der Rückstand wurde ab filtriert, mit Wasser gewaschen (Waschwasser pH 7) und im Hochvakuum über
Phosphoφentoxid getrocknet. (Ausbeute 0,41 g/82 %). Hochreine Chargen (Milli- gramm-Mengen) wurden durch Säulenchromatographie über Sephadex G25 (Pharmacia disposable PD-10 desalting column) von gesättigten wässrigen Lösungen (pH 7) des Polyethylenimins mit Millipore- Wasser als Eluent und anschließender Gefriertrocknung erhalten.
Die mittels Reaktivester-Methode Acyl-funktionalisierten linearen Polyethylenimine wurden durch 1H-NMR und FT-IR charakterisiert, wodurch der gewünschte Acy- lierungsgrad bestätigt werden konnte.
Beispiel 5
Zetapotentialmessungen
Zur Ermittlung der Ladung bzw. des Protonierungsgrades der linearen Polyethylen- imine und der hydrophob funktionalisierten Polyethylenimine in wässriger Lösung bei physiologischem pH- Wert wurden Zetapotentialmessungen durchgeführt. Unabhängig vom mittleren Molekulargewicht und unabhängig vom Polymertyp ließ sich bei pH 7 ein mittlerer Protonierungsgrad von 50 % ermitteln, d.h. ca. 50 % der Stickstoffatome liegen in wässriger Lösung bei pH 7 protoniert vor.
Beispiel 6
Von allen Polyethyleniminen (LPEI, H-LPEI) wurden Stammlösungen in physiologischer Kochsalzlösung bei pH 7 mit einer Konzentration von 0,5 mg/ml hergestellt. Dazu wurden 25 mg des LPEI bzw. des H-LPEI unter Erhitzen und kurzer Ultraschallbehandlung in 30 ml Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung gelöst, mit 0,1 N HC1 auf pH 7 eingestellt und auf ein Ehdvolumen von 50 ml aufgefüllt. Die Stammlösungen wurden steril filtriert (0,2 μm) und können bei 20°C über lange Zeit gelagert werden. Um die Verwendbarkeit von Polyaminen, insbesondere von Polyethyleniminen als Immuntherapeutika zu belegen, wurde die Interferon-γ stimulierende Wirkung der Polyamine und anschließend der Wirksamkeitsnachweis in vivo demonstriert.
1. IFN-γ-Induktion in einem Maus-Milzzell- Assay
a) Tierhaltung
Die NMRI-Mäuse (Auszuchtstamm, weiblich, Gewicht 18-20 g) wurden 8 Tage vor Beginn der Experimente von der Firma Charles River (Sulzfeld, Deutschland) bezogen. Die Tiere hatten freien Zugang zu Futter und Wasser und wurden in einem künstlichen Tag-Nacht-Rhythmus gehalten (Beleuchtung von 07:00 bis 19:00 Uhr, Dunkelheit von 19:00 bis 07:00 Uhr).
b) Präparation von Maus-Milzzellen
Die Tiere wurden durch cervikale Dislokation getötet und dann die Milzen entnommen. Die Milzen wurden von anhängendem Bindegewebe befreit und nach folgender Vorschrift aufgearbeitet:
Die Milz wird auf ein Metallsieb (Maschenweite ca. 70 μm) gelegt (Petrischale) und mit einer Schere zerkleinert. Anschließend werden 5 ml PBS zugegeben und die Gewebestücke mit einem Glaspistill durch das Sieb gedrückt. Das Sieb wird mehrmals mit PBS nachgespült, die Zellen in insgesamt 50 ml PBS in ein Falcon- Röhrchen überführt und anschließend für 10 Minuten bei 300 x g zentrifugiert. Der
Überstand wird verworfen, die Zellen in 20 ml PBS resuspendiert und dann erneut für 10 Minuten bei 300 x g zentrifugiert. Nach resuspendieren der Zellen in 5-10 ml Medium wird die Zellzahl bestimmt und mit Medium auf 2,5 x 106 Zellen/ml eingestellt. c) Stimulation von Maus-Milzzellen
Die Stimulationen erfolgten in einem Volumen von 1 ml in 24-Lochplatten bei 37°C und 5 % CO2 für 72 Stunden. In einem Gesamtvolumen von 1 ml (0,8 ml Medium: RPMI, 10 % FCS, 1 % Penicillin/Streptomycin) wurden 2 x 106 Milzzellen stimuliert. Pro Ansatz wurde, je nach Anzahl der Stimulantien, folgendes zusammengegeben:
800 μl Medium mit 2,5 x 106 Zellen/ml 100 μl Stimulanz (Polyethylenimin, 0,5 mg/ml)
100 μl PBS
Alle Milzzellstimulationen wurden als Doppelbestimmung angesetzt.
