EP1370555A1 - Composes derives des oxindoles et leur application therapeutique en cancerologie - Google Patents

Composes derives des oxindoles et leur application therapeutique en cancerologie

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Publication number
EP1370555A1
EP1370555A1 EP02722330A EP02722330A EP1370555A1 EP 1370555 A1 EP1370555 A1 EP 1370555A1 EP 02722330 A EP02722330 A EP 02722330A EP 02722330 A EP02722330 A EP 02722330A EP 1370555 A1 EP1370555 A1 EP 1370555A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
compound according
treatment
cancer
application
formula
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02722330A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Cécile Combeau
Patrick Mailliet
Marielle Chiron
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Pharma SA
Original Assignee
Aventis Pharma SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharma SA filed Critical Aventis Pharma SA
Publication of EP1370555A1 publication Critical patent/EP1370555A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to compounds derived from oxindoles, their use for inhibiting the vascularisation of a tumor mass and / or their therapeutic application for the preparation of a medicament having an antivascular pharmacological property.
  • phase M which consists of a nuclear division (mitosis) and a cytoplasmic division (cytodieresis)
  • This interphase begins with the G1 phase during which there is an increased resumption of the cell's biosynthesis activities.
  • Phase S begins when DNA synthesis begins and ends when the chromosomes have replicated (each chromosome is then composed of two identical sister chromatids).
  • the cell then enters phase G2 (last phase of the interphase) which continues until the start of mitosis, initiating phase M.
  • Cell division thus involves the division of chromosomes (or mitosis) and the division of cytoplasm ( or cytodieresis).
  • the process of mitosis includes several phases: • prophase characterized by the condensation of DNA and the duplication in the still intact nucleus of chromosomes in two chromatids united by a centromere,
  • telophase during this stage, the chromosomes take the form of two networks of diffuse fine chromatin, the nuclear envelope is reformed, then the cytoplasmic membrane, and a new network of microtubules appears in the cytoplasm.
  • Microtubules are microscopic fibers that are part of the cell cytoskeleton and play a crucial role in the division, transport and mobility of cell. Microtubules are made up of tubulin, a heterodimeric protein that polymerizes to reversibly form microtubules, which themselves assemble to make up the mitotic spindle during metaphase. By virtue of its function in the cell, tubulin thus represents a target of choice for antimitotic compounds for antitumor purposes.
  • Angiogenesis is a mechanism of neovascularization that arises from an existing capillary network. We can either prevent the formation of new blood vessels in the tumor (antiangiogenesis) or consider destroying the existing vessels in order to limit the supply of nutrients to the tumor (antivascular approach).
  • the antiangiogenic approach which is a cytostatic approach, the angiogenic factors generally synthesized by tumors such as NEGF (Nascular Endothelial Growth Factor), PD-ECGF (Platelet Derived Endothelial Cell Growth Factor) or b-FGF (Growth Factor basic fibroblasts) are blocked.
  • NEGF Neuronal Growth Factor
  • PD-ECGF Plater Derived Endothelial Cell Growth Factor
  • b-FGF Brownth Factor basic fibroblasts
  • antiangiogenic molecules such as KDR tyrosine kinase receptor inhibitors, anti-integrin antibodies, or by natural anti-angiogenic polypeptides such as angiostatin or endostatin.
  • the antivascular approach induces cytotoxic effects.
  • Colchicine, colcemide, and nocadazole inhibit the polymerization of tubulin.
  • Vinblastine and vincristine at low concentrations, also inhibit polymerization, but by interacting at a site distinct from the previous one, at a higher concentration, these last two molecules can aggregate tubulin.
  • Taxol on the contrary, stimulates the assembly of tubulin into microtubules and stabilizes the pre-formed microtubules.
  • Patent application WO / 48606 describes a method which, by means of phosphorylation, allows the solubilization of combretastatin A4 in water.
  • This phosphorylated compound is in the form of a prodrug (that is to say inactive) but is capable of becoming active in vivo under the action of non-specific phosphatases and thus, of stopping the cell cycle in the G2 / M phase.
  • Patent application WO96 / 40116 describes these oxindole derivatives for modulating the protein tyrosine kinase (PTK) transduction signal.
