EP1301533A1 - Tumorassoziiertes antigen (b345), gekennzeichnet durch eine aminosäuresequenz wie in seq. id. no. 4 - Google Patents

Tumorassoziiertes antigen (b345), gekennzeichnet durch eine aminosäuresequenz wie in seq. id. no. 4

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Publication number
EP1301533A1
EP1301533A1 EP01960465A EP01960465A EP1301533A1 EP 1301533 A1 EP1301533 A1 EP 1301533A1 EP 01960465 A EP01960465 A EP 01960465A EP 01960465 A EP01960465 A EP 01960465A EP 1301533 A1 EP1301533 A1 EP 1301533A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
tumor
cdna
sequence
pcr
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01960465A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Norbert Schweifer
Marwa Scherl-Mostageer
Wolfgang Sommergruber
Roger Abseher
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boehringer Ingelheim International GmbH
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International GmbH
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Filing date
Publication date
Priority claimed from DE2001119294 external-priority patent/DE10119294A1/de
Application filed by Boehringer Ingelheim International GmbH filed Critical Boehringer Ingelheim International GmbH
Publication of EP1301533A1 publication Critical patent/EP1301533A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to the chemotherapy of tumor diseases.
  • Normal body cells are subject to a strictly ordered system that controls the growth, cell division and death of certain cells. So share
  • Cancer cells 10 body cells of an adult only if they have to replace dead cells or heal an injury. Cancer cells, on the other hand, continue to grow uncontrollably, they accumulate and form a tumor. If the tumor reaches a critical size, can
  • cancer cells can also be transported to other areas of the body via the bloodstream or the lymphatic system and form colonies there (metastases). Not all tumors are carcinogenic, because benign tumors do not metastasize and are therefore usually not life-threatening because they
  • Cancer cells can be triggered by a number of factors, such as environmental influences, radiation, viruses or chemical reagents.
  • epigenetic methylation, Acetylations and changed chromatin structure
  • genetic modifications point mutation, deletion, amplification, translocation
  • Mutations in coding regions of genes that are involved in the regulation of cell proliferation can contribute to the transfer of a normal cell into a tumor cell, since the transformed cell has growth advantages over its healthy neighboring cell.
  • Cancer therefore arises from an accumulation of inherited or acquired mutations in critical proto-oncogenes or tumor suppressor genes.
  • Cell proliferation is under the control of various gene systems, while products of oncogenes are involved in signaling from the cell surface to the nucleus, cyclin-dependent protein kinase and its inhibitors guide the cell through the cell cycle. Disturbances in the synthesis of these proteins are often found in tumor cells.
  • the p53 protein plays a central role in this.
  • RB protein-type proteins regulate the availability of crucial transcription factors.
  • transcription level the level of gene expression
  • Chemotherapy is the administration of substances that interfere with metabolism, signal transduction and
  • Chemotherapeutic agents can be classified based on the influence of specific targets in the tumor cell, the type of cellular interaction and the Interaction with a specific cell cycle phase, divided into different categories.
  • the type of cancer treatment depends on the tumor stage, the decisive factor here is whether metastases are already present and how widespread they are in the body.
  • the application of cell poisons for cancer treatment is, in addition to operative measures and radiation therapy, an integral part of today's therapy concepts in oncology.
  • Chemotherapy First and foremost, it is curing cancer; this means that the tumor disappears and no longer occurs. If a cure is no longer possible for various reasons, one tries to restrict or control the growth and spread of the tumor.
  • Each tissue has a characteristic growth behavior, which includes cell division, growth arrest, differentiation and aging and is influenced and regulated by internal and external factors.
  • Chemotherapeutic agents are divided into different categories depending on how they affect specific substances within the tumor cell, the cellular processes with which the drugs interact and the cell cycle phase they influence.
  • the genes upregulated in tumor tissues thus represent potential new target structures and since proteins of various functions are highly expressed, the approach for therapeutic interventions is very versatile.
  • Targets Genes upregulated in tumor tissues represent points of attack and thus potential target structures ("targets”) for chemotherapy.
  • the object of the present invention was to provide a new protein, preferably expressed by tumor cells, which is a target molecule for the Intervention using chemotherapy methods.
  • Normal lung tissue was created using a cDNA subtraction library.
  • the cDNA clones obtained were then sequenced and compared with sequences available in databases.
  • the genes that were annotated were 321 unknowns, most of which had ESTs (expressed sequence tags) in the database.
  • the number of candidate clones was restricted to 59, whose ESTs do not originate from critical normal tissues.
  • the length of the transcripts was determined by means of Northern blot analysis and the expression pattern in different cell systems was precisely characterized by quantitative PCR. Only unknown genes or ESTs with tumor-specific expression profiles were found followed up and subjected to a "full length cloning". Potential ORFs ("open reading frames") are converted into the corresponding amino acid sequence and analyzed for possible function prediction using in silico strategies.
  • the human B345 cDNA was cloned, the sequence obtained in a first cloning approach is shown in SEQ ID NO: 1. Sequence analysis of the human B345 CDNA cloned in this approach showed a continuous open reading frame from position 215 to position 2461 (excluding stop codon) which, at the nucleotide and protein levels, has no homology or identity in the known sequences of the databases. It can be concluded from the data obtained from Northern blot experiments that the B345 transcript has a length of approximately 6.5 kb.
  • a B345 CDNA with 5897 bp (exclusive polyA region) was obtained as the cloned region, the presence of a polyadenylation signal and the polyA tail at the 3 'end of the sequence indicating the completeness of the cDNA in this region , Due to the fact that there was no continuous reading frame in the 5 'region of the cloned cDNA from position 1 to 214, it was initially assumed that the ATG at position 215, which is also 75% a Kozak translation initiation site (ACCATGT) (Kozak , 1987) corresponds to the start codon of B345.
  • ACCATGT Kozak translation initiation site
  • primer extension analysis can be located precisely and is at position 201 (SEQ ID NO: 3).
  • SEQ ID NO: 3 Through repeated sequencing also in the 3 ⁇ region, in comparison to the sequence shown in SEQ ID NO: 1, an additional base at position 2430 was found, which leads to a reading frame shift and thus shifts the stop codon from position 2729 to 2791.
  • the cDNA obtained (SEQ ID NO: 3) has an open reading frame which codes for a potential protein with a length of 836 amino acids (SEQ ID NO: 4).
  • the translation initiation site at position 283 corresponds approximately to 70% of a Kozak consensus sequence.
  • the promoter region 200bp upstream of the putative transcription start site contains neither a TATA nor a CCAAT box, but a unique GC box, which represents a binding site of the SP1 protein.
  • the fact that the GC content in the 5 "region is over 60% indicates a CpG Island (Bird, 1986).
  • the resulting primary amino acid sequence of B345 is shown in SEQ ID NO: 4.
  • Analysis of the hydrophilicity plot of the amino acid sequence shows that the B345 protein has two characteristic hydrophobic domains which represent a signal peptide and a helical transmembrane domain (FIG. 6). This polarized structure indicates indicates that B345 is an integral membrane protein.
  • the extracellular domain suggests the existence of definitely one, possibly three, CUB domains.
  • CUB domains are found in various proteins, most of which are regulated during embryonic development.
  • a recent publication (Gerstein et al., 2000) demonstrated that proteins containing CUB domains are the most pronounced differentially regulated proteins in C. elegans. Since genes that play a key role in embryonic development have corresponding functions, e.g. in cell division, cell proliferation or signal transmission in cancer, it can be assumed that overexpression of B345 in cells causes a change in the properties of substrate adhesion or the extracellular matrix.
  • the B345 protein has 12 potential N-glycosylation sites found in the putative extracellular domain.
  • B345 protein forms a ß-sheet secondary structure, since CUB domains are known to fold as a ß-sandwich.
  • the intracellular domain (range 691-836) has no significant homologies. However, the entire C-terminus shows an identity (82%) over 124 amino acids with an EST (Acc No. AW063026) from human ovarian cancer cells.
  • B345 transmembrane protein plays a role in communication, interaction and / or signal transduction with extracellular components or ligands. Furthermore, the data from the expression analysis are a strong indication that B345 is metastatic
  • cell lines preferably human cell lines
  • the cells are transfected with a plasmid containing the B345 sequence and B345 expressed. Changes in the
  • Morphology and / or migration behavior e.g. Using a soft agar assay (Hamburger and Salmon, 1977) or a migration assay (Liaw et al; 1995) of the cells expressing B345 versus the non-transfected cells indicate a role of B345 in the biological process responsible for this. This is a clear indication of the involvement of B345 in the interaction of tumor cells with one another and / or with the extracellular matrix and thus for a function in metastasis.
  • B345 in cells which endogenously express this protein is suppressed in a complementary approach in order to also determine any changes in morphology and / or migration behavior.
  • it may be investigated whether protein components exist that interact with B345 inter- or extracellularly eg using the Yeast Two Hybrid System (Fields and Song, 1989).
  • the invention thus relates in a first aspect to a tumor-specific polypeptide with the designation B345, with the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 4, or to a polypeptide which is encoded by a polynucleotide which, under stringent conditions, is linked to a polynucleotide of the type shown in SEQ ID NO: 3 shown sequence or a partial sequence thereof hybridized, as well as derived protein fragments or peptides.
  • the present invention relates to an isolated DNA molecule coding for the tumor-specific polypeptide of the designation B345.
  • the DNA molecule according to the invention is preferably a polynucleotide of the sequence shown in SEQ ID NO: 3 or a fragment thereof or a DNA molecule which is linked to a DNA molecule of the sequence shown in SEQ ID NO: 3 or a partial sequence thereof under stringent conditions hybridized, or a fragment thereof.
  • the DNA molecules according to the invention code for (poly) peptides of the designation B345 with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: or for protein fragments or peptides derived therefrom; this also includes DNA molecules or fragments which, due to the degeneration of the genetic code, have deviations from the sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • the invention relates to an isolated DNA molecule of the sequence shown in SEQ ID NO: 3 or a fragment thereof, or a DNA molecule which is associated with a DNA molecule of the sequence shown in SEQ ID NO: 3 or with a Partial sequence hybridized, coding for the natural B345 polypeptide or for a fragment thereof.
  • the B345 DNA molecules can be used in a so-called DNA vaccine for the immunotherapy of tumors.
  • the B345 DNA molecules of the invention can be administered, preferably in recombinant form as plasmids, directly or as part of a recombinant virus or bacterium.
  • any gene therapy method for the immunotherapy of cancer based on DNA (“DNA vaccine”) on B345-DNA can be used, both in vivo and ex vivo.
  • Examples of in vivo administration are the direct injection of "naked" DNA, either intramuscularly or by means of a gene gun, which has been shown to lead to the formation of CTLs against tumor antigens.
  • Examples of recombinant organisms are vaccinia virus, adenovirus or Listeria monocytogenes (an overview was given by Coulie, 1997).
  • synthetic carriers for nucleic acids such as cationic lipids, microspheres, microspheres or liposomes, can be used for the in vivo administration of nucleic acid molecules, coding for B345 peptide.
  • cytokines either in the form of proteins or plasmids encoding them.
  • the application can optionally be combined with physical methods, eg electroporation.
  • ex vivo administration is the transfection of dendritic cells as described by Tuting, 1997, or other APCs . which are used as cellular cancer vaccines.
  • the present invention thus relates to the use of cells which express B345, either on their own or, in optionally modified form, after transfection with the corresponding coding sequence, for the production of a cancer vaccine.
  • modified derivatives can be used. These include sequences with modifications for a protein (fragment) or peptides with stronger ones
  • Coding immunogenicity with the same considerations for the modifications at the DNA level as for the peptides described above.
  • Another type of modification is the stringing together of numerous sequences, coding for immunologically relevant peptides, according to Art a string of beads ("string-of-beads"; Toes et al., 1997).
  • the sequences can also be modified by adding auxiliary elements, for example functions which ensure more efficient delivery and processing of the immunogen (Wu et al., 1995). For example, by adding a
  • ER targeting sequence Localization sequence in the endoplasmic reticulum
  • the present invention relates to a recombinant DNA molecule containing B345 DNA, e.g. linked to a regulatory DNA sequence, especially a heterologous regulatory DNA sequence, e.g. a promoter or enhancer.
  • the invention relates to antibodies against B345 or fragments thereof.
  • Polyclonal antibodies can be obtained in a conventional manner by immunizing animals, in particular rabbits, by injection of the B 345 antigen or fragments thereof, and subsequent purification of the immunoglobulin.
  • Monoclonal anti-B345 antibodies can be obtained according to standard protocols according to the principle described by Köhler and Milstein, 1975, by immunizing animals, in particular mice, then immortalizing antibody-producing cells of the immunized animals, for example by fusion with myeloma cells, and the supernatant hybridomas obtained is screened for monoclonal anti-B345 antibodies by means of standard immunological assays.
  • these animal antibodies can optionally be chimerized in a conventional manner (Neuberger et al., 1984; Boulianne et al., 1984) or humanized (Riechmann et al., 1988; Graziano et al., 1995) ,
  • Human monoclonal anti-B345 antibodies fragments can also be obtained from so-called "phage display libraries” (Winter et al., 1994; Griffiths et al., 1994; Kruif et al.,
  • the anti-B345 antibodies according to the invention can be used in immunohistochemical analyzes for diagnostic purposes, or as a therapeutic agent in cancer therapy.
  • a monoclonal antibody in cancer therapy is Herceptin; an antibody against the proto-oncogene HER2.
  • Herceptin can be used in breast cancer patients who overexpress HER2.
  • the invention relates to the use of B345-specific antibodies in order to selectively bring any substances into or into a tumor which expresses B345.
