EP1343491A2 - Utilisation d'inhibiteurs de l'apoptose des pericytes pour le traitement et/ou la prevention de la retinopathie diabetique - Google Patents

Utilisation d'inhibiteurs de l'apoptose des pericytes pour le traitement et/ou la prevention de la retinopathie diabetique

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EP1343491A2
EP1343491A2 EP01982545A EP01982545A EP1343491A2 EP 1343491 A2 EP1343491 A2 EP 1343491A2 EP 01982545 A EP01982545 A EP 01982545A EP 01982545 A EP01982545 A EP 01982545A EP 1343491 A2 EP1343491 A2 EP 1343491A2
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EP
European Patent Office
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inhibitor
caspase
apoptosis
pericytes
use according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01982545A
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German (de)
English (en)
Inventor
Marc Lecomte
Ulriche Denis
Clarisse Paget
Nicolas Wiernsperger
Michel Lagarde
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Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Merck Sante SAS
Original Assignee
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Merck Sante SAS
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Publication date
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    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics

Definitions

  • Diabetic retinopathy is one of the most debilitating microvascular complications of diabetes, which can lead to blindness in its ultimate stage (Grange, 1995; Frank, 1995; Aiello LP et al, 1998). It is the second leading cause of blindness acquired in developed countries behind age-related macular degeneration (Nathan et al, 1991), and the risk of a diabetic patient of becoming blind has been estimated 25 times that of the general population (Kahn and Hiller, 1974). There is currently no preventive or curative pharmacological treatment for this complication, the only treatment being retinal laser photocoagulation or vitreotectomy in the most severe cases (Frank, 1995; Aiello, 1998) .
  • Diabetic retinopathy is a progressive diabetic complication, going from a so-called “simple” or beginner stage (background retinopathy), to a final phase called “proliferative retinopathy", where there is formation of fragile retinal neovessels, leading to hemorrhages severe, sometimes with retinal detachment, and loss of vision (Grange 1995, Frank, 1995).
  • simple retinopathy microvascular lesions are characterized by naicroaneurysms, small point hemorrhages, exudates and venous dilations (Palmberg, 1977, ETDRS report No. 10, 1991). This form of simple retinopathy can remain clinically silent for a long time.
  • retinal capillaries are lined with endothelial cells on the luminal side of the vessel, and pericytes (or wall cells) located outside and buried in the basement membrane of the vessel.
  • CPP 32 Cysteine Protease Protein 32 kDa
  • These purified pericytes also see the increased expression of other genes involved in cellular antioxidant defenses such as that of glutathione peroxidase for example, suggesting that oxidative stress could be involved in the disappearance of retinal pericytes by apoptosis (Li et al, 1999 ).
  • basement membrane components collagen, laminin, fibronectin
  • glucose Li et al, 1984, Mandarino et al;, 1993
  • Another mechanism by which glucose can lead to vascular complications in diabetes is the increased production and accumulation of advanced glycation end products (AGEs) formed by non-enzymatic glycosylation -or glycation- of proteins. , DNA or lipids (Maillard reaction, 1912) which have been highlighted in numerous studies during diabetes (Thornalley, 1999).
  • AGEs advanced glycation end products
  • DNA or lipids Maillard reaction, 1912
  • Maillard represented in FIG. 2 in the appendix, describes the linkage of reducing sugars to proteins: a reducing sugar, in open form, reacts first with the free amino group of basic amino acids contained in proteins (lysine, arginine), resulting in the formation of a Schiff base later stabilized in Amadori product.
  • Methylglyoxal formed by the fragmentation of triose phosphates and the oxidation of acetone in the liver (thanks to monooxygenases), is another dicarbonyl whose blood concentration is increased in diabetics (Me Lellan et al., 1994) and which, in vi tro, under physiological conditions of pH and temperature, is capable of irreversibly modifying, in particular the arginine residues of proteins (Lo et al., 1994).
  • EFAs of proteins formed after reaction with methylglyoxal are described as major products observed during diabetes (Degenhardt et al, 1998).
  • Extracellular EFAs are capable of binding to specific membrane receptors and of inducing various cellular responses. Studies have shown that there is co-localization of EFAs and EFA receptors in the retinal microvessels of diabetic rats (Stitt et al, 1997, Soulis et al, 1997).
  • This work made it possible to design new methods for preventing or treating diabetic retinopathy consisting in administering to a subject an effective amount of at least one inhibitor of apoptosis of retinal pericytes.
  • the invention is remarkable in that it offers new means of treatment or prevention both of clinically established retinopathy and of simple retinopathy.
  • the clinical signs of a simple retinopathy are generally the appearance of one or two microaneurysms per fundus.
  • the term “diabetic retinopathy” will denote both an established retinopathy and a simple retinopathy.
  • the subject of the invention is the use of an inhibitor of apoptosis of the retinal pericytes for the preparation of a medicament useful for preventing or treating diabetic retinopathy.
  • EFAs produced after incubation of albumin with methylglyoxal, added in the pericyte culture medium (2 ⁇ M) during two passages (10-15 days) cause stimulation of their death by apoptosis (3 times the basal rate), as well as the intracellular accumulation of ceramides and diacylglycerol (DAG) (200% of the basal rate).
  • DAG diacylglycerol
  • the invention relates, as an inhibitor of apoptosis of the retinal pericytes, to an antioxidant compound.
  • antioxidants such as N-acetyl cysteine (NAC) at 10 or 50 ⁇ M, non cytotoxic concentrations, suggesting that AGEs induce a oxidative stress in cells and that they contribute to their death by apoptosis. Consequently, the invention relates, as an inhibitor of apoptosis of the retinal pericytes, to an antioxidant compound.
  • N-acetyl-L-cysteine lipoic acid, ebselen, zeaxanthin, coelenteramine, a derivative or a mixture of these.
  • Anti-oxidant compounds are very particularly interesting because they reduce the production of ceramides and / or DAGs.
  • the invention also relates to any compound capable of directly or indirectly reducing the production of ceramides and / or DAGs.
  • DAGs and ceramides are produced by coupled activation of phosphatidylcholine-specific phospholipase C
  • PC-PLC acid sphingomyelinase and that ceramides do not seem to be synthesized de novo.
  • xanthogenate also designated D609 (9.4 or 30 ⁇ M), which is a PC-PLC inhibitor, well inhibit the production of ceramides, but only D609 inhibits both the production of ceramides (95% ) and DAG (80%), suggesting that the production of DAG by PC-PLC is located upstream of the activation of the acid sphingomyelinase producing the ceramides.
  • Fumonisin B1 (0.01 ⁇ M), inhibitor of synthesis de novo ceramides, inhibits only marginally
  • Apoptosis is only inhibited by approximately 50% in the presence of 10, 11 - Dihydro - 5 - [3- (methylamino) propyl] -5H-dibenz [b, f] azepine (desipramine)
  • the invention particularly relates to the use: a phosphatidylcholine phospholipase C inhibitor (PC-PLC) as an inhibitor of the formation of DAGs,
  • PC-PLC phosphatidylcholine phospholipase C inhibitor
  • phosphatidylcholine phospholipase C inhibitors mention may more particularly be made of D609, or a derivative thereof.
  • inhibitors of acid sphingomyelinase there may be mentioned more particularly desipramine, or a derivative thereof.
  • the peptide z-VAD-fmk (pan caspase inhibitor), z-DEVD-fmk (caspase-3), z-AEVD-fmk (caspase-10) and z-LEHD- fmk (caspase-9) inhibit all four 1 AGE-induced apoptosis, but only the peptide z-VAD-fmk inhibited the production of DAG and ceramides while z-DEVD-fmk and z-LEHD-fmk had no effect. This suggests that an initiating caspase is involved upstream of the production of DAG and ceramides, and that it is inhibited by z-VAD-fmk.
  • caspase-3 and caspase-9 are involved in the final phase of apoptosis and are inhibited by z-DEVD-fmk and z-LEDH-fmk, respectively, and are located after the production of DAG and ceramides, which is not affected by these two peptides.
  • the initiating caspase involved does not appear to be caspase-8, z-IETD-fmk having no effect on apoptosis.
  • Caspase-10 inhibited by z-AEVD-fmk, seems on the other hand implicated, this peptide completely inhibiting apotosis of pericytes induced by AGEs.
  • z-VDVAD-fmk partially inhibits apoptosis suggesting that the initiating caspase-2 is also involved.
  • caspase-2 or 10 can be involved, as initiating caspases, in the cascade leading to AGE-induced pericyte apoptosis, and that caspase-9 and caspase -3 effector cells seem to be involved in the final phase of this apoptosis.
  • the invention relates especially to the use of a caspase inhibitor for the preparation of a medicament protecting the retinal pericytes from apoptosis useful for the treatment and / or prevention of retinopathy in a diabetic patient.
  • Such inhibitors are preferably of the peptide type. They are advantageously peptides chemically modified by a benzyleoxycarbonyl group on the N-terminal side (z) and by a (0-methyl) -fluoromethyl ketone (fmk) group on the C-terminal side making them more permeable to cells.
  • a caspase inhibitor peptide mention may be made of the tripeptide z-VAD-fmk, an inhibitor of all caspases.
  • the invention particularly contemplates the use of an inhibitor of an initiating caspase, preferably chosen from caspases 2 or 10 and / or an inhibitor of an effector caspase, preferably chosen from caspases 3, 6 , 7 or 9, most preferably caspases 3 or 9, for the preparation of a medicament useful for preventing or treating diabetic retinopathy.
  • an initiator caspase 10 inhibitor mention may be made of the peptide z-AEVD-fmk.
  • an initiator caspase 2 inhibitor mention may be made of the peptide z-VDVAD-fmk.
  • the invention particularly contemplates the use of a combination of at least two inhibitors of apoptosis of the retinal pericytes mentioned above for the preparation of a medicament useful for the treatment or prevention of diabetic retinopathy.
  • a preferred form of implementation of the invention consists in administering jointly to a patient an effective amount of at least two compounds chosen from:
  • PC-PLC phosphatidylcholine-phospholipase C inhibitor
  • Apoptosis of retinal pericytes can be simultaneous or not. Consequently, the subject of the invention is also a pharmaceutical composition comprising, as active agents, at least one inhibitor of apoptosis of retinal pericytes described above.
  • the invention relates more particularly to a composition
  • a composition comprising as active agent (s) at least one compound chosen from: an antioxidant, a compound which inhibits the production of ceramides and / or DAGs, a acid sphingomyelinase inhibitor, a phosphatidylcholine phospholipase C inhibitor, a caspase inhibitor, as defined above, or a mixture of at least two of these.
  • active agent s
  • a composition is particularly useful for preventing or treating diabetic retinopathy.
  • compositions comprising, as active agents, an antioxidant and / or a phosphatidylcholine phospholipase C inhibitor (PC-PLC) and / or a sphingomyelinase inhibitor acid, associated (s) in said composition with at least one caspase inhibitor as defined above.
  • PC-PLC phosphatidylcholine phospholipase C inhibitor
  • sphingomyelinase inhibitor acid associated (s) in said composition with at least one caspase inhibitor as defined above.
  • composition according to the invention can accept any form of administration known to a person skilled in the art, generally (po), by subcutaneous injection (sc) intraperitoneal (ip) or intravenous (iv), in a suitable formulation whose dosage of active agent (s) allows daily administration preferably between approximately 0.01 and approximately 200 mg / kg of body mass , preferably between 0.5 and approximately 75 mg / kg of body mass and ideally between approximately 1 and 50 mg / kg of body mass, but not limited to these and which can go higher in the case of a compound which is not very toxic and not very active in vi vo.
  • the amount of active compound which will be combined with the excipient for administration in a single dose in a composition comprising only an active compound defined above may vary and depends on the mode of administration. .
  • a typical preparation will contain from about 5% to 95% of the active compound (w / w).
  • the preparations will preferably contain from about 20% to 80% (w / w) of active compound.
  • compositions according to the invention comprising at least two active compounds defined above, each of them is present in doses ranging from approximately 10% to 80% of the doses normally administered in a monotherapy regimen as described below -above.
  • a maintenance dose of a compound, composition or combination concerned with this invention may be administered, if necessary.
  • the dose or frequency of administration may be reduced depending on the symptoms, and if these are limited to a desired level, treatment may be discontinued.
  • some patients may require long-term intermittent treatment until the recurrence of one or other symptom of retinopathy.
  • the formulations for the general route can be very varied, tablets, capsules, powders, solutions, comprising the active agent (s), excipients, taste masks, buffers, preservatives, known to those skilled in the art and pharmaceutically acceptable.
  • the injectable forms comprise the active principle (s) in a preferably aqueous solvent, optionally with a co-solvent which can lower the dielectric constant of the medium, containing a pair of salts which buffers the pH to close values physiological values (pH 7.0 -7.4) known to those skilled in the art, and optionally a surfactant increasing the solubility of the active principle (s).
  • a very preferred form of administration according to the invention consists of topical application or ocular injection. This form of application makes it possible to limit the general negative systemic effects that could result from the prolonged use of caspase inhibitors administered by general route.
  • a pharmaceutical composition for topical ocular application according to the invention can be formulated in a suitable ointment (ointment, gel or solution) containing the active compound (s), dissolved or suspended in a vehicle.
  • the pharmaceutically acceptable vehicles of which may be isotonic sodium chloride (0.9%, 308 mOsm / L) or isotonic saline solutions comprising sodium chloride , potassium chloride, potassium gluconate, calcium chloride, boric acid, sodium borate or borax, sodium lactate, sodium hydrogen phosphate dihydrate and sodium dihydrogen phosphate dodecahydrate, sorbitol , with or without agents mimicking the lacrimal viscosity such as hypromellose 4000 cP, dextran, and preservatives such as sodium edetate, benzododecinium bromide, sodium mercurothiolate, benzalkonium chloride, methyl parahydroxybenzoate, sodium metabisulfite, phenylmercury borate.
  • isotonic sodium chloride (0.9%, 308 mOsm / L) or isotonic saline solutions comprising sodium chloride , potassium chloride, potassium gluconate, calcium chlor
  • various polymers can be used, such as, for example, the carbomer 980 NF (polymer of 4.10 6 Da), sorbitol, an oil for example of paraffin, monostearate of sorbitan, polysorbate 60, cetyl ester wax, cetearyl ester wax, petroleum jelly, methylcellulose, a fat.
  • carbomer 980 NF polymer of 4.10 6 Da
  • sorbitol an oil for example of paraffin, monostearate of sorbitan
  • polysorbate 60 cetyl ester wax, cetearyl ester wax, petroleum jelly, methylcellulose, a fat.
  • cetyl ester wax cetearyl ester wax
  • petroleum jelly methylcellulose
  • methylcellulose a fat.
  • Other emulsifying principles known to those skilled in the art can be used in these compositions.
  • composition according to the invention comprises, for example, between 0.01 and 10% and preferably between 0.01 and 4% by weight of said inhibitors, in order to limit any risk of undesirable reactions in the long term, and an excessive systemic passage. may lead to discontinuation of topical therapy.
  • a typical administration according to the invention is administration in the conjunctival cul-de-sac, for example once and up to four times a day, with a preference for one or two daily applications.
  • An Ocusert type drug delivery system (Friederich, 1974), formed by an ellipsoidal reservoir in polyacrylate, butylcyanoacrylate or pluronic F127 gel (Desai and Blanchard, 1998) or also fibrin or collagen (Rubin et al , 1973), for example, containing one or more of the compounds defined above, maintained between two layers of copolymers (methylcellulose 15 cP or hydroxypropylcellulose 80-120 cP (Desai and Blanchard, 1998)), controlling the administration of the said compound (s) in time, and placed in the conjunctival cul-de-sac, is also part of this invention.
  • a 5x2 or 7x4 mm piece of sponge (Altomed TM, but also Week TM or Merocel TM) soaked in the solution containing the active compounds and placed for a few minutes in the conjunctival cul-de-sac can also be considered for the topical application of products (Wilkins et al, 2000).
  • compositions according to the invention can also be formulated in emulsions, where the compounds defined above are encapsulated in droplets of the order of a micron (liposomes), for example in soybean oil or lecithin, gelatin (Vandervoort and Ludwig, 1999), the viscosity of the preparation can be increased by the addition of methylcellulose or sodium carmellose (Zurowska-Pryczkowska, 1999).
  • a micron liposomes
  • the viscosity of the preparation can be increased by the addition of methylcellulose or sodium carmellose (Zurowska-Pryczkowska, 1999).
  • the compounds can also be encapsulated in hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrins (solution at 5%, for example) of variable concentration but which can go as low as a molar ratio of one for one compared to the active principle (s) (s), which would increase their bioavailability (s), their stability (s), and their solubility (s) (Freedman et al, 1993).
  • the invention also relates to the use of antisense oligonucleotides complementary to a part of a polynucleotide sequence chosen from that coding for a caspase, phosphatidyleholine phospholipase C, acid sphingomyelinase for the preparation of a medicament intended for the treatment and / or prevention of diabetic retinopathy.
  • ol igodeoxynucleot ide s antisense phosphorothioates offer the opportunity to modulate the gene expression of specific genes and carry enormous potential for clinical application.
  • antisense oligomers of different sizes between 6 and 25 nucleotides in length, directed against caspase 2, 3, 9 or 10 or against PC-PLC, or against acid sphingomyelinase are synthesized and used alone or in combinations.
  • These antisense oligonucleotides are defined in the sequences of caspases close to the N- or C-terminus of these enzymes, to avoid cross-reactions and to be as specific as possible.
  • PC-PLC oligonucleotides are defined either in the C-terminal part or in the N-terminal part, close to histidines conserved in the active site, such as H69 and H118 of the protein of Listeria monocytogenes (Zuckert WR et al, 1998).
  • Acid sphingomyelinase oligonucleotides are defined in the N-terminal or C-terminal part of the human enzyme (Schuchman et al., 1991) to be as specific as possible and to avoid cross-reactions.
  • the oligonucleotides are mixed at a concentration of between 1 and 10 ⁇ M in the presence of a polyoxyethylene-polyspermine copolymer or fibrinogen microspheres (Oganesian et al, 1999), on a piece of polytetrafluoroethylene membrane. (PTFE)
  • the antisense oligonucleotides can also be injected as such, or else encapsulated in liposomes, after emulsion with different fats or oils, which are then covered with the viral envelope of the inactivated Japanese haemaglutinating virus (Sendai virus) after fusion, and then injected into the subretinal space by the pars plana (Hangai et al, 1998).
  • the injected doses, to be active advantageously lie in a range between 10 and 200 ⁇ g per eye (Leeds et al, 1998).
  • the invention also contemplates the implementation of an antisense gene strategy for caspases-2, 3, 9 or 10 in a method of treatment and / or prevention of diabetic retinopathy.
  • the antisense genes of these caspases are introduced into an adenovirus, as indicated below, which is injected into the subretinal space, after injection by the pars plana as described above (Lai et al, 2000).
  • the invention also contemplates the use of cyclic or linear peptides, from two or three amino acids to five or six, competitive caspase inhibitors, for the preparation of a medicament intended for the treatment and / or prevention of diabetic retinopathy .
  • peptides such as, VAD, general caspase inhibitor, DEVD, specific caspase 3 inhibitor, AEVD, specific caspase 10 inhibitor, VDVAD, specific caspase 2 inhibitor, or LEHD, specific caspase inhibitor- 9.
  • linear peptides are chemically protected on the N-terminal side by a derivative of an acetyl or benzyl group, such as but not limited to a benzyleoxycarbonyl group (z or BOC), and on the C-terminal side by a methyl ketone group, such that but not limited to a fluoro- or chloromethylketone group or even to a 2,6 dimethyl or dichloro benzoyloxymethylketone group, and the side chains of amino acids aspartic acids (D) are O- methylated.
  • a derivative of an acetyl or benzyl group such as but not limited to a benzyleoxycarbonyl group (z or BOC)
  • a methyl ketone group such that but not limited to a fluoro- or chloromethylketone group or even to a 2,6 dimethyl or dichloro benzoyloxymethylketone group
  • D side chains of amino acids aspartic acids
  • peptides can also be coupled to peptides of 16 amino acids originating from the hydrophobic sequence of the peptide signal of the fibroblast growth factor (FGF) of Kaposi, improving their permeability to cells (NH 2 -AAVALLPAVLLALLAP-COOH).
  • FGF fibroblast growth factor
  • Derivatives of one aspartate alone, protected by a benzyl group and a fluoromethyl ketone group are also possible in this invention.
  • peptides can be administered by injection, by sc, ip or iv route, or by topical application in the conjunctival cul-de-sac, preferably by iv or topical route, and in a formulation which allows a slow and controlled infusion to reduce the frequency of injections as part of preventive treatment.
  • Such solutions exist and consist of preparations of biodegradable polymers containing the peptide and controlling its diffusion, such as, but not limited to, a poly (DL-lactide-co-glycolide) (PLGA), injectable in form (a) either microspheres approximately 1 to 100 ⁇ m in diameter, or (b) a single, cylindrical implant, approximately 0.8 mm to 1.5 mm in diameter, called a "mini-cylinder” (Zhu et al, 2000) . Stabilization of the peptides incorporated in the presence of an antacid such as Mg (OH) 2 during encapsulation in the polymer is also envisaged in the context of the present invention. (Zhu et al, 2000).