  • PTK protein tyrosine kinase
  • the Applicant has discovered a family of chemical compounds derived from oxindoles or indolin-2-ones having an action of inhibiting tubulin polymerization, a cytotoxic effect on tumor epithelial cells and an action on cell detachment.
  • the term “cell detachment” is understood to mean the detachment of endothelial cells from the vessels which will cause disorganization of these vessels and, consequently, stasis of the blood flow and subsequent necrosis of the tumor by failure to supply essentially growth factors and oxygen.
  • the object of the invention is the use of compounds derived from indolin-2-one to inhibit the polymerization of tubulin, which has the consequence of interrupting the cell cycle in G2 / M phase. Thanks to the antimitotic and therefore cytotoxic action of the invention, these compounds can exert an antitumor effect.
  • due to their mechanism of action - inhibition of tubulin polymerization - may exert an antivascular effect on tumors.
  • R 5 is chosen from groups
  • R2 is a C1-C3 alkyl group in which X can be Cl, Br, or F in which n is between 1 and 3, in the form E, Z, or a mixture of the two forms of isomers.
  • R2 preferably denotes a methyl group
  • X is preferentially chlorine
  • n is preferably equal to 2.
  • the present invention relates very particularly to the compounds of formula (T) as defined above, corresponding to the following formulas: 3-pSf- (3,5-dichlorophenyl) -pyr ⁇ ol-2-yl] -5-acetylamino -indolin-2-one 3- [N- (3-chlorophenyl) -pyrrol-2-yl] -5-acetylamino-indolin-2-one
  • the coupling reaction is generally carried out under the conditions described by E. Knoevenagel (Chem. Ber. 1900, 23, 172), namely in a protic solvent such as methanol or ethanol, in the presence of a catalytic amount of organic base such as piperidine, at a temperature between 20 ° C and the reflux temperature of the solvent used.
  • a protic solvent such as methanol or ethanol
  • organic base such as piperidine
  • the compounds of the present invention as defined above have antimitotic properties by inhibiting the polymerization of tubulin into microtubules which are key components in the establishment of the mitotic spindle during cell division.
  • molecules interfering with the polymerization of tubulin are capable of limiting untimely cell proliferation such as that observed in cancers.
  • the compounds of the present invention possess, in addition to their tubulin-specific inhibitory properties, cellular effects such as antiproliferative and antivascular properties.
  • the compounds of the present invention are especially useful in the context of therapy for primary cancer tumors. These properties justify their application in therapy and the invention particularly relates as medicaments, the products of formula (I) as defined above in a pharmaceutically acceptable medium.
  • These pharmaceutical compositions can be administered by the oral route, by the parenteral route or by the local route as a topical application to the skin and the mucous membranes or by injection by the intravenous or intramuscular route.
  • compositions can be solid or liquid and can be presented in all the pharmaceutical forms commonly used in human medicine such as, for example, simple or coated tablets, pills, tablets, capsules, drops, granules, injectable preparations, ointments, creams or gels. They are prepared according to the usual methods.
  • the active ingredient can be incorporated therein into excipients usually used in these pharmaceutical compositions, such as talc, gum arabic, lactose, starch, magnesium stearate, cocoa butter, aqueous vehicles or not, fatty substances of animal or vegetable origin, paraffinic derivatives, glycols, various wetting agents, dispersants, or emulsifiers, preservatives.
  • the usual dosage which varies according to the product used and the subject treated, can be, for example, from 0.05 to 5 grams per day in adults.
  • Example 1 3- [N- (3,5-dichlorophenyl) -pyrrol-2-yl] -5-acetylamino-indolin-2-one
  • 0.5 mmol of indolyl-2-one of general formula (11) is introduced into a magnetic heating reactor with Zymark condenser, of the STEM RS2050 type containing 25 wells in parallel, each provided with a 50 ml glass tube.
  • the reaction medium is brought to reflux overnight. After cooling, and diluting with 5 ml of water, the precipitate formed is drained and dried under reduced pressure.
  • Tubulin is purified from pig brains (Shelanski et al, 1973, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 70, 765-768. Weinberger et al, 1975, Proc. Natl. Acad.
  • the brains are ground and centrifuged in an extraction buffer.
  • the tubulin present in the supernatant of the extract undergoes two successive cycles of polymerization at 37 ° C and depolymerization at 4 ° C, before being separated from MAPs (Microtubule Associated Proteins) by chromatography on a phosphocellulose Pl i column (hatman).