  • examples of such substances are cytotoxic agents or radioactive nuclides, the effect of which is to damage the tumor on site. Due to the relatively tumor-specific expression of B345, only a few are involved Expected side effects.
  • B345 antibodies can be used to visualize tumors that express B345. This is useful for the diagnosis and evaluation of the course of therapy.
  • the protein of the designation B345 according to the present invention and the protein fragments, peptides or peptide equivalents or peptidomimetics derived therefrom can be used in cancer therapy, e.g. B. to induce an immune response against tumor cells that express the corresponding antigen determinants. They are preferably used for the therapy of
  • B345-positive tumors are used, especially in lung and colon carcinoma.
  • B345 or peptides, peptide equivalents and peptidomimetics can be used for the immunotherapy of cancer, e.g. in WO 00/73438, the disclosure of which is hereby incorporated by reference.
  • tumor-associated antigens can have tumor-specific mutations that contribute to: an immunological differentiation between tumor and normal tissue (Mandruzzato et al., 1997; Hogan et al., 1998; Gaudi et al., 1999; Wölfel et al., 1994).
  • the B345 cDNA is expediently determined using probes from the isolated cDNA according to the invention cloned one or more different tumors and compared the sequences obtained with normal tissue B345 CDNA.
  • the present invention thus relates to B345 peptides derived from regions of a tumor-expressed B345 which have tumor-specific mutations.
  • B345 Due to the preferred expression of B345 in tumor cells, it can be assumed that this protein has an important function for the tumor, e.g. for emergence, infiltration and growth and thus a target for chemotherapeutic intervention.
  • B345 is characterized in more detail in order to develop the appropriate strategy for the intervention with this function.
  • a bioinformatic analysis is expediently carried out in a first step, which is trend-setting for the experimental validation of B345 as a target.
  • the bioinformatics concepts based on similarity and modular structure represent an essential basis for this analysis.
  • Established bioinformatics tools for determining similarities are BLAST
  • B345 has a helical transmembrane domain, with both the N-terminal and the C-terminal region being hydrohpil, which suggests that this protein is a transmembrane protein.
  • the N-terminal, The extracellular region has some CUB domains which tend to form disulfide bridges and are therefore involved in dimerization or in protein-protein interactions (Bork et al., 1993).
  • the C-terminal, intracellular end shows homologies to a receptor kinase and to a C-kinase substrate.
  • B345 is subjected to a biochemical and biological analysis.
  • Proliferation assays in vitro or in animal models that overexpress the B345 gene to be examined (constitutive or inducible) and express it as a control either in deleted (inactive) form or downregulate via antisense (see e.g. Grosveld and Kollias, 1992).
  • B345 can be used in screening assays to identify substances that modulate, especially inhibit, the activity of this protein.
  • an assay may e.g. B. consist of introducing the B345 protein, or an active fragment thereof, into cells which react to the activity of B345 with proliferation or to express the corresponding B345 cDNA in the cell, and the proliferation of the cells in the presence and to determine in the absence of a test substance.
  • test cells are cells with a low division rate, for example primary cells that have no endogenous B345.
  • Substances with an anti-proliferative effect can be used for the treatment of tumors with strong B345 expression, particularly in the case of lung and colon carcinoma.
  • FIG. 1A Expression profile of B345, B452 and B540 in individual lung carcinomas and lung tumor cell lines.
  • Fig. IC Graphical representation of the alignment of B345, B452 and B540.
  • Fig. 2A Northern blot analysis of tumor cell line A549 with a 490bp long B345 PCR product
  • Fig. 2B Northern blot analysis of various
  • Fig. 4 mRNA expression analysis of B345 by real-time PCR of laser microscope-prepared colon tumors (LCM) as well as normal colon tissue and tumor cell lines.
  • Fig. 5 Graphical representation of the gene structure of B345.
  • Fig. 6 Hydrophilicity and transmembrane blot of the B345 protein
  • RDA Representative Difference Analysis
  • the human lung adenocarcinoma cell line A549 obtained from ATCC was grown up in T150 cell culture flasks. MEM served with 10% heat-inactivated, fetal calf serum and 2 mM L-glutamine as the nutrient medium. Every 3 to 4 days the cells were cleaved by trypsinization 1: 5 to 1:10 for propagation. After approximately 80% confluence had been reached, 4 ml of a trypsin solution (data per liter: 8 g NaCl, 0.2 g KC1, 1.13 g Na 2 HP0 4 - water-free, 0.2 g KH 2 PO 4 ,
  • the poly-A (+) RNA of the lung adenocarcinoma cell line A549 was described as "solid", that of normal lung tissue (1 mg / ml; Clontech, Palo Alto; # 6524-1) used as a "driver”.
  • the RDA was carried out using the PCR-select TM kit (Clontech, Palo Alto) according to the manufacturer's protocol, except that a modified primer / adapter-2 oligonucleotide system was used: adapter-2-alt-l (SEQ ID NO: 31) and nested PCR primer-2-alt (SEQ ID NO: 32) and adapter-2-alt-2 (SEQ ID NO: 33).
  • the newly generated primer / adapter sequences enable the presence of three new restriction enzyme interfaces (Kpn I, Sac I and Xho I) in the sequence of the nested PCR primer-2-alt after cloning the subtracted cDNA fragments in the pPCRII- Vector a subsequent cutting out of the respective cDNA fragments.
  • Restriction enzyme interfaces were necessary because point mutations were often observed, particularly in the primer sequences due to the PCR amplification steps.
  • the cDNA obtained was digested by "tester” and "driver” with Rsal (Rsal is a 4-base-recognizing restriction enzyme and provides a statistical average of 256 bp long cDNA fragments).
  • Identical parts of "tester cDNA” were ligated either with adapters 1 or 2 and then hybridized separately with an excess of "driver cDNA” at 65 ° C. The two approaches were then combined and subjected to a second hybridization with freshly denatured "driver cDNA”.
  • the enriched "tester” -specific cDNAs were then exponentially amplified by PCR, with primers 1 and 2 specific for the adapters.
  • 712 positive transformants (blue-white selection) were obtained and cultured in 96-well blocks in LB-Amp medium (1.3 ml per well) for 48 h at 37 ° C.
  • 750 ⁇ l of the E. coli suspensions were used per well for the preparation of the plasmid DNA (96-well mini-preparation method from QIAgen according to the manufacturer's instructions).
  • the remaining bacterial cultures were stored as glycerol stocks at -80 ° C.
  • a cDNA subtraction library consisting of 712 individual clones was obtained, which was available both in the form of E. coli glycerol stock cultures and in the form of purified plasmids.
  • the isolated plasmid DNA of all 712 clones was sequenced according to the Sanger method on an ABI-377 Prism device. The sequences obtained were annotated using the BioScout software (LION, Heidelberg) and subjected to database comparisons (Genbank). From 712 clones, 678 could be sequenced and annotated. The rest (34) had either only poly (A) sequences as an insert or corresponded to a religious vector or could not be sequenced. Of the 678 annotable sequences, 357 proved to be genes with a known function. The remaining 321 represented clones encoding genes with unknown function; 59 of them did not even have entries in the human EST database. Known genes were not further treated. For those unknown
  • oligonucleotide primer pairs were designed and synthesized from the sequences determined from the 200 selected clones.
  • 8 different human tissue-derived cDNA libraries (GibcoBRL "SUPERSCRIPT TM"), which are directionally cloned into pCMV-SPORT, were tested for the presence of the respective candidates by means of qualitative PCR.
  • the cDNA libraries used here came from tissue from the heart (# 10419-018), liver (# 10422-012), leukocytes (# 10421-022), kidney (# 10420-016), lung (# 10424-018), Testis (# 10426-013), brain (# 10418-010) and fetal brain (# 10662-013).
  • PCR conditions were like follows: 20 ⁇ l total volume per PCR mixture contained 1 ⁇ TaqPol buffer (50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl pH9, 0.1% Triton X-100), 1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM dNTPs (Promega ), 0.025 U / ⁇ l Taq DNA polymerase (Promega), each 5 pM at specific oligonucleotide primers for B345 (B345-D,
  • Primer pairs of oligonucleotide primers (SEQ ID NO: 34) and (SEQ ID NO: 35) were also tested in parallel for the isolated plasmid with the B345 "original fragment” (originally isolated cDNA fragment from B345).
  • a number of clones were selected from the dBE ⁇ T database via nucleotide sequence search, the most diverse
  • IMAGE clones (of which 1024 already known genes) were ordered and sequenced for control. Microtiter plates with bacteria containing sequences of approximately 800 bp from the 3 "end of the gene in the vector were sent to Incyte Pharmaceuticals, Inc. (USA) and spotted there on 60 chips. In addition to these clones, 120 EST identified by RDA were also found The DNA chips produced in this way were then hybridized with Cy3-labeled cDNA from normal tissue, tumor tissue and cell lines together with Cy5-labeled cDNA from a mixture of nine different normal tissues and the two signals for normalizing the expression values were compared.
  • B345 is a gene which, according to DNA chip analyzes, is up-regulated in tumor tissues (see FIGS. 1A and 1B, Tab. La and Tab. 1B).
  • a Northern blot analysis was carried out for B345 using human cell lines and the "Human Multiple Tissue Northern Blot" (Clontech and Invitrogen) , The 490 bp and 318 bp long PCR products labeled with [ ⁇ - 32 P] dCTP (NEN, Boston) (primers (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8)). The hybridization took place at 68 ° for 2 h; visualization using standard autoradiography (Hyperfilm, Amersham). 2A, 2B and 2C and Tab.
  • Fig. 2A from cell line A549
  • Fig. 2B from 12 normal tissues (peripheral blood lymphocytes (PBL), lungs, placenta, small intestine, liver, kidney, spleen , Thymus, colon, skeletal muscle, heart and brain) and FIG.
  • PBL peripheral blood lymphocytes
  • the B345 transcript is 6.5 kb in length.
  • RNA was isolated from frozen tissue using trizole in accordance with Gibco's manufacturer's protocol. To remove any contaminating DNA, the prepared RNA was digested with DNAase I as follows: 3 ⁇ g of total RNA were mixed with 20 ⁇ l of 5 ⁇ AMV buffer (Promega), 1 ⁇ l of RNasin (Promega) and 2 ⁇ l of DNase I (Boehringer Mannheim) incubated for a total of 80 ⁇ l at 37 ° C. for 15 minutes. 120 ⁇ l phenol: chloroform: Isoamyl alcohol (25: 24: 1) was added, mixed on a vortex mixer and centrifuged briefly. The aqueous phase was removed, mixed with 120 ul chloroform: isoamyl alcohol (24: 1) and centrifuged as before. The purified RNA was ethanol-precipitated and dissolved in water.
  • DNAase I 3 ⁇ g of total RNA were mixed with 20 ⁇ l of 5 ⁇ AMV
  • RNA was then transcribed with reverse transcriptase (Superscript, Gibco, BRL) into cDNA: 1 ⁇ l of oligo dT primer (Promega) was added to 3 ⁇ g of total RNA and water was added to it
  • a TaqMan PCR Run included samples of ⁇ -actin control sequence with 10 2 , 10 3 , 10 4 , 10 5 and 10 6 copies / ⁇ l (Perkin Elmer) to determine the standard curve, a negative control without DNA and the cDNA pools to be quantified. All samples were analyzed in triplicate. For a 25 ⁇ l
  • the reaction mixture was 1 ul cDNA, 2.5 ul lOx buffer A (Perkin Elmer), 4 ul MgCl 2 (25 mM, (Perkin Elmer)), 0.5 ul per nucleotide (10 mM dATP, dCTP, dGTP; 20 mM dUTP ), 0.125 ⁇ l TaqMan probe (20 ⁇ M; TaqMan probe for ß-actin (SEQ ID NO: 20 fluorescence-labeled at the 5 'end with 6-carboxyfluorescein and with
  • the PCR was carried out as follows: a cycle with 2 minutes 50 ° C for the UNG reaction, a cycle 10 minutes 95 ° C to activate the AmpliTaq, 40 cycles with 15 seconds each 95 ° and 1 minute 60 ° C. The samples were then kept at 25 ° C. The data are evaluated with the program "Sequence Detection System 1.5bl" * (PE Applied Biosystems), the fluorescence signals of the cDNA samples to be quantified being compared in principle with the signals of the control plasmid dilutions of known concentration.
  • GAPDH-TaqMan PCR The following primers or probes were used for the quantification of GAPDH, which was used to normalize the RNAs used, such as ⁇ -actin or tubulin.
  • a TaqMan probe for GAPDH (SEQ ID NO: 23) was used at the 5 'end
  • SybrGreen PCR see manufacturer information (Perkin Elmer).
  • a SybrGreen PCR run contained samples of tubulin control plasmid with 10 2 , 10 3 , 10 4 , 10 5 and 10 e copies / ⁇ l (Perkin. Elmer) to determine the standard curve, a negative control without DNA and the cDNA pools to be quantified , All samples were analyzed in triplicate.
  • B345 specific primers SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29
  • SEQ ID NO: 30, 20 ⁇ M B345 specific probe
  • Fig. 3 illustrates the TaqMan expression analysis (Fig. 3A: ⁇ -actin; Fig. 3B: tubulin). It was shown that B345 is expressed higher in colon cancer tissue than in normal tissue (see Table 2a). Now, however, both the normal tissue and the tumor tissue represent a very heterogeneous mixture of different cell types. Furthermore, the proportion of tumor cells in the tumor tissue varies greatly from about 30 to 80%. In order to minimize this biological heterogeneity, the epithelial cells of the large intestine, which are the original cells of the adenocarcinoma, and the cancer cells or cancer areas were specifically prepared by laser microdissection.