  • PLGA poly (DL-lactide-co-glycolide)
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid molecule comprising at least one polynucleotide sequence coding for a peptide of 2 to 10 amino acids competitive caspase inhibitor for the preparation of a medicament intended for the treatment and / or prevention of diabetic retinopathy.
  • the invention also contemplates a method of treatment and / or prevention of diabetic retinopathy consisting in producing locally and continuously at the intravitreal and sub-retinal level, in situ, these small peptides. It is then advantageously a strategy of gene expression of these small peptides, inhibitors of caspases, within the framework of a gene therapy protocol with the vectors commonly used during such an approach.
  • the oligomers of deoxyribonucleotides corresponding to the peptide sequences of VAD, DEVD, VDVAD or AEVD can be synthesized by automatic machines accessible to those skilled in the art.
  • the vector pACCMVpLpA is produced by insertion of the promoter / enhancer of early genes constituting the cytomegalovirus (CMV), the polylinker (pL) of restriction sites of the vector pUC 18, and a fragment of the genome of the simian virus SV 40 which includes the antigen.
  • CMV cytomegalovirus
  • pL polylinker
  • pA polyadenylation signal
  • the double stranded DNA corresponding to the sequence AEVD is then introduced into the vector linearized with the restriction enzymes corresponding to the restriction sites flanking the sequence AEVD, in the example described BamHI and Eco RI.
  • the corresponding plasmid is then produced by conventional techniques of bacterial cloning, and the insertion verified by sequencing using the flanking sequence of the polylinker.
  • the resulting plasmid is then co-transfected with pJM17 (McGrory et al, 1988) in 293 cells (human renal embryonic cells transfected with the AdEA adenovirus) (Graham et al., 1977) by coprecipitation of DNA with phosphate phosphate calcium.
  • pJM17 codes for an adenovirus 5 of complete genomic sequence interrupted by a bacterial plasmid pBRX at the position 3.7 unit of the genetic map of the adenovirus, therefore exceeding the packaging limits for the adenovirus.
  • AdCMV-AEVD The presence of the insertion corresponding to the AEVD peptide is confirmed by PCR using primers flanking the AEVD sequence and by sequencing the PCR product obtained.
  • the appropriate viral plaques are then amplified in stocks containing 5-50 x 10 7 plaque forming unit (pfu) / ml and stored in the DMEM supplemented with 10% fetal calf serum.
  • the recombinant adenovirus can then be used and encapsulated, by one of the techniques described above and injected by the parsplana into the subretin space in the intravitreal cavity, in order to have in if you have a sustained and spread production in the caspase inhibitor time, to prevent loss of pericytes by apoptosis.
  • the invention finally relates to a method of identifying compounds capable of preventing or treating diabetic retinopathy, characterized in that it comprises bringing a culture of pericytes treated with EFAs into contact with a compound to be tested and in that the apoptosis in said perrycites is evaluated to determine the ability of said compound to prevent or treat diabetic retinopathy.
  • this evaluation includes the comparison with the apotosis of a culture of pericytes not treated with said compound and / or not treated with EFAs.
  • the compound tested is chosen from those previously considered and in particular from the group comprising: antioxidants, inhibitors of the production of ceramides and / or DAGs, caspase inhibitors, antisense oligonucleotides, from 6 to 25 nucleotides, complementary of a part of a polynucleotide sequence chosen from that coding for a caspase, phosphatidylcholine-phospholipase C, acid sphingomyelinase, nucleic acid molecules comprising at least one polynucleotide sequence coding for a peptide, from 2 to 10 amino acids , competitive inhibitor of a caspase.
  • Figure 1 shows the diagram of a retinal capillary.
  • Figure 2 shows the Maillard route.
  • Figure 3 shows the 3 P labeling of ceramides and DAGs.
  • FIG. 4 shows the effect of AGE-methylglyoxal on apoptosis of retinal pericytes of beef.
  • FIG. 5 represents the effect of AGE-methylglyoxal on the production of ceramides and DAG in the retinal pericytes of beef.
  • Figure 8 shows the effects of various antioxidants on apoptosis of pericytes in response to
  • FIG. 10 represents the effect of desipramine on apoptosis of pericytes induced by
  • Figure 11 shows the effect of desipramine on the stimulated production of ceramides and DAG in BRP induced by AGE-methylglyoxal.
  • FIG. 12 represents the production route for ceramides and DAGs in the pericytes envisaged on the basis of the invention.
  • FIG. 13 represents the effect of D609 on apoptosis of pericytes induced by AGE-methylglyoxal after two passages.
  • Figure 14 shows the effect of D609 on the stimulated production of ceramides and DAG in BRP induced by AGE-methylglyoxal.
  • FIG. 15 represents the signaling pathway leading to apoptosis of the pericytes envisaged on the basis of the invention.
  • FIG. 16 represents the effect of the caspase inhibiting peptides on the apoptosis of pericytes induced by AGE-methylglyoxal.
  • FIG. 17 represents the effect of the caspase inhibiting peptides z-VAD-FMK, z-LEHD-fmk and z-DEVD-FMK (50 ⁇ M) on the stimulated production of ceramides and DAG in BRP induced by AGE- methylglyoxal.
  • FIG. 18 represents the signaling pathway leading to apoptosis of the pericytes envisaged on the basis of the invention.
  • Figure 19 is a wester blot with an anti-human caspase antibody on cell lysates of pericytes treated or not with AGE.
  • Reagents All cell culture products come from Sigma (France) except SVF (Gibco, France), collagenase IA and collagenase / dispase (Boehringer-Mannheim, France). All the other reagents are pure "for analysis” and were purchased from Sigma (France), except the silica plates (silica gel 60 G, Merck), DAG kinase and ceramides (Tebu, France). The PD-10 columns are from Pharmacia (Sweden). The annexin-V labeling kit comes from Boehringer-Mannheim (France). N-acetyl-L-cysteine, desipramine, lipoic acid and ebselen come from Sigma (France). Caspase inhibitor peptides are from Calbiochem (France), fumonisin B1 and D609 are from Biomol (France).
  • the solutions are sterilized using a sterile 0.2 ⁇ m acrodisc filter (Gellman Science).
  • the stock solution of 1 ⁇ M of N-acetyl-L-cysteine is prepared extemporaneously: 163.2 mg are taken up in 1 ml of DMEM then the solution is sterile filtered.
  • a 1.2 mM coelenteramine stock solution in ethanol is prepared extemporaneously and added to the cells at the final concentration of 2 ⁇ M.
  • Zeaxanthin is dissolved in sterile DMSO at a concentration of 1.2 mM and added to the cells at a concentration of 2 ⁇ M.
  • a stock solution of 10 mM of ebselen is prepared from 2.74 g of product taken up in 1 ml of ethanol then the solution is aliquoted and stored at -20 ° C.
  • the stock solution of 100 mM of desipramine is prepared extemporaneously: 30.3 mg are taken up in 1 ml of distilled water then the solution is sterile filtered.
  • a stock solution of 1 mM fumonisin B1 is prepared from 1 mg taken up in 1378 ⁇ l of distilled water and then the solution is sterilized, aliquoted, frozen at -180 ° C and stored at -20 ° C.
  • the 9.4 mM stock solution of D609 is prepared extemporaneously: 1 mg of D609 is taken up in 400 ⁇ l of distilled water and then the solution is sterile filtered.
  • a 30 mM stock solution of the peptide z-VAD-FMK, z-DEVD- fmk, z-AEVD- fmk, z-VDVAD- fmk, z-IETD- fmk and z-LEHD-fmk is prepared from 1 mg sterile product included in 70, 50, 54, 45, 51 and 42 ⁇ l of sterile DMSO respectively.
  • the solution of each inhibitor is aliquoted in adequate volumes, then frozen at -20 ° C. 2) Devices. Spectrophotometric assays were carried out using the 96-well plate reader iEMS Reader MF
  • the fluorometer (type LS 50B) comes from
  • the sonication device (model B 15) comes from Branson.
  • the detection of apoptosis was carried out under an Axioplan fluorescence microscope from Cari Zeiss with a Zeiss IV filter, No. 9 (excitation: 450-490 nm; emission> 520 nm).
  • Ox eyes, freshly enucleated, are transported from the slaughterhouse on ice, immediately stripped of extraocular tissue and placed in PBS buffer. All the manipulations are then carried out in a sterile manner, under a laminar flow hood. Two eyes are required for each box of cells to sow.
  • the eyes are briefly immersed in 70% ethanol and then rinsed in HBSS medium (without Ca 2+ or Mg 2+ ). They are dissected 5 mm posterior to the cornea, the anterior chamber of the eye with the lens, as well as the vitreous contained in the eyeball, are removed.
  • the neuronal retina is detached from the eyeball, cut at the optic nerve and placed in HBSS buffer at 4 ° C.
  • This buffer is prepared from HBSS without Mg 2+ or Ca 2+ containing 10 mM HEPES at pH 7.4, 100 U / ml of penicillin and 100 ⁇ g / ml of streptomycin. After 10 min of oxygenation
  • Contaminating pigment cells are removed and the retinas, in sets of two, are placed in 10 ml of clean HBSS buffer on ice. The retinas are minced with scissors
  • Two beef retinas are used for each box (6 cm in diameter) to be seeded.
  • Each batch of two retinas is treated and homogenized as described above in 10 ml of HBSS buffer at 4 ° C.
  • the homogenate is centrifuged (300 g, 5 min, 4 ° C) and the pellet is resuspended in 5 ml of an enzymatic solution of collagenase / dispase.
  • This collagenase / dispase solution (1 mg / ml) prepared in HBSS medium without Mg 2+ or Ca 2+ containing 10 mM HEPES at pH 7.4, 100 U / ml of penicillin and 100 ⁇ g / ml of streptomycin , is then oxygenated for 10 min and the pH is adjusted to 7.4 before addition of TLCK (147 ng / ml) and DNase (200 U / ml). Digestion is continued for 20 min at 37 ° C and the cell pellet is resuspended by hand at mid-incubation. The suspension is then filtered on a filter 70 ⁇ m mesh nylon, sterile.
  • the fragments of microvessels contained on the filter are recovered in HBSS buffer (the filter is rinsed twice), centrifuged (300 g, 5 min, 4 ° C) and washed once in the same buffer. After centrifugation (300 g, 5 min, 4 ° C), the fragments of microvessels are resuspended in 3 ml of DMEM containing 10% of FCS, 2 mM of glutamine and the antibiotics. The microvessel fragments are seeded in a petri dish (6 cm in diameter) coated with 100 ⁇ g of fibronectin (4 ⁇ g / cm 2 ) in 2 ml of DMEM for 3-4 hours at 37 ° C (Su & Gillies, 1992 ).
  • the medium and the debris which have not adhered to the matrix are eliminated and 3 ml of the culture medium are added.
  • This medium consists of DMEM with 10% fetal calf serum (FCS), 80 ⁇ g / ml of heparin, glutamine and antibiotics.
  • FCS fetal calf serum
  • the cells are kept in an incubator at 37 ° C, under an atmosphere of humidified air containing 5% CO2.
  • the culture medium is renewed after 24 hours and then every 48 hours until they reach confluence.
  • the culture medium is eliminated and the cells are trypsinized with 1 ml of a 0.5% solution of trypsin and 0.2% EDTA until the cells round off (approximately 5 minutes ) after examination with a phase contrast microscope.
  • the trypsin is then inactivated with 2 ml of culture medium containing serum and the cells are recovered and then centrifuged (180 g, 3 min, 4 ° C).
  • the cells, subcultured in a 1: 3 ratio, are seeded in three dishes (6 cm in diameter) covered with fibronectin and cultured in the same medium. 2) Culture of pericytes in the presence of advanced glycation products (AGE).
  • AGE advanced glycation products
  • EFAs The effects of EFAs are tested on the same batch of cells (BRP from the same primary culture). When they are at confluence, the BRPs in primary culture are trypsinized. After having allowed them to attach for 4 hours at 37 ° C., the medium and the cellular debris which have not adhered to the matrix are eliminated and the culture medium (10% of FCS for the BRPs) is added. In order to test the effects of EFAs, an EFA solution (or its control) is added to the culture medium up to a concentration of 20 ⁇ M. Cultures are thus continued for 1 or 2 passages with the agents, ie 7 and 15 days respectively for the BRPs. Preparation of AGE:
  • AGE-methylglyoxal were prepared by incubating 7.2 mg / ml of BSA and 100 mM methylglyoxal for 50 hours at 37 ° C (Westwood & Thornalley, 1995).
  • the BSA-control was obtained by incubating albumin under the same conditions but without methylglyoxal.
  • the glycated proteins have been characterized by their fluorescence (370-
  • the proteins are assayed according to the method described by Schaffner & Weissmann (1973).
  • the assay samples containing the proteins are made up to 270 ⁇ l with PBS before adding 30 ⁇ l of Tris-HCl buffer (1 M, pH 7.5) containing 1% SDS, then 60 ⁇ l of 60% trichloroacetic acid. These solutions are "vortexed", left for 2 min at room temperature for the precipitation of the proteins and each filtered at the level of a benchmark previously noted, on a 0.45 ⁇ m nitrocellulose filter, wetted with 6% TCA. A standard range with 0 to 27 ⁇ g of BSA is carried out in parallel.
  • Apoptosis is detected and quantified in pericytes cultured for two passages with 2 ⁇ M of AGE-methylglyoxal or of its control using the technique of detection of apoptotic cells by annexin V and necrotic by propidium iodide.
  • Annexin V staining The presence of phosphatidylserine (PS) on the outer layer of the plasma membrane, characteristic of apoptotic cells, can be detected using annexin-V labeled with fluorescein. This protein has a very strong affinity for PS.
  • PS phosphatidylserine
  • this staining is carried out in the presence of a DNA intercalating and coloring agent, propidium iodide, similar to ethydium bromide.
  • a DNA intercalating and coloring agent propidium iodide, similar to ethydium bromide.
  • the pericytes must be under-confluent (75% confluence) and have therefore only been cultivated for approximately 12 days with AGE-methylglyoxal or BSA-control.
  • the BRPs (3.5 cm diameter dish) are rinsed three times with PBS and then incubated for 10 min in the dark with 500 ⁇ l of HEPES buffer containing 10 ⁇ l of annexin-V solution marked with fluorescein. and 10 ⁇ l of the propidium iodide solution supplied in the assay kit.
  • Apoptotic cells as well as necrotic cells have fixed annexin-V and therefore appear green under the fluorescence microscope, but only the nucleus of necrotic cells is colored red by propidium iodide.
  • the percentage of necrotic cells and apoptotic cells is determined on 10 different fields, that is to say on 300 to 800 cells in total.
  • Ceramides and diacylglycerols are measured in pericytes cultured for two passages with 2 ⁇ M of AGE-methylglyoxal or their control, according to the method described by Preiss et al. (1986). This method is based on the phosphorylation of ceramides and DAGs by diacylglycerol kinase (DAG-kinase) purified from Echerischia coli in the presence of ATP labeled with 32 P on the ⁇ phosphorus, according to the diagram represented in FIG. 3 attached.
  • DAG-kinase diacylglycerol kinase
  • the pericytes (2 or 3 boxes of 6 cm in diameter) are rinsed, recovered by scraping with "rubber policeman" in 0.5 ml of water on ice and the box rinsed with an additional 0.5 ml (volume of 1 ml of cell suspension) to which are added 10 ⁇ l of a solution of [9, 10- 3 H] -triacylglycerol at 0.5 ⁇ Ci / ml.
  • the total lipids are then extracted by the method of Bligh and Dyer (1959).
  • To this cell suspension (1 ml of PBS) are added 3.75 ml of a chloroform: methanol mixture (2: 1, v / v) containing 80 ⁇ l of BHT (5 mM) in solution in ethanol.
  • the solutions are then "vortexed" 30 sec and kept at rest for 30 min minimum, then 1.25 ml of NaCl (0.9%) and 1.25 ml of chloroform are added to separate the phases.
  • After centrifugation 700 g, 5 min), the lower organic phase is removed and the extraction of the aqueous phase is repeated twice with 1.5 ml of chloroform.
  • the lipid extracts are then collected and the chloroform is evaporated under a stream of nitrogen.
  • the aqueous phase allows the total proteins to be determined by amide black coloring and the organic phase is collected in an Eppendorff tube and then evaporated under nitrogen.
  • a standard range of ceramides (25 to 2,500 ng) and DAG (25 to 25,000 ng) containing the same amount of tritium-labeled triacylglycerol is produced in parallel.
  • the lipids are then dissolved in 20 ⁇ l of a detergent solution (7.5% of n-octylglucopyranoside, 5 mM of cardiolipin and 1 mM of DETAPAC) with 1 min of "sonication" followed by an incubation of 15 min at ambient temperature.
  • the reaction is started by adding 50 ⁇ l of the reaction buffer (100 mM imidazole, 100 mM NaCl, 25 mM MgCl 2 , 2 mM EGTA, pH 6.6), 20 ⁇ l of a DAG-kinase solution ( 4.86 mU) containing 10 mM DTT, and 10 ⁇ l of [ ⁇ - 32 P] ATP at 5 mCi / ml diluted 10 times in a solution containing 10 mM of unlabelled ATP, 100 mM of imidazole and 1 mM DETAPAC (pH 6.6).
  • the reaction buffer 100 mM imidazole, 100 mM NaCl, 25 mM MgCl 2 , 2 mM EGTA, pH 6.6
  • a DAG-kinase solution 4.86 mU
  • [ ⁇ - 32 P] ATP at 5 mCi / ml diluted 10 times in a solution containing 10 mM of unlabelled
  • the reaction is continued for 1 hour at room temperature and then stopped with 1 ml of the chloroform: methanol: IN hydrochloric acid mixture (100: 100: 1, v / v / v), 170 ⁇ l of a buffer containing 10 mM HEPES , 135 mM NaCl, 1.5 mM CaCl 2 , 0.5 mM MgCl 2 and 5.6 mM glucose (pH 7.4) then 30 ⁇ l of 100 mM EDTA. The mixture is then "vortexed", left for 15 min at room temperature and then centrifuged (10,000 g, 5 min) at room temperature.
  • the organic phase (lower) is removed and evaporated under nitrogen.
  • the lipids are then taken up in 300 ⁇ l of the ether: methanol mixture (9: 1, v / v) and deposited on a silica plate.
  • Ceramides-1-phosphate are separated from phosphatidic acid and triacylglycerols using the chloroform: methanol: acetic acid mixture (65: 15: 5, v / v / v) as the migration solvent.
  • the exposure of the silica plate to an autoradiographic film (30 min, -80 ° C.) makes it possible to visualize the different lipids labeled with 32 P.
  • the spots corresponding to ceramides-1-phosphate and to phosphatidic acid as well as the The last 3 cm before the migration front (corresponding to the triacylglycerols) are delimited with a graphite pencil and scraped.
  • the silica is collected in counting pots, humidified with 200 ⁇ l of methanol, 200 ⁇ l of distilled water and 2 ml of scintillation liquid (Picofluor) for 2 hours before adding 8 ml of the scintillation liquid.
  • the radioactivity emitted by 32 P or 3 H is then counted in each pot.
  • the radioactivity emitted by the stock solution of [9,10- 3 H] -triacylglycérol is also counted, thereby calculating the reaction yield for each sample.
  • the quantities of ceramides and diacylglycerols present in each sample are then determined after extrapolation from the standard range, taking into account the yield, and related to the amount of total protein.
  • Methylglyoxal does indeed seem to be very important in diabetes. It is a dicarbonyl whose blood concentration is greatly increased in diabetics (McLellan et al, 1994).
  • advanced glycation products derived from methylglyoxal have been described as the major chemical changes observed in chronic diseases such as diabetes (Degenhardt et al, 1998).
  • the BRPs were cultured for two passages (approximately 15 days) in the presence of AGE-methylglyoxal in order to mimic the chronicity of a diabetic environment, the objective of the study being first of all to test whether AGE-methylglyoxal induce 1 apoptosis of pericytes and if this phenomenon is associated with increased production of ceramides and DAG.
  • Apoptosis of pericytes in response to AGE-methylglyoxal L 1 Apoptosis was detected and quantified by labeling 1 annexin V 1 and propidium iodide in the BRP grown for two passages with 2 .mu.M of AGE- methylglyoxal or control (see Materials and Methods). This technique highlights the translocation of phosphatidylserine from the inner layer to the outer layer of the plasma membrane, a biochemical phenomenon characteristic of the early phase of apoptosis.
  • Annexin V labeled with fluorescein, stains the plasma membranes of apoptotic and necrotic cells in green, but only necrotic cells, whose plasma membrane has lost its integrity, are permeable to propidium iodide, which stains their nucleus in red.
  • Figure 4 reports the effect of AGE-methylglyoxal on apoptosis of beef retinal pericytes. The cells were cultured for two passages (approximately 15 days) in the presence of 2 ⁇ M of AGE-methylglyoxal or of BSA-control. The results are expressed as% of apoptotic cells in the total cell population.
  • AGE-methylglyoxal induce an increase of about a factor of 3 on average in the rate of apoptosis in the pericytes. No necrotic cells were observed.
