EP1325327A2 - Verfahren zur bestimmung der peptidhormon-aktivitäten oder der steroidhormon-aktivitäten eines materials oder stoffgemisches - Google Patents

Verfahren zur bestimmung der peptidhormon-aktivitäten oder der steroidhormon-aktivitäten eines materials oder stoffgemisches

Info

Publication number
EP1325327A2
EP1325327A2 EP01982131A EP01982131A EP1325327A2 EP 1325327 A2 EP1325327 A2 EP 1325327A2 EP 01982131 A EP01982131 A EP 01982131A EP 01982131 A EP01982131 A EP 01982131A EP 1325327 A2 EP1325327 A2 EP 1325327A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
hormone
cell
cells
reporter gene
activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01982131A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Axel Alléra
Ludwig Wildt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ALLERA, AXEL
DAUFELDT, DR., SABINE
DAUFELDT, HANS-PETER
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of EP1325327A2 publication Critical patent/EP1325327A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/743—Steroid hormones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells

Definitions

  • the invention relates to a method for the qualification and quantification of hormonal and antagonistic hormonal activities of a material, a bioassay, and the use thereof.
  • Hormones are bioactive signaling molecules that are synthesized in specialized, so-called endocrine cells of every organism, usually. are released into the blood and trigger certain biological effects by reversibly binding to receptors of target cells in a highly affine and highly specific manner; this sends the hormone signal into the cell.
  • the peptide hormones e.g. insulin, thyroid hormones, adrenaline
  • the steroid hormones which mainly include the glucocorticoids, mineralocorticoids, androgens (incl. Androgenic anabolics, "doping agents"), estrogens and gestagens, are the most important hormones for almost all living beings. They regulate growth, physical education and are indispensable for the process and maintenance of vital physiological and biological functions, e.g. of reproduction.
  • steroids are used in a not inconsiderable amount in animal fattening - it is therefore also important to be able to quickly and easily determine whether these mostly illicit means have been used and then end up in human consumption.
  • the decisive factor in determining a so-called hormone status and, if necessary, its dynamics and the resulting diagnostic and therapeutic consequences is not the amount or concentration of the respective peptide or steroid hormones, but rather their activity, i.e. the type and extent of the biological effect, which, for example is influenced by the dissociation constants of the ligand-receptor complex, but also by many other factors, such as the presence of transport proteins, etc.
  • the principle of action of the steroid hormones will first be explained. These mediate their effect significantly via receptors specific for the respective steroid hormone classes, which according to the prevailing doctrine are located within the target cells.
  • the receptors for peptide hormones are located on or in the cell membrane, i.e. the cell outer shell). They form a very binding-resistant receptor-steroid complex. This complex formation is an essential link in the hormone-dependent signal chain, which leads to the hormone-specific effect (see below).
  • steroid hormone receptors examples include the glucocorticoid receptor (GR), which binds the glucocorticoid cortisol; the androgen receptor (AR), which binds the male sex hormone testosterone and various synthetic steroid hormone analogues, such as anabolic steroids; the estrogen receptors - ER ⁇ and ERß - which bind the female sex hormone estradiol, but also synthetic estrogens (e.g.
  • HRE hormone responsive elements
  • the steroid hormone cortisol in the liver cell the formation of the essential enzyme tyrosine aminotransferase; estradiol that of PR or that of transcortin (indispensable transport protein for glucocorticoids in the blood).
  • the object is achieved by a method with the features of claim 1.
  • Advantageous further developments result from the dependent claims.
  • the invention also relates to a determination assay for the hormone activities of materials according to claim 9.
  • a suitable cell either a) with endogenous hormone receptor that is transient or stable with a recombinant hormone-sensitive reporter gene construct (reporter expression plasmid), or additionally with a recombinant specific hormone receptor expression plasmid mono- or is co-transfected, or b) without endogenous hormone receptor, which is transiently or stably co-transfected with a recombinant hormone-sensitive reporter gene construct and a recombinant specific hormone receptor expression plasmid, which in case a) or b ) - as a transfected cell can express a signaling, easily measurable product.
  • reporter expression plasmid reporter expression plasmid
  • transient transfection means the introduction of foreign DNA into the cell, either into its cytoplasm only for the duration of a cell cycle
  • stable transfection means the permanent introduction of foreign DNA into its genome.
  • Genetically modified (recombinant) plasmids [AA1] ("cloning vectors"), which contain the genetic building instructions for the desired reporter protein or the specific hormone receptor, generally serve as vehicles. These genes are preceded by a specific promoter.
  • This can either be a constitutive promoter (eg with SV40 or Tk (thymidine kinase) in the receptor expression plasmid), the permanent expression, or an inducible promoter (eg with HRE in the reporter expression plasmid), the stimulable (eg by a hormone ) Expression of the downstream (foreign) gene causes.
  • a constitutive promoter eg with SV40 or Tk (thymidine kinase) in the receptor expression plasmid
  • the permanent expression eg with HRE in the reporter expression plasmid
  • an inducible promoter eg with HRE in the reporter expression plasmid
  • the stimulable eg by a hormone
  • the most effective transfection method is the so-called “non-recombinant adenovirus polylysine" technique.
  • Sommer B. et al . “Efficient gene transfer into normal human skeletal cells using recombinant adenovirus and conjugated adenovirus-DNA complexes", Calcif. Tissue Int., 64 (1999), 45-49. This method is particularly indicated for the transfection of differentiated eukaryotic cells with endogenous hormone receptor according to point 1.
  • the hormone-active component (s) of the material forms after introduction into the transfected cell - (for example by adding the material to the cell culture medium) - with the endogenous and / or recombinant steroid receptor (for example glucocorticoid receptor, estrogen receptor, androgen receptor) , Mineralocorticoid receptor, progesterone receptor, etc.) a binding-resistant ligand-receptor complex.
  • ligand forms after introduction into the transfected cell - (for example by adding the material to the cell culture medium) - with the endogenous and / or recombinant steroid receptor (for example glucocorticoid receptor, estrogen receptor, androgen receptor) , Mineralocorticoid receptor, progesterone receptor, etc.) a binding-resistant ligand-receptor complex.
  • reporter proteins are the enzymes luciferase and ⁇ -galactosidase or green, red, yellow fluorescent proteins (GFP, RFP, YFP), which can easily be prepared by existing devices, using established protocols and with commercially available kits, luminescence reaction in the luminometer or fluorescence reaction in FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting) can be quantified.
  • the "Dual-Luciferase TM Reporter Assay System” available from Promega, Madison, Wl, USA; cat. No. E1916
  • luciferase measurement of the successfully transfected cells by measuring the constitutively expressed Renilla luciferase.
  • FACS Fluorescent Activated Cell Sorting
  • Some cells with endogenous hormone receptor according to 1. contain different endogenous hormone receptors: HepG2 and CC-1, HTC and other "hepatoma tissue cells" (non-hepatoma or hepatoma lines of human or rat liver), for example, contain glucocorticoid receptor and estrogen receptor; MCF-7 (human breast cancer cell line) even estrogen receptor, glucocorticoid receptor and androgen receptor.
  • the material to be examined should be discriminated between different qualities of steroid hormone activities, for example glucocorticoid, estrogen, androgen, mineralocorticoid or Gestagen activity, etc., therefore cells without endogenous hormone receptor according to 1.b) are used; these are expressed with the respective hormone receptor expression plasmid, i.e.
  • the appropriate hormone-sensitive Reporter gene plasmid for all listed activity qualities, with the exception of the estrogen-active materials, is, for example, GRE ("glucocorticoid responsible elements") - Luc with a GRE2-TATA promoter which codes for luciferase; this plasmid (pLCO546A) - also generally referred to as a vector - reacts significantly more sensitively and therefore more strongly to inducing substances with hormone activity as the commonly used plasmid with an MMTV-GRE promoter.
  • GRE glucocorticoid responsible elements
  • pLCO546A this plasmid (pLCO546A) - also generally referred to as a vector - reacts significantly more sensitively and therefore more strongly to inducing substances with hormone activity as the commonly used plasmid with an MMTV-GRE promoter.
  • Suitable for estrogen-active materials is, for example, ERE-Luc with an ERE-TATA promoter which also codes for luciferase.
  • Suitable cells / cell lines as such are, for example, CV-1 and COS-1, COS-7 (monkey kidney cells), and above all special yeast cell lines which have been shown to express various gene products, including various steroid like receptors ", have proven very successful (McEwan IJ:" Investigation of steroid receptor function in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ", FEMS Microbiol. Lett. 179 (1999), 183-4). All listed and other suitable cell lines, as under point 1. a) and 1. b) are commercially available from various cell banks and with a precise definition; some important ones are listed as examples:
  • DSMZ Human and Animal Cell Cultures
  • German Collection of Microorganisms & Cell Cultures Mascheroder Weg 1b, Braunschweig, D-38124, Germany
  • yeast cells unlike eukaryotic cells, have a cell wall, the above-mentioned transfection technique is not suitable.
  • the person skilled in the art is also familiar with processes, for example the lithium acetate method. (Gietz RD et "Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc / SS-DNA / PEG procedure", Yeast, 11 (1995), 355-60.
  • Co-transfection of cells (see point 1. a) with a hormone receptor expression plasmid considerably increases the measuring sensitivity of the transfected cell: namely, in addition to the naturally existing ("endogenous") steroid receptors, other, “recombinant” receptors ", that is Nature-identical, made. As a result, the cells respond to even lower concentrations of hormone-active substances and thus represent a particularly sensitive measuring arrangement.
  • Co-transfection i.d.S. is therefore an essential element of the invention.
  • bioassay according to the invention for the qualification and quantification of substances / molecules and other materials with respect to, for example, suspected steroid hormone ac- Activity, steroid hormone agonism and possibly antagonism is also advantageous for another reason and is superior to the usual one for determining the amount of substance: as already mentioned above, there are numerous naturally occurring substances and those from the technical environment, or chemical compounds and their often unknown Metabolites with steroid hormone activity (e.g. phyto-estrogens, pesticides and DDT and its still ubiquitous chemical derivatives that act like estrogens). Possibly common and important uses of the invention include that of determining:
  • Estrogen-active individual materials and / or mixtures of substances of physiological origin e.g. in the serum of humans and cattle
  • foods, cosmetics and other pharmaceutical products as well as in some technical-synthetic "Permanent Organic Pollutants” (POP).
  • POP Permanent Organic Pollutants
  • COS-1, COS-7, HeLa undifferentiated, aneuploid cell line from a rapidly growing human cervical carcinoma
  • MCF-7 CHO ("Chinese Chineseamster ovary cells") cells, in particular Yeast cell lines (see above) which are co-transfected with an androgen receptor or estrogen receptor-coding expression plasmid and a luciferase reporter gene construct which contains a GRE2-TATA or ERE-TATA promoter, the principle of application and implementation of the assay are as described above.
  • Fig. 1 Androgen-induced luciferase activity in human genital skin fibroblasts (GHF) in culture, which with three different luciferase gene constructs of different Different androgen sensitivity (“Luc”) were transfected: PRE2-Tk-Luc, MMTV-Luc, GRE2-TATA-Luc
  • Fig. 2 Dose-effect relationship of a steroid hormone with known glucocorticoid (GC) activity: corticosterone-induced luciferase activity in CC1 cells without (o) and with ( ⁇ ) co-expression of the glucocorticoid receptor
  • Fig. 4 Induction-time-dependent dose-effect relationship of a supposedly inactive steroid hormone: 21-hemisuccinate corticosterone: BSA-induced luciferase activity in CC1 cells
  • Fig. 7 Dose-effect relationship of various steroid hormones with different levels of GC activity: induction of luciferase activity by corticosterone (B), medroxyprogesterone (MP), estrone (E1), progesterone (P) and 17 ⁇ -21-dihydroxy-progesterone (Cortex) in CC1 cells
  • Fig. 8 Dose-effect relationship of various steroid hormones with different GC activity: induction of luciferase activity by corticosterone (B), medroxyprogesterone (MP), estrone (E1), progesterone (P) and 17 ⁇ -21-dihydroxy progesterone (Cortex) in MH 3924 cells
  • FIG. 9 Antagonistic effect of a synthetic steroid hormone on the GC activity: inhibition of the luciferase activity induced by corticosterone (B) and 21-hemisuccinate corticosterone: BSA (B: BSA) in CC1 cells by RU 486 (mifepristone TM)
