EP1358173A1 - Verfahren zur herstellung von optisch aktiven, propargylischen, terminalen epoxiden - Google Patents

Verfahren zur herstellung von optisch aktiven, propargylischen, terminalen epoxiden

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EP1358173A1
EP1358173A1 EP02706661A EP02706661A EP1358173A1 EP 1358173 A1 EP1358173 A1 EP 1358173A1 EP 02706661 A EP02706661 A EP 02706661A EP 02706661 A EP02706661 A EP 02706661A EP 1358173 A1 EP1358173 A1 EP 1358173A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
propargylic
alcohol dehydrogenase
carried out
base
reduction
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02706661A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas A. Schubert
Werner Hummel
Michael Müller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Publication of EP1358173A1 publication Critical patent/EP1358173A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07F7/083—Syntheses without formation of a Si-C bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/07—Optical isomers

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of optically active, propargyli Service, terminal epoxides according to the preamble of claim 1.
  • Optically active, propargylic, terminal epoxides are important intermediates in the synthesis of natural and active substances (e.g. HMG-CoA reductase inhibitors in K. Takahashi, T. Minami, Y. Ohara, T. Hiyama, Bull. Chem Soc. 1995, 68, 2649).
  • Optical purity is one of the most important target values in the representation of these chiral compounds.
  • the low optical purity (ee's of 66 - 88%) and the moderate overall yield of 20 - 30% (which does not include the synthesis of the starting compound) are the most serious disadvantages of this method.
  • the reaction procedure also has disadvantages, since it is not possible, for example, to recover the chiral auxiliary.
  • the applicability has only been shown to a very limited extent so that transferability to a wide range of functional groups has not been tested.
  • the ee values of the alcohols obtained are low to moderate (42 - 80%), which is why the chiral alcohols are not suitable for use in natural and active ingredient synthesis.
  • no example of the reduction of a ketone which is substituted on the triple bond is described for TE-ADH.
  • the predominantly moderate ee values and the poorly predictable configuration of the products make the reduction using TE-ADH unsuitable for targeted natural product synthesis, especially since the literature does not describe TE-ADH reduction of ketones with substituted triple bonds.
  • Table 1 Substrates according to the invention with the activity of LB-ADH and the enantiomeric excess and the configuration of the products (alcohol) in% for -halogenated substrates.
  • Table 2 Comparison of ⁇ -halogen-substituted substrates with structurally identical, non- ⁇ -halogen-substituted substrates.
  • Table 3 Activities of LB-ADH with other alkynones.
  • Table 4 Substrates of the LB-ADH with which a formal reversal of the configuration occurs.
  • Figure 1 A reaction scheme for the application of the formal configuration reversal for the representation of both enantiomers of propargyli- see terminal epoxides.
  • Tables 1 to 5 list the activities of Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase and further oxidoreductases in% based on the standard specified in each case.
  • Nb means "not determined”.
  • an ⁇ -halogen-substituted propargyl ketone is reduced to an alcohol by means of an alcohol dehydrogenase, after which a ring closure to give a propargylic epoxide takes place by reaction with a base with elimination of the corresponding hydrohalic acid.
  • the alcohol dehydrogenase can, for example, from thermophilic microorganisms, such as. B. Thermoanaerobium brockii or Thermoanaerobacter ethanolicus, from horse liver or from Lactobacillus, preferably Lactojbacillus brevis or Lactobacillus kefir, preferably recombinantly.
  • the corresponding muteins which can be expressed by an allele, homolog or derivative of the associated nucleotide sequence, are also intended to be included.
  • alcohol dehydrogenases of Lactobacillus brevis and Lactobacillus kefir it is also possible to use biologically active parts, a modified form (for example to increase the temperature stability), isoenzymes or mixtures thereof.
  • modified enzymes alcohol dehydrogenases, preferably from Lactobacillus, are preferred
  • Lactobacillus brevis or Lactobacillus kefir in which there are changes in the sequence, for example at the N- and / or C-terminus of the polypeptide or in the range of conserved amino acids, without however impairing the function of the enzyme. These changes can be made by exchanging one or more amino acids according to known methods.
  • Isoenzymes are understood to mean enzymes with the same or comparable substrate and activity specificity, but which have a different primary structure.
  • the alcohol dehydrogenase which is preferably obtained from horse liver or thermophilic microorganisms (such as thermo- anaerobium brockii or Thermoanaerobacter ethanolicus) or from Lactobacillus, and in a particularly preferred embodiment is recompressively overexpressed in Escherichia coli, converts the compounds of general formula 1. If the reaction is not carried out in a whole cell transformation, a cofactor such as NAD (P) H is added.
  • a cofactor such as NAD (P) H is added.
  • Formula 1 shows the course of the reaction for the process according to the invention, in which R 1 is a radical R, R 2
  • Halogen preferably chlorine or bromine
  • ADH is an alcohol dehydrogenase, preferably from Lactobacillus, preferably Lactobacillus brevis or Lactobacillus kefir, and can be used as an isolated enzyme, as a cell-free crude extract or in a whole cell transformation
  • the base is preferably an amine base or amidine -Base, preferably DBU.
  • the alcohols and epoxides are advantageously formed in enantiomerically pure form (ee> 99%).
  • the epoxides are obtained from commercially available starting materials, starting from a step upstream of formula 1, shown in only three synthesis steps.
  • the epoxides are formed in good overall yield (70-90% based on the reduction and epoxidation), so that the process according to the invention is particularly economical.
  • Chirality is introduced by means of a catalytic reaction, and the work-up can be carried out simply and efficiently by extraction.
  • a large number of alkynones can be used for the synthesis according to the invention, which differ in a variety of substituents on the triple bond. These substituents can also include reactive functional groups. The results are shown in Table 3.
  • Halogen preferably ⁇ -chloro or ⁇ -bromo-substituted propargyl ketone, as shown in formula 2, reduced.
  • the reduction is catalyzed by an alcohol dehydrogenase, preferably from Lactobacillus, preferably Lactobacillus brevis or Lactobacillus kefir.
  • the conversion is highly enantioselective, which reduces the prochiral, propargyl ketones to alcohols with an ee> 99%.
  • substituents and functional groups can be used on the triple bond of the ketone, and compounds with reactive functional groups without side reactions are also reduced in 100% conversion to the desired products. This large tolerance to substituents on the triple bond opens up a general approach to
  • ⁇ -Halogen-substituted propargyl alcohols form the intermediate stage of the present process.
  • Various ⁇ -chloro or ⁇ -bromo-substituted propargyl ketones (formula 2) with the alcohol dehydrogenase from Lactobacillus brevis have been implemented (Table 1).
  • this enzyme showed a high reduction activity.
  • the ketones were then preparatively reduced to the corresponding alcohols in 100% conversion in batches.
  • the cofactor regeneration can take place via a coenzyme (e.g. formate dehydrogenase, formate).
  • the cofactor NADPH can be regenerated by the LB-ADH itself in the presence of a secondary alcohol (e.g. i-propanol).
  • a secondary alcohol e.g. i-propanol
  • many enzymes of the halogen ketones used here can be alkylated and thus inhibited or deactivated, which causes problems when using coenzymes.
  • the previously determined high levels of activity could be confirmed in all batch approaches.
  • the characterization of the propargylic alcohols showed an ee> 99%.
  • a comparison of the activities with the chlorinated and the corresponding non-chlorinated ketones showed that the activity is surprisingly reduced by only a maximum of 50% by an ⁇ -chloro substituent (see Table 2).
  • the radical R 1 is a component from the group consisting of saturated or unsaturated aliphatic, aromatic or heteroaromatic hydrocarbons, which can be mono- or polysubstituted, where the substituents are alkyl (for example straight-chain, branched, saturated, unsaturated, cyclic alkyl), aryl (for example phenyl, tosyl, naphthyl, condensed aromatic, heteroaromatic) or aralkyl groups or heteroatoms, such as. B. F, Cl, Br, I or 0, S, P, N or combinations thereof.
  • the radical R 1 can be a component from the group of the silyl compounds (for example trialkylsilyl, dialkyl arylsilyl, diarylalkylsilyl), the carbonyls (for example esters), the amines (for example tert. Amine, sec amine, prim. A in, cyclic amine) or a proton.
  • the silyl compounds for example trialkylsilyl, dialkyl arylsilyl, diarylalkylsilyl
  • the carbonyls for example esters
  • the amines for example tert. Amine, sec amine, prim. A in, cyclic amine
  • R 2 can be a component from the group of the halogens, preferably Cl and Br.
  • the reduction is characterized by a very wide range of substrates because all of the propargylic ketones we use, which carry a wide variety of substituents and functional groups R 1 on the triple bond, have been converted.
  • the reduction can be carried out in a temperature range between 0 ° C. and 90 ° C., preferably 5-70 ° C., particularly preferably 15-40 ° C.
  • the pH can be between 4 and 10, ideally it is 5-8, preferably 6.5.
  • the enzymatic reaction can be carried out in aqueous solution, but organic solvents, preferably water-soluble solvents, preferably low-chain alcohols, preferably i-propanol or ethanol, can also be added.
  • organic solvents preferably water-soluble solvents, preferably low-chain alcohols, preferably i-propanol or ethanol, can also be added.
  • the admixture can be up to about 30% of the organic solvent and has the consequence that the organic reaction components are better dissolved.
  • the enzymatic reaction can also be carried out without a solvent, e.g. B. in the gas phase.
  • Suitable bases are, for example, metal organyls, preferably lithium organyls (for example n-butyl lithium), alcoholates (for example potassium butylate), amides (for example LDA).
  • the deprotonation is carried out in a preferably inert, non-protic organic solvent, for example ethers (for example diethyl ether, THF) or alkanes (for example pentane, hexane) at a temperature in a range from preferably - 150 ° C. to 50 ° C, particularly preferably -80 ° C to 10 ° C, performed.
  • any substituent can be introduced at position R 1 ' .