  • MAPs Microtubule Associated Proteins
  • MES-NaOH 2- (N-morpholino) -ethanesulfonic acid
  • tubulin in microtubules is followed by turbidimetry: the tubulin is adjusted to a concentration of 10 ⁇ M in the RB / 2 buffer 30% glycerol to which 1 mM GTP and 6 mM MgCl 2 are added .
  • the polymerization is triggered by an increase in temperature from 6 ° C to 37 ° C in a cell with a 1 cm optical path, placed in a UNTKON 931 spectrophotometer (Kontron) equipped with a thermostated cell holder.
  • the increase in the turbidity of the solution is followed at 350 nm.
  • the products to be tested are dissolved in 10 mM in DMSO and added at variable concentrations (0.5 to 10 ⁇ M) to the tubulin solution before polymerization. The results are expressed as a percentage of inhibition of the polymerization relative to the controls.
  • the IC50 is defined as the concentration of product which inhibits the polymerization rate of tubulin by 50%.
  • a product whose IC 50 is less than or equal to 3 ⁇ M is considered to be very active. Of the three compounds tested, those carrying two chlorine residues seem more active.
  • HeLa cells The proliferation of HeLa cells is evaluated by measuring the inco ⁇ oration of [ 14 C] - thymidine as follows.
  • HeLa cells tumor epithelial cells of human origin
  • DMEM medium Gibco
  • antibiotics penicillin 1%, streptomycin 1%
  • the cells are seeded in 96-well cytostar microplates (Amersham), at a rate of 5000 cells per well.
  • [ 14 C] -thymidine 0.1 ⁇ Ci / well
  • the compounds to be evaluated are then added at concentrations varying up to 10 ⁇ M; the DMSO used to dissolve the compounds must not exceed 0.5% in the medium.
  • the inco ⁇ orated radioactivity in the cells is measured by counting the plate in a TRI-LUX counter (Wallac). The results are expressed in% of inco ⁇ orated strokes in the cells in the presence of compounds compared to the proliferation control.
  • the IC 50 is defined as the concentration of product which decreases the radioactivity by 50% compared to an untreated control.
  • HDMEC cells Human Dermal Microvascular Endothelial Cells, Promocell, c-122102
  • ECGM-MV medium which contains 5% heat-inactivated fetal calf serum, growth factors (EGF 10 ng / mL, hydrocortisone 1 ⁇ g / mL, 0.4% growth supplement with heparin) and antibiotics (amphotericin 50 ng / mL and gentamicin 50 ⁇ g / mL).
  • the HDMECs are seeded at 5000 cells per well in 96-well bright-field plates (Costar) pre-adsorbed with fibronectin (10 ⁇ g / ml) or vitronectin (1 ⁇ g / ml) or gelatin. Twenty-four hours later, the culture medium is replaced by ECGM-MV 0.1% BSA medium (bovine serum albumin) containing the indicated products. The concentrations tested are 0.1-0.3 and 1 ⁇ M for each product. After two hours of treatment, the cells are labeled for one hour with calcein (1.6 ⁇ g / ml, Molecular Probes) in ECGM-MV 0.1% BSA medium.
  • calcein 1.6 ⁇ g / ml, Molecular Probes
  • the detached cells are then removed by washing with ECGM-MV 0.1% BSA medium; 100 ⁇ l of medium is added to each well.
  • the fluorescence of the cells which remain attached to the substrate of the well is counted using a fluorimeter, Spectrafluor Plus (Tecan, excitation 485 nm, and emission 535 nm). The data are the average of six different samples and are expressed as a percentage of the control (untreated cells).
  • a cell detachment effect greater than or equal to 15% is considered significant.
  • Product 1 therefore has, in addition to inhibiting tubulin and inhibiting cell proliferation properties of the HeLa cells tested, a marked action on the detachment of endothelial cells.

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Abstract

L'invention concerne des composés de formule (I) dans laquelle R5 est choisi parmi les groupements : -NH-CO-R2 ou -CO-NH-R2 dans laquelle R2 est un groupement alkyle en C1-C3 dans laquelle X peut être Cl, Br, ou Fdans laquelle n est compris entre 1 et 3, sous la forme E, Z, ou un mélange des deux formes d'isomères possédant des propriétés antimitotiques, antiprolifératives et antivasculaires par inhibition de la polymérisation de tubuline en microtubules.