  • Fig. 10 Dose-effect relationship of GC-active steroid hormones: corticosterone (B) and 21-hemisuccinate-corticosterone: BSA (B: BSA) -induced green fluorescent protein (GFP) activity in MH 3924 cells, stable with an MMTV-GFP reporter gene construct and transiently transfected with a glucocorticoid receptor expression plasmid
  • non-recombinant adenovirus polylysine technique was always used as the transient transfection method of the experiments shown in FIGS. 1-10.
  • Fig. 11 Dose-effect relationship of a synthetic androgen with anabolic activity: induction of luciferase activity by R1881 (methyltrienolone) in HeLa cells, co-transfected with an androgen receptor expression plasmid.
  • the DOTAP method was used as the transfection method (Boehringer, Mannheim, Germany).
  • Fig. 12 Estrogen activity determination of E2 and E1 by co-transfected COS-1 cells (Ex. 13). The superfect method from Qiagen, USA was used as the transient transfection method for the COS-1 cells.
  • Fig. 13 Androgen activity determination of testosterone with co-transfected COS-1 cells (Ex. 14)
  • GHF human genital skin fibroblasts
  • Luc luciferase gene constructs
  • GRE promoters glucocorticoid-responsive element promoters
  • ARE glucocorticoid-responsive elements
  • GHF contain only androgen receptors (AR) as steroid hormone receptors.
  • the miboleron used in this experiment is a synthetic anabolic androgen.
  • CC-1 transiently transfected by means of GRE2-TATA-Luc (these contain nendogenously in addition to ER also FR) or MH 3924 cells in culture are the determination of the glucocorticoid activity of corticosterone and of bovine serum albumin (BSA : "bovine serum albumin") coupled corticosterone derivative (see FIG. 4); these cell lines contain endogenous glucocorticoid receptors.
  • BSA bovine serum albumin
  • the steroid concentration - here corticosterone concentration - determines the extent of the glucocorticoid activity.
  • nM 10 "9 ) means nanoMol / liter. Induction duration: 24 h (see also example 12).
  • Example 3 The following examples therefore always relate to transiently co-transfected CC1 or MH 3924 cells.
  • Example 3
  • the measuring system "co-transfected cell” is so sensitive that materials - here corticosterone - the hormone activity inherent in them either with a long induction time (eg 24 h) even at very low concentrations, or in higher concentrations reveal a very short induction time (eg 10 min).
  • FIG. 4a as in FIG. 2a, it is shown how co-transfected CC1 cells are produced by a corticosterone derivative coupled to bovine serum albumin (BSA: "bovine serum albumin”), which is generally considered to be glucocorticoid-inactive, luciferase induce.
  • BSA bovine serum albumin
  • glucocorticoid activity detected here is not due to the fact that free corticosterone molecules within this formulation are responsible. Thus, even a low glucocorticoid-like activity can be detected by the assay according to the invention. This also results from FIG.
  • transfected MH 3924 cells can be used to measure an easily measurable luciferase induction even after a short-term induction of 10 to 30 min with a very low concentration of corticosterone: BSA ( ⁇ 50 nM).
  • BSA derivatives classified as inactive 21: BSA, 3: BSA; 200 nM each
  • CC1 cells according to Example 4 The difference becomes particularly clear with a long induction time. It can be seen that obviously slight differences in the activity of the two steroid derivatives by means of the assay according to the invention are evident within a relatively short period of time. Mood durations can be determined, as is desired, for example, for "doping" tests or for rapid tests.
  • FIG. 7 shows a comparison of the glucocorticoid activity of various steroid hormones at different concentrations (induction time: 24 h).
  • Example 6 - are highly active while the natural estrogen estrone (E1) is inactive.
  • the natural progestogens (P) and especially cortexolone (17 ⁇ -, 21-dihydroxy progesterone) classified as glucocorticoid antagonistic show significant glucocorticoid activity - see. a. 7a “higher sensitivity of the MH 3924 cells”.
  • Example 8 Assay to determine the glucocorticoid activity of various steroid hormones with MH
  • Glucocorticoid active hormones This becomes particularly clear for progesterone, but also for corticosterone - s. Fig. 8 and also Fig. 7a.
  • RU 38486 known as Mifepristone, the essential component of the so-called “abortion pill”.
  • the luciferase-inducing effect (glucocorticoid agonism) of corticosterone and 21-hemisuccinate corticosterone: BSA is largely blocked by RU 38486 - i.e. Luciferase induction is inhibited.
  • MH 3924 cells were transiently co-transfected with a glucocorticoid receptor expression plasmid and stably with a GFP reporter gene construct which contains the MMTV-GRE promoter. (Induction time: 24 h). The result is shown in FIG. 10. The considerably lower sensitivity of this reporter gene to GRE2-TATA-Luc is clear from the comparison with FIGS. 3 and 4 (see also FIG.
  • FIG. 11 shows the determination of the androgen activity of methyltrienolone (R1881), a synthetic anabolic androgen, by means of luciferase induction in cultured HeLa cells.
  • R1881 methyltrienolone
  • This androgen receptor-free cell line was transiently co-transfected with GRE2-TATA-Luc and a recombinant androgen receptor expression.
  • Induction duration: 24 h .. pM (10 " 12 ) means picoMol / liter.
  • GRE2-TATA-Luc pLCO546A
  • Luciferase (Luc) gene with a minimal glucocorticoid-inducible GRE promoter GRE-TATA
  • GRE-TATA minimal glucocorticoid-inducible GRE promoter
  • pRL-TK Vector Renilla luciferase
  • HSV-TK herpes simplex virus thymidine kinase
  • GR expression plasmid pSTC-rGR: for the GR of the rat with a constitutive cytomegalus virus (CMV) promoter
  • the replication-defective adenovirus type 5 (Adv5, strain DL-312) lacks the "early region” genes E1a and E1b.
  • the multiplication of the viruses took place in stably transfected human 293 embryonic kidney cells (293 cells) complementing the missing genes.
  • poly-L-lysine (pLys; Sigma, St. Louis, MO, USA) was applied to the using the 1-ethyl-3- (dimethyl-aminopropyl) carbodiimide (EDC) technique
  • pLys poly-L-lysine
  • EDC 1-ethyl-3- (dimethyl-aminopropyl) carbodiimide
  • DMEM Dulbecco's Modification of Eagle's Medium; available from Mediatech Inc. under the brand cellgro® Park Center, Herndon, Va, USA
  • 10% fetal calf serum is used as the nutrient medium for the cultivation of the cells.
  • the cells from confluently overgrown culture dishes are converted 24 hours before the transfection in 12-well culture plates to 2.5 * 10 5 cells per cavity. During this 24 hour period, the cells grow in the medium with steroid hormone-free fetal calf serum. It is transfected when the cells have a cell density of about 60 to 90% confluence.
  • the medium is changed after washing with phosphate buffer to 0.5 ml medium without fetal calf serum.
  • the transfection solution per batch for one cavity is prepared in polystyrene tubes as follows:
  • adenovirus pLys solution with 5.7 * 10 10 particles / ml are mixed and incubated for 30 min at room temperature in the dark. After adding 7.55 ⁇ l of pLys-HBS solution in a weight ratio of DNA to pLys of 1: 1, 3, the mixture is incubated again in the dark at room temperature for 30 min.
  • the cells are incubated with 25 ⁇ l of this transfection solution for two hours.
  • the transfection medium is then replaced by 1.5 ml of fresh medium.
  • 12.5 ⁇ l steroid hormone solution is added to induce luciferase production.
  • Blank value approaches receive hormone-free phosphate buffer with 0.1% ethanol.
  • the ethanolic stock solutions are evaporated in glass vessels at 50 ° C and 1 atm in a Speed-Vac, resolubilized in 3 ⁇ l ethanol and diluted with phosphate buffer.
  • the specified steroid concentrations from 20 to 1000 nM (double values are the final concentrations in the medium.
  • the ethanol fraction is not more than 0.1%.
  • the control batch (double value) contains no hormone.
  • the cells are induction for a maximum of 24 hours exposed to corticosterone. In the case of short-term induction of 10, 30 or 60 min, the steroid-containing medium is replaced by steroid-free medium.
  • the cells are 48 hours with a medium- Change and after 24 hours with a second hormone dose for 10, 30 or 60 minutes.
  • the cells are lysed with 200 ⁇ l lysis buffer (see following section) per cavity with occasional swirling for 20 min at room temperature.
  • the lysed cells are frozen in the culture plates at -80 ° C. until the luciferase activity is measured.
  • Luc activity can be measured in any luminometer, e.g. BIOLUMAT LB 95000 T (from Berthold, Wildbad, Black Forest), and is carried out according to the protocol for the "Dual-Luciferase Reporter Assay System” (available from Promega, Madison, Wl, USA).
  • the Firefly activity is measured first, and then that of the Renilla luciferase.
  • 10 ⁇ l lysate is mixed with 50 ⁇ l LAR buffer, and the light signals are measured after 10fsec in the luminometer.
  • the measuring mode is set to 10 sec, 25 ° C, integer.
  • 50 ⁇ l of “Stop & Glow” buffer are added, the mixture is vortexed vigorously for 5 seconds and measured again in the luminometer 10 seconds after the addition of the buffer.
  • the measurement of the two luciferases is carried out with lysates from cells which have been transfected either only with Firefly or only with Renilla luciferase reporter gene.
  • the induction of luciferase synthesis per culture batch is calculated as a multiple of the Firefly pro Renilla luciferase activity of the test batch, based on the corresponding quotient of the control batch without hormones.
  • the x-fold induction of each approach is based on that of the approach with 100 nM corticosterone.
  • the mean values of Luc (Std) are used for the evaluation and the representations. The final values are the result of the following calculation: 18
  • Luc (100) induction of Luc by 100 nM corticosterone in a single experiment, standardized Firefly-Luc / Renilla-Luc
  • Luc (N) induction of Luc by unequal 100 nM corticosterone in a single experiment, standardized Firefly-Luc / Renilla-Luc
  • Luc ( p. ) Luc values of Firefly-Luc without steroid
  • Luc (R +) Luc values of the Renilla-Luc with variable. Steroid (concentration)
  • Luc (R-) Luc values of the Renilla-Luc without steroid
  • Reporter gene construct ERE-E1A-Luc; Luciferase (Luc) gene with a minimal estrogen-inducible ERE promoter (ERE-TATA)
  • Constitutive reporter gene Renilla luciferase (pRL-TK Vector) with the herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) promoter (available from Promega, Madison, Wl, USA.)
  • ER expression plasmid pSTC-TK-hER: for the estrogen receptor of humans with a constitutive thymidine kinase (TK) promoter
  • Estrogen antagonist Tamoxifen as a competitive ER antagonist
  • COS and CV cells have no endogenous hormone receptors and therefore, as a prerequisite for performing the boi assay, they must be transient or stable with a recombinant specific hormone receptor expression plasmid. be co-transfected
  • the COS-1 cells are cultivated analogously to Example 12
  • GRE2-TATA-Luc pLCO546A
  • Luciferase (Luc) gene with a minimal glucocorticoid-inducible GRE promoter GRE-TATA
  • Renilla luciferase Renilla luciferase (pRL-TK Vector) with the herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) promoter (available from Promega, Madison, Wl, USA)
  • AR expression plasmid pSTC-hAR: for the AR of humans with a constitutive cytomegalus virus (CMV) promoter
  • the entire bioassay is carried out as in Example 13.
  • the amounts of DNA used per cavity for the reporter gene construct, the AR expression plasmid and for the constitutive reporter gene pRL-TK are identical to those mentioned there.
  • the testosterone concentrations from 100 pM to 10 nM (double values) are the final concentrations in the medium.
  • the MH 3924 cell line (source: PD Dr. Doris Mayer, AG Hormone Effect and Signal Transduction, FS Tumor Cell Regulation, German Cancer Research Center, Im Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg) is representative of glucocorticoid agonists because of its high sensitivity numerous other hepatoma cell lines of rats and humans (sources of supply e.g. ATCC, DSMZ, ECACC - see above).
  • the parameters listed by way of example therefore represent optimization elements for a kit for the use of the bioassay according to the invention for the qualification and quantification of the steroid hormone agonism and possible antagonism of substances / molecules or material mixtures, the skilled person selecting the suitable cell lines and the reporter gene constructs in accordance with the posed Requirements (durability, sensitivity, specificity, etc.) is possible due to his specialist knowledge and in accordance with the teaching of the invention.
  • the invention is therefore in no way limited to the examples explained here.
  • the above invention is not limited to the exact construction and the exemplary embodiments given, but a wide variety of modifications are possible without deviations from the concept and scope of protection.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Peptidhormon-Aktivitäten oder der Steroidhormon-Aktivitäten eines Materials oder Stoffgemisches, mit: (a) Vorlegen mindestens einer Ausgangszelle mit oder ohne endogene Peptidhormon-Rezeptoren oder Steroidhormon-Rezeptoren; (b) Transfektion der Zelle mit einem spezifischen rekombinanten Reportergen-Konstrukt, das die Fähigkeit besitzt, ein durch die Hormon-Aktivität des Materials induziertes meßbares Produkt zu exprimieren; (c) Einbringen eines zu untersuchenden Materials in die transfizierte Zelle; (d) Herstellung eines leicht bestimmbaren Signal-gebenden Reportergen-Translationsprodukts durch die transfizierte Zelle mittels der induktiven Wirkung des Materials auf den dem Reportergen vorgeschalteten Hormon-reaktiven Promoter; (e) Messen des Reportegen-Translationsprodukts der tranfizierten Zelle und (f) Bestimmen der Hormon-Aktivität des Materials aus dem Meßergebnis.