  • the enzymatic reduction of the propargylic ⁇ -halogen ketones can also be carried out with other oxidoreductases.
  • Both horse liver ADH (HL-ADH), T ermoanaerojbium jbrocJii-ADH (TB-ADH), Candi da boidinii-ADH (CB-ADH) and Candida parapsilosis carbonyl reductase (CPCR) reduce, for example, 4-phenyl-l-chlorine -3-butin-2-one and 4- t-butyldimethylsilyl-l-chloro-3-butin-2-one to the corresponding alcohol (see Table 5). With all of the enzymes listed, the activity could be confirmed in batch batches by demonstrating the formation of the chiral propargylic alcohols by chromatography and spectroscopy.
  • the second and final step of the present process is the conversion of the enantiomerically pure alcohol into the epoxide.
  • Bases which can be used are, for example, hydroxides, alcoholates, cyanide ions, amine bases, such as primary, secondary or tertiary amines, cyclic amines, amidine bases such as DBN or preferably DBU, or generally preferably mild bases.
  • the reaction is successful using DBU as a gentle base at room temperature and proceeds with 100% conversion (see formula 3).
  • the isolated yield is 60-80%. All tested substituents and functional groups on the triple bond are stable under the very mild conditions.
  • the ⁇ -halogenated, propargylic alcohols (accessible through the enzymatic reduction in a large variety) can be used for the formation of epoxides, so that the reaction has general applicability.
  • the reaction proceeds without racemesis, whereby the ee of> 99% is retained.
  • this reaction step is generally applicable, gives good to high yields under mild conditions and there is no racemization.
  • the radical R 1 is a component from the group consisting of saturated or unsaturated aliphatic, aromatic or heteroaromatic hydrocarbons, which can be mono- or polysubstituted, where the substituents are alkyl (for example straight-chain, branched, saturated, unsaturated, cyclic alkyl), aryl (for example phenyl, tosyl, naphthyl, condensed aromatic, heteroaromatic) or aralkyl groups or heteroatoms, such as. B. F, Cl, Br, I or 0, S, P, N or combinations thereof.
  • radical R 1 is a component from the group of the silyl compounds (for example trialkylsilyl, dialkyl arylsilyl, diarylalkylsilyl), the carbonyls (for example esters), the amines (for example tert. amine, sec amine, primary amine, cyclic Amine) or a proton.
  • silyl compounds for example trialkylsilyl, dialkyl arylsilyl, diarylalkylsilyl
  • the carbonyls for example esters
  • the amines for example tert. amine, sec amine, primary amine, cyclic Amine
  • R 2 can be a component from the group of the halogens, preferably Cl and Br.
  • the reaction can be carried out in numerous solvents.
  • water and aqueous buffer systems or a protic or aprotic solvent or a solvent mixture are suitable, but the reaction can also take place without a solvent (for example in the gas phase).
  • the intermediate stage of the epoxide was detected by GC-MS, but is immediately implemented in situ.
  • NMR spectra AMX-300 ( 1 H: 300 MHz, 13 C: 75.5 MHz) from Bruker Physik AG. Chemical shifts are reported in ppm relative to CHC1 3 as the internal standard.
  • GC Chrompack CP9002 with an FS-Cyclodex-ß-I / P (CS GmbH) and a Lipodex E column (Macherey-Nagel).
  • HPLC Hewlett Packard Series 1100 with a Chiracel OB and a Chiralpak AD column (Daicel Chem. Ind.) At 20 ° C, 0.5 ml / min.
  • the propargyl ketones were prepared using methods known from the literature.
  • the synthesis can be carried out via deprotonation of a terminal alkyne with subsequent coupling of a Weinreb amide (S. Nahm, SM Weinreb, Tetrahedron Lett. 1981, 22, 3815), via the coupling of a trimethylsilyl-substituted alkyne with a Acid chloride (L. Birkofer, A. Ritter, H. Uhlenbrauck, Chem. Ber. 1963, 96, 3280) and the oxidation of the corresponding alcohol (K. Bowden, IM Heilbron, ERH Jones, BCL Weedon, J. Chem. Soc 1946, 39).
  • Enzyme Assays For the photometric determination of the enzyme activity, the following solutions were combined and the decrease in absorbance at 340 nm was followed ( ⁇ N AD (P) H 6.22 L mol "1 cm “ 1 ), 20 ° C: 970 ⁇ L solution of the Ketones in TEA / NaOH buffer (5 M ketone [2 mM for aromatically substituted alkinones due to the lower solubility], 100 mM TEA, ImM MgCl 2 ) pH 7.0, 20 ⁇ L
  • NAD (P) H (12.5 mM) and 10 ⁇ L enzyme solution.
  • the initial decrease in absorbance was recorded and set relative to the values of the standard substrate 5-oxo-hexanoic acid ethyl ester.
  • the ketone (1 mmol) was at RT with 50 mg NADP + , 1.5 mL i-propanol and 50 U LB-ADH (1 U enzyme reduced 1 ⁇ mol substrate per minute) in 100 mL TEA / NaOH buffer (100 mM TEA, 1 mM MgCl 2 ; pH 6.5) stirred. After 16 h the reaction mixture was extracted with CH 2 C1 2 (3 x 40 mL). The combined organic phases were dried over sodium sulfate, concentrated in vacuo and chromatographed on silica gel (hexane / ethyl acetate).
  • the propargyl ketone (10 ⁇ mol) and 0.2 mg NaBH 4 (5 ⁇ mol) were stirred in 1 ml EtOH at 0 ° C. for 1 h.
  • the reaction mixture is hydrolyzed with 1 M HC1 (1 ml), saturated NaCl solution (4 ml) is added and the reaction mixture is extracted with CH 2 C1 2 (1 ml). All alcohols were obtained in 100% conversion.
  • Enzyme-catalyzed reduction of propargylic alcohols (analytical scale): The ketone (10 ⁇ mol) was at RT with 0.5 mg NAD (P) + , 15 ⁇ L 2-propanol (with HL-ADH: 12 ⁇ L ethanol) and 0.5 U enzyme in 1 mL TEA / NaOH buffer (100 M TEA, 1 mM MgCl 2 ; pH 6.5) carefully shaken. After 16 h the reaction mixture was extracted with 200 ⁇ L CH 2 C1 2 . The analysis of the approaches was carried out as described above; the activities, configurations and ee values of the alcohols are given in Tables 1-5.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enantioselektiven Darstellung von optisch aktiven, propargylischen, terminalen Epoxiden. Erfindungsgemäss werden im ersten Schritt des Verfahrens Verbindungen der Formel 1 mit einer Alkoholdehydrogenase, die bevorzugt aus Pferdeleber oder thermophilen Mikroorganismen (wie z. B. Thermoanaerobium brockii oder Thermoanaerobacter ethanolicus ) oder aus <i >Lactobacillus stammt und in Escherichia coli rekombinant überexpremiert wird, in Anwesen heit von NAD (P) H umgesetzt. Bei dieser Reaktion wird die Oxogruppe enantioselektiv reduziert. Da sowohl ( S ) - Als auch ( R ) -selektive Oxidoreduktasen eingesetzt werden können, ist die Synthese beider Enantiomere möglich. Die Darstellung beider Enantiomere unter Verwendung des selben Enzyms gelingt mit der Alkoholdehydrogenase aus <i>Lactobacillus brevis , da diese Verbindungen m it R<1> = H und Verbindungen mit R<1> = H zu Alkoholen mit entgegengestezter Konfiguration umsetzen. Im zweiten Schritt des Verfahrens wird der alpha -halogenierte Alkohol mittels einer Base in das enantiomereine Epoxide überführt.

Description

B e s c h r e i b u n g
Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven, propargylisehen, terminalen Epoxiden
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven, propargylisehen, terminalen Epoxiden nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
Optisch aktive, propargylische, terminale Epoxide stellen wichtige Zwischenprodukte bei der Synthese von Natur- und Wirkstoffen dar (z. B. HMG-CoA-Reduktase Inhibitoren in K. Takahashi, T. Minami, Y. Ohara, T. Hiyama, Bull . Chem . Soc . Jpn . 1995, 68 , 2649). Bei der Darstellung dieser chiralen Verbindungen ist die optische Reinheit eine der wichtigsten Zielgrößen.
Für die Herstellung von chiralen, nicht racemischen propargylisehen, terminalen Epoxiden sind nach dem Stand der Technik bereits einige Verfahren bekannt.
In M. opp, T. Kanger, A. Müraus, T. Pehk, Ü. Lille, Tetrahedron : Asymmetry 1991, 2, 943 wird die Synthese von (R) -1- t-Butyldimethylsilyl-3 , 4-epoxy-but-l-in beschrieben. Es handelt sich hierbei um ein Verfahren, das von ( S, S) - (+) -2 , 3-O-isopropyliden-L-threitol (einem Weinsäure-Derivat) ausgeht, welches in 6 unabhängigen und teilweise sehr aufwendigen Syntheseschritten in das Epoxid überführt wird. Das Produkt hat einen Enantiome- renüberschuß (ee > 99 % und die Gesamtausbeute beträgt 20 %. Da die Chiralität bereits auf der ersten Synthe- sestufe eingeführt wird, gehen insgesamt 80 % der eingesetzten optischen Aktivität im Verlauf der Darstellung wieder verloren. Die Synthese ist sowohl in der oben aufgeführten Originalveröffentlichung sowie in der nachfolgenden Veröffentlichung T. Kanger, P. Niidas, A.-M. Müürisepp, T. Pehk, M. Lopp, Tetrahedron: Asym- metry 1998, 9, 2499 lediglich mit der t-Butyldimethyl- silyl-Gruppe als Substituent durchgeführt worden.
Nachteilig hierbei sind die hohe Zahl von Syntheseschritten (6) , die mäßige Gesamtausbeute (20 %) und das frühe Einführen der optischen Aktivität, die Verbesserungen zu wünschen übrig lassen. Die Anwendbarkeit wurde bisher nur für ein einziges Beispiel gezeigt, so daß keine universelle Anwendbarkeit des Verfahrens zu erkennen ist.