Nach Ende der Stimulation wurden die Überstände in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt, die restlichen Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g für 10 Minuten abgetrennt. Die zellfreien Überstände wurden abgenommen und bis zur Messung von IFN-γ durch ELISA bei -20°C gelagert.
d) Messung der IFN-γ Konzentrationen
Die Bestimmung der iFN-γ-Konzentrationen in den Stimulations-Überständen erfolgte mit dem "Mouse IFN-γ OptEIA®-ELISA Set" (Firma Pharmingen, Heidelberg, Deutschland) nach Angaben des Herstellers.
Ergebnis gemäß Abbildung 1 :
Die getesteten Polyethylenimine zeigen eine signifikante IFN-γ-Induktion im Maus-
Milzzell-Assay. 2. In vivo IFN-γ-Induktion
a) Maushaltung
NMRI-Mäuse (Auszuchtstamm HdsWimNMRI, weiblich, Gewicht 18-20 g, bezogen über Harlan/Winkelmann, Borchen, Deutschland) wurden in autoklavierbaren, mit Sägespänen ausgelegten Polycarbonatkisten, im S2-Isolierstall bei 20-22 °C (Luftfeuchtigkeit 50-60 %) und in einem künstlichen Tag/Nacht Rhythmus gehalten (Beleuchtung von 06:30 bis 18:30 Uhr, Dunkelheit von 18:30 bis 06:30 Uhr). Sie hatten freien Zugang zu Futter und Wasser.
b) VersuchsdurcMührung
Die Tiere wurden randomisiert und in zwei Gruppen zu jeweils 6 Tieren aufgeteilt.
Nach der Anlieferung wurden die Mäuse zunächst ohne weitere Behandlung für 3 Tage im Tierstall gehalten.
Die zu analysierenden Substanzen wurden in einem Volumen von 0,2 ml intraperitoneal appliziert. Folgendes Behandlungsschema wurde angewandt:
Gruppe 1: Placebo: PBS
Gruppe 2: Polyethylenimin, H-LPEI, Mw: 87000, C18 Acyl, 3 mol%, gemäß Beispiel 3 (0,1 mg pro Maus).
9 Stunden nach der Behandlung wurden die Mäuse getötet und die Peritonealzellen durch eine Bauchspülung mit 5 ml eiskaltem PBS gewonnen.
Die Zellen wurden über einen Zentrifugationsschritt (30 Sekunden bei 16.000 x g, Raumtemperatur) aufkonzentriert, der Überstand dekantiert und die zelluläre Gesamt-RNA mittles des NucleoSpin RNA II Kits (Machery-Nagel, Düren, Deutschland) extrahiert.