Description

Verfahren zur Bestimmung der Peptidhormon-Aktivitäten oder der Steroidhormon- Aktivitäten eines Materials oder Stoffgemisches
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Qualifizierung und Quantifizierung von ago- nistischen und antagonistischen Hormon-Aktivitäten eines Materials, einen Bioas- say, sowie die Verwendung desselben.
Hormone sind bioaktive Signalmoleküle, die in spezialisierten, sog. endokrinen Zellen eines jeden Organismus synthetisiert, i.d.R. in das Blut abgegeben werden und bestimmte biologische Effekte auslösen, indem sie hochaffin und hochspezifisch an Rezeptoren von Zielzellen reversibel binden; dadurch wird das Hormonsignal in die Zelle weitergeleitet. Neben den Peptidhormonen (z.B. Insulin, Schilddrüsenhormone, Adrenalin) sind die Steroidhormone, wozu hauptsächlich die Glucocorticoide, Mineralocorticoide, Androgene (incl. androgene Anabolika, "Dopingmittel"), Estro- gene und Gestagene gehören, die wichtigsten Hormone für fast alle Lebewesen. Sie regeln Wachstum, körperliche Ausbildung und sind unentbehrlich für Ablauf und Aufrechterhaltung lebenswichtiger physiologischer und biologischer Funktionen, z.B. der Reproduktion.
Die Konzentrationsbestimmung der verschiedenen Peptid- und Steroidhormone - natürlichen und synthetischen -, im Serum und anderen Körperflüssigkeiten von Patienten ist diagnostisch von großer Bedeutung. Sie gehört zum klinischen Alltag, da sie bei vielen gesundheitlichen Störungen und Krankheiten therapeutisch und auch zur Regulation physiologischer Prozesse (z.B. die "Antibabypille") eingesetzt werden. Auch wird mit gewissen Steroiden erheblicher Mißbrauch getrieben, z.B. mit den zahlreichen synthetischen, als Anabolika wirkenden Androgenabkömmlin- gen, die von vielen Hochleistungssportlern als Dopingmittel eingenommen werden; daher dient ihr Nachweis im Serum zur Dopingkontrolle.
Schließlich werden Steroide in nicht unerheblichen Mengen bei der Tiermast eingesetzt - es ist daher auch wichtig, schnell und problemlos feststellen zu können, ob diese meist unerlaubten Mittel eingesetzt wurden und dann in den menschlichen Verzehr gelangen.
Bezüglich der biologischen Aktivität - sowohl als Agonisten als auch als Antagoni- sten - von Peptid- oder Steroidhormon-aktivem Material muß berücksichtigt werden, daß nicht nur Peptidhormone und Steroidhormone im eigentlichen Sinne biologisch wirken, also - chemisch definiert - Aminosäuren-Oligo- und Polymer-, bzw. Cyclppentanoperhydrophenanthren-Derivate. Oft sind auch Substanzen wirksam, die nur teilweise oder gar nicht diesen chemischen Stoffklassen entsprechen, aber dennoch offensichtlich an die entsprechenden Hormon-Rezeptoren binden. Die biologische Wirkung derartiger Materialien ist ebenfalls äußerst wichtig, kann sie doch z.B. zu grundlegenden Problemen in der biologischen Signalkette führen, wie durch verschiedene Weichmacher, Pestizide etc. bekannt. Von besonderer Bedeutung sind hierbei zahlreiche Stoffe aus der natürlichen und technischen Umwelt, die Estrogen-aktiv sind, obwohl sie chemisch nicht zu den Steroiden gehören; einzelne Komponenten in Stoffgemischen können sogar, in Kombination, synergistisch wirken. Es ist daher ebenfalls äußerst erwünscht, die hormoneile Aktivität derartiger Materialien bereits im Vorfeld - vor dem Einsatz - oder solcher schon im Einsatz befindlichen Stoffe erkennen zu können.
Obwohl die Erfindung beispielhaft anhand der Bestimmung der biologischen Wirkung von Steroidhormonen, insbesonders von Glucocorticoid-, Androgen- und Estrogen-aktiven Steroiden, nachfolgend näher erläutert wird, ist zu berücksichtigen, daß sie keinesfalls auf Steroidhormone beschränkt ist, sondern allgemein für die Bestimmung der Steroid- und Peptidhormon-typischen Wirkungen von Materialien einsetzbar ist.
Es ist von vielen Stoffen, insbesondere auch Hormonen, bekannt, daß ihre biologische Aktivität mit der absoluten Konzentration derselben nicht unbedingt gleichzusetzen ist. Häufig sind Teilmengen dieser Stoffe durch Komplexe mit Proteinen oder dgl. oder aber durch Annahme einer anderen Konfiguration inaktiviert oder auch stärker aktiv; z.B. ist von den Schilddrüsenhormonen bekannt, daß diese je nach Bindung an Proteine unterschiedlich wirksam sind. Andere Einflüsse - z.B der pH- Wert oder Metallionen können ebenfalls die Wirkung von Materialien im menschlichen oder tierischen Körper stark beeinflussen. Somit muß zwischen „freien" und „gebundenen" Hormonen und ihren Bestandteilen unterschieden werden, die sodann die Aktivität bestimmen.
Entscheidend bei der Ermittlung eines sog. Hormonstatus und ggf. seiner Dynamik sowie der daraus folgenden diagnostischen und therapeutischen Konsequenzen ist also nicht die Menge oder Konzentration der jeweiligen Peptid- oder Steroidhormone, sondern ihre Aktivität, also Art und Ausmaß der biologischen Wirkung, die z.B. durch die Dissoziationskonstanten von Ligand-Rezeptor-Komplex, aber auch durch viele, andere Faktoren, etwa das Vorliegen von Transportproteinen etc., beeinflußt wird.
Zum besseren Verständnis der Erfindung und beispielhaft soll zunächst das Wirkprinzip der Steroidhormone erläutert werden. Diese vermitteln ihre Wirkung maßgeblich über für die jeweiligen Steroidhormon-Klassen spezifischen Rezeptoren, die nach herrschender Lehrmeinung sich innerhalb der Zielzellen befinden. (Die Rezeptoren für Peptidhormone sind dagegen auf oder in der Zellmembran, also der Zellaußenhülle lokalisiert). Sie bilden dabei einen sehr bindungsfesten Rezeptor- Steroid Komplex. Diese Komplexbildung ist ein wesentliches Glied in der hormonabhängigen Signalkette, welche zum hormonspezifischen Effekt führt (s.u.). Beispiele für Steroidhormonrezeptoren sind - wobei diese Aufzählung keineswegs einschränkend ist, sondern nur der Erläuterung dienen soll: der Glucocorti- coidrezeptor (GR), der das Glucocorticoid Cortisol bindet; der Androgenrezeptor (AR), der das männliche Geschlechtshormon Testosteron sowie diverse synthetische Steroidhormon-Analoga, wie Anabolika, bindet; die Estrogenrezeptoren - ERα und ERß - die das weibliche Geschlechtshormon Estradiol, aber auch synthetische Estrogene (z.B. Komponenten der "Anti-Babypille") und andere Stoffe mit Estrogener Aktivität binden; der Mineralocorticoidrezeptor (MR) und der Progesteronrezeptor (PR), welcher Aldosteron bzw. natürliche sowie synthetische Gesta- gene erkennt. Die Bindung des Steroids an den Rezeptor bewirkt, daß dieser zum Zellkern wandert und sich an spezifische DNA-Abschnitte des Zellkerns bindet, die "hormone responsive elements" (HRE) genannt werden. Diese HRE, Bestandteile eines sog. Promoters, aktivieren nun lokal daran anschließende Gene (die als HRE- "downstream"-Gene bezeichnet werden), welche für spezifische Proteine (z.B. Enzyme) codieren und deren Bildung induzieren. So veranlaßt z. B. das Steroid- hormon Cortisol in der Leberzelle die Bildung des essentiellen Enzyms Tyrosinami- notransferase; das Estradiol die des PR oder die von Transcortin (unentbehrliches Transportprotein für Glucocorticoide im Blut).
Erstaunlicherweise wird allgemein - u. a. in der klinischen Diagnostik und der Dopingkontrolle - z.Zt. nur die Konzentration der Steroidhormone bzw. der Anabolika bestimmt; die Bestimmung der Aktivität derartiger Steroidhormone war bisher nicht üblich und entsprechende Bestimmungsverfahrenn sind unbekannt, obwohl sie biologisch/medizinisch viel sinnvoller sind als die o.a. gängige Praxis. Von Burdge OB. et. a/.: "Determination ofoestrogen concentrations in bovine plasma by a recombinant oestrogen receptor-reporter gene yeast bioassay", Analyst, 123 (1998), 2585-2588, wurde vorgeschlagen, mittels einer Hefezellinie, stabil transfiziert mit einem Estrogenrezeptor-Galactosidase Reportergenkonstrukt, Estrogenkonzentrationen im Serum von Rindern zu bestimmen ("Recombinant Cell Yeast Bioassay - RCBA"). Auch hier wird, wie in der allgemeinen klinischen Diagnostik üblich, nur die Konzentration eines einzigen Steroidhormons, nämlich von 17ß-Estradiol, bestimmt.
Es ist Aufgabe der Erfindung, Mittel zur Bestimmung von Hormon-Aktivitäten eines Materials anzugeben.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruches 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen. Ferner betrifft die Erfindung auch ein Bestimmungs-Assay für die Hormonaktivitäten von Materialien nach Patentanspruch 9. Es wird also durchgeführt:
1. Auswahl und Vorlegen einer geeigneten Zelle - entweder a) mit endogenem Hormon-Rezeptor, die transient oder stabil mit einem rekombinanten Hormon-sensitiven Reportergen-Konstrukt (Reporter-Expressionsplasmid), bzw. zusätzlich mit einem rekombinanten spezifischen Hormon-Rezeptor Expressionsplasmid mono- oder ko-tranfiziert wird, oder b)ohne endogenen Hormon-Rezeptor, die transient oder stabil mit einem rekombinanten Hormon-sensitiven Reportergen-Konstrukt und einem rekombinanten spezifischen Hormon-Rezeptor Expressionsplasmid ko-tranfiziert wird, die dann - im Falle a) oder b) - als transfizierte Zelle ein signalgebendes, leicht meßbares Produkt exprimieren kann.
2. Einbringen eines Materials oder Materialgemisches mit bekannter oder vermuteter Hormonaktivität in die transfizierte Zelle, i.d.R durch Zugabe zum Zellkultur- Medium.
3. Durch das Material mittels des Hormon-Rezeptors bewirkte Induktion des signalgebenden Reportergen-Translationsprodukts der Zelle.
4. Messen des o.a. Produkts, ggfs. nach geeigneter Aufbereitung der transfizierten Zellen in an sich bekannter Weise.
5. Analyse: die Menge des gebildeten (= induzierten) Translationsprodukts ist direkt proportional zur Stärke der jeweiligen Hormonaktivität des untersuchten Materials. Im Zusammenhang mit dieser Anmeldung bedeutet transiente Transfektion das Einbringen von Fremd-DNA in die Zelle, entweder in ihr Cytoplasma nur für die Dauer eines Zellzyklus, stabile Transfektion bedeutet das dauerhafte Einbringen von Fremd-DNA in ihr Genom. Als Vehikel dienen i.d.R. gentechnisch veränderte (rekombinante) Plasmide [AA1]("cloning vectors"), welche die genetische Bauanweisung für das gewünschte Reporter-Protein oder den spezifischen Hormon- Rezeptor enthalten. Vorgeschaltet ist diesen Genen jeweils ein bestimmter Promoter. Dieser kann entweder ein konstitutiver Promoter (z.B. mit SV40 oder Tk (Thymidinkinase) im Rezeptor-Expressionsplasmid) sein, der permanente Expression, oder ein induzierbarer Promoter sein (z.B. mit HRE im Reporter-Expres- sionsplasmid), der anregbare (z.B. durch ein Hormon) Expression des nachgeschalteten (Fremd-)Gens bewirkt.
Da hohe Transfektionseffizienz eine wichtige Bedingung für verläßliche Anwendung der Erfindung bedeutet, ist dem Fachmann offensichtlich, daß ein möglichst effektives Transfektionsverfahren eingesetzt werden sollte. Z.Zt. ist die bevorzugte, sehr effektive Transfektionsverfahren die sog. "Non-Recombinant Adenovirus-Polylysin"- Technik. Sie ist, z.B., veröffentlicht von Sommer B. et al.: "Efficient gene transfer into normal human skeletal cells using recombinant adenovirus and conjugated adenovirus-DNA complexes", Calcif. Tissue Int., 64 (1999), 45-49. Diese Methode ist insbes. angezeigt bei der Transfektion von ausdifferenzierten eukaryontischen Zellen mit endogenem Hormon-Rezeptor gemäß Punkt 1. a), da diese, im Gegensatz zu den in Punkt 1. b) definierten Zellinien ohne endogenen Hormon-Rezeptor, mit konventionellen Transfektionstechniken nicht hinreichend effektiv transfizierbar sind. Vorteilhafterweise ist dieses Verfahren z.Zt. in Deutschland genrechtlich nur S1-pflichtig, im Gegensatz zur S2-Pflichtigkeit der "Recombinant Adenovirus"- Transfektionstechnik.
Das Prinzip der Erfindung sei beispielhaft, jedoch nicht einschränkend, für Materialien mit Steroidhormon-Aktivität erläutert. Die hormonaktive Komponente(n) des Materials, im folgenden "Ligand" genannt, bildet nach Einbringen in die transfizierte Zelle - (z.B. durch Zugabe des Materials in das Zellkulturmedium) - mit dem endogenen und/oder rekombinanten Steroidrezeptor (z.B. Glucocorticoidrezeptor, Estrogenrezeptor, Androgenrezeptor, Mineralocorticoidrezeptor, Progesteronrezeptor, etc.) einen bindungsfesten Ligand-Rezeptorkomplex. Dieser bindet nicht nur an die HRE-Sequenzen der DNA im Zellkern, sondern auch an die des Promoters im Reporter-Expressionsplasmid, wodurch das nachgeschaltete Gen das Reporterprotein exprimiert. Wesentlich ist, daß diese Reporterproteine in eu- karyontischen Zellen, wie sie hier verwendet werden, natürlicherweise nicht vorkommen, wodurch die gebildete Menge ein direktes quantitatives Maß darstellt für die Hormon-Aktivität des untersuchten Materials. Bewährte Beispiele für solche Reporterproteine sind die Enzyme Luciferase und ß-Galactosidase oder Green-, Red-, Yellow-Fluorescent Proteine (GFP, RFP, YFP), die leicht durch bestehende Vorrichtungen, anhand etablierter Protokolle und mit kommerziell erhältlichen Kits, Lumineszenzreaktion im Luminometer bzw. Fluoreszenzreaktion im FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting), quantifiziert werden können. Als übliches Protokoll zur Luciferase-Messung wird das "Dual-Luciferase™ Reporter Assay System" verwendet (erhältlich von der Fa. Promega, Madison, Wl, USA; cat. no. E1916), das eine Standardisierung der Enzymbestimmung auf der Basis der Anzahl der erfolgreich transfizierten Zellen (mittels Messung der konstitutiv exprimierten Renilla-Luciferase) ermöglicht. Bei der Bestimmung von GFP, RFP und YFP im FACS-Gerät (z.B. FACSCalibur, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg) geschieht die Standardisierung dadurch, daß das Fluoreszenz-Signal nur von erfolgreich transfizierten Zellen ausgesendet werden kann.
Manche Zellen mit endogenem Hormonrezeptor gemäß 1. a) enthalten verschiedene endogene Hormon-Rezeptoren: HepG2 sowie CC-1 , HTC und sonstige „hepatoma tissue cells" (Nicht-Hepatoma- bzw. Hepatoma-Linien der Menschenoder Rattenleber) z.B. enthalten Glucocorticoid-Rezeptor und Estrogenrezeptor; MCF-7 (humane Brustkrebs-Zellinie) sogar Estrogenrezeptor, Glucocorticoid-Rezeptor und Androgenrezeptor. Soll jedoch beim zu untersuchenden Material zwischen verschiedenen Qualitäten der Steroidhormon-Aktivitäten diskriminiert werden, z.B. Glucocorticoid-, Estrogen-, Androgen-, Mineralocorticoid- oder Gestagen- Aktivität, etc., so kommen deshalb Zellen ohne endogenen Hormonrezeptor gemäß 1. b) zum Einsatz; diese werden mit dem jeweiligen Hormon-Rezeptor Expressionsplasmid, also einen für den Glucocorticoidrezeptor-, Estrogenrezeptor-, Androgenrezeptor-, Mineralocorticoidrezeptor, Progesteronrezeptor, etc- codierenden Konstrukt (pGR, etc.), transfiziert. Das jeweils geeignete hormonsensitive Reportergen-Plasmid für alle aufgeführten Aktivitäts-Qualitäten, ausgenommen die Estrogen-aktiven Materialien, ist, z.B., GRE („glucocorticoid re- sponsive elements")-Luc mit einem GRE2-TATA Promoter, das für Luciferase codiert; dieses Plasmid (pLCO546A) - auch generell als Vektor bezeichnet - reagiert deutlich sensitiver und damit stärker auf induzierende Stoffe mit Hormon-Aktivität als das üblicherweise verwendete Plasmid mit einem MMTV-GRE Promoter. Für Estrogen-aktive Materialien eignet sich, z.B., ERE-Luc mit einem ERE-TATA Promoter, das ebenfalls für Luciferase codiert. Geeignete Zellen/Zellinien i.d.S., also ohne jegliche endogene Hormon-Rezeptoren, sind z.B. CV-1 und COS-1, COS-7 (Affennierenzellen), und vor allem spezielle Hefezellinien, die sich nachweislich zur Expression verschiedener Genprodukte, inklusive diverser „steroid-like receptors", sehr bewährt haben (McEwan I. J.: "Investigation of steroid receptor function in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae", FEMS Microbiol. Lett. 179 (1999), 183- 4). Alle aufgeführten und weitere geeignete Zellinien, wie unter Punkt 1. a) und 1. b) definiert, sind bei verschiedenen Zellbanken kommerziell und mit genauer Definition erhältlich; beispielhaft seien einige bedeutende aufgeführt:
ATCC (American Type Culture Collection), 10801 University Boulevard, Manassas (VA), 20110-2209, USA
DSMZ (Human and Animal Cell Cultures), German Collection of Microorganisms & Cell Cultures, Mascheroder Weg 1b, Braunschweig, D-38124, Germany
ECACC (European Collection of Cell Cultures), CAMR Centre for Applied Microbio- logy & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP40JG, UK
Da Hefezellen im Gegensatz zu eukaryotischen Zellen eine Zellwand besitzen, eignet sich die o.a. Transfektionstechnik nicht. Um diese Zellen zu transfizieren, sind dem Fachmann ebenfalls Verfahren geläufig, z.B. die Lithium-Acetat Methode. (Gietz R.D. et "Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS- DNA/PEG procedure", Yeast, 11 (1995), 355-60.
Ko-Transfektion von Zellen (s. Punkt 1. a) mit einem Hormon-Rezeptor Expressionsplasmid verstärkt beträchtlich die Meß-Empfindlichkeit der transfizierten Zelle: es werden nämlich in der Zelle zusätzlich zu den natürlich vorhandenen ("endogenen") Steroidrezeptoren weitere, "rekombinante", d.h. Natur-identische, hergestellt. Dadurch sprechen die Zellen auf noch geringere Konzentrationen von Hormonaktiven Stoffen an und stellen insofern eine besonders empfindliche Meßanordnung dar. Ko-Transfektion i.d.S. ist daher ein wesentliches Element der Erfindung.