In R. Sanchez-Obregon, B. Ortiz, F. Walls, F. Yuste, J. L. Garcia Ruano, Tetrahedron : Asymmetry 1999, 10, 947 wird ein weiteres Verfahren beschrieben, in dem (kommerziell nicht erhältliche) propargylische Ester und (R) - (+) -Methyl p-tolylsulfoxid zu ß-Ketosulfoxiden umgesetzt werden und die entstandene Ketofunktion dia- stereoselektiv syn bzw. anti reduziert wird. Abschlie- ßend wird das Sulfoxid reduziert und die Verbindung durch Abspalten der Sulfid-Gruppe in das Epoxid überführt. Der schwerwiegendste Nachteil dieses Verfahrens ist der niedrige ee der dargestellten Epoxide, da die erzielten Enantiomerenüberschüsse bei nur 66 - 78 % liegen. Selbst beim besten aufgeführten Beispiel konnten nur 88 % ee erreicht werden, welche für eine Anwendung in der WirkstoffSynthese bei weitem nicht ausrei- chend sind. Auch die Gesamtausbeute ist mit 20 - 30 %, die Darstellung der propargylisehen Ester nicht mit einbezogen, eher mäßig zu beurteilen. Weiterhin handelt es sich um ein Verfahren, bei dem die Rückgewinnung der abgespaltenen chiralen Hilfsgruppe nicht möglich ist.
Als Substituenten an der Dreifachbindung sind lediglich die Reste Phenyl, Methyl und n-Propyl getestet worden, die alle keine funktioneilen Gruppen enthalten.
Die geringe optische Reinheit (ee's von 66 - 88 %)und die mäßige Gesamtausbeute von 20 - 30 % (bei der die Synthese der Ausgangsverbindung nicht mit einbezogen ist) sind die gravierendsten Nachteile dieser Methode. Auch die Reaktionsführung bedingt Nachteile, da bei- spielsweise eine Rückgewinnung des chiralen Auxiliars nicht möglich ist. Die Anwendbarkeit wurde bisher nur stark eingeschränkt gezeigt, so daß eine Übertragbarkeit auf ein breites Spektrum von funktioneilen Gruppen nicht getestet ist.
Der Anmelderin ist lediglich ein einziger optisch aktiver α-Chlor- bzw. Brom-substituierter, propargylischer Alkohol in der Literatur bekannt. In C. J. H. Helal , P. A. Magriotis, E. J. Corey, J. Am. Chem. Soc . 1996, 118 , 10938 wird l-Chlor-4-tri-i-propylsilyl-3-butin-2- on mit 0.05 Äquivalenten eines Oxazaborolidin-Kataly- sators und 1.2 Äquivalenten Catecholboran in Dichlor- methan zu dem entsprechenden Alkohol reduziert. Die Synthese verläuft nicht absolut enantioselektiv (ee = 95 %) bei einer Ausbeute von 97 %. Die sterisch anspruchsvolle Tri-i-propylsilylgruppe ist notwendig, um den ee von 95 % zu erreichen, da in derselben Veröf- fentlichung gezeigt wurde, daß z. B. beim entsprechenden nicht chlorierten Keton der Austausch der Tri-i- propylsilylgruppe gegen die gängigere Trimethylsi- lylgruppe eine deutliche Verschlechterung des Enantio- merenverhältnisses von 39 : 1 (ee = 95 %) auf 14 : 1 (ee = 87 %) zur Folge hat. Auch in zwei weiteren von Corey et al . aufgeführten Beispielen wird diese Tendenz bestätigt .
Nachteilhafterweise ist der Alkohol nicht enantiomeren- rein und ein sterisch anspruchsvoller Substituent an der Dreifachbindung ist notwendig, um einen ee von 95 % zu erreichen. Weiterhin wurde die Reaktion nur an einem einzigen Beispiel gezeigt.
In C. W. Bradshaw, W. Hummel, C.-H. Wong, J". Org. Chem. 1992, 57, 1532 sowie im United States Patent 5,342,767 von C.-H. Wong, C. W. Bradshaw Aug. 30, 1994 wird die Aktivität der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir bei der Reduktion von Ketonen beschrieben. Die Aktivität des Enzyms bei dem Substrat l-Chlor-4-tri- methylsilyl-3-butin-2-on wird mit 52 % bezogen auf den Standard l-Phenoxy-2-propanon angegeben. Dieser Wert wurde in einem UV-Assay bestimmt. Es handelt sich hier- bei um einen indirekten Nachweis, bei dem lediglich die Abnahme von NADPH verfolgt wird. Eine hierbei möglicherweise beobachtete Nebenreaktion wird in D. D. Tanner, A. R. Stein, J\ Org. Chem . 1988, 53 , 1642 und in L. M. Aleixo, M. de Carvalho, P. J. S. Moran, J. A. R. Rodrigues, Bioorg. Med . Chem . Let t . 1993, 3 , 1637 beschrieben. In beiden Arbeiten konnte gezeigt werden, daß bei der Umsetzung von α-Halogenketonen mit Oxidoreduktasen über einen Radikalmechanismus die ent- halogenierten Ketone gebildet werden können. Auch bei dieser Reaktion wird NAD(P)H verbraucht und damit Aktivität im UV-Assay gemessen, ohne daß jedoch zwingend der gewünschte Alkohol entsteht. Die tatsächliche Bildung des halogenierten Alkohols ist somit von Bradshaw et al . nicht nachgewiesen worden. Dementsprechend konnte auch keine Bestimmung der optischen Reinheit erfolgen oder eine andere Charakterisierung des Produktes bezüglich Stabilitäten etc. durchgeführt werden.
In C. Heiss, R. S. Phillips, J. Chem. Soc . , Perkin Trans . 1 2000, 2821 wird zum ersten mal von einer formalen Konfigurationsumkehr bei der Reduktion von pro- pargylischen Ketonen mit isolierten Oxidoreduktasen berichtet. Die Alkoholdehydrogenase aus Thermoanaerobacter ethanolicus TJS-ADH reduziert Ketone der allgemeinen Struktur:
Die Verbindungen mit den Resten R = Methyl (ee des gebildeten Alkohols = 60 %) , Εthyl (ee = 80 %) , Isopropyl (ee > 98 %) , t-Butyl (ee = 85 %) und Propyl (ee = 51 %) werden zu Produkten mit (S) -Konfiguration umgesetzt, während Ketone mit den Resten R = Isobutyl (ee = 50 %) , Neopentyl (ee = 66 %) , n-Butyl (ee = 42 %) , Isopentyl
(ee = 80 %) sowie diverse Keto-Εster (ee = 82 - > 98 %) zu (R) -konfigurierten Alkoholen reduziert werden. Nachteilig hierbei ist, daß die formale Konfigurationsumkehr nicht präzise definiert werden kann. Es ist lediglich bekannt, daß mit R = Propyl noch ( S) -konfiguriertes Produkt gebildet wird, während der größere Iso- butyl-Rest bereits zum (R) -Alkohol führt. Somit läßt sich für weitere mögliche Substrate, z. B. für Ketone mit halogenierten Alkyl-Resten, nicht eindeutig vorhersagen, wie sich das Substitutionsmuster auf die Stereoselektivität des Enzyms auswirkt. Die ee-Werte der er- haltenen Alkohole sind bis auf wenige Ausnahmen niedrig bis mäßig (42 - 80 %) , weshalb die chiralen Alkohole für den Einsatz in der Natur- und WirkstoffSynthese nicht geeignet sind. Weiterhin ist für TE-ADH kein Beispiel für die Reduktion eines Ketons beschrieben, das an der Dreifachbindung substituiert ist. Die überwiegend mäßigen ee-Werte und die schlecht voraussagbare Konfiguration der Produkte machen die Reduktion mittels TE-ADH für die gezielte NaturstoffSynthese ungeeignet, zumal in der Literatur keine TE-ADH Reduktion von Keto- nen mit substituierten Dreifachbindungen beschrieben sind.
In M. H. Ansari, T. Kusumoto, T. Hiyama, Tetrahedron Lett . 1993, 34 , 8271 wird die Reduktion von 3-Keto-4- pentinsäuremethylestern mit Bäckerhefe beschrieben.
Während das Derivat mit der terminalen Dreifachbindung in 46 % Ausbeute zu dem ( S) -Enantiomer (ee = 80 %) reduziert wird, führt die Reduktion des entsprechenden Ketons mit einem Tri ethylsilyl-Substituenten an der Dreifachbindung in 48 % Ausbeute zu dem (R) -Produkt (ee = 82 %) . Hierbei handelt es sich jedoch um eine Ganzzellbiotransformation, bei der die oben genannten Reduktionen vermutlich von unterschiedlichen Enzymen katalysiert werden. Es handelt sich somit um keine formale Konfigurationsumkehr bei Alkoholen, deren Synthese von derselben Oxidoreduktase katalysiert wird, sondern vielmehr um Produkte, die durch Reduktion eines Substrates durch zwei oder mehr Enzyme entstanden sind. Die dabei erzielten mäßigen Ausbeuten und optischen Reinheiten spiegeln ebenfalls wieder, daß vermutlich verschiedene Biokatalysatoren konkurrierend an der Re- duktion beteiligt sind.