Description

COMPOSES DERIVES DES OXINDOLES ET LEUR APPLICATION THERAPEUTIQUE EN CANCEROLOGIE
La présente invention concerne des composés dérivés des oxindoles, leur utilisation pour inhiber la vascularisation d'une masse tumorale et/ou leur application thérapeutique pour la préparation d'un médicament ayant une propriété pharmacologique antivasculaire.
Les étapes essentielles du cycle cellulaire d'un eucaryote se décomposent de la façon suivante :
Après la phase M, qui se compose d'une division nucléaire (mitose) et d'une division cytoplasmique (cytodiérèse), les cellules filles commencent rinterphase d'un nouveau cycle. Cette interphase commence avec la phase Gl pendant laquelle on note une reprise accrue des activités de biosynthèse de la cellule. La phase S commence quand la synthèse de l'ADN démarre et se termine quand les chromosomes se sont répliqués (chaque chromosome est alors composé de deux chromatides sœurs identiques). La cellule entre ensuite en phase G2 (dernière phase de l'interphase) qui se poursuit jusqu'au début de la mitose, initiant la phase M. La division cellulaire comporte ainsi la division des chromosomes (ou mitose) et la division du cytoplasme (ou cytodiérèse). Le processus de mitose comprend plusieurs phases : • la prophase caractérisée par la condensation de l'ADN et la duplication dans le noyau encore intact des chromosomes en deux chromatides unies par un centromère,
• la métaphase où l'on observe la dissolution de la membrane du noyau et la formation d'un faisceau de microtubules et protéines, le fuseau mitotique, sur lequel les chromosomes se placent en position équatoriale pour former la plaque métaphasique,
• l'anaphase qui consiste en la séparation et la migration des chromatides de part et d'autre du noyau vers les pôles du fuseau mitotique en s 'attachant aux microtubules à l'aide d'une structure appelée kinétochore,
• la télophase : lors de cette étape, les chromosomes reprennent la forme de deux réseaux de chromatine fine diffuse, l'enveloppe nucléaire se reforme, puis la membrane cytoplasmique, et un nouveau réseau de microtubules apparaît dans le cytoplasme.
Les microtubules sont des fibres microscopiques qui font partie du cytosquelette cellulaire et jouent un rôle crucial dans la division, le transport et la mobilité de la cellule. Les microtubules sont composés de tubuline, une protéine hétérodimérique qui polymérise pour former de façon réversible les microtubules qui, eux-mêmes s'assemblent pour composer le fuseau mitotique lors de la métaphase. De par sa fonction dans la cellule, la tubuline représente ainsi une cible de choix pour des composés antimitotiques à visée antitumorale.
Il est maintenant bien établi que le développement d'une vascularisation intra ou péritumorale est un événement clé autant pour la croissance d'une tumeur que pour la dissémination métastatique par voie sanguine. Un vaisseau sanguin nourrit en effet des millions de cellules. Ainsi, il est primordial dans une approche anticancéreuse de limiter l'apport sanguin au site de la tumeur.
L'angiogenèse est un mécanisme de néovascularisation qui prend naissance à partir d'un réseau capillaire existant. On peut soit empêcher la formation de nouveaux vaisseaux sanguins dans la tumeur (antiangiogenèse) soit envisager une destruction des vaisseaux existants dans le but de limiter l'approvisionnement en nutriments de la tumeur (approche antivasculaire).
Dans l'approche antiangiogénique qui est une approche cytostatique, les facteurs angiogéniques généralement synthétisés par les tumeurs comme le NEGF (Nascular Endothelial Growth Factor), le PD-ECGF (Platelet Derived Endothelial Cell Growth Factor) ou le b-FGF (Facteur de Croissance basique des Fibroblastes) sont bloqués. La croissance de nouveaux vaisseaux peut également être inhibée avec des molécules antiangiogeniques tels que les inhibiteurs du récepteur tyrosine kinase KDR, des anticorps anti-intégrines, ou par des polypeptides anti-angiogéniques naturels comme l'angiostatine ou l'endostatine. Au contraire, l'approche antivasculaire induit des effets cytotoxiques. La colchicine, le colcémide, et le nocadazole inhibent la polymérisation de la tubuline. La vinblastine et la vincristine, à faibles concentrations, inhibent également la polymérisation, mais en interagissant à un site distinct du précédent, à concentration plus élevée, ces deux dernières molécules peuvent agréger la tubuline. Le taxol, au contraire, stimule l'assemblage de la tubuline en microtubules et stabilise les microtubules pré-formés.