Der erfindungsgemäße Bioassay zur Qualifizierung und Quantifizierung von Stoffen/Molekülen und sonstigen Materialien bzgl., z.B., vermuteter Steroidhormon-Ak- tivität, Steroidhormon-Agonismus und eventuellem -Antagonismus ist auch noch aus einem weiteren Grund vorteilhaft und dem üblichen zur Stoffmengenbestimmung überlegen: wie schon oben erwähnt, gibt es zahlreiche natürlich vorkommende und aus der technischen Umwelt stammende Substanzen, bzw. chemische Verbindungen und deren oft unbekannte Metaboliten, mit Steroidhormon-Aktivität (z. B. Phyto-Estrogene, Pestizide sowie DDT und dessen immer noch ubiquitär vorkommenden chemischen Abkömmlinge, die wie Estrogene wirken). Zu den wahrscheinlich häufigen und wichtigen Verwendungen der Erfindung gehört die zur Ermittlung von:
1. bekannten und auch unbekannten Androgenabkömmlingen, z.B. Anabolika, welche von vielen Hochleistungssportlern als Dopingmittel eingenommen werden.
2. Estrogenaktiven Einzelmaterialien und/oder Stoffgemischen physiologischer Herkunft (z.B. im Serum von Menschen und Rindern), in Nahrungsmitteln, Kosmetika und sonstigen pharmazeutischen Produkten sowie in manchen technisch-synthetischen "Permanent Organic Pollutants" (POP).
Für beide Anwendungen böten sich, z.B., COS-1 , COS-7, HeLa (undifferenzierte, aneuploide Zellinie aus einem stark wachsendem humanen Zervix-Carcinom), MCF- 7, CHO („Chinese Λamster ovary cells") Zellen, insbes. auch Hefezellinien (s.o.) an, die mit einem Androgenrezeptor-, bzw. Estrogenrezeptor-codierenden Expressionsplasmid und einem Luciferase-Reportergen-Konstrukt, das einen GRE2-TATA, bzw. ERE-TATA Promoter enthält ko-tranfiziert werden. Das Prinzip der Anwendung und Durchführung des Assays sind wie oben beschrieben.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand einiger spezieller Beispiele sowie der begleitenden Zeichnung erläutert, die das Verständnis der Erfindung verbessern sollen; sie ist jedoch keineswegs auf diese eingeschränkt. Im Folgenden bedeutet die Beschriftung der Y-Achse mit "Luc-I" oder "GFP-I" (Fig. 10) stets: x-fache Induktion (gegenüber Kontrolle, d.h. ohne Zugabe des hormonaktiven Materials zu den Zellen) der Luciferase, bzw. des Green-Fluorescent Protein. Darin zeigt:
Fig. 1 : Androgen-induzierte Luciferase-Aktivität in humanen Genitalhautfibroblasten (GHF) in Kultur, die mit drei verschiedenen Luciferase-Gen Konstrukten von unter- schiedlicher Androgen-Sensitivität ("Luc") transfiziert waren: PRE2-Tk-Luc, MMTV- Luc, GRE2-TATA-Luc
Fig. 2: Dosis-Wirkung Beziehung eines Steroidhormones mit bekannter Glucocorticoid (GC)-Aktivität: Corticosteron-induzierte Luciferase-Aktivität in CC1 -Zellen ohne (o) und mit (■) Ko-expression des Glucocorticoid-Rezeptors
Fig. 2a: Unterschiedliche Dosis-Wirkung Beziehung eines vermeintlich inaktiven Steroidhormones: 21-Hemisuccinat-Corticosteron:BSA-induzierte Luciferase-Aktivität in CC1 und MH 3924-Zellen ohne (-Co) und mit Ko-expression (+Co) des Glucocorticoid-Rezeptors
Fig. 3: Induktionszeit-abhängige Dosis-Wirkung Beziehung eines GC-aktiven Steroidhormones: Corticosteron-induzierte Luciferase-Aktivität für verschiedene Induktionszeiten in CC1 -Zellen
Fig. 4: Induktionszeit-abhängige Dosis-Wirkung Beziehung eines vermeintlich inaktiven Steroidhormones: 21-Hemisuccinat-Corticosteron:BSA-induzierte Luciferase- Aktivität in CC1 -Zellen
Fig. 4a: r ι//zze/ϊ-lnduktion abhängige Dosis-Wirkung Beziehung eines vermeintlich /naktiven Steroidhormones: 21-Hemisuccinat-Corticosteron:BSA-induzierte Luciferase-Aktivität in MH 3924-Zellen
Fig. 5: Induktionszeit-abhängige Wirkung von Steroid-Derivaten mit schwacher und starker GC-Aktivität: Induktion der Luciferase-Aktivität in CC1 -Zellen durch 3-CMO- Corticosteron:BSA bzw. 21-Hemisuccinat-Corticosteron:BSA
Fig. 6: Induktionszeit-abhängige Dosis-Wirkung Beziehung eines Steroidhormones mit n/cM-bekannter GC-Aktivität: Induktion der Luciferase-Aktivität in CC1 -Zellen durch 6α-Methyl-17α-Hydroxy-Progesterons (Medroxyprogesteron)
Fig. 7: Dosis-Wirkung Beziehung diverser Steroidhormone mit unterschiedlich starker GC-Aktivität: Induktion der Luciferase-Aktivität durch Corticosteron (B), Medroxyprogesteron (MP), Östron (E1), Progesteron (P) und 17α-21-Dihydroxy- Progesteron (Cortex) in CC1 -Zellen Fig. 8: Dosis-Wirkung Beziehung diverser Steroidhormone mit unterschiedlich starker GC-Aktivität: Induktion der Luciferase-Aktivität durch Corticosteron (B), Medroxyprogesteron (MP), Östron (E1), Progesteron (P) und 17α-21-Dihydroxy- Progesteron (Cortex ) in MH 3924 Zellen
Fig. 9: Antagonistische Wirkung eines synthetischen Steroidhormons auf die GC- Aktivität: Hemmung der durch Corticosteron (B) und 21-Hemisuccinat-Cortico- steron:BSA (B:BSA) in CC1 -Zellen induzierten Luciferase-Aktivität durch RU 486 (Mifepristone™)
Fig. 10: Dosis-Wirkung Beziehung GC-aktiver Steroidhormone: Corticosteron (B) und 21-Hemisuccinat-Corticosteron:BSA (B:BSA)-induzierte Green-Fluorescent- Protein (GFP)-Aktivität in MH 3924-Zellen, stabil mit einem MMTV-GFP-Reporter- gen-Konstrukt und transient transfiziert mit einem Glucocorticoid-Rezeptor-Expres- sionsplasmid
Als transiente Transfektions-Methode der in den Fig. 1 - 10 dargestellten Versuche wurde stets die "Non-Recombinant Adenovirus-Polylysin"-Technik eingesetzt.
Fig. 11 : Dosis-Wirkung Beziehung eines synthetischen Androgens mit anaboler Wirksamkeit: Induktion der Luciferase-Aktivität durch R1881 (Methyltrienolon) in HeLa-Zellen, ko-transfiziert mit einem Androgen-Rezeptor-Expressionsplasmid Bei diesem Versuch wurde als Transfektionsmethode die DOTAP-Methode (Fa Boehringer, Mannheim, Deutschland) eingesetzt.
Fig. 12: Estrogen-Aktivitätsbestimmung von E2 und E1 durch ko-transfizierte COS-1 Zellen (Bsp.13) Bei den COS-1 -Zellen wurde als transiente Transfektionsmethode die Superfect Methode der Fa. Qiagen, USA eingesetzt.
Fig. 13: Androgen-Aktivitätsbestimmun von Testosteron mit ko-transfizierten COS-1 Zellen (Bsp. 14)
Beispiel 1 :
Empfindlichkeit von Assays mit Zellen, transfiziert mit unterschiedlich starken An- drogen-sensitiven Reporterαen-Konstrukten Wie in Fig. 1 gezeigt, wurden humane Genitalhautfibroblasten (GHF) in Kultur mit drei verschiedenen Luciferasegen-Konstrukten ("Luc") mit Glucocorticoid-Respon- sive Element-Promotern (GRE-Promotem) von unterschiedlicher Androgen-Sensiti- vität transient transfiziert. (GRE, Glucocorticoid-Responsive-EIements, sind in ihrer Nukleotidsequenz mit PRE, "Progesterone Responsive Elements", und mit ARE, "Androgen Responsive Elements", identisch). GHF enthalten als Steroidhormon- Rezeptoren nur Androgenrezeptoren (AR). Das in diesem Versuch eingesetzte Miboleron ist ein synthetisches anabol wirkendes Androgen. Ganz offensichtlich wird durch die Zugabe von Miboleron in einer Konzentration von 2 nM 24h nach erfolgter Transfektion - je nach Herkunft der GHF (Patienten mit Phimose, VHF, oder mit Androgenresistenz, AR und P1 ), - eine unterschiedlich starke Luciferase- Aktivität gefunden, wobei diese aus den drei Promotoren unterschiedlicher Andro- gen-induzierbarer Stärke resultierte. Es wird deutlich, daß bei den hier verwendeten Reportergen-Konstrukten GRE2-TATA-Luc das empfindlichste Reportergen-Konstrukt ist. (s. zum Vergleich auch Beispiel 10, mit einem MMTV-Promoter Reportergen-Konstrukt sowie Fig. 10).
Beispiel 2
Assay zur Bestimmung der Glucocorticoid-Aktivität in CC1- und MH 3924-Zellen ohne und mit Ko-Transfektion
In Fig. 2. ist mittels GRE2-TATA-Luc transient transfizierter CC-1- (diese enthalten nendogen neben ER auch FR) oder MH 3924- Zellen in Kultur die Bestimmung der Glucocorticoid-Aktivität von Corticosteron sowie von an Rinder-Serumalbumin (BSA: "bovine serum albumin") gekoppeltes Corticosteronderivat (s. Fig. 4) gezeigt; diese Zellinien enthalten endogene Glucocorticoid-Rezeptoren. Die Steroidkonzentration - hier Corticosterononzentration - bestimmt dabei das Ausmaß der Glucocorticoid- Aktivität. Es wird deutlich, daß Ko-Transfektion mit einem rekombinanten Glucocorticoid-Rezeptor-Expressionsplasmid die Meß-Empfindlichkeit der Zellen beträchtlich erhöht (s. auch Fig. 2a); letztere kann auch verbessert werden durch die Wahl einer empfindlicheren Zellinie (Fig. 2a). nM (10"9) bedeutet nanoMol/Liter. Induktionsdauer: 24 h (s. a. Beispiel 12).
Daher betreffen die nachfolgenden Beispiele stets transient ko-transfizierte CC1 oder MH 3924 Zellen. Beispiel 3:
Assay zur Bestimmung der Glucocorticoid-Aktivität mit CC1 -Zellen: Einfluß der
Hormonkonzentration und der Induktionszeit