Die Bildung eines propargylisehen, terminalen Epoxides aus einem α-Halogen-Alkohol ist bislang dreimal in der Literatur beschrieben worden. In allen drei Darstellun- gen werden jedoch racemische Verbindungen als Edukte verwendet. In M. R. Lespieau, Bull . Soc . Chim. Fr. 1928, 4, 203 wird l-Chlor-3-butin-2-ol mit KOH in Ether ohne Angabe zur Ausbeute zum Epoxid umgesetzt. Die gleiche Reaktion wird in H. Kleijn, J. Meijer, G. C. Overbeek, P. Vermeer, J. R . Neth . Chem. Soc . 1982, 101 , 97 beschrieben. Die Reaktion wird bei 70 °C durchgeführt und die Ausbeute beträgt 45 %. In D. Bernard, A. Doutheau, J. Gore, J. Moulinoux, V. Quemener, Tetra- hedron 1989, 45, 1429 wird 5-Amino-l-chlor-5-methyl-3 - hexin-2-ol mit t-BuOK in lediglich 5 % Ausbeute in das Epoxid überführt. Substrate mit empfindlicheren funkti- onellen Gruppen dürften aufgrund der stark basischen Bedingungen für die beschriebenen Reaktionen wenig geeignet sein, was deren allgemeine Anwendbarkeit stark einschränkt. Ein weiterer Nachteil ist die Tatsache, daß alle Beispiele bislang ausgehend von racemischen Edukten durchgeführt worden sind. Somit kann keine Aus- sage darüber getroffen werden, ob bei optisch aktiven Alkoholen durch die Einwirkung der verwendeten starken Basen eine Racemisierung eintritt. Die drei Verfahren sind mit Ausnahme eines Amin-Substituenten nicht für Substrate mit funktioneilen Gruppen getestet worden, und die Ausbeuten sind mit 5% bzw. 45% niedrig. Weiterhin sind die Synthesen ausschließlich an racemischen Edukten und Produkten durchgeführt worden.
Für nicht propargylisehe, terminale Systeme sind in der Literatur eine Vielzahl von Reaktionen beschrieben, bei denen α-Halogen-Alkohole in Epoxide überführt werden. Hierfür stehen eine große Bandbreite von Reagenzien zur Verfügung, die jedoch keine allgemeine Anwendbarkeit besitzen. Somit müssen für jede neue Epoxid-Bildung Bedingungen ausgearbeitet werden, die den entsprechenden Aktivierungsgrad, die Funktionalisierungen des Alkohols und mögliche Reaktivitäten der Substituenten berücksichtigen.
Den nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven, propargylisehen, terminalen Epoxiden ist gemeinsam, daß sie zu einer mäßigen bis niedrigen Gesamtausbeute bei teilweise geringem Enantiomerenüberschuß führen.
Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, ein Herstellungsverfahren für optisch aktive, propargylisehe, terminale Epoxide zu schaffen, welches in hoher Gesamtaus- beute einen hohen Enantiomerenüberschuß liefert. Das
Verfahren sollte daher in wenigen Synthesestufen, ver- bunden mit einer einfachen Aufarbeitung der Zwischenprodukte, zu den Epoxiden führen und somit die im Stand der Technik genannten Nachteile nicht aufweisen.
Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmale.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nunmehr mög- lieh, optisch aktive, propargylische, terminale Epoxide in hoher Gesamtausbeute und hohem ee herzustellen.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Im Folgenden soll die Erfindung erläutert und weitere Vorteile beschrieben werden.
Die Tabellen und die Figur zeigen Ergebnisse und ein Reaktionsschema für die formale Konfigurationsumkehr gemäß der Erfindung.
Es zeigt:
Tabelle 1: Erfindungsgemäße Substrate mit der Aktivi- tat von LB-ADH sowie dem Enantiomerenüberschuß und der Konfiguration der Produkte (Alkohol) in % für -halogenierte Substrate. Tabelle 2: Vergleich α-halogensubstituierter Substrate mit strukturgleichen nicht α-halogensub- stituierten Substraten.
Tabelle 3 : Aktivitäten der LB-ADH mit weiteren Alkinonen.
Tabelle 4: Substrate der LB-ADH, bei denen eine formale Konfigurationsumkehr eintritt.
Tabelle 5: Aktivitäten weiterer Oxidoreduktasen am
Beispiel des Substrates 4-t-Butyldimethyl- silyl-l-chlor-3-butin-2-on.
Figur 1: Ein Reaktionsschema für die Anwendung der formalen Konfigurationsumkehr zur Darstellung beider Enantiomere von propargyli- sehen, terminalen Epoxiden.
In den Tabellen 1 bis 5 werden die Aktivitäten von Lactobacillus brevis Alkoholdehydrogenase sowie weiterer Oxidoreduktasen in % bezogen auf den jeweils angegebenen Standard genannt .
Die Bezeichnung Nb bedeutet „nicht bestimmt".
Erfindungsgemäß wird ein α-halogensubstituiertes pro- pargylisches Keton mittels einer Alkoholdehydrogenase zu einem Alkohol reduziert, wonach durch Umsetzung mit einer Base unter Abspaltung der entsprechenden Halogenwasserstoffsäure ein Ringschluß zu einem propargyli- schen Epoxid erfolgt . Die Alkoholdehydrogenase kann beispielsweise aus thermophilen Mikroorganismen, wie z. B. Thermoanaerobium brockii oder Thermoanaerobacter ethanolicus, aus Pferdeleber oder aus Lactobacillus , vorzugsweise Lactojba- cillus brevis oder Lactobacillus kefir, vorzugsweise rekombinant, abstammen. Es sollen dabei auch die entsprechenden Muteine umfaßt sein, welche durch ein Al- lel, Homolog oder Derivat der zugehörigen Nucleotidse- quenz exprimiert werden können. Von den Alkoholdehydro- genasen von Lactobacillus brevis und Lactobacillus kefir können auch biologisch aktive Teile, eine modifizierte Form (z.B. zur Erhöhung der Temperaturstabilität) , Isoenzyme oder Mischungen davon eingesetzt werden. Unter modifizierten Enzymen sind Alkoholdehydroge- nasen, vorzugsweise aus Lactobacillus , vorzugsweise
Lactobacillus brevis oder Lactobacillus kefir, zu verstehen, bei denen Änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N- und/oder C-Terminus des Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne je- doch die Funktion des Enzyms zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können durch den Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren nach bekannten Methoden vorgenommen werden.
Unter Isoenzymen sind Enzyme mit gleicher oder vergleichbarer Substrat- und Wirkungsspezifität zu verstehen, die jedoch eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen.
Die Alkoholdehydrogenase, die bevorzugt aus Pferdeleber oder thermophilen Mikroorganismen (wie z. B. Thermo- anaerobium brockii oder Thermoanaerobacter ethanolicus) oder aus Lactobacillus stammt, und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform in Escherichia coli rekom- binant uberexpremiert wird, setzt die Verbindungen der allgemeinen Formel 1 um. Wird die Reaktion nicht in einer Ganzzelltransformation durchgeführt, so wird ein Cofaktor, wie beispielsweise NAD(P)H, zugesetzt.
Formelbild 1 zeigt den Reaktionsablauf für das erfin- dungsgemäße Verfahren, bei dem R1 ein Rest R, R2 ein
Halogen, vorzugsweise Chlor oder Brom ist, ADH eine Alkoholdehydrogenase, vorzugsweise aus Lactobacillus, vorzugsweise Lactobacillus brevis oder Lactobacillus kefir, ist und als isoliertes Enzym, als zellfreier Rohextrakt oder in einer Ganzzelltransformation eingesetzt werden kann, und die Base vorzugsweise eine Amin- Base oder Amidin-Base, vorzugsweise DBU ist.
ee>99%
Formelbild 1
Vorteilhafterweise werden die Alkohole und Epoxide in enantiomerenreiner Form (ee > 99%) gebildet. Die Epoxide werden aus kommerziell erhältlichen Edukten, ausgehend von einem dem Formelbild 1 vorgelagerten Schritt, in nur drei Synthesestufen dargestellt. Die Epoxide werden in guter Gesamtausbeute (70 - 90% bezogen auf die Reduktion und Epoxidierung) gebildet, so daß das erfindungsgemäße Verfahren besonders wirtschaftlich ist. Die Chiralität wird durch eine katalytische Reaktion eingeführt, wobei die Aufarbeitung durch Extraktion einfach und effizient durchgeführt werden kann. Für die erfindungsgemäße Synthese kann eine Vielzahl von Alkinonen eingesetzt werden, welche sich durch eine Vielfalt an Substituenten an der Dreifachbindung unterscheiden. Diese Substituenten können auch reaktive funktioneile Gruppen einschließen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
Im ersten Syntheseschritt des Verfahrens wird ein α-
Halogen-, bevorzugt α-Chlor- oder α-Brom- substituiertes propargylisches Keton, wie es in Formelbild 2 dargestellt ist, reduziert. Die Reduktion wird durch eine Alkoholdehydrogenase, vorzugsweise aus Lactobacillus, vorzugsweise Lactobacillus brevis oder Lactobacillus kefir, katalysiert. Die Umsetzung erfolgt hoch enantio- selektiv, wodurch die prochiralen, propargylisehen Ketone zu Alkoholen mit einem ee > 99 % reduziert werden. Hierbei können unterschiedlichste Substituenten und funktionelle Gruppen an der Dreifachbindung des Ketons eingesetzt werden, wobei auch Verbindungen mit reaktiven funktioneilen Gruppen ohne Nebenreaktionen in 100 % Umsatz zu den gewünschten Produkten reduziert werden. Diese große Toleranz gegenüber Substituenten an der Dreifachbindung eröffnet einen allgemeinen Zugang zur
Synthese von optisch aktiven, propargylisehen, terminalen Epoxiden. Da die enzymatische Reduktion durch kon- tinuierliche oder diskontinuierliche Extraktion aufgearbeitet wird, können die Alkohole in hohen Ausbeuten isoliert werden.
Rz = Halogen
ee > 99 %
Formelbild 2
Überraschenderweise führt die Reduktion von Propargyl- Ketonen mit einer terminalen Dreifachbindung (R1 = H, R2 ≠ H) , insbesondere bei der Verwendung von ADH aus Lactobacillus brevis, zu einer formalen Konfigurations- umkehr bei den Produkten. Auch diese Alkohole besitzen einen ee > 99 %. Die Dreifachbindung kann anschließend deprotoniert und mit vielfältigen Substituenten verknüpft werden. Durch diesen zusätzlichen Synthese- schritt ergibt sich ein einfacher Zugang zu beiden Enantiomeren propargylischer Alkohole in hohen optischen Reinheiten, wobei die Einführung der Chiralität jeweils vom selben Enzym katalysiert wird.