Tous ces composés cependant, qu'ils polymérisent la tubuline ou qu'ils dépolymérisent les microtubules ont un même effet antimitotique donc cytotoxique vis-à-vis des cellules endothéliales et tumorales. Certains composés inhibiteurs de la polymérisation des microtubules tels que la colchicine, la vincristine ou la vinblastine ont de plus été caractérisés pour leur activité anti-vasculaire c'est-à-dire qu'ils induisent en quelques heures un arrêt du flux sanguin dans la tumeur et une nécrose hémorragique dans des modèles expérimentaux de tumeur.
Beaucoup de ces composés capables de se fixer à la tubuline comme la combrestatine A4 ou les analogues de taxol sont insolubles dans l'eau. La demande de brevet WO/48606 décrit une méthode qui par le biais d'une phosphorylation, permet la solubilisation de la combrétastatine A4 dans l'eau. Ce composé phosphorylé est sous forme de prodrogue (c'est-à-dire inactive) mais est capable de devenir active in vivo sous l'action de phosphatases non spécifiques et ainsi, de stopper le cycle cellulaire en phase G2/M. La demande de brevet WO96/40116 décrit ces dérivés d'oxindoles pour moduler le signal de transduction de la protéine tyrosine kinase (PTK).
La demanderesse a découvert une famille de composés chimiques dérivés des oxindoles ou indolin-2-ones ayant une action d'inhibition de polymérisation de tubuline, un effet cytotoxique sur des cellules épithéliales tumorales et une action sur le détachement cellulaire. On entend par "détachement cellulaire" le détachement des cellules endothéliales des vaisseaux qui vont entraîner une désorganisation de ces vaisseaux et, par conséquent, une stase du flux sanguin et nécrose subséquente de la tumeur par non-approvisionnement essentiellement en facteurs de croissance et en oxygène. L'objet de l'invention est l'utilisation de composés dérivés de l'indolin-2-one pour inhiber la polymérisation de la tubuline, ce qui a pour conséquence d'interrompre le cycle cellulaire en phase G2/M. Grâce à l'action antimitotique donc cytotoxique de l'invention, ces composés pourront exercer un effet antitumorale. En outre, de part leur mécanisme d'action -inhibition de la polymérisation de la tubuline- pourront exercer un effet antivasculaire sur les tumeurs.
La présente invention a ainsi pour objet les composés de la formule (I)
dans laquelle R5 est choisi parmi les groupements
O O II
— NH R. c- -NH — R, ou
dans laquelle R2 est un groupement alkyle en C1-C3 dans laquelle X peut être Cl, Br, ou F dans laquelle n est compris entre 1 et 3, sous la forme E, Z, ou un mélange des deux formes d'isomères.
Dans les composés de la formule (I), R2 désigne préférentiellement un groupement méthyle, X est préférentiellement chlore, n est de préférence égal à 2.