Dazu wurde das Zellpellet in 400 μl RA1 -Puffer (aus dem NucleoSpin RNA II Kit) resuspendiert und bei -80 °C eingefroren. Nach dem Auftauen auf 37°C wurde der
Ansatz zur Reduktion der Viskosität auf einen NucleoSpin Filter aufgetragen und für 1 Minute zentrifugiert (16.000 x g, Raumtemperatur). Das Filtrat wurde mit 300 μl Ethanol versetzt und die Mischung auf eine NucleoSpin RNA-Säule aufgetragen. Nach Zentrifugation (30 Sekunden 8.000 x g), Entfernung des Filtrats und an- schließender Trockenzentrifugation der Säule (1 Minute 16.000 x g) erfolgte die
Spaltung der DNA durch DNase I. Dazu wurden 90 μl DNase Reaktionspuffer mit 10 μl DNase I (beides aus dem NucleoSpin RNA II Kit) vermischt und 95 μl dieser Lösung auf den trockenen Filter aufgetragen. Nach Inkubation für 15 Minuten (Raumtemperatur) wurde der Filter zunächst mit 500 μl RA2, dann mit 600 μl RA3 und anschließend mit 250 μl RA3 (aus dem NucleoSpin RNA II Kit) gewaschen.
Dazu wurden die Waschpuffer aufgetragen und die Säule jeweils für 30 Sekunden bei 8.000 x g und nach dem letzten Waschschritt für 2 Minuten bei 16.000 x g zentrifugiert. Anschließend wurde die RNA in 60 μl RNase freiem, destilliertem Wasser eluiert (1 Minute 16.000 x g).
Die Qualität der RNA wurde durch photometrische Messung übeφriift.
Die Synthese der cDNA erfolgte durch reverse Transkription der RNA unter Verwendung von "Random Hexamers" als Primer für die Polymerasereaktion. Dabei wurden die TaqMan Reverse Transkription Reagents (Applied Biosystems,
Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Der Synthese wurde in 100 μl durchgeführt. Der Syntheseansatz setzte sich wie folgt zusammen:
1300-1500 μg RNA
10 μl RT Buffer (lOx)
22 μl MgCl2 (25 mM)
5 μl Random Hexamers
2,5 μl MultiScribe RT
2 μl RNase Inhibitor
20 μl dNTP
RNase freies Wasser (ad 100 μl Gesamtvolumen)
Der Ansatz wurde in dem Thermocycler GeneAmp 2400 (Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) zunächst für 10 Minuten bei 25 °C, dann für 30 Minuten bei 48°C inkubiert und anschließend auf +4°C gekühlt. Die auf diese Weise synthetisierte cDNA wurde bei -20°C aufbewahrt.
Die quantitative PCR wurde mit dem ABI PRISM® 5700 (Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) durchgeführt. Dazu wurde das PDAR-Kit (Pre-Developed
TaqMan® Assay Reagens) für murines IFN-γ eingesetzt (Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland).
Die Mengen der cDNAs wurden mittels eines "housekeeping" Genes (18S RNA), unter Verwendung des PDAR-Kits "Endogenious Control Ribosomal RNA Control
(18S RNA)" normalisiert.
Für die Standardisierung und die Induktionsberechnung wurde eine Kalibrator-cDNA eingesetzt. Diese bestand aus einem Gemisch der cDNA 11 verschiedener Mäuse, die ensprechend der Gruppe 1 behandelt wurden.
Die Amplifikationen erfolgten jeweils in einem Volumen von 50 μl und setzten sich wie folgt zusammen: Endogene 18S RNA Kontrolle:
• 1 ng cDNA
• 25 μl 2 x TaqMan Universal PCR Master Mix
• 2,5 μl 18S RNA
RNase freies Wasser (ad 100 μl Gesamtvolumen)
IFN-γ Nachweis:
10 ng cDNA
• 25 μl 2 x TaqMan Universal PCR Master Mix • 2,5 μl IFN-γ Primer
• RNase freies Wasser (ad 100 μl Gesamtvolumen)
Nach Inkubation für 2 Minuten bei 50°C und der anschließenden initialen Denaturierung (95°C 10 Minuten), folgten 45 Zyklen Denaturierung (94°C 15 Sekunden) und Armealing/Extension (60°C, 1 Minute). Zur Analyse der Produkte wurde die
GeneAmp® 5700 Sequence Detection System Software (v. 1.3) verwendet.