α-Halogen-substituierte Propargylalkohole bilden die Zwischenstufe des vorliegenden Verfahrens. In einem UV- Assay sind verschiedene α-Chlor- bzw. α-Brom-substi- tuierte Propargylketone (Formelbild 2) mit der Alkohol- dehydrogenase aus Lactobacillus brevis umgesetzt worden (Tabelle 1) . Bei allen von uns getesteten Alkinonen zeigte dieses Enzym eine hohe Reduktionsaktivität. Um die gemessenen Aktivitäten zu bestätigen, wurden die Ketone anschließend in Batch-Ansätzen präparativ zu den entsprechenden Alkoholen in 100 % Umsatz reduziert. Die Cofaktorregenerierung kann über ein Coenzym (z. B. Formiatdehydrogenase, Formiat) erfolgen. Alternativ kann der Cofaktor NADPH in Anwesenheit eines sekundären Alkohols (z. B. i-Propanol) von der LB-ADH selbst regeneriert werden. Hierdurch ergibt sich ein weiterer Vorteil, da viele Enzyme von den hier eingesetzten - Halogen-Ketonen alkyliert und dadurch inhibiert bzw. desaktiviert werden können, wodurch Probleme bei der Anwendung von Coenzymen entstehen. In allen durchgeführten Batch-Ansätzen konnten die zuvor bestimmten hohen Aktivitäten bestätigt werden. Die Charakterisierung der propargylischen Alkohole ergab einen ee > 99 %. Ein Vergleich der Aktivitäten bei den chlorierten mit den entsprechenden nicht-chlorierten Ketonen zeigte, daß die Aktivität durch einen α-Chlor-Substituenten überraschenderweise um nur maximal 50 % verringert wird (s. Tabelle 2) . Dies ist ein unerwartet gutes Ergebnis, da für die enzymatische Umsetzung α-halogensubstituierter Keton-Substrate geringere Aktivitäten erwartet werden, bzw. aufgrund des hohen Alkylierungspotentials der Substrate eine Deaktivierung der Alkoholdehydrogenase vermutet werden könnte. Weitere Substrat-Screenings (s. Tabelle 3) wurden daher mit den nicht-chlorierten pro- pargylischen Ketonen durchgeführt, da diese meist kostengünstiger zugänglich sind. Die hohen Aktivitäten [bei weiterhin einheitlichem ee von > 99 %] der unterschiedlichen nicht-chlorierten Substrate zeigen, daß auch bei diesen vielfältigen Substituenten an der Dreifachbindung die entsprechenden α-chlorierten bzw. α- bromierten Ketone für das vorliegende Verfahren verwendet werden könnten.
Der Rest R1 ist eine Komponente aus der Gruppe gesättigter oder ungesättigter aliphatischer, aromatischer oder heteroaromatischer Kohlenwasserstoffe, die einfach oder mehrfach substituiert sein kann, wobei die Substituenten Alkyl- (beispielsweise geradkettiges, verzweigtes, gesättigtes, ungesättigtes, cyclisches Alkyl), Aryl- (beispielsweise Phenyl-, Tosyl-, Naphthyl-, kon- densierter Aromat, Heteroaromat) oder Aralkyl-Gruppen oder Heteroatome, wie z. B. F, Cl , Br, I oder 0, S, P, N oder Kombinationen davon sein können. Weiterhin kann der Rest R1 eine Komponente aus der Gruppe der Silyl- Verbindungen (beispielsweise Trialkylsilyl- , Dialkyl- arylsilyl-, Diarylalkylsilyl-) , der Carbonyle (beispielsweise Ester), der Amine (beispielsweise tert . Amin, sec Amin, prim. A in, cyclisches Amin) oder ein Proton sein.
Die Auflistung soll jedoch nur beispielhaft und nicht beschränkend sein.
R2 kann eine Komponente aus der Gruppe der Halogene, bevorzugt Cl und Br sein.
Die Reduktion zeichnet sich somit neben der hohen Enan- tioselektivität durch ein sehr breites Substratspektrum aus, da alle von uns eingesetzten propargylischen Ketone, welche an der Dreifachbindung unterschiedlichste Substituenten und funktioneile Gruppen R1 tragen, umgesetzt wurden.
Alle Alkohole, die am Acetylen-Rest substituiert sind (R1 ≠ H) , besitzen (R) -Konfiguration, wenn sie nicht α- halogeniert sind (R2 = H) und ( S) -Konfiguration im Falle der α-halogenierten Produkte (R2 = Halogen) .
Die Reduktion kann in einem Temperaturbereich zwischen 0 °C und 90 °C, vorzugsweise 5 - 70 °C , besonders bevorzugt 15 - 40 °C, durchgeführt werden. Der pH-Wert kann zwischen 4 und 10 liegen, idealerweise liegt er bei 5 - 8, bevorzugt 6,5.
Die enzy atische Reaktion kann in wäßriger Lösung durchgeführt werden, jedoch können auch organische Lösungsmittel, vorzugsweise wasserlösliche Lösungsmittel, vorzugsweise niederkettige Alkohole, vorzugsweise i-Propanol oder Ethanol, beigemischt sein. Die Beimischung kann bis zu ca. 30 % des organischen Lösungsmittels betragen und hat zur Folge, daß die organischen Reaktionskomponenten besser gelöst werden. Weiterhin kann die enzymatische Reaktion auch ohne Lösungsmittel, z. B. in der Gasphase, durchgeführt werden.
Die milden Bedingungen der enzymatisehen Reduktion von (pH = 5 - 8, Raumtemperatur) in Zusammenhang mit der einfachen Aufarbeitung (die Produkte können durch Extraktion bzw. Adsorption-Elution, z. B. an Harzen, rein erhalten werden) stellen einen schonenden Produktzugang dar, der auch die Darstellung von Alkoholen mit reaktiven Substituenten ermöglicht.
Die besonderen Vorteile dieses Reaktionsschrittes sind die Enantiomerenreinheit der Produkte (ee > 99 %) sowie das extrem breite Substrat-Spektrum der eingesetzten ADH. Weiterhin ist für die Cofaktorregenerierung nicht zwingend ein Coenzym notwendig (die eingesetzte ADH kann bei Zugabe von Cosubstrat den Cofaktor selber re- generieren) und es liegen milde Reaktionsbedingungen, wie pH = 5 - 8 und Raumtemperatur, vor. Außerdem ist die Isolierung der Produkte besonders einfach.
Die Reduktion von Propargyl-Ketonen mit einer termina- len Dreifachbindung (R1 = H, R2 ≠ H) führt überraschenderweise zu einer formalen Konfigurationsumkehr bei den Produkten, insbesondere bei der Reduktion mit LB-ADH. Auch diese Alkohole werden hochenantioselektiv gebildet (Ausnahme: R2 = CH3; ee = 34 %) . Die terminale Drei- fachbindung kann anschließend deprotoniert und vielfältig substituiert werden. Das entsprechende Syntheseschema ist in Figur 1 dargestellt. Durch diesen zusätzlichen Syntheseschritt ergibt sich ein einfacher Zugang zu beiden Enantiomeren propargylischer Alkohole in ho- hen optischen Reinheiten, wobei die Einführung der Chi- ralität jeweils vom selben Enzym katalysiert wird.
Der größte Nachteil bei der Reduktion von Ketonen mit einer Oxidoreduktase ist, daß nur eines der beiden ge- wünschten Enantiomere zugänglich ist. Durch die Reduktion mit der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis oder Lactobacillus kefir ist eine Vielzahl von propargylischen Alkoholen mit unterschiedlichsten Resten an der Dreifachbindung zugänglich (R1 ≠ H, R2 = R) . Diese Alkohole besitzen die (R) -Konfiguration (bzw. ( S) im Falle der α-halogenierten Substrate) . Überraschen- derweise führt jedoch der Einsatz von Ketonen mit einer terminalen Dreifachbindung (R1 = H) , insbesondere bei der Reduktion mit ADH aus Lactobacillus brevis, zu einer formalen Konfigurationsumkehr bei den Produkten, sobald R2 ≠ H ist (Tabelle 4) . Die formale Konfigurati- onsumkehr findet bereits bei l-Pentin-3-on
(R1 = H, R2 = CH3) statt. Hier ist der Größenunterschied der Substituenten allerdings noch nicht ausreichend, um einen ee > 99 % zu erreichen. Überraschenderweise werden alle anderen von uns getesteten Ketone mit termina- 1er Dreifachbindung (R1 = H, R2 ≠ H) zu den enantiome- renreinen ( S) -Alkoholen (bzw. (R) im Falle der α- halogenierten Substrate) reduziert (s. Tabelle 4).
Dieses ist die erste Beschreibung einer Oxidoreduktase, die Alkohole mit gegensätzlicher Konfiguration enantio- merenrein (ee > 99 %) erzeugen kann. Durch einen zusätzlichen chemischen Schritt wird diese Fähigkeit dazu verwendet, beide Enantiomere desselben Propargyl- Alkohols unter Verwendung nur einer Alkoholdehydrogena- se optisch rein zu synthetisieren (s. Figur 1) : Nach der enzymatischen Reduktion von l-Chlor-3-butin-2-on zu (R) -l-Chlor-3-butin-2-ol (oder der entsprechenden Brom- Verbindungen) kann die terminale Dreifachbindung mit einer Base deprotoniert und mit vielfältigen Funktiona- litäten substituiert werden. Jedoch ist diese Reihenfolge nicht zwingend, vielmehr kann auch der Ringschluß gemäß Reaktionsschritt 2 des Formelbildes 1 zum Epoxid zuerst und danach der Ersatz des Protons der terminalen Alkingruppe erfolgen.