La présente invention a tout particulièrement pour objet les composés de la formule (T) telle que définie ci-dessus, répondant aux formules suivantes : 3-pSf-(3,5-dichlorophényl)-pyrτol-2-yl]-5-acétylamino-indolin-2-one 3-[N-(3-chlorophényl)-pyrrol-2-yl]-5-acétylamino-indolin-2-one
Les produits de formule générale (I), dans lesquels R5, et X et n sont décrits comme précédemment, peuvent être obtenus par couplage d'une indolin-2-one de formule générale (II), dans laquelle R5 est décrit comme précédemment, avec un N-phényl- pyrrol-2-carboxaldéhyde de formule générale (III), dans lequel X et n sont décrits comme précédemment, selon le schéma ci-dessous :
(II) (III) (I)
La réaction de couplage s'effectue généralement dans les conditions décrites par E. Knoevenagel (Chem. Ber. 1900, 23, 172), à savoir dans un solvant protique comme le méthanol ou l'éthanol, en présence d'une quantité catalytique de base organique telle que la pipéridine, à une température comprise entre 20°C et la température de reflux du solvant utilisé. Les indolin-2-ones de formule générale (13) et les N-phényl-pyrrol-2-carboxaldéhyde de formule (Lïï), dans lesquels respectivement R5, X et n sont décrits comme précédemment, sont soit commerciaux soit préparés selon les conditions décrites dans la littérature. Les composés de la présente invention tels que définis ci-dessus possèdent des propriétés antimitotiques par inhibition de la polymérisation de tubuline en microtubules qui sont des composants clés dans l'établissement du fuseau mitotique lors de la division cellulaire. Ainsi, les molécules interférant avec la polymérisation de la tubuline sont susceptibles de limiter les proliférations cellulaires inopportunes telles que celles observées dans les cancers.
Les composés de la présente invention possèdent en plus de leurs propriétés inhibitrices spécifiques de la tubuline, des effets cellulaires tels que des propriétés antiprolifératives et antivasculaires. Les composés de la présente invention sont notamment utiles dans le cadre de thérapie de tumeurs primaires de cancers. Ces propriétés justifient leur application en thérapeutique et l'invention a particulièrement pour objet à titre de médicaments, les produits de la formule (I) telle que définie ci-dessus dans un milieu pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être administrées par voie buccale, par voie parentérale ou par voie locale en application topique sur la peau et les muqueuses ou par injection par voie intraveineuse ou intramusculaire. Ces compositions peuvent être solides ou liquides et se présenter sous toutes les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine comme, par exemple, les comprimés simples ou dragéifiés, les pilules, les tablettes, les gélules, les gouttes, les granulés, les préparations injectables, les pommades, les crèmes ou les gels. Elles sont préparées selon les méthodes usuelles. Le principe actif peut y être incorporé à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants, ou émulsifiants, les conservateurs.
La posologie usuelle, variable selon le produit utilisé et le sujet traité peut être, par exemple, de 0,05 à 5 grammes par jour chez l'adulte.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter : Exemple 1 : 3-[N-(3,5-dichlorophényl)-pyrrol-2-yl]-5-acétylamino-indolin-2-one
A une solution de 2,12 g (11 mmoles) de 5-acétylamino-indolin-2-one dans 220 mL d'éthanol contenant 0,5 mL de pipéridine, on ajoute 2,68 g (11 mmoles) de 3-[N- (3,5-dichlorophényl)-pyrrole-2-carboxaldéhyde. Le milieu réactionnel est porté au reflux pendant 3 heures. Après refroidissement, le précipité formé est essoré, lavé par 2 fois 5 mL d'éthanol glacé et séché sous pression réduite. On obtient ainsi 1,81 g (40 %) de 3-[N-(3,5-dichlorophényl)-pyιτol-2-yl]-5-acétylamino-indolin-2-one, sous forme d'un solide jaune dont la caractéristique est la suivante : point de fusion = 267°C.
Exemple 2 : 3-[N-(3-cMorophényl)-pyrrol-2-yl]-5-acétylamino-indolin-2-one
En opérant comme à l'exemple 1, mais à partir de 1,05 g (5 mmoles) de 5-acétylamino-indolin-2-one dans 150 mL d'éthanol et de 0,95 g (10 mmoles) de 3-[N-(3-chlorophényl)-pyrrole-2-carboxaldéhyde, on obtient 0,32 g (17 %) de 3-[N- (3-chlorophényl)-pyrrol-2-yl]-5-acétylamino-indolin-2-one, sous forme d'un solide orange dont la caractéristique est la suivante : point de fusion = 251°C.
Exemple 3 : Synthèse en parallèle de 3-(aryl)méthylène-indolin-2-one de formule générale (I)
Dans un réacteur magnétique chauffant avec condenseur Zymark, de type STEM RS2050 contenant 25 puits en parallèle munis chacun d'un tube en verre de 50 mL, on introduit 0,5 mmole d'indolyl-2-one de formule générale (11), 0,5 mmole d'un aldéhyde aromatique de formule générale (III), 5 mL d'éthanol et 1 goutte de pipéridine. Le milieu réactionnel est porté au reflux pendant une nuit. Après refroidissement, et dilution avec 5 mL d'eau, le précipité formé est essoré et séché sous pression réduite. On obtient ainsi les 3-(aryl)méthylène-indolin-2-ones de formule générale (I), qui peuvent être représentées, à titre non limitatif par le 3-[N- (3,5-dichlorophényl)-pyrrol-2-yl]-indolin-2-one-5-yl-N-méthylcarboxamide (exemple 3-1).