  • Tissue sections of 10 ⁇ m thickness were made with the Kyromikrotome from Leica, Jung CM1800 and onto one with polyethylene coated slides applied (Böhm et al., 1997). The sections, dried at room temperature for about 30 minutes, were incubated with Mayer's hematoxylin (SIGMA DIAGNOSTICS) and then washed under running water for five minutes to remove non-specifically bound dye. After drying for five minutes at 37 ° C, the laser microdissection was carried out. The laser microscope from PALM (PALM GmbH, Bernried, Germany) was used for this and about 2000 to 5000 cells were prepared. The cDNA obtained by reverse transcription was also analyzed here by real time PCR. The result shows that the B345 expression in colon carcinoma cell lines and in patient material is many times higher than that of the normal colon tissue. The expression level of GAPDH was determined for normalization (see FIG. 4 and Table 2B).
  • RNA from the lung carcinoma cell line Calu 6 (AACC No.HTB56) was reverse transcribed using the primer (SEQ ID NO: 9) and the resulting single-stranded cDNA was PCR by means of the gene-specific primer SEQ ID NO: 5 and the adapter primer SEQ ID NO: 10 amplified.
  • PCR For a 25 ul PCR approach, 1 ul of the cDNA pool with 2.5 ul lOxTaq buffer (Promega), 1.5 ul MgCl 2 (25 mM, Promega), 0.5 ul dNTPs (10 mM each, Boehringer Mannheim) , 1 ⁇ l primer mixture (20 ⁇ M each), 0.15 ⁇ l Taq polymerase (Promega) mixed in water.
  • the PCR was carried out as follows: 1 ⁇ 94 ° C. for 3 minutes; 30x 94 ° C 30 seconds,
  • the PCR was analyzed on a 1.2% agarose gel.
  • the two primers were then used to sequence the purified PCR product.
  • the determined Sequences showed high homology with the "in silico" cloned DNA section (including the PolyA tract).
  • Calu 6 was also used as the starting cell line.
  • a linker consisting of the two oligos SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 was ligated to the double-strand cDNA (Abe et al., 1992) .
  • the resulting LoneLinker cDNA library was then linearly amplified with the gene-specific primer SEQ ID NO: 6 over 35 cycles.
  • An aliquot of the B345-enriched cDNA could then be further amplified with the primers SEQ ID NO: 13 and LLEcoRIA SEQ ID NO: 11.
  • the cDNA mentioned has an open reading frame (ORF) which codes for a potential protein with a length of 749 amino acids.
  • ORF open reading frame
  • the translation initiation site at position 215 corresponds to approximately 75% of a Kozak consensus sequence.
  • the 5 ⁇ region and the promoter region as well as the accurate transcription initiation site were determined.
  • the 5 'region was performed using a genomic DNA library from Clontech with B345 specific primers ( SEQ ID NO: 38 or nested SEQ ID NO: 39) and adapter primer in the kit amplified.
  • the primer extension reaction was carried out to determine the exact start of transcription.
  • the primer SEQ ID NO: 40 at the 5 "end was labeled using 10 U of the T4 polynucleotide kinase (Promega) and 3 ⁇ l [ ⁇ - 32 P] ATP, (3000 Ci / mmol) according to standard protocols (Sa brook et al
  • the labeled oligonucleotide was purified by precipitation and 10,000 cpm oligonucleotide in a total volume of 20 ⁇ l to 25 ⁇ g total RNA of the Colo 205 cell line (ATCC: CCL-222) were used for the primer extension reaction.
  • RNA of the cell line was reverse transcribed with the radioactively labeled primer and applied to a 10% polyacryamide gel.
  • a PCR fragment of nt 1000 - nt 1362 with 35 S-labeled nucleotides was sequenced and also applied.
  • the fragment of 209 nucleotides resulting from the elongation of the reverse primer specifies the start of transcription exactly at position 201 B345 sequence obtained in Example 6a expanded in the 5 "region and a new start codon at position 283 determined.
  • the resulting primary amino acid sequence of B345 is shown in SEQ ID NO: 4.
  • Analysis of the hydrophilicity plot of the amino acid sequence by the method of Kyte and Doolittle (1982) shows that the B345 protein has two characteristic hydrophobic domains (amino acids pos. 1 - 29 and 666 - 691), which represent a signal peptide and a helical transmembrane domain ( Fig. 6).
  • This polarized structure indicates that B345 is an integral membrane protein.
  • the transmembrane helix connects an approximately 666 amino acid long extracellular and a short (145 amino acid) intracellular part (see FIG. 7).
  • the extracellular domain also has clear indications for the existence of a CUB domain at positions 220-350 as well as indications for two possible further CUB domains in the region of amino acids 425-660.
  • CUB domains are found in various proteins, most of which are regulated during embryonic development. In addition, CUB domains are sometimes found in EGF (epidermal growth factor) -like domains.
  • EGF epidermal growth factor
  • a recent publication (Gerstein et al., 2000) demonstrated that proteins containing CUB domains are the most pronounced differentially regulated proteins in C. elegans. Since genes that have a key role in embryonic development also perform analogous functions in cancer, it can be assumed overexpression of B345 in cells causes a change in the properties of the substrate adhesion or the extracellular matrix.
  • the protein also has 12 potential N-glycosylation sites found in the predicted extracellular domain, which is consistent with the predicted orientation of the protein.
  • a BLAST hit (E-value: 5.8 x 10 ⁇ 2 ) for the amino acid range from 235 to 282 of B345 identified a complement-activating component of the _RA-reactive factor (RARF) from mus musculus.
  • the alignment is located within CUB Domain 1 of B345.
  • the CUB domains 2 and 3 (range 425-535 and 545-660) have marginal homologies to the human and fugu
  • PCOLCE Procollagen C-Proteinase Enhancer Protein
  • the B345 protein presumably forms a ß-sheet secondary structure, since CUB domains are known to fold as a ß-sandwich.
  • the intracellular domain (range 691-836) has no significant homologies. However, the entire C-terminus was aligned with an EST (AW063026) of human ovarian cancer cells (82% identity over 124 amino acids).
  • Bac clones were first searched in public databases (BLAST search) which contained the B345 gene. Bac clones Ac068625 and Ac010170 contained one
  • the chromosomal location of the gene was determined using fluorescence in situ hybridization (FISH).
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • the human, digoxigenin-labeled B345 probe was used together with the biotin-labeled probe from B47a2 (Knight et al., 1997), which is located on the sub-telomeric region of the chromosome arm 3p, with metaphase chromosomes from two "normal" individuals hybridizes (Lichter et al., 1988).
  • the hybridized digoxygenin probe was detected using anti-sheep dig (Boehringer Mannheim FRG) and rabbit anti-sheep FITC-labeled antibodies.
  • the sample labeled with biotin was visualized with mouse anti-biotin and rabbit anti-mouse (TRITC) and then stained with DAPI.
  • TRITC mouse anti-biotin and rabbit anti-mouse
  • the FISH results show that a majority of the metaphases have unique signals at one or have two chromatids of chromosome 3 in the region p21-p23.
  • the co-localization of the B47a2 (TRITC) probe on the same chromosomal arm served as confirmation of the position.

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Abstract

Tumorassoziiertes Antigen B345 und dafür kodierende DNA-Moleküle.

Description

TUMORASSOZI IERTES ANTIGEN (B345 ) , GEKENNZEICHNET DURCH EINE AMINOSAURESEQUENZ WIE IN SEQ . ID . NO .4
5 Die Erfindung bezieht sich auf die Chemotherapie von Tumorerkrankungen.
Normale Körperzellen unterliegen einem strikt geordneten System, das das Wachstum, die Zellteilung und das Absterben bestimmter Zellen kontrolliert. So teilen sich
10 Körperzellen einer erwachsenen Person nur dann, wenn sie tote Zellen ersetzen oder eine Verletzung verheilen müssen. Krebszellen dagegen wachsen unkontrolliert weiter, sie akkumulieren und bilden einen Tumor. Erreicht der Tumor eine kritische Größe, können
15 Krebszellen über die Blutbahnen oder das Lymphsystem auch in andere Bereiche des Körpers transportiert werden und dort Kolonien bilden (Metastasen) . Nicht alle Tumore sind kanzerogen, denn benigne Tumore metastasieren nicht und sind daher meistens nicht lebensgefährlich, da sie
20 chirurgisch entfernt werden können. Detailliertere
Informationen zu diesem Thema sowie den weiter unten diskutierten Aspekten der Tumorentstehung geben folgende Publikationen: Rauscher und Vogt, 1997; Kastan, 1997; Hesketh, 1995; Pusztai, Lewis und Yap, 1995.
25 Die Transformation einer gesunden Zelle in eine
Krebszelle kann durch eine ganze Reihe von Faktoren, wie Umwelteinflüsse, Strahlung, Viren oder chemische Reagenzien ausgelöst werden. Bei der Tumorentwicklung spielen jedoch auch epigenetische (Methylierungen, Acetylierungen und veränderte Chromatinstruktur) und genetische Modifikationen (Punktmutation, Deletion, Amplifikation, Translokation) eine bedeutendende Rolle.
Mutationen in kodierenden Bereichen von Genen, die an der Regulation der Zeil-Proliferation beteiligt sind, können an der Überführung einer normalen Zelle in eine Tumorzelle beitragen, da die transformierte Zelle Wachstumsvorteile gegenüber ihrer gesunden Nachbarzelle hat.
Krebs entsteht also durch eine Ansammlung von vererbten oder erworbenen Mutationen in kritischen Protoonkogenen oder Tumorsuppressorgenen.
Die Zellproliferation steht unter der Kontrolle verschiedener Gensysteme, während Produkte von Onkogenen an der Signalvermittlung von Zelloberfläche zum Zellkern beteiligt sind, geleiten cyclinabhängige Proteinkinase und ihre Inhibitoren die Zelle durch den Zellzyklus. Nicht selten werden Störungen in der Synthese dieser Proteine bei Tumorzellen gefunden. Eine zentrale Rolle spielt dabei das p53 -Protein.
Proteine vom Typ des RB-Proteins regulieren die Verfügbarkeit entscheidender Transkriptionsfaktoren.
Die in Tumorgeweben hochregulierten Gene stellen 'meist den Ausgangspunkt für weitere detaillierte Analysen dar und da Proteine verschiedenster Funktionen hochexprimiert werden, ist der Ansatz für therapeutische Interventionen sehr vielseitig. Es ist daher das Ziel der Krebsforschung weitere neue Zielmoleküle (sog. „Targets" ) für therapeutische Interventionen zu finden, die dann für eine gezielte Therapie mit geringen Nebenwirkungen benutzt werden können.
In erster Linie gilt es daher molekulare Veränderungen zwischen Normalgewebe und Tumor auf dem Niveau der Genexpression („Transkriptionslevel") aufzudecken, die einerseits neue Targets identifizieren sollen und andererseits für die Entwicklung bzw. das Auffinden von Substanzen zur Hemmung von Fehlfunktionen herangezogen werden können.
Eine ganze Reihe verschiedenster Methoden zur
Identifizierung und Charakterisierung von neuen Targets, die den Ausgangspunkt für die Entwicklung von neuen Therapeutika darstellen, basieren auf der Erstellung differenzieller mRNA Transkriptionsprofile zwischen Tumoren und Normalgeweben. Dazu zählen die differenzielle Hybridisierung, die Erstellung von Subtraktions-cDNA-Banken ( "representational difference analysis"; Hubank und Schatz, 1994; Diatchenko et al . , 1996) und der Einsatz der DNA-Chip Technologie oder der SAGE-Methode (Velculescu et al . , 1995).
Neben immuntherapeutischen Ansätzen kommt der gezielten Chemotherapie eine wesentliche Rolle bei der Behandlung von Krebs zu. Unter Chemotherapie versteht man die Verabreichung von Substanzen, die durch Eingriff in Stoffwechsel, Signaltransduktion und
Zellteilungsvorgänge maligner Zellen entweder zytostatisch oder zytotoxisch-zytolytisch wirken. Chemotherapeutika lassen sich auf Grund der Beeinflussung von spezifischen Targets in der Tumorzelle, nach Art der zellulären Interaktion und der Wechselwirkung mit einer bestimmten Zellzyklusphase, in verschiedene Kategorien unterteilen.
Die Art der Krebsbehandlung hängt vom Tumorstadium ab, entscheidend ist dabei, ob bereits Metastasen vorhanden sind und wie weit diese im Körper verbreitet sind. Die Applikation von Zellgiften zur Krebsbehandlung ist, neben operativen Maßnahmen und der Strahlentherapie, ein integraler Bestandteil der heutigen Therapiekonzepte in der Onkologie.
Im wesentlichen gibt es zwei Hauptziele der
Chemotherapie: In erster Linie ist es die Heilung von Krebs; das bedeutet, dass der Tumor verschwindet und nicht mehr auftritt. Ist eine Heilung aus verschiedensten Gründen nicht mehr möglich, versucht man den Tumor in seinem Wachstum und seiner Ausbreitung einzuschränken bzw. zu kontrollieren.
Prinzipiell entfalten Substanzen, die bei der Chemotherapie Anwendung finden, ihre Wirkung bei allen sich teilenden Zellen. Tumorzellen zeigen jedoch eine höhere Empfindlichkeit gegenüber Chemotherapeutika als gesunde Zellen, da hauptsächlich stark proliferierende Zellen angegriffen werden.