  • genes regulating apoptosis have also been demonstrated in pericytes cultivated long-term with high concentrations of glucose and then subjected to a rapid reduction in glucose (Li et al., 1998) and in the reticy pericytes of diabetic patients recovered post mortem (Podesta et al., 2000).
  • the antioxidants tested can be classified into 3 groups.
  • the first group includes water-soluble compounds having a thiol function which has the capacity to provide a proton: these are N ⁇ -acetyl-L-Cysteine (NAC) and lipoic acid. These two agents have a protective effect on the redox balance of the cell's cytoplasm.
  • the second type of antioxidant tested is ebselen, a synthetic molecule containing a selenium atom. This compound has the particularity of mimicking the glutathione-selenium dependent peroxidase activity
  • the 3 rd group consists of liposoluble compounds rich in conjugated double bonds which have a high reactivity with respect to free radicals and which thus more specifically protect the membranes against lipid peroxidation. These are zeaxanthin and coelentermine.
  • Cysteine on apoptosis (annexin V, see Materials and Methods) induced by BRP by AGE-methylglyoxal.
  • the pericytes were cultured for two passages (12 to 15 days) in the presence of 2 ⁇ M AGE-methylglyoxal (or BSA-control) and 10 ⁇ M or 50 ⁇ M of N-acetyl-L-Cysteine.
  • the results, expressed as% inhibition of the induced apoptosis, are the average of 5 independent experiments.
  • N-acetyl-L-Cysteine protects the pericytes from apoptosis induced by AGE-Metylglyoxal.
  • Ceramides and DAGs were also assayed in the BRPs cultivated in the presence of N-acetyl-L-Cysteine (see FIG. 7). Ceramides and DAGs were assayed as described in the Materials and Methods section. The results, expressed as% inhibition of stimulated production of ceramides and DAG, are the average of 2 independent experiments.
  • ceramides can come from the de novo biosynthetic pathway. Two metabolic intermediates, sphingosine and sphinganine are acetylated by a sphinganine-acyl-transferase to form ceramides. Ceramides can also be the product of enzymatic hydrolysis: they can come from the sphingomyelin "pool” on the one hand and from the glycosphingolipid "pool” (ceramides linked to one or more glycan chains) (Mathias and al, 1998; Okasaki et al., 1998).
  • DAGs can come from an activation of the de novo biosynthesis pathway, or they can come from enzymatic hydrolysis: DAGs can be released from a "pool” of phosphatidylinositolbisphosphates or from a “pool” of phosphatidylcholines under l action of specific phospholipases.
  • the production routes of these two metabolic intermediates have been explored using a pharmacological approach.
  • the cells were cultured in the presence of various enzyme inhibitors, the effects of which were analyzed on the one hand on induced apoptosis and on the other hand on stimulated production of ceramides and DAG in response to AGE-methylglyoxal.
  • fumonisin B1 The addition of 0.01 ⁇ M of fumonisin B1 to the culture medium only induced a 22% inhibition of apoptosis of the pericytes (annexin V, see Materials and Methods) cultured for two passages (approximately 15 days ) in the presence of 1 AGE-methylglyoxal (or BSA-control). The 0.1 ⁇ M fumonisin B1 was also tested. At this concentration, fumonisin B1 is proapoptotic, since it affects the basal rate of apoptosis of cells cultured with BSA-control (results not shown).
  • Fumonisin B1 does not protect the pericytes from induced apoptosis. De novo synthesis of ceramides therefore does not seem to be involved in apoptosis of retinal pericytes induced by AGE-methylglyoxal.
  • FIG. 10 reports the effect of desipramine on apoptosis of pericytes induced by AGE- methylglyoxal.
  • the results, expressed in% of inhibition of the induced apoptosis, are the average of 7 independent experiments for desipramine at 0.1 ⁇ M and 6 independent experiments for desipramine at 0.3 ⁇ M.
  • a culture of the pericytes for two passages (approximately 15 days) in the presence of AGE-methylglyoxal with 0.1 ⁇ M and 0.3 ⁇ M of desipramine allows a partial inhibition of 35% of the apoptosis induced by AGE-methylglyoxal (Figure 10).
  • Desipramine at 1 ⁇ M was also added to the culture medium but; under these conditions, the basal rate of apoptosis of the control cells was affected (results not shown).
  • Figure 11 reports the effect of desipramine on the stimulated production of ceramides and DAG in BRP induced by AGE-methylglyoxal. Ceramides and DAGs were assayed as described in the Materials and Methods section. The results, expressed as% inhibition of stimulated production of ceramides and DAG, are the average of 4 independent experiments for desipramine at 0.1 ⁇ M and 2 independent experiments for desipramine at 0.3 ⁇ M. 0.1 ⁇ M desipramine added to the culture medium during two passages blocks 78% of the ceramides produced in the pericytes in response to AGE-methylglyoxal but only reduces the overproduction of DAG by 17%.
  • FIG. 12 reports the production route for ceramides and DAGs in the pericytes envisaged on the basis of the invention.
  • Figure 13 reports the effect of D609 on apoptosis (annexin V, Material and Methods) of pericytes induced by AGE-methylglyoxal after two passages.
  • the results expressed as a% inhibition of induced apoptosis, are the average of 7 independent experiments for D609 at 9.4 ⁇ M and 6 independent experiments for D609 at 30 ⁇ M and the desipramine / D609 combination.
  • the addition of 9.4 ⁇ M and 30 ⁇ M of D609 in the culture medium made it possible to block 40% and 47% respectively of the apoptosis of the pericytes induced by AGE-methylglyoxal.
  • Figure 14 reports the effect of D609 on the stimulated production of ceramides and DAG (see Materials and Methods) in BRP induced by AGE-methylglyoxal.
  • the results, expressed as% inhibition of stimulated production of ceramides and DAG, are the average of 4 independent experiments for D609 at 9.4 ⁇ M and 2 independent experiments for D609 at 30 ⁇ M and the combination desipramine / D609.
  • Incubation of the cells in the presence of 9.4 ⁇ M of D609 induces an almost total inhibition of the production of ceramides and DAGs by 95% and 80% of the stimulated level, respectively.
  • D609 enabled complete inhibition of the production of ceramides and an inhibition 65% of the DAG produced.
  • Treatment of the cells with the two combined agents induces an effect equivalent to D609 30 ⁇ M: the overproduction of ceramides is completely blocked and 70% of the DAGs produced under AGE-methylglyoxal are inhibited.
  • Figure 15 shows the signaling pathway leading to apicyosis of pericytes.
  • AGE-methylglyoxal probably via a specific AGE receptor, induce oxidative stress which can be located at the crossroads of two signal transduction pathways leading to apoptosis of pericytes.
  • treatment of the cells with N-acetyl-L-Cysteine completely blocks the stimulated production of ceramides and DAGs and completely inhibits the apoptosis of the pericytes induced by AGE-methylglyoxal.
  • the research work then consisted in defining an enzymatic target located upstream of the ceramides and DAGs and which could also be at the crossroads of the two signaling routes.
  • proteases from the ICE family (Interleukin-1 Converting Enzyme) known as caspases (Cytosolic Asparte- Specifies Cysteine Proteases) play a key role in the transduction of apoptotic signals.
  • caspases Cytosolic Asparte- Specifies Cysteine Proteases
  • the caspases could be classified differently into three subgroups :, group I consisting of caspases- 1, 4, 5 (enzymes described as being involved in inflammatory responses), group II consisting of caspases-2, 3, 7 and group III consisting of caspases-6, 8, 9, 10.
  • group II proteases require an aspartate residue in both the first and fourth position of the site of proteolytic cleavage (XDXXD)
  • group III proteases are more tolerant towards the fourth amino acid residue, while presenting a preference for aliphatic amino acids (XE [I / T / H / V] D) (Thornberry et al, 1997; Garcia-Calvo et al, 1998).
  • caspases-1 family of caspases-1 grouping together the caspases- 1, 4, 5, 11, the IchlI-like proteases (family of caspases- 2) grouping caspases-2, 9 and CPP (cysteine protein protease) 32-like proteases (family of caspases-3) grouping caspases-3, 6, 7, 8, 10 (Alnemri et al, 1996; Duan and al, 1996a, 1996b).
  • ICE-like proteases family of caspases-1 grouping together the caspases- 1, 4, 5, 11, the IchlI-like proteases (family of caspases- 2) grouping caspases-2, 9 and CPP (cysteine protein protease) 32-like proteases (family of caspases-3) grouping caspases-3, 6, 7, 8, 10 (Alnemri et al, 1996; Duan and al, 1996a, 1996b).
  • Caspases are specifically inhibited in vitro and in vivo by synthetic peptides (most often tetrapeptides) made permeable to cells by chemical groups blocking the terminal NH 2 and COOH functions and mimicking the cleavage site of their respective substrate .
  • Figure 16 reports the effect of caspase inhibiting peptides on apoptosis of pericytes induced by AGE-methylglyoxal.
  • the cells were cultured for two passages (approximately 15 days) in the presence of AGE-methylglyoxal (or of BSA-control) and the inhibitory peptides z-VAD-fmk, z-DEVD-fmk, z-IETD-fmk, z - AEVD-fmk, z-VDVAD-fmk and z-LEHD-fmk (50 ⁇ M).
  • Apoptosis was detected and assayed by labeling with annexin V, as described in the Materials and Methods section.
  • results expressed as% inhibition of induced apoptosis are the average of 6 independent experiments for z-VAD-fmk and z-DEVD-fmk, 4 independent experiments for z-LEHD-fmk and 3 independent experiments for z -VDVAD-fmk, z-AEVD-fmk and z-IETD-fmk. Adding 50 ⁇ M of z-VAD-fmk, z-DEVD-fmk, z-
  • AEVD-fmk and z-LEHD-fmk in the culture medium allows an almost total inhibition of apoptosis of pericytes induced by AGE-methylglyoxal. While the z-IETD-fmk peptide does not protect cells from apoptosis, the z- VDVAD-fmk induces partial inhibition of AGE-methylglyoxal-induced apoptosis ( Figure 16).
  • Figure 17 shows the effect of the z-VAD-FMK and z-DEVD-FMK caspase inhibiting peptides (50 ⁇ M) on the stimulated production of ceramides and DAG in BRP induced by AGE-methylglyoxal. Ceramides and DAGs were assayed as described in the Materials and Methods section. The results are expressed as% inhibition of stimulated production and are the result of 2 independent experiments.
  • peptide inhibitors on the production of ceramides and DAGs differ: while the stimulated production of the two metabolic intermediates is not affected in the pericytes treated with 50 ⁇ M of z-DEVD-fmk or z-LEHD-fmk, the z-VAD-fmk peptide blocks the overproduction of ceramides and DAGs by 75% and 100% respectively.
  • the primary antibody directed against caspase-10, its respective blocking peptide, the recombinant caspase-10 used as positive control and the secondary anti-rabbit antibody were supplied by Biomol (France) Films for autoradiography (Hyperfilm) and ECL development reagents were purchased from Amersham (France). SDS-page gels (12% Tris-HCl ready gel), nitrocellulose membranes (porosity 0.45 ⁇ M) for immunoblotting, the secondary anti-goat antibody and the molecular weight markers (protein precision standards, broad range) are from Bio-Rad (France).
  • Pericytes (2 to 3 6 cm dishes), grown for 15 days in the presence of 3 ⁇ M of AGE-methyglyoxal (or
  • BSA-control as described in the above-mentioned application, are placed on a bed of ice, washed 3 times with cold DPBS and then scraped using a policeman ruber in 500 ⁇ l of cold recovery buffer (Tris -HCl 0.1 M pH 8 containing 4.4 ⁇ M of pepstatin A, 6 ⁇ M of leupeptin, 0.6 mM of PMSF and 10 mM of EDTA).
  • cold recovery buffer Tris -HCl 0.1 M pH 8 containing 4.4 ⁇ M of pepstatin A, 6 ⁇ M of leupeptin, 0.6 mM of PMSF and 10 mM of EDTA.
  • the cell suspension is solubilized directly in the petri dish by adding 100 ⁇ l of La ⁇ mmli 5X buffer (Tris-HCl 0.15 M pH6, 8 containing 5% SDS, 12.5% glycerol , 12.5% ⁇ mercaptoethanol and 1% bromophenol blue).
  • La ⁇ mmli 5X buffer Tris-HCl 0.15 M pH6, 8 containing 5% SDS, 12.5% glycerol , 12.5% ⁇ mercaptoethanol and 1% bromophenol blue.
  • the DNA balls, making the solution viscous are broken mechanically using energetic back and forth in a syringe equipped with a 30G needle 1 2 .
  • the protein samples are then heated for 3 min at 100 ° C. before being deposited on the polyacrylamide gel.
  • Electrophoresis is carried out under reducing ( ⁇ -mercaptoethanol) and denaturing conditions
  • Electrotransfer of proteins on nitrocellulose membrane At the end of electrophoresis, the membrane, the sheets of Wattman paper and the foam sponges (Scotch Brite, 3M) are balanced for 10 min in the cold transfer buffer (Tris 25 mM pH 8.3, glycinel92 mM, methanol 20% (v / v)).
  • the sandwich is made in semi-immersion: the membrane and the gel are superimposed and framed on both sides with paper and a sponge.
  • the assembly placed in the tank, is immersed in the transfer buffer, and the proteins are transferred from the gel (cathode) to the nitrocellulose membrane (anode) electrophoretically at 100 V for 45 min, at 4 ° C. and with stirring. magnetic.
  • the antigenic material used in our study is from bovine sources. Not having primary antibodies directed against bovine material, our choice is focused on polyclonal antibodies with cross immunoreactivity with different species (humans, mice and rats).
  • Buffers used TBS buffer (Tris Buffer Saline): Tris-HCl 10 mM pH 8.0, NaCl 150 mM
  • TTBS buffer 0.05% Tween 20 in TBS
  • Antibody dilution buffer 1% BSA in TTBS
  • Membrane saturation buffer 10% milk in TTBS
  • the nitrocellulose membrane is stained with culvert red to identify the protein migration tracks, then discolored.
  • the non-specific binding sites of the membrane are blocked by incubation in the appropriate saturation buffer for 60 min at room temperature with gentle shaking (or alternatively at 4 ° C. overnight). The membrane is washed three times (15 min then 5 and 5 min) in buffer
  • TTBS precedes the second incubation (1 hour 30) with the secondary anti-rabbit antibody coupled to horseradish peroxidase (1/6000).
  • the membrane is again washed in TTBS and then rinsed for 5 min in TBS before being revealed at the ECL.
  • the membrane is dried quickly on absorbent paper, incubated with the detection solution for chemiluminescence of the ECL kit for 1 min and then wrapped in Saran film paper. It is then exposed to an autoradiographic film for a period of 8 min and the films are developed. c) Results.
  • caspase 10b or 10d is present in pericytes incubated with EFAs suggesting that there is indeed activation of caspase 10 during apoptosis of retinal pericytes induced by EFAs.
  • the peptide z-LEHD-fmk an inhibitor described as specific for effector caspase-9, also has a protective effect on apoptosis of the pericytes, but without affecting the overproduction of DAGs or ceramides induced by AGE-methylglyoxal. This result suggests that caspase-9, blocked by z-LEHD-fmk, occurs downstream of the production of DAGs and ceramides.
  • caspases-2, 9 and 10 seem to participate in the transduction of the apoptotic signal in the retinal pericytes.
  • Figure 18 shows a signaling pathway leading to apoptosis of pericytes.
  • AGE-methylglyoxal induce oxidative stress which seems to activate an initiating caspase (caspase-2 or -10).
  • Activation of this caspase would activate an enzymatic cascade involving first a phosphatidylcholine-phospholipaseC, then an acid sphingomyelinase and then caspase 9 and an effector caspase of CPP32-like proteases. It was possible to determine that these caspases 9 and 3 are located at the crossroads of the two metabolic pathways. On the other hand, it is not possible to conclude if the two pathways diverge downstream of the initiating caspase or if the oxidative stress remains at the crossroads of these two pathways.
  • FIG. 19 shows that caspase 10 is well activated when the bovine retinal pericytes are subjected to EFAs.
  • caspase 10b FADD like interleukin-1-converting enzyme-2, FLICE-2
  • lOd 60 kDa
  • ICE-LAP3 a novel Mammalian Homologue of Caenorhabditis elegans Cell Death Protein Ced- 3 is Activated During Fas- and T ⁇ F-induced Apoptosis. J. Biol. Chem. 271: 1621-1624 17) Duan H, Orth K, Chinnaiyan AM, Poirier GG, Froelich CJ, He WW and Dixit WM (1996b).
  • ICE-LAP6 a Novel Member of the ICE / Ced-3 Gène Family, is Activated by Cytotoxic T Cell Protease Gramzyme BJ Biol. Chem. 271: 16720-16724
  • Beta-cyclodextrins enhance bioavailability of pilocarpine.
  • Docosahexaeno ⁇ c acid is a major n-3 polyunsaturated fatty acid in bovine retinal microvessels. J " . Neurochem. 66: 2160-2167
  • TNF Activâtes NF-kB by Phosphatidylcholine-specif ic Phospholipase C-

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur de l'apoptose des péricytes rétiniens pour la préparation d'un médicament utile pour prévenir ou traiter la rétinopathie diabétique. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation d'un composé choisi parmi: un anti-oxydant, un composé inhibiteur de la production des céramides et/ou des DAG, un inhibiteur de la sphingomyélinase acide, un inhibiteur de la phosphatidylcholine-phospholipase C, un inhibiteur de caspase, ou d'un mélange d'au moins deux de ceux-ci pour la préparation d'un médicament utile pour prévenir ou traiter la rétinopathie diabétique.

Description

UTILISATION D'INHIBITEURS DE L'APOPTOSE DES PERICYTES POUR LE TRAITEMENT ET/OU LA PREVENTION DE LA RETINOPATHIE DIABETIQUE .
La rétinopathie diabétique représente une des complications microvasculaires parmi les plus invalidantes du diabète, pouvant mener à son stade ultime à la cécité (Grange, 1995 ; Frank, 1995 ; Aiello LP et al , 1998) . C'est la deuxième cause de cécité acquise dans les pays développés derrière la dégénérescence maculaire liée à l'âge (Nathan et al, 1991), et le risque d'un patient diabétique de devenir aveugle a été estimé 25 fois supérieur à celui de la population générale (Kahn et Hiller, 1974) . Il n'y a pas, à l'heure actuelle, de traitement pharmacologique préventif ou curatif de cette complication, le seul traitement étant la photocoagulation rétinienne au laser ou la vitréotectomie dans les cas les plus sévères (Frank, 1995 ; Aiello, 1998) .
La rétinopathie diabétique est une complication diabétique évolutive, passant d'un stade dit "simple" ou débutant (background retinopathy) , à une phase finale dite « rétinopathie proliférante », où il y a formation de néovaisseaux rétiniens, fragiles, menant à des hémorragies sévères, parfois avec décollement de la rétine, et à la perte de vision (Grange 1995, Frank, 1995) . Dans la rétinopathie simple, les lésions microvasculaires se caractérisent par des naicroanévrysmes, petites hémorragies en points, exsudats et dilatations veineuses (Palmberg, 1977, ETDRS report n° 10, 1991) . Cette forme de rétinopathie simple peut rester un grand temps cliniquement silencieuse. A ce stade de rétinopathie simple, des altérations cellulaires et structurales des capillaires rétiniens ont pu être notées, à partir de l'examen de rétines de patients diabétiques prélevées post mortem et comparées à des rétines d'individus normaux d'âges comparables. Comme montré sur la figure 1 en annexe, les capillaires rétiniens sont tapissés de cellules endothéliales du côté luminal du vaisseau, et de péricytes (ou cellules murales) situés à l'extérieur et enfouis dans la membrane basale du vaisseau.
Dans la rétine humaine ou la rétine de rat, le rapport numérique des péricytes aux cellules endothéliales est de un pour un (Kuwabara and Cogan, 1963) . Les altérations observées à ce stade précoce consistent en un épaississement de la membrane basale des capillaires
(Frieden ald, 1950) et une disparition sélective des péricytes (Cogan et al, 1961, Kuwabara and Cogan, 1963), abaissant le rapport numérique des péricytes par rapport aux cellules endothéliales des capillaires rétiniens à 0,3 pour 1 dans la situation pathologique et même 0,1 pour les stades ultimes (Cogan et al, 1961 ; Kuwabara and Cogan, 1963) .
Les travaux réalisés à partir de rétines humaines prélevées pos t mort em chez des patients diabétiques de longue durée ont permis de montrer que les péricytes mourraient par apoptose, la mort cellulaire programmée, et non par nécrose, la mort brutale observée suite à une atteinte toxique (Mizutani et al, 1996, Li et al, 1997, Podesta et al, 2000). Mais la(les) voie(s) de signalisation (s) intra cellulaire (s) par la (es) quelle (s) ils disparaissent n'est (ne sont) pas connue(s).
La détection des péricytes apoptotiques a été effectuée in si tu , sur les rétines entières par une technique de marquage des noyaux des cellules qui entrent en apoptose, la méthode TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUDP nick-end labeling) (Mizutani et al, 1996). Venant à l'appui de ces données, certains péricytes qui entrent en apoptose sont aussi colorés quand on utilise un anticorps dirigé contre une protéine impliquée dans 1 'apoptose qui se nomme Bax (Podesta et al, 2000) .