Exemple 4 : Evaluation de l'inhibition de polymérisation de la tubuline
La tubuline est purifiée à partir de cerveaux de porc (Shelanski et al, 1973, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 70, 765-768. Weingarten et al, 1975, Proc. Natl. Acad.
Sci.USA, 72, 1858-1862). Brièvement, les cerveaux sont broyés et centrifugés dans un tampon d'extraction. La tubuline présente dans le surnageant de l'extrait subit deux cycles successifs de polymérisation à 37°C et dépolymérisation à 4°C, avant d'être séparée des MAPs (Microtubule Associated Proteins) par chromatographie sur colonne de phosphocellulose Pl i ( hatman). La tubuline ainsi isolée est pure à plus de 95 %. Elle est conservée dans un tampon nommé RB/2 30 % glycerol de composition MES-NaOH [2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid] 50 mM, pH6.8 ; MgCl2 0.25 mM ; EGTA 0.5 mM ; glycerol 30 % (v/v), GTP (guanosine-5 '-tri- phosphate) 0.2mM.
La polymérisation de la tubuline en microtubules est suivie par turbidimétrie : la tubuline est ajustée à une concentration de 10 μM dans le tampon RB/2 30 % glycerol auquel on ajoute 1 mM GTP et 6 mM MgCl2. La polymérisation est déclenchée par une augmentation de la température de 6°C à 37°C dans une cuve de 1 cm de trajet optique, placée dans un spectrophotomètre UNTKON 931 (Kontron) équipé d'un porte-cuve thermostaté. L'augmentation de la turbidité de la solution est suivie à 350 nm. Les produits à tester sont mis en solution à 10 mM dans le DMSO et ajoutés à des concentrations variables (0.5 à 10 μM) à la solution de tubuline avant polymérisation. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition de la polymérisation par rapport aux contrôles. La CI50 est définie comme la concentration de produit qui inhibe de 50 % la vitesse de polymérisation de la tubuline.
Mesure de l'inhibition de la polymérisation de la tubuline en fonction des composés de formule (I)
On considère comme très actif un produit dont la CI50 est inférieure ou égale à 3 μM. Sur les trois composés testés, ceux portant deux résidus chlore semblent plus actifs.
Exemple 5 : Evaluation de l'inhibition de prolifération de cellules HeLa
On évalue la prolifération des cellules HeLa en mesurant l'incoφoration de [I4C]- thymidine de la façon suivante. Les cellules HeLa (cellules épithéliales tumorales d'origine humaine) sont cultivées dans un milieu DMEM (Gibco) qui contient 10 % de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur et des antibiotiques (pénicilline 1 %, streptomycine 1 %). Pour effectuer le test de prolifération, on ensemence les cellules dans des microplaques cytostar 96 puits (Amersham), à raison de 5000 cellules par puits. On ajoute ensuite la [14C] -thymidine (0.1 μCi/puits) et les composés à évaluer à des concentrations variant jusqu'à 10 μM ; le DMSO utilisé pour solubiliser les composés ne doit pas excéder 0.5 % dans le milieu. 48 heures après incubation à 37°C, on mesure la radioactivité incoφorée dans les cellules par comptage de la plaque dans un compteur TRI-LUX (Wallac). Les résultats sont exprimés en % de coups incoφorés dans les cellules en présence de composés par rapport au témoin de prolifération.
La CI50 est définie comme la concentration de produit qui diminue de 50 % la radioactivité par rapport à un contrôle non traité.