Aus Fig. 3 ist ersichtlich, daß das Meßsystem "ko-transfizierte Zelle" so empfindlich ist, daß Materialien - hier Corticosteron - die ihnen innewohnende Hormonaktivität entweder bei langer Induktionszeit (z.B. 24 h) schon bei sehr niedrigen Konzentrationen, oder in höheren Konzentrationen bei sehr kurzer Induktionszeit (z.B. 10 min) offenbaren.
Beispiel 4
Assay zur Bestimmung der Glucocorticoid-Aktivität eines Corticosteronderivats mit
CC1- und MH 3924-Zellen
In Fig. 4a ist - wie in Fig. 2a - gezeigt, wie ko-transfizierte CC1 -Zellen durch ein an Rinder-Serumalbumin (BSA: "bovine serum albumin") gekoppeltes Corticosteronde- rivat, das allgemein als Glucocorticoid-inaktiv gilt, Luciferase induzieren. Es ist gesichert, daß für die hier nachgewiesene Glucocorticoid-Aktivität nicht freie Cortico- steron-Moleküle innerhalb dieser Formulierung verantwortlich sind. Somit kann durch den erfindungsgemäßen Assay selbst eine geringe Glucocorticoidartige Aktivität nachgewiesen werden. Dies ergibt sich auch aus Fig. 4a, wo mit transfizierten MH 3924-Zellen bereits nach einer Kurzzeit-Induktion von 10 bis 30 min schon mit sehr geringer Konzentration Corticosteron: BSA (< 50 nM) eine leicht meßbare Luciferase-Induktion gemessen werden kann.
Beispiel 5
Assay zur Bestimmung der Glucocorticoid-Aktivität von zwei verschiedenen Cortico- steronderivaten mit CCI-Zellen
In Fig. 5 ist gezeigt, wie mit CC1- Zellen gemäß Beispiel 4 ein Vergleich von zwei verschiedenen, als inaktiv eingestuften Corticosteron :BSA-Derivaten (21 :BSA, 3:BSA; je 200 nM) mit starker und schwacher Glucocorticoid-Aktivität möglich ist. Der Unterschied wird besonders deutlich bei langer Induktionszeit. Es ist ersichtlich, daß offensichtlich bereits geringe Unterschiede in der Aktivität der beiden Steroidderivate mittels des erfindungsgemäßen Assay innerhalb relativ kurzer Be- Stimmungsdauern bestimmbar sind, wie es z.B. für "Doping"-Tests oder aber für Schnelltests erwünscht ist.
Beispiel 6
Assay zur Bestimmung der Glucocorticoid-Aktivität eines synthetischen Gestagens mit CC1 -Zellen
Hier wurde das synthetische Gestagen Medroxyprogesteron (6α-Methyl-17α- Hydroxy-Progesteron) mit CC1 -Zellen untersucht. Überraschenderweise zeigte sich eine Glucocorticoid-Aktivität dieser Substanz, von der bisher eine solche Hormon- Aktivität nicht bekannt war. Dieses Gestagen wird vor allem klinisch bei Hormon-abhängigen Tumoren und bei Endometriose, aber auch in der "Hormonersatztherapie" bei postmenopausalen Frauen eingesetzt, und ist auch Bestandteil in manchen Depotformen oraler Kontrazeptiva. Diese mittels des erfindungsgemäßen Assays bestimmbaren - unerwarteten - Hormonaktivitäten können Nebenwirkungen derartiger synthetischer Hormone vorhersagen bzw. dadurch ermittelt werden, was mit anderen Verfahren nur aufwendig oder unsicher feststellbar sind. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt.
Im übrigen wurde wie in Beispiel 5 verfahren - auch sind hier Induktionszeiten von 10 bis 30 min hinreichend.
Beispiel 7
Assay zur Bestimmung der Glucocorticoid-Aktivität diverser Steroidhormone mit
CC1 -Zellen
Fig. 7 zeigt einen Vergleich der Glucocorticoid-Aktivität diverser Steroidhormone bei verschiedenen Konzentrationen (Induktionszeit: 24 h). Erwartungsgemäß zeigte sich, daß Corticosteron (B) und Medroxyprogesteron (MP) - s. Beispiel 6 - stark aktiv sind, während das natürliche Estrogen Estron (E1) inaktiv ist. Hingegen zeigen die als Glucocorticoid-antagonistisch eingestuften natürlichen Gestagene Progesteron (P) und vor allem Cortexolon (17α-, 21-Dihydroxy-Progesteron) signifikante Glucocorticoid-Aktivität - s. a. Fig. 7a „höhere Sensitivität der MH 3924 Zellen".
Beispiel 8 Assay zur Bestimmung der Glucocorticoid-Aktivität diverser Steroidhormone mit MH
3924-Zellen
Die Bestimmung wurde wie bei Beispiel 7 durchgeführt, wobei jedoch MH 3924
Zellen eingesetzt wurden; diese reagieren deutlich sensitiver als CC-1 Zellen auf
Glucocorticoid-aktive Hormone. Dies wird besonders deutlich für Progesteron, aber auch für Corticosteron - s. Fig. 8 und auch Fig. 7a.
Beispiel 9
Assay zur Bestimmung der Glucocorticoid-antagonistischen Aktivität von Mifepri- stone mit CC1 -Zellen
In Fig. 9 ist der Glucocorticoid-Antagonismus von RU 38486, bekannt als Mifepri- stone, der wesentlichen Komponente der sog. „Abtreibungspille, gezeigt. Die Luciferase-induzierende Wirkung (Glucocorticoid-Agonismus) von Corticosteron und 21-Hemisuccinat-Corticosteron:BSA wird durch RU 38486 weitgehend blockiert - d.h. die Luciferase-Induktion ist gehemmt.
Beispiel 10:
Assay zur Bestimmung der Glucocorticoid-Aktivität mit stabil und transient transfizierten MH-3924-Zellen
Es wurden MH 3924 Zellen transient mit einem Glucocorticoidrezeptor-Expressions- plasmid und stabil mit einem GFP-Reportergen-Konstrukt, welches den MMTV-GRE Promoter enthält, ko-transfiziert. (Induktionszeit: 24 h). Das Ergebnis ist in Fig. 10 gezeigt Die erheblich geringere Sensitivität dieses Reportergens gegenüber GRE2- TATA-Luc wird deutlich aus dem Vergleich mit Fig. 3 und Fig. 4. (s. hierzu auch Fig.
1)-
Beispiel 11
Assay zur Bestimmung der Androgen-Aktivität eines synthetischen Androgens mit
HeLaZellen
In Fig. 11 ist die Bestimmung der Androgen-Aktivität von Methyltrienolon (R1881 ), einem synthetischen anabolisch wirkenden Androgen, mittels der Luciferase-Induktion in kultivierten HeLa Zellen gezeigt. Diese Androgenrezeptor-freie Zellinie wurde transient ko-transfiziert mit GRE2-TATA-Luc und einem rekombinanten Androgen- rezeptor-Expressionsplasmid. Die Hormon-Aktivität, d.h. die anabolische Potenz von R1881 , wird schon bei einer Konzentration von 10 pM erkennbar (pM (10"12) = pMol/l. Induktionsdauer: 24 h.. pM (10"12) bedeutet picoMol/Liter. Induktionsdauer: 24 h.
Beispiel 12
Bioassay mit CC-1 Zellen (permanente Zellinie aus Rattenleber)
Reportergenkonstrukt: GRE2-TATA-Luc (pLCO546A); Luciferase (Luc)-Gen mit einem minimalen Glucocorticoid-induzierbaren GRE-Promoter (GRE-TATA) Konstitutives Reportergen: Renilla-Luciferase (pRL-TK Vector) mit dem Herpes Simplex Virus Thymidinekinase (HSV-TK) Promoter (erhältlich von der Fa. Promega, Madison, Wl, USA),
GR-Expressionsplasmid: pSTC-rGR: für den GR der Ratte mit einem konstitutiven Cytomegalus Virus (CMV) Promoter
GC-Aktivität eines Stoffes: Corticosteron als Luc-induzierendes Hormon
Graphische Darstellung der Messergebnisse: Fig. 2 und Fig. 3
Hintergrund des Transfektionsverfahrens:
Dem Replikations-defekten Adenovirus Typ 5 (Adv5, strain DL-312), fehlen die "early region"-Gene E1a und E1b. Die Vermehrung der Viren fand in stabil transfizierten, die fehlenden Gene komplementierenden, humanen 293 embryonalen Nierenzellen (293-Zellen) statt. Nach Isolierung der Viren über eine CsCI-Dichtegra- dientenzentrifugation wurde poly-L-Lysin (pLys; Sigma, St. Louis, MO, USA) mit der 1-Ethyl-3-(dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC) Technik an die Virenkapsel ko- valent gebunden (Cristiano et al.: 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 90: 11548- 11552).
Zellkultur:
Als Nährmedium für die Kultivierung der Zellen wird DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium; erhältlich von der Fa Mediatech Inc. Unter der Marke cellgro® Park Centre, Herndon, Va, USA) mit 10% fötalem Kälberserum verwendet. Für transiente Transfektionen werden die Zellen aus konfluent bewachsenen Kulturschalen 24 Std. vor der Transfektion in 12er-Kulturplatten zu 2,5 * 105 Zellen pro Kavität umgesetzt. Während dieser 24 Std. wachsen die Zellen im Medium mit Steroidhormon-freiem fötales Kälberserum. Es wird transfiziert, wenn die Zellen eine Zelldichte von etwa 60 bis 90 % Konfluenz aufweisen.. Zur Transfektion wird das Medium nach einem Waschschritt mit Phosphatpuffer gegen 0,5 ml Medium ohne fötales Kälberserum gewechselt.
Bei der Transfektion wird das nachfolgende Pipettierschema angewendet:
Die Transfektionslösung pro Ansatz für eine Kavität wird in Polystyrol-Röhrchen wie folgt angesetzt:
- 14,2μl HEPES-Puffer, pH 7,3
- 0,5 μl GRE2-TATA-Luc- (100 ng/μl), rGR- (50 ng / μl) und pRL-TK- (5 ng/μl) DNA
- 2,25 μl Adenovirus-pLys-Lösung mit 5,7*1010 Partikeln/ml werden gemischt und 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach Zugabe von 7,55 μl pLys-HBS-Lösung in einem Gewichtsverhältnis DNA zu pLys von 1 :1 ,3 wird 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln erneut inkubiert.
Transfektion und Induktion:
Die Zellen werden zwei Std. mit 25 μl dieser Transfektionslösung inkubiert. Danach wird das Transfektionsmedium durch 1 ,5 ml frisches Medium ersetzt. Sofort bzw. nach zwei bis drei Std. wird zur Induktion der Luciferaseproduktion 12,5 μl Steroid- hormonlösung zugegeben. Leerwertansätze erhalten hormonfreies Phosphatpuffer mit 0,1 % Ethanol.