Als Base kommen beispielsweise Metallorganyle, vorzugsweise Lithiumorganyle, (z. B. n-Butyl-Lithium) , Alkoho- late (z. B. Kalium- -Butylat) , Amide (z. B. LDA) in Betracht. Die Deprotonierung wird dabei in einem vorzugsweise inerten, nicht protischen organischen Lösungsmit- tel, beispielsweise Ethern (z.B. Diethylether, THF) oder Alkanen (z. B. Pentan, Hexan) bei einer Temperatur in einem Bereich von vorzugsweise - 150 °C bis 50 °C, besonders bevorzugt -80 °C bis 10 °C, durchgeführt. An Stelle des Protons kann ein beliebiger Substituent an die Position R1' eingeführt werden.
Als R1' kommen praktisch alle Substituenten in Betracht, welche nach der aufgezeigten Vorgehensweise eingeführt werden können, beispielhaft können jedoch dieselben Substituenten genannt werden, welche für R1 angeführt wurden. Dieser allgemeine Zugang ermöglicht die Synthese einer großen Zahl propargylischer Alkohole. In Verbindung mit der enzymatischen Reduktion von Ketonen, die an der Dreifachbindung substituiert sind, ergibt sich erstmals die Möglichkeit, beide Enantiomere einer Vielzahl von α-Halogen-propargylalkoholen optisch rein darzustellen.
Zum ersten Mal ist es möglich, mittels nur einer Oxidoreduktase, Alkohole mit gegensätzlicher Konfiguration enantiomerenrein (ee > 99 %) zu erzeugen. Es kann eine Vielzahl von Substituenten an die Dreifachbindung eingeführt werden, und es ist eine präzise Vorhersage der absoluten Konfiguration der Alkohole möglich.
Die enzymatische Reduktion der propargylischen α- Halogen-Ketone kann alternativ zu ADHs aus Lactobacil - lus auch mit anderen Oxidoreduktasen durchgeführt werden. Sowohl Pferdeleber-ADH (HL-ADH) , T ermoanaerojbium jbrocJii-ADH (TB-ADH) , Candi da boidinii-ADH (CB-ADH) als auch Candida parapsilosis-Carbonyl Reduktase (CPCR) reduzieren beispielsweise 4-Phenyl-l-chlor-3-butin-2-on und 4- t-Butyldimethylsilyl-l-chlor-3-butin-2-on zu dem entsprechenden Alkohol (s. Tabelle 5) . Bei allen aufgeführten Enzymen konnte die Aktivität in Batch-Ansätzen bestätigt werden, indem die Bildung der chiralen propargylischen Alkohole chromatographisch und spektrosko- pisch nachgewiesen wurde.
Der zweite und abschließende Schritt des vorliegenden Verfahrens ist die Überführung des enantiomerenreinen Alkohols in das Epoxid. Der Schritt erfolgt durch Eli- mination von HX (X = Halogen) mittels einer Base unter Erhalt der Enantiomerenreinheit .
Als Basen können beispielsweise Hydroxide, Alkoholate, Cyanid-Ionen, Aminbasen, wie primäre, sekundäre oder tertiäre Amine, cyclische Amine, Amidin-Basen wie DBN oder vorzugsweise DBU, oder allgemein bevorzugt milde Basen eingesetzt werden.
Die Reaktion gelingt unter Verwendung von DBU als schonende Base bereits bei Raumtemperatur und verläuft mit 100 % Umsatz (s. Formelbild 3). Je nach Funktionalisie- rung beträgt die isolierte Ausbeute 60 - 80 %. Sämtliche getesteten Substituenten und funktionellen Gruppen an der Dreifachbindung sind unter den sehr milden Bedingungen stabil. Somit können die (durch die enzymatische Reduktion in großer Vielfalt zugänglichen) α-halo- genierten, propargylischen Alkohole für die Epoxidbil- dung eingesetzt werden, wodurch die Reaktion allgemeine Anwendbarkeit besitzt. Die Reaktion verläuft racemesie- rungsfrei, wodurch der ee von > 99 % erhalten bleibt.
R = Halogen ee > 99 %
Formelbild 3
Vorteilhafterweise ist dieser Reaktionsschritt allgemein anwendbar, liefert gute bis hohe Ausbeuten bei milden Bedingungen und es findet keine Racemisierung statt .
Der Rest R1 ist eine Komponente aus der Gruppe gesättigter oder ungesättigter aliphatischer, aromatischer oder heteroaromatischer Kohlenwasserstoffe, die einfach oder mehrfach substituiert sein kann, wobei die Substituenten Alkyl- (beispielsweise geradkettiges, verzweigtes, gesättigtes, ungesättigtes, cyclisches Alkyl) , Aryl- (beispielsweise Phenyl-, Tosyl-, Naphthyl-, kon- densierter Aromat, Heteroaromat) oder Aralkyl-Gruppen oder Heteroatome, wie z. B. F, Cl , Br, I oder 0, S, P, N oder Kombinationen davon sein können. Weiterhin kann der Rest R1 eine Komponente aus der Gruppe der Silyl- Verbindungen (beispielsweise Trialkylsilyl- , Dialkyl- arylsilyl-, Diarylalkylsilyl-) , der Carbonyle (beispielsweise Ester), der Amine (beispielsweise tert . Amin, sec Amin, prim. Amin, cyclisches Amin) oder ein Proton sein.
Die Auflistung soll jedoch nur beispielhaft und nicht beschränkend sein.
R2 kann eine Komponente aus der Gruppe der Halogene, bevorzugt Cl und Br sein.
Die Reaktion kann in zahlreichen Lösungsmitteln durch- geführt werden. Beispielsweise kommt Wasser sowie wäßrige Puffersysteme oder ein protisches oder aprotisches Lösungsmittel oder ein Lösungsmittelgemisch in Betracht, die Reaktion kann aber auch ohne Lösungsmittel (z. B. in der Gasphase) stattfinden.
Die nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Darstellung propargylischer, terminaler Epoxide sind bei den hier angegebenen Substraten nur bedingt anwendbar. Die Ausbeuten liegen meist bei kleiner als 10 % und ein Teil der funktionalisierten Alkohole ist unter diesen Bedingungen nicht stabil.
Da dieses Verfahren den ersten allgemeinen Zugang zu optisch aktiven, propargylischen, terminalen Epoxiden in hohen optischen Reinheiten darstellt, ergeben sich eine Vielzahl an neuen Anwendungsmöglichkeiten z. B. für die Naturstoff- und Wirkstoff-Synthese. Die nucleophile Öffnung der Epoxide eröffnet Zugang zu einer Reihe interessanter Verbindungen. So bildet sich beispielsweise bei Zugabe von 1.2 Äquivalenten KCN in Ethanol / Wasser (4 / 1) bei RT bereits nach 12 h das entsprechende Nitril unter 100 % Umsatz. Nach Extraktion wird ohne weitere Aufarbeitung das reine Produkt erhalten. Für die Synthese des Nitrils ist die vorherige Isolierung des Epoxides nicht notwendig, da es unter den beschriebenen Bedingungen auch direkt aus dem halogenierten Alkohol gebildet werden kann (Formelbild 4) . Die Zwischenstufe des Epoxides wurde mittels GC-MS nachgewiesen, wird jedoch sofort in situ umgesetzt. Das erhaltene Nitril kann z. B. in der Synthese von HMG-CoA Reduktase Inhibitoren eingesetzt werden. Diese Synthese wird in K. Takahashi , T. Minami, Y. Ohara, T. Hiyama, Bull. Chem. Soc . Jpn . 1995, 68 , 2649 beschrieben, wobei das verwendete Nitril (R1 = TBDMS; s. Formelbild 4) in einer 7 Stufen-Synthese dargestellt wurde.
R = Halogen ee>99%
Formelbild 4 Experimenteller Teil
Methoden: Alle Lösungsmittel wurden in p.a. Qualität verwendet und falls nötig nach Standardmethoden getrocknet. Die Chemikalien wurden von Aldrich, Lancaster, TCI und Fluka bezogen. HL-ADH, TB-ADH und CB-ADH wurden von Sigma bezogen; LB-ADH und CPCR wurden am Institut für Enzymtechnologie der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf isoliert (für LB-ADH s.: B. Riebel, Dissertation, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, 1996; für CPCR s.: J. Peters, Dissertation, Hein- rich-Heine-Universität Düsseldorf, 1993) . DC: Kieselgel 60 F254 (Merck). Säulenchromatographie: Kieselgel 60 (Merck). NMR-Spektren: AMX-300 (1H: 300 MHz, 13C: 75.5 MHz) der Bruker Physik AG. Chemische Verschiebungen sind in ppm relativ zu CHC13 als internen Standard angegeben. GC: Chrompack CP9002 mit einer FS-Cyclodex-ß-I/P (CS GmbH) und einer Lipodex E Säule (Macherey-Nagel) . HPLC: Hewlett Packard Series 1100 mit einer Chiracel OB und einer Chiralpak AD Säule (Daicel Chem. Ind.) bei 20 °C, 0.5 ml/min. GCMS : HP 6890 series GC- system ausgestattet mit einem HP 5973 Massendetektor (EI, 70 eV) und einer HP-5MS Säule (TGC (Injektor) = 250 °C, Zeitprogramm (Ofen) : T0 mιn = 60 °C, T3 mιn = 60 °C, T14 min = 280 °C (20 °/min) , T19 mιn = 280 °C. Drehwerte: Polarimeter 241 (Perkin Eimer) .
Substratdarstellung
Die propargylischen Ketone wurden nach literaturbekannten Methoden dargestellt. Die Synthese kann über Depro- tonierung eines terminalen Alkins mit anschließender Kupplung eines Weinreb-Amids (S . Nahm, S. M. Weinreb, Tetrahedron Lett . 1981, 22, 3815) , über die Kupplung eines Trimethylsilyl -substituierten Alkins mit einem Säurechlorid (L. Birkofer, A. Ritter, H. Uhlenbrauck, Chem . Ber. 1963, 96, 3280) sowie über die Oxidation des entsprechenden Alkohols (K. Bowden, I. M. Heilbron, E. R. H. Jones, B. C. L. Weedon, J. Chem. Soc . 1946, 39) durchgeführt werden.