Mesure de l'inhibition de prolifération de cellules HeLa en présence de composés de formule (I)
On considère qu'un produit dont la CI50 est inférieure à lμM est cytotoxique
Parmi les deux composés testés, le composé 1 présente des caractéristiques intéressantes en ce qui concerne l'inhibition de la prolifération cellulaire. Exemple 6 : Evaluation de l'effet de détachement de cellules endothéliales HDMEC
L'évaluation du détachement des cellules endothéliales in vitro est déterminée de la façon suivante. Les cellules HDMEC (Human Dermal Microvascular Endothelial Cells, Promocell, c-122102) sont cultivées dans un milieu ECGM-MV qui contient 5 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, des facteurs de croissance (EGF 10 ng/mL, hydrocortisone 1 μg/mL, 0.4 % supplément de croissance avec héparine) et des antibiotiques (amphotéricine 50 ng/mL et gentamicine 50 μg/mL). Pour le test de détachement, les HDMEC sont ensemencées à 5000 cellules par puits dans des plaques 96 puits à fond clair (Costar) pré-adsorbées avec de la fibronectine (10 μg/mL) ou de la vitronectine (1 μg/mL) ou de la gélatine. Vingt-quatre heures plus tard, le milieu de culture est remplacé par du milieu ECGM-MV 0.1 % BSA (sérum albumine bovine) contenant les produits indiqués. Les concentrations testées sont 0,1-0,3 et 1 μM pour chaque produit. Après deux heures de traitement, les cellules sont marquées pendant une heure à la calcéine (1.6 μg/mL, Molecular Probes) dans du milieu ECGM-MV 0.1 % BSA. Les cellules détachées sont ensuite enlevées par lavage avec du milieu ECGM-MV 0.1 % BSA; 100 μl de milieu est ajouté à chaque puits. La fluorescence des cellules qui restent attachées au substratum du puits est comptée à l'aide d'un fluorimètre, Spectrafluor Plus (Tecan, excitation 485 nm, et émission 535 nm). Les données sont la moyenne de six échantillons différents et sont exprimées en pourcentage du contrôle (cellules non traitées).
Un effet de détachement cellulaire supérieur ou égal à 15 % est considéré comme significatif.
Le produit 1 a donc, en plus de propriétés d'inhibition de la tubuline et d'inhibition de la prolifération cellulaire des cellules HeLa testées, une action marquée sur le détachement de cellules endothéliales.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composé de formule (I)
dans laquelle R5 est choisi parmi les groupements :
O O
I l I I — NH C R2 C NH — R2 OU
dans laquelle R2 est un groupement alkyle en C1-C3 dans laquelle X peut être Cl, Br, ou F dans laquelle n est compris entre 1 et 3, sous la forme E, Z, ou un mélange des deux formes d'isomères.
2. Composé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que R2 est un groupement méthyle.
3. Composé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé par le fait que X est Cl.
4. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé par le fait que n est égal à 2.
5. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé par le fait qu'il est choisi parmi :
3-[N-(3,5-dicUorophényl)-pyrrol-2-yl]-5-acétylamino-indolin-2-one 3-[N-(3-chlorophényl)-pyrrol-2-yl]-5-acétylamino-indolin-2-one 3-[N-(3,5-dicUorophényl)-pyrrol-2-yl]-hdolm-2-one-5-yl-N-mémylcarboxamide.
6. Procédé de préparation des composés de formule (I) caractérisé par le fait que l'on soumet le composé de formule (ÏÏ) dans laquelle R5 est choisi parmi les groupements
O O
II II
— NH ' C - R-> -- C - -NH — R2 ou dans laquelle R2 est un groupement alkyle en Cj-C à une réaction avec un composé de formule (III)
dans laquelle X peut être Cl, Br, ou F dans laquelle n est compris entre 1 et 3.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que la réaction s'effectue en présence de pipéridine et d'éthanol au reflux.
8. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour son application comme médicament.
9. Composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable, un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
10. Médicament caractérisé par le fait qu'il contient au moins un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour son application thérapeutique dans le traitement des tumeurs primaires de cancers.
11. Médicament selon la revendication 9 pour son application dans le traitement du cancer par action inhibitrice sur la polymérisation de la tubuline en microtubules.
12. Médicament selon la revendication 9 pour son application dans le traitement du cancer par action inhibitrice de la prolifération cellulaire.
13. Médicament selon la revendication 9 pour son application dans le traitement du cancer par action de détachement de cellules endothéliales.
14. Médicament selon la revendication 9 pour son application dans le traitement di cancer par action antivasculaire.
15. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du cancer.
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