Folgende Ergebnisse wurden erhalten:
Die Expression von Interferon-γ wird in vivo 9 Stunden nach Behandlung mit
Polyethylenimin H-LPEI, Mw: 87000, C18 Acyl, 3 mol% induziert (vgl. Abbildung 2). Diese Induktion ist je nach Tier 16-120 fach höher als der Kalibrator. Hingegen zeigen die unbehandelten bzw. die mit PBS behandelten Tiere eine Schwankung in der Interferon-γ-Expression von 0,9 fach geringerer bis zu einer 7 fachen Erhöhung gegenüber dem Kalibrator an. 3. Nachweis der immunstimulatorischen Wirkung im Aujeszky-Maus-Modell
Das Aujeszky-Maus-Modell ist ein in vivo Belastungsmodell zum Nachweis der Wirkung von verschiedenen Immunstimulatoren (z. B. BAYPAMUN®, CpG- Oligonukleotiden).
a) Maushaltung
Die NMRI-Mäuse (Auszuchtstamm HdsWimNMRI, weiblich, Gewicht 18-20 g, bezogen über Harlan/Winkelmann, Borchen, Deutschland) wurden in autoklavierbaren, mit Sägespänen ausgelegten Polycarbonatkisten, im S2-Isolierstall bei 20-22 °C (Luftfeuchtigkeit 50-60 %) und in einem künstlichen Tag/Nacht Rhythmus gehalten (Beleuchtung von 06:30 bis 18:30 Uhr, Dunkelheit von 18:30 bis 06:30 Uhr). Sie hatten freien Zugang zu Futter und Wasser.
b) Belastungsmodell
Für die Untersuchungen wurden Mausgruppen mit 10 Mäusen pro Gruppe gebildet. Die Tiere einer Gruppe erhielten jeweils die selbe Testsubstanz.
Die Mäuse wurden nach der Anlieferung für 2-3 Tage im Tierstall gehalten. Anschließend wurden die Polyethylenimine (Ausgangskonzentration 0,5 mg/ ml) mit physiologischer NaCl-Lösung (pH-Wert 7,6) 1:10 und 1:100 verdünnt. Von diesen Lösungen wurde 0,2 ml pro Maus intraperitoneal appliziert.
24 Stunden nach der Behandlung wurden die Mäuse durch intraperitoneale Applikation von Pseudorabiesvirus, Stamm Hannover H2, belastet. Dazu wurde das Virus in PBS bis zu einem Belastungstiter von lO^-lO4'1 TCιD50/ ml verdünnt und 0,2 ml dieser Suspension appliziert. Als Negativkontrolle wurde eine Gruppe von Mäusen mit physiologischer NaCl- Lösung behandelt und anschließend belastet.
Die Mäuse dieser Gruppe starben 3-8 Tage nach der Belastung. Die mit Polyethylen- iminen behandelten Mäuse überlebten zu einem großen Anteil die Pseudorabiesvirus-
Infektion. 10 Tage nach Belastung wurde der Versuch beendet.
Die Stärke der induzierten Immunstimulation ergab sich aus dem Vergleich der gestorbenen Mäuse in der NaCl-Kontrollgruppe und den Testgruppen und wurde durch den Wirkungsindex quantifiziert. Dieser gibt den prozentualen Anzahl der
Mäuse an, die aufgrund der Immunstimulation durch die zu testende Substanz vor der letalen Wirkung des Aujeszky- Virus geschützt sind. Er wird mit der Formel
WI = (b-a)/b xl00
berechnet. Dabei gibt b den prozentualen Anteil der toten Mäuse in der Kontrollgruppe, a den prozentualer Anteil der toten Mäuse in der Testgruppe an.
Ergebnisse (vgl. Abbildung 3):
Die Prüfung unterschiedlicher Konzentrationen von Polyethyleniminen im Aujeszky Maus Modell zeigt überraschenderweise:
• Nach der Behandlung der Mäuse mit 0,1 bzw. 0,01 mg H-LPEI, M : 87000, C18 Acyl, 3 mol% oder H-LPEI, Mw: 87000, CDC Acyl, 3 mol% wurde mit
Wirkungsindizes von > 60 % jeweils eine signifikante Immunstimulation nachgewiesen.
