EP1315838A2 - Verfahren zur erfassung von resistenz-profilen von geweben und zelllinien - Google Patents
Verfahren zur erfassung von resistenz-profilen von geweben und zelllinienInfo
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- EP1315838A2 EP1315838A2 EP01980157A EP01980157A EP1315838A2 EP 1315838 A2 EP1315838 A2 EP 1315838A2 EP 01980157 A EP01980157 A EP 01980157A EP 01980157 A EP01980157 A EP 01980157A EP 1315838 A2 EP1315838 A2 EP 1315838A2
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Definitions
- the invention relates to a method for recording chemotherapy resistance profiles in human tumor tissue or tumor cell lines using real-time PCR technology (can be carried out, for example, on the Light Cycler, Röche Diagnostics GmbH). These patient-individual resistance profiles are created on the basis of quantitatively determined expressions of resistance-relevant genes. You can then form the molecular biological rationale for the selection of suitable cytostatics in the respective tumor chemotherapy. In addition, the chances of success (response) of certain chemotherapeutic regimes can be forecast.
- MDR multidrug resistance
- ABSC transporters ATP-dependent transmembrane drug-efflux pumps
- MDR-associated genes include the following genes coding for ABC transporters: the MDR1 gene (coding for P-glycoprotein), the genes MRP1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 (coding for multidrug resistance) Proteins 1 to 7), and the gene BCRP / MXR / ABCP (encoded for an identical protein; different nomenclature due to simultaneous discovery by 3 different groups).
- the main cytostatic spectrum of these transporters includes anthracyclines such as doxorubicin and daunorubicin, vinca alkaloids such as vincristine and vinblastine, epipodophyllotoxins such as etoposide, taxanes such as taxol, and mitoxantrone, but also the transport of, for example, nucleosides.
- Vault The main component of the corresponding cell organelle (Vault) is the Lung Resistance Protein / Major Vault Protein LRP / MVP.
- cytoplasmic proteins that are involved in the metabolism or detoxification of cytostatics: the enzymes glutathione-S-transferase (GST) and aldehyde dehydrogenase (ADH) via intracellular detoxification of cyclophosphamide resistance.
- GST glutathione-S-transferase
- ADH aldehyde dehydrogenase
- Other cytostatics resistance are e.g. mediated via dihydrofolate reductase (DHFR; against methotrexate), via thymidylate synthase (against 5-fluorodeoxyuridine) or via tubilin (against Vinca alkaloids and taxol).
- Nuclear gene products can also cause resistance to cytostatics.
- the enzymes topoisomerase I (resistance to camptothecin) and II (to doxorubicin and etoposide) are involved in the repair of cytostatic-induced DNA damage, as well as methyltransferase (MGMT) and methylpurine glycosylase (MPG; both resistance to alkylating agents).
- MGMT methyltransferase
- MPG methylpurine glycosylase
- the enzyme superoxide dismutase (MnSOD, resistance e.g. to anthracyclines) protects against oxidative DNA damage.
- This group of resistance-causing nuclear gene products also includes the "DNA mismatch repair" genes, such as MLH1, MSH2 and MSH6, as well as PMS 1 and PMS2.
- apoptosis-regulating genes eg Bcl-2, Bax
- genes involved in cell cycle eg p53, MDM2
- Standard techniques such as e.g. the Northern blotting method can be used.
- PCR-based methods such as As a very complex and semi-quantitative PCR variant, MIMIC-PCR is not suitable for examining the expression of a panel of genes on a large number of tissues.
- the densitometric evaluation of PCR products after gel electrophoretic separation is also difficult. Therefore, the method of real time RT-PCR should be used to quantify gene expression, e.g. on the Light Cycler (Röche Diagnostics GmbH).
- Cryosections are made from the biopsies or resectates that are shock-frozen directly in the OR for expression analysis. Since the microdissection method is generally used, the cryosections of each tissue are assessed by a pathologist in order to microdissectively target tumor cell populations or normal tissue. This procedure offers the advantage of comparing the subsequent expression analyzes of defined malignant tissue and normal tissue (eg both cell areas from the same section). The total cellular RNA is then isolated from these microdissected tissues. Expression analysis at the mRNA level is carried out using the Light Cycler System with real time RT-PCR and 50 ng total cellular RNA according to the manufacturer's protocol.
