EP1347828A1 - Micro reseau statique de sondes biologiques ou chimiques, immobilisees sur un support par attraction magnetique - Google Patents

Micro reseau statique de sondes biologiques ou chimiques, immobilisees sur un support par attraction magnetique

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EP1347828A1
EP1347828A1 EP01998399A EP01998399A EP1347828A1 EP 1347828 A1 EP1347828 A1 EP 1347828A1 EP 01998399 A EP01998399 A EP 01998399A EP 01998399 A EP01998399 A EP 01998399A EP 1347828 A1 EP1347828 A1 EP 1347828A1
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EP
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probes
support
vector
network
magnetic
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01998399A
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German (de)
English (en)
Inventor
Nicolas Ugolin
Gérard MARGUERIE DE ROTROU
Thierry Kortulewski
Olivier Alibert
Diana Le Roux
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Commissariat à l'Énergie Atomique et Aux Énergies Alternatives
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
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    • C40B60/00—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries

Definitions

  • the subject of the present invention is a network of biological or chemical ligands (probes) immobilized on a support which is not chemically functionalized, by magnetic attraction.
  • the probes can be natural or synthetic products having a biological or chemical activity or an affinity for biological or chemical molecules, for example, peptides, proteins, oligonucleotides, RNA, double stranded or single stranded DNA, polysaccharides and phospholipids and combinatorics of chemicals.
  • These networks can find applications in many fields, for example as diagnostic tools, or as screening tools for collections of molecules or biological samples, or molecules for therapeutic or diagnostic purposes.
  • the invention lies in the stable immobilization of these ligands on a magnetic surface, to organize a network of biological or chemical probes. This method can be adapted to the production of variable density micro networks or macro networks.
  • the first technology consists in making a direct synthesis of short oligonucleotides or peptides, on a surface previously functionalized and activated to allow grafting.
  • the second technology consists in immobilizing the ligands previously synthesized and characterized before their immobilization, on a functionalized surface, the deposition of these probes can be carried out by mechanical or electrochemical methods.
  • the second type of technology used to produce arrays of probes seems a priori more suitable for the integration of new data, since it consists in synthesizing and characterizing probes individually before immobilizing them on a support.
  • the ligands are prepared, purified and then deposited on an activated surface.
  • oligonucleotides of variable lengths and preamplified double-stranded probes can be deposited to make arrays of DNA arrays.
  • the deposition surface may be made of glass or of porous or non-porous silicon, of polymer material or any other chemically functionalized surface.
  • Electrochemical addressing techniques have also been described (patent application WO A-94/22889).
  • This method has the advantage of a controlled addressing of ligands on a reaction zone. Addressing, however, requires the use of a conductive surface, functionalized reagents and a cumbersome process for the industrialization and quality control of matrices produced in large series.
  • the present invention specifically relates to extremely diverse microarray of probes and which can be nucleic probes (oligonucleotides, double stranded DNA or single stranded DNA, RNA, ...), proteins (membrane receptors, monoclonal antibodies, peptides, recombinant proteins or domains thereof, ...), or viruses, cells, or organic synthesis molecules from chemical libraries.
  • nucleic probes oligonucleotides, double stranded DNA or single stranded DNA, RNA, Among these networks of biological or chemical probes are easy to produce, by a process which is based on the immobilization of the probes on a support by magnetic interaction.
  • the matrices thus created can be used in all fields of use of micro or macro networks, and more particularly in diagnosis, pharmacogenomics, toxicogenomics, study of the structure and expression of genomes, and in general in any type of application involving molecular interactions. They can therefore be used in particular for diagnostic or high-throughput screening tools.
  • the manufacture of these networks does not require any prior chemical functionalization of the support and can be done in a simple and inexpensive manner. The quality of the chemical substrate on which the immobilization takes place is no longer a limiting element.
  • One of the advantages of the invention is also to increase the detection sensitivity of these networks.
  • the possibility of attaching single stranded DNA, which avoids double strand competition during the hybridization of nucleic targets is a significant example.
  • the possibility of easily fixing several fragments or domains of recombinant proteins previously tested for their specific activities is another significant example.
  • the absence of a chemical treatment for grafting the probes makes it possible to carry out a standard optical treatment on the slides, to make them inert to parasitic fluorescence and diffusion.
  • biological probes will denote:
  • any biological molecule such as peptides, proteins and glycoproteins (antigens, antibodies, receptors, ligands or fragments thereof ...), nucleic acids (single or double stranded DNA, oligonucleotides, RNA), carbohydrates, lipoproteins , lipids,
  • “Chemical probes” designate any type of chemical molecule, for example from chemical libraries.
  • a “binding vector” is an element capable, on the one hand, of binding covalently or through strong interactions, to a biological and / or chemical probe and, on the other hand, capable of binding to a support, by magnetic attraction.
  • a fixing vector is a magnetic bead of the type of beads known to those skilled in the art, commonly used in biology for cell separation or molecular purification, and sold for example by
  • the vector of attachment is not necessarily spherical. In all cases, the "diameter of the fixation vector" will designate the diameter of the sphere to which the particle is circumscribed.
  • An "organized network” can be defined as a set of points such that the content of each point is known according to its coordinates.
  • network here will designate a set of points fixed on a support, and will then be synonymous with “chip”.
  • a “magneto-chip” is a chip according to the invention, that is to say a network of ligands or biological or chemical probes immobilized on a support, by magnetic attraction, via a fixing vector.
  • a “point” of the network is, in the case of the present invention, a hybridization or reaction unit carrying a given probe, and having a given “density”.
  • the “density of a point” is defined here as the number of probes per point (for example number of molecules, if the probe is molecular).
  • Network density refers to the number of points per unit area.
  • a “paramagnetic” material is characterized by a weak magnetic susceptibility and a rapid loss of its magnetism when it is no longer in a magnetic field.
  • Magnetic materials have a high magnetic susceptibility and are capable of retaining magnetic properties in the absence of a magnetic field (permanent magnetism).
  • superparamagnetic materials are characterized by a high magnetic susceptibility (ie they become strongly when placed in a magnetic field), but, like paramagnetic materials, they quickly lose their magnetism in the absence of a magnetic field.
  • Superparamagnetism can be obtained in ferromagnetic materials when the size of the crystal is less than a critical value.
  • Superparamagnetic balls have the double advantage of being able to undergo a strong attraction by a magnet, and not to aggregate in the absence of magnetic field.
  • the support can consist of a simple magnetized blade, and then creates a magnetic field of homogeneous intensity on its surface.
  • the support can have a “structured magnetism”, defined by an intensity of the magnetic field which is not homogeneous on the surface of the support and has maxima at well-defined positions. This is the case for example of a silica blade in which micro-magnets would be embedded (three-dimensional structure), or of a simple magnetized blade covered by an opaque mask with a magnetic field and pierced with regularly spaced windows (two-dimensional structure) .
  • the present invention consists in fixing at well defined positions, organized in a network on a magnetic support, biological or chemical probes linked by a covalent bond or by strong interactions to a particle capable of being attracted by a magnetic force. These particles constitute the "fixation vectors".
  • the probes are retained at precise coordinates of the support by the interaction between the fixation vectors and the magnetic support.
  • the support must therefore be capable of providing or undergoing a magnetic attraction. It can consist of a simple magnetized blade, but it can also be a structured support comprising three-dimensional magnetic zones, for example a silica blade comprising cavities filled with ferromagnetic particles.
  • the magnetism of the support can also be of electrical origin.
  • An example of a support having structured electromagnetism is a micro-circuit comprising a set of conductive loops traversed by a current.
  • the attachment vectors are elements capable of undergoing and possibly of providing a magnetic attraction.
  • These fixing vectors can be paramagnetic, that is to say that they are attracted by a magnet but do not exhibit magnetism when they are placed outside the magnetic field.
  • the coupling of the probes to the support by fixation vectors made of paramagnetic material will not be very strong, and it is therefore preferable to consider the use of superparamagnetic or ferromagnetic materials. They may, for example, be magnetic beads with a diameter of less than 5 ⁇ m, commonly used in biology and inexpensive, or nanoparticles such as nanoferrins.
  • the attachment of the probe (s) to the attachment vector can be done either by covalent bonds, or by non-covalent bonds of affine type for example, such as the bonds involved between streptavidin and biotin, the antigenic bonds. antibodies or receptor ligand interactions.
  • affine type for example, such as the bonds involved between streptavidin and biotin, the antigenic bonds.
  • antibodies or receptor ligand interactions Many types of magnetic beads covered with molecules capable of specifically binding to a biological target are already on the market. These are, for example, beads coated with streptavidin or avidin, capable of interacting with biotin, or beads bearing particular antibodies capable of binding to proteins, or to cells by interaction with a membrane receptor.
  • Beads coated with poly-dT or poly-U oligonucleotides can also be used as a binding vector for nucleic acid probes comprising a poly A residue (for example, cDNAs having a poly-A "tail” or RNAs messengers).
  • a poly A residue for example, cDNAs having a poly-A "tail” or RNAs messengers.
  • the points of the network will advantageously be of reduced size, for example with a diameter of the order of 50 ⁇ m.
  • a larger diameter for example 200 ⁇ m, will be preferred in other types of applications, for example in the case where the probes are cells.
  • all the points of the same network will have the same surface.
  • the invention therefore relates to a two-dimensional or three-dimensional network of points regularly arranged on the support, each point being made up of a different type of biological or chemical probe, connected by covalent bonds or strong interactions with its fixing vector, - even immobilized on the support by magnetic interaction.
  • the originality of such a network lies in the method used to immobilize the probe / fixing vector couple at precise coordinates on the support in order to form a micro network.
  • the immobilization of the probes in the network is not due to a chemical reaction but calls upon a physical force: the magnetic force.
  • Coupling the probes to the support by magnetic interaction via a binding vector has many advantages. Firstly, this type of coupling avoids any prior chemical treatment of the support with a view to fixing the probes, and does not require storage under special conditions. Indeed, in the context of a chemical functionalization of the surface of the support, the vagaries of surface treatment and the degradations occurring during storage, do not make it possible to guarantee the reproducibility and the stability of a chemical substrate. As for example, mention may be made of the dehydration or rehydration of the Lysine or Polyacrylamide substrate. In the case of the networks described in the present invention, the magnetic supports can be used instantaneously and do not need any particular conditioning.
  • Molecular probes can be made up of RNA or DNA molecule, double or single strand, proteins or peptides, more generally of any type of biological or chemical molecule that one wishes to immobilize in a stable manner at precise positions on a support, in order to form a micro network.
  • the size and quality of the single-stranded DNA or RNA fragments used is not limiting, since they are synthesized and purified outside the chip, under optimal conditions.
  • the probes are large single-stranded DNA molecules, which increases the detection sensitivity compared to oligonucleotide or double DNA probes strand.
  • the attachment of the probes to the support by means of a fixing vector coupled to the support by magnetic interaction also makes it very easy to produce networks of cells, genetically modified or not, for screening molecules.
  • cells genetically modified to express stress genes can be immobilized for screening for stress agents or anti-stress molecules in large series.
  • the long-term immobilization of the molecular probe / vector of attachment to the fixed support pair in order to create a micro network results from the magnetic interaction of the attachment vector and the support. It is important to note that in this approach, the members of the attachment support / attachment vector pair do not necessarily have to both supply a magnetic force (or magnetic field) simultaneously. It suffices that one of the two actors provides the force (or the magnetic field) and that the other actor is capable of undergoing this force (is attracted by the magnetic field).
  • the invention therefore relates firstly to an organized network of biological or chemical probes, linked to a support by magnetic coupling, using a fixing vector.
  • the support is optically neutral.
  • the support comprises a permanent magnet, for example a samarium-cobalt or neodymium-iron-boron magnet, such as those sold by the company UGIMAG, 38830 Saint
  • the support has an electro-induced magnetism.
  • the support has structured magnetism. If the support has a permanent magnet, this property can result from the very structure of the support. This may for example consist of a blade of a material inert on the magnetic plane (for example, silica), which has regularly spaced holes which are filled with ferromagnetic particles. Structured magnetism can also be obtained from a plane permanent magnet, and the use of a mask. In the case of an electromagnetic support, structured magnetism can be obtained for example with a micro-circuit comprising a set of conductive loops in parallel. The magnetic support can be chosen such that the magnetic field is perpendicular or parallel to the largest surface of the support.
  • the networks of the present invention include attachment vectors, which ensure the coupling of biological or chemical probes to the magnetic support. These fixation vectors must by definition be capable of undergoing and if necessary of providing a magnetic attraction.
  • a fixing vector is therefore paramagnetic, superparamagnetic or ferromagnetic.
  • An example of a fixing vector is a ball of latex or of polysaccharides, comprising particles of iron oxide.
  • the fixation vectors can be multipolar or, on the contrary, capable of orienting themselves in a magnetic field.
  • the fixing vectors are themselves magnetized.
  • magnetized fixing vectors have the disadvantage of aggregating even in the absence of a magnetic field.
  • the attachment vectors will therefore preferably be superparamagnetic.
  • the attachment vectors which can be used to produce networks according to the present invention have a diameter of between 1 nm and 500 ⁇ m, preferably between 0.5 and 5 ⁇ m.
  • the fixing vectors are intended to ensure the coupling of the probes to the support. In addition to their magnetic properties, they must therefore be able to bind to the probes, by covalent bond or by strong interactions, for example of the affine type.
  • the attachment vector carries elements capable of specifically binding to a biological target.
  • An example of a covalent bond, specific for a type of target, is that established by condensation between a Schiff base and certain compounds of R-NH 2 type .
  • Examples of specific non-covalent bonds of a biological target are the affine interactions established between a receptor and a corresponding ligand, or between an antigen and an antibody recognizing it. It can also be hydrogen bonds established between two complementary nucleic acid sequences.
  • a fixing vector carries elements capable of specifically binding to a biological target when it carries elements having a high affinity for a given type of biological molecules.
  • these elements can be selected, for example, from the group comprising immunoglobulins, antigens or fragments thereof, membrane receptors, membrane receptor ligands, avidin, streptavidin, oligonucleotides poly-T or poly-U, or any chemical or biological molecule allowing a specific interaction.
  • the invention also relates to the coupling product between a biological or chemical probe and a binding vector.
  • the number of copies of the probe coupled to each binding vector will be between 1 (for example, when the probe is a cell) and 10 8 (for example, for a nucleic probe).
  • the invention relates to the coupling product between a nucleic acid probe and a binding vector.
  • the nucleic acid probe is preferably a single-stranded DNA probe of a size greater than 50 nucleotides, but it can also be a single-stranded oligonucleotide or double-stranded DNA.
  • Each coupling product between a binding vector and a nucleic acid probe carries a number between 10 3 and 10 8 , preferably between 10 5 and 10 7 nucleotide probes.
  • each probe coupled to its attachment vector is deposited at a point whose diameter is between 10 ⁇ m and 1 mm, preferably between 50 and 200 ⁇ m.
  • the diameter of the points will be chosen by a person skilled in the art according to the type of application considered, in particular according to the type of probe used.
  • Each point of the networks of the invention comprises between 10 5 and 10 10 probes, preferably between 10 8 and 10 10 probes.
  • the number of probes per point is the product of the number of fixation vectors per point, multiplied by the number of probes linked on average to a fixation vector. These two parameters are controllable experimentally.
  • the number of probes linked on average to a binding vector depends in particular on the “capacity” of the vector, that is to say on the average number of binding sites of each vector. This “capacity” is indicated by the suppliers of functionalized magnetic beads.
  • the number of fixing vectors per point will be calculated by a person skilled in the art so that the density of fixing vectors per unit area is such that the fixing vectors form a monolayer.
  • the networks of the invention can therefore advantageously have points of homogeneous density, that is to say that each point theoretically comprises the same number of probes.
  • the density of the networks of the invention is between 1 and 100,000 points per cm 2 , preferably between 10 and 1,000 points per cm 2 .
  • the invention also relates to methods of fabricating an organized array of biological or chemical probes linked to a support by magnetic coupling using a fixation vector.
  • a first method of the invention, described in Example 1, comprises the following steps:
  • Another manufacturing process, illustrated in example 2, of an organized network of biological or chemical probes, linked to a support by magnetic coupling using a fixing vector, comprises the following steps:
  • the step of coupling the attachment vector to the support can be carried out using a mask.
  • This mask pierced with regularly spaced windows, is preferably opaque to the magnetic field, so that the fixing vectors will be fixed only at said windows.
  • the mask may be permeable to the magnetic field.
  • the fixing vectors will first be fixed over the entire surface of the support, whether or not covered by the mask.
  • the mask will be carefully removed, so as to remove the fixation vectors which were not directly in contact with the support.
  • Example 3 An alternative method of manufacturing an organized network of biological or chemical probes, linked to a support by magnetic coupling using a fixing vector, is described in Example 3, and comprises the following steps:
  • the deposition of the attachment vectors, whether or not coupled to the probes, on the magnetic support or not is achieved by any means that a person skilled in the art can imagine. It can be carried out for example using pipettes, micropipettes, piezoelectric pipettes, nozzles, needles, or small electromagnets whose soft iron core would consist of a needle with a diameter of less than 200 ⁇ m per l 'end.
  • a particular method of the invention, described in Example 4, allows the manufacture of an organized network of probes made up of single-stranded nucleic acid molecules whose size can be between 20 and 5000 nucleotides, but preferably between 100 and 500 nucleotides. This process includes the following steps:
  • the step of binding the probe to the binding vector is carried out at a concentration of probes which is saturated for the binding vector.
  • concentration of probes which is saturated for the binding vector.
  • the invention also relates to a support capable of exhibiting structured, permanent or electroinduced magnetism, for the manufacture of an array of biological or chemical probes such as those described above.
  • a preferred support of the invention has permanent structured magnetism. More preferably, a support of the invention has a static magnetization decoupled from any electric field and is inert for any charged molecule.
  • An organized network of attachment vectors coupled to a support by a magnetic interaction between the support and the attachment vectors is also part of the present invention.
  • the invention relates to a kit for the manufacture of an organized network of biological or chemical probes, comprising a magnetic support and fixing vectors.
  • a kit for the manufacture of an organized network of biological or chemical probes comprising a magnetic support and fixing vectors.
  • Such a kit is particularly advantageous to allow research or analysis laboratories to manufacture themselves, at low cost, networks of probes particularly suited to their needs.
  • this kit can allow a laboratory to develop a DNA chip "to order", possibly by implementing the last process mentioned above.
  • the magnetic support present in a kit of the invention is optically neutral and includes a permanent magnet. If necessary, this support has a structured magnetism.
  • the fixing vectors are already fixed to the support, according to an organized network.
  • the fixing vectors present in the kits according to the invention are for example paramagnetic, superparamagnetic, or ferromagnetic beads.
  • the attachment vector is functionalized, that is to say that it carries elements capable of specifically binding to a biological target.
  • kits of the invention may be intended for several types of use, or may be intended to be used with a given type of probes.
  • a kit comprising, as binding vectors, beads carrying oligonucleotides comprising a poly-T or poly-U end will be more specifically used to manufacture messenger RNA or cDNA chips on which a poly A tail is grafted.
  • a kit in which the binding vector is coupled to streptavidin or to avidin can be used for any type of probe which it is possible to biotinylate.
  • kits of the invention may also include one or more control probe (s), possibly linked to the binding vector. It may, for example, be a single-stranded DNA probe encoding a fragment of ⁇ -actin, if the kit is intended to manufacture chips to analyze the expression of genes in eukaryotic cells.
  • a kit can also comprise on the one hand, the free control probe, and on the other hand, the control probe already fixed on the fixing vector, which will allow the user to control the step of coupling the probes on the fixation vectors.
  • the kits can also include attachment vectors coupled to labeled probes, intended to calibrate the deposition of the attachment vectors on the support. These examples are not limiting, and those skilled in the art are able to imagine any type of kit comprising additional elements intended to facilitate its use, to allow a more precise interpretation of the results, or to target a particular type of application.
  • Fig. 1 Attachment of the probe to the magnetized particle
  • Fig. 2 Realization of a magneto-chip
  • Fig. 3 Creation of a network of functionalized beads
  • Fig. 5 Depositing the probes on a previously magnetically organized network
  • Fig. 6 Fluorescence image, scanned at 5 ⁇ m resolution, of the formation of a complex between the nucleic probes and the binding vectors on the slide: A) Cy3-labeled probe not functionalized with biotin
  • the observation is carried out with a GMS 428 scanner at 5 ⁇ m resolution.
  • Fig. 7 Fluorescence image, scanned at 5 ⁇ m resolution, of the hybridization of the nucleic target on the bead / probe complex:
  • Fig. 8 Fluorescence image, scanned at 5 ⁇ m resolution, of the binding of a target and of a protein probe on a binding vector:
  • the particles are pre-incubated with serum albumin (BSA), then with the total total protein extract linked to Cy3
  • B) the particles are pre-incubated with the non-specific antibody, then with unlabeled BSA, then with the total extract marked in Cy3
  • Example I Method of Manufacturing a Magneto-Chip by One-Step Deposition
  • the probes are fixed to magnetized particles, for example multipolar magnetic beads.
  • the attachment to the bead is done either by a covalent bond, or any other chemical bond, for example the establishment of a SCHIFF base, or by a non-covalent bond, such as for example the streptavidin / biotin or antibody / antigen bonds. (figure 1).
  • the attachment vector / probe assembly is then deposited at the desired density over a small area of a few ⁇ m 2 of the magnetic support. There is thus obtained at the determined coordinates of the support, a point of probes identical to the desired density. The operation is carried out as many times as necessary to obtain a micro array of different probe points. Note that several points can be made simultaneously ( Figure 2).
  • Example II Method of Manufacturing a Magneto-Chip by Two-Step Deposition
  • Example II An alternative to the protocol described in Example I is possible by using a non-covalent bond between the binding vectors and the probes. Indeed, in the latter case, it is possible to dissociate the deposition of functionalized beads and probes on the magnetic surface.
  • the beads functionalized with streptavidin are first deposited on the magnetic support so as to create a regular network of magnetic beads where each point consists of a density of well beads. defined.
  • the network can be created in two ways, either by successive deposits as above (Figure 3A), or in a single operation using a mask ( Figure 3B).
  • the network of magnetic beads will be made using a mask “insulating for the magnetic field” leaving only exposed the surfaces of the magnetized blade intended to receive the beads, the rest of the surface of the magnetized blade being masked (cf. fig. 3B). Therefore, only the free parts of the magnet can immobilize the magnetic balls.
  • the mask for depositing the beads may be a silica blade structured by chemical treatment or a plastic film architecture with a laser.
  • the support has a structured magnetism, for example if it is a silica blade in which micro-magnets are embedded, the network of fixing vectors can be produced in a single operation without the need to use a mask.
  • the unbound probes are eliminated by adding free streptavidin and washing.
  • a final variant consists in depositing the probes linked to the fixing vector on a glass slide and then transferring the couples formed by the magnetic beads and the probes which are fixed to them to a magnetized slide.
  • the transfer can be done simply by bringing the magnetized blade above the glass slide, the magnetized ball / probe couple jumping spontaneously at equivalent coordinates, from the glass slide to the magnetic blade.
  • the magnetic attraction is provided by magnetic blades of 35 x 25 mm for a thickness of 1 mm.
  • blades composed of neodymium iron boron which can provide a maximum magnetization of 1, 3 T
  • magnetic blades of samarium cobalt which can provide a maximum magnetization of 1 T.
  • the fixation vectors used are beads (Dynabeads) with a diameter of 2.8 ⁇ m, made of polymer, including iron oxides (Fe 2 O 3 10-14%) with a susceptibility of 8.10 "3 cgs per unit.
  • the oxide particles provide reactivity to the magnetic field.
  • These beads are covalently coated with streptavidin molecules capable of fixing biotin.
  • the density of streptavidin receptors is 7.10 5 to 10 6 on average per ball.
  • the deposition of the vector (bead) / probe (single-strand cDNA molecule) couple is carried out initially using a 0.2 mm pen at the end.
  • the concentration of beads chosen for each deposit will be such that a deposit will represent approximately 6000 beads, which will correspond to 6.10 9 probe molecules per unit of hybridization, if all the streptavidin sites are saturated. Under these conditions, a single-layer deposit of balls is obtained (each ball rests directly on the blade).
  • the PCR specific region of the gene to be studied is carried out.
  • a double strand sequence is thus obtained for each PCR.
  • This sequence is biotinylated respectively in 5 ′ of the coding strand, 5 ′ of the reverse strand or biotinylated in 5 ′ on the two strands depending on the construction chosen.
  • the double strands are denatured by soaking, then coupled to magnetic beads functionalized with streptavidin. The number of magnetic beads added is calculated so that the streptavidin sites are saturated with DNA biotin.
  • all the beads will have fixed n single-stranded DNA molecules, where n represents the number of streptavidin sites per bead.
  • the ball / single-strand DNA pair is precipitated in a magnetic field and then washed to remove DNA not attached to biotin (in the case where only one of the primers was biotinylated, only one of the two strands of the DNA double helix is retained).
  • the magnetic ball (vector) / single-strand DNA (probe) couple is resuspended at the desired concentration in order to obtain a desired final DNA concentration; in this case, the DNA molarity which depends on the concentration of beads is obtained directly.
  • the attachment vector assembly (magnetic bead) / probes (single-stranded DNA) is deposited using a feather or an electric pietzo pipette at the desired density on a small area of 100 to 300 ⁇ m side.
  • a feather or an electric pietzo pipette is deposited using a feather or an electric pietzo pipette at the desired density on a small area of 100 to 300 ⁇ m side.
  • the slide thus produced is then directly hybridized with a mixture of fluorescently labeled cDNAs.
  • These cDNAs are obtained by RT-PCR (in the presence of Cy3 TM for example, as a fluorescent marker) from the mRNAs extracted from the cells studied. It is also possible to carry out a co-hybridization from two RNA extracts which will provide cDNAs labeled respectively in Cy3 TM and Cy5 TM.
  • Example V Magnetochip of single-stranded DNA probes targeting the GADPH and HPRT genes.
  • the underlined sequences correspond to the specific primers used to amplify the probes.
  • Example VI Verification of the formation of a complex between the nucleic probes and the binding vectors on the slide.
  • the binding vectors used here are paramagnetic Fe 2 ⁇ 3 polystyrene particles 1 ⁇ m in diameter, functionalized with streptavidin.
  • the probe corresponds to the fragment of the GAPDH gene indicated in the previous example. It is functionalized or not by 5 'biotin, on only one of the two strands (the sense strand).
  • the probes are labeled either in Cy3 TM or in Cy5 TM throughout the sequence during an amplification by PCR.
  • the PCR products are precipitated, resuspended, denatured at 100 ° C, quenched at 0 ° C and then incubated with the particles, at 4 ° C for 60 minutes.
  • the complexes obtained probe / vector are precipitated by magnetic activation and washed three times in 10X SS ⁇ buffer and 1 time in 3X SSC buffer.
  • the base is re-suspended in a 3X SSC buffer.
  • Example VII Verification of the hybridization of the nucleic target on the probe ball complex.
  • the probes consist of a fragment of the GAPDH gene sequence functionalized or not by biotin in 5 ′ on the sense strand.
  • the targets consist of the PCR product of GAPDH labeled throughout the sequence in Cy3 TM or Cy5 TM.
  • the binding vectors are paramagnetic Fe 2 O 3 polystyrene particles 1 ⁇ m in diameter functionalized with streptavidin.
  • the probes are denatured at 100 ° C, quenched at 0 ° C and then complexed with particles at 4 ° C for 60 min.
  • the probe / vector complexes obtained are precipitated by magnetic activation and rinsed four times in 10X SSC buffer.
  • the pellet is re-suspended in a 25% formamide buffer, the denatured targets are then mixed with the probes and are hybridized at 50 ° C.
  • Targets are therefore able to hybridize to the probe when it is attached to the particle, and there is very little non-specific absorption.
  • the target is well retained on the slide via the vector.
  • Example VIII Verification of target and protein probe fixation on a fixation vector.
  • the vectors are paramagnetic Fe 2 0 3 polystyrene particles 1 ⁇ m in diameter, capable of adsorbing proteins on their surface, in an aspecific manner.
  • the probe is here an antibody specific for a protein x.
  • the target is a protein x contained in a cell extract labeled with Cy3.
  • An antibody which is not specific for protein x, and which does not recognize any element of the cell extract containing the target, is used as a control.
  • FIG. 8 A the particles were pre-incubated with serum albumin (BSA), then with the total protein extract labeled with Cy3.
  • BSA serum albumin
  • Figure 8B the particles were pre-incubated with the non-specific antibody, then saturated with unlabelled BSA, then incubated with the total extract labeled with Cy3. The same nonspecific binding appears as during the pre-hybridization with BSA.
  • Figure 8C the particles were pre-incubated with the specific antibody x, saturated with unlabeled BSA, then incubated with the total extract labeled with Cy3.
  • the intensity of the fluorescence signal is increased compared to the aspecific hybridization. There is indeed a specific hybridization with anti-x antibodies.
  • the non-specific fixation observed in this experiment is important. This non-specific fixation can be eliminated by using paramagnetic particles of the silicate or silicon type such as “particulate silica” or “beads silica”, on which SH functions are grafted.
  • the antibodies can be fixed for example by the thiol of the heavy chain after reduction.
  • the specific binding site will therefore consist of a light chain and a heavy chain covalently linked to the particle by an S-S bridge.
  • Example IX Feasibility of a network of paramagnetic particles on a support having a static magnetization of 1T.
  • the beads functionalized with probes marked in Cy3 were deposited at a density of 625 per cm 2 on a support having a static magnetization of 1T.
  • the network obtained was then washed three times with a 10X SSC solution, then once in a 3X SSC solution.
  • the result, illustrated in Figure 9, shows the stability of the network obtained.

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Abstract

L'invention porte sur un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, liées à un support par couplage magnétique à l'aide d'un vecteur de fixation. Le support peut comporter un aimant permanent ou présenter un magnétisme électro-induit. Les vecteurs de fixation peuvent être constitués de billes magnétiques fonctionnalisées pour être capables de se lier spécifiquement à un type de sondes biologiques.

Description

MICRO RESEAU STATIQUE DE SONDES BIOLOGIQUES OU CHIMIQUES, IMMOBILISEES SUR UN SUPPORT PAR ATTRACTION
MAGNETIQUE
La présente invention a pour objet un réseau de ligands biologiques ou chimiques (sondes) immobilisés sur un support non fonctionnalisé chimiquement, par attraction magnétique.
Les sondes peuvent être des produits naturels ou synthétiques ayant une activité biologique ou chimique ou une affinité pour des molécules biologiques ou chimiques, par exemple, des peptides, des protéines, des oligonucléotides, des ARN, des ADN double brin ou simple brin, des polysaccharides et des phospholipides et des combinatoires de produits chimiques. Ces réseaux, d'un coût très réduit, peuvent trouver des applications dans de nombreux domaines, par exemple comme outils de diagnostic, ou comme outils de criblage de collections de molécules ou d'échantillons biologiques, ou de molécules à visée thérapeutique ou diagnostique. L'invention réside dans l'immobilisation stable de ces ligands sur une surface magnétique, pour organiser un réseau de sondes biologiques ou chimiques. Cette méthode peut être adaptée à la production de micro réseaux de densité variable ou de macro réseaux.
De nombreuses méthodes ont été proposées au cours des dernières années, pour fabriquer des réseaux miniaturisés comportant des sondes biologiques immobilisées à des positions bien définies.
Il existe deux technologies pour fabriquer de telles matrices. La première technologie consiste à faire une synthèse directe d'oligonucléotides courts ou de peptides, sur une surface préalablement fonctionnalisée et activée pour permettre le greffage. La seconde technologie consiste à immobiliser les ligands préalablement synthétisés et caractérisés avant leur immobilisation, sur une surface fonctionnalisée, le dépôt de ces sondes pouvant être réalisé par des méthodes mécaniques ou électrochimiques.
Plusieurs brevets et publications décrivent l'application de la photo- lithogravure, pour réaliser un adressage photochimique, notamment pour l'obtention d'une matrice d'oligonucléotides ou de peptides par adressage photochimique. Ce procédé consiste à utiliser des surfaces fonctionnalisées chimiquement et protégées par des groupements photo-activables. Une illumination sélective à l'aide de masques permet ensuite de déprotéger les différents sites de couplage et de réaliser une synthèse in situ de l'oligonucléotide ou du peptide.
Cette méthode d'adressage photochimique présente plusieurs inconvénients. Tout d'abord, les réactions de déprotection n'ont pas un rendement de 100%.
Par conséquent, les synthèses in situ accumulent des erreurs pouvant conduire par exemple à des ligands tronqués et à des misappariements terminaux dans le cas d'oligonucléotides. Ceci impose une forte redondance des sondes et de nombreux contrôles, ainsi qu'une informatique lourde pour reconstituer un signal standard. D'autre part, la qualité des réactions d'interaction ou d'hybridation avec des ligands de courte taille immobilisés en phase solide est difficile à prédire. Enfin, l'utilisation de jeux de masques complique le procédé et le rend coûteux et peu flexible, ce qui constitue un inconvénient majeur. En effet, les bases de données génomiques et fonctionnelles sont en perpétuelle évolution, puisqu'elles intègrent en permanence les nouveaux résultats obtenus par de très nombreux laboratoires. Ceci conduit d'une part à un enrichissement de ces bases de données, et d'autre part, à la correction de certaines séquences erronées présentes dans ces bases. Dans les domaines de la recherche et des études cliniques, il est donc utile de pouvoir adapter le réseau utilisé à l'objet biologique étudié, en fonction de l'évolution des connaissances. Les procédés de fabrication de réseaux décrits ci-dessus, reposant sur l'utilisation de jeux de masques, n'ont pas la souplesse nécessaire pour modifier rapidement et à peu de frais la séquence de certaines sondes, ni pour ajouter facilement ne fût-ce qu'une sonde supplémentaire.
Le deuxième type de technologie employé pour produire des réseaux de sondes paraît a priori plus adapté à l'intégration de nouvelles données, puisqu'il consiste à synthétiser et caractériser individuellement des sondes avant de les immobiliser sur un support.
Une première méthode de greffage de sondes a été décrite dans Lehrach et al. (in Hybridization fingerprinting in génome mapping and sequencing, génome analysis, 1990, Cold Spring Harbor press, pages 39-81). Cette méthode utilise des aiguilles pour constituer des réseaux de 9216 unités d'hybridation. La limite de cette méthode réside dans la grande variabilité des dépôts et le nombre réduit de réseaux qui peuvent être produits à la fois.
D'autres technologies d'adressage par voie mécanique ou électrochimique ont été décrites. Dans ces méthodes, les ligands sont préparés, purifiés puis déposés sur une surface activée. Par exemple, des oligonucléotides de longueurs variables et des sondes double brin pré-amplifiées peuvent être déposés pour réaliser des réseaux de matrices d'ADN. La surface de dépôt peut être en verre ou en silicium poreux ou non, en matériau polymère ou toute autre surface fonctionnalisée chimiquement.
Ainsi, plusieurs documents décrivent l'utilisation de la technique de micro pipetage ou de repiquage à l'aide d'aiguilles pour déposer des sondes nucléiques sur des surfaces de verre fonctionnalisées par de la Poly-L-lysine ou par un gel de polyacrylamide activé en substituant certains groupes amides en groupes hydrazides. Ces méthodes présentent plusieurs inconvénients majeurs. En premier lieu, la fonctionnalisation chimique de la surface sans laquelle une fixation covalente et robuste du ligand n'est pas possible est difficile à contrôler. De plus, la densité des ligands déposés et immobilisés n'est pas contrôlable. Enfin, le greffage chimique des sondes peut, dans certains cas, altérer leur réactivité vis-à-vis de leur cible, par exemple dans le cas d'un récepteur fixé à un support fonctionnalisé par l'intermédiaire d'un groupement aminé proche du site de reconnaissance.
Des techniques d'adressage électrochimique ont également été décrites (demande de brevet WO A-94/22889). Dans ce cas, on part d'un support qui comporte plusieurs électrodes et on utilise ces électrodes pour fixer des ligands biologiques par voie électrochimique en utilisant des ligands préalablement fonctionnalisés à l'aide d'un électrolyte comme le noyau pyrrole ayant la propriété de polymériser sous l'effet d'un courant. Cette méthode présente l'avantage d'un adressage contrôlé de ligands sur une zone de réaction. L'adressage nécessite cependant l'utilisation d'une surface conductrice, de réactifs fonctionnalisés et un lourd procédé pour l'industrialisation et le contrôle qualité des matrices produites en grandes séries.
Tous les procédés décrits ci-dessus ont permis de fabriquer des micro réseaux de sondes biologiques, mais sont limités dans leur possibilité de diversification et par leur mise en oeuvre, souvent complexe, à l'échelle industrielle.
De plus, la plupart des documents cités ci-dessus décrivent l'utilisation de ces méthodes pour obtenir des réseaux de sondes nucléiques limitées à des oligonucléotides ou à des ADN double brin. Il est pourtant plus avantageux, pour des raisons de sensibilité, d'utiliser des sondes d'ADN simple brin d'une taille supérieure à celle des oligonucléotides synthétiques, qui dépassent difficilement quelques dizaines de nucléotides. Par exemple, des sondes d'ADN simple brin de 100 à 500 bases permettraient d'obtenir une excellente spécificité d'hybridation. De plus, l'avènement de la génomique fonctionnelle crée une demande importante de réseaux de sondes polypeptidiques, proteiques et même cellulaires.
On voit donc qu'il existe un besoin important de méthodes moins coûteuses, plus adaptées à de nombreuses modifications, permettant d'utiliser tous les types de sondes (nucléiques, proteiques, cellulaires, chimiques...), et qui puissent être réalisées sur demande dans des laboratoires sans équipement particulier.
La présente invention a précisément pour objet des micro réseaux de sondes extrêmement diversifiées et qui peuvent être des sondes nucléiques (oligonucléotides, ADN double brin ou ADN simple brin, ARN,...), des protéines (récepteurs membranaires, anticorps monoclonaux, peptides, protéines recombinantes ou des domaines de celles-ci,...), ou encore des virus, des cellules, ou des molécules de synthèse organique issues de chimiothèques. Ces réseaux de sondes biologiques ou chimiques sont de réalisation aisée, par un procédé qui repose sur l'immobilisation des sondes sur un support par interaction magnétique. Les matrices ainsi créées sont utilisables dans tous les domaines d'utilisation des micro ou macro réseaux, et plus particulièrement en diagnostic, pharmacogénomique, toxicogénomique, étude de la structure et de l'expression de génomes, et de manière générale dans tout type d'application mettant en jeu des interactions moléculaires. Elles peuvent donc notamment servir d'outils de diagnostic ou de criblage à haut débit. La fabrication de ces réseaux ne nécessite aucune fonctionnalisation chimique préalable du support et peut être faite de façon simple et peu coûteuse. La qualité du substrat chimique sur lequel s'effectue l'immobilisation n'est plus un élément limitant.
Un des avantages de l'invention est également d'augmenter la sensibilité de détection de ces réseaux. La possibilité de fixer des ADN simple brin, qui évite la compétition du double brin lors de l'hybridation de cibles nucléiques est un exemple significatif. La possibilité de fixer aisément plusieurs fragments ou domaines de protéines recombinantes préalablement testés pour leurs activités spécifiques est un autre exemple significatif. L'absence d'un traitement chimique pour le greffage des sondes permet de réaliser un traitement optique de série sur les lames, pour les rendre inertes à la fluorescence et à la diffusion parasites.
L'exposé détaillé de l'invention fait appel à plusieurs notions qui sont définies ci-après :
Dans l'ensemble du texte, le terme « sondes biologiques » désignera :
- n'importe quelle molécule biologique telle que peptides, protéines et glycoprotéines (antigènes, anticorps, récepteurs, ligands ou fragments de ceux-ci...), acides nucléiques (ADN simple ou double brin, oligonucléotides, ARN), carbohydrates, lipoprotéines, lipides,
- n'importe quel type de cellules (bactéries, protozoaires, levures, champignons, cellules eucaryotes, ...),
- n'importe quel type de virus,
- fragments de cellules ou de virus, etc.
Les « sondes chimiques » désignent n'importe quel type de molécule chimique, issue par exemple de chimiothèques.
Dans cette demande, un « vecteur de fixation » est un élément capable, d'une part, de se lier covalemment ou par des interactions fortes, à une sonde biologique et/ou chimique et, d'autre part, capable de se fixer à un support, par attraction magnétique. Dans un cas particulier, un vecteur de fixation est une bille magnétique du type des billes connues de l'homme du métier, utilisées couramment en biologie pour faire de la séparation cellulaire ou de la purification moléculaire, et commercialisées par exemple par
Miltenyi ou Dynabeads (par exemple Dynal M-280 streptavidine). Le vecteur de fixation n'est pas nécessairement sphérique. Dans tous les cas, le « diamètre du vecteur de fixation » désignera le diamètre de la sphère à laquelle la particule est circonscrite.
Un « réseau organisé » peut être défini comme un ensemble de points tels que le contenu de chaque point est connu en fonction de ses coordonnées.
Par extension, le terme « réseau » désignera ici un ensemble de points fixés sur un support, et sera alors synonyme de « puce ».
Une « magnéto-puce » est une puce selon l'invention, c'est-à-dire un réseau de ligands ou sondes biologiques ou chimiques immobilisés sur un support, par attraction magnétique, via un vecteur de fixation.
Un « point » du réseau (spot en anglais) est, dans le cas de la présente invention, une unité d'hybridation ou de réaction portant une sonde donnée, et présentant une « densité » donnée.
La « densité d'un point » se définit ici comme le nombre de sondes par point (par exemple nombre de molécules, si la sonde est moléculaire).
La « densité d'un réseau » désigne le nombre de points par unité de surface.
Un matériau « paramagnétique » se caractérise par une susceptibilité magnétique faible et une perte rapide de son magnétisme dès lors qu'il n'est plus dans un champ magnétique.
Les matériaux « ferromagnétiques » ont une susceptibilité magnétique élevée et sont capables de conserver des propriétés magnétiques en l'absence de champ magnétique (magnétisme permanent).
Les matériaux dits « superparamagnétiques » sont caractérisés par une susceptibilité magnétique élevée (c'est à dire qu'ils deviennent fortement magnétiques lorsqu'ils sont placés dans un champ magnétique), mais, à l'instar des matériaux paramagnetiques, ils perdent rapidement leur magnétisme en l'absence de champ magnétique. On peut obtenir du superparamagnétisme dans des matériaux ferromagnétiques quand la taille du cristal est inférieure à une valeur critique. Des billes superparamagnétiques présentent le double avantage de pouvoir subir une attraction forte par un aimant, et de ne pas s'agréger en l'absence de champ magnétique.
Le support peut être constitué d'une simple lame aimantée, et crée alors un champ magnétique d'intensité homogène à sa surface. Alternativement, le support peut présenter un « magnétisme structuré », défini par une intensité du champ magnétique qui n'est pas homogène à la surface du support et présente des maxima à des positions bien définies. Ceci est le cas par exemple d'une lame de silice dans laquelle seraient incrustés des micro- aimants (structuration tridimensionnelle), ou d'une lame aimantée simple recouverte par un masque opaque au champ magnétique et percé de fenêtres régulièrement espacées (structuration bidimensionnelle).
La présente invention consiste à fixer à des positions bien définies, organisées en réseau sur un support magnétique, des sondes biologiques ou chimiques reliées par une liaison covalente ou par des interactions fortes à une particule capable d'être attirée par une force magnétique. Ces particules constituent les « vecteurs de fixation ». Les sondes sont retenues à des coordonnées précises du support par l'interaction entre les vecteurs de fixation et le support magnétique.
Le support doit donc être capable de fournir ou de subir une attraction magnétique. Il peut être constitué d'une lame aimantée simple, mais il peut s'agir aussi d'un support structuré comportant des zones tridimensionnelles magnétiques, par exemple d'une lame de silice comportant des cavités remplies de particules ferromagnétiques. Le magnétisme du support peut aussi être d'origine électrique. Un exemple de support présentant un électromagnétisme structuré est un micro-circuit comportant un ensemble de boucles conductrices parcourues par un courant.
Les vecteurs de fixation, permettant le couplage des sondes au support, sont des éléments capables de subir et éventuellement de fournir une attraction magnétique. Ces vecteurs de fixation peuvent être paramagnetiques, c'est-à- dire qu'ils sont attirés par un aimant mais ne présentent pas de magnétisme lorsqu'ils sont placés en dehors du champ magnétique. Cependant, le couplage des sondes au support par des vecteurs de fixation en matériau paramagnétique ne sera pas très fort, et il est donc préférable d'envisager l'utilisation de matériaux superparamagnétiqùes ou ferromagnétiques. Il peut s'agir par exemple de billes magnétiques d'un diamètre inférieur à 5 μm, communément utilisées en biologie et peu coûteuses, ou de nanoparticules telles que les nanoferrines.
La fixation de la ou des sondes au vecteur de fixation peut se faire, soit par des liaisons covalentes, soit par des liaisons non covalentes de type affine par exemple, telles que les liaisons mises en jeu entre la streptavidine et la biotine, les liaisons antigènes anticorps ou les interactions récepteurs ligands. De nombreux types de billes magnétiques recouvertes de molécules capables de se lier spécifiquement à une cible biologique sont déjà commercialisés. Il s'agit par exemple de billes recouvertes de streptavidine ou d'avidine, capables d'interagir avec la biotine, ou de billes portant des anticorps particuliers capables de se lier à des protéines, ou à des cellules par interaction avec un récepteur membranaire. Des billes recouvertes d'oligonucléotides poly-dT ou poly-U peuvent aussi être utilisées comme vecteur de fixation pour des sondes d'acides nucléiques comportant un résidu poly A (par exemple, des ADNc ayant une "queue" poly-A ou des ARN messagers). Ces exemples ne sont aucunement limitatifs, et l'homme du métier est en mesure de choisir d'autres vecteurs de fixation adaptés à l'application qu'il souhaite faire des réseaux décrits ici. Chaque point du réseau, ou unité d'hybridation, représente quelques dizaines de μm2 à 1 mm2 répertoriés du support, sur lesquels sont greffées des sondes identiques immobilisées par l'interaction de leur vecteur de fixation. Le diamètre des points du réseau dépend du type de vecteur de fixation utilisé et sera choisi en fonction de l'application envisagée. Ainsi, dans une puce à ADN destinée au diagnostic ou au criblage à haut débit, les points du réseau seront avantageusement de taille réduite, par exemple d'un diamètre de l'ordre de 50 μm. En revanche, un diamètre plus important, par exemple de 200 μm, sera préféré dans d'autres types d'applications, par exemple dans le cas où les sondes sont des cellules. De manière préférée, tous les points d'un même réseau auront la même surface. L'invention porte donc sur un réseau bidimensionnel ou tridimensionnel de points régulièrement disposés sur le support, chaque point étant constitué d'un type de sonde biologique ou chimique différent, relié par des liaisons covalentes ou des interactions fortes avec son vecteur de fixation, lui-même immobilisé sur le support par interaction magnétique.
L'originalité d'un tel réseau réside dans la méthode utilisée pour immobiliser le couple sonde / vecteur de fixation à des coordonnées précises sur le support afin de former un micro réseau. L'immobilisation des sondes dans le réseau n'est pas due à une réaction chimique mais fait appel à une force physique : la force magnétique.
Le couplage des sondes au support par interaction magnétique par l'intermédiaire d'un vecteur de fixation présente de nombreux avantages. En premier lieu, ce type de couplage évite tout traitement chimique préalable du support en vue de la fixation des sondes, et ne nécessite pas de stockage dans des conditions particulières. En effet, dans le cadre d'une fonctionnalisation chimique de la surface du support, les aléas du traitement de surface et les dégradations survenant durant le stockage, ne permettent pas de garantir la reproductibilité et la stabilité d'un substrat chimique. A titre d'exemple, on peut citer la déshydratation ou la réhydratation de substrat Lysine ou Polyacrylamide. Dans le cas des réseaux décrits dans la présente invention, les supports magnétiques sont utilisables instantanément et n'ont pas besoin de conditionnement particulier.
De plus, l'absence de nécessité d'un traitement chimique du support pour la fixation des sondes permet de recouvrir la surface du support par une substance optiquement neutre et perméable aux champs magnétiques, en vue d'une détection optimale.
Les sondes moléculaires peuvent être constituées de molécule d'ARN ou d'ADN, double ou simple brin, de protéines ou de peptides, d'une manière plus générale de tout type de molécules biologique ou chimique que l'on veut immobiliser de façon stable à des positions précises sur un support, dans le but de constituer un micro réseau. Dans le cadre des études des acides nucléiques, la taille et la qualité des fragments d'ADN ou d'ARN simple brin utilisés n'est pas limitant, car ils sont synthétisés et purifiés en dehors de la puce, dans des conditions optimales. Dans une réalisation particulière des réseaux de l'invention, illustrée à l'exemple 4, les sondes sont des molécules d'ADN simple brin de taille importante, ce qui augmente la sensibilité de détection par rapport à des sondes oligonucléotidiques ou d'ADN double brin.
La fixation des sondes au support par l'intermédiaire d'un vecteur de fixation couplé au support par interaction magnétique permet également de réaliser très facilement des réseaux de cellules génétiquement modifiées ou non pour cribler des molécules. A titre d'exemple, des cellules génétiquement modifiées pour exprimer des gènes de stress pourront être immobilisées pour des criblages d'agents de stress ou de molécules anti-stress en grandes séries. L'immobilisation durable du couple sonde moléculaire / vecteur de fixation au support fixe dans le but de réaliser un micro réseau, résulte de l'interaction magnétique du vecteur de fixation et du support. Il est important de noter que dans cette approche, les membres du couple support de fixation / vecteur de fixation, ne doivent pas nécessairement fournir tous les deux une force magnétique (ou champ magnétique) simultanément. Il suffit que l'un des deux acteurs fournisse la force (ou le champ magnétique) et que l'autre acteur soit capable de subir cette force (soit attiré par le champ magnétique).
L'invention porte donc en premier lieu sur un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, liées à un support par couplage magnétique, à l'aide d'un vecteur de fixation. De manière préférée, le support est optiquement neutre.
Dans une réalisation particulière de l'invention, le support comporte un aimant permanent, par exemple un aimant samarium-cobalt ou néodyme-fer- bore, tels que ceux commercialisés par la société UGIMAG, 38830 Saint
Pierre d'Allevard, France.
Alternativement, le support présente un magnétisme électro-induit.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le support présente un magnétisme structuré. Si le support comporte un aimant permanent, cette propriété peut résulter de la structure même du support. Celui-ci peut être par exemple constitué d'une lame d'un matériau inerte sur le plan magnétique (par exemple, de silice), qui comporte des trous régulièrement espacés que l'on remplit de particules ferromagnétiques. Le magnétisme structuré peut aussi être obtenu à partir d'un aimant permanent plan, et l'utilisation d'un masque. Dans le cas d'un support électromagnétique, un magnétisme structuré peut être obtenu par exemple avec un micro-circuit comportant un ensemble de boucles conductrices en parallèle. Le support magnétique peut être choisi de telle façon que le champ magnétique soit perpendiculaire ou parallèle à la plus grande surface du support.
Les réseaux de la présente invention comportent des vecteurs de fixation, qui assurent le couplage des sondes biologiques ou chimiques au support magnétique. Ces vecteurs de fixation doivent par définition être capables de subir et le cas échéant de fournir une attraction magnétique. Un vecteur de fixation est donc paramagnétique, superparamagnétique ou ferromagnétique. Un exemple de vecteur de fixation est une bille de latex ou de polysaccharides, comportant des particules d'oxyde de fer.
Les vecteurs de fixation peuvent être multipolaires ou au contraire capables de s'orienter dans un champ magnétique. Dans une réalisation particulière de l'invention, les vecteurs de fixation sont eux-mêmes aimantés. Toutefois, des vecteurs de fixation aimantés présentent l'inconvénient de s'agréger même en l'absence d'un champ magnétique. Les vecteurs de fixation seront donc préférentiellement superparamagnétiques.
Les vecteurs de fixation utilisables pour réaliser des réseaux selon la présente invention ont un diamètre compris entre 1 nm et 500 μm, préférentiellement entre 0,5 et 5 μm.
Les vecteurs de fixation sont destinés à assurer le couplage des sondes au support. Outre leurs propriétés magnétiques, ils doivent donc être capables de se lier aux sondes, par liaison covalente ou par des interactions fortes, par exemple de type affine. Dans une réalisation préférée de l'invention, le vecteur de fixation porte des éléments capables de se lier spécifiquement à une cible biologique. Un exemple de liaison covalente, spécifique d'un type de cibles, est celle établie par condensation entre une base de Schiff et certains composés de type R-NH2. Des exemples de liaisons non covalentes spécifiques d'une cible biologique sont les interactions affines établies entre un récepteur et un ligand correspondant, ou entre un antigène et un anticorps le reconnaissant. Il peut aussi s'agir de liaisons hydrogène établies entre deux séquences d'acides nucléiques complémentaires. Dans la suite de ce texte, on dira qu'un vecteur de fixation porte des éléments capables de se lier spécifiquement à une cible biologique lorsqu'il porte des éléments ayant une affinité élevée pour un type de molécules biologiques donné. Suivant le type de sonde considéré, ces éléments peuvent être sélectionnés par exemple dans le groupe comportant les immunoglobulines, les antigènes ou les fragments de ceux-ci, les récepteurs membranaires, les ligands de récepteurs membranaires, l'avidine, la streptavidine, les oligonucléotides poly-T ou poly-U, ou toute molécule chimique ou biologique permettant une interaction spécifique.
L'invention porte également sur le produit de couplage entre une sonde biologique ou chimique et un vecteur de fixation. Suivant la nature de la sonde, le nombre d'exemplaires de la sonde couplés à chaque vecteur de fixation sera compris entre 1 (par exemple, quand la sonde est une cellule) et 108 (par exemple, pour une sonde nucléique). En particulier, l'invention porte sur le produit de couplage entre une sonde d'acide nucléique et un vecteur de fixation. La sonde d'acide nucléique est préférentiellement une sonde d'ADN simple brin d'une taille supérieure à 50 nucléotides, mais il peut aussi s'agir d'un oligonucléotide simple brin ou d'ADN double brin. Chaque produit de couplage entre un vecteur de fixation et une sonde d'acide nucléique porte un nombre compris entre 103 et 108, préférentiellement entre 105 et 107 sondes nucléotidiques.
L'utilisation d'un produit de couplage formé d'une sonde biologique ou chimique et d'un vecteur de fixation, pour la fabrication d'un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, fait aussi partie intégrante de l'invention. Dans les réseaux de l'invention, chaque sonde couplée à son vecteur de fixation est déposée en un point dont le diamètre est compris entre 10 μm et 1 mm, préférentiellement entre 50 et 200 μm. Le diamètre des points sera choisi par l'homme du métier en fonction du type d'application considérée, en particulier en fonction du type de sonde utilisée.
Chaque point des réseaux de l'invention comporte entre 105 et 1010 sondes, préférentiellement entre 108 et 1010 sondes. Le nombre de sondes par point est le produit du nombre de vecteurs de fixation par point, multiplié par le nombre de sondes liées en moyenne à un vecteur de fixation. Ces deux paramètres sont contrôlables expérimentalement. Le nombre de sondes liées en moyenne à un vecteur de fixation dépend notamment de la « capacité » du vecteur, c'est-à-dire du nombre moyen de sites de liaison de chaque vecteur. Cette « capacité » est indiquée par les fournisseurs de billes magnétiques fonctionnalisées. Le nombre de vecteurs de fixation par point sera calculé par l'homme du métier pour que la densité de vecteurs de fixation par unité de surface soit telle que les vecteurs de fixation forment une monocouche. Les réseaux de l'invention peuvent donc avantageusement avoir des points de densité homogène, c'est-à-dire que chaque point comporte théoriquement le même nombre de sondes.
La densité des réseaux de l'invention est comprise entre 1 et 100000 points par cm2, préférentiellement entre 10 et 1000 points par cm2.
L'invention porte également sur des procédés de fabrication d'un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, liées à un support par couplage magnétique à l'aide d'un vecteur de fixation. Un premier procédé de l'invention, décrit à l'exemple 1 , comporte les étapes suivantes :
A) liaison des sondes au vecteur de fixation,
B) dépôt sur un support magnétique, des sondes couplées au vecteur de fixation, selon un réseau organisé. Un autre procédé de fabrication, illustré à l'exemple 2, d'un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, liées à un support par couplage magnétique à l'aide d'un vecteur de fixation, comporte les étapes suivantes :
A) couplage magnétique d'un vecteur de fixation en des coordonnées connues d'un support,
B) liaison des sondes sur les vecteurs de fixation.
Dans le procédé décrit ci-dessus, l'étape de couplage du vecteur de fixation au support peut être effectuée en utilisant un masque.
Ce masque, percé de fenêtres régulièrement espacées, est préférentiellement opaque au champ magnétique, si bien que les vecteurs de fixation se fixeront uniquement au niveau desdites fenêtres. Alternativement, le masque peut être perméable au champ magnétique. Dans ce cas, les vecteurs de fixation se fixeront dans un premier temps sur toute la surface du support, couverte ou non par le masque. Dans un deuxième temps, le masque sera soigneusement retiré, de façon à retirer les vecteurs de fixation qui n'étaient pas directement en contact avec le support.
Un procédé alternatif de fabrication d'un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, liées à un support par couplage magnétique à l'aide d'un vecteur de fixation, est décrit à l'exemple 3, et comporte les étapes suivantes :
A) liaison des sondes au vecteur de fixation,
B) dépôt des sondes couplées au vecteur de fixation sur une lame non aimantée, selon un réseau organisé
C) transfert du réseau de l'étape B sur un support magnétique.
Dans tous les procédés de l'invention décrits ci-dessus, le dépôt des vecteurs de fixation, couplés ou non aux sondes, sur le support, magnétique ou non, est réalisé par n'importe quel moyen que l'homme du métier peut imaginer. Il peut être effectué par exemple à l'aide de pipettes, micropipettes, pipettes piezzo-électriques, buses, aiguilles, ou de petits électroaimants dont le cœur en fer doux serait constitué d'une aiguille d'un diamètre inférieur à 200 μm à l'extrémité.
Un procédé particulier de l'invention, décrit à l'exemple 4, permet la fabrication d'un réseau organisé de sondes constituées de molécules d'acide nucléique simple brin dont la taille peut être comprise entre 20 et 5000 nucléotides, mais de préférence entre 100 et 500 nucléotides. Ce procédé comporte les étapes suivantes :
A) amplification des sondes à partir d'amorces nucléotidiques dont l'une au moins est biotinylée,
B) dénaturation des sondes par chauffage suivi d'un refroidissement rapide, C) couplage des sondes biotinylées sur des billes paramagnetiques, superparamagnétiques ou ferromagnétiques liées à de l'avidine ou de la streptavidine,
D) précipitation magnétique des sondes liées aux billes,
E) élimination des sondes non liées par lavage, F) resuspension des sondes couplées aux billes à une concentration choisie,
G) dépôt des sondes couplées aux billes sur un support.
Dans une mise en œuvre préférée des procédés décrits ci-dessus, l'étape de liaison de la sonde au vecteur de fixation est réalisée à une concentration de sondes saturante pour le vecteur de fixation. Ceci permet notamment de connaître le nombre de sondes liées en moyenne à chaque vecteur de fixation, de façon aisément reproductible. L'invention porte également sur un support capable de présenter un magnétisme structuré, permanent ou électro-induit, pour la fabrication d'un réseau de sondes biologiques ou chimiques tels que ceux décrits ci-dessus. Un support préféré de l'invention présente un magnétisme structuré permanent. De façon encore préférée, un support de l'invention présente une magnétisation statique découplée de tout champ électrique et est inerte pour toute molécule chargée. En effet, la plupart des polymères biologiques, et particulièrement l'ADN, sont chargés et donc sensibles aux champs électriques, même de très petit voltage, comme décrit dans les articles de Meller et al (Meller, A., L. Nivon, et al. (2000). "Rapid nanopore discrimination between single polynucleotide molécules." Proc Natl Acad Sci U S A 97(3): 1079-84. Meller, A., L. Nivon, et al. (2001). "Voltage-driven DNA translocations through a nanopore." Phys Rev Lett 86(15): 3435-8). L'induction d'un champ magnétique par une bobine est en général accompagnée d'un champ électrique résiduel (dépendant de la géométrie de la bobine). L'utilisation d'un champ électromagnétique induit par une bobine dont la géométrie ne permettrait pas d'annihiler complètement ce champ électrique résiduel résulterait donc en une adsorption aspécifique des molécules chargées sur la surface du support. De plus, un tel champ électrique pourrait modifier les caractéristiques physico-chimiques des molécules. Par exemple, dans certaines conditions, le gradient ionique induit par ce champ électrique pourrait détériorer les hélices d'ADN.
Un réseau organisé de vecteurs de fixation couplés à un support par une interaction magnétique entre le support et les vecteurs de fixation fait aussi partie de la présente invention.
Enfin, l'invention porte sur un kit pour la fabrication d'un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, comprenant un support magnétique et des vecteurs de fixation. Un tel kit est particulièrement intéressant pour permettre à des laboratoires de recherche ou d'analyse de fabriquer eux-mêmes, à moindre frais, des réseaux de sondes particulièrement adaptés à leurs besoins. Par exemple, ce kit peut permettre à un laboratoire d'élaborer une puce à ADN « à façon », éventuellement en mettant en œuvre le dernier procédé mentionné ci-dessus.
De manière préférée mais non limitative, le support magnétique présent dans un kit de l'invention est optiquement neutre et comporte un aimant permanent. Le cas échéant, ce support présente un magnétisme structuré.
Dans une version particulière des kits de l'invention, les vecteurs de fixation sont déjà fixés au support, suivant un réseau organisé.
Les vecteurs de fixation présents dans les kits selon l'invention sont par exemple des billes paramagnetiques, superparamagnétiques, ou ferromagnétiques.
Dans une réalisation avantageuse des kits de l'invention, le vecteur de fixation est fonctionnalisé, c'est-à-dire qu'il porte des éléments capables de se lier spécifiquement à une cible biologique.
Les kits de l'invention peuvent être destinés à plusieurs types d'utilisation, ou être destinés à être utilisés avec un type donné de sondes. Par exemple, un kit comportant comme vecteurs de fixation des billes portant des oligonucléotides comportant une extrémité poly-T ou poly-U sera plus spécifiquement employé pour fabriquer des puces d'ARN messager ou d'ADNc sur lesquels on greffe une queue poly A. En revanche, un kit dans lequel le vecteur de fixation est couplé à de la streptavidine ou à de l'avidine peut être utilisé pour n'importe quel type de sonde qu'il est possible de biotinyler.
Les kits de l'invention peuvent comporter en outre une ou plusieurs sonde(s) de contrôle, éventuellement liées au vecteur de fixation. Il peut s'agir par exemple d'une sonde d'ADN simple brin codant un fragment de la β-actine, si le kit est destiné à fabriquer des puces pour analyser l'expression de gènes dans des cellules eucaryotes. Un kit peut aussi comprendre d'une part, la sonde contrôle libre, et d'autre part, la sonde contrôle déjà fixée sur le vecteur de fixation, ce qui permettra à l'utilisateur de contrôler l'étape de couplage des sondes sur les vecteurs de fixation. Les kits peuvent aussi comprendre des vecteurs de fixation couplés à des sondes marquées, destinés à calibrer le dépôt des vecteurs de fixation sur le support. Ces exemples ne sont pas limitatifs, et l'homme du métier est apte à imaginer tout type de kit comprenant des éléments supplémentaires destinés à faciliter son utilisation, à permettre une interprétation plus précise des résultats, ou à cibler un type particulier d'application.
Les exemples et figures ci-après, illustrent la mise en œuvre et l'intérêt de la présente invention, sans toutefois en limiter la portée.
Légende des figures :
Fig. 1 : Fixation de la sonde à la particule aimantée
Fig. 2 : Réalisation d'une magnéto-puce
Fig. 3 : Réalisation d'un réseau de billes fonctionnalisées
A) par dépôts successifs
B) par dépôt en une étape en utilisant un cache imperméable au champ magnétique.
Fig. 4 : Réseau de billes magnétiques organisé
Fig. 5 : Dépôt des sondes sur un réseau préalablement magnétiquement organisé
Fig. 6 : Image en fluorescence, scannée à 5 μm de résolution, de la formation d'un complexe entre les sondes nucléiques et les vecteurs de fixation sur la lame : A) sonde marquée en Cy3 non fonctionnalisée avec la biotine
B) sonde marquée en Cy3 fonctionnalisée avec la biotine en 5'
C) sonde marquée en Cy5 non fonctionnalisée
D) sonde marquée en Cy5 fonctionnalisée avec biotine en 5' E) particule seule.
L'observation est réalisée avec un scanner GMS 428 à 5 μm de résolution.
Fig. 7 : Image en fluorescence, scannée à 5 μm de résolution, de l'hybridation de la cible nucléique sur le complexe bille/sonde :
A) sonde non marquée fonctionnalisée avec biotine en 5', cible marquée en Cy3
B) sonde non fonctionnalisée avec biotine, cible marquée en Cy3
C) sonde non marquée fonctionnalisée avec biotine en 5', cible marquée en Cy5
D) sonde non fonctionnalisée avec biotine, cible marquée en Cy5 L'observation est réalisée avec un scanner GMS 428 à 5 μm de résolution.
Fig. 8 : Image en fluorescence, scannée à 5 μm de résolution, de la fixation d'une cible et d'une sonde proteiques sur un vecteur de fixation :
A) les particules sont pré-incubées avec le sérum albumine (BSA), puis avec l'extrait total protéique total rfiarqué en Cy3 B) les particules sont pré-incubées avec l'anticorps non spécifique, puis avec de la BSA non marquée, puis avec l'extrait total marqué en Cy3
C) les particules sont pré-incubées avec l'anticorps spécifique x, puis avec de la BSA non marquée, puis avec l'extrait total marqué en Cy3
D) protéine marquée en Cy3, déposée après les lavages. L'observation est réalisée avec un scanner GMS 428 à 5 μm de résolution. Fig. 9 : réseau de billes fonctionnalisées avec des sondes marquées en Cy3, à une densité de 625 par cm2, observées avec un scanner GMS 428 à 5 μm de résolution. La surface scannée était un carré de 0,75 cm de côté.
Exemple I : Procédé de fabrication d'une magnéto-puce par dépôt en une étape
Les sondes sont fixées à des particules aimantées, par exemple des billes magnétiques multipolaires. La fixation à la bille se fait, soit par une liaison covalente, ou toute autre liaison chimique, par exemple l'établissement d'une base SCHIFF, soit par une liaison non covalente, comme par exemple les liaisons streptavidine / biotine ou anticorps / antigène (figure 1).
L'ensemble vecteur de fixation / sondes est ensuite déposé à la densité souhaitée sur une petite surface de quelques μm2 du support aimanté. On obtient ainsi aux coordonnées déterminées du support, un point de sondes identiques à la densité souhaitée. L'opération est réalisée autant de fois que nécessaire pour obtenir un micro réseau de points de sondes différents. On notera que plusieurs points peuvent être réalisés simultanément (figure 2).
Exemple II : Procédé de fabrication d'une magnéto-puce par dépôt en deux étapes
Une alternative au protocole décrit à l'exemple I est possible en utilisant une liaison non covalente entre les vecteurs de fixation et les sondes. En effet, dans ce dernier cas, il est possible de dissocier le dépôt des billes fonctionnalisées et des sondes sur la surface magnétique. Ainsi, à titre d'exemple, les billes fonctionnalisées par la streptavidine sont d'abord déposées sur le support magnétique de façon à créer un réseau régulier de billes magnétiques où chaque point est constitué d'une densité de billes bien définie. Le réseau peut être créé de deux manières, soit par dépôts successifs comme précédemment (figure 3A), soit en une seule opération en utilisant un masque (figure 3B).
Le réseau de billes magnétiques sera réalisé en utilisant un masque « isolant pour le champs magnétique » ne laissant démasquées que les surfaces de la lame aimantée destinées à recevoir les billes, le reste de la surface de la lame aimantée étant masqué (cf. fig. 3B). Donc, seules les parties libres de l'aimant pourront immobiliser les billes magnétiques. Le masque de dépôt des billes pourra être une lame de silice structurée par traitement chimique ou un film plastique architecture au laser.
Si le support présente un magnétisme structuré, par exemple s'il s'agit d'une lame de silice dans laquelle sont incrustés des micro-aimants, le réseau de vecteurs de fixation peut être réalisé en une seule opération sans nécessité d'utiliser un masque.
On obtient ainsi en un seul dépôt un réseau de billes magnétiques organisé
(figure 4).
Dans une deuxième étape, on déposera sur chaque point de billes magnétiques les sondes spécifiques couplées à la biotine en concentration saturante pour la streptavidine (figure 5). La même stratégie peut être suivie pour toutes les liaisons vecteur de fixation / sonde faisant intervenir une liaison non covalente.
Après le dépôt, les sondes non fixées sont éliminées par ajout de streptavidine libre et lavage.
On obtient ainsi un micro réseau de points, eux-mêmes constitués de sondes spécifiques à la densité souhaitée et fixés durablement sur le support à des coordonnées déterminées. Exemple III : Procédé de fabrication d'une magnéto-puce par réplique
Une dernière variante consiste à réaliser le dépôt des sondes liées au vecteur de fixation sur une lame de verre puis à transférer les couples constitués par les billes magnétiques et les sondes qui leur sont fixées à une lame aimantée.
Le transfert peut se faire simplement par rapprochement de la lame aimantée au-dessus de la lame de verre, le couple bille aimantée/sonde sautant spontanément à des coordonnées équivalentes, de la lame de verre à la lame aimantée.
Exemple IV : Préparation et utilisation d'une magnéto-puce de sondes d'ADN simple brin
• Préparation des lames
Dans une première étape de fabrication, l'attraction magnétique est fournie par des lames aimantées de 35 x 25 mm pour une épaisseur de 1 mm.
Deux types de composition pour les lames sont expérimentés, d'une part des lames composées de néodyme fer bore, qui peuvent fournir une aimantation maximale de 1 ,3 T, d'autre part des lames aimantées de samarium cobalt qui peuvent fournir une aimantation maximale de 1 T.
Pour chaque type de lames, deux orientations de champs d'aimantation seront expérimentées : d'une part, un champ perpendiculaire à la plus grande surface de la lame, et d'autre part, une aimantation parallèle à la plus grande surface de la lame. Pour chaque champ, quatre forces différentes seront utilisées : 0.2, 0.5 et 1 ou 1.3 T.
• Le vecteur de fixation Dans une première expérience, les vecteurs de fixation utilisés sont des billes (Dynabeads) d'un diamètre de 2,8 μm, constituées de polymère, incluant des oxydes de fer (Fe2O3 10-14%) d'une susceptibilité de 8.10"3 cgs par unité. Les particules d'oxyde fournissent la réactivité au champ magnétique. Ces billes sont recouvertes de manière covalente de molécules de streptavidine capables de fixer la biotine. La densité des récepteurs streptavidine est de 7.105 à 106 en moyenne par bille.
• Le dépôt des spots ou unité d'hybridation
Le dépôt du couple vecteur (bille) / sonde (molécule d'ADNc simple brin) est effectué dans un premier temps à l'aide d'une plume de 0,2 mm à l'extrémité.
La concentration de billes choisies pour chaque dépôt sera telle qu'un dépôt représentera 6000 billes environ, ce qui correspondra à 6.109 molécules sondes par unité d'hybridation, si tous les sites streptavidine sont saturés. Dans ces conditions, on obtient un dépôt mono-couche de billes (chaque bille repose directement sur la lame).
• Préparation des sondes
A partir de couples d'amorces biotinylées en 5', soit sur l'amorce directe, soit sur l'amorce reverse, soit sur les deux amorces, on effectue l'amplification par PCR de la région spécifique du gène à étudier. On obtient ainsi pour chaque PCR une séquence double brin. Cette séquence est biotinylée respectivement en 5' du brin codant, 5' du brin reverse ou biotinylée en 5' sur les deux brins selon la construction choisie. Dans chaque cas, les doubles brins sont dénaturés par trempage, puis couplés à des billes magnétiques fonctionnalisées avec la streptavidine. Le nombre de billes magnétiques ajoutées est calculé de sorte que les sites streptavidine soient saturés par la biotine des ADN. Ainsi, toutes les billes auront fixé n molécules d'ADN simple brin, où n représente le nombre de sites streptavidine par bille. Le couple bille / ADN simple brin est précipité dans un champ magnétique puis lavé pour éliminer l'ADN non fixé à la biotine (dans le cas où seule l'une des amorces était biotinylée, on ne retient qu'un des deux brins de la double hélice d'ADN). Le couple bille magnétique (vecteur) / ADN simple brin (sonde) est resuspendu à la concentration souhaitée pour obtenir une concentration finale souhaitée en ADN ; dans ce cas, on obtient directement la molarité des ADN qui dépend de la concentration en billes.
• Préparation du réseau
L'ensemble vecteur de fixation (bille magnétique) / sondes (ADN simple brin) est déposé à l'aide d'une plume ou d'une pipette pietzo électrique à la densité souhaitée sur une petite surface de 100 à 300 μm de côté. On obtient ainsi aux coordonnées déterminées du support, une unité d'hybridation de sondes identiques à la densité souhaitée. L'opération est réalisée autant de fois que nécessaire pour obtenir un micro réseau de points de sondes différentes. On notera que plusieurs points peuvent être réalisés simultanément.
• L'hybridation
La lame ainsi réalisée est alors directement hybridée avec un mélange d'ADNc marqués en fluorescence. Ces ADNc sont obtenus par RT-PCR (en présence de Cy3™ par exemple, comme marqueur fluorescent) des ARNm extraits des cellules étudiées. Il est également possible de réaliser une co- hybridation à partir de deux extraits d'ARN qui fourniront des ADNc marqués respectivement en Cy3™ et Cy5™.
Après lavage de la lame pour éliminer les molécules d'ADNc non hybridées, la quantification de la fluorescence au niveau de chaque point indiquera le taux d'hybridation, donc la proportion de chaque type de molécules.
Le marquage n'est pas limitatif ; les mêmes expériences peuvent être réalisées avec des ADNc en radioactivité. Exemple V : Magnéto-puce de sondes d'ADN simple brin ciblant les gènes GADPH et HPRT.
Un exemple de magnéto-puce a été réalisé en utilisant comme sondes les séquences suivantes obtenues par amplification spécifique (PCR). Pour chaque séquence les trois constructions décrites précédemment sont réalisées :
• séquence 5' biotinylé sur le brin codant,
• séquence 5' biotinylé sur le brin anti sens
• séquence 5' biotinylé sur les deux brins.
Les séquences soulignées correspondent aux amorces spécifiques utilisées pour amplifier les sondes.
Sondes choisies pour le gène GAPDH.
CTGGTGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCCGGGGCCCACTTGAAGGGTG GAGCCAAACGGGTCATCATCTCCGCCCCTTCTGCCGATGCCCCCATGT
TTGTGATGGGTGTGAACCACGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGT CAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTAGCCCCCCTGGCCAAGGT CATCCATGACAACTTTGGCATTGTGGAAGGGCTCATGACCACAGTCCAT GCCATCACTGCCACCCAGAAGACTGTGGATGGCCCCTCTGGAAAGCTG TGGCGTGATGGCCGTGGGGCTGCCCAGAACATCATCCCTGCATCCACT
GGTGCTGCCAAGGCTGTGGGCAAGGTCATCCCAGAGCTGAACGGGAA GCTCACTGGCATGGCCTTCCGTGTTCCTACCCCCAATGTGTCCGTCGTG GATCTGACGTGCCGCCTGGAGAAACCTGCCAAGTATGATGACATCAAG AAGGTGGTGA TTCACCACCATGGAGAAGGCCGGGGCCCACTTGAAGGGTGGAGCCAAA
CGGGTCATCATCTCCGCCCCTTCTGCCGATGCCCCCATGTTTGTGATGG
GTGTGAACCACGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGC
ATCCTGCACCACCAACTGCTTAGCCCCCCTGGCCAAGGTCATCCATGAC
AACTTTGGCATTGTGGAAGGGCTCATGACCACAGTCCATGCC
Sondes choisies pour le gène HPRT
GCTGGTGAAAAGGACCTCTCGAAGTGTTGGATACAGGCCAGACTTTGTT GGATTTGAAATTCCAGACAAGTTTGTTGTTGGATATGCCCTTGACTATAA TGAGTACTTCAGGAATTTGAATCACGTTTGTGTCATTAGTGAAACTGGAA
AAGCCAAATACAAAGCCTAAGATGAGCGCAAGTTGAATCTGCAAATACG AGGAGTCCTGTTGATGTTGCCAGTAAAATTAGCAGGTGTTCTAGTCCTG TG
AGGAGATGGGAGGCCATCACATTGTGGCCCTCTGTGTGCTCAAGGGGG
GCTATAAGTTCTTTGCTGACCTGCTGGATTACATTAAAGCACTGAATAGA AATAGTGATAGATCCATTCCTATGACTGTAGATTTTATCAGACTGAAGAG CTACTGTAATGATCAGTCAACGGGGGACATAAAAGTTATTGGTGGAGAT GATCTCTCAACTTTAACTGGAAAGAATGTCTTGATTGTTGAAGATATAAT TGACACTGGTAAAACAATGCAAACTTTGCTTTCCCTGGTTAAGCAGTACA
GCCCCAAAATGGTTAAGGTTGCAAGCTTGCTGGTGAAAAGGACCTCTCG AAGTGTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTGGATTTGAAATTCCAGACAAG TTTGTTGTTGGATATGCCCTTGACTATAATGAGTACTTCAGGAATTTGAA TCACGTTTGTGTCATTAGTGAAACTGGAAAAGCCAAATACAAAGCC
Exemple VI : Vérification de la formation d'un complexe entre les sondes nucléiques et les vecteurs de fixation sur la lame. Les vecteurs de fixation utilisés ici sont des particules de polystyrène Fe2θ3 paramagnetiques de 1 μm de diamètre, fonctionnalisées par la streptavidine. La sonde correspond au fragment du gène GAPDH indiqué à l'exemple précédent. Elle est fonctionnalisée ou non par la biotine en 5', sur un seul des deux brins (le brin sens).
Amorces définissant la séquence: 5' CTGGTGTCTTCACCACCATG 3'
5' TCACCACCTTCTTGATGTCATC 3'
Les sondes sont marquées soit en Cy3™ soit en Cy5™ tout le long de la séquence lors d'une amplification par PCR.
Les produits de PCR sont précipités, re-suspendus, dénaturés à 100°C, trempés à 0°C puis incubés avec les particules, à 4°C pendant 60 minutes. Les complexes obtenus sonde/vecteur sont précipités par activation magnétique et lavés trois fois en tampon 10X SSÇ et 1 fois dans un tampon 3X SSC. Le culot est re-suspendu dans un tampon 3X SSC .
Un aliquot de la solution obtenue est prélevé à l'aide d'une aiguille et déposé sur une lame 20 x 30 x 1 mm magnétique de 1T. Le dépôt est rincé 3 fois au tampon 10X SSC.
La figure 6 montre le résultat des dépôts suivants :
A) sonde marquée en Cy3 non fonctionnalisée avec la biotine B) sonde marquée en Cy3 fonctionnalisée avec la biotine en 5'
C) sonde marquée en Cy5 non fonctionnalisée
D) sonde marquée en Cy5 fonctionnalisée avec biotine en 5'
E) particule seule.
Cette figure montre que la fixation des sondes sur la particule est bien spécifique (absence de marquage fluorescent lorsque la sonde n'est pas fonctionnalisée par la biotine), et que le complexe bille/sonde est bien retenu sur la lame magnétique (figures B et D).
Exemple VII : Vérification de l'hybridation de la cible nucléique sur le complexe bille sonde.
Les sondes se composent d'un fragment de la séquence du gène GAPDH fonctionnalisé ou non par la biotine en 5' sur le brin sens.
Les cibles se composent du produit de PCR de la GAPDH marqué tout le long de la séquence en Cy3™ ou Cy5™.
Les vecteurs de fixation sont des particules de polystyrène Fe2O3paramagnétiques de 1 μm de diamètre fonctionnalisées par la streptavidine.
Les sondes son dénaturées à 100°C, trempées à 0°C puis complexées avec des particules à 4°C pendant 60 min. Les complexes obtenus sonde/vecteur sont précipités par activation magnétique et rincés quatre fois en tampon 10X SSC. Le culot est re-suspendu dans un tampon formamide 25%, les cibles dénaturées sont alors mélangées avec les sondes et sont hybridées à 50°C.
Un aliquot de la solution obtenue est prélevé à l'aide d'une aiguille et déposé sur une lame 20 x 30 x 1 mm magnétique de 1T. Le dépôt est rincé 3 fois avec un tampon 10X SSC et une fois avec un tampon 3X SSC.
Les résultats sont montrés sur la figure 7, où les différents points correspondent aux conditions suivantes :
A) sonde non marquée fonctionnalisée avec biotine en 5', cible marquée en Cy3
B) sonde non fonctionnalisée avec biotine, cible marquée en Cy3 C) sonde non marquée fonctionnalisée avec biotine en 5', cible marquée en Cy5
D) sonde non fonctionnalisée avec biotine, cible marquée en Cy5
Les cibles sont donc capables de s'hybrider sur la sonde lorsqu'elle est fixée à la particule, et il y a très peu d'absorption non spécifique.
La cible est bien retenue sur la lame par l'intermédiaire du vecteur.
Exemple VIII : Vérification de fixation de cible et de sonde protéique sur un vecteur de fixation.
Les vecteurs sont des particules de polystyrène Fe203 paramagnetiques de 1 μm de diamètre, capables d'adsorber les protéines à leur surface, de façon aspécifique.
La sonde est ici un anticorps spécifique d'une protéine x.
La cible est une protéine x contenue dans un extrait cellulaire marqué au Cy3.
Un anticorps non spécifique de la protéine x, et ne reconnaissant aucun élément de l'extrait cellulaire contenant la cible, est utilisé comme témoin.
Différentes hybridations ont été réalisées, dont le résultat apparaît sur la figure 8:
Figure 8 A : les particules ont été pré-incubées avec le sérum albumine (BSA), puis avec l'extrait protéique total marqué en Cy3.
Il apparaît une fixation non spécifique.
Figure 8 B : les particules ont été pré-incubées avec l'anticorps non spécifique, puis saturées avec de la BSA non marquée, puis incubées avec l'extrait total marqué en Cy3. Il apparaît la même fixation non spécifique que lors de la pré-hybridation à la BSA.
Figure 8 C : les particules ont été pré-incubées avec l'anticorps spécifique x, saturées avec de la BSA non marquée, puis incubées avec l'extrait total marqué en Cy3.
L'intensité du signal de fluorescence est augmentée par rapport à l'hybridation aspécifique. Il y a bien une hybridation spécifique avec les anticorps anti-x.
La fixation non spécifique observée dans cette expérience est importante. Cette fixation non spécifique peut être éliminée en utilisant des particules paramagnetiques de type silicate ou silicium telles que les « silica particul » ou les « beads silica », sur lesquels sont greffées des fonctions SH.
Ces particules n'adsorbent pas les protéines, donc éliminent l'absorption aspécifique. Les anticorps pourront être fixés par exemple par le thiol de la chaîne lourde après réduction. Le site de fixation spécifique sera donc constitué d'une chaîne légère et d'une chaîne lourde liée covalemment à la particule par un pont S-S.
Exemple IX : Faisabilité d'un réseau de particules paramagnetiques sur un support possédant une aimantation statique de 1T.
Les billes fonctionnalisées avec des sondes marquées en Cy3 ont été déposées à une densité de 625 par cm2 sur un support présentant une aimantation statique de 1T. Le réseau obtenu a ensuite été lavé trois fois avec une solution 10X SSC, puis une fois en solution 3X SSC. Le résultat, illustré à la figure 9, montre la stabilité du réseau obtenu.

Claims

REVENDICATIONS
1. Réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, liées à un support par couplage magnétique à l'aide d'un vecteur de fixation.
2. Réseau selon la revendication 1, fixé sur un support optiquement neutre.
3. Réseau selon la revendication 1 ou 2, fixé sur un support comportant un aimant permanent.
4. Réseau selon la revendication 1 et 2, fixé sur un support présentant un magnétisme électro-induit.
5. Réseau selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, fixé sur un support présentant un magnétisme structuré.
6. Réseau selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le champ magnétique est perpendiculaire ou parallèle au plan du support.
7. Réseau selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le vecteur de fixation est paramagnétique, superparamagnétique ou ferromagnétique.
8. Réseau selon la revendication 7, dans lequel le vecteur de fixation est une bille de latex ou de polysaccharides comportant des particules d'oxyde de fer.
9. Réseau selon la revendication 7 ou 8, dans lequel le vecteur de fixation est une bille multipolaire.
10. Réseau selon la revendication 7 ou 8, dans lequel le vecteur de fixation est capable de s'orienter dans un champ magnétique.
11. Réseau selon la revendication 10, dans lequel le vecteur de fixation est lui-même aimanté.
12. Réseau selon l'une quelconque des revendications 7 à 11 , dans lequel le vecteur de fixation a un diamètre compris entre 1 nm et 500 μm, préférentiellement entre 0,5 et 5 μm.
13. Réseau selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel le vecteur de fixation porte des éléments capables de se lier spécifiquement à une cible biologique.
14. Réseau selon la revendication 13, dans lequel les éléments capables de se lier spécifiquement à une cible biologique portés par le vecteur de fixation sont sélectionnés dans le groupe comportant les immunoglobulines, les antigènes, les récepteurs membranaires, les ligands de récepteurs membranaires, l'avidine, la streptavidine, les oligonucléotides poly-T ou poly-U.
15. Réseau selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, dans lequel chaque sonde est déposée en un point dont le diamètre est compris entre 10 μm et 1 mm, préférentiellement entre 50 et 200 μm.
16. Réseau selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, dans lequel chaque point comporte entre 105 et 1010 sondes, préférentiellement entre 108 et 1010 sondes.
17. Réseau selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, ayant une densité comprise entre 1 et 100000 points par cm2, préférentiellement entre 10 et 1000 points par cm2.
18. Procédé de fabrication d'un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, liées à un support par couplage magnétique à l'aide d'un vecteur de fixation, comportant les étapes suivantes : A) liaison des sondes au vecteur de fixation,
B) dépôt sur un support magnétique, des sondes couplées au vecteur de fixation, selon un réseau organisé.
19. Procédé de fabrication d'un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, liées à un support par couplage magnétique à l'aide d'un vecteur de fixation, comportant les étapes suivantes :
A) couplage magnétique d'un vecteur de fixation en des coordonnées connues d'un support,
B) liaison des sondes sur les vecteurs de fixation.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'étape de couplage du vecteur de fixation au support est effectuée en utilisant un masque.
21. Procédé de fabrication d'un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, liées à un support par couplage magnétique à l'aide d'un vecteur de fixation, comportant les étapes suivantes :
A) liaison des sondes au vecteur de fixation,
B) dépôt des sondes couplées au vecteur de fixation sur une lame non aimantée, selon un réseau organisé
C) transfert du réseau de l'étape B sur un support magnétique.
22. Procédé selon la revendication 18 ou 21 , pour la fabrication d'un réseau organisé de sondes constituées de molécules d'acide nucléique simple brin, comportant les étapes suivantes :
A) amplification des sondes à partir d'amorces nucléotidiques dont l'une au moins est biotinylée, B) dénaturation des sondes par chauffage suivi d'un refroidissement rapide,
C) couplage des sondes biotinylées sur des billes paramagnetiques, superparamagnétiques ou ferromagnétiques liées à de l'avidine ou de la streptavidine,
D) précipitation magnétique des sondes liées aux billes,
E) élimination des sondes non liées par lavage,
F) resuspension des sondes à une concentration choisie,
G) dépôt des sondes sur un support.
23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 22, dans lequel l'étape de liaison de la sonde au vecteur de fixation est réalisée à une concentration de sondes saturante pour le vecteur de fixation.
24. Support présentant un magnétisme structuré permanent, pour la fabrication d'un réseau de sondes biologiques ou chimiques, suivant un procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 23.
25. Support selon la revendication 24, dans lequel le magnétisme structuré résulte d'une magnétisation statique découplée de tout champ électrique et est inerte pour toute molécule chargée.
26. Réseau organisé de vecteurs de fixation couplés à un support par une interaction magnétique entre le support et les vecteurs de fixation.
27. Produit de couplage formé d'une sonde d'acide nucléique et d'un vecteur de fixation, dans lequel un vecteur de fixation est couplé à un nombre compris entre 103 et 108, préférentiellement entre 105 et 107 molécules d'acide nucléique.
28. Utilisation d'un produit de couplage formé d'une sonde biologique ou chimique et d'un vecteur de fixation, pour la fabrication d'un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 17.
29. Kit pour la fabrication d'un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, comprenant un support magnétique et des vecteurs de fixation.
30. Kit selon la revendication 29, dans lequel le vecteur de fixation porte des éléments capables de se lier spécifiquement à une cible biologique.
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