Une autre équipe, après purification des péricytes de rétines de patients diabétiques, a montré une augmentation de l'expression du gène d'une autre protéine impliquée dans l' apoptose, la caspase 3 ou CPP 32 (Cysteine Protease Protein 32 kDa) , en détectant un taux augmenté ARNm de cette protéine par une technique d'amplification par polymérisation en chaîne à la transcriptase inverse (Li et al, 1999) . Ces péricytes purifiés voient aussi l'expression augmentée d'autres gènes impliqués dans les défenses antioxydantes cellulaires comme celui de la glutathion peroxydase par exemple, suggérant que le stress oxydant pourrait être impliqué dans la disparition des péricytes rétiniens par apoptose (Li et al, 1999) .
Les mécanismes cellulaires sous-jacents par lesquels les péricytes meurent par apoptose sont encore largement inconnus. Les travaux réalisés dans le cadre de la présente invention ont précisément visé à identifier la chaîne d'événements menant à 1 ' apoptose des péricytes de façon à définir des cibles pharmacologiques permettant d'enrayer le processus de perte des péricytes observée dans la phase précoce de la rétinopathie diabétique.
Des études entreprises dans le passé par The Diabètes Control Complications Trial Research Group (DCCT) (1993) ou l'UK Prospective Diabètes Study Group (UKPDS) (1998a et b) ont déjà montré le rôle clef du contrôle de l'hyperglycémie dans le développement de la rétinopathie diabétique. Plusieurs études ont déterminé que le glucose, à des concentrations pathologiques, pouvait induire des changements biochimiques susceptibles d'altérer les fonctions physiologiques ou la viabilité des cellules microvasculaires rétiniennes. L'effet inhibiteur du glucose in vitro sur la prolifération des péricytes, alors que la croissance des cellules endothéliales n'est pas modifiée (Porta et al, 1994), pourrait par exemple expliquer la disparition sélective des péricytes au cours de la rétinopathie. De même, la synthèse de composants de la membrane basale (collagène, laminine, fibronectine) stimulée dans les péricytes et les cellules endothéliales rétiniennes cultivés en présence de glucose (Li et al, 1984, Mandarino et al;, 1993) pourrait entraîner 1 ' épaississement de la membrane basale.
Un autre mécanisme par lequel le glucose peut mener aux complications vasculaires dans le diabète, est la production et l'accumulation accrues de produits avancés de glycation ou AGE (Advanced Glycation End products) formés par la glycosylation non-enzymatique -ou glycation- de protéines, ADN ou lipides (réaction de Maillard, 1912) qui ont été mis en évidence dans de nombreuses études lors du diabète (Thornalley, 1999) . La quantité d'AGE mesurée dans la peau de patients diabétiques est d'ailleurs fortement corrélée avec la sévérité des complications vasculaires
(Beisswenger et al., 1995) . La glycation, ou voie de
Maillard représentée à la figure 2 en annexe, décrit la liaison des sucres réducteurs aux protéines : un sucre réducteur, sous forme ouverte, réagit d'abord avec le groupe aminé libre d'acides aminés basiques contenus dans les protéines (lysine, arginine) , entraînant la formation d'une base de Schiff stabilisée par la suite en produit d'Amadori.
Ces étapes sont réversibles et dépendantes de la concentration en substrats (protéines et sucres) . Une fois formé, le produit d'Amadori subit une série de modifications qui mène soit à une fragmentation oxydative et à la formation de produits dits de glycoxydation comme la carboxyméthyllysine (CML) , soit à la formation de dicarbonyles comme la 3-désoxyglucosone . Ces dicarbonyles, très réactifs, vont à leur tour réagir avec des aminés de protéines, et propager ainsi la réaction de Maillard, en formant des ponts intra et intermoléculaires dans certaines protéines à durée de vie longue (Thornalley, 1999) . D'autres voies de synthèse des AGE, outre le glucose ont été proposées récemment . Le méthylglyoxal, formé par la fragmentation des trioses phosphates et l'oxydation de l'acétone dans le foie (grâce à des monooxygénases) , est un autre dicarbonyle dont la concentration sanguine est augmentée chez les diabétiques (Me Lellan et al., 1994) et qui, in vi tro, dans des conditions physiologiques de pH et de température, est capable de modifier de manière irréversible, notamment les résidus arginine de protéines (Lo et al., 1994). De plus, les AGE de protéines formés après réaction avec le méthylglyoxal sont décrits comme des produits majeurs observés lors du diabète (Degenhardt et al, 1998) . La formation d'AGE de protéines intracellulaires après réaction avec le méthylglyoxal, plus réactif que le glucose dans la réaction de Maillard, semble être une voie de formation majoritaire dans les cellules (Nishikawa et al., 2000, Shinohara et al, 1998) .
Dans les microvaisseaux rétiniens, une accumulation de produits d'Amadori, précurseurs d'AGE (Schalkwijk et al, 1999), ainsi qu'une accumulation d'AGE a été mise en évidence grâce à des anticorps anti-AGE (ou anti-Amadori) , au niveau de la membrane basale des péricytes et des cellules endothéliales (Stitt et al., 1997) . Plusieurs études réalisées in vi tro suggèrent que les AGE pourraient être impliqués dans le dysfonctionnement vasculaire rétinien. Les AGE modifient en effet la prolifération des deux types cellulaires, ils inhibent en particulier la croissance des péricytes (Chibber et al., 1997 ; Ruggiero-Lopez et al., 1997, Yamagishi et al, 1995). Les AGE extracellulaires sont capables de se lier à des récepteurs membranaires spécifiques et d'induire des réponses cellulaires variées. Des travaux ont montré qu'il y a colocalisation des AGE et des récepteurs aux AGE dans les microvaisseaux rétiniens de rats diabétiques (Stitt et al, 1997, Soulis et al, 1997). Ces récepteurs ont été identifiés sur plusieurs types cellulaires, dont les péricytes (Chibber et al, 1997, Yamagishi et al, 1995, Stitt et al, 1997, Thornalley, 1998 ) et différents types de récepteurs ont été isolés : p60, p90 (Yang et al., 1991) , RAGE (Receptor for AGE) , qui est un récepteur de la superfamille des immunoglobulines (Neeper et al, 1992) complexé à la lactoferrine (Schmidt et al, 1992) et la galectine 3 (Vlassara et al., 1995). RAGE, le récepteur le mieux caractérisé et qui est présent sur les péricytes
(Yamagishi et al, 1995, Brett et al, 1993), après avoir fixé un AGE, induit un stress oxydant intracellulaire (Yan et al., 1994) et l'activation du facteur de transcription NF-KB (Yan et al., 1994) ainsi que de l'activation de p21 ras et de la MAP (Mitogen Activated Protein) - kinase
(Lander et al., 1997) dans les cellules endothéliales de veine de cordon ombilical. L'activation du facteur de transcription NF-KB dans ces cellules peut être inhibée par divers antioxydants comme l'acide lipoïque (Bierhaus et al., 1997), les enzymes antioxydantes (Yan et al., 1994). Le trolox, un antioxydant, est capable de prévenir la perte des péricytes dans la rétine de rats diabétiques (Ansari et al, 1998) suggérant que le stress oxydant pourrait être impliqué dans leur disparition. Un ARN antisens dirigé contre le récepteur RAGE corrige l'effet antiprolifératif des AGE observé sur les péricytes (Yamagishi et al, 1995) . L'importance de la voie de Maillard et de l'accumulation des AGE dans la pathogenèse des complications diabétiques, et de la rétinopathie en particulier, a pu être explorée notamment grâce à l'utilisation d'inhibiteurs de glycation comme 1 ' aminoguanidine, qui par son aminé libre piège le glucose ou les dicarbonyles réactifs en les empêchant de réagir avec les protéines. Dans un modèle de rats diabétiques à la streptozotocine, 1 ' aminoguanidine prévient l'accumulation des AGE dans les microvaisseaux rétiniens, ainsi que la disparition des péricytes et réduit de 80% le nombre de capillaires acellulaires dans la rétine (Hammes et al., 1991) .
Les mécanismes par lesquels les AGE mènent à la disparition des péricytes, ainsi que le mode de disparition, apoptose ou nécrose, des péricytes par les AGE, restent des questions par contre non-résolues à ce jour et ont fait précisément l'objet d'une partie des travaux réalisés dans le cadre de la présente invention. Les Inventeurs se sont ainsi intéressés à élucider les voies de signalisation intracellulaires par lesquelles les AGE provoquent la mort des péricytes par apoptose.
Ces travaux ont permis de concevoir de nouvelles méthodes pour prévenir ou traiter la rétinopathie diabétique consistant à administrer à un sujet une quantité efficace d'au moins un inhibiteur de l' apoptose des péricytes rétiniens. L'invention est remarquable en ce qu'elle offre de nouveaux moyens de traitement ou de prévention tant d'une rétinopathie établie cliniquement que d'une rétinopathie simple. Les signes cliniques d'une rétinopathie simple sont généralement l'apparition d'un ou deux microanévrysmes par fond d'oeil. On désignera ci-après par rétinopathie diabétique, tant une rétinopathie établie qu'une rétinopathie simple. Ainsi, l'invention a pour objet l'utilisation d'un inhibiteur de l' apoptose des péricytes rétiniens pour la préparation d'un médicament utile pour prévenir ou traiter la rétinopathie diabétique.
Il a été montré dans le cadre de l'invention que les AGE, produits après incubation de l'albumine avec du méthylglyoxal, ajoutés dans le milieu de culture des péricytes (2 μM) pendant deux passages (10-15 jours) provoquait une stimulation de leur mort par apoptose (3 fois le taux basai), ainsi que l'accumulation intracellulaire de ceramides et de diacylglycërol (DAG) (200 % du taux basai) . L' apoptose et la production accrue de ceramides et DAG sont normalisées en présence d' antioxydants dans le milieu de culture, comme la N - acétyl-cystéine (NAC) à 10 ou 50 μM, concentrations non cytotoxiques, suggérant que les AGE induisent un stress oxydant dans les cellules et qu'ils contribuent à leur mort par apoptose . En conséquence, l'invention concerne à titre d'inhibiteur de 1 ' apoptose des péricytes rétiniens, un composé anti -oxydant . A titre d'exemple de tels composés anti-oxydants on peut citer la N -acétyl-L-Cystéine, l'acide lipoïque, l'ebselen, la zéaxanthine, la coelentéramine, un dérivé ou un mélange de ceux-ci. Les composés anti -oxydants sont tout particulièrement intéressants car ils réduisent la production des ceramides et/ou des DAG. Ainsi, l'invention vise également tout composé capable de réduire directement ou indirectement la production des ceramides et/ou des DAG.
Il a en effet été mis en évidence que 1 ' apoptose est corrigée par d'autres antioxydants que la N- acétyl-L-Cystéine comme l'acide lipoïque (7 et 14 μM) ou l'ebselen (5 et 10 μM) , et partiellement (réduction de l'ordre de 50%) par la zéaxanthine (2 μM) ou la coelentéramine (2 μM) , tous utilisés à des concentrations non cytotoxiques .
Il a en outre maintenant été trouvé que les DAG et les ceramides sont produits par une activation couplée de la phospholipase C spécifique de la phosphatidylcholine
(PC-PLC) et de la sphingomyelinase acide et que les ceramides ne semblent pas être synthétisés de novo .
En effet, le 10 , 11 - D ihydro - 5 - [ 3 - (methylamino) propyl] -5H-dibenz [b, f] azepine aussi désigné désipramine (0,1 et 0,3 μM) , qui est un inhibiteur de la sphingomyelinase acide, ou le tricyclo [5.21.0 (2.6) ] decyl-
(9 [8] xanthogenate aussi désigné D609 (9,4 ou 30 μM) , qui est un inhibiteur de la PC-PLC, inhibent bien la production de ceramides, mais seul le D609 inhibe à la fois la production de ceramides (95%) et de DAG (80%) , suggérant que la production de DAG par la PC-PLC est située en amont de l'activation de la sphingomyelinase acide produisant les ceramides. La fumonisine Bl (0,01 μM) , inhibiteur de la synthèse de novo des ceramides, n'inhibe que marginalement
1 ' apoptose induite par les AGE (20%) suggérant que cette voie de production des ceramides n'est probablement pas impliquée. L' apoptose, quant à elle, n'est inhibée que 50% environ en présence de 10 , 11 - Dihydro - 5 - [3- (methylamino) propyl] -5H-dibenz [b, f] azepine (désipramine)
(0.3 μM) ou de tricyclo [5.21.0 (2.6) ] decyl- (9 [8] xanthogenate
(D609) (30 μM) , ou leur combinaison, alors que les antioxydants protègent totalement les cellules, suggérant une voie parallèle à celle de la PC-PLC et sphingomyelinase acide menant à 1 ' apoptose des péricytes à partir du stress oxydant intracellulaire.
En conséquence, l'invention concerne tout particulièrement l'utilisation : - d'un inhibiteur de la phosphatidylcholine- phospholipase C (PC-PLC) en tant qu'inhibiteur de la formation des DAG,
- d'un inhibiteur de la sphingomyelinase acide en tant qu'inhibiteur de la formation des ceramides, pour la préparation d'un médicament utile pour le traitement et/ou la prévention de la rétinopathie diabétique. En effet, ces inhibiteurs sont remarquables pour leur capacité à protéger les péricytes rétiniens de 1' apoptose.
Parmi les inhibiteurs de la phosphatidylcholine-phospholipase C, on peut citer plus particulièrement le D609, ou un dérivé de celui-ci.
Parmi les inhibiteurs de la sphingomyelinase acide, on peut citer plus particulièrement la désipramine, ou un dérivé de celle-ci.
En outre, grâce à des inhibiteurs peptidiques spécifiques de protéases effectrices à cystéine impliquées dans l' apoptose, les caspases, les Inventeurs ont pu explorer l'intervention des caspases dans 1 ' apoptose des péricytes par les AGE. Ces peptides sont modifiés chimiquement par un groupement benzyleoxycarbonyle du côté N-terminal (z) et par un groupe (0-méthyle) -fluorométhyle cëtone (fmk) du côté C-terminal les rendant plus perméants aux cellules. Les peptides testés sur 1 ' apoptose des péricytes provoquée par les AGE ont été :
- le tripeptide z-VAD-fmk, un inhibiteur de toutes les caspases, - z-DEVD-fmk, un inhibiteur spécifique d'une caspase effectrice, la caspase-3,
- z-LEHD-fmk, un inhibiteur spécifique d'une caspase effectrice, la caspase-9, - z-IETD-fmk, un inhibiteur spécifique d'une caspase initiatrice, la caspase-8, z-VDVAD-fmk et z-AEVD-fmk inhibiteurs respectivement de la caspase-2 et -10, initiatrices. Le peptide z-VAD-fmk (pan caspase inhibiteur) , z-DEVD-fmk (caspase-3) , z-AEVD-fmk (caspase-10) et z-LEHD- fmk (caspase-9) inhibent tous les quatre 1 ' apoptose induite par les AGE, mais seul le peptide z-VAD-fmk a inhibé la production de DAG et de ceramides alors que z-DEVD-fmk et z-LEHD-fmk n'ont pas eu d'effet. Ceci suggère qu'une caspase initiatrice est impliquée en amont de la production de DAG et de ceramides, et qu'elle est inhibée par z-VAD- fmk. De plus, deux caspases effectrices, la caspase-3 et la caspase-9, sont impliquées dans la phase finale de 1 ' apoptose et sont inhibées par z-DEVD-fmk et z-LEDH-fmk, respectivement, et sont situées après la production de DAG et de ceramides, qui n'est pas affectée par ces deux peptides .
Sur la base de la spécificité des inhibiteurs utilisés, la caspase initiatrice impliquée ne semble pas être la caspase-8, z-IETD-fmk n'ayant pas eu d'effet sur 1' apoptose. La caspase-10, inhibée par z-AEVD-fmk, semble par contre impliquée, ce peptide inhibant totalement 1 ' apotose des péricytes induite par les AGE. D'autre part, z-VDVAD-fmk inhibe partiellement 1 ' apoptose suggérant que la caspase-2 initiatrice serait elle aussi impliquée. En résumé, ces travaux ont tout particulièrement mis en évidence que les caspase-2 ou 10 peuvent être impliquées, comme caspases initiatrices, dans la cascade menant à 1 ' apoptose des péricytes induite par les AGE, et que la caspase-9 et la caspase-3 effectrices semblent être impliquées dans la phase finale de cette apoptose.
En conséquence, l'invention se rapporte tout spécialement à l'utilisation d'un inhibiteur de caspase pour la préparation d'un médicament protégeant les péricytes rétiniens de l' apoptose utile pour le traitement et/ou la prévention de la rétinopathie chez un patient diabétique . De tels inhibiteurs sont de préférence de type peptidique. Il s'agit avantageusement de peptides modifiés chimiquement par un groupement benzyleoxycarbonyle du côté N-terminal (z) et par un groupe (0-méthyle) -fluorométhyle cétone (fmk) du côté C-terminal les rendant plus perméants aux cellules. A titre d'exemple de peptide inhibiteur de caspase ont peut citer le tripeptide z-VAD-fmk, un inhibiteur de toutes les caspases.
L'invention envisage tout particulièrement l'utilisation d'un inhibiteur d'une caspase initiatrice, de préférence choisie parmi les caspases 2 ou 10 et/ou d'un inhibiteur d'une caspase effectrice, de préférence choisie parmi les caspases 3, 6, 7 ou 9 tout préférentiellement des caspases 3 ou 9, pour la préparation d'un médicament utile pour prévenir ou traiter la rétinopathie diabétique. A titre d'exemple d'inhibiteur de la caspase initiatrice 10, on peut citer le peptide z-AEVD-fmk.
A titre d'exemple d'un inhibiteur de la caspase initiatrice 2, on peut citer le peptide z-VDVAD-fmk.
A titre d'exemple d'un inhibiteur de la caspase effectrice 9, on peut citer le peptide z-LEHD-fmk.
A titre d'exemple d'inhibiteur de la caspase effectrice 3, on peut citer le peptide z-DEVD-fmk.
L'invention envisage tout particulièrement l'utilisation d'une association d'au moins deux inhibiteurs de l' apoptose des péricytes rétiniens cités précédemment pour la préparation d'un médicament utile pour le traitement ou la prévention de la rétinopathie diabétique. Ainsi, une forme de mise en œuvre préférée de l'invention consiste à administrer conjointement à un patient une quantité efficace d'au moins deux composés choisis parmi :
- un composé anti-oxydant , un inhibiteur de la phosphatidylcholine- phospholipase C (PC-PLC) ,
- un inhibiteur d'une sphingomyelinase acide,
- un inhibiteur de caspase. L'administration desdits inhibiteurs de
1' apoptose des péricytes rétiniens peut être simultanée ou non. En conséquence, l'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agents actifs au moins un inhibiteur de 1 ' apoptose de péricytes rétiniens décrits précédemment.
Ainsi, l'invention concerne plus particulièrement une composition comprenant à titre d'agent (s) actif (s) au moins un composé choisi parmi : un anti-oxydant , un composé inhibiteur de la production des ceramides et/ou des DAG, un inhibiteur de la sphingomyelinase acide, un inhibiteur de la phosphatidylcholine-phospholipase C, un inhibiteur de caspase, comme définis précédemment, ou d'un mélange d'au moins deux de ceux-ci. En effet, une telle composition est particulièrement utile pour prévenir ou traiter la rétinopathie diabétique. On peut citer à titre d'exemple préféré d'une telle composition, celles comprenant à titre d'agents actifs, un antioxydant et/ou un inhibiteur de la phosphatidylcholine-phospholipase C (PC-PLC) et/ou un inhibiteur de la sphingomyelinase acide, associé (s) dans ladite composition avec au moins un inhibiteur de caspase comme défini précédemment.
La composition selon l'invention peut accepter toute forme d'administration connue de l'homme du métier, par voie générale (p.o.), par injection sous-cutanée (s.c.) intra-péritonéale (i.p.) ou intra-veineuse (i.v.), dans une formulation adaptée dont le dosage en agent (s) actif (s) permet une administration journalières comprise préférentiellement entre environ 0,01 et environ 200 mg/kg de masse corporelle, préférentiellement entre 0,5 et environ 75 mg/kg de masse corporelle et idéalement entre environ 1 et 50 mg/kg de masse corporelle, mais pas limitées à celles-ci et pouvant aller plus haut en cas d'un composé peu toxique et peu actif in vi vo . Pour l'administration autre qu'oculaire, la quantité de composé actif qui sera combinée à l'excipient pour l'administration en dose unique dans une composition ne comprenant qu'un composé actif défini précédemment, peut varier et dépend du mode d'administration. Une préparation typique contiendra de 5% environ à 95% de composé actif (w/w) . Les préparations contiendront, de préférence, de 20% à 80% (w/w) environ de composé actif.