- the amplificates can be detected either by the intercalation of a fluorescent dye (SYBR Green) or by using fluorescence-labeled oligos that hybridize between the primers to be detected in a sequence-specific manner.
- the quantification takes place via gene-specific transcripts, which were carried out in serial dilution series (mostly 10 8 , 10 7 , 10 6 , 10 5 ). These transcripts were produced by cloning the corresponding gene-specific cDNA or fragments thereof into special plasmids (for example with SP6, T3 or T7 promoters for the corresponding DNA-dependent RNA polymerases).
- the quality control of the PCR fragments obtained vs. primer Dimers are carried out using melting point analysis. Visual control can be performed using conventional gel electrophoresis.
- control cell lines are included in the evaluation of the expression levels of the MDR genes in the tumors. These human cell lines are available as parent lines and as chemoresistant variants. Overexpression e.g. Certain resistance genes are characterized on both expression levels: on the RNA level using real time RT-PCR, and on the protein level using FACScan analysis with monoclonal antibodies. Functional parameters are also recorded, e.g. in the adriamycin accumulation assay and in the rhodamine influx / efflux assay. These characterizations form the basis for evaluating gene expressions in human tissues or cell lines, since RNA of the corresponding cell line pair is carried as a positive control in each RT-PCR run.
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Abstract
Die Effizienz einer Chemotherapie maligner Erkrankungen ist oft durch Resistenzen gegenüber der eingesetzten Zytostatika limitiert, die durch eine Vielzahl unterschiedlicher, parallel oder sequentiell auftretender Mechanismen vermittelt werden. Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Verfahrens zur Erfassung von Resistenz-Profilen mittels RNA aus Geweben bzw. Zelllinien mit der real time-RT-PCR-Technologie (durchführbar z.B. am Light Cycler, Roche Diagnostics GmbH). Es können so die Expressionen unterschiedlicher Gene, die an der Entstehung oder Verstärkung oder Verminderung von Resistenzen beteiligt sind, quantitativ nachgewiesen werden. Basierend darauf können dann z.B. Patienten-individuelle Resistenz-Profile erstellt werden, die die molekularbiologische Grundlage zur Auswahl geeigneter Zytostatika vor und auch während der jeweiligen Tumorchemotherapie bilden. Darüber hinaus können prognostisch die Erfolgschancen (Response) bestimmter chemotherapeutischer Regime abgeschätzt werden.
Description
Verfahren zur Erfassung von Resistenz-Profilen von Geweben und Zellinien
Gegenstand der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Erfassung von Chemotherapie- Resistenz-Profilen in humanem Tumorgewebe bzw. Tumorzelllinien unter Verwendung der real time-PCR-Technologie (durchführbar z.B. am Light Cycler, Röche Diagnostics GmbH). Diese Patienten-individuelle Resistenzprofile werden aufgrund quantitativ ermittelter Expressionen Resistenz-relevanter Gene erstellt. Sie können dann die molekularbiologische Rationale zur Auswahl geeigneter Zytostatika in der jeweiligen Tumorchemotherapie bilden. Darüber hinaus können prognostisch die Erfolgschancen (Response) bestimmter chemotherapeutischer Regime abgeschätzt werden.
Wissenschaftlicher Hintergrund
Die Effizienz einer Chemotherapie maligner Erkrankungen ist oft durch Resistenzen gegenüber den eingesetzten Zytostatika limitiert, die durch eine Vielzahl unterschiedlicher, parallel oder sequentiell auftretender Mechanismen vermittelt werden.