• Bei Einsatz unterschiedlicher Konzentrationen der beiden Polyethylenimine H-LPEI, Mw: 87000, C18 Acyl, 3 mol% und H-LPEI, Mw: 87000, CDC Acyl,
3 mol% wurde jeweils eine Dosis/Wirkungsbeziehung nachgewiesen.
4. Analyse der Wirkung der Polyethylenimine H-LPEI, Mw: 87000, C18 Acyl, 3 mol%, und H-LPEI, M : 87000, CDC Acyl, 3 mol% auf die Genexpression in murinen Peritonealzellen (in vivo) mittels des PIOOR™-cDNA-Array-Systems
a) Tierhaltung
Die NMRI-Mäuse (Auszuchtstamm, weiblich, Gewicht 18-20 g) wurden 8 Tage vor Beginn der Experimente von der Firma Charles River (Sulzfeld, Deutschland) bezogen. Die Tiere hatten freien Zugang zu Futter und Wasser und wurden in einem künstlichen Tag-Nacht-Rhythmus gehalten (Beleuchtung von 07:00 bis 19:00 Uhr, Dunkelheit von 19:00 bis 07:00 Uhr).
b) VersuchsdOTchführung
Die Tiere wurden randomisiert und in drei Gruppen zu jeweils 4 Tieren aufgeteilt. Die zu analysierenden Substanzen wurden in einem Volumen von 0,2 ml intraperitoneal appliziert. Folgendes Behandlungsschema wurde angewandt:
Gruppe 1 : Placebo: Physiologische NaCl-Lösung. Gruppe 2: Polyethylenimin, H-LPEI, M : 87000, C18 Acyl, 3 mol% (0,1 mg pro
Maus). Gruppe 3: Polyethylenimin, H-LPEI, M : 87000, CDC Acyl, 3 mol% (0,1 mg pro Maus).
6 Stunden nach der Behandlung wurden die Mäuse getötet und die Peritonealzellen durch eine Bauchspülung mit 10 ml Medium (DMEM, 5 % FCS) gewonnen.
Die Zellen wurden anschließend durch Zentrifugation (10 Minuten bei 300 x g, Raumtemperatur) aufkonzentriert und dann entweder sofort in die RNA-Extraktion eingesetzt oder zunächst einer Erythrozyten-Lyse unterzogen.
Erythrozyten-Lyse
Für die Erythrozyten-Lyse wurden die pelletierten Peritonealzellen in 1 ml PBS resuspendiert, mit 10 ml Lysis-Puffer (10 ml 0,17 M Tris, pH 7,2 + 90 ml 0,16 M
Nfϊ-tCl, pH 7,2) versetzt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation für 10 Minuten bei 300 x g. Der Überstand wurde verworfen, die Zellen mit 10 ml PBS gewaschen und erneut zentrifugiert (10 Minuten bei 300 x g).
Gesamt-RNA-Präparation
Die Präparation von gesamt-RNA aus den Peritonealzellen erfolgte mit dem RNeasy Mini-Kit (Firma QIAGEN, Hilden, Deutschland) nach den Angaben des Herstellers. Dabei wurden jeweils zwei Ansätze für eine Aufarbeitung gemischt.
Die Ausbeuten an gesamt-RNA aus den Peritonealzellen von jeweils vier Tieren betrugen zwischen 10 und 20 μg RNA. Zwischenamplifikation der RNA
Für die ZwischenampUfikation der RNA wurde basierend auf dem Protokoll von Eberwine et al. (1992) verfahren. Hierbei erfolgt die Amplifikation der mRNA aus der gesamt-RNA-Präperation.
cDNA Array
Für die Analyse der induzierten und reprimierten Gene wurde das PIQOR™-cDNA- Array-System der Firma Memorec Stoffel GmbH (Köln, Deutschland) eingesetzt. Dabei wurde die cDNA immunologisch relevanter Gene (Interleukine, Differenzierungscluster (CDs), Transkriptionsfaktoren, Rezeptoren etc.) auf einen Chip aufgetragen.