Dans le cas d'une composition selon l'invention comprenant au moins deux composés actifs définis précédemment, chacun d'eux est présent à des doses allant d'environ 10% à 80% des doses normalement administrées dans un régime de monothérapie comme décrit ci-dessus. Lors de l'amélioration de la condition d'un patient, une dose d'entretien d'un composé, d'une composition ou d'une combinaison concernée par cette invention peut être administrée, si nécessaire. De même, la dose ou la fréquence d'administration peut être réduite en fonction des symptômes, et si ceux-ci sont circonscrits à un niveau désiré, le traitement pourrait être interrompu. De la même manière, certains patients pourraient requérir un traitement intermittent sur le long- terme jusqu'à la récurrence de l'un ou l'autre symptôme de la rétinopathie.
Les formulations pour voie générale peuvent être très variées, comprimés, gélules, poudres, solutions, comprenant le (s) agent (s) actif (s), les excipients, masqueurs de goût, tampons, agents conservateurs, connus de l'homme du métier et pharmaceutiquement acceptables. Les formes injectables comprennent le (s) principe (s) actif (s) dans un solvant de préférence aqueux, éventuellement avec un co-solvant pouvant abaisser la constante diélectrique du milieu, contenant un couple de sels qui tamponne le pH à des valeurs proches des valeurs physiologiques (pH 7,0 -7,4) connus de l'homme du métier, et éventuellement un agent tensio-actif augmentant la solubilité du (des) principe (s) actif (s).
Une forme d'administration toute préférée selon l'invention, consiste en une application topique ou une injection oculaire. Cette forme d'application permet de limiter les effets systémiques généraux négatifs que pourrait engendrer l'usage prolongé d'inhibiteurs de caspases administrés par voie générale. Une composition pharmaceutique pour une application topique oculaire selon l'invention peut être formulée dans un onguent (pommade, gel ou solution) convenable contenant le (les) composé (s) actif (s), dissous ou en suspension dans un véhicule.
Ainsi, à titre d'exemple, il peut s'agir de gouttes oculaires, dont les véhicules pharmaceutiquement acceptables peuvent être du chlorure de sodium isotonique (0,9%, 308 mOsm/L) ou des solutions salines isotoniques comprenant du chlorure de sodium, du chlorure de potassium, du gluconate de potassium, du chlorure de calcium, de l'acide borique, du borate ou borax de sodium, du lactate de sodium, de 1 ' hydrogénophosphate de sodium dihydraté et du dihydrogénophosphate de sodium dodécahydraté , du sorbitol, avec ou sans agents mimant la viscosité lacrymale tels que de 1 ' hypromellose 4000 cP, du dextran, et des agents conservateurs comme de 1 ' édetate de sodium, du bromure de benzododëcinium, du mercurothiolate sodique, du chlorure de benzalkonium, du parahydroxybenzoate de méthyle, du métabisulfite de sodium, du borate de phénylmercure . Ces composés sont donnés à titre d'exemples non limitatifs de réalisation de l'invention. Dans le cas d'une pommade ou d'un gel ophtalmique, des polymères variés peuvent être utilisés, comme par exemple, le carbomère 980 NF (polymère de 4.106 Da) , le sorbitol, une huile par exemple de paraffine, le monostéarate de sorbitan, le polysorbate 60, la cire de cëtyl esters, la cire de cetéaryl esters, la vaseline, le méthylcellulose, une graisse. D'autres principes émulsifiants connus de l'homme du métier peuvent rentrer dans ces compositions.
Une telle composition selon l'invention comprend par exemple entre 0,01 et 10% et de préférence entre 0,01 et 4% en poids desdits inhibiteurs, afin de limiter tout risque de réactions indésirables à long terme, et un passage systémique trop important pouvant mener à l'arrêt du traitement topique. Une administration typique selon l'invention est une administration dans le cul-de-sac conjonctival, par exemple une fois et jusqu'à quatre fois par jour, avec une préférence pour une ou deux applications journalières .
Un système d'administration de drogues de type Ocusert (Friederich, 1974), formé d'un réservoir de forme ellipsoïdale en gel de polyacrylate, butylcyanoacrylate ou pluronique F127 (Desai et Blanchard, 1998) ou encore de fibrine ou collagêne (Rubin et al, 1973) , par exemple, contenant un ou plusieurs des composés définis précédemment, maintenu entre deux couches de copolymères (méthylcellulose 15 cP ou hydroxypropylcellulose 80-120 cP (Desai et Blanchard, 1998)), contrôlant l'administration du ou desdits composés dans le temps, et placé dans le cul-de- sac conjonctival, fait aussi partie de la présente invention. Un morceau d'épongé de 5x2 ou 7x4 mm (Altomed™, mais aussi Week™ ou Merocel™) imbibé par la solution contenant les composés actifs et placé pendant quelques minutes dans le cul-de-sac conjonctival peut aussi être envisagé pour l'application topique des produits (Wilkins et al, 2000) .
Les compositions selon l'invention peuvent être aussi formulées dans des émulsions, où les composés définis précédemment sont encapsulés dans des goutelettes de l'ordre du micron (liposomes) , par exemple dans de l'huile ou de la lécithine de soja, la gélatine (Vandervoort et Ludwig, 1999) , la viscosité de la préparation peut être augmentée par l'addition de méthylcellulose ou de carmellose de sodium (Zurowska-Pryczkowska, 1999) . Les composés peuvent aussi être encapsulé dans des hydroxypropyl-β-cyclodextrines (solution à 5%, par exemple) de concentration variable mais pouvant aller aussi bas qu'un rapport molaire de un pour un par rapport au(x) principe(s) actif (s) , ce qui augmenterait leur(s) biodisponibilité (s) , leur(s) stabilité (s) , et leur(s) solubilité (s) (Freedman et al, 1993) .
L'invention concerne aussi l'utilisation d' oligonucléotides antisens complémentaires d'une partie d'une séquence polynucléotidique choisie parmi celle codant pour une caspase, la phosphatidyleholine-phospholipase C, la sphingomyelinase acide pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention de la rétinopathie diabétique. En effet, les ol igodéoxynucléot ide s phosphorothioates antisens offrent l'opportunité de moduler l'expression génique de gènes spécifiques et sont porteurs d'un potentiel énorme pour une application clinique. Différents oligoméres antisens de tailles différentes, entre 6 et 25 nucléotides de longueur, dirigés contre la caspase 2, 3, 9 ou 10 ou contre la PC-PLC, ou encore contre la sphingomyelinase acide sont synthétisés et utilisés seuls ou en combinaisons. Ces oligonucléotides antisens sont définis dans les séquences des caspases proches du N- ou C-terminus de ces enzymes, pour éviter les réactions croisées et être le plus spécifique possible. Les oligonucléotides de PC-PLC sont définis soit dans la partie C-terminale ou dans la partie N-terminale, proche d'histidines conservées dans le site actif, telles que H69 et H118 de la protéine de Listeria monocytogenes (Zuckert WR et al, 1998) .
Des oligonucléotides de sphingomyelinase acide sont définis dans la partie N-terminale ou C-terminale de l'enzyme humaine (Schuchman et al., 1991) pour être le plus spécifique possible et éviter les réactions croisées.
Les oligonucléotides sont mélangés à une concentration comprise entre 1 et 10 μM en présence d'un copolymère de polyoxyéthylène-polyspermine ou de microsphères de fibrinogene (Oganesian et al, 1999) , sur un morceau de membrane de polytétrafluoroéthylène. (PTFE)
(Karesh, 1987) ou de polyuréthane (Nuyts et al, 1999) , et ce patch peut alors être appliqué à l'intérieur de l'œil, dans la cavité vitréenne et dans l'espace situé sous la rétine par une technique microchirurgicale du pars plana (l'espace de 2 mm situé à 4-5 mm latéralement de la jonction cornéo-sclérale) (Algvere et al, 1999) et éventuellement maintenu en place à l'aide d'une colle ciment à base de N-butylcyanoacrylate (Nexacryl™) (Leahey et al, 1993), afin de permettre une diffusion contrôlée lente et étalée dans le temps de ces inhibiteurs.
Les oligonucléotides antisens peuvent être aussi injectés tels quels, ou encore encapsulés dans des liposomes, après émulsion avec différentes graisses ou huiles, qui sont ensuite recouverts de l'enveloppe virale du virus hémaglutinant du Japon inactivé (virus de Sendai) après fusion, et ensuite injecté dans l'espace sous rétinien par le pars plana (Hangai et al, 1998) . Les doses injectées, pour être actives, se situent avantageusement dans une fourchette comprise entre 10 et 200 μg par œil (Leeds et al, 1998) .
L'invention envisage également la mise en œuvre d'une stratégie de gène antisens pour les caspases-2, 3, 9 ou 10 dans une méthode de traitement et/ou de prévention de la rétinopathie diabétique. En effet, les gènes antisens de ces caspases sont introduits dans un adénovirus, comme indiqué ci-dessous, qui est injecté dans l'espace sous rétinien, après injection par le pars plana comme décrit ci-dessus (Lai et al, 2000) .
L'invention envisage encore l'utilisation de peptides cycliques ou linéaires, de deux ou trois acides aminés à cinq ou six, inhibiteurs compétitifs des caspases, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention de la rétinopathie diabétique.
Il s'agit par exemple de peptides tels que, VAD, inhibiteur général de caspases, DEVD, inhibiteur spécifique de caspase 3, AEVD, inhibiteur spécifique de caspase 10, VDVAD, inhibiteur spécifique de caspase 2, ou LEHD, inhibiteur spécifique de caspase-9. Ces peptides linéaires sont protégés chimiquement du côté N-terminal par un dérivé d'un groupement acétyle ou benzyle, tel que mais pas limité à un groupement benzyleoxycarbonyle (z ou BOC) , et du côté C-terminal par un groupement méthyl cétone, tel que mais pas limité à un groupement fluoro- ou chloro- méthylcétone ou encore à un groupement 2,6 diméthyl ou dichloro benzoyloxyméthylcétone, et dont les chaînes latérales d'acides aminés acides aspartiques (D) sont O- méthylées. Ces peptides peuvent aussi être couplés à des peptides de 16 acides aminés provenant de la séquence hydrophobe du peptide signal du facteur de croissance des fibroblastes (FGF) de Kaposi, améliorant leur perméabilité aux cellules (NH2-AAVALLPAVLLALLAP-COOH) . Des dérivés de 1 ' aspartate seul, protégé par un groupement benzyle et un groupement fluorométhyl cétone sont aussi envisageables dans cette invention. Ces peptides pouvant être administrés par injection, par voie s.c., i.p. ou i.v., ou en application topique dans le cul-de-sac conjonctival, préférentiellement par voie i.v. ou topique, et dans une formulation qui permette une infusion lente et contrôlée pour réduire la fréquence des injections dans le cadre d'un traitement préventif. De telles solutions existent et sont constituées de préparations de polymères biodégradables contenant le peptide et contrôlant sa diffusion, tel que, mais pas limité à, un poly (DL-lactide-co-glycolide) (PLGA) , injectable sous forme (a) soit de microsphères ayant approximativement de 1 à 100 μm de diamètre, ou (b) un implant unique, cylindrique, de taille approximative entre 0,8 mm et 1,5 mm de diamètre, appelé un "minicylindre" (Zhu et al, 2000) . La stabilisation des peptides incorporés en présence d'un anti-acide tel que Mg(0H)2 lors de 1 ' encapsulation dans le polymère est aussi envisagée dans le cadre de la présente invention. (Zhu et al, 2000) .
L'invention concerne aussi l'utilisation d'une molécule d'acide nucléique comprenant au moins une séquence polynucléotidique codant pour un peptide de 2 à 10 acides aminés inhibiteur compétitif d'une caspase pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention de la rétinopathie diabétique.
En effet, l'invention envisage également une méthode de traitement et/ou de prévention de la rétinopathie diabétique consistant à produire localement et en continu au niveau intravitréen et sub-rétinien, in situ, ces petits peptides. Il s'agit alors avantageusement d'une stratégie d'expression génique de ces petits peptides inhibiteurs de caspases, dans le cadre d'un protocole de thérapie génique avec les vecteurs couramment utilisés lors d'une telle approche. Par exemple, les oligoméres de désoxyribonucléotides correspondant aux séquences peptidiques de VAD, DEVD, VDVAD ou AEVD, peuvent être synthétisés par des machines automatiques accessibles à l'homme de l'art. Dans le cas de AEVD, il s'agirait de produire deux oligomères complémentaires de séquences suivantes, l' oligomère codant, 5' - G A T C C (G ou A) (T, C, A ou G) (T, C, A ou G) A T G G C (T, C, A ou G) G A (A ou G) G T (T, C, A ou G) G A (T ou C) T A A G -3 ' et le non-codant 5' - A A T T C T T A (A ou G) T C (T, C, A ou G)
A C (T ou C) T C (T, C, A ou G) G C C A T (T, C, A ou G)
(T, C, A ou G) G -3'. Les deux oligomères une fois synthétisés sont ensuite phosphorylés par la kinase du bacteriophage T , et hybrides, pour obtenir la séquence d'ADN double brin correspondante à la séquence peptidique AEVD, qui peut être alors clonée dans le site polylinker contenant les sites de coupures d'enzymes de restriction adéquats (BamHI et EcoRI, dans le cas décrit) d'un vecteur d'expression de type pAC, qui peut alors produire des adénovirus recombinants exprimant le petit peptide désiré par la stratégie suivante. Le vecteur pACCMVpLpA est produit par insertion du promoteur/enhancer de gènes précoces constitutif du cytomégalovirus (CMV) , le polylinker (pL) de sites de restriction du vecteur pUC 18, et un fragment du génome du virus simien SV 40 qui inclus l'antigène petit - T (t) et le signal de polyadénylation (pA) , dans le vecteur pAC (Gluzman et al, 1982). L 'ADN double brin correspondant à la séquence AEVD est alors introduite dans le vecteur linéarisé avec les enzymes de restriction correspondant aux sites de restriction flanquant la séquence AEVD, dans l'exemple décrit BamHI et Eco RI . Le plasmide correspondant est ensuite produit par des techniques classiques de clonage bactérien, et l'insertion vérifiée par séquençage en utilisant la séquence flanquante du polylinker. Le plasmide résultant est ensuite co-transfecté avec pJM17 (McGrory et al, 1988) dans des cellules 293 (cellules embryonnaires rénales humaines transfectées par l' adénovirus AdEA) (Graham et al., 1977) par coprécipitation d'ADN avec le phosphate de calcium. pJM17 code pour un adénovirus 5 de séquence génomique complète interrompu par un plasmide bactérien pBRX à la position 3.7 unité de la carte génétique de 1' adénovirus, excédant donc les limites d'empaquetage pour 1 ' adénovirus . La recombinaison homologue entre le plasmide recombinant pACCMVpLpA et pJM17 dans les cellules 293 génère un génome de taille empaquetable, dans lequel la région précoce 1 est remplacée par le gène chimérique clone, rendant le virus recombinant défectif pour la réplication. Le virus résultant est nommé AdCMV-AEVD. La présence de l'insertion correspondant au peptide AEVD est confirmée par PCR en utilisant des primers flanquant la séquence AEVD et en séquençant le produit de PCR obtenu. Les plaques virales appropriées sont alors amplifiées en stocks contenant 5-50 x 107 plaque forming unit (pfu) /ml et stockées dans le DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal. L' adénovirus recombinant peut alors être utilisé et encapsulé, par une des techniques décrites ci- dessus et injecté par le pars-plana dans l'espace subrétinien dans la cavité intravitréenne, afin d'avoir in si t u une production soutenue et étalée dans le temps d'inhibiteurs de caspases, permettant de prévenir la perte des péricytes par apoptose. L'invention se rapporte enfin à une méthode d' identification de composés capables de prévenir ou traiter la rétinopathie diabétique, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'une culture de péricytes traités par des AGE avec un composé à tester et en ce que l'on évalue l' apoptose dans lesdits përycites pour déterminer la capacité dudit composé à prévenir ou traiter la rétinopathie diabétique. Avantageusement, cette évaluation comprend la comparaison avec l'apotose d'une culture de péricytes non traités par ledit composé et/ou non traités par des AGE.
Le composé testé est choisi parmi ceux envisagés précédement et notamment dans le groupe comprenant : les anti-oxydants , les inhibiteurs de la production des ceramides et/ou des DAG, les inhibiteurs de caspase, les oligonucléotide antisens, de 6 à 25 nucléotides, complémentaire d'une partie d'une séquence polynucléotidique choisie parmi celle codant pour une caspase, la phosphatidylcholine-phospholipase C, la sphingomyelinase acide, les molécules d'acide nucléique comprenant au moins une séquence polynucléotidique codant pour un peptide, de 2 à 10 acides aminés, inhibiteur compétitif d'une caspase.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront de la description qui suit rapportant :
1) Les effets des AGE-méthylglyoxal sur les péricytes rétiniens de bœuf.
2) L'induction d'un stress oxydant par les AGE- méthylglyoxal dans les péricytes rétiniens en culture. 3) Les voies de production des ceramides et des DAG activées dans les péricytes rétiniens en réponse aux AGE-méthylglyoxal .
4) L'implication des caspases. II sera fait référence dans ce qui suite aux dessins en annexe dans lesquels :
La figure 1 représente le schéma d'un capillaire rétinien.
La figure 2 représente la voie de Maillard. La figure 3 représente le marquage au 3P des ceramides et des DAG.
La figure 4 représente l'effet des AGE- méthylglyoxal sur 1 ' apoptose des péricytes rétiniens de bœuf . La figure 5 représente l'effet des AGE- méthylglyoxal sur la production de ceramides et de DAG dans les péricytes rétiniens de bœuf.
La figure 6 représente l'effet de la Nα-acétyl-
L-Cystéine sur 1 ' apoptose induite des BRP par les AGE- méthylglyoxal.
La figure 7 représente l'effet de la Nα-acétyl-
L-Cystéine sur la production de ceramides et de DAG dans les BRP induite par les AGE-méthylglyoxal .
La figure 8 représente les effets de divers antioxydants sur 1 ' apoptose des péricytes en réponse aux
AGE-méthylglyoxal .
La figure 9 représente l'effet de la fumonisine
Bl sur l' apoptose des péricytes induite par les AGE- méthylglyoxal . La figure 10 représente l'effet de la désipramine sur 1 ' apoptose des péricytes induite par les
AGE-méthylglyoxal . La figure 11 représente l'effet de la désipramine sur la production stimulée de ceramides et de DAG dans les BRP induites par les AGE-méthylglyoxal .
La figure 12 représente la voie de production des ceramides et des DAG dans les péricytes envisagée sur la base de l'invention.
La figure 13 représente l'effet du D609 sur 1 ' apoptose des péricytes induite par les AGE-méthylglyoxal après deux passages . La figure 14 représente l'effet du D609 sur la production stimulée de ceramides et de DAG dans les BRP induites par les AGE-méthylglyoxal.
La figure 15 représente la voie de signalisation menant à 1 ' apoptose des péricytes envisagée sur la base de l'invention.
La figure 16 représente l'effet des peptides inhibiteurs de caspases sur l' apoptose des péricytes induite par les AGE-méthylglyoxal.
La figure 17 représente l'effet des peptides inhibiteurs de caspases z-VAD-FMK, z-LEHD-fmk et z-DEVD-FMK (50 μM) sur la production stimulée de ceramides et de DAG dans les BRP induites par les AGE-méthylglyoxal.
La figure 18 représente la voie de signalisation menant à 1 ' apoptose des péricytes envisagée sur la base de l'invention.
La figure 19 est un wester blot avec un anticorps anti-caspase 10 humaine sur des lysats cellulaires de péricytes traités ou non avec AGE.
PARTIE A : MATERIEL ET METHODES.
I - Matériel .
1) Réactifs. Tous les produits pour la culture cellulaire proviennent de Sigma (France) sauf le SVF (Gibco, France) , la collagénase IA et la collagénase/dispase (Boehringer- Mannheim, France) . Tous les autres réactifs sont purs « pour analyse » et ont été achetés chez Sigma (France) , sauf les plaques de silice (silica gel 60 G, Merck) , la DAG kinase et les ceramides (Tebu, France) . Les colonnes PD-10 proviennent de Pharmacia (Suède) . Le kit de marquage à l'annexine-V provient de Boehringer-Mannheim (France) . La N-acétyl-L-cystêine, la désipramine, l'acide lipoïque et l'ebselen proviennent de Sigma (France) . Les peptides inhibiteurs de caspases proviennent de Calbiochem (France) , la fumonisine Bl et le D609 proviennent de Biomol (France) .
Préparation des solutions d'agents pharmacoloqiques :
Les solutions sont stérilisées au moyen d'un filtre acrodisc stérile 0,2 μm (Gellman Science).
La solution mère de 1 μM de N-acëtyl-L-cystéine est préparée extemporanement : 163,2 mg sont repris dans 1 ml de DMEM puis la solution est filtrée stérilement.
Une solution mère de coelentéramine à 1,2 mM dans 1 ' éthanol est préparée extemporanement et ajoutée aux cellules à la concentration finale de 2 μM.
La zéaxanthine est dissoute dans du DMSO stérile à la concentration de 1,2 mM et ajoutée aux cellules à la concentration de 2 μM.
Une solution stock de 10 mM d'ebselen est préparée à partir de 2,74 g de produit repris dans 1 ml d'ethanol puis la solution est aliquotee et conservée à -20°C.