Jedes Gewebe hat ein charakteristisches Wachstumsverhalten, das Zellteilung, Wachstumsstillstand, Differenzierung und Alterung umfasst und durch interne und externe Faktoren beeinflusst und reguliert wird.
Viele der heute eingesetzten zytotoxischen Chemotherapeutika wirken nur bei proliferierenden Zellen (nicht in der G0-Phase der Zellteilung) . Dabei werden allerdings sowohl Normal- als auch Krebszellen attackiert. Die Zerstörung von normalen Zellen kann zu starken Nebeneffekten führen; z.B. Zerstörung der Blutzellen-produzierenden Gewebe des Knochenmarks (Myelosuppression) .
Chemotherapeutika werden je nachdem, wie sie spezifische Substanzen innerhalb der Tumorzelle beeinflussen, mit welchen zellulären Prozessen die Medikamente interagieren und welche Zellzyklusphase sie beeinflussen, in verschiedene Kategorien unterteilt.
Diese Informationen sind für Onkologen notwendig für die Entscheidung welche Präparate bei der Therapie miteinander kombiniert werden können.
Die in Tumorgeweben hochregulierten Gene stellen somit potentielle neue Zielstrukturen dar und da Proteine verschiedenster Funktionen hochexprimiert werden, ist der Ansatz für therapeutische Interventionen sehr vielseitig.
Es ist daher das Ziel der Krebsforschung, weitere neue Targets für therapeutische Interventionen zu finden, die dann für eine gezielte Therapie mit - verglichen mit derzeitig eingesetzten Therapeutika - geringeren Nebenwirkungen benutzt werden können.
In Tumorgeweben hochregulierte Gene stellen Angriffspunkte und somit potentielle Zielstrukturen („Targets") für die Chemotherapie dar.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein neues, bevorzugt von Tumorzellen exprimiertes Protein bereitzustellen, das ein Zielmolekül für die Intervention mittels chemotherapeutischer Methoden darstellt .
Diese Aufgabe wurde gelöst, indem zunächst mittels RDA („representational difference analysis") zwischen einer Lungen-Adenokarzinom-Zelllinie (A549) und
Normallungengewebe eine cDNA-Substraktionsbibliothek hergestellt wurde. Zur Selektion der im Tumor überexprimierten Antigene wurden anschließend die erhaltenen cDNA-Klone sequenziert und mit in Datenbanken verfügbaren Sequenzen verglichen. Unter den dabei annotierten Genen befanden sich 321 unbekannte, zu denen größtenteils ESTs ("expressed sequence tags") -Einträge in der Datenbank existierten. Nach einer weiteren qualitativen PCR-Analyse in cDNA-Bibliotheken von kritischen Normalgeweben und immunprivilegierten Geweben sowie detaillierteren Datenbankrecherchen wurde die Anzahl der Kandidatenklone auf 59 eingeschränkt, deren ESTs nicht aus kritischen Normalgeweben stammen.
Diese Klone wurden auf Incyte DNA Chips gespottet und mit einer ganzen Reihe von Tumorgeweben und
Normalgeweben als Referenz hybridisiert . Das mRNA Expressionsprofil von EST Fragmenten, die in Krebsgeweben und Normalgeweben differentiell exprimiert werden und zu einem noch unbekannten Gen gehören, wurde mit unterschiedlichen Methoden verifiziert.
Die Länge der Transkripte wurde mittels Northern blot Analyse bestimmt und das Expressionsmuster in verschiedenen Zellsystemen durch quantitative PCR exakt charakterisiert. Nur unbekannte Gene bzw. ESTs mit tumorspezifischen Expressionsprofil wurden weiterverfolgt und einer "füll length Klonierung" unterworfen. Potentielle ORFs ("open reading frames") werden in die entsprechende Aminosäuresequenz umgewandelt und zur möglichen Funktionsvorhersage mittels in silico Strategien analysiert.
Die humane B345-cDNA wurde kloniert, die in einem ersten Klonierungsansatz erhaltene Sequenz ist in SEQ ID NO:l dargestellt. Die Sequenzanalyse der in diesem Ansatz klonierten humanen B345-CDNA zeigte einen durchgehenden offenen Leserahmen von Position 215 bis Position 2461 (exklusive Stopcodon) , der, auf Nukleotid- und Proteinebene, in den bekannten Sequenzen der Datenbanken keine Homologie oder Identität aufweist. Aus den aus Northern Blot Experimenten gewonnenen Daten ist zu schließen, dass das B345-Transkript eine Länge von ca. 6,5 kb hat. In einem ersten Ansatz wurde als klonierter Bereich eine B345-CDNA mit 5897 bp (exklusive polyA- Region) , erhalten, wobei das Vorhandensein eines Polyadenylationssignals und des PolyA-Tails am 3 '-Ende der Sequenz auf die Vollständigkeit der cDNA in diesem Bereich hindeutete. Aufgrund der Tatsache, dass im 5 '-Bereich der klonierten cDNA von Position 1 bis 214 kein durchgehender Leserahmen aufschien, wurde zunächst angenommen, dass es sich bei dem ATG an Position 215, die auch zu 75% einer Kozak Translationinitiationsstelle (ACCATGT) (Kozak, 1987) entspricht, um das Startkodon von B345 handelt.
In einem weiteren Klonierungsansatz wurden mittels einer molekularbiologischen Standardmethode, und zwar mittels sog. „Promotor Finder DNA Walking", zusätzliche Informationen über die weiter stromaufwärts liegende Sequenz von B345 gewonnen.
Somit wurde die in dem ersten Klonierunsversuch erhaltene B345-Sequenz (SEQ ID NO:l) in der 5"Region erweitert. Der Transkriptionsstart konnte unter
Anwendung der Primer Extension Analyse genau lokalisiert werden und liegt bei Position 201 (SEQ ID NO: 3) . Durch wiederholte Sequenzierungen auch in der 3 ^Region wurde, im Vergleich zur in SEQ ID NO:l dargestellten Sequenz, eine zusätzliche Base an Position 2430 gefunden, die zu einer Leserasterverschiebung führt und somit das Stoppcodon von Position 2729 auf 2791 verschiebt. Die erhaltene cDNA (SEQ ID NO: 3) besitzt einen offenen Leserahmen, der für ein potentielles Protein mit einer Länge von 836 Aminosäuren (SEQ ID NO: 4) kodiert. Die
Translationsinitiationsstelle an Position 283 entspricht etwa zu 70% einer Kozak-Konsensussequenz .
Die Promotorregion 200bp upstream der mutmaßlichen Transkriptionsstartstelle enthält weder eine TATA noch eine CCAAT box, jedoch eine eindeutige GC-box, welche eine Bindungsstelle des SP1 Proteins darstellt. Die Tatsache , dass der GC Gehalt in der 5 "Region über 60% ist, deutet auf ein CpG Island hin (Bird, 1986) .
Die resultierende primäre Aminosäuresequenz von B345 ist in SEQ ID NO: 4 gezeigt. Die Analyse des Hydrophilizitäts Plots der Aminosäuresequenz zeigt, dass das B345 Protein zwei charakteristische hydrophobe Domänen aufweist, die ein Signalpeptid und eine helikale Transmembrandomäne darstellen (Fig. 6) . Diese polarisierte Struktur deutet darauf hin, dass es sich bei B345 um ein integrales Membraneprotein handelt.
Die extrazelluläre Domäne läßt auf die Existenz von definitiv einer, gegebenenfalls drei, CUB Domänen schließen. CUB Domänen kommen bei verschiedenen, meist während der Embryonalentwicklung regulierten Proteinen vor. Eine kürzlich erschienene Publikation (Gerstein et al., 2000) demonstriert, daß CUB Domänen enthaltende Proteine die am ausgeprägtesten differenziell regulierten Proteine in C. elegans sind. Da Gene, die eine Schlüsselrolle in der Embryonalentwicklung haben, entsprechende Funktionen, z.B. in der Zellteilung, der Zeilproliferation oder Signalübertragung, in Krebs ausführen, kann angenommen werden, dass eine Überexpression von B345 in Zellen eine Veränderung in den Eigenschaften der Substratadhäsion oder der extrazellulären Matrix bewirkt. Das B345 Protein weist 12 potentielle N-Glycosylierungsstellen auf, die in der mutmaßlichen extrazellulären Domäne zu finden sind.
Aufgrund seiner Aminosäuresequenz ist anzunehmen, dass das B345-Protein eine ß-Sheet Sekundärstruktur ausbildet, da sich CUB Domänen bekanntlich als ß-Sandwich falten.
Die intrazelluläre Domäne (Bereich 691-836) weist keine signifikanten Homologien auf. Der gesamte C-Terminus zeigt jedoch eine Identität (82%) über 124 Aminosäuren mit einem EST (Acc No. AW063026) aus humanen Eierstockkrebs Zellen.
Ausgehend von den Funktionen anderer CUB Domänen enthaltender Proteine kann gefolgert werden, daß das B345 Transmembranprotein in der Kommunikation, der Interaktion und/oder der Signaltransduktion mit extrazellulären Komponenten oder Liganden eine Rolle spielt. Ferner sind die Daten der Expressionsanalyse ein starkes Indiz dafür, dass B345 beim metastatischen
Prozess von Krebs, insbesondere Dickdarmkrebs, beteiligt ist .
Für die Aufklärung der physiologischen Funktion und der Rolle von B345 bei der Metastasierung sind folgende Untersuchungsmethoden geeignet:
Zunächst werden Zelllinien, vorzugsweise humane Zelllinien identifiziert, z.B. mittels TaqMan PCR, die B345 nicht endogen exprimieren. Die Zellen werden mit einem Plasmid, das die B345-Sequenz enthält, transfiziert und B345 exprimiert. Änderungen in der
Morphologie und/oder dem Migrationsverhalten, das z.B. mittels Softagar Assay (Hamburger und Salmon, 1977) oder Migrationsassay (Liaw et al; 1995) der B345 exprimierenden Zellen gegenüber den nicht-transfizierten Zellen deuten auf eine Rolle von B345 in dem dafür verantwortlichen biologischen Prozess hin. Dies ist ein deutlicher Hinweis auf eine Beteiligung von B345 an der Interaktion von Tumorzellen untereinander und/oder mit der extrazellulären Matrix und somit auf eine Funktion bei der Metastasierung.
Alternativ bzw. zusätzlich zu dieser Funktionsanalyse wird in einem komplementären Ansatz die Expression von B345 in Zellen, die dieses Protein endogen exprimieren, unterdrückt, um ebenfalls die etwaige Änderungen in Morphologie und/oder Migrationsverhalten festzustellen. Außerdem wird gegebenenfalls untersucht, ob Proteinkomponenten existieren, die mit B345 inter- oder extrazellulär interagieren (z.B. mittels Yeast Two Hybrid System (Fields und Song, 1989) .
Die Erfindung betrifft somit in einem ersten Aspekt ein tumorspezifisches Polypeptid mit der Bezeichnung B345, mit der in SEQ ID NO: 4 angegebenen Aminosäuresequenz oder ein Polypeptid, das von einem Polynukleotid kodiert wird, das unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz oder einer Teilsequenz davon hybridisiert, sowie davon abgeleitete Proteinfragmente oder Peptide.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes DNA-Molekül, kodierend für das tumorspezifische Polypeptid der Bezeichung B345.
Bevorzugt ist das erfindungsgemäße DNA-Molekül ein Polynukleotid der in SEQ ID NO : 3 dargestellten Sequenz oder ein Fragment davon oder ein DNA-Molekül, das mit einem DNA-Molekül der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz oder einer Teilsequenz davon unter stringenten Bedingungen hybridisiert, oder ein Fragment davon.
Unter „stringenten Bedingungen" wird z.B. verstanden: Inkubation über Nacht bei 65°C - 68 °C mit βxSSC (lxSSC = 150 mM NaCl, 15 mM Tri-Natriumcitrat) , 5xDenhardt ' s Lösung, 0.2%SDS, 50 μg/ml Lachsspermien-DNA, daran anschließend Waschen zweimal 30 min mit 2xSSC, 0.1% SDS bei 65°C, einmal 30 min mit 0.2xSSC, 0.1% SDS bei 65°C und gegebenenfalls abschließendes Spülen mit O.lxSSC, 0.1%SDS bei 65°C, oder äquivalente Bedingungen. Die erfindungsgemäßen DNA Moleküle kodieren für (Poly)peptide der Bezeichnung B345 mit der in SEQ ID NO: dargestellten Aminosäuresequenz bzw. für davon abgeleitete Proteinfragmente oder Peptide; damit sind DNA Moleküle bzw. Fragmente mitumfasst, die durch die Degeneration des genetischen Codes Abweichungen von der in SEQ ID NO : 3 dargestellten Sequenz aufweisen
In einer Ausführungsform der Erfindung betrifft die Erfindung ein isoliertes DNA-Molekül der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz oder ein Fragment davon, oder ein DNA-Molekül, das mit einem DNA-Molekül der in SEQ ID NO: 3 dargestellten oder mit einer Teilsequenz davon hybridisiert, kodierend für das natürliche B345-Polypeptid bzw. für ein Fragment davon.
Die B345-DNA-Moleküle können in einer sog. DNA-Vakzine für die Immuntherapie von Tumoren verwendet werden.
Dabei können die B345-DNA-Moleküle der Erfindung, vorzugsweise in rekombinanter Form als Plasmide, direkt oder als Bestandteil eines rekombinanten Virus, oder Bakteriums verabreicht werden. Prinzipiell kann jede gentherapeutische Methode für die Immuntherapie von Krebs auf Basis von DNA ("DNA-Vakzine") auf B345-DNA angewendet werden, und zwar sowohl in vivo als auch ex vivo.