1. Der in diesem Kontext bedeutendste Mechanismus besteht in der simultanen Resistenz gegenüber strukturell und funktioneil nicht verwandten zytotoxischen Verbindungen. Dieses als Arzneimittel-Vielfachresistenz (Multidrug Resistenz MDR) bezeichnete Phänomen wird durch die Expression von MDR-assoziierten Genen verursacht. Hier stehen insbesondere die Gene, die für die ATP-abhängigen transmembranen Drug-Efflux-Pumpen kodieren (ABC-Transporter), im Mittelpunkt des Interesses. Durch Überexpression und Funktion dieser ABC-Transporter werden die intrazellulären Konzentrationen MDR-assoziierter Zytostatika gering gehalten, die Zelle wird nicht/wenig beeinträchtigt und ist resistent. Zu diesen MDR-assoziierten Genen zählen die folgenden, für ABC-Transporter kodierende Gene: das MDR1-Gen (kodiert für P-Glykoprotein), die Gene MRP1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7 (kodieren für die Multidrug Resistenz Proteine 1 bis 7), sowie das Gen BCRP/MXR/ABCP (kodiert für
ein identisches Protein; unterschiedliche Nomenklatur aufgrund zeitgleicher Entdeckung durch 3 unterschiedliche Gruppen). Das hauptsächliche Zytostatika- Spektrum dieser Transporter umfasst Anthrazykline wie Doxorubicin und Daunorubicin, Vinca Alkaloide wie Vincristin und Vinblastin, Epipodophyllotoxine wie Etoposide, Taxane wie Taxol, und Mitoxantron, aber auch den Transport von z.B. Nukleosiden.
2. Ein weiterer, MDR-assoziierter Mechnismus besteht in der subzellulären Redistribution von Substanzen, z.B. im nukleozytoplasmatischen Transport. Der Hauptbestandteil der entsprechenden Zellorganelle (Vault) ist das Lung Resistance Protein/Major Vault Protein LRP/MVP.
3. Weitere, Resistenz-verursachende Gene kodieren für zytoplasmatische Proteine, die in den Metabolismus oder Detoxifikation von Zytostatika involviert sind: So verursachen z.B. die Enzyme GIutathion-S-Transferase (GST) und Aldehyd- Dehydrogenase (ADH) über intracelluläre Detoxifikation Cyclophosphamid- Resistenzen. Weitere Zytostatika-Resistenzen werden z.B. über die Dihydrofolat- Reduktase (DHFR; gegen Methotrexat), über die Thymidylate-Synthase (gegen 5- Fluorodesoxyuridin) oder über Tubilin (gegen Vinca Alkaloide und Taxol) vermittelt.
4. Auch nukleare Genprodukte können Zytostatika-Resistenzen verursachen. So sind z.B. die Enzyme Topoisomerase I (Resistenz gegen Camptothecin) und II (gegen Doxorubicin und Etoposid) in die Reparatur Zytostatika-induzierter DNA-Schäden involviert, ebenso wie Methyltransferase (MGMT) und Methylpurin-Glykosylase (MPG; beide Resistenz gegen alkylierende Agenzien). Das Enzym Superoxid- Dismutase (MnSOD, Resistenz z.B. gegen Anthrazykline) schützt vor oxidativen DNA-Schäden. In diese Gruppe Resistenz-verursachender, nuklearer Genprodukte zählen ebenso die „DNA-mismatch repair"-Gene, wie z.B. MLH1 , MSH2 und MSH6, sowie PMS 1 und PMS2.
5. Darüber hinaus zählen auch Apoptose-regulierende Gene (z.B. Bcl-2, Bax) sowie Zellzyklus-involvierte Gene (z.B. p53, MDM2) zu denen, die an der Entstehung bzw. Steigerung von Zytostatika-Resistenzen zumindest beteiligt sind.
Verfahren
Zur Nachweis der Expression aller dieser Gene können Standard-Techniken wie z.B. die Northern Blotting-Methode eingesetzt werden. Allerdings können über derartige Techniken keine quantitativen Aussagen zur jeweiligen Expressionshöhe gemacht werden. PCR-basierende Verfahren wie z.B. die MIMIC-PCR ist als eine sehr aufwendige und semi-quantitative PCR-Variane nicht geeignet, Expressionen eines Panels von Genen an einer Vielzahl von Geweben zu untersuchen. Ebenfalls schwierig gestaltet sich die densitometrische Auswertung von PCR-produkten nach gelelektrophoretischer Trennung. Deshalb soll hier zur Quantifizierung der Genexpression die Methode der real time RT-PCR zum Einsatz kommen, die z.B. am Light Cycler (Röche Diagnostics GmbH) durchführbar ist.