La solution mère de 100 mM de désipramine est préparée extemporanement : 30,3 mg sont repris dans 1 ml d'eau distillée puis la solution est filtrée stérilement. Une solution mère de 1 mM de fumonisine Bl est préparée à partir de 1 mg repris dans 1378 μl d'eau distillée puis la solution est stérilisée, aliquotee, congelée à -180°C et conservée à -20°C. La solution mère de 9,4 mM de D609 est préparée extemporanement : 1 mg de D609 est repris dans 400 μl d'eau distillée puis la solution est filtrée stérilement.
Une solution stock de 30 mM du peptide z-VAD- FMK, z-DEVD- fmk, z-AEVD- fmk, z-VDVAD- fmk, z-IETD- fmk et z-LEHD-fmk est préparée à partir de 1 mg de produit stérile repris dans respectivement 70, 50, 54, 45, 51 et 42 μl de DMSO stérile. La solution de chaque inhibiteur est aliquotee en volumes adéquats, puis congelée à -20°C. 2) Appareils . Les dosages spectrophotométriques ont été réalisés grâce au lecteur de plaque 96 puits iEMS Reader MF
(Labsystems) . Le fluorimètre (type LS 50B) provient de
Perkin-Elmer . L'appareil à sonication (modèle B 15) provient de Branson. La détection de l' apoptose a été réalisée sous un microscope à fluorescence Axioplan de Cari Zeiss avec un filtre Zeiss IV, n° 9 (excitation : 450-490 nm ; émission >520 nm) .
II - Méthodes .
1 ) Culture des cellules microvasculaires rétiniennes bovines (Lecomte et al, 1996) .
Les yeux de bœufs, fraîchement énucléés, sont transportés de l'abattoir sur de la glace, immédiatement débarrassés des tissus extraoculaires et placés dans du tampon PBS . Toutes les manipulations sont ensuite effectuées de façon stérile, sous hotte à flux laminaire. Deux yeux sont nécessaires pour chaque boîte de cellules à ensemencer. Les yeux sont plongés brièvement dans de 1 ' éthanol à 70% puis rincés dans du milieu HBSS (sans Ca2+ ni Mg2+) . Ils sont disséqués 5 mm postérieur à la cornée, la chambre antérieure de l'œil avec le cristallin, ainsi que le vitré contenu dans le globe oculaire, sont enlevés. La rétine neuronale est décollée du globe oculaire, coupée au niveau du nerf optique et placée dans du tampon HBSS à 4°C. Ce tampon est préparé à partir de HBSS sans Mg2+ ni Ca2+ contenant 10 mM d'HEPES à pH 7,4, 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine. Après 10 min d'oxygénation
(95% d'02 ; 5% de C02) , de la BSA à 22% est ajoutée jusqu'à une concentration finale de 0,5% ; le pH est alors ajusté à
7,4 avec quelques gouttes de NaOH (en suivant le virage de l'indicateur rouge phénol) . Les cellules pigmentaires contaminantes sont éliminées et les rétines, par lot de deux, sont placées dans 10 ml de tampon HBSS propre sur de la glace. Les rétines sont émincées avec des ciseaux
(morceaux d'environ 2 mm), homogénéisées (Dounce 15 ml, piston A) avant d'être centrifugées (300 g, 5 min, 4°C) . Culture des péricytes (BRP) :
Deux rétines de bœuf sont utilisées pour chaque boîte (6 cm de diamètre) à ensemencer. Chaque lot de deux rétines est traité et homogénéisé comme décrit précédemment dans 10 ml de tampon HBSS à 4°C. L'homogenat est centrifugé (300 g, 5 min, 4°C) et le culot est resuspendu dans 5 ml d'une solution enzymatique de collagénase/dispase . Cette solution de collagénase/dispase (1 mg/ml) préparée dans du milieu HBSS sans Mg2+ ni Ca2+ contenant 10 mM d'HEPES à pH 7,4, 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine, est ensuite oxygénée pendant 10 min et le pH est ajusté à 7,4 avant addition de TLCK (147 ng/ml) et de DNase (200 U/ml) . La digestion est poursuivie pendant 20 min à 37°C et le culot cellulaire est resuspendu à la main à la mi- incubation. La suspension est alors filtrée sur un filtre nylon de mailles de 70 μm, stérile. Les fragments de microvaisseaux contenus sur le filtre sont récupérés dans du tampon HBSS (le filtre est rincé deux fois) , centrifugés (300 g, 5 min, 4°C) et lavés une fois dans le même tampon. Après centrifugation (300 g, 5 min, 4°C) , les fragments de microvaisseaux sont resuspendus dans 3 ml de DMEM contenant 10% de SVF, 2 mM de glutamine et les antibiotiques. Les fragments de microvaisseaux sont ensemencés dans une boîte de Pétri (6 cm de diamètre) enduite avec 100 μg de fibronectine (4 μg/cm2) dans 2 ml de DMEM pendant 3-4 heures à 37°C (Su & Gillies, 1992) . Après avoir laissé les microvaisseaux s'attacher pendant 3 heures à 37°C, le milieu et les débris qui n'ont pas adhéré à la matrice sont éliminés et 3 ml du milieu de culture sont ajoutés. Ce milieu est constitué par du DMEM avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 80 μg/ml d'héparine, la glutamine et les antibiotiques. Les cellules sont maintenues dans un incubateur à 37°C, sous une atmosphère d'air humidifiée contenant 5% de CO2. Le milieu de culture est renouvelé au bout de 24 heures puis toutes les 48 heures jusqu'à ce qu'elles atteignent la confluence.
A confluence, le milieu de culture est éliminé et les cellules sont trypsinées avec 1 ml d'une solution à 0,5% de trypsine et 0,2% d'EDTA jusqu'à ce que les cellules s'arrondissent (environ 5 minutes) après examen au microscope à contraste de phase. La trypsine est alors inactivée avec 2 ml de milieu de culture contenant du sérum et les cellules sont récupérées puis centrifugées (180 g, 3 min, 4°C) . Les cellules, sous-cultivées dans un rapport 1:3, sont ensemencées dans trois boîtes (6 cm de diamètre) recouvertes de fibronectine et cultivées dans le même milieu. 2 ) Culture des péricytes en présence de produits avancés de glycation (AGE) .
Les effets des AGE sont testés sur un même lot de cellules (BRP issus de la même culture primaire) . Lorsqu'ils sont à confluence, les BRP en culture primaire sont trypsinés. Après les avoir laissés s'attacher 4 heures à 37°C, le milieu et les débris cellulaires qui n'ont pas adhéré à la matrice sont éliminés et le milieu de culture (10% de SVF pour les BRP) est ajouté. Afin de tester les effets des AGE, une solution d'AGE (ou son contrôle) est ajoutée au milieu de culture jusqu'à une concentration de 20 μM. Les cultures sont ainsi poursuivies pendant 1 ou 2 passages avec les agents, soit 7 et 15 jours respectivement pour les BRP. Préparation des AGE :
Des "AGE-méthylglyoxal" ont été préparés en incubant 7,2 mg/ml de BSA et 100 mM de méthylglyoxal pendant 50 heures à 37°C (Westwood & Thornalley, 1995) . La BSA-contrôle a été obtenue en incubant de l'albumine dans les mêmes conditions mais sans méthylglyoxal. Les protéines glyquées ont été caractérisées par leur fluorescence (370-
440 nm) , leur fixation à des cellules endothéliales en culture, des phagocytes mononucléaires et le RAGE purifié
(Yan et al . , 1994) . Les différentes préparations ont ensuite été dessalées sur des colonnes PD-10 (2,5 ml des préparations sont filtrés et récupérés dans 3,5 ml de DMEM) .
3) Dosage des protéines par coloration au noir amide sur membrane de nitrocellulose .
Les protéines sont dosées selon la méthode décrite par Schaffner & Weissmann (1973) . Les échantillons à doser contenant les protéines sont complétés à 270 μl avec du PBS avant d'ajouter 30 μl de tampon Tris-HCl (1 M, pH 7,5) contenant 1% de SDS, puis 60 μl d'acide trichloroacétique à 60%. Ces solutions sont "vortexées", laissées 2 min à température ambiante pour la précipitation des protéines et filtrées chacune au niveau d'un repère préalablement noté, sur un filtre de nitrocellulose de 0,45 μm, mouillé au TCA 6%. Une gamme étalon avec 0 à 27 μg de BSA est réalisée parallèlement. Tous les filtres sont ensuite immergés quelques minutes dans une solution de noir amide à 0,1% (w/v, dans méthanol : acide acétique : eau, 45:10:45, v/v/v) . Les filtres sont alors rincés dans un bain d'eau puis dans la solution de décoloration
(méthanol : acide acétique : eau, 90 :2 :8, v/v/v) jusqu'à ce que la membrane soit complètement blanche excepté au niveau des dépôts de protéines. Le filtre est séché, les dépôts sont découpés et le colorant fixé sur les protéines est élue par 1 ml de la solution d' élution (éthanol : eau : NaOH : EDTA, 100 :100 :0,1 :1,9, v/v/w/w) (environ 10 min en "vortexant" régulièrement) . La lecture se fait sur 300 μl de ces solutions (plaque 96 puits) à 620 nm et la quantification est réalisée grâce au logiciel Biolise.
4) Evaluation immunocytochimique de l' apoptose dans les péricytes cultivés en présence d'AGE.
L' apoptose est détectée et quantifiée dans les péricytes cultivés pendant deux passages avec 2 μM d'AGE- méthylglyoxal ou de son contrôle en utilisant la technique de détection des cellules apoptotiques par 1 ' annexine V et nécrotiques par 1 ' iodure de propidium. Coloration à 1 ' annexine V : La présence de phosphatidylsérine (PS) sur le feuillet externe de la membrane plasmique, caractéristique des cellules apoptotiques, peut être détectée grâce à l'annexine-V marquée à la fluorescéine . Cette protéine a en effet une très forte affinité pour la PS. Afin de distinguer les cellules apoptotiques des éventuelles cellules nécrotiques qui fixent également 1 ' annexine-V, cette coloration est effectuée en présence d'un agent intercalant et colorant de l'ADN, 1 ' iodure de propidium, similaire au bromure d'éthydium. Pour ce marquage, les péricytes doivent être sous-confluents (75% de confluence) et n'ont donc été cultivés que 12 jours environ avec les AGE-méthylglyoxal ou BSA-contrôle.
Les BRP (boîte de 3,5 cm de diamètre) sont rincés trois fois avec du PBS puis incubés pendant 10 min dans le noir avec 500 μl d'un tampon HEPES contenant 10 μl de la solution d' annexine-V marquée à la fluorescéine et 10 μl de la solution d' iodure de propidium fournies dans la trousse de dosage. Les cellules apoptotiques ainsi que les cellules nécrotiques ont fixé l' annexine-V et apparaissent donc vertes sous le microscope à fluorescence, mais seul le noyau des cellules nécrotiques est coloré en rouge par 1 ' iodure de propidium. Le pourcentage de cellules nécrotiques et de cellules apoptotiques est déterminé sur 10 champs différents, soit sur 300 à 800 cellules au total.
5) Dosage des ceramides et diacylglycérols (DAG) .
Les ceramides et les diacylglycérols sont mesurés, dans les péricytes cultivés pendant deux passages avec 2 μM d' AGE-méthylglyoxal ou leur contrôle, selon la méthode décrite par Preiss et al . (1986) . Cette méthode est basée sur la phosphorylation des ceramides et des DAG par la diacylglycérol kinase (DAG-kinase) purifiée à partir d' Echerischia coli en présence d'ATP marqué au 32P sur le phosphore γ, selon le schéma représenté à la figure 3 en annexe .
Les péricytes (2 ou 3 boîtes de 6 cm de diamètre) sont rincés, récupérés par grattage au « rubber policeman » dans 0,5 ml d'eau sur glace et la boîte rincée par 0,5 ml supplémentaire (volume de 1 ml de suspension cellulaire) auquel sont ajoutés 10 μl d'une solution de [9, 10-3H] -triacylglycérol à 0,5 μCi/ml.
5.1) Extraction des lipides totaux.
Les lipides totaux sont ensuite extraits par la méthode de Bligh and Dyer (1959) . A cette suspension cellulaire (1 ml de PBS) sont ajoutés 3.75 ml d'un mélange chloroforme : méthanol (2:1, v/v) contenant 80 μl de BHT (5 mM) en solution dans 1 ' éthanol . Les solutions sont ensuite "vortexées" 30 sec et maintenues au repos 30 min minimum, puis 1,25 ml de NaCl (0.9%) et 1,25 ml de chloroforme sont ajoutés pour séparer les phases. Après centrifugation (700 g, 5 min) , la phase organique inférieure est prélevée et l'extraction de la phase aqueuse est répétée deux fois avec 1,5 ml de chloroforme. Les extraits lipidiques sont alors rassemblés et le chloroforme est évaporé sous courant d'azote. La phase aqueuse permet de doser les protéines totales par coloration au noir amide et la phase organique, est récupérée dans un tube Eppendorff puis évaporée sous azote .
5.2) Phosphorylation à la DAG kinase.
Une gamme étalon de ceramides (25 à 2500 ng) et de DAG (25 à 25000 ng) contenant la même quantité de triacylglycérol marqué au tritium est réalisée en parallèle. Les lipides sont ensuite solubilisés dans 20 μl d'une solution de détergents (7,5% de n- octylglucopyranoside, 5 mM de cardiolipine et 1 mM de DETAPAC) par 1 min de "sonication" suivie d'une incubation de 15 min à température ambiante. La réaction est démarrée par l'ajout de 50 μl du tampon de réaction (imidazole 100 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 25 mM, EGTA 2 mM, pH 6,6), 20 μl d'une solution de DAG-kinase (4,86 mU) contenant 10 mM de DTT, et 10 μl de [γ-32P] ATP à 5 mCi/ml dilué 10 fois dans une solution contenant 10 mM d'ATP non marqué, 100 mM d'imidazole et 1 mM DETAPAC (pH 6,6). La réaction est poursuivie pendant 1 heure à température ambiante puis arrêtée par 1 ml du mélange chloroforme : méthanol : acide chlorhydrique IN (100 :100 :1, v/v/v), 170 μl d'un tampon contenant 10 mM d'HEPES, 135 mM de NaCl, 1,5 mM de CaCl2 , 0,5 mM de MgCl2 et 5,6 mM de glucose (pH 7,4) puis 30 μl d'EDTA 100 mM. Le mélange est alors "vortexé", laissé 15 min à température ambiante puis centrifugé (10 000 g, 5 min) à température ambiante.
La phase organique (inférieure) est prélevée et évaporée sous azote. Les lipides sont alors repris par 300 μl du mélange éther : méthanol (9:1, v/v) et déposés sur une plaque de silice. Les céramides-1-phosphate sont séparés de l'acide phosphatidique et des triacylglycérols en utilisant le mélange chloroforme : méthanol : acide acétique (65 : 15 :5, v/v/v) comme solvant de migration.
L'exposition de la plaque de silice à un film autoradiographique (30 min, -80°C) permet de visualiser les différents lipides marqués au 32P. Les taches correspondant aux ceramides-1-phosphate et à l'acide phosphatidique ainsi que les 3 derniers cm avant le front de migration (correspondant aux triacylglycérols) sont délimités au crayon à mine graphite et grattés. La silice est récupérée dans des pots de comptage, humidifiée par 200 μl de méthanol, 200 μl d'eau distillée et 2 ml de liquide de scintillation (Picofluor) pendant 2 heures avant de rajouter 8 ml du liquide de scintillation. La radioactivité émise par le 32P ou le 3H est ensuite comptée dans chaque pot. La radioactivité émise par la solution mère de [9,10- 3H] -triacylglycérol est également comptée, ce qui permet de calculer le rendement de la réaction pour chaque échantillon. Les quantités de ceramides et diacylglycérols présentes dans chaque échantillon sont alors déterminées après extrapolation à partir de la gamme-étalon, en tenant compte du rendement, et rapportées à la quantité de protéines totales.
PARTIE B : RÉSULTATS.
I - EFFETS DES AGE-METHYLGLYOXAL SUR LES PERICYTES RETINIENS DE BŒUF.
Lors de travaux antérieurs in vi tro, l'effet toxique d' AGE-glucose sur la prolifération des péricytes rétiniens a été mise en évidence (Ruggiero-Lopez et al, 1997) .
L'étude s'est plus particulièrement intéressée aux effets des AGE-méthylglyoxal sur les péricytes rétiniens. Le méthylglyoxal semble en effet prendre toute son importance dans le diabète. Il s'agit d'un dicarbonyle dont la concentration sanguine est fortement augmentée chez le diabétique (McLellan et al, 1994) . De plus, les produits avancés de glycation dérivant du méthylglyoxal ont été décrits comme les modifications chimiques majeures observées au cours de maladies chroniques comme le diabète (Degenhardt et al, 1998) .
Les BRP ont été cultivés pendant deux passages (environ 15 jours) en présence des AGE-méthylglyoxal afin de mimer la chronicité d'un environnement diabétique, l'objectif de l'étude étant dans un premier temps de tester si les AGE-méthylglyoxal induisent 1 ' apoptose des péricytes et si ce phénomène est associé à une production accrue de ceramides et de DAG.
1) Apoptose des péricytes en réponse aux AGE- méthylglyoxal . L1 apoptose a été détectée et quantifiée par un marquage à 1 ' annexine V et à 1 ' iodure de propidium dans les BRP cultivés pendant deux passages avec 2 μM d' AGE- méthylglyoxal ou leur contrôle (voir Matériel et Méthodes) . Cette technique met en évidence la translocation de la phosphatidylsérine du feuillet interne vers le feuillet externe de la membrane plasmique, phénomène biochimique caractéristique de la phase précoce de l' apoptose. L ' annexine V, marquée à la fluorescéine, colore en vert les membranes plasmiques des cellules apoptotiques et nécrotiques mais seules les cellules nécrotiques, dont la membrane plasmique a perdu son intégrité, sont perméables à 1 ' iodure de propidium qui colore leur noyau en rouge. La figure 4 rapporte l'effet des AGE-méthylglyoxal sur 1' apoptose des péricytes rétiniens de bœuf. Les cellules ont été cultivées pendant deux passages (15 jours environ) en présence de 2 μM d' AGE-méthylglyoxal ou de BSA-contrôle. Les résultats sont exprimés en % de cellules apoptotiques dans la population cellulaire totale. La proportion des cellules apoptotiques représente 8,9 ± 1,1% (moyenne ± SEM, n=10, p<0,05) du total des péricytes cultivés avec 2 μM d' AGE-méthylglyoxal contre seulement 2,9 ± 0,34% des cellules cultivées avec 2 μM BSA-contrôle. Ainsi les AGE-méthylglyoxal induisent une augmentation environ d'un facteur 3 en moyenne du taux d' apoptose dans les péricytes. Aucune cellule nécrotique n'a été observée.
2) Production de ceramides et de DAG dans les péricytes .
Afin de déterminer si les ceramides et les DAG pouvaient être impliqués dans le signal de transduction menant à l' apoptose, ces deux composés ont été dosés dans les péricytes incubés pendant deux passages (15 jours environ) avec 2 μM d'AGE-méthylglyoxal ou leur contrôle. La technique de dosage employée est basée sur la phosphorylation des ceramides et des DAG par la DAG-kinase en présence d'ATP radioactif (32P) (voir Matériel et Méthodes) . La figure 5 rapporte l'effet des AGE- méthylglyoxal sur la production de ceramides et de DAG dans les péricytes rétiniens de bœuf. Les résultats sont exprimés en % de variation du contrôle cellules cultivées avec BSA contrôle. Une stimulation de la production des ceramides
(+ 85 ± 12%) (moyenne ± SEM, n=10, p<0,05) et des DAG (+ 94 ± 9%) a pu être mise en évidence dans les BRP en réponse aux AGE-méthylglyoxal.
3) Conclusion.
Un marquage à 1 ' annexine V et à 1 ' iodure de propidium des cellules cultivées pendant 15 jours avec 2 μM d' AGE-méthylglyoxal a permis de détecter une augmentation du taux d' apoptose des BRP d'un facteur 3, en moyenne. Ceci suggère que les AGE-méthylglyoxal induisent à long terme 1 ' apoptose des péricytes en culture. La disparition des péricytes rétiniens par apoptose a été décrite in vitro en réponse à des fluctuations abruptes de glucose (Li et al . , 1996) et ex vivo dans la rétine de patients et de rats diabétiques (Mizutani et al., 1996; Li et al . , 1997). L'altération de l'expression de gènes régulateurs de 1 ' apoptose (ARNm de la protéine Bax) a également été mise en évidence dans les péricytes cultivés à long terme avec de fortes concentrations de glucose puis soumis à une réduction rapide en glucose (Li et al . , 1998) et dans les péricytes de rétines de patients diabétiques récupérées post mortem (Podesta et al . , 2000).
En revanche, l'induction de 1 ' apoptose des péricytes rétiniens par des AGE (les AGE-glucose et AGE- méthylglyoxal) n'a jamais été mise en évidence précédemment .