Beispiele für die in vivo Verabreichung sind die direkte Injektion von "nackter" DNA, entweder intramuskulär oder mittels Gen-Pistole ("gene gun") von der sich gezeigt hat, daß sie zur Bildung von CTLs gegen Tumorantigene führt. Beispiele für rekombinante Organismen sind Vaccinia Virus, Adenovirus oder Listeria monocytogenes (eine Übersicht wurde von Coulie, 1997, gegeben) . Desweiteren können synthetische Träger für Nukleinsäuren, wie kationische Lipide, Mikrosphären, Mikrokügelchen oder Liposomen für die in vivo Verabreichung von Nukleinsäure-Molekülen, kodierend für B345-Peptid verwendet werden. Verschiedene Hilfsstoffe, die die Immunantwort verstärken, können mitverabreicht werden, z.B. Zytokine, entweder in Form von Proteinen oder dafür kodierenden Plasmiden. Die Applikation kann gegebenenfalls mit physikalischen Methoden, z.B. Elektroporation, kombiniert werden.
Ein Beispiel für die ex vivo Verabreichung ist die Transfektion dendritischer Zellen, wie von Tuting, 1997, beschrieben, oder anderer APCs,.die als zelluläre Krebsvakzine zur Anwendung kommen.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt die Verwendung von Zellen, die B345 exprimieren, entweder von sich aus oder, in gegebenenfalls modifizierter Form, nach Transfektion mit der entsprechend kodierenden Sequenz, für die Herstellung einer Krebsvakzine.
Alternativ zur natürlichen B345-CDNA bzw. Fragmenten davon können modifizierte Derivate verwendet werden. Diese umfassen Sequenzen mit Modifikationen, die für ein Protein (fragment) bzw. Peptide mit stärkerer
Immunogenität kodieren, wobei für die Modifikationen auf DNA-Ebene dieselben Überlegungen gelten wie für die oben beschriebenen Peptide. Eine weitere Art der Modifikation ist die Aneinanderreihung zahlreicher Sequenzen, kodierend für immunologisch relevante Peptide, nach Art einer Perlenschnur ("string-of-beads" ; Toes et al . , 1997) . Die Sequenzen können auch durch Anfügung von Hilfselementen modifiziert werden, z.B. Funktionen, die eine effizientere Abgabe und Prozessierung des Immunogens gewährleisten (Wu et al., 1995). Beispielsweise kann durch Anfügen einer
Lokalisierungssequenz in das endoplasmatische Retikulum ("ER targeting sequence") die Prozessierung und damit die Präsentation und letztlich die Immunogenität des Antigens erhöht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt ein rekombinantes DNA-Molekül, das B345-DNA enthält, z.B. verbunden mit einer regulatorischen DNA-Sequenz, insbesondere einer heterologen regulatorischen DNA-Sequenz, z.B. einem Promoter oder Enhancer .
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt Antikörper gegen B345 bzw. Fragmente davon. Polyklonale Antikörper können in herkömmlicher Weise durch Immunisierung von Tieren, insbesondere Kaninchen, mittels Injektion des B 345-Antigens bzw. Fragmenten davon, und anschließender Reinigung des Immunglobulins erhalten werden.
Monoklonale anti-B345-Antikörper können nach Standardprotokollen gemäß dem von Köhler und Milstein, 1975, beschriebenen Prinzip gewonnen werden, indem Tiere, insbesondere Mäuse, immunisiert, anschließend antikörperproduzierende Zellen der immunisierten Tiere immortalisiert werden, z.B. durch Fusion mit Myelomzellen, und der Überstand der erhaltenen Hybridome mittels immunologischer Standard-Assays auf monoklonale anti-B345-Antikörper gescreent wird. Für den therapeutischen oder diagnostischen Einsatz im Menschen können diese tierischen Antikörper gegebenenfalls auf herkömmliche Weise chimerisiert (Neuberger et al., 1984; Boulianne et al . , 1984) oder humanisiert (Riechmann et al . , 1988; Graziano et al . , 1995) werden.
Humane monoklonale anti-B345-Antikörper (fragmente) können auch von sog. "Phage Display Libraries" (Winter et al., 1994; Griffiths et al . , 1994; Kruif et al . ,
1995; Mc Guiness et al . , 1996) und mittels transgener Tiere (Brüggemann et al., 1996; Jakobovits et al., 1995) gewonnen werden.
Die erfindungsgemäßen anti-B345-Antikörper können in immunhistochemischen Analysen für diagnostische Zwecke eingesetzt werden, oder als Therapeutikum in der Krebstherapie. (Ein Beispiel für die erfolgreiche Anwendung eines monoklonalen Antikörpers in der Krebstherapie ist Herceptin; ein Antikörper gegen das Proto-Onkogen HER2. Herceptin kann in Brustkrebs- Patienten angewendet werden, die eine Überexpression von HER2 aufweisen.)
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von B345-spezifischen Antikörpern, um beliebige Substanzen selektiv zu bzw. in einen Tumor zu bringen, der B345 exprimiert. Beispiele für solche Substanzen sind zytotoxische Agenzien oder radioaktive Nuklide, deren Wirkung darin besteht, den Tumor Vorort zu schädigen. Aufgrund der relativ tumorspezifischen Expression von B345 sind dabei nur geringe Nebenwirkungen zu erwarten. In einem weiteren Aspekt können mit Hilfe von B345-Antikörpern Substanzen zur Sichtbarmachung von Tumoren, die B345 exprimieren, herangezogen werden. Dies ist für die Diagnose und die Bewertung des Therapieverlaufs von Nutzen.
Therapeutische und diagnostische Anwendungen von Antikörpern, die für anti-B345-Antikörper in Frage kommen, sind in der WO 95/33771 beschrieben.
Das Protein der Bezeichnung B345 gemäß der vorliegenden Erfindung und die davon abgeleiteten Proteinfragmente, Peptide bzw. Peptid-Äquivalente oder Peptidomimetika können in der Krebstherapie eingesetzt werden, z. B. um eine Immunantwort gegen Tumorzellen zu induzieren, die die entsprechenden Antigen-Determinanten exprimieren. Vorzugsweise werden sie für die Therapie von
B345-positiven Tumoren verwendet, insbesondere beim Lungen- und Kolonkarzinom.
B345 bzw. Peptide, Peptid-Äquivalente und Peptidomimetika können für die Immuntherapie von Krebs eingesetzt werden, wie z.B. in der WO 00/73438 beschrieben, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird.
Es ist bekannt, dass tumorassoziierte Antigene tumorspezifische Mutationen aufweisen können, die zu: einer immunologischen Unterscheidung zwischen Tumor und Normalgewebe beitragen (Mandruzzato et al . , 1997; Hogan et al., 1998; Gaudi et al., 1999; Wölfel et al.,1994). Um das Vorhandensein tumorspezifischer B345-Mutationen festzustellen, wird, zweckmäßig mit Hilfe von Sonden aus der erfindungsgemäßen isolierten cDNA, die B345-cDNA aus einem oder mehreren unterschiedlichen Tumoren kloniert und die erhaltenen Sequenzen mit Normalgewebs-B345-CDNA verglichen. Es werden Versuche durchgeführt, die zeigen sollen, ob Tumor-B345-Peptide aus einem gegenüber Normalgewebs-B345 mutierten Sequenzabschnitt im Vergleich zu Normalgewebs-B345-Peptiden aus dem entsprechenden Abschnitt eine verstärkte Immunogenität aufweisen. Um zu bestätigen, dass etwaige Mutationen tumorspezifisch sind, können Antikörper gegen diese Bereiche generiert und Tumorzellen auf Expression von möglichen Mutationen untersucht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt B345-Peptide, abgeleitet von Bereichen eines tumorexprimierten B345, die tumorspezifische Mutationen aufweisen.
Auf Grund der bevorzugten Expression von B345 in Tumorzellen kann angenommen werden, dass dieses Protein eine wichtige Funktion für den Tumor hat, z.B. für Entstehung, Infiltration und Wachstum und somit ein Target für die chemotherapeutische Intervention darstellt .
Im Hinblick auf seinen Einsatz als Target in der gezielten Chemotherapie wird B345 näher charakterisiert, um die geeignete Strategie für die Intervention mit dieser Funktion zu entwickeln.
Als ersten Schritt bei der sog. "down-stream" Funktionsanalyse von B345 führt man zweckmäßig in einem ersten Schritt eine bioinformatische Analyse durch, die den für die experimentelle Validierung von B345 als Target richtungweisend ist. Für diese Analyse stellen die auf Ähnlichkeit und modularer Struktur beruhenden Bioinformatik-Konzepte eine wesentliche Grundlage dar. Etablierte bioinformatische Hilfsmittel zur Feststellung von Ähnlichkeiten sind BLAST
(http : //www.ncbi .nlm.nih.gov/BLAST, Altschul et al . , 1997) oder FASTA (Pearson & Lipman, 1988) , die spezialisierten Datenbanken wie Pfam (http: //www. sanger .ac .uk/Pfam, Bateman et al . , 2000) und SMART (http : //smart . embl-heidelberg . de, Schultz et al . , 2000) , welche Domänenstrukturen berücksichtigen. Zur Verfeinerung der Analyse können Applikationen wie Clustal (http : //www2. ebi . ac . uk/clustalw, Higgins et al . , 1996) HMMer (http : //hmmer.wustl . edu) , PSI-BLAST (Altschul et al . , 1997) und die PROSITE Datenbank
(http: //www.expasy.ch/prosite, Hofmann et al . , 1999) herangezogen werden. Statistische Analysemethoden, die nicht auf Homologien beruhen, gestatten die Vorhersage weiterer Struktur- und funktionsrelevanter Eigenschaften wie der Sekundärstruktur und des Auftretens von
Transmembransegmenten und Helix-Turn-Helix-Motiven. Methoden zur Vorhersage der Sekundärstruktur von Proteinen sind verfügbar; besonders erwähnenswert ist Jpred (http: //barton. ebi .ac .uk/servers/jpred.html, Cuff et al., 1998). Die Sekundärstrukturvorhersage kann
Funktionshypothesen untermauern, etwa wenn die Struktur des vermuteten Homologen bekannt ist.
Gemäß Bioinformatikanalyse weist B345 eine helikale Transmembrandomäne auf, wobei sowohl der N-terminale als auch der C-terminale Bereich hydrohpil sind, was darauf schließen lässt, dass dieses Protein ein Transmembranprotein darstellt. Der N-terminale, extrazelluläre Bereich besitzt einige CUB-Domänen, welche zu Disulfidbrückenbildung neigen und daher bei der Dimerisierung bzw. bei Protein -Protein Wechselwirkungen beteiligt sind (Bork et al . , 1993) . Das C-terminale, intrazelluläre Ende zeigt Homologien zu einer Rezeptorkinase und zu einem C-Kinase Substrat.
In weiterer Folge wird B345 einer biochemischen und biologischen Analyse unterworfen.
In einem nächsten Schritt wird die Funktion von B345 für das Tumorgeschehen aufgeklärt; z.B. durch
Proliferationsassays in vitro oder in Tiermodellen, die das zu untersuchende B345-Gen überexprimieren (konstitutiv oder induzierbar) und als Kontrolle entweder in deletierter (inaktiver) Form exprimieren oder über Antisense hinunteregulieren (siehe z.B. Grosveld und Kollias, 1992) .
B345 kann in Screening-Assays verwendet werden, um Substanzen zu identifizieren, die die Aktivität dieses Proteins modulieren, insbesondere inhibieren. In einer Ausführungsform kann ein derartiger Assay z. B. darin bestehen, das B345 Protein, oder ein aktives Fragment davon, in Zellen, die auf die Aktivität von B345 mit Proliferation reagieren, einzubringen bzw. die entsprechende B345 cDNA in der Zelle zur Expression zu bringen, und die Proliferation der Zellen in Gegenwart und in Abwesenheit einer Testsubstanz zu bestimmen.
Ein Beispiel für Testzellen sind Zellen mit niedriger Teilungsrate, z.B. primäre Zellen, die kein endogenes B345 aufweisen. Um die Eignung der Zellen für einen Screening-Assay festzustellen, werden diese mit B345-CDNA transformiert, gezüchtet und mit Standard- Assays, z.B. Thymidin-Einbau, auf ihre Proliferationsfähigkeit getestet. Aufgrund einer nach B345-Expression signifikanten Erhöhung ihrer Proliferationseigenschaft können sie als Testzellen eingesetzt werden, z.B. in High Throughput Screening Proliferationsassays. Beispiele für Proliferationsassays im High Throughput Format, z.B. auf Grundlage des MTS- Assays, sind in der WO 98/00713 beschrieben.
Substanzen mit proliferationshemmender Wirkung können zur Behandlung von Tumoren mit starker B345 -Expression verwendet werden, insbesondere beim Lungen-und Kolonkarzinom.
Figurenübersicht:
Fig. 1A: Expressionsprofil von B345, B452 und B540 in individuellen Lungenkarzinomen und Lungentumorzelllinien.
Fig. 1B: Expressionsprofil von B345 in normalem Dickdarmgewebe und Tumorzelllinien.
Fig. IC: Graphische Darstellung des Alignments von B345, B452 und B540.
Fig. 2A: Northern Blot Analyse der Tumorzelllinie A549 mit einem 490bp langem B345 PCR-Produkt
Fig. 2B: Northern Blot Analyse verschiedener
Normalgewebe mit einem 490bp langem B345 PCR-Produkt Fig. 2C: Northern Blot Analyse verschiedener
Krebsgewebe mit einem 318bp langen B345 PCR-Produkt
Fig. 3 mRNA Expressionsanalyse von B345 durch real-time PCR von Tumor- und Normal-Geweben.