Für die Hormonlösungen werden die ethanolischen Stammlösungen in Glasgefäßen bei 50°C und 1 atm in einer Speed-Vac eingedampft, in 3 μl Ethanol resolubilisiert und mit Phosphatpuffer verdünnt. Die angegebenen Steroidkonzentrationen von 20 bis 1000 nM (Doppelwerte sind die End-Konzentrationen im Medium. Der ethanoli- sche Anteil beträgt nicht mehr als 0,1 %. Der Kontrollansatz (Doppelwert) enthält kein Hormon. Die Zellen werden maximal 24 Std. der Induktion durch Corticosteron ausgesetzt. Bei Kurzzeitinduktionen von 10, 30 oder 60 min wird das steroidhaltige Medium durch steroidfreies ersetzt. Die Zellen werden 48 Std. mit einem Medium- Wechsel und nach 24 Std. mit einer zweiten Hormongabe für 10, 30 oder 60 Min inkubiert. Schließlich werden die Zellen mit 200 μl Lysispuffer (s. folgenden Abschnitt) pro Kavität unter gelegentlichem Schwenken während 20 min bei Raumtemperatur lysiert. Die lysierten Zellen werden bis zur Messung der Luciferase-Aktivität in den Kulturplatten bei -80°C eingefroren.
Analyse der Reportersignale und Bestimmung der Luciferase-Aktivität:
Zur Messung der Luciferase-Aktivität wird das aufgetaute Lysat in Eppendorfgefäße überführt, 10 sec gevortext und 2 min bei 14000 x g und Raumtemperatur zentrifu- giert. Der Überstand wird abermals gevortext und dann im Enzymtest eingesetzt. Die Luc-Aktivität kann in einem beliebigen Luminometer gemessen werden, z.B. BIOLUMAT LB 95000 T (Fa. Berthold, Wildbad, Schwarzwald), und wird gemäß dem Protokoll für das "Dual-Luciferase Reporter Assay System" (erhältlich von der Fa. Promega, Madison, Wl, USA) durchgeführt.
Beim Enzymtest wird zunächst die Aktivität der Firefly-, sofort danach die der Renilla-Luciferase gemessen. Dazu werden 10 μl Lysat mit 50 μl LAR-Puffer gemischt, und die Lichtsignale nach 10fsec im Luminometer gemessen. Der Meßmodus wird auf 10 sec, 25° C, Integer eingestellt. Sofort anschließend werden 50 μl "Stop&Glow"-Puffer zugegeben, der Ansatz 5 sec kräftig gevortext und 10 sec nach Zugabe des Puffers erneut im Luminometer gemessen. Um den Background des Meßsystems zu bestimmen, wird die Messung der beiden Luciferasen mit Lysaten von Zellen, die entweder nur mit Firefly- oder nur mit Renilla-Luciferase-Reportergen transfiziert wurden, durchgeführt.
Die Induktion der Luciferasesynthese je Kulturansatz wird als ein Vielfaches der Firefly- pro Renilla-Luciferaseaktivität des Testansatzes, bezogen auf den entsprechenden Quotienten des Kontrollansatzes ohne Hormone, berechnet. Zur Standardisierung der Auswertung verschiedener Transfektions- und Induktionsversuche wird die x-fache Induktion jedes Ansatzes bezogen auf die des Ansatzes mit 100 nM Corticosteron. Für die Auswertung und bei den Darstellungen werden die Mittelwerte von Luc(Std) verwendet Die endgültigen Werte sind Ergebnis folgender Berechnung: 18
LucF+(100) * LucR-
(1) Luc (100)
LucF+(N) * LucR-
(2) LUC (N)
Luc (100) = Induktion von Luc durch 100 nM Corticosteron im Einzelexperiment, standardisiert Firefly-Luc / Renilla-Luc
Luc (N) = Induktion von Luc durch ungleich 100 nM Corticosteron im Einzelexperiment, standardisiert Firefly-Luc / Renilla-Luc
Luc (Std) = standardisierte Induktion von Luc im Einzelexperiment
Luc (F+) = Luc-Werte der Firefly-Luc mit variabler. Steroid(konzentration)
Luc (p.) = Luc-Werte der Firefly-Luc ohne Steroid
Luc (R+) = Luc-Werte der Renilla-Luc mit variabler. Steroid(konzentration)
Luc (R-) = Luc-Werte der Renilla-Luc ohne Steroid
Mw = Mittelwert
13. Bioassay mit COS-1 Zellen (permanente Zellinie aus Affenniere)
Transiente Transfektion: SuperFect Transfection Reagent Method (Reagenzien und Gebrauchsanweisung erhältlich von der Fa QIAGEN Inc. Valencia, CA, USA)
Reportergenkonstrukt: ERE-E1A-Luc; Luciferase (Luc)-Gen mit einem minimalen estrogen-induzierbaren ERE-Promoter (ERE-TATA) Konstitutives Reportergen: Renilla-Luciferase (pRL-TK Vector) mit dem Herpes simplex Virus Thymidinkinase (HSV-TK) Promoter (erhältlich von der Fa. Promega, Madison, Wl, USA.)
ER-Expressionsplasmid: pSTC-TK-hER: für den Estrogen-Rezeptor des Menschen mit einem konstitutiven Thymidinkinase (TK)Promoter
Estrogen-Aktivität von: 17ß -Estradiol, Estron als Luc-induzierende Stoffe
Estrogen-Antagonist: Tamoxifen als kompetitiver ER-Antagonist
Graphische Darstellung der Messergebnisse: s. Fig. 12
COS und CV Zellen haben keine endogenen Hormon-Rezeptoren und müssen daher, als Voraussetzung für die Durchführung des Boiassays, transient oder stabil mit einem rekombinanten spezifischen Hormon-Rezeptor Expressionsplasmid. ko- transfiziert werden
Hintergrund zu Transfektionsverfahren: Reagenzien und Gebrauchsanweisung erhältlich von der Fa QIAGEN Inc. Valencia, CA, USA.
Zellkultur:
Die Kultivierung der COS-1 Zellen erfolgt analog zu Beispiel 12
Pipettierschema, Transfektion und Induktion:
Die Verfahren werden strikt nach dem Protokoll "Protocol for Transient Transfection of Adherent Cells " (Reagenzien und Gebrauchsanweisung erhältlich von der Fa QIAGEN Inc. Valencia, CA, USA) durchgeführt. Für die Messansätze (Doppelwerte ) wird pro Kavität einer 12er-Kulturplatte, neben den laut o.a. Protokoll Mengen an SuperFect Transfection Reagent und DMEM-Medium, eine Mischung aus 1.5 μg ERE-E1A-Luc-, 1.5 μg pSTC-TK-hER- und 5 ng pRL-TK-DNA den COS-1 Zellen zugegeben. Die angegebenen Steroidkonzentrationen von 1 bis 1000 pM sowie die von Tamoxifen (5 μ) sind die End-Konzentrationen im Medium. Im übrigen wird hinsichtlich des Kontrollansatzes, 24 Std. Induktionsdauer, Lysis der Zellen, etc. das Verfahren wie in Beispiel 12 beschrieben, durchgeführt.
Die Analyse der Reportersignale und Bestimmung der Luciferase-Aktivität erfolgte analog Beispiel 12.
Beispiel 14
Bioassay mit COS-1 Zellen (permanente Zellinie aus Affenniere)
Transiente Transfektion: SuperFect Transfection Reagent Methode(Reagenzien und Gebrauchsanweisung erhältlich von der Fa QIAGEN Inc. Valencia, CA, USA)
Reportergenkonstrukt: GRE2-TATA-Luc (pLCO546A); Luciferase (Luc)-Gen mit einem minimalen Glucocorticoid-induzierbaren GRE-Promoter (GRE-TATA)
Konstitutives Reportergen: Renilla-Luciferase (pRL-TK Vector) mit dem Herpes simplex Virus Thymidinekinase (HSV-TK) Promoter (erhältlich von der Fa. Promega, Madison, Wl, USA)
AR-Expressionsplasmid: pSTC-hAR: für den AR des Menschen mit einem konstitu- tiven Cytomegalus Virus (CMV) Promoter
Androgen-Aktivität von Testosteron als Luc-induzierendes Hormon
Die Messergebnisse sind in Fig. 13 dargestellt.
Der gesamte Bioassay wird wie im Bsp. 13 durchgeführt. Die pro Kavität eingesetzten DNA-Mengen für das Reportergenkonstrukt, das AR-Expressionsplasmid sowie für das konstitutive Reportergen pRL-TK sind mit den dortselbst genannten identisch. Die Testosteronkonzentrationen von 100 pM bis 10 nM (Doppelwerte) sind die End-Konzentrationen im Medium.
Demzufolge kann - wie die aufgeführten Beispiele demonstrieren - durch die Wahl eines hochempfindlichen Reportergen-Konstrukts, hier z.B. GRE2-TATA-Luc, einer sehr sensitiven Zellinie, hier z.B. MH 3924 sowie zusätzliche Transfektion mit einem Hormonrezeptor-Expressionsplasmid, hier z.B. pGR, die Sensitivität des Meßsystems "transfizierte Zelle" dramatisch gesteigert werden. Das wird besonders deutlich erkennbar in Fig. 2a. vgl.: "CC-1, -Co" mit "MH, +Co".
Es sei darauf hingewiesen, daß die Zellinie MH 3924 (Bezugsquelle: PD Dr. Doris Mayer, AG Hormonwirkung und Signaltransduktion, FS Tumorzellregulation, Deutsches Krebsforschungszentrum, Im Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg) bzgl. ihrer hohen Sensitivität für Glucocorticoid-Agonisten nur stellvertretend für zahlreiche weitere Hepatomazellinien der Ratte und des Menschen (Bezugsquellen bsw. ATCC, DSMZ, ECACC - s.o.) steht).
Die beispielhaft aufgeführten Parameter stellen daher Optimierungselemente dar für einen Kit zur Anwendung des erfindungsgemäßen Bioassays zur Qualifizierung und Quantifizierung des Steroidhormon-Agonismus und eventuellen Antagonismus von Stoffen/Molekülen oder Materialgemischen, wobei dem Fachmann die Wahl der geeigneten Zellinien und der Reportergen-Konstrukte entsprechend den gestellten Anforderungen (Haltbarkeit, Empfindlichkeit, Spezifität etc.) aufgrund seines Fachwissens und entsprechend der Lehre der Erfindung möglich ist. Die Erfindung ist daher keineswegs auf die hier erläuterten Beispiele eingeschränkt. Selbstverständlich ist die obige Erfindung nicht auf die genaue Konstruktion und die beispielhaft angeführten Ausführungsformen beschränkt, sondern es sind unterschiedlichste Abänderungen ohne Abweichungen vom Gedanken und Schutzumfang möglich.

Claims

ANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Bestimmung der Peptidhormon-Aktivitäten oder der Steroidhormon-Aktivitäten eines Materials oder Stoffgemisches, gekennzeichnet durch:
a) Vorlegen mindestens einer Ausgangszelle mit oder ohne endogene
Peptidhormon-Rezeptoren oder Steroid hormon-Rezeptoren. b) Transfektion der Zelle mit einem spezifischen rekombinanten Reportergen-
Konstrukt, das die Fähigkeit besitzt, ein durch die Hormon-Aktivität des Materials induziertes meßbares Produkt zu exprimieren. c) Einbringen eines zu untersuchenden Materials in die transfizierte Zelle; d) Herstellung eines leicht bestimmbaren Signal-gebenden Reportergen- Translationsprodukts durch die transfizierte Zelle mittels der induktiven Wirkung des Materials auf den dem Reportergen vorgeschalteten Hormon-reaktiven Promoter; e) Messen des Reportergen-Translationsprodukts der tranfizierten Zelle und f) Bestimmen der Hormon-Aktivität des Materials aus dem Meßergebnis
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die transfizierte Zelle herstellbar ist durch: a) Vorlegen einer Ausgangszelle mit endogenen, die Hormon-Aktivität des Materials vermittelnden Hormonrezeptoren und b) Transfektion der Ausgangszelle mittels eines Vektors, welcher ein rekombinantes, für die jeweilige Hormonqualität reaktives Reportergenkonstrukt einbringt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß eine ko-transfizierte Zelle hergestellt wird durch:
a) Vorlegen einer Ausgangszelle mit oder ohne endogene Peptidhormon-Rezeptoren oder Steroidhormon-Rezeptoren, und b) Transfektion der Ausgangszelle mittels eines Vektors, welcher ein rekombinantes, für die jeweilige Hormonqualität reaktives Reportergenkonstrukt und ein für den jeweiligen Hormonrezeptor codierendes Expressionsplasmid in die Zelle einbringt.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das zu untersuchende Material ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Peptidhormonen, Steroidhormonen (z.B. natürlichen oder synthetischen Glucocorticoid-, Mineralocorticoid-, Androgen- (eingeschl. androgenen Anabolika), Estrogn-, Gestagen-Agonisten oder -Antagonisten) und sonstigen Materialien mit agonistischer oder antagonistischer Hormon-Aktivität.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangszelle eine nicht-pflanzliche eukaryontische Zelle oder eine Hefezelle ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportergen Teil eines estrognreaktiven Luciferase-Reprotergenkonstrukts ist, herstellbar durch:
Transfektion von Estrogn-Zielzellen (z.B. MC F7, Endometriumzellen - primäre Zellen und Zellinien - ) mit einem Luciferase-Reportergenkonstrukt (estrogen-responsive- Luc: Luciferase-Gen mit einem vorgeschalteten „minimal" estrogen-responsive- TATA-Promoter).
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportergen-Konstrukt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus z.B. Luciferase, ß-Galactosidase, ß-Glucuronidase, Green-, Red-, Yellow-Fluorescent Proteine (GFP, RFP, YFP).
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Transfektionsverfahren eine "non-recombinant adenovirus"-Polylysin- unterstützte Technik eingesetzt wird
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangs-Zelle z.B. eine HeLa-Urzelle (undifferenzierte, aneuploide Zellinie aus einem humanen squamous Epithel-Uterus Cevix-Carcinom), CV1 , COS (Affennierenzellen), LnCap (Lymphknoten-Zellen von Prostata-Carcinomen), MC7 eingesetzt wird.
10. Bestimmungs-Assay für die Hormonaktivität von Material, dadurch gekennzeichnet, daß es transfizierte Zellen nach einem der vorangehenden Ansprüche aufweist.
EP01982131A 2000-09-20 2001-09-20 Verfahren zur bestimmung der peptidhormon-aktivitäten oder der steroidhormon-aktivitäten eines materials oder stoffgemisches Withdrawn EP1325327A2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10046647A DE10046647A1 (de) 2000-09-20 2000-09-20 Verfahren zur Bestimmung der Peptidhormon-Aktivitäten oder der Steroidhormon-Aktivitäten eines Materials oder Stoffgemisches
DE10046647 2000-09-20
PCT/DE2001/003628 WO2002025278A2 (de) 2000-09-20 2001-09-20 Verfahren zur bestimmung der peptidhormon-aktivitäten oder der steroidhormon-aktivitäten eines materials oder stoffgemisches

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1325327A2 true EP1325327A2 (de) 2003-07-09

Family

ID=7657001

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP01982131A Withdrawn EP1325327A2 (de) 2000-09-20 2001-09-20 Verfahren zur bestimmung der peptidhormon-aktivitäten oder der steroidhormon-aktivitäten eines materials oder stoffgemisches

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20040023264A1 (de)
EP (1) EP1325327A2 (de)
AU (1) AU2002213808A1 (de)
DE (2) DE10046647A1 (de)
WO (1) WO2002025278A2 (de)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070004045A1 (en) * 2005-06-07 2007-01-04 Xia Xu Analysis of large numbers of estrogens and other steroids and applications thereof
US20090215111A1 (en) * 2005-06-07 2009-08-27 Veenstra Timothy D Analysis of steroid hormones in thin tissue sections
CN113801889B (zh) * 2021-09-18 2023-04-07 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 细胞筛选模型及其构建方法和应用、酵母菌及其制备方法和应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4138621A1 (de) * 1991-11-25 1993-06-17 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum screenen von substanzen mit modulierender wirkung auf einen rezeptorabhaengigen zellulaeren signaluebertragungsweg
US5445941A (en) * 1993-06-21 1995-08-29 Eli Lilly And Company Method for screening anti-osteoporosis agents
US6017924A (en) * 1996-06-27 2000-01-25 Ligand Pharmaceuticals Incorporated Androgen receptor modulator compounds and methods
EP1865060B1 (de) * 1996-07-12 2010-11-17 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Transkriptionaler Intermediärfaktor 2
US5728534A (en) * 1996-07-19 1998-03-17 New England Medical Center Hospitals, Inc. Methods for identifying cardiovascular therapeutic agents
US5929058A (en) * 1996-12-24 1999-07-27 Zymogenetics, Inc. Treatment agents and methods for treating type II diabetes and symptoms of type II diabetes
GB9720693D0 (en) * 1997-09-30 1997-11-26 Univ Wales Medicine Assay
CA2319167A1 (en) * 1998-02-12 1999-08-19 Prolifix Limited Interaction between cyclin d1 and steroid receptor co-activators
HUP0104719A3 (en) * 1998-12-18 2004-03-01 Wyeth Corp Bioassay for identifying estrogen receptor-betha/alfa selective modulators
US6291194B1 (en) * 2000-07-28 2001-09-18 Taneli Raivio Assay for determination of androgenic or anti-androgenic activity of a serum sample or a test compound

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO0225278A3 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE10194024D2 (de) 2003-10-02
US20040023264A1 (en) 2004-02-05
WO2002025278A2 (de) 2002-03-28
DE10046647A1 (de) 2002-03-28
AU2002213808A1 (en) 2002-04-02
WO2002025278A3 (de) 2002-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69334150T2 (de) Mutierte steroidhormonrezeptoren, methoden für ihre benutzung und molekularer schalter für gentherapie
ROTH Age-related changes in specific glucocorticoid binding by steroid-responsive tissues of rats
Davis et al. Correlation between low levels of estrogen receptors and estrogen responsiveness in two rat osteoblast‐like cell lines
Salhanick et al. Dexamethasone stimulates insulin receptor synthesis in cultured rat hepatocytes.
Pincas et al. Proximal cis-acting elements, including steroidogenic factor 1, mediate the efficiency of a distal enhancer in the promoter of the rat gonadotropin-releasing hormone receptor gene
DE60023261T2 (de) Verfahren zur untersuchung der wechselwirkung von substanz und hormonrezeptor
DE19723794A1 (de) Nichtestrogene Derivate des Estradiols mit antioxidativer Aktivität
EP1325327A2 (de) Verfahren zur bestimmung der peptidhormon-aktivitäten oder der steroidhormon-aktivitäten eines materials oder stoffgemisches
EP1255113B1 (de) Verfahren zur Testung des hormonellen Effekts von Substanzen
Knet et al. The effects of the environmental antiandrogen vinclozolin on the induction of granulosa cell apoptosis during follicular atresia in pigs
DE102006008074B4 (de) Behandlung von Krebs mit Geruchsrezeptor-Liganden
Shiizaki et al. Bioassay of phytoestrogen in herbal medicine used for postmenopausal disorder using transformed MCF‐7 cells
Dougherty et al. Comparison of the responsiveness of the pGL3 and pGL4 luciferase reporter vectors to steroid hormones
Sumida et al. Evaluation of in vitro methods for detecting the effects of various chemicals on the human progesterone receptor, with a focus on pyrethroid insecticides
Detlefsen et al. A high-affinity, low-capacity receptor for estradiol in normal and anemic mouse spleen cytosols
DE60030796T2 (de) Zelle zur Bestimmung der Fähigkeit die Aktivität eines Liganden-abhängigen Transkriptionskontrollfaktors zu kontrollieren
Gunnet et al. Characterization of the progestin receptors in the human TE85 and murine MC3T3-E1 osteoblast-like cell lines
DE60116109T2 (de) In vitro Screening nach Liganden des Östrogenrezeptors
New et al. Resistance to multiple steroids in two sisters
McEwen Steroid hormone effects on brain: Novel insights connecting cellular and molecular features of brain cells to behavior
EP1371988A2 (de) Verfahren zur Testung des hormonellen Effekts von Substanzen
EP1311851B1 (de) Screeningverfahren zur findung von die endocytose fördernden hilfsstoffen
DE19855013C2 (de) Androgen- und Progesteron-Rezeptor bindendes Hormon Response Element
Lewandowski Assoziationen zwischen der Einnahme oraler Kontrazeptiva und hämatologischen Parametern bei weiblichen Jugendlichen
Lee et al. Activation of the GDNF-inducible transcription factor (GIF) gene promoter by glucocorticoid and progesterone

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

AK Designated contracting states

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL LT LV MK RO SI

17P Request for examination filed

Effective date: 20030911

17Q First examination report despatched

Effective date: 20050412

RIN1 Information on inventor provided before grant (corrected)

Inventor name: DIE ERFINDER HABEN AUF IHRE NENNUNG VERZICHTET.

RIN1 Information on inventor provided before grant (corrected)

Inventor name: DAUFELDT, SABINE

Inventor name: WILDT, LUDWIG

Inventor name: ALLERA, AXEL

RIN1 Information on inventor provided before grant (corrected)

Inventor name: DAUFELDT, SABINE

Inventor name: WILDT, LUDWIG, PROF. DR.

Inventor name: ALLERA, AXEL

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: DAUFELDT, DR., SABINE

Owner name: DAUFELDT, HANS-PETER

Owner name: ALLERA, AXEL

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION HAS BEEN WITHDRAWN

18W Application withdrawn

Effective date: 20090730