Reduktion
Enzyme Assays: Für die photometrische Bestimmung der Enzym-Aktivität wurden folgende Lösungen zusammengegeben und die Abnahme der Extinktion bei 340 nm verfolgt (εNAD(P)H 6.22 L mol"1 cm"1) , 20 °C: 970 μL Lösung des Ketons in TEA/NaOH-Puffer (5 M Keton [2 mM bei aromatisch substituierten Alkinonen aufgrund der geringeren Löslichkeit], 100 mM TEA, ImM MgCl2) pH 7.0, 20 μL
NAD(P)H (12.5 mM) und 10 μL Enzym-Lösung. Die Anfangsabnahme der Extinktion wurde aufgezeichnet und relativ zu den Werten des Standard-Substrats 5-Oxo-hexansäure- ethylester gesetzt.
LB-Alkoholdehydrogenase katalysierte Reduktionen von propargylischen Ketonen (präparativer Maßstab) :
Das Keton (1 mmol) wurde bei RT mit 50 mg NADP+, 1.5 mL i-Propanol und 50 U LB-ADH (1 U Enzym reduziert 1 μmol Substrat pro Minute) in 100 mL TEA/NaOH-buffer (100 mM TEA, 1 mM MgCl2; pH 6.5) gerührt. Nach 16 h wurde die Reaktionsmischung mit CH2C12 (3 x 40 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum aufkonzent- riert und über Kieselgel chromatographiert (Hexan / Ethylacetat) .
(R) -4-Phenyl-3-butin-2-ol: 85 % Ausbeute; ee > 99 % bestimmt mittels HPLC auf Chiracel OB (i-Hexane : i-Propanol = 95:5) ,
Rt = 24.3 min (R) ; XH-NMR (CDCl3) : δ = 1.55 (d, J = 6.6 Hz, 3H, CH3) , 2.13 (s, 1H, OH) , 4.75 (q, -7 = 6.6 Hz, 1H) , 7.31-7.42 (m, 5H, Ar-H) . - 13C-NMR (CDC13) : δ = 24.3 (CH3) , 58.7 (CH) , 83.9, 90.9 (Cq) , 122.5, 128.2, 128.3, 131.6 (Car) . - GCMS: Rt = 8.0 min; m/ z (%) = 146 (50) [M+] , 131 (100)
[M+ - CH3] , 103 (61) [M+ - CH3 - CO] , 77 (35) [C6H5 +] . [α] 22 D +43.8 (c = 0.6, Et20) (Literaturwert von (S)-2a: [α] 25 D - 44.8 (c = 1.0, Et20, ee = 97 %) ; K. Nakamura, K. Takena- ka, A. Ohno, Tetrahedron: Asymmetry 1998, 9, 4429.)
(R) -4- (4-Methoxy-phenyl-3-butin-2-ol: 64 % Ausbeute; ee > 99 % bestimmt mittels HPLC auf Chiracel OB ( i -Hexan :i-Propanol = 85:15) , Rt = 29.0 min (R) ; ^-NMR (CDC13) : δ = 1.55 (d, J = 6.5 Hz, 3H, CH3) , 1.90 (s, 1H, OH) , 3.80 (s, 3H, OCH3) , 4.75 (q, -7 = 6.5 Hz, 1H) , 6.82 (d, J = 9.5 Hz, 2H) , 7.37 (d, J = 9.5 Hz, 2H,
Ar-H) . - 13C-NMR (CDC13) : δ = 24.7 (CH3) , 55.5 (OCH3) , 59.1 (CH) , 84.1, 89.8 (Cq) , 114.1, 114.8, 133.3, 159.8 (Car) . - GCMS: Rt = 10.3 min; m/z (%) = 176 (40) [M+] , 161 (100) [M+ - CH3] , 145 (5) [M+ - 2CH3] , 133 (26) [M+ - CH3 - CO] , 118 (14) [M+ - 2CH3 - CO] . [α] 22 D +34.8
(c = 1.0, Et20) (Literaturwert von (S) -2b: [α] 25 D - 35.1 (c = 1.0, Et20, ee = 97 %) ; K. Nakamura, K. Takenaka, A. Ohno, Tetrahedron: Asymmetry 1998, 9, 4429.) (S) -l-Pentin-3-ol: 81 % Ausbeute; ee = 34 % bestimmt mittels GC auf Lipodex E (T = 35 °C) , Rt = 30.5 min (S) + 32.0 min (R) ; XH-NMR (CDCl3) : δ = 1.01 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH3) , 1.72 (m, 2H, CH2) , 2.12 (s, 1H, OH) , 2.40 (s, 1H, Cl), 3.98 (t, J = 6.6 Hz, 1H, C3) . - 13C-NMR
(CDC13) : δ = 9.4 (CH3) , 30.6 (CH2) , 63.3 (CHOH) , 72.9 (CH) , 84.9 (Cq) . [α] 22 D -8.4 (c = 0.5, Et20) (Literaturwert von (12) -6a: [α] 22 D +34.0 (c = 2.2, Et20, ee > 97 %) ; O. Steiner, C. Tamm, Tetrahedron Lett. 1993, 34, 6729.)
(S) -l-Hexin-3-ol: 86 % Ausbeute; ee > 99 % bestimmt mittels GC auf HP FS-Cyclodex-ß-l/P (T = 60 °C) , Rt = 26.3 min (S) ; XH-NMR (CDC13) : δ = 0.94 (t, J = 7.3 Hz, 3H, CH3) , 1.42 - 1.77 (m, 4H, CH2) , 2.10 (s, 1H, Cl) ,
2.12 (s, 1H, OH) , 4.27 (t, J = 6.5 Hz, 1H, C3 ) . - 13C-
NMR (CDC13) : δ = 18.4 (CH3) , 25.5 (CH2) , 39.8 (CH2) , 64.5 (CHOH) , 66.0 (CH) , 72.9 (Cq) . - GCMS (T = 60 °C) : Rt = 4.2 min; / z (%) = 97 (5) [M+ - H] , 83 (33) [M+ - CH3] , 70 (17) [M+ - H20] , 55 (100) [M+ - CH3 - CO] .
[α]22 D -35.1 (c = 1.5, Et20) (Literaturwert: [α] 22 D -24.0 (c = 2.4, Et20; ee = 68 %) ; K. Mori, H. Akao, Tetrahedron 1980, 36, 91.)
(S) -4-t-Butyldimethylsilyl-l-chlor-3-butin-2-ol: 55 %
Ausbeute; ^-NMR (CDC13) : δ = 0.16 (s, 6H, Si-CH3) , 0.98 (s, 9H, t-bu) , 2.51 (s, 1H, OH) , 3.68 (d, J" = 4.0 Hz, 2H, CH2C1) , 4.51 (t, J = 4.0 Hz, 1H, CH) . - 13C-NMR (CDC13) : δ = - 1.3 (SiCH3) , 12.1 (t-bu-Cq) , 23.4 (t-bu-CH3) , 48.6 (CH2) , 63.1 (CHOH) , 92.0, 102.4 (Cq) .
- GCMS: Rt = 8.1 min; / z (%) = 218 (5) [M+] , 203 (1) [M+ - CH3 ] , 161 ( 21 ) [M+ - t-Bu] , 95 ( 100 ) [M+ - t-bu - 2CH3 - Cl ] . (Der Drehwert wird nach der folgenden Synthesestufe bestimmt ; s . ( S) - 1 - t-Butyldimethylsilyl - 3 , 4 - epoxy- 1 -butin)
Synthese der race isehen Alkohole und Trennung der Enantiomere (Analytischer Maßstab) :
Das propargylische Keton (10 μmol) und 0.2 mg NaBH4 (5 μmol) wurden in 1 ml EtOH 1 h bei 0 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 1 M HC1 (1 ml) hydrolisiert , gesättigte NaCl-Lösung (4 ml) zugegeben und die Reaktionsmischung mit CH2C12 (1 ml) extrahiert. Alle Alkohole wurden in 100 % Umsatz erhalten.
4-Phenyl-3-butin-2-ol: Die Enantiomere wurden mittels HPLC auf Chiracel OB getrennt (i-Hexan: i-Propanol = 95:5), Rt = 24.3 min (R) + 31.9 min ( S) .
4- (4-Methoxy-phenyl) -3-butin-2-ol : Die Enantiomere wurden mittels HPLC auf Chiracel OB getrennt (i-Hexan:i- Propanol = 85:15), Rt = 29.0 min (R) + 38.2 min ( S) .
l-Butin-3-ol: Die Enantiomere wurden mittels GC auf HP FS-Cyclodex-ß-I/P (T = 35 °C) getrennt, Rt = 13.9 min (R) + 15.5 min ( S) .
l-Pentin-3-ol: Die Enantiomere wurden mittels GC auf HP Lipodex E (T = 35 °C) getrennt, Rt = 30.5 min (S) + 32.0 min (R) . l-Hexin-3-ol: Die Enantiomere wurden mittels GC auf HP FS-Cyclodex-ß-I/P (T = 60 °C) getrennt, Rt = 26.3 min (S) + 28.4 min {R) .
l-Octin-3-ol: Die Enantiomere wurden mittels GC auf HP
FS-Cyclodex-ß-I/P (T = 80 °C) getrennt, Rt = 41.8 min (S) + 44.9 min (fl) .GCMS: Rt = 5.0 min; m/ z (%) = 125 (3) [M+ - H] , 111 (3) [M+ - CH3] , 107 (7) [M+ - H20 - H] , 97 (19) [M+ - C2H5] , 83 (42) [M+ - CH3 - CO] , 55 (100) [C4H7] .
l-Chloro-4-trimethylsilyl-3-butin-2-ol: GCMS: Rt = 7.0 min; m/z (%) = 176 (1) [M+] , 161 (1) [M+ - CH3] , 127 (100) [M+ - CH3 - Cl] , 95 (93) [M+ - 3CH3 - Cl] .
l-Bromo-4-trimethylsilyl-3-butin-2-ol: GCMS: Rt = 7.7 min; m/z (%) = 221 (1) [M+] , 206 (1) [M+ - CH3] , 139 (64) [M+ - Br] , 127 (100) [M+ - CH3 - Br] .