Fig. 4: mRNA Expressionsanalyse von B345 durch real-time PCR von Laser-Mikroskop-präparierten Dickdarmtumoren (LCM) sowie normalem Dickdarmgewebe und Tumorzelllinien.
Fig. 5: Graphische Darstellung der Genstruktur von B345.
Fig. 6: Hydrophilizitäts-und Transmembran-Blot des B345-Proteins
Fig. 7: Potentielle Proteinstruktur von B345
Tabellenübersicht
Tab . 1 : Zusammenfassung der Northern Blot Daten von B345 in verschiedenen Normalgeweben (1A) , Krebszelllinien (1B) ; und verschiedenen
Normalgeweben im Vergleich mit dem entsprechenden Tumorgewebe (IC)
Tab. 2A: Zusammenfassung der Daten der quantitativen PCR von B345 in verschiedenen Normal- und Krebsgeweben Tab. 2B: Zusammenfassung der Daten der quantitativen PCR von B345 in verschiedenen Normalgeweben und mikrodissektierten Kolonadenokarzinom Geweben
Zeichenerklärung
+++ extrem positiv
++ stark positiv
+ positiv
(+) schwach positiv
negativ
Beispiel 1
RDA („Representational Difference Analysis") von der humanen Adenokarzinom-Zelllinie der Lunge (A549) und normalem Lungengewebe
Die von ATCC bezogene humane Lungenadenokarzinom- Zellinie A549 (CCL 185) wurde in T150 Zellkulturflaschen hochgezüchtet. Als Nährmedium diente MEM mit 10% hitze- inaktiviertem, fötalem Kälberserum und 2 mM L-Glutamin. Alle 3 bis 4 Tage wurden die Zellen durch Trypsinisieren 1:5 bis 1:10 zur Propagation gespalten. Nach Erreichen von etwa 80% Konfluenz wurden pro T150 Zellkulturflasche 4 ml einer Trypsinlösung (Angaben pro Liter: 8g NaCl, 0,2g KC1, 1,13g Na2HP04-wasserfrei , 0,2g KH2PO4,
100ml 2,5% Trypsinlösung, lg EDTA-Na-Salz; pH 7,2 - 7,4) zum Ernten der Zellen eingesetzt. Die 4 ml wurden in ein 15 ml Falconröhrchen transferiert, mit 8 ml PBS versetzt, bei 1200 rpm in einer Haereus Tischzentrifuge (Megafuge 2.0R) 5 min bei 4°C zentrifugiert, das Zellpellet mit 1 ml Lysis-Puffer (lOmM Tris-HCl pH8, 140mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,5% NP40) versetzt, kräftig geschüttelt und in einem 2 ml Eppendorfgefäß bei 12 000 rpm und 4°C 5 min in einer Sigma Tischzentrifuge (Sigma 202 MK) abzentrifugiert . Der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß transferiert und nach Zusatz von 55 μl 20% SDS-Lösung zweimal mit dem doppelten Volumen an einer CHCl3/Phenol (1:1 v/v) Mischung und einmal mit dem einfachen Volumen an CHC13 extrahiert. Die wässrige RNA-enthaltende Phase wurde mit 1/10 Volumen an 3M NaAc (pH5) und dem zweifachen Volumen an 96% EtOH versetzt und über Nacht bei -20°C die RNA präzipitiert . Ausgehend von 1 mg Gesamt-RNA wurde für die Isolierung von poly-A(+)RNA mittels des PolyATtract Kit (Promega) entsprechend dem Hersteller-Protokoll vorgegangen. Die Lagerung der A549 poly-A(+)RNA mit einer Konzentration von 1 mg/ml in DEPC-behandeltem H20 erfolgte in Aliquots bei -80°C.
Zur Durchführung der repräsentativen Differenzanalyse (RDA; Hubank and Schatz, 1994; Diatchenko et al . , 1996) wurde die poly-A(+)RNA der Lungenadenokarzinom-Zellinie A549 als „fester", die von normalem Lungengewebe (1 mg/ml; Clontech, Palo Alto; #6524-1) als „driver" eingesetzt. Die RDA wurde unter Verwendung des PCR-select™ kit (Clontech, Palo Alto) entsprechend dem Hersteller-Protokoll durchgeführt, mit der Ausnahme, dass ein modifiziertes Primer/Adaptor-2- Oligonukleotidsystem zum Einsatz kam: Adaptor-2-alt-l (SEQ ID NO:31) und nested-PCR-primer-2-alt (SEQ ID NO: 32) und Adaptor-2-alt-2 (SEQ ID NO: 33) . Die neu generierten Primer/Adaptor-Sequenzen ermöglichen durch die Anwesenheit von drei neuen Restriktionsenzymschnittstellen (Kpn I, Sac I und Xho I) in der Sequenz des nested-PCR-primer-2-alt nach Klonierung der subtrahierten cDNA-Fragmente in den pPCRII-Vektor ein nachträgliches Herausschneiden der jeweiligen cDNA-Fragmente. Das Designen einer Primer/Adaptorsequenz mit mehreren verfügbaren
Restriktionsenzymschnittstellen war deshalb notwendig, weil besonders in den Primersequenzen - bedingt durch die PCR-Amplifikationsschritte- oft Punktmutationen zu beobachten waren.
Nach der Synthese von doppelsträngiger cDNA mittels oligo-dT wurde die erhaltene cDNA von "tester" und "driver" mit Rsal verdaut (Rsal ist ein 4-Basen erkennendes Restriktionsenzym und liefert im statistischen Mittel 256 bp lange cDNA-Fragmente) . Gleiche Teile von "tester-cDNA" wurden entweder mit den Adaptoren 1 oder 2 ligiert und anschließend getrennt mit einem Überschuss an "driver-cDNA" bei 65 °C hybridisiert. Danach wurden die beiden Ansätze vereinigt und einer zweiten Hybridisierung mit frischer denaturierter "driver-cDNA" unterworfen. Die angereicherten "tester" - spezifischen cDNAs wurden anschließend durch PCR, mit für die Adaptoren 1 bzw. 2 spezifischen Primern, exponentiell amplifiziert . Für eine weitere Anreicherung wurde ein Aliquot dieser Reaktion einer zweiten PCR mit spezifischen nach innen versetzten ("nested") Primern unterworfen. Die aus dieser Reaktion resultierenden, exponentiell amplifizierten cDNA-Fragmente wurden direkt in den pCRII-Vektor (Invitrogen; "TA-cloning vector") ligiert und anschließend ein Drittel des Ligationsansatzes in kompetente E. coli (OneShot™, Invitrogen) transfiziert .
712 positive Transformanten (Blau-Weiß-Selektion) wurden erhalten und in 96-Napf Blöcken in LB-Amp Medium (1,3 ml pro Napf) für 48 h bei 37°C kultiviert. Pro Napf wurden 750 μl der E. coli Suspensionen für die Präparation der Plasmid-DNA eingesetzt (96-Napf- Minipräparationsmethode von QIAgen nach Vorschrift des Herstellers) . Die verbleibenden Bakterienkulturen wurden als Glycerinstammkulturen bei -80°C gelagert.
Es wurde eine aus 712 Einzelklonen bestehende cDNA- Subtraktionsbibliothek erhalten, die sowohl in Form von E. coli Glycerin-Stammkulturen als auch in Form gereinigter Plasmide vorlag.
Beispiel 2
DNA-Sequenzierung und Annotation von TAA-Kandidaten
Die isolierte Plasmid-DNA sämtlicher 712 Klone (siehe Beispiel 1) wurde nach der Sanger-Methode auf einem ABI-377 Prism Gerät sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden mittels der BioScout-Software (LION, Heidelberg) annotiert und Datenbankvergleichen (Genbank) unterzogen. Von 712 Klonen konnten 678 sequenziert und annotiert werden. Der Rest (34) wies als Insert entweder nur poly(A) Sequenzen auf oder entsprach einem religierten Vektor oder war nicht sequenzierbar. Von den 678 annotierbaren Sequenzen erwiesen sich 357 als Gene mit bekannter Funktion. Die restlichen 321 repräsentierten Klone, kodierend für Gene mit unbekannter Funktion; 59 davon wiesen nicht einmal Einträge in der humanen EST-Datenbank auf. Bekannte Gene wurden nicht weiter behandelt. Für jene unbekannten
Gene, für die ein EST-Eintrag verfügbar war, wurde eine Abschätzung des Expressionsprofils vorgenommen: dabei wurden all jene ESTs mit > 95% Identität (BLAST), die zur entsprechend experimentell ermittelten Sequenz der Subtraktionsbibliotheken gehörten, überprüft. Bei der Annotation wurde eine Unterteilung in a) kritische Normalgewebe, b) fötale, "verzichtbare" und immunprivilegierte Gewebe und c) Tumore und Tumor- Zellinien vorgenommen. Auf der Basis dieses "virtuellen mRNA-Profils" ("virtueller Northern blot") wurden
200 Klone, für die keine ESTs in der Gruppe a) gefunden wurden, für weitere experimentelle Analysen ausgewählt (inklusive der 59 Klone, für die keine EST-Eintragung vorlag) . Zur weiteren Einengung der Kandidatenklone wurden aus den von den 200 ausgewählten Klonen ermittelten Sequenzen Oligonukleotidprimerpaare entworfen und synthetisiert. Es wurden zunächst 8 verschiedene, von humanem Gewebe abgeleitete cDNA-Bibliotheken (GibcoBRL "SUPERSCRIPT™"), welche direktional in pCMV-SPORT kloniert sind, mittels qualitativer PCR auf das Vorhandensein der jeweiligen Kandidaten getestet. Die dabei eingesetzten cDNA-Bibliotheken stammten aus Gewebe von Herz (#10419-018), Leber (#10422-012), Leukozyten (#10421-022), Niere (#10420-016), Lunge (#10424-018), Testis (#10426-013), Gehirn (#10418-010) und fötalem Gehirn (#10662-013) . Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 20 μl Gesamtvolumen pro PCR-Ansatz enthielten 1 x TaqPol-Puffer(50mM KC1, 10 mM Tris-HCl pH9, 0,1% Triton X-100) , 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs (Promega) , 0,025 U/μl Taq-DNA-Polymerase (Promega), jeweils 5 pM an spezifischen Oligonukleotidprimer für B345 (B345-D,
SEQ ID NO: 34) und (B345-U, SEQ ID NO: 35) sowie 100 ng der jeweils zu untersuchenden Plasmid-DNA. Zur Kontrolle wurden spezifische Primer für GAPDH (SEQ ID NO: 36 und 37) eingesetzt. Zur Überprüfung des selektiven Nachweises wurden die jeweiligen B345 spezifischen
Primerpaare Oligonukleotidprimer (SEQ ID NO: 34) und (SEQ ID NO: 35) parallel auch auf das isolierte Plasmid mit dem B345 "original Fragment" hin ausgetestet (ursprünglich isoliertes cDNA-Fragment von B345) . Die Nachweisbarkeit von Fragmenten der zu erwartenden Länge mit starkem Signal in einem der kritischen Normalgewebe (Herz, Leber, Lunge, Niere und Leukozyten) , nicht jedoch in den cDNA-Bibliotheken aus immunprivilegierten Geweben (Gehirn, fötales Gehirn und Testis) unter diesen PCR-Bedingungen (1 Zyklus: 3' 94°C; 35 Zyklen: 1' 94°C - 1' 55°C - 1' 72°C; 1 Zyklus: 7' 72°C) wurde als Ausscheidungskriterium definiert. Mittels dieser qualitativen PCR-Analyse konnte die Zahl der Kandidaten auf 56 eingeengt werden; Klon B345 befand sich in dieser bereits vorselektionierten Kandidatengruppe. Beispiel 3
Expressionsanalyse durch cDNA Chip Hybridisierung
Für das Design eines cDNA Chips wurden von der dBEΞT Datenbank über Nukleotid-Sequenzsuche eine Reihe von Klonen ausgewählt, die zu verschiedensten
Funktionskategorien, wie Apoptose bis zur Zellzyklus- Regulation, gehören. Ingesamt wurden 1299 IMAGE Klone (davon repräsentieren 1024 bereits bekannte Gene) bestellt und zur Kontrolle sequenziert. Mikrotiterplatten mit Bakterien, die ca. 800 bp lange Sequenzen vom 3 "Ende des Gens im Vektor enthalten, wurden an Incyte Pharmaceuticals, Inc. (USA) geschickt und diese dort auf 60 Chips gespottet. Neben diesen Klonen wurden auch 120 durch RDA identifizierten EST Klone auf die Chips gespottet . Die so produzierten DNA Chips wurden anschließend mit Cy3 markierter cDNA aus Normalgewebe, Tumorgewebe und Zelllinien zusammen mit Cy5 markierter cDNA aus einer Mischung von neun verschiedenen Normalgeweben hybridisiert und die beiden Signale zur Normalisierung der Expressionswerte verglichen. Die Berechnungen erfolgten teilweise in S-Plus oder in Microsoft Excel. Die Auswertung der Chip Experimente ergab ein sehr ähnliches Expressionsprofil für B345, B540 und B452 bei der Hybridisierung mit Lungenkrebs Proben von Zelllinien und Pa'tientenmaterial (Siehe Fig. 1A) . Solch ein tumorassoziiertes Expressionsprofil konnte für B345 auch bei Vergleich von Kolon Adenokarcinom mit Kolon Normalgewebe gezeigt werden (Siehe Fig. 1B) . Das Sequenzalignment von B345, B540 und B452 zeigte eindeutig ein Überlappen der einzelnen EST Fragmente. Daher konnte man annehmen, dass es sich bei den drei Klonen um ESTs von ein und dem selben Gen handelt . Der daraus resultierende DNA Abschnitt deckt eine Länge von 843 bp ab (Siehe Fig. IC) und wurde in weiteren Versuchen zur Durchsuchung von öffentlichen Datenbanken verwendet. Die Suchergebnisse lieferten keine signifikante Homologie zu bekannten DNA bzw. Protein Sequenzen, was darauf hindeutet, dass es sich bei B345 um ein bis lang unbekanntes Gen handelt.