Im Folgenden wird die Methodik zur Analyse von humanem Tumormaterial beschrieben. Von den unmittelbar im OP schock-gefroreren Biopsien bzw. Resektaten werden Kryoschnitte zur Expressionsanalyse angefertigt. Da generell die Methode der Mikrodissektion zum Einsatz kommt, werden die Kryoschnitte von jedem Gewebe durch einen Pathologen befundet, um zielgerichtet Tumorzellpopulationen bzw. Normalgewebe zu mikrodissiziieren. Diese Vorgehensweise bietet den Vorteil der Vergleichbarkeit der nachfolgenden Expressionsanalysen von definiertem malignen Gewebe und Normalgewebe (z.B. beide Zellareale vom selben Schnitt). Aus diesen mikrodissiziierten Geweben wird dann die totale zelluläre RNA isoliert. Die Expressionsanalyse auf mRNA-Ebene wird unter Verwendung des Light Cycler Systems mit der real time RT-PCR und 50 ng totaler zellulärer RNA nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die Amplifikate können entweder durch die Interkalation eines Fluoreszenzfarbstoffes (SYBR Green) detektiert werden, oder durch Verwendung von Fluoreszenzmarkierten Oligos, die zwischen den Primern hybridisieren, sequenz-spezifisch nachgewiesen werden. Die Quantifizierung erfolgt über Gen-spezifische Transkripte, die in seriellen Verdünnungsreihen (meist 108, 107, 106, 105) mitgeführt wurden. Die Herstellung dieser Transkripte erfolgte über Klonierungsarbeiten der entsprechenden Gen-spezifischen cDNA bzw. Fragmente davon in spezielle Plasmide (z.B. mit SP6-, T3- oder T7-Promotoren für die entsprechenden DNA-abhängigen RNA- Polymerasen). Die Qualitätskontrolle der erhaltenen PCR-Fragmente vs. Primer-
Dimeren erfolgt über Schmelzpunktanalytik. Die visuelle Kontrolle kann mit herkömmlicher Gelelektrophorese durchgeführt werden.
Für die Evaluation der Expressionshöhen der MDR-Gene in den Tumoren werden sogenannte Kontroll-Zellinien mitgeführt. Diese humanen Zellinien sind jeweils als parentale Linien sowie als chemoresistente Varianten vorhanden. Überexpressionen z.B. bestimmter Resistenzgene werden auf beiden Expressionsebenen charakterisiert: auf RNA-Ebene mittels real time RT-PCR, und auf Proteinebene mittels FACScan-Analyse mit monoklonalen Antikörpern. Darüber hinaus werden funktioneile Parameter erfaßt, wie z.B. im Adriamycin-Akkumulations-Assay und im Rhodamin-Influx/Efflux-Assay. Diese Charakterisierungen bilden die Grundlage zur Evaluation der Genexpressionen in humanen Geweben oder Zellinien, da in jeder RT-PCR-Lauf RNA des entsprechenden Zellinienpaares als Positivkontrolle mitgeführt wird.
Die Anwendung der real time RT-PCR-Technologie wird bereits in der onkologischen Literatur z.B. zum quantitativen Nachweis des Onkogens MET als Marker von Tumorzellen in Lymphknotenmetastasen (G. Cortesina et al., Int. J. Cancer 89: 286- 292, 2000) oder zum Nachweis einer minimal residual disease beim Mammakarzinom ( M. Giesing et al., Int. J. Biol. Markers 15: 94-99, 2000), bei Lymphomen (J.G. Sharp et al., Cancer Metastasis Rev. 18: 127-142, 1999), bei akuter myeloischer Leukämie (T. Sugimoto et al., Am. J. Hematol. 64: 101-106, 2000) oder bei chronischer myeloischer Leukämie (M. Emig et al., Clin. Cancer Res. 13: 1825-1832, 1999) beschrieben. Für die Thematik der Chemotherapie-Resistenz ist diese Technik bisher nicht eingesetzt worden.