Allgemeines Verfahren zur Analyse der 4-Silyl-3-butin-
2-ole: Die Silyl -Gruppe der Alkohole wurde durch die Zugabe von (Bu) 4NF (0.2 mL; 1 M in THF) in THF (1 mL) abgespalten. Nach 1 h wurde gesättigte NaCl -Lösung (2 mL) zugegeben und die Mischung mit CH2C12 extra- hiert . Die Produkte wurden in 100 % Umsatz erhalten und wie unten aufgeführt analysiert.
l-Chloro-3-butin-2-ol : Die Enantiomere wurden mittels GC auf Lipodex E (T = 60 °C) getrennt, Rt = 59.1 min (S) + 65.4 min (1?) . l-Bromo-3-butin-2-ol: Die Enantiomere wurden mittels GC auf Lipodex E (T = 70 °C) getrennt, Rt = 67.2 min ( S) + 70.7 min (R) .
Enzym katalysierte Reduktion propargylischer Alkohole (Analytischer Maßstab) : Das Keton (10 μmol) wurde bei RT mit 0.5 mg NAD(P)+, 15 μL 2-Propanol (bei HL-ADH: 12 μL Ethanol) und 0.5 U Enzym in 1 mL TEA/NaOH-Puffer (100 M TEA, 1 mM MgCl2; pH 6.5) vorsichtig geschüt- telt. Nach 16 h wurde die Reaktionsmischung mit 200 μL CH2C12 extrahiert. Die Analyse der Ansätze wurde wie oben beschrieben durchgeführt; die Aktivitäten, Konfigurationen und ee-Werte der Alkohole sind in den Tabellen 1-5 angegeben.
Epoxidierung
(S) -l-t-Butyldimethylsilyl-3,4-epoxy-but-l-in: Zu einer Lösung von 100 mg (460 μmol) ( S) - 4- -Butyldimethyl- silyl-l-chlor-3-butin-2-ol in 50 ml CH2C12 wurden bei RT 216 mg (1.4 mmol) DBU gegeben und gerührt. Nach 22 h wird die Lösung mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Säulenchro- matographie (Pentan: CH2C12 = 3:1) ergaben 58 mg (317 μmol, 69 % Ausbeute) des Epoxids .
^-N R (CDC13) : δ = 0.12 (s, 6H, Si-CH3) , 0.94 (s, 9H, t-bu) , 2.92 (d, J = 3.4 Hz, 2H) , 3.38 (t, J = 3.4 Hz, 1H) . - 13C-NMR (CDCI3) : δ = - 4.6 (SiCH3) , 16.7 (t-bu- Cq) , 26.2 (t-bu-CH3), 40.1 (CH) , 49.2 (CH2) , 87.8, 102.7 (Cq) . - GCMS: Rt = 7.5 min; / z (%) = 182 (8) [M+] , 167 (4) [M+ - CH3] , 125 (100) [M+ - t-Bu] , 109 (14) [M+ - t-bu - CH3] , 97 (76) [M+ -t-bu - CO] . [α] 22 D +71.6 (c = 1.02, CH2C12) (Literaturwert von (R) -1-t-Butyl- dimethylsilyl-3,4-epoxy-but-l-in: [α] 20 D -72.3 (c =
5.63, CH2C12) ; T. Kanger, P. Niidas, A.-M. Müürisepp,
T. Pehk, M. Lopp, Tetrahedron: Asymmetry 1998, 9,
2499.)
Folgechemie
(R) - 4-t-Butyldimethylsilyl-l-cyano-3-butin-2-ol: Zu einer Lösung von 100 mg (460 μmol) (S) - 4-t-Butyl- dimethylsilyl-l-chlor-3-butin-2-ol in 100 ml ETOH/H20 (4/1) wurden 38 mg (575 mmol) KCN gegeben und bei 50 °C gerührt. Nach 16 h wird das Ethanol im Vakuum entfernt. Anschließend wird mit Ethylacetat extrahiert, die organischen Phasen über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert . Ohne weitere Aufreinigung wurden 73 mg (350 μmol, 76 % Ausbeute) des reinen Nitrils er- halten.
^-NMR (CDC13) : δ = 0.16 (s, 6H, Si-CH3) , 0.98 (s, 9H, t-bu), 1.50 - 2.00 (s, 1H, OH), 2.78 (d, J = 5.8 Hz, 2H, CH2CN) , 4.66 (t, J = 5.8 Hz, 1H, CH) . - 13C-NMR (CDCI3) : δ = - 4.6 (SiCH3) , 16.6 (t-bu-Cq), 26.2 (t-bu-CH3), 27.6 (CH2) , 59.0 (CHOH), 91.3, 103.3 (Cq) , 116.3 (CN) . - GCMS: Rt = 9.5 min; m/ z (%) = 191 (3) [M+-H20] , 176 (2) [M+ - H20 - CH3] , 152 (64) [M+ - t-Bu] , 134 (59) [M+ - t-Bu - H20] , 111 (100) [M+ - t-Bu - CH3 - CN] . Tabelle 1
'bezogen auf 5-Oxohexansäureethylester als Standard (in %) **Konfiguration der resultierenden Alkohole
Tabelle 2:
bezogen auf 5-Oxohexansäureethylester als Standard (in %) "Konfiguration der resultierenden Alkohole Tabelle 3
*bezogen auf 5-Oxohexansäureethylester als Standard (in %) **nicht bestimmt
***Konfiguration der resultierenden Alkohole (Fortsetzung Tabelle 3)
Tabelle 4
'bezogen auf 5-Oxohexansäureethylester als Standard (in %) **Konfiguration der resultierenden Alkohole
Tabelle 5 :
Oxidoreduktase
R1 = TBDMS
'bezogen auf den jeweiligen Standard: 5-Oxohexansäure- ethylester bei Lactobacillus Jbrevis-ADH und Candida parapsilosis-CR; Cyclohexanon bei Pferdeleber-ADH; 2-Butanon bei Thermoanaerobium brockii-ADH; Aceton bei Candida boidinii -ADH) in %
"Konfiguration der resultierenden Alkohole *"very slow

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven, propargylischen, terminalen Epoxiden der Formel 1,
Formel 1
dadurch gekennzeichnet, daß ein α-Halogen substituiertes propargylisches Keton mittels einer Alkoholdehydrogenase zu einem Alkohol reduziert wird und der resultierende op- tisch aktive, propargylische Alkohol mit einer Base zu einem optisch aktiven, propargylischen, terminalen Epoxid umgesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß eine Alkoholdehydrogenase eingesetzt wird, die von Lactobacillus, Thermoanaerobium, Thermoethano- licus oder Pferdeleber abstammt.
3. Verfahren nach Anspruch 2 , dadurch gekennzeichnet, daß die Alkoholdehydrogenase von Lactobacillus brevis oder Lactobacillus kefir abstammt.
4. Verfahren nach Anspruch 2 , dadurch gekennzeichnet, daß die Alkoholdehydrogenase von Thermoanaerobium brockii abstammt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkoholdehydrogenase rekombinant ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß biologisch aktive Teile, eine modifizierte Form, Isoenzyme oder Mischungen der Alkoholdehydrogenase einzeln oder in Kombination eingesetzt wer- den.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkoholdehydrogenase in einer Ganzzeil- transformation oder isoliert eingesetzt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das α-Halogen substituierte propargylische Ke- ton eine Verbindung der allgemeinen Formel 2 ist:
9. Verfahren nach Anspruch 8 , dadurch gekennzeichnet, daß Rl eine Komponente aus der Gruppe gesättigter oder ungesättigter aliphatischer, aromatischer oder heteroaromatischer Kohlenwasserstoffe, die einfach oder mehrfach substituiert sein kann, wobei die Substituenten Alkyl-, Aryl- oder Aralkyl -Gruppen oder Heteroatome, wie z. B. F, Cl , Br, I oder 0, S, P, N oder Kombinationen davon sein können oder eine Komponente aus der Gruppe der Silyl -Verbindungen, der Carbonyle, der Amine oder ein Proton ist.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß R2 ein Halogen, vorzugsweise Cl oder Br ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Base mindestens eine Komponente aus der Gruppe Hydroxyd, Alkoholat, Cyanid, Aminbase, Ami- dinbase eingesetzt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Base eine milde Base eingesetzt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Base eine Amidin-Base, vorzugsweise DBU oder DBN eingesetzt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion mittels der Alkoholdehydrogenase in einem Temperaturbereich zwischen 0 °C und 90 °C durchgeführt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion in einem Temperaturbereich zwi- sehen 5 °C bis 70 °C durchgeführt wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion mit der Alkoholdehydrogenase bei einem pH-Wert von 4 bis 10 durchgeführt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion mit der Alkoholdehydrogenase in wäßriger Lösung oder ohne Lösungsmittel durchgeführt wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion mit der Alkoholdehydrogenase in der Gasphase durchgeführt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der wäßrigen Lösung ein organisches Lösungsmittel beigemischt wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung zu dem propargylischen Epoxid in einem Lösungsmittel durchgeführt wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung zu dem propargylischen Epoxid ohne Lösungsmittel durchgeführt wird.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß als α-Halogen substituiertes propargylisches Keton ein Keton mit einer terminalen Dreifachbin- düng eingesetzt wird, wobei das Proton der terminalen Dreifachbindung nach der Umsetzung mit der Alkoholdehydrogenase durch einen Substituenten ersetzt werden kann.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet , daß das resultierende optisch aktive, propargylische, terminale Epoxid unter Öffnung des Epoxidrin- ges als Ausgangsstoff für die Herstellung eines chiralen Produktes eingesetzt wird.
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