Beispiel 4
Expressionsanalyse von B345 mittels Northern Blots
Bei B345 handelt es sich um ein Gen, das laut DNA Chip Analysen in Tumorgeweben (siehe Fig. 1A und 1B, Tab. la und Tab. 1B) hochreguliert ist.
Um einerseits das erhaltene Transkriptionsprofil zu bestätigen und andererseits die Länge der zu erwartenden mRNA für die füll size Klonierung zu bestimmen, wurde für B345 eine Northern Blot Analyse unter Einsatz von humanen Zelllinien und des "Human Multiple Tissue Northern Blots" (Clontech und Invitrogen) durchgeführt. Als Sonden dienten die mit [α-32P]dCTP (NEN, Boston) markierten 490 bp bzw. 318bp langen PCR Produkte von B345 (Primer (SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO : 6 bzw. SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8)) . Die Hybridisierung erfolgte bei 68° für 2 h; die Visualisierung durch Standard- Autoradiografie (Hyperfilm, Amersham) . Fig. 2A, 2B und 2C sowie Tab. la und Tab. 1B, IC zeigen das Ergebnis dieser Analyse: Fig. 2A von der Zelllinie A549, Fig. 2B von 12 Normalgeweben (Periphere Blut Lymphozyten (PBL) , Lunge, Placenta, Dünndarm, Leber, Niere, Milz, Thymus, Kolon, Skelettmuskel, Herz und Hirn) und Fig. 2C von 8 Krebszelllinien (Promyelozytische Leukämie HL60, HeLa-S3, chronische myelogene Leukämie K-562, lymphoblastische Leukämie MOLT-4, Burkitt "s Lymphom (Raji), Kolon Adenokarzinom SW480, Lungen Adenokarzinom A549 und Melanom G361) . Das B345-Transkript zeigt eine Länge von 6,5 kb.
Beispiel 5
Analyse des Expressionsprofils von B345 auf RNA-Ebene mittels quantitativer RT-PCR (real time PCR oder TaqMan-Analyse)
Um eine exaktere Quantifizierung der mRNA Expression in den verschiedenen normal und Tumorgeweben durchzuführen, wurde die "real time PCR" angewandt, die es erlaubt die RNA Konzentration im Vergleich zu einen externen Standard zu berechnen.
Die Isolierung der RNA aus Gefriergewebe erfolgte mit Trizol gemäß dem Herstellerprotokoll von Gibco. Zur Entfernung von etwaig kontaminierender DNA wurde die präparierte RNA wie folgt mit DNAase I verdaut: 3 μg Gesa t-RNA wurden mit 20 μl 5x AMV Puffer (Promega) , 1 μl RNasin (Promega) und 2 μl DNase I (Boehringer Mannheim) in einem Gesamtvolumen von 80 μl 15 Minuten bei 37 °C inkubiert. 120 μl Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25:24:1) wurden zugegeben, auf einem Vortexer gemischt und kurz abzentrifugiert. Die wässrige Phase wurde abgenommen, mit 120 μl Chloroform: Isoamylalkohol (24:1) versetzt und wie vorher zentrifugiert. Die gereinigte RNA wurde Ethanol-gefällt und in Wasser gelöst.
Anschließend wurde die Gesamt-RNA mit reverser Transkriptase (Superscript , Gibco, BRL) in cDNA umgeschrieben: Zu 3 μg Gesamt-RNA wurden 1 μl Oligo dT primer (Promega) zugegeben und mit Wasser auf ein
Endvolumen von 10 μl gebracht. Nach einer Inkubation von 5 Minuten bei 70 °C wurde die Lösung 5 Minuten bei Zimmertemperatur abgekühlt. 5 μl RT reaction buffer (5x, Gibco, BRL), 2,5 μl dNTPs (je 10 mM, Boehringer Mannheim), 1 μl RNasin (lOU/μl, Promega), 1,5 μl
Superscript (10 U/μl, Gibco, BRL) und 5 μl Wasser wurden zugegeben und 1 Stunde bei 42 °C inkubiert und die Reaktion durch Inkubation von 3 Minuten bei 95 °C beendet .
Zur Herstellung eines cDNA-pools eines bestimmten Gewebe oder Tumortyps wurden 3 bis 10 verschiedene Einzelpräparationen von unterschiedlichen Patienten in gleichen Anteilen gemischt.
Die quantitative Bestimmung der "Haushaltsgene" ß-Aktin, GAPDH und Tubulin in cDNA-pools wurde wie folgt durchgeführt:
A) ß-Actin-TaqMan PCR (Perkin Eimer)
Details über das Prinzip der TaqMan Methode siehe Herstellerinformation (Perkin Eimer) . Ein TaqMan PCR Lauf beinhaltete Proben an ß-Actin-Kontrollsequenz mit je 102, 103, 104, 105 und 106 Kopien/μl (Perkin Eimer) zur Bestimmung der Standardkurve, eine Negativkontrolle ohne DNA und die zu quantifizierenden cDNA-pools. Alle Proben wurden in Triplikaten analysiert. Für einen 25 μl
Reaktionsansatz wurden 1 μl cDNA, 2,5 μl lOx Puffer A (Perkin Eimer), 4 μl MgCl2 (25 mM, (Perkin Eimer)), 0,5 μl je Nukleotid (10 mM dATP, dCTP, dGTP; 20 mM dUTP) , 0,125 μl TaqMan Sonde (20 μM; TaqMan Sonde für ß-Aktin (SEQ ID NO: 20fluoreszenzmarkiert am 5 ' -Ende mit 6-Carboxyfluorescein und mit
6-Carboxytetramethylrhodamine am 3'-Ende), 1 μl je ß-Aktin spezifischer Primer (je 20 μM, Forward Primer SEQ ID NO:21 und Reverse Primer SEQ ID NO:22), 0,25 μl AmpErase uracil N-Glycosylase "UNG" (1 U/μl, Perkin Eimer), und 0,125 μl AmpliTaq Gold (5 U/μl, Perkin Eimer) gemischt, in MicroAmp .Optical Tubes (Perkin Eimer) überführt und mit MicroAmp Optical Caps verschlossen. Die PCR wurde folgendermaßen durchgeführt: ein Zyklus mit 2 Minuten 50°C für die UNG Reaktion, ein Zyklus 10 Minuten 95°C zur Aktivierung der AmpliTaq, 40 Zyklen mit je 15 Sekunden 95° und 1 Minute 60°C. Anschließend wurden die Proben auf 25°C gehalten. Die Auswertung der Daten erfolgt mit dem Programm "Sequence Detection System 1.5bl" *(PE Applied Biosystems), wobei im Prinzip die Fluoreszenzsignale der zu quantifizierenden cDNA-Proben mit den Signalen der Kontrollplasmidverdünnungen bekannter Konzentration verglichen wurden.
B) GAPDH-TaqMan PCR Für die Quantifizierung von GAPDH, das wie ß-Aktin oder Tubulin zur Normalisierung der eingesetzten RNAs verwendet wurde, sind folgende Primer bzw. Sonden eingesetzt worden. Als TaqMan Sonde für GAPDH diente (SEQ ID NO: 23) eine am 5 ' -Ende mit
Tetrachlorfluorescein und am 3 ' -Ende mit Carboxymethylrhodamin markierte Sonde (Forward GAPDH Primer: SEQ ID NO: 24 und Reverse Primer: SEQ ID NO: 25) . Die Reaktionen wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
C) Tubulin-SybrGreen PCR (Perkin Eimer)
Prinzip der SybrGreen PCR siehe Herstellerinformation (Perkin Eimer) . Ein SybrGreen PCR Lauf beinhaltete Proben an Tubulin-Kontrollplasmid mit je 102, 103, 104, 105 und 10e Kopien/μl (Perkin. Eimer) zur Bestimmung der Standardkurve, eine Negativkontrolle ohne DNA und die zu quantifizierenden cDNA-pools. Alle Proben wurden in Triplikaten analysiert. Für einen 25 μl Reaktionsansatz wurden 1 μl cDNA, 2,5 μl lOx SybrGreen Puffer (Perkin Eimer), 3,5 μl MgCl2 (25 mM, Perkin Eimer) ), 0,5 μl je Primer (je 20 μM, Perkin Eimer, Tubulin Forward (SEQ ID NO:26); Tubulin reverse (SEQ ID NO:27), 0,25 μl AmpErase uracil N-Glycosylase "UNG" (1 U/μl, Perkin Eimer), und 0,25 μl AmpliTaq Gold (5 U/μl, Perkin Eimer) gemischt, in MicroAmp Optical Tubes (Perkin Eimer) überführt und mit MicroAmp Optical Caps verschlossen. Die PCR wurde folgendermaßen durchgeführt: ein Zyklus mit 2 Minuten 50°C für die UNG Reaktion, ein Zyklus 10 Minuten 95°C zur Aktivierung der AmpliTaq, 40 Zyklen mit je 15 Sekunden 95° und 1 Minute 60°C. Anschließend wurden die Proben auf 25°C gehalten. Die Auswertung der Daten erfolgt mit dem Programm "Sequence Detection System 1.5bl" (PE Applied Biosystems), wobei im Prinzip die Fluoreszenzsignale der zu quantifizierenden cDNA-Proben mit den Signalen der Kontrollplasmidverdünnungen bekannter Konzentration verglichen wurden.
D) B345-TaqMan PCR
Die quantitative TaqMan-PCR-Analyse von B345 wurde, wie für die "Haushaltsgene" beschrieben, durchgeführt. Es wurden jedoch B345 spezifische Primer (SEQ ID NO:28 und SEQ ID NO:29) (200 ng/μl) und eine B345 spezifische Sonde (SEQ ID NO:30, 20 μM) , die am 5'-Ende mit Tetrachlorfluorescein und am 3 '-Ende mit Carboxymethylrhodamin markiert ist, verwendet. Als Standard wurde das PCR Produkt von B345 mit den Primern SEQ ID NO: 28 und SEQ ID NO: 29 mit bekannter Kopienzahl eingesetzt.
Fig. 3 veranschaulicht die TaqMan- Expressionsanalyse (Fig. 3A: ß-Actin; Fig. 3B: Tubulin) . Es zeigte sich, dass B345 höher in Dickdarmkrebsgewebe als in Normalgewebe exprimiert ist (siehe Tab. 2a) . Nun stellt aber sowohl das Normalgewebe als auch das Tumorgewebe ein sehr heterogenes Gemisch von verschiedenen Zelltypen dar. Weiteres variiert der Anteil von Tumorzellen im Tumorgewebe sehr stark von etwa 30 bis 80%. Um diese biologische Heterogenität auf ein Minimum zu beschränken, wurden die Epithelzellen des Dickdarms, die die Ursprungszellen des Adenokarzinoms darstellen, und die Krebszellen oder Krebsareale durch Laser- Mikrodissektion spezifisch präpariert. Gewebeschnitte von lOμm Stärke wurden mit dem Kyromikrotom von Leica, Jung CM1800 angefertigt und auf einen mit Polyethylen beschichteten Objektträger aufgebracht (Böhm et al., 1997) . Die bei Raumtemperatur für etwa 30 Minuten getrockneten Schnitte wurden mit Mayers Hämatoxylin (SIGMA DIAGNOSTICS) inkubiert und anschließend zur Entfernung von unspezifisch gebundenen Farbstoff fünf Minuten unter fließendem Wasser gewaschen. Nach fünf minütigem Trocknen bei 37 °C wurde die Laser- Mikrodissektion durchgeführt. Dafür wurde das Lasermikroskop von PALM (PALM GmbH, Bernried, Deutschland) eingesetzt und etwa 2000 bis 5000 Zellen präpariert. Die durch Reverse Transkription gewonnene cDNA, wurde auch hier durch Real Time PCR analysiert. Das Ergebnis zeigt, dass die B345 Expression in Dickdarmkarzinom Zelllinien sowie in Patientenmaterial um ein Vielfaches höher ist als vergleichsweise die des Dickdarmnormalgewebes. Zur Normalisierung wurde der Expressionslevel von GAPDH bestimmt (siehe Fig. 4 und Tab. 2B) .
Beispiel 6
a) Klonierung der cDNA von B345
Das Durchsuchen von Datenbanken nach Sequenzen von Genfragmenten (ESTs, expressed sequence tags) , die für die „in silico" Klonierung von B345 herangezogen werden können, ergab ein überlappendes EST-Kontig von etwa 1500 bp. Der polyA-Bereich an einem der Enden gab Hinweis auf die Orientierung des DNA Abschnittes in Bezug auf 5Λ - 3 , Orientierung, was beim Design von neuen Primern für die Amplifikation von B345- spezifischen cDNA-Fragmenten essentiell ist.
Zunächst wurde das durch die Datenbankanalyse beschriebene potentielle 3Λ Ende durch experimentelle Ansätze verifiziert. RNA von der Lungen-Karzinom Zelllinie Calu 6 (AACC No . HTB56) wurde mit Hilfe des Primers (SEQ ID NO: 9) revers transkribiert und die resultierende einzelsträngige cDNA wurde mittels PCR mit den Gen spezifischen Primer SEQ ID NO: 5 und den Adapterprimer SEQ ID NO: 10 amplifiziert .