Für die Hybridisierung wurde die amplifizierte RNA eingesetzt. In einer RT- Reaktion wurden je 2 μg der amplifizierte RNA in cDNA umgeschrieben und dabei die fluoreszenzmarkierten Nukleotide eingebaut. Die Kontrollen wurden mit Cy3 und die Proben mit Cy5 markiert.
Folgende Hybridisierungen wurden nach dem vom Hersteller angebenenen Protokoll (PIQOR™-cDNA-Array-System, Edition 2.6, February 2000) durchgeführt und ausgewertet:
Für die Auswertung der Hybridisierungssignale wurden ausschließlich solche Signale analysiert, bei denen mindestens eine der jeweils zu vergleichenden Proben (Cy3 bzw. Cy5-Signal) ein mindestens 2fach stärkeres Signal aufweist als der- Mittelwert der beiden negativ-Kontrollen (Salz und Heringssperma-DNA). Zur Bestimmung der Genexpression wurden ausschließlich die Signale der Gene einbezogen, die größer als zweifach differentiell exprimiert wurden.
Ergebnisse:
Die nachstehende Tabelle zeigt eine Zusammenfassung der cDNA-Analyse. Werte über 2,0 zeigen eine spezifische Erhöhung der Expression der jeweiligen mRNA an
(A), während Werte < - 2,0 Suppression anzeigen (B). Nach Stimulation mit den Polyethyleniminen sind insbesondere anti-inflammatorische bzw. anti-apoptotische Faktoren überexprimiert. Extrem hoch ist die Steigerung der Expression von Interleukin-1 -Rezeptor Typ 2, dem in der Literatur eine stark anti-inflammatorische Wirkung zugeordnet wird (Brown et al., 1996; Bossu et al., 1995). Anti- inflammatorisch bzw. anti-apoptotisch wird die Expression von FERHA (ferritin heavy chain mRNA) beschrieben (Weiss et al., 1997; Oberle & Schröder, 1997). Die Erhöhung von MCL-1 auf 2,88 weißt zusätzlich auf eine anti-apoptotische Wirkung der Polymere hin (Fujise et al., 2000).
Analyse der Wirkung der Polyethylenimine H-LPEI, Mw: 87000, C18 Acyl, 3 mol%, und H-LPEI, M : 87000, CDC Acyl, 3 mol% auf die Genexpression in murinen Peritonealzellen (in vivo) mittels des PIQOR™-cDNA-Array-Systems
A) Induzierte Gene
B) Supprimierte Gene
Literaturverzeichnis
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Claims

Patentansprtiche
1. Arzneimittel enthaltend ein Polyamin als Wirksubstanz.
2. Arzneimittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyamin hydrophobe Substituenten aufweist.
3. Arzneimittel gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Substituenten als Seitenketten oder endständig angeordnet sind.
4. Arzneimittel gemäß Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Substituenten Alkylketten, Acylketten oder Steroid-artige Substituenten sind, sowie hydrophobe Substituenten, die durch Addition der Stickstofffunktionen der Polyaminhauptkette an Isocyanate oder an α,ß-ungesättigte Carbonyl- Verbindungen eingeführt werden können.
5. Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyamin ein Polyethylenimin darstellt.
6. Arzneimittel gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenimin die folgende allgemeine Formel aufweist:
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N] -Einheit
R1 Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet und
R2 Alkyl mit 1 bis 23 Kohlenstoffatomen bedeutet, und worin
R3 und R4 (Endgruppen) unabhängig voneinander Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei R5 (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt und n = a xP mit 0,000 l<a<0,l, wobei die Einheiten m und n statistisch im Polymer verteilt sind.
Arzneimittel gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenimin die folgende allgemeine Formel aufweist:
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N] -Einheit
Rl Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet und
R2 Alkyl mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen bedeutet,
und worin R3 und R4 (Endgruppen) unabhängig voneinander Wasserstoff oder Acyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei R5 (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt und n = a χP mit 0,000 Ka<0,l, wobei die Einheiten m und n statistisch im Polymer verteilt sind.