Les travaux réalisés dans le cadre de l'invention ont permis de montrer que 1 ' apoptose des péricytes induite par les AGE-méthylglyoxal est associée à une stimulation de la production de ceramides et de DAG, démontrant ainsi que ces deux composés sont impliqués dans la transduction du signal apoptotique. Les travaux suivants ont consisté à décrire la voie de signalisation menant à 1' apoptose des péricytes en réponse aux AGE-méthylglyoxal.
II - INDUCTION D'UN STRESS OXYDANT PAR LES AGE-
METHYLGLYOXAL DANS LES PERICYTES RETINIENS EN CULTURE.
Des travaux antérieurs ont permis de démontrer une atteinte des capacités antioxydantes des péricytes rétiniens de bœuf, en réponse aux AGE-Glucose (20 μM) . Une augmentation des activités de la catalase et de la Cu/Zn SOD ainsi que la quantité de thiols réduits a été observée dans les péricytes cultivés de façon chronique avec les AGE-Glucose, suggérant une réponse compensatoire des cellules face à une production accrue de radicaux libres et donc à un stress oxydant (Paget et al, 1998) . Une diminution des marqueurs de la peroxydation lipidique, les TBARS et les isoprostanes, a également été observée comme le reflet en miroir d'une stimulation des défenses antioxydantes (Paget et al, 1998).
Afin de vérifier l'implication d'un stress oxydant dans la voie de signalisation menant à l' apoptose, les effets de différentes classes d ' antioxydants sur 1 ' apoptose induite des péricytes et sur la production stimulée des ceramides et des DAG en réponse aux AGE- méthylglyoxal ont été étudiés . 1) Les différents antioxydants testés.
Sur la base de leur structure moléculaire et de leur mode d'action, les antioxydants testés peuvent être classés en 3 groupes. Le premier groupe comprend des composés hydrosolubles possédant une fonction thiol qui a la capacité de fournir un proton : il s'agit de la Nα- acétyl-L-Cystéine (NAC) et de l'acide lipoïque. Ces deux agents présentent un effet protecteur de la balance rédox du cytoplasme de la cellule. Le deuxième type d' antioxydant testé est l'ebselen, une molécule de synthèse contenant un atome de sélénium. Ce composé présente la particularité de mimer l'activité glutathion-peroxydase sélénium dépendante
(Se-GPx) . Il induit ainsi une protection des membranes contre la peroxydation lipidique. Le 3eme groupe est constitué de composés liposolubles riches en doubles liaisons conjuguées qui présentent une haute rëactivité vis-à-vis des radicaux libres et qui protègent ainsi plus spécifiquement les membranes contre la peroxydation lipidique. Il s'agit de la zéaxanthine et de la cœlentëramine .
2) Effets de la N-acétyl-L-Cystéine .
La figure 6 rapporte l'effet de la Nα-acétyl-L-
Cystéine sur 1 ' apoptose (annexine V, voir Matériel et Méthodes) induite des BRP par les AGE-méthylglyoxal. Les péricytes ont été cultivés pendant deux passages (de 12 à 15 jours) en présence de 2 μM AGE-méthylglyoxal (ou de la BSA-contrôle) et de 10 μM ou 50 μM de N-acétyl-L-Cystéine. Les résultats, exprimés en % d'inhibition de 1 ' apoptose induite, sont la moyenne de 5 expériences indépendantes.
Aux deux concentrations testées, la N-acétyl-L- Cystéine protège les péricytes de 1 ' apoptose induite par les AGE-Mêtylglyoxal. Les ceramides et les DAG ont été également dosés dans les BRP cultivés en présence de N-acétyl-L- Cystéine (voir figure 7) . Les ceramides et les DAG ont été dosés comme décrit dans la section Matériel et Méthodes. Les résultats, exprimés en % d'inhibition de production stimulée de ceramides et de DAG, sont la moyenne de 2 expériences indépendantes. L'ajout de 10 μM de N-acétyl-L- Cystéine dans le milieu de culture inhibe totalement la production de ceramides et de DAG induite par les AGE- méthylglyoxal (-100%) . En revanche, un traitement des cellules par 50 μM de N-acétyl-L-Cystéine n'induit qu'une inhibition partielle de cette surproduction (-60% de la surproduction des ceramides et -70% de la surproduction de DAG) . Cet effet partiel peut probablement être expliqué par un effet prooxydant d'un antioxydant employé à une concentration trop élevée.
L'inhibition complète de 1 ' apoptose induite des péricytes cultivés en présence de 10 μM de N-acétyl-L- Cystéine a été associée à une inhibition parallèle totale de la surproduction des ceramides et des DAG, ceci suggère donc que les AGE-méthylglyoxal induisent un stress oxydant situé en amont de la production de ceramides et des DAG ainsi que de l' apoptose des péricytes.
3) Effets de divers antioxydants sur 1 ' apoptose des péricytes en réponse aux AGE-méthylglyoxal.
L'effet protecteur de la Nα-acétyl-L-Cystéine sur la disparition des péricytes en réponse aux AGE- méthylglyoxal a été confirmé en testant différents antioxydants. La figure 8 rapporte les effets des antioxydants sur 1 ' apoptose des péricytes en réponse aux AGE-méthylglyoxal. Les résultats, exprimés en % d'inhibition de 1 'apoptose induite, sont la moyenne de 3 expériences indépendantes sauf pour la cœlentéramine (2 expériences indépendantes) .
L'ajout dans le milieu de culture d'acide lipoïque aux concentrations de 7 μM et de 14 μM inhibe respectivement de 88% et de 75% 1 ' apoptose (annexine V, voir Matériel et Méthodes) des péricytes induite par les AGE. Une incubation des cellules avec 5 μM et 10 μM d'ebselen bloque respectivement à 94% et 88% 1 ' apoptose induite par les AGE-méthylglyoxal. En revanche, un traitement des péricytes avec 2 μM de cœlentéramine et 2 μM de zéaxanthine ne permet qu'une inhibition partielle de 1 ' apoptose induite de 60% et de 50 % respectivement. Cet effet modéré des deux antioxydants liposolubles peut être expliqué par le fait que ces deux agents n'ont pas pu être testés à des concentrations plus élevées: un effet véhicule (le DMSO) a été observé sur l' apoptose des péricytes en réponse aux AGE-méthylglyoxal.
Une incubation des péricytes avec différents antioxydants permet de protéger les cellules de l' apoptose. Ce résultat confirme bien l'induction d'un stress oxydant dans la voie de signalisation de 1 ' apoptose des péricytes induite par les AGE-méthylglyoxal.
III - VOIES DE PRODUCTION DES CERAMIDES ET DES DAG ACTIVEES DANS LES PERICYTES RETINIENS EN REPONSE AUX AGE-METHYLGLYOXAL .
Les travaux réalisés dans le cadre de l'invention ont également consisté à définir les voies métaboliques de production des ceramides et des DAG activées dans les péricytes cultivés avec des AGE- méthylglyoxal .
Il s'agissait notamment de déterminer les différentes voies possibles de production des ceramides. D'une part, les ceramides peuvent être issus de la voie de biosynthèse de novo. Deux intermédiaires métaboliques, la sphingosine et la sphinganine sont acétylës par une sphinganine-acyl-transférase pour former des ceramides. Les ceramides peuvent être également le produit d'hydrolyse enzymatique : ils peuvent être issus d'une part du « pool » de sphingomyélines et d'autre part du « pool » de glycosphingolipides (ceramides liés à une ou plusieurs chaînes glycanniques) (Mathias et al, 1998; Okasaki et al., 1998) .
De même, les voies de production des DAG sont de deux types. Ils peuvent provenir d'une activation de la voie de biosynthèse de novo, ou alors être issus d'hydrolyses enzymatiques : les DAG peuvent être libérés à partir d'un « pool » de phosphatidylinositolbisphosphates ou d'un « pool » de phosphatidylcholines sous l'action de phospholipases spécifiques.
Les voies de production de ces deux intermédiaires métaboliques ont été explorées selon une approche pharmacologique. Les cellules ont été cultivées en présence de différents inhibiteurs enzymatiques, dont les effets ont été analysés d'une part sur 1 ' apoptose induite et d'autre part sur la production stimulée de ceramides et de DAG en réponse aux AGE-méthylglyoxal.
1) La Voie de production des ceramides activée dans les péricytes. a) Implication d'une sphinganine-acyl - transférase . Afin de vérifier si la voie de biosynthèse de novo est activée en réponse aux AGE-méthylglyoxal, l'effet d'un inhibiteur spécifique de la sphinganine-acyl- transférase sur l' apoptose des péricytes, la fumonisine Bl (Wang et al, 1991), a été testé. La figure 9 rapporte l'effet de la fumunisine Bl sur l' apoptose des péricytes induite par les AGE- méthylglyoxal. Les résultats, exprimés en % d'inhibition de 1 ' apoptose induite, sont la moyenne de 2 expériences indépendantes. L'ajout de 0,01 μM de fumonisine Bl dans le milieu de culture n'a induit qu'une inhibition de 22% de 1' apoptose des péricytes (annexine V, voir Matériel et Méthodes) cultivés pendant deux passages (15 jours environ) en présence d1 AGE-méthylglyoxal (ou de BSA-contrôle) . La fumonisine Bl à 0,1 μM a également été testée. A cette concentration, la fumonisine Bl est proapoptotique , puisqu'elle affecte le taux basai d' apoptose des cellules cultivées avec de la BSA-contrôle (résultats non montrés) .
La fumonisine Bl ne protège pas les péricytes de l' apoptose induite. La synthèse de novo des ceramides ne semble donc pas être impliquée dans 1 ' apoptose des péricytes rétiniens induite par les AGE-méthylglyoxal. b) Implication d'une sphingomyelinase acide. Les ceramides peuvent être formés à partir du « pool » de sphingomyélines sous l'action de sphingomyélinases . Il existe différentes sphingomyélinases qui se distinguent par leur localisation intracellulaire et par leur pH optimal d'activité: il s'agit des sphingomyélinases acide, neutre et basique. L'implication d'une sphingomyelinase acide a été vérifiée en analysant les effets d'un inhibiteur spécifique de cet enzyme, la désipramine (10, ll-Dihydro-5- [3- (methylamino) propyl] -5H-dibenz [b, f] azepine) (Andrieu et al., 1994; Jaffrezou et al., 1995), sur 1 ' apoptose induite des cellules et sur la production stimulée des ceramides et des DAG dans les péricytes cultivés avec les AGE- méthylglyoxal .
La figure 10 rapporte l'effet de la désipramine sur 1 ' apoptose des péricytes induite par les AGE- méthylglyoxal. Les résultats, exprimés en % d'inhibition de 1 ' apoptose induite, sont la moyenne de 7 expériences indépendantes pour la désipramine à 0,1 μM et de 6 expériences indépendantes pour la désipramine à 0,3 μM. Une culture des péricytes pendant deux passages (15 jours environ) en présence d' AGE-méthylglyoxal avec 0,1 μM et 0,3 μM de désipramine permet une inhibition partielle de 35% de 1 ' apoptose induite par les AGE-méthylglyoxal (Figure 10). De la désipramine à 1 μM a également été ajoutée dans le milieu de culture mais; dans ces conditions, le taux basai d' apoptose des cellules-contrôle a été affecté (résultats non montrés) .
La figure 11 rapporte l'effet de la désipramine sur la production stimulée de ceramides et de DAG dans les BRP induites par les AGE-méthylglyoxal. Les ceramides et les DAG ont été dosés comme décrit dans la section Matériel et Méthodes. Les résultats, exprimés en % d'inhibition de production stimulée de ceramides et de DAG, sont la moyenne de 4 expériences indépendantes pour la désipramine à 0,1 μM et de 2 expériences indépendantes pour la désipramine à 0,3 μM. La désipramine à 0,1 μM ajoutée dans le milieu de culture pendant deux passages bloque 78% des ceramides produits dans les péricytes en réponse aux AGE- méthylglyoxal mais ne réduit que de 17% la surproduction de DAG. L'effet inhibiteur de la désipramine à 0,3 μM sur la production stimulée des ceramides semble être dose- dépendant puisque l'agent testé induit une inhibition de 95% des ceramides formés. La surproduction des DAG n'est bloquée que de 13%. L'ajout de 1 μM de désipramine dans le milieu de culture a affecté le taux basai des ceramides et des DAG des cellules cultivées avec la BSA-contrôle (résultats non montrés) . c) Conclusions . Un traitement des péricytes avec 0,3 μM de désipramine induit une inhibition complète des ceramides produits sans affecter la surproduction des DAG : l'augmentation observée des ceramides dans les péricytes cultivés avec 2 μM d 'AGE-méthylglyoxal est bien liée à l'activation d'une sphingomyelinase acide. Cet enzyme pourrait être couplé à une phospholipase C spécifique des phosphatidylcholines (PC-PLC) (Schùtze et al, 1992; Genestier et al, 1998) . Ainsi dans les péricytes cultivés avec 2 μM d' AGE-méthylglyoxal, l'action d'une PC-PLC sur un pool de phosphatidylcholines libérerait des DAG qui activeraient en cascade une sphingomyelinase acide induisant la formation de ceramides. Lorsque les cellules sont cultivées avec de la désipramine, la sphingomyelinase acide est inhibée : il en résulte une baisse de la production des ceramides alors que les DAG, produits en amont de la cible enzymatique, ne sont pas affectés.
La figure 12 rapporte la voie de production des ceramides et des DAG dans les péricytes envisagée sur la base de l'invention.
Bien que la surproduction des ceramides ait été totalement bloquée, la désipramine ne protège que partiellement les péricytes de 1 ' apoptose induite par les AGE-méthylglyoxal .
2) Voie de production des DAG activée dans les péricytes . a) Implication d'une phosphat idylcholine- phospholipase C. Afin de confirmer, d'une part, l'hypothèse proposée pour la voie de production des ceramides et des DAG et de vérifier, d'autre part, si les DAG sont impliqués dans 1 ' apoptose résiduelle, les effets d'un inhibiteur spécifique de la phosphatidylcholine-phospholipase C, le D609 (tricyclo [5.21.0 (2.6) ] decyl-9 [8] anthogenate) (Mùller- Decker et al, 1988; Mùller-Decker , 1989), sur 1 ' apoptose induite (Figure 13) et sur la production des ceramides et des DAG induite par les AGE-méthylglyoxal (Figure 14) a été analysée .
La figure 13 rapporte l'effet du D609 sur 1 ' apoptose (annexine V, Matériel et Méthodes) des péricytes induite par les AGE-méthylglyoxal après deux passages. Les résultats, exprimés en % d'inhibition de l' apoptose induite, sont la moyenne de 7 expériences indépendantes pour le D609 à 9,4 μM et de 6 expériences indépendantes pour le D609 à 30 μM et la combinaison désipramine/D609. L'ajout de 9,4 μM et 30 μM de D609 dans le milieu de culture a permis de bloquer respectivement de 40% et 47% 1 ' apoptose des péricytes induite par les AGE-méthylglyoxal. Nous avons également testé la combinaison 0,1 μM de désipramine/ 9,4 μM de D609, dans l'optique d'agir simultanément sur les deux cibles enzymatiques. Un traitement des cellules par les deux agents combinés induit un effet équivalent au D609 seul: 1 ' apoptose des péricytes a été inhibée de 51%.
La figure 14 rapporte l'effet du D609 sur la production stimulée de ceramides et de DAG (voir Matériel et Méthodes) dans les BRP induites par les AGE- méthylglyoxal. Les résultats, exprimés en % d'inhibition de la production stimulée de ceramides et de DAG, sont la moyenne de 4 expériences indépendantes pour le D609 à 9,4 μM et de 2 expériences indépendantes pour le D609 à 30 μM et la combinaison désipramine/D609. Une incubation des cellules en présence de 9,4 μM de D609 induit une inhibition presque totale de la production des ceramides et des DAG de 95% et de 80% du niveau stimulé, respectivement. A la concentration de 30 μM le D609 a permis une inhibition complète de la production des ceramides et une inhibition de 65% des DAG produits. Un traitement des cellules par les deux agents combinés induit un effet équivalent au D609 30 μM: la surproduction des ceramides est totalement bloquée et 70% des DAG produits sous AGE-méthylglyoxal sont inhibés . b) Conclusion.
Une incubation des péricytes avec du D609, plus particulièrement à la concentration de 9,4 μM, induit une inhibition parallèle de la production stimulée des ceramides et des DAG. Ce résultat permet donc de conclure que la formation des DAG est bien liée à l'activation d'une phosphatidylcholine-phospholipase C couplée à une sphingomyelinase acide, ce qui valide la voie de production des ceramides et des DAG envisagée précédemment. Toutefois, malgré une inhibition complète des ceramides et des DAG, les cellules ne sont que partiellement protégées de 1 ' apoptose induite par les AGE- méthylglyoxal, ceci suggère l'existence d'une seconde voie de signalisation parallèle à la production des ceramides et des DAG et menant à 1 ' apoptose des péricytes.
La figure 15 montre la voie de signalisation menant à l' apoptose des péricytes.
Les AGE-méthylglyoxal, probablement par l'intermédiaire d'un récepteur spécifique aux AGE, induisent un stress oxydant qui peut être situé au carrefour de deux voies de transduction de signal menant à 1 ' apoptose des péricytes. Effectivement, un traitement des cellules avec de la N-acétyl-L-Cystéine bloque complètement la production stimulée des ceramides et des DAG et inhibe totalement l' apoptose des péricytes induite par les AGE- méthylglyoxal .
Les travaux de recherche ont alors consisté à définir une cible enzymatique située en amont des ceramides et des DAG et qui pourrait également se trouver au carrefour des deux voies de signalisation.
IV - IMPLICATION DE CASPASES: LES PROTEASES SPECIFIQUES DE L' APOPTOSE.
Des études récentes ont mis en évidence qu'une série de proteases de la famille des ICE (Interleukin-1 Converting Enzyme) renommées caspases (Cytosolic Asparte- Spécifie Cysteine Proteases) jouaient un rôle clef dans la transduction des signaux apoptotiques. En fonction du critère de comparaison, différentes classifications de ces proteases ont été proposées :
- Selon leur temps d'implication dans la voie de signalisation de l' apoptose, ces enzymes ont été classées en deux groupes : les caspases initiatrices, activées au cours la phase d'initiation de 1 ' apoptose (caspases-2, 8, 10) et les caspases effectrices, pouvant être activées en cascade par des caspases initiatrices, impliquées dans la phase d'exécution de 1 ' apoptose qui se caractérise par des atteintes biochimiques et morphologiques de la cellule (caspases-3, 6, 7, 9) (Nunez et al, 1998; Stennicke et al, 1998; Alnemri, 1999) .
- En revanche, sur la base de leur spécificité de substrat, les caspases ont pu être classées différemment en trois sous groupes:, le groupe I constitué des caspases- 1, 4, 5 (enzymes décrits comme étant impliqués dans les réponses inflammatoires) , le groupe II constitué des caspases-2, 3, 7 et le groupe III constitué des caspases-6, 8, 9, 10. Alors que les proteases du groupe II exigent un résidu aspartate aussi bien en première qu'en quatrième position du site de clivage protéolytique (XDXXD) , les proteases du groupe III sont plus tolérantes vis-à-vis du quatrième résidu aminoacide, tout en présentant une préférence pour les acides aminés aliphatiques (XE[I/T/H/V]D) (Thornberry et al, 1997; Garcia-Calvo et al, 1998) .
- Enfin une analyse phylogénétique des caspases a permis de définir trois sous-familles : les ICE-like proteases (famille des caspases-1) regroupant les caspases- 1, 4, 5, 11, les IchlI-like proteases (famille des caspases-2) regroupant les caspases-2, 9 et les CPP (cysteine protein protease) 32-like proteases (famille des caspases-3) regroupant les caspases-3, 6, 7, 8, 10 (Alnemri et al, 1996; Duan et al, 1996a, 1996b) .
Les caspases sont inhibées de façon spécifique in vi tro et in vivo par des peptides synthétiques (le plus souvent des tétrapeptides) rendus perméables aux cellules par des groupements chimiques bloquant les fonctions NH2 et COOH terminales et mimant le site de clivage de leur substrat respectif.
Différents peptides inhibiteurs synthétiques ont été testés afin de vérifier si des caspases initiatrices et/ou effectrices étaient impliquées dans 1' apoptose des péricytes induite par les AGE-méthylglyoxal. Trois peptides décrits comme des inhibiteurs spécifiques d'une protease ont été testés :
- le peptide z-VDVAD-fmk inhibiteur spécifique de la caspase-2 initiatrice,
- le peptide z-IETD-fmk inhibiteur spécifique de la caspase-8,
- le peptide z-LEHD-fmk inhibiteur spécifique de la caspase-9. Nous avons également analysé les effets d'autres peptides modifiés ne présentant pas de spécificité vis-à-vis d'une caspase ou bien une spécificité modérée dépendant de l'accessibilité de l'enzyme et de la concentration intracellulaire de l'inhibiteur : - l'inhibiteur z-VAD-fmk qui inhibe un large spectre de caspases, incluant ainsi les caspases initiatrices et les caspases effectrices (Garcia-Calvo et al, 1998) ; - le peptide z-DEVD-fmk qui présente un effet inhibiteur des CPP32-like proteases, agissant principalement sur la caspase-3 effectrice (Nicholson et al, 1995) et de façon moins spécifique sur les caspases-6, 7, 8, 10 (Fernandes-Alnemri et al, 1995) ; - le peptide z-AEVD-fmk qui est un inhibiteur de la caspase-10 initiatrice et de façon moins spécifique des caspases-8, 9.