Für einen 25 μl PCR Ansatz wurden 1 μl des cDNA-pools mit 2,5 μl lOxTaq Puffer (Promega), 1,5 μl MgCl2 (25 mM, Promega), 0,5 μl dNTPs (je 10 mM, Boehringer Mannheim), 1 μl Primermischung (je 20 μM) , 0,15 μl Taq Polymerase (Promega) in Wasser gemischt. Die PCR wurde wie folgt durchgeführt: lx 94°C 3 Minuten; 30x 94°C 30 Sekunden,
55°C 30 Sekunden, 72°C 1 Minute; auf 4°C halten. Die PCR wurde auf einem 1,2% Agarosegel analysiert.
Die beiden Primer wurden anschließend zum Sequenzieren des gereinigten PCR Produktes verwendet . Die ermittelten Sequenzen zeigten eine hohe Homologie mit dem "in silico" klonierten DNA Abschnitt (inklusive des PolyA- Trakts) .
Da das Klonieren von 5 ' -Endsequenzen einen meist sehr aufwendigen Prozess darstellt, wurden im Folgenden zur Lösung des Problems verschiedene Methoden angewandt.
Als Ausgangszelllinie wurde auch hier Calu 6 verwendet. Nach der reversen Transkription der RNA mit dem Primer SEQ ID NO: 9 und der Zweitstrangsynthese wurde an die Doppelstrang-cDNA ein Linker bestehend aus den beiden Oligos SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12 ligiert (Abe et al . , 1992). Die daraus resultierende LoneLinker cDNA Bibliothek wurde dann mit dem Gen spezifischen Primer SEQ ID NO: 6 linear über 35 Zyklen amplifiziert . Ein Aliquot der B345 angereicherten cDNA konnte anschließend mit den Primern SEQ ID NO: 13 und LLEcoRIA SEQ ID NO: 11 weiter amplifiziert werden. Nach der Gelelektrophorese eines Aliquots und Southernanalyse mit dem genspezifischen Oligo SEQ ID NO: 14 konnte eine 5 kb Bande lokalisiert werden. In weiterer Folge wurde dieses Fragment schrittweise sequenziert und auf die Sequenz des EST-Kontigs ausgerichtet ("aligned") .
Um die resultierende Sequenz aus der LLcDNA Klonierung zu überprüfen, wurden zwei Fragmente mittels PCR (SEQ ID NO: 15 und SEQ ID NO: 16 bzw. SEQ ID NO : 6 und SEQ ID
NO: 17) amplifiziert und für das Screenen von Lambda gtlO cDNA Phagen Bibliotheken eingesetzt. Positive Plaques wurden isoliert und mittels den gtlO spezifischen Primern (SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19) PCR amplifiziert. Anschließende Sequenzierung und das Alignment mit den Sequenzen führte zu der Annahme, das es sich hierbei um ein differenzielles Spleißprodukt handelt. Die Spleißdonor, Akzeptor und Lariatsequenz konnten in weiterer Folge gefunden werden. Mittels PCR durch geeigneter Primerkombination wurde in verschiedenen Zelllinien nach differenziellen Spleißprodukten gesucht, wobei in allen gescreenten Zelllinien nur ein Produkt gefunden wurde und zu der in Fig. 5 dargestellten Genstruktur führte. Die angeführte cDNA besitzt einen offenen Leserahmen (ORF) der für ein potentielles Protein mit einer Länge von 749 Aminosäuren kodiert. Die Translationsinitiationsstelle an Position 215 entspricht zu etwa 75% einer Kozak- Konsensussequenz. Die in diesem Experiment erhaltenen Ergebnisse veranlassten dazu, in einem weiteren Experiment (Beispiel 6b) die
Transkriptionsinitiationsstelle noch exakt durch Primer- Extension zu bestimmen, um sicher zu gehen, dass das hier ermittelte 5' Ende das tatsächliche 5 ' -Ende von B345 ist. Die von der in diesem Klonierungsversuch erhaltenen cDNA (SEQ ID NO:l) abgeleitete Aminosäuresequenz von B345 ist in SEQ ID NO: 2 gezeigt.
b) Zweiter Klonierungsversuch; Bestimmung der 5Λ-und der Promotorregion von B345
Mit Hilfe des Promotor Finder DNA Walking Kit (Clontech)" und anschließender Primerextension Reaktion wurden die 5Λ -Region und die Promotorregion sowie die exakte Transkriptionsinitiationsstelle bestimmt. Die 5"-Region wurde mit Hilfe einer genomischen DNA Library von Clontech mit B345 spezifischen Primern (SEQ ID NO: 38 bzw. nested SEQ ID NO: 39) und Adaptor Primer im Kit amplifiziert. Um den exakten Transkriptionsstart zu bestimmen, wurde die Primer Extension Reaktion durchgeführt. Dafür wurde der Primer SEQ ID NO: 40 am 5"-Ende mit Hilfe 10 U der T4 Polynukleotid Kinase (Promega) und 3μl [γ-32P]ATP ,(3000Ci/mmol) nach Standard- Protokollen markiert (Sa brook et al . , 1989) . Das markierte Oligonukleotid wurde durch Präzipitation gereinigt. Für die Primerextension Reaktion wurden 10.000 cpm Oligonukleotid in einem Gesamtvolumen von 20 μl zu 25 μg Total RNA der Colo 205 Zelllinie (ATCC:CCL-222) eingesetzt.
Die RNA der Zelllinie wurde mit dem radioaktiv markiertem Primer revers transkribiert und auf ein 10%- Polyacryamidgel aufgetragen. Zur Bestimmung der genauen Bandenlänge wurde ein PCR Fragment von nt 1000 - nt 1362 mit 35S markierten Nukleotiden sequenziert und "ebenfalls aufgetragen. Das aus der Elongation des reversen Primers resultierende Fragment von 209 Nukleotiden legt den Transkriptionsstart genau an Position 201 fest. Somit wurde die in Beispiel 6a erhaltene B345-Sequenz in der 5"Region erweitert und ein neues Startkodon auf Position 283 bestimmt. Durch wiederholte Sequenzierungen auch in der 3 "Region wurde, im Vergleich zur in SEQ ID NO:l dargestellten Sequenz, eine zusätzliche Base an Position 2430 gefunden, die zu einer Leserasterverschiebung führt und somit das Stoppcodon von Position 2729 auf 2791 verschiebt. Die in diesem Versuch erhaltene cDNA (SEQ ID NO: 3) besitzt einen offenen Leserahmen, der für ein potentielles Protein mit einer Länge von 836 Aminosäuren (SEQ ID NO: 4) kodiert. Beispiel 7
Bioinformatik-Analyse zur Funktion von B345
Die resultierende primäre Aminosäuresequenz von B345 ist in SEQ ID NO: 4 gezeigt. Die Analyse des Hydrophilizitäts Plots der Aminosäuresequenz mit der Methode von Kyte und Doolittle (1982) zeigt, dass das B345 Protein zwei charakteristische hydrophobe Domänen aufweist (Aminosäuren Pos. 1 - 29 und 666 - 691), die ein Signalpeptid und eine helikale Transmembrandomäne darstellen (Fig. 6). Diese polarisierte Struktur deutet darauf hin, dass es sich bei B345 um ein integrales Membraneprotein handelt-. Die Transmembranhelix verbindet einen etwa 666 Aminosäuren langen extrazellulären und einen kurzen (145 Aminosäuren) intrazellulären Teil (siehe Fig. 7) .
Die extrazelluläre Domäne weist außerdem klare Indizien für die Existenz einer CUB Domäne bei Position 220 - 350 sowie Indizien für 2 mögliche weitere CUB Domänen im Bereich der Aminosäuren 425 - 660 auf. CUB Domänen kommen bei verschiedenen, meist während der Embryonalentwicklung regulierten Proteinen vor. Außerdem sind manchmal bei EGF (Epidermal Growth Factor) -ähnlichen Domänen auch CUB Domänen anzutreffen. Eine kürzlich erschienene Publikation (Gerstein et al., 2000) demonstriert, daß CUB Domänen enthaltende Proteine die am ausgeprägtesten differenziell regulierten Proteine in C. elegans sind. Da Gene, die eine Schlüsselrolle in der Embryonalentwicklung haben, auch analoge Funktionen in Krebs ausführen, kann angenommen werden, dass eine Überexpression von B345 in Zellen eine Veränderung in den Eigenschaften der Substratadhäsion oder der extrazellulären Matrix bewirkt. Das Protein weist außerdem 12 potentielle N- Glycosylierungsstellen auf, die in der vorhergesagten extrazellulären Domäne zu finden sind, was mit der vorhergesagten Orientierung des Proteins übereinstimmt.
Mit einem BLAST hit (E-value: 5.8 x 10~2) für den Bereich der Aminosäuren von 235 bis 282 von B345 konnte eine Komplement aktivierende Komponente des _RA-reactive factor (RARF) aus mus musculus identifiziert werden. Das Alignment befindet sich innerhalb der CUB Domäne 1 von B345.
Die CUB-Domänen 2 and 3 (Bereich 425-535 und 545-660) weisen marginale Homologien zu dem humanen und Fugu
Prokollagen C-Proteinase Enhancer Protein (PCOLCE) auf. Diese Regionen kommen in dem Bereich von PCOLCE vor, welcher ein CUB Domänen Tandem Repeat enthält (E-values: 0.5 (human) und 2.7 (Fugu)). CUB Domänen kommen manchmal in Repeats vor.
Vermutlich bildet das B345-Protein eine ß-Sheet Sekundärstruktur, da sich CUB Domänen bekanntlich als ß-Sandwich falten.
Die intrazelluläre Domäne (Bereich 691-836) weist keine signifikanten Homologien auf. Der gesamte C-Terminus aligned jedoch mit einem EST (AW063026) von humanen Eierstockkrebs Zellen (82% Identität über 124 Aminosäuren) . Beispiel 8
Bestimmung der genauen Genstruktur von B345
Zunächst wurden Bac Klone in öffentlichen Datenbanken (BLAST search) gesucht, die das B345-Gen enthalten. Die Bac Klone Ac068625 und Ac010170 enthielten einen
Großteil des Gens. Mit intronspannenden Primern wurden Spliceakzeptor und Donorsequenzen in Colo 205 cDNA und genomischer DNA als Template gesucht. Das PCR Protokoll wurde wie folgt durchgeführt: Ix 95°C 2 Minuten, 35x 95°C 15 Sekunden, 68 °C 3 Minuten und dann auf 4°C gehalten. Die PCR wurde auf einem 1,2% Agarosegel analysiert und dabei die Längen der PCR Produkte der 2 Templates mit gleichen Primerkombinationen verglichen. Es stellte sich heraus, dass B345 aus 8 Exons, getrennt von 7 Introns besteht (Fig. 5) .
Die chromosomale Lokalisation des Gens wurde mittels Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) bestimmt. Dabei wurde die humane, Digoxigenin-markierte B345 Sonde zusammen mit der Biotin-markierten Sonde von B47a2 (Knight et al . , 1997), welche sich auf der sub- telomerischen Region des Chromosomenarms 3p befindet, mit Metaphase-Chromosomen zweier "normaler" Individuen hybridisiert (Lichter et al . , 1988). Die hybridisierte Digoxygenin-Sonde wurde mittels Anti-Schaf-Dig (Boehringer Mannheim FRG) und Kaninchen Anti-Schaf FITC- markierten Antikörpern detektiert. Die Biotin markierte Probe dagegen wurde mit Maus Anti-Biotin und Kaninchen- Anti-Maus (TRITC)und anschließende Färbung mit DAPI sichtbar gemacht. Die FISH Resultate zeigen, dass eine Mehrheit der Metaphasen eindeutige Signale an einem oder beiden Chromatiden des Chromosoms 3 in der Region p21-p23 haben. Als Bestätigung der Position diente die Co-lokalisation der B47a2 (TRITC) -Sonde auf dem selben chromosomalen Arm.
Tab . 1A
Tab . 1B
Tab. IC
Tab . 2A
Tab . 2B
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Claims

Patentansprüche
1. Tumorassoziiertes Antigen der Bezeichnung B345, dadurch gekennzeichnet, dass es die in SEQ ID NO: 4 definierte Aminosäuresequenz aufweist oder diese als Teilsequenz enthält, oder ein Fragment davon.
2. Isoliertes DNA-Molekül, kodierend für das in Anspruch 1 definierte tumorassoziierte Antigen oder für Fragmente davon.
3. DNA-Molekül nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Polynukleotid mit der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz ist oder diese Sequenz enthält oder dass es ein Polynukleotid ist oder dieses enthält, das mit einem Polynukleotid der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert, oder ein Fragment davon.
4. Rekombinantes DNA-Molekül, enthaltend ein DNA-Molekül gemäß Anspruch 2 oder 3.
5. Pharmazeutische Zusammensetzung für die
Immuntherapie von Krebs, enthaltend als wirksame Komponente das in Anspruch 1 definierte tumorassoziierte Antigen der Bezeichnung B345 oder ein oder mehrere Fragmente davon.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung für die
Immuntherapie von Krebs, enthaltend als wirksame Komponente ein DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4.
7. Antikörper gegen das in in Anspruch 1 definierte Polypeptid.
8. Antikörper nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass er monoklonal ist.
9. Antikörper nach Anspruch 7 oder 8 für die Therapie und Diagnose von Krebserkrankungen, die mit der Expression von B345 assoziiert sind.
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