8. Arzneimittel gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenimin die folgende allgemeine Formel aufweist:
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N] -Einheit
R ,ι , R und R Wasserstoff oder Hydroxy bedeuten,
und worin R4 und R5 (Endgruppen) unabhängig voneinander Wasserstoff oder Steroid- Grundkörper, insbesondere Gallensäuren, bedeuten, oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei R6 (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt und n = a x P mit 0,000 Ka<0,l, wobei die Einheiten m und n statistisch im Polymer verteilt sind.
Arzneimittel gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenimin die folgende allgemeine Formel aufweist:
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N] -Einheit
R1 OR4 oder NR R5 bedeutet,
wobei
R und R unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen bedeuten,
und worin R2 und R3 (Endgruppen) unabhängig voneinander den Substituenten der Stickstoffatome der Polymerhauptkette entsprechen oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei R6 (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt und n = a P mit 0,000 l<a<0,l, wobei die Einheiten m und n statistisch im Polymer verteilt sind.
10. Arzneimittel gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenimin die folgende allgemeine Formel aufweist:
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N]-Einheit
R1 Alkyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen bedeutet,
und worin
R und R (Endgruppen) unabhängig voneinander den Substituenten der Stickstoffatome der Polymerhauptkette entsprechen oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen, wobei R4 (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt und n = a x P mit 0,001<a<0,l, wobei die Einheiten m und n statistisch im Polymer verteilt sind.
11. Arzneimittel gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenimin die folgende allgemeine Formel aufweist:
worin in jeder einzelnen [CH2-CH2-N] -Einheit der Rest R entweder Wasserstoff oder ein Rest der Formel
sein kann und worin Rx entweder Wasserstoff oder ebenfalls wieder ein Rest des Typs R sein kann,
und worin jede einzelne [CH2-CH2-N] -Einheit und die Endgruppen die in einem der Ansprüche 8 bis 13 genannten Substituenten tragen können,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P=(m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt.
12. Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyamin ein Molekulargewicht unter 220000 g/Mol aufweist.
13. Arzneimittel gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyamin ein Molekulargewicht von 2000 bis 100000 g/Mol aufweist.
14. Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyamin an einen zellspezifischen Liganden gekoppelt ist.
15. Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich Formulierungshilfsstoffe enthält.
16. Polyamin, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, zur Verwendung als
Arzneimittel.
17. Verwendung eines Polyamins, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, zur Herstellung eines immunstimulierenden Arzneimittels.
18. Verwendung eines Polyamins, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von viralen Infektionen oder für die Prophylaxe vor viralen Infektionen.
19. Verwendung gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um
Infektionen mit Papilloma- Viren, Viren der Herpes-Gruppe, Hepatitis- Viren oder HIV handelt.
20. Nerwendung gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Infektionen um Infektionen des Respirationstraktes oder der inneren
Organe handelt.
21. Nerwendung gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Propylaxe um die Vorbeugung einer Infektion durch Stress oder nach einer Operation oder zahnärztlichen Behandlung handelt.
22. Verwendung eines Polyamins, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung bakterieller Infektionen.
23. Verwendung eines Polyamins, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Krebs oder Tumoren.
24. Verwendung eines Polyamins, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Organfibrosen oder für die Prophylaxe vor Organfibrosen.
25. Verwendung eines Polyamins, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Erkrankungen, die mit erhöhter Kollagenablagerung einhergehen.
26. Verwendung eines Polyamins, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, zur
Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von entzündlichen, degenerativen und proliferativen Erkrankungen der inneren Organe, der Haut, des Blutes, des Zentralnervensystems und seiner Anhangsgebilde einschließlich des Auges.
27. Verwendung eines Polyamins, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Erkrankungen des allergischen Formenkreises, insbesondere für die Behandlung von Asthma.
28. Verwendung eines Polyamins, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, als
Adjuvans.
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