Anwendungsbeispiel
Unter Anwendung der oben beschriebenen Vorgehensweise wurden bereits Expressionsanalysen Resistenz-assoziierter Gene an humanen Tumoren wie Sarkomen und Melanomen (MDR1 , MRP1 , LRP) sowie an humanen Tumorzelllinien wie Kolonkarzinom- und Magenkarzinomlinien (MDR1 , MRP1 , LRP, BCRP) durchgeführt. Im Folgenden sind einige Beispiele für die Expression des LRP-Gens in humanen Sarkomen sowie dem korrepondierenden Normalgewebe dargestellt (Abb.1 ):
Legende zu Abbildung 1
Abbildung 1
Exemplarisch ausgewählte Resistenz-Profile von Leiomyosarkom-Patienten #1 - #3, erstellt mittels quantitativer real time RT-PCR. Die Expressionsanalytik erfolgte an Geweben, die an den fettgedruckten Behandlungszeitpunkten erhalten wurden. S=Chirurgie, C=Chemotherapie, H=Hyperthermie, R=Radiotherapie, ci=Cisplatin, cy=CYVADIC, d=Dacarbacin, e=Epirubicin, i=lfosphamid, t=TNF, me=Mel p halan,
Claims
1. Verwendung eines Verfahrens zur Erfassung von Resistenz-Profilen in Geweben oder Zellinien, dadurch gekennzeichnet, dass es quantitativ die RNA-Expression von definierten Genen a) mittels Interkalierung eines Fluoreszenz-Farbstoffes (z.B. SYBR-Green), oder b) mittels Verwendung sog. Taqman-Sonden (ist am 5'- und 3'-Ende markiert), oder c) mittels HybProbes (2 jeweils am 3'- bzw. am 5'-Ende markierte Hybridisierungssonden), d) singulär (die Expression eines Genes wird in einer Probe in einem Lauf detektiert), oder e) multiplex (die Expression von mehreren Genen wird simultan in einer Probe in einem Lauf detektiert) erfasst.
2. Verwendung nach Anspruch 1., dadurch gekennzeichnet, dass die RNA a) aus humanen Geweben wie Normalgewebe oder Tumorgewebe, b) aus Geweben von in vivo-Modellen, c) aus Zellinien isoliert wird.
3. Verwendung nach Ansprüchen 1. und 2., dadurch gekennzeichnet, dass Genspezifische Primer bzw. Primer und Sonden für die Expressionsanalyse von Genen eingesetzt werden, die am Prozess der EntstehungΛ/erstärkung/Verminderung von Resistenzen beteiligt sind, wie a) Gene für transmembrane ABC-Transporter wie MDR1 , MRP1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, BCRP/MXR/ABCP, b) Gene für den nukleozytoplasmatischen Transport wie LRP/MVP, c) Gene für zytoplasmatische Enzyme wie GST, ADH, DHFR, Thymidylate-Synthase, oder Tubulin, d) Gene für nukleare Proteine wie Topoisomerase I und II, MGMT, MPG, MnSOD, MLH1 , MSH2, MSH6, PMS1 uns PMS2, e) Gene für Apotose- bzw. Zellzyklus-involvierte Proteine wie Bcl-2, Bax, p53, MDM2.
4. Verwendung nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass das Expressionsprofil a) den intrinsischen Expressionsstatus nachweist, und/oder b) den Expressionsstatus nach Beeinflussung durch externe Faktoren wie z.B. bei einer Tumortherapie nachweist und damit die Erfassung potentiell Therapiebedingter Genmodulationen erlaubt.
5. Verwendung nach Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass a) die Auswahl der Zytostatika vor einer Tumorchemotherapie aufgrund des individuellen, intrinsischen Resistenz-Profils erfolgt, b) die Auswahl der Zytostatika während einer Tumorchemotherapie aufgrund des individuellen, jedoch modulierten Resistenz-Profils erfolgt und c) prognostisch die Erfolgschancen (Response) bestimmter chemotherapeutischer Regime abgeschätzt werden.
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