2) Effet des peptides inhibiteurs de caspases sur l'apoptose induite des péricytes.
La figure 16 rapporte l'effet des peptides inhibiteurs de caspases sur l'apoptose des péricytes induite par les AGE-méthylglyoxal. Les cellules ont été cultivées pendant deux passages (15 jours environ) en présence d' AGE-méthylglyoxal (ou de BSA-contrôle) et des peptides inhibiteurs z-VAD-fmk, z-DEVD-fmk, z-IETD-fmk, z- AEVD-fmk, z-VDVAD-fmk et z-LEHD-fmk (50 μM) . L'apoptose a été détectée et dosée par un marquage à 1 ' annexine V, comme décrit dans la section Matériel et Méthodes. Les résultats exprimés en % d'inhibition de l'apoptose induite sont la moyenne de 6 expériences indépendantes pour z-VAD-fmk et z- DEVD-fmk, de 4 expériences indépendantes pour z-LEHD-fmk et de 3 expériences indépendantes pour z-VDVAD-fmk, z-AEVD-fmk et z-IETD-fmk. L'ajout de 50 μM de z-VAD-fmk, z-DEVD-fmk, z-
AEVD-fmk et z-LEHD-fmk dans le milieu de culture permet une inhibition quasi totale de l'apoptose des péricytes induite par les AGE-méthylglyoxal. Alors que le peptide z-IETD-fmk ne protège pas les cellules de l'apoptose, le peptide z- VDVAD-fmk induit une inhibition partielle de l'apoptose induite par les AGE-méthylglyoxal (Figure 16) .
3) Effet des peptides inhibiteurs de caspases sur la production stimulée des ceramides et des DAG dans les péricytes rétiniens.
La figure 17 montre l'effet des peptides inhibiteurs de caspases z-VAD-FMK et z-DEVD-FMK (50 μM) sur la production stimulée de ceramides et de DAG dans les BRP induites par les AGE-méthylglyoxal . Les ceramides et les DAG ont été dosés comme décrit dans la section Matériel et Méthodes. Les résultats sont exprimés en % d'inhibition de la production stimulée et sont le résultat de 2 expériences indépendantes . Les effets des inhibiteurs peptidiques sur la production des ceramides et des DAG diffèrent: alors que la production stimulée des deux intermédiaires métaboliques n'est pas affectée dans les péricytes traités avec 50 μM de z-DEVD-fmk ou de z-LEHD-fmk, le peptide z-VAD-fmk bloque la surproduction des ceramides et des DAG de 75% et 100% respectivement .
4) Implication de la caspase 10 dans l'apotose des péricytes rétiniens provoquée par les AGE.
a) Matériel .
L' anticorps primaire dirigé contre la caspase- 10, son peptide bloquant respectif, la caspase-10 recombinante utilisée comme contrôle positif et l'anticorps secondaire anti-lapin ont été fournis par Biomol (France) Les films pour autoradiographie (Hyperfilm) et les réactifs de révélation ECL ont été achetés chez Amersham (France) . Les gels de SDS-page (ready gel Tris-HCl 12%) , les membranes de nitrocellulose (porosité de 0,45 μM) pour les immunoempreintes, l'anticorps secondaire anti-chèvre et les marqueurs de poids moléculaires (protein précision standards, broad range) sont de Bio-Rad (France) .
Pour l' êlectrophorèse et 1 ' électrotransfert des protéines, les systèmes Mini-Protean II et Mini-Trans Blot de Bio-Rad ont été utilisés, b) Immunoblot .
- Préparation des échantillons :
Les péricytes (2 à 3 boites de 6 cm) , cultivés pendant 15 jours en présence de 3 μM d'AGE-méthyglyoxal (ou
BSA-contrôle) comme décrit dans l'application sus-nommée, sont déposés sur un lit de glace, lavés 3 fois par du DPBS froid puis grattés à l'aide d'un ruber policeman dans 500 μl de tampon de récupération froid (Tris-HCl 0.1 M pH 8 contenant 4.4 μM de pepstatine A, 6 μM de leupeptine, 0.6 mM de PMSF et 10 mM d'EDTA) . Afin de limiter la perte de matériel cytoplasmique, la suspension cellulaire est solubilisée directement dans la boite de pétri par addition de 100 μl de tampon Laëmmli 5X (Tris-HCl 0,15 M pH6 , 8 contenant 5% de SDS, 12.5 % de glycérol, 12.5% de βmercaptoéthanol et 1% de bleu de bromophénol) . Les pelotes d'ADN, rendant la solution visqueuse, sont cassées mécaniquement à l'aide de va-et-vient énergiques dans une seringue équipée d'une aiguille 30G1 2. Les échantillons proteiques sont alors chauffés 3 min à 100°C avant d'être déposés sur le gel de polyacrylamide .
- Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en condition dénaturante (SDS-page) :
L ' êlectrophorèse est réalisée dans des conditions réductrices (β-mercaptoéthanol) et dénaturantes
(SDS) selon la technique de Laëmmli (Laëmmli U.K, 1970) .
Des aliquotes de lysats de péricytes (20 μg) sont déposées sur un gel de polyacrylamide (ready gel Tris- HCl de Bio-Rad), constitué d'un gel de concentration de 4% d'acrylamide et d'un gel de séparation de 12% d' acrylamide. L' êlectrophorèse des protéines est effectuée à 100 V (gel de concentration) puis 200 V (gel de séparation) dans le tampon de migration (Tris 25 mM, glycine 0,19 M, SDS 0.1%), jusqu'à ce que le bleu de bromophénol (repérant le front de migration) atteigne le bas du gel . Des marqueurs de masse moléculaire (250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 15, 10 kDa) sont également déposés afin d'étalonner la migration des protéines . Le gel est alors utilisé pour un électrotransfert des protéines puis coloré au bleu de Coomassie .
- Electrotransfert des protéines sur membrane de nitrocellulose : En fin d' êlectrophorèse, la membrane, les feuilles de papier Wattman et les éponges de mousse (Scotch Brite, 3M) sont équilibrés pendant 10 min dans le tampon de transfert froid (Tris 25 mM pH 8,3, glycinel92 mM, méthanol 20% (v/v) ) . Le sandwich est réalisé en semi- immersion: la membrane et le gel sont superposés et encadrés de part et d'autre d'un papier et d'une éponge. L'ensemble, placé dans la cuve, est immergé dans le tampon de transfert , et les protéines sont transférées du gel (cathode) vers la membrane de nitrocellulose (anode) électrophoretiquement à 100 V pendant 45 min, à 4°C et sous agitation magnétique.
Immunodétection des protéines transférées : Le matériel antigénique utilisé dans notre étude est de source bovine. Ne disposant pas d'anticorps primaires dirigés contre du matériel bovin, notre choix c'est porté sur des anticorps polyclonaux présentant une immunoréactivité croisée avec différentes espèces (homme, souris et rat) .
. Tampons utilisés : Tampon TBS (Tris Buffer Saline) : Tris-HCl 10 mM pH 8.0, NaCl 150 mM
Tampon TTBS : 0.05% de Tween 20 dans du TBS
Tampon de dilution de l'anticorps: BSA 1% dans du TTBS
Tampon de saturation des membranes : : lait 10% dans du TTBS
. Révélation des protéines :
Réaction antigénique. Après êlectrophorèse des protéines et transfert, la membrane de nitrocellulose est colorée au rouge ponceau pour repérer les pistes de migration des protéines, puis décolorée. Les sites de liaisons non spécifiques de la membrane sont bloqués par une incubation dans le tampon de saturation adéquat pendant 60 min à température ambiante sous agitation douce (ou alternativement à 4°C pendant la nuit) . La membrane est lavée trois fois (15 min puis 5 et 5 min) dans du tampon
TTBS avant d'être incubée pendant 2 heures avec l'anticorps primaire anti caspase 10 humaine (1/2000) dilué dans le tampon de dilution. Une seconde série de lavages dans du
TTBS précède la deuxième incubation (1 heure 30) avec l'anticorps secondaire anti-lapin couplé à la peroxydase de raifort (1/6000) . La membrane est de nouveau lavée dans du TTBS puis rincée 5 min dans du TBS avant d'être révélée à l'ECL.
Révélation à l'ECL.
La membrane est séchée rapidement sur du papier absorbant, incubée avec la solution de détection pour chimiluminescence du kit ECL pendant 1 min puis enveloppée dans du papier film Saran. Elle est alors exposée à un film autoradiographique pendant une durée de 8 min et les films sont développés. c) Résultats.
Ces résultats confortent les précédents précédemment où uniquement des peptides inhibiteurs de caspases avaient été utilisés. Les présents résultats illustrés par la figure 19 montre par analyse directe avec un anticorps spécifique que la grande sous-unité (25 kDa) de la caspase 10 activée à partir de son précurseur
(caspase 10b ou lOd) est bien présente dans les péricytes incubés avec les AGE suggérant qu' il y a bien activation de la caspase 10 lors de l'apoptose des péricytes rétiniens induite par les AGE.
5) Conclusion.
L'effet protecteur du peptide z-VAD-fmk (inhibiteur à large spectre de caspases) sur l'apoptose des péricytes met en évidence l'activation de caspases dans la voie de transduction des signaux apoptotiques. Dans les péricytes cultivés avec ce peptide inhibiteur, la production de ceramides et de DAG induite par les AGE- méthylglyoxal est bloquée, ceci suggère ainsi l'implication d'une caspase initiatrice (caspases-2, -8, -10), contrôlant la production des ceramides et des DAG.
Dans un premier temps, nous avons vérifié si la caspase-8 initiatrice est l'enzyme activé en réponse aux AGE-Méthylglyoxal . Une incubation des cellules avec son inhibiteur spécifique z-IETD-fmk ne permet pas de bloquer l'apoptose. La caspase- 8 ne semble donc pas être impliquée dans l'apoptose des péricytes.
Afin de définir si la caspase-2 initiatrice participe à la transduction du signal menant à l'apoptose, nous avons incubé les péricytes en présence du peptide inhibiteur z-VDVAD-fmk, spécifique de cette caspase. Le peptide z-VDVAD-fmk inhibe partiellement l'apoptose induite par les AGE-méthylglyoxal, suggérant que la caspase- 2 initiatrice semble être impliquée dans l'apoptose des péricytes .
Nous avons également analysé les effets du peptide z-AEVD-fmk, décrit comme un inhibiteur de la caspase- 10 initiatrice et inhibiteur moins spécifique de la caspase-8 initiatrice et de la caspase-9 effectrice. L'effet protecteur de ce peptide sur l'apoptose des péricytes suggère l'activation de la caspase-10 et/ou de la caspase-9, l'implication de la caspase-8 étant exclue par l'absence d'effet de z-IETD-fmk sur l'apoptose. Le peptide z-LEHD-fmk, inhibiteur décrit comme spécifique de la caspase-9 effectrice, a lui aussi un effet protecteur sur l'apoptose des péricytes, mais sans affecter la surproduction des DAG ou des ceramides induite par les AGE- méthylglyoxal. Ce résultat suggère que la caspase-9, bloquée par z-LEHD-fmk, intervient en aval de la production des DAG et des ceramides .
Ainsi, les caspases-2, 9 et 10 semblent participer à la transduction du signal apoptotique dans les péricytes rétiniens.
L'effet protecteur du peptide z-DEVD-fmk sur l'apoptose des péricytes suggère que les deux voies métaboliques proposées convergent vers une même caspase de la famille des CPP32-like proteases. Un traitement des péricytes avec ce peptide inhibiteur n'a pas affecté la surproduction des ceramides et des DAG induite par les AGE- méthylglyoxal . Ce résultat permet alors de conclure que la (les) caspase (s) bloquée (s) par z-DEVD-fmk intervient (nent) en aval des ceramides et des DAG. D'autre part, l'inhibition de l'apoptose observée en présence de z-DEVD- fmk ne semble pas être liée à l'inhibition des caspases-2, -8, -10 initiatrices puisque le niveau de production des ceramides et des DAG n'a pas été affecté. De même, l'inhibition de l'apoptose par z-LEHD-fmk, spécifique de la caspase- 9, ne semble pas liée à l'inhibition des caspases initiatrices, puisque le niveau de DAG et ceramides n'a pas été affecté. Nous pouvons donc conclure que les deux voies métaboliques convergent bien vers deux caspases effectrices, la caspase 9 et la caspase-3, et peut-être la caspase 6 et 7 des CPP32-like proteases, intervenant dans la phase d'exécution de l'apoptose.
La figure 18 montre une voie de signalisation menant à l'apoptose des péricytes. Les AGE-méthylglyoxal induisent un stress oxydant qui semble activer une caspase initiatrice (la caspase-2 ou -10). L'activation de cette caspase activerait une cascade enzymatique impliquant dans un premier temps une phosphatidylcholine-phospholipaseC, puis une sphingomyelinase acide et ensuite la caspase 9 et une caspase effectrice des CPP32-like proteases. Il a été possible de déterminer que ces caspases 9 et 3 se situent au carrefour des deux voies métaboliques. En revanche, il n'est pas possible de conclure si les deux voies divergent en aval de la caspase initiatrice ou si le stress oxydant reste au carrefour de ces deux voies.
Les travaux décrits réalisés dans le cadre de l'invention mettent clairement en évidence qu'une caspase initiatrice, probablement la caspase 10 est impliquée dans la cascade d'événements biochimique menant à l'apoptose des péricytes induite par les AGE. Cette implication est étayée par des arguments expérimentaux basés sur une approche purement pharmacologique utilisant des inhibiteurs peptidiques spécifiques de différentes caspases. La figure 19 montre en que la caspase 10 est bien activée lorsque les péricytes rétiniens bovins sont soumis aux AGE. En effet, par immunodetection sur nitrocellulose à l'aide d'un anticorps spécifique qui reconnaît la forme clivée et active (grande sous-unité , 25 kDa) de la caspase 10 à partir de son précurseur (caspase 10b (FADD like interleukin-1-converting enzyme-2, FLICE-2) ou lOd, 60 kDa) , il a été possible de détecter la grande sous-unité de la caspase activée (25 kDa) dans les cellules traitées par les AGE alors qu'elle est quasi inexistante dans le cas des cellules traitées par la BSA contrôle (voir Figure 19) bien que la quantité de précurseur (caspase 10b ou lOd) soit similaire dans les deux conditions (voir Figure 1) .
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Claims

REVENDICATIONS
1) Utilisation d'un inhibiteur de l'apoptose des péricytes rétiniens pour la préparation d'un médicament utile pour prévenir ou traiter la rétinopathie diabétique.
2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'inhibiteur de l'apoptose des péricytes rétiniens est un composé anti-oxydant .
3) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le composé anti -oxydant est choisi dans le groupe comprenant : la N-acétyl-L-Cystéine, l'acide lipoïque, l'ebselen, la zéaxanthine, la coelenteramine, un dérivé ou un mélange de ceux-ci.
4) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'inhibiteur de l'apoptose des péricytes rétiniens est un composé anti- oxydant capable d'inhiber indirectement la production des ceramides et/ou des DAG.
5) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'inhibiteur de l'apoptose des péricytes rétiniens est un composé inhibiteur de la production des ceramides et/ou des DAG.
6) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que le composé inhibiteur de la production des ceramides est un inhibiteur de la sphingomyelinase acide.
7) Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la sphingomyelinase acide est le 10 , ll-Dihydro-5- [3- (methylamino) propyl] -5H- dibenz [b, f] azepine (désipramine) ou l'un de ses dérivés.
8) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que le composé inhibiteur de la production des DAG est un inhibiteur de la phosphatidylcholine-phospholipase C.
9) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la phospha t idyl chol ine -phosphol ipase C est le tricyclo [5.21.0 (2.6) ] decyl- (9 [8] xanthogenate (D609) ou l'un de ses dérivés.
10) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'inhibiteur de l'apoptose des péricytes rétiniens est un inhibiteur de caspase.
11) Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que l'inhibiteur de caspase est de type peptidique.
12) Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que l'inhibiteur de caspase est un peptide modifié chimiquement par un groupement benzyleoxycarbonyle (z) du côté N-terminal et par un groupe (O-méthyle) -fluorométhyle cétone (fmk) du côté C-terminal.
13) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisée en ce que l'inhibiteur de caspase est un inhibiteur de toutes les caspases . 14) Utilisation selon la revendications 13, caractérisée en ce que l'inhibiteur de toutes les caspases est le tripeptide z-VAD-fmk.
15) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisée en ce que l'inhibiteur de caspase est un inhibiteur d'une caspase initiatrice.
16) Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que l'inhibiteur de caspase est un inhibiteur d'une caspase initiatrice choisie parmi les caspases 2 ou 10.
17) Utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que l'inhibiteur de caspase initiatrice
10 est le peptide z-AEVD-fmk.
18) Utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que l'inhibiteur de caspase initiatrice 2 est le peptide z-VDVAD-fmk.
19) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisée en ce que l'inhibiteur de caspase est un inhibiteur d'une caspase effectrice.
20) Utilisation selon la revendication 19, caractérisée en ce que l'inhibiteur de caspase est un inhibiteur de la caspase effectrice 3.
21) Utilisation selon la revendication 20, caractérisée en ce que l'inhibiteur de caspase effectrice 3 est le peptide z-DEVD-fmk. 22) Utilisation selon la revendication 19, caractérisée en ce que l'inhibiteur de caspase est un inhibiteur de la caspase effectrice 9.
23) Utilisation selon la revendication 22, caractérisée en ce que l'inhibiteur de caspase effectrice 9 est le peptide z-LEHD-fmk.
24) Utilisation d'une association de deux ou plus inhibiteurs de l'apoptose des péricytes rétiniens définis dans l'une quelconque des revendications 2 à 23 pour la préparation d'un médicament utile pour prévenir ou traiter la rétinopathie diabétique.
25) Utilisation selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'association comprend au moins deux inhibiteurs de l'apoptose des péricytes choisis parmi les composés suivants :
- un composé anti-oxydant, - un inhibiteur de la phosphatidylcholine- phospholipase C (PC-PLC) ,
- un inhibiteur d'une sphingomyelinase acide,
- un inhibiteur de caspase .
26) Composition pharmaceutique comprenant à titre d'agents actifs au moins un inhibiteur de l'apoptose de péricytes rétiniens définis dans l'une quelconque des revendications précédentes.
27) Composition pharmaceutique selon la revendication 26, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre d'agents actifs un composé antioxydant et/ou un inhibiteur de la phosphatidylcholine-phospholipase C et/ou un inhibiteur d'une sphingomyelinase acide, associé (s) dans ladite composition avec au moins un inhibiteur de caspase.
28) Composition pharmaceutique selon l'un des revendications 26 ou 27, caractérisée en ce que le dosage en agent (s) actif (s) permet une administration journalière comprise préférentiellement entre environ 0,01 et environ 200 mg/kg de masse corporelle, préférentiellement entre 0,5 et environ 75 mg/kg de masse corporelle et tout préférentiellement entre environ 1 et 50 mg/kg de masse corporelle .
29) Composition pharmaceutique selon l'un des revendications 26 à 28, caractérisée en ce qu'elle comprend de 5% à 95% (w/w) environ et de préférence de 20 % à 80 I environ (w/w) d'agent (s) actif (s) .
30) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 26 ou 27, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme pour une administration topique ou une injection oculaire.
31) Composition pharmaceutique selon la revendication 30, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 0,01 et 10% et de préférence entre 0,01 et 4% en poids d' agent (s) actif (s) .
32) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'inhibiteur de l'apoptose des péricytes rétiniens est un oligonucleotide antisens, de 6 à
25 nucléotides, complémentaire d'une partie d'une séquence polynucléotidique choisie parmi celle codant pour une caspase, la phosphatidylcholine-phospholipase C, la sphingomyelinase acide. 33) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'inhibiteur de l'apoptose des péricytes rétiniens est une molécule d'acide nucléique comprenant au moins une séquence polynucléotidique codant pour un peptide, de 2 à 10 acides aminés, inhibiteur compétitif d'une caspase.
34) Méthode d'identification de composés capables de prévenir ou traiter la rétinopathie diabétique, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'une culture de péricytes traités par des AGE avec un composé à tester et en ce que l'on évalue l'apoptose dans lesdits pérycites pour déterminer la capacité dudit composé à prévenir ou traiter la rétinopathie diabétique.
35) Méthode selon la revendication 34, caractérisée en ce que le composé est choisi dans le groupe comprenant : les anti-oxydants , les inhibiteurs de la production des ceramides et/ou des DAG, les inhibiteurs de caspase, les oligonucleotide antisens, de 6 à 25 nucléotides, complémentaire d'une partie d'une séquence polynucléotidique choisie parmi celle codant pour une caspase, la phosphatidylcholine-phospholipase C, la sphingomyelinase acide, les molécules d'acide nucléique comprenant au moins une séquence polynucléotidique codant pour un peptide, de 2 à 10 acides aminés, inhibiteur compétitif d'